MXPA05006521A - Agentes de enlace que inhiben miostatina. - Google Patents

Agentes de enlace que inhiben miostatina.

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Abstract

La presente invencion proporciona agentes de enlace que comprenden peptidos capaces de enlazar a la miostatina e inhibir su actividad. En una modalidad, el agente de enlace comprende al menos un peptido de enlace a la miostatina colocado directamente o indirectamente a al menos un vehiculo, tal como polimero o un dominio Fc. Los agentes de enlace de la presente invencion producidos aumentan la masa muscular magra cuando se administran a animales y disminuyen las relaciones de grasa a musculos. Las composiciones terapeuticas que contiene los agentes de enlace de la presente invencion son utiles para el tratamiento de trastorno de desgaste muscular y otros trastornos metabolicos incluyen diabetes y obesidad.

Description

AGENTES DE ENLACE QUE INHIBEN MIOSTATINA CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a factores de crecimiento, en particular, al factor de crecimiento de miostatina y a los agentes que enlazan miostatina e inhiben su actividad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La miostatina, conocida también como factor 8 de crecimiento/diferenciación (GDF-8) es un miembro de la familia del factor-ß de crecimiento transformante (TGF-ß) conocido por estar involucrado en la regulación de la masa muscular del esqueleto. La mayoría de la familia TGF-p-GDF se expresa no específicamente en muchos tipos del tejido y ejerce una variedad de acciones pleitróficas . Sin embargo, la miostatina se expresa ampliamente en las células que desarrollan el tejido muscular esquelético adulto y juega un papel esencial en el control negativo del crecimiento muscular esquelético (McPherron et al. Nature (London) 387, 83-90 (1997)). Sin embargo, estudios recientes indican que los niveles bajos de expresión de miostatina pueden medirse en los tejidos cardiaco, adiposo y pre-adiposo. La miostatina se ha conservado evolutivamente de manera favorable (McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)). La región C terminal biológicamente activa de la miostatina Ref: 164776 tiene una identidad de la secuencia del 100 por ciento entre las secuencias de humano, ratón, rata, vaca, pollo y pavo. La función de la miostatina parece también conservarse a través de las especies. Esto es evidente a partir de los fenotipos de animales que tienen una mutación en el gen de la miostatina. Dos especies de ganado vacuno, el Azul Belga (Hanset R. , Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, La Haya, Países Bajos) pp. 37-449) y el Piamontés (Masoero, G. & Poujardieu, B, Muscle Hypertrophy of Genetics Origin and its Use to Improve Beef Production., Kings, J.W.G. & Menisier, F. (Nijhoff, La Haya, Países Bajos) pp. 450-459) se caracterizan por un fenotipo "formación de músculos doble" e incremento en masa muscular. Estas especies demuestran contener mutaciones en la región que codifica al gen de la miostatina (McPherron et al. (1997) supra) . Además, los ratones que contienen una supresión de direccionamiento del gen que codifica a la miostatina (Mstn) demuestran un incremento dramático en su masa muscular sin el incremento correspondiente en grasa. Los músculos particulares de ratones Mstn _/~ pesan aproximadamente de 100 a 200 por ciento más que los animales de control conforme al resultado de la hipertrofia de fibra muscular e hiperplasia (Zimmers et al. Science 296, 1486(2002)) . La administración de miostatina para ciertas cepas de ratones ha demostrado originar una condición similar en los trastornos del desgaste muscular asociado por ejemplo, con el cáncer, SIDA y distrofia muscular. La miostatina administrada como células CHO que producen miostatina para ratones desnudos atímicos da como resultado un efecto de desgaste con un alto grado de pérdida de peso, una disminución tanto del 50% en la masa muscular del esqueleto como en la disminución de grasa, e hipoglicemia severa (Zimmers et al. supra.) . La pérdida de miostatina se presenta como resultado de una conservación de la masa muscular y una reducción en grasa acumulada con la edad. Se ha demostrado que el incremento en la masa del tej ido adiposo relacionado con la edad y la disminución en la masa muscular fueron proporcionales a los niveles de la miostatina, determinados mediante la comparación de masa muscular y grasa en ratones Mstn+^ con respecto a los ratones agénicos adultos Mstn^" (McFerron et al. J. Clin. Invest 109, 595 (2002)). Los ratones Mstn" " demostraron disminuir la acumulación de grasa con la edad en comparación con los ratones Mstn+ +. Además, la miostatina puede jugar un papel importante en el mantenimiento de los niveles de la glucosa sanguínea e influencia el desarrollo de la diabetes en ciertos casos. Se sabe por ejemplo que, la resistencia muscular del esqueleto para la absorción de glucosa -estimulada por la insulina es la manifestación más conocida de la diabetes mellitus (tipo 2) no dependiente de la insulina (Corregan et al. Endocrinology 128:1682(1991)). Se ha demostrado recientemente que la carencia de miostatina atenúa parcialmente los fenotipos de la obesidad y la diabetes de dos modelos de ratón, los (Ay) amarillo letal agouti (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994)), y el de la obesidad (Lepob ob) . La acumulación de grasa y el peso corporal total del ratón mutante doble, se reduce dramáticamente en comparación con el ratón Ay/a Msn_,~, (McFerron et al., (2002,) supra) . Además, los niveles de glucosa en los ratones Ay/a Msn"^" fueron dramáticamente inferiores a los ratones Ay/a Msn+/+ después de la carga de glucosa exógena, indicando que la carencia de miostatina mejora el metabolismo de la glucosa. De igual manera, los ratones Lepob ob Msn_ " demostraron una disminución en la acumulación de grasa cuando se compararon con el fenotipo Lepob/ob Msn÷/÷_ Por lo tanto, existe una notable evidencia de fenotipos de sobreexpresión y animales agénicos en los que la miostatina juega un papel importante al contribuir en una variedad de trastornos metabólicos dentro de los que se incluyen, trastornos que resultan del desgaste muscular, diabetes, obesidad e hiperglicemia.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a agentes de enlace que enlazan miostatina e inhiben su actividad. Los agentes de enlace incluyen al menos un péptido capaz de enlazar miostatina. Los péptidos que enlazan miostatina se prefieren entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, de preferencia entre aproximadamente 10 y 30 aminoácidos en longitud, y preferentemente entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos en longitud. En una modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina comprende la secuencia de aminoácidos WMCPP (SEC ID NO: 633). En otra modalidad, los péptidos que enlazan miostatina comprenden la secuencia de los aminoácidos Caia2Wa3WMCPP (SEC ID NO: 352), en donde alfa2 y a3 se seleccionan a partir de un aminoácido hidrofóbico, neutral polar o básico. En otra modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina comprende la secuencia Cb!b2Wb3WMCPP (SEC ID NO: 353) , en donde bi se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de cualquiera de uno de R, S, Q; b3 se selecciona de cualquiera de P, R y Q, y en donde el péptido se encuentra entre 10 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de las mismas. En otra modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina comprende la fórmula: c1c2c3C4C5C6Cc7c8 c9WMCPPc1oC11c12Ci3 (SEC ID NO: 354) , en donde : ex está ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o idrofóbico neutral; c3 está ausente o es un aminoácido ácido, polar- neutral o hidrofóbico neutral; c4 está ausente o es cualquier aminoácido, c5 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral, c6 está ausente o es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral, c7 es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral, c8 es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral , c9 es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral , y Cío a ci3 es cualquier aminoácido; en donde el péptido se encuentra entre 20 y 50 aminoácidos en longitud y sales fisiológicamente aceptables de los mismos . Una modalidad relacionada con el péptido que se enlaza a miostatina comprende la fórmula: d1d2d3d4d5d6Cd7d8Wd9M CPPdi0d11d12d13 (SEC ID NO: 355), en donde di está ausente o es cualquier aminoácido; di está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral; d3 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral; d4 está ausente o es cualquier aminoácido, ds está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral, ds está ausente o es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral, d7 se selecciona de cualquiera de uno de los aminoácidos T, I o R, de se selecciona de cualquiera de uno de R, S, Q, dg se selecciona de cualquiera de uno de P, R y Q, y dio a da3 se selecciona de cualquier aminoácido, y en donde el péptido se encuentra entre 20 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos . Las modalidades adicionales de agentes de enlace comprenden al menos uno de los siguientes péptidos: (1) un péptido capaz de enlazar miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia WYeie2Ye3G, (SEC ID NO: 356) en donde ei es P, S o Y, e2 es C o Q, y e3 es G o H, en donde el péptido se encuentra entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de las mismas, (2) un péptido capaz de enlazar miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia flEMLf2SL 3f4LL, (SEC ID N0:455) , en donde fx es M o I, f2 es cualquier aminoácido, f3 es L o F, f4 es E, Q o D; y en donde el peptido se encuentra entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos; (3) un peptido capaz de enlazar miostatina en donde el peptido comprende la secuencia Lg1g2LLg3g4L, (SEC ID NO: 56) , en donde gi es Q, D o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, g es L, W, F o Y, y en donde el peptido se encuentra entre 8 y 50 aminoácidos en longitud y sales fisiológicamente aceptables de los mismos; (4) un peptido capaz de enlazar miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia hih2h3hhshsh7h8h9 (SEC ID NO: 457) , en donde h2 es cualquier aminoácido, h3 es A, T, S o Q, 4 es L o M, hs es L o S, h6 es F o E, h7 es F o E, h8 es , F o C, 9 es L, F, M o K, y en donde el péptido se encuentra entre 9 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos. En una modalidad, los agentes de enlace de la presente invención comprenden además al menos un vehículo tal como un polímero o un dominio Fe, y pueden comprender además al menos una secuencia de agente de ligado. En esta modalidad, los agentes de enlace de la presente invención se construyen de manera que al menos un péptido que se enlaza a miostatina se una a al menos un vehículo. El péptido o péptidos se unen directamente o indirectamente a través de una secuencia de agente de ligado al vehículo en la terminal C, terminal N o a una cadena lateral de aminoácidos del péptido. En esta modalidad, los agentes de enlace de la presente invención tienen la siguiente estructura generalizada: (X1) a-F1- (X2)b, o multímeros de los mismos; en donde F1 es un vehículo, y X1 y X2 se seleccionan independientemente a partir de -(L^c-P1; - (I,1) (L2) á- l>2- (1?) xe-T?3 ; y -(L^c-P^ÍL^d- '-ÍL'Jxe-P'-ÍL^f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de enlazar miostatina, y L1, L2, L3 y L4 son cada uno agentes de ligado; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b sea 1, y las sales fisiológicamente aceptables de los mismos. En varias modalidades de agentes de enlace que tienen esta estructura generalizada, los péptidos P1, P2, P3 y P4 pueden seleccionarse independientemente a partir de uno o más de cualquiera de los péptidos que comprenden las secuencias proporcionadas arriba. P1, P2, P3 y P4 se seleccionan independientemente a partir de uno o más péptidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:455, SEQ ID NO:456, o la SEQ ID NO: 457. En una modalidad adicional, los agentes de enlace comprenden péptidos fusionados a un dominio Fe ya sea directamente o indirectamente proporcionando de este modo cuerpos de péptido o pepticuerpos . Los pepticuerpos de la presente invención exhiben una afinidad de enlace alta para la miostatina y pueden inhibir la actividad de la miostatina ambas demostradas in vitro usando ensayos basados en células y en animales . La presente invención proporciona también moléculas de ácidos nucleicos que comprenden polinucleótidos que codifican a los péptidos, pepticuerpos , variantes de péptidos y pepticuerpos y derivados de la presente invención. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden uno o más agentes de enlace de la presente invención. Los agentes de enlace de la presente invención inhiben la actividad de la miostatina in vitro e in vivo. Los agentes de enlace de la presente invención incrementan la masa muscular sin grasa en un animal tratado y disminuye la masa con grasa como un porcentaje del peso corporal del animal. Los agentes que enlazan miostatina de la presente invención incrementan la fuerza muscular en modelos de animales tratados . La presente invención proporciona métodos para inhibir la actividad de la miostatina en animales que incluyen a humanos, administrando una dosis efectiva de uno o más agentes de enlace al sujeto. La presente invención proporciona métodos para incrementar la masa muscular sin grasa en animales que incluyen humanos administrando una dosis efectiva de uno o más agentes de enlace. La presente invención proporciona además, métodos para tratar trastornos relacionados con la miostatina mediante la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de uno o más agentes que enlazan miostatina en una composición farmacéuticamente aceptable a un sujeto. La presente invención proporciona métodos para tratar trastornos de desgaste muscular que incluyen distrofia muscular, desgaste muscular debido al cáncer, SIDA, artritis reumatoide, insuficiencia renal, uremia, insuficiencia cardiaca, sarcopenia relacionada con la edad, reposo prolongado en cama, lesión de la médula espinal, apoplejía, fracturas óseas. La presente invención proporciona también métodos para tratar trastornos metabólicos que incluyen obesidad, diabetes, hiperglicemia y pérdida ósea. La presente invención proporciona también un método para incrementar la masa muscular en animales de alimento administrando una dosificación efectiva de uno o más agentes que enlazan miostatina al animal . La presente invención proporciona ensayos que utilizan uno o más agentes que enlazan miostatina para identificar y cuantificar la miostatina en una muestra. Los ensayos pueden ser ensayos diagnósticos para medir o monitorear niveles de miostatina en individuos con una miostatina relacionada con la enfermedad o el desorden.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la actividad de la miostatina medida por la actividad de la luciferasa expresada (eje y) contra la concentración (eje x) para el péptido TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEC ID N0:32) y el péptido TN8-19 (pb) para determinar el IC50 para cada uno usando el ensayo de luciferasa C2C12 pMARE descrito en los ejemplos de abajo. El pepticuerpo tiene un valor IC50 inferior en comparación con el péptido. La figura 2 es una gráfica que muestra el incremento en peso total para ratones nu/nu CD1 tratados con dosificaciones incrementadas del pepticuerpo lx mTN8-19-21 durante un periodo de catorce días comparada con los ratones tratados con un control huFc descrito en el ejemplo 8. La figura 3A muestra el incremento en la masa del músculo gastrocnemius durante la necropsia de los ratones tratados en la figura 2 (Ejemplo 8) . La figura 3B muestra el incremento en la masa sin grasa determinada por la RMN en el día 0 comparada con el día 13 del experimento descrito en el Ejemplo 8. La figura 4 muestra el incremento en la masa corporal sin grasa en los ratones nu/nu CD1 tratados con inyecciones quincenales que incrementan las dosificaciones del pepticuerpo lx mTN8-19-32 determinado por RMN en el día 0 y el día 13 del experimento descrito en el ejemplo 8. La figura 5A muestra el incremento en el peso corporal para ratones nu/nu CD1 tratados con inyecciones quincenales de lx mTN8-19-7 comparada con 2x mTN8-19 y los animales de control durante 35 días como se describe en el ejemplo 8. La figura 5B muestra el incremento en el peso del cuerpo sin grasa durante la necropsia para las versiones lx y 2x en 1 mg/kg y 3 mg/kg comparada con los animales que reciben el vehículo (huFc) (controles) . La figura 6A muestra el incremento en la masa muscular sin grasa contra el peso corporal para ratones mdx viejos tratados ya sea con pepticuerpos lx mTN8-19-33 de afinidad madura o vehículo huFc en 10 mg/kg subcutáneamente cada dos días durante tres meses. La figura 6B muestra el cambio en la masa con grasa comparada con el peso corporal determinado por RM para los mismos ratones después de 3 meses de tratamiento .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona agentes de enlace capaces de enlazar miostatina e inhibir su actividad. Los agentes que enlazan miostatina pueden ser usados en ensayos para identificar, cuantificar o monitorear el nivel de miostatina en un animal . Los agentes que enlazan miostatina de la presente invención incrementan la masa muscular sin grasa en los animales, disminuyen la masa con grasa como un porcentaje de peso corporal e incrementan la fuerza muscular. Los agentes que enlazan miostatina de la presente invención pueden usarse para tratar una variedad de trastornos metabólicos en los que la miostatina · juega un papel importante que incluyen trastornos del desgaste muscular tales como distrofias musculares, desgaste muscular debido al cáncer, SIDA, artritis reumatoide, insuficiencia renal, uremia, insuficiencia del corazón crónica, reposo en cama prolongado, lesión de la médula espinal, apoplejía y sarcopenia relacionada con la edad así como otros trastornos metabólicos que incluyen diabetes, obesidad, hiperglicemia y pérdida ósea administrando una dosificación terapéutica de uno o más agentes de enlace en una composición farmacéuticamente aceptable para un sujeto. iostatina La miostatina, un factor de crecimiento también conocido como GDF-8, se conoce como un regulador negativo del tejido muscular del esqueleto. La miostatina se sintetiza como una preproteína inactiva que se activa mediante el desdoblamiento proteolítico (Zimmers et al., supra (2002)). La proteína precursora se desdobla para producir un predominio inactivo ¾ terminal y una proteína COOH terminal de aproximadamente 109 aminoácidos en la forma de un homodímero de aproximadamente 25 kDa, que es la forma madura activa (Zimmers et al, supra (2002)) . Se cree ahora que el dímero maduro circula en la sangre como un enlace complejo latente inactivo para el propéptido (Zimmers et al, supra (2002) . Como se usa en la presente, el término "miostatina de longitud completa" se refiere a la secuencia de preproteína de humano de longitud completa descrita en cPherron et al. supra (1997) , así como los polipéptidos relacionados de longitud completa que incluyen variantes alélicas y homologas de interespecies que se describen también en McPherron et al . (1997) . Como se usa en la presente, el término "predominio" o "propéptido" se refiere a la proteina terminal H2 inactiva que se desdobla para liberar la proteína COOH terminal activa. Como se usa en la presente, el término "miostatina" o "miostatina madura" se refiere al polipéptido COOH terminal biológicamente activo maduro, en monómero, dímero, forma multimérica u otra forma. "Miostatina" o "miostatina madura" se refiere también a fragmentos de la miostatina madura biológicamente activa, también a polipéptidos relacionados que incluyen variantes alélicas, variantes de empalme polipéptidos y péptidos de fusión. Se ha reportado que la proteína COOH terminal de miostatina madura tiene una identidad de secuencia del 100% entre muchas especies dentro de las que se incluyen, humana, ratón, pollo, porcino, pavo y rata (Lee et al., PNAS 98,9306 (2001)). La miostatina puede o no incluir residuos terminales adicionales tales como secuencias de direccionamiento o residuos de lisina y metionina y/o secuencias de la proteína de fusión u objetivo dependiendo de cómo se preparen. Como se usa en la presente, el término "capaz de enlazar miostatina" o "tener una afinidad de enlace para la miostatina" se refiere a un agente de enlace o péptido que se enlaza a miostatina demostrado por el fago en el ensayo ELISA, los ensayos BIAcore® o KinExA™ descritos en los ejemplos de abaj o . Como se usa en la presente, el término "capaz de modificar la actividad de la miostatina" se refiere a la acción de un agente, ya sea un agonista o un antagonista con respecto a al menos una actividad biológica de la miostatina. Como se usa en la presente, actividad "agonista" o "mimética" se refiere a un agente que tiene actividad biológica comparable a una proteína que interactúa con la proteína de interés, descrita por ejemplo, en la solicitud Internacional WO 01/83525, presentada el 2 de Mayo de 2001, que se incorpora en la presente mediante la referencia. Como se usa en la presente, el término "que inhibe la actividad de la miostatina" o "tener actividad antagonista" se refiere a la capacidad de un péptido o un agente de enlace para reducir o bloquear la actividad de la miostatina o señalización demostrada o ensayos in vitro tales como po ejemplo, el ensayo de actividad de la miostatina basada en células pMARE c2C12 o mediante la prueba animal in vivo descrita abajo.
Estructura de agentes que enlazan miostatina En una modalidad, los agentes de enlace de la presente invención comprenden al menos un péptido que se enlaza a miostatina unida covalentemente a al menos un vehículo tal como un polímero o un dominio Fe . La unión de péptidos que se enlazan a miostatina en al menos un vehículo pretende incrementar la efectividad del agente de enlace como una terapia incrementando la actividad biológica del agente y/o disminuyendo la degradación in vivo, incrementando la vida media in vivo, reduciendo la toxicidad o inmunogenicidad in vivo. Los agentes de enlace de la presente invención pueden comprender además, una secuencia de agente de ligado que conecta al péptido y al vehículo. El péptido o péptidos se unen directamente o indirectamente a través de una secuencia de agente de ligado al vehículo en la terminal N, terminal C o una cadena lateral de aminoácidos del péptido. En esta modalidad, los agentes de enlace de la presente invención tienen la siguiente estructura: (X1) a-F1- (X2) b, o multímeros de los mismos; en donde F1 es un vehículo, y X1 y X2 se seleccionan independientemente a partir de -(L^c-P1; y - (L^c-P1- (L2)d-P2- (L3)e-P3- (L4)f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de enlazar miostatina, y L1, L2, L3 y L4 son cada uno agentes de ligado; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b sea 1.
Cualquier péptido que contenga un residuo cisteinilo puede ser reticulado con otro péptido que contiene Cys, cualquiera o ambos de los cuales puede enlazarse a un vehículo. Cualquier péptido que tiene más de un residuo Cys puede formar también un enlace bisulfuro intrapéptido . En una modalidad, el vehículo es un dominio Fe definido abajo. Esta modalidad se refiere como un "pepticuerpo" . Como se usa en la presente, el término "pepticuerpo" se refiere a una molécula que comprende un dominio Fe del anticuerpo unido a al menos un péptido. La producción de pepticuerpos se describe generalmente en la publicación PCT WO 00/24782 publicada el 4 de mayo de 2000, que está incorporada en la presente mediante la referencia. Los pepticuerpos de ejemplo se incorporan como las configuraciones Ix y 2x con una copia y dos copias del péptido (anexada en tándem) respectivamente, descrita en los ejemplos de abajo.
Péptidos Como se usa en la presente, el término "péptido" se refiere a moléculas de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 90 aminoácidos enlazados mediante enlaces de péptido. Los péptidos de la presente invención se encuentran preferiblemente entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y 30 aminoácidos en longitud, y más preferiblemente entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos en longitud, los cuales son capaces de enlazar a la proteína miostatina . Los péptidos de la presente invención pueden comprender parte de una secuencia de proteínas que se presentan naturalmente, pueden ser secuencias aleatorias derivadas de proteínas que se presentan naturalmente, o pueden ser secuencias completamente aleatorias. Los péptidos de la presente invención pueden ser generados mediante cualquiera de los métodos conocidos en el arte incluyendo la síntesis química, digestión de proteínas o tecnología recombinante . El despliegue de fagos, separación por exclusión del péptido del ARN y otras técnicas de separación por exclusión de afinidad son particularmente útiles para generar péptidos capaces de enlazar miostatina. La tecnología que despliega fagos se describe por ejemplo, en Scott et al. Science 249:386 (1990); Devlin et al., Science 249:404 (1990); patente de lo E.u: No. 5,223,409 emitida el 29 de junio de 1993, patente de los E.U. No. 5,733,731 emitida el 31 de marzo de 1998, patente de los E.U. No. 5,498,530 emitida el 12 de Marzo de 1996, patente de lo E.u: No. 5,432,018 emitida el 11 de Julio de 1995, patente de los E.U. No. 5,338,665 emitida el 16 de Agosto de 1994, patente de lo E.U. No. 5,922,545 emitida el 13 de Julio de 1999, la WO 96/40987 publicada el 19 de Diciembre de 1996 y la WO 98/15833, publicada el 16 de Abril de 1998, cada una de las cuales está incorporada en la presente mediante las referencias. Usando colecciones de fagos, las secuencias de péptido aleatorias se muestran mediante la fusión con proteínas revestidas de fagos filamentosos. Típicamente, los péptidos exhibidos son ya sea eluidos por afinidad específicamente o no específicamente contra la molécula de direccionamiento . Los fagos retenidos pueden ser enriquecidos mediante rondas sucesivas de purificación por afinidad y repropagación. Los mejores péptidos de enlace se seleccionan para análisis adicionales, por ejemplo, usando el fago ELISA descrito abajo y después formado en secuencias. Opcionalmente, las colecciones de la mutagénesis pueden ser creadas y separadas por exclusión para optimizar adicionalmente la secuencia de los mejores aglutinantes (Lowman, Ann Rev Biophys Biomol Strut 26:401-24 (1997)) . Otros métodos para generar los péptidos que enlazan miostatina incluyen técnicas de selección de afinidad adicionales conocidas en el arte. Una colección de péptidos puede fusionarse en el término carboxilo del represor lac y expresada en E.coli. Otro método basado en E.coli que permite exhibir la membrana externa de la células es mediante la fusión con una lipoproteína asociada con el peptidoglicano (PAL) . Más adelante, estos y los métodos relacionados son referidos colectivamente como "despliegue E. coli" . En otro método, la traducción de AR aleatorio se interrumpe previo a la liberación del ribosoma resultando en una colección de polipéptidos con su ARN asociado aún unido. Más abajo, esto y los métodos relacionados son referidos colectivamente como una "exhibición del ribosoma" . Otros métodos emplean enlaces químicos de péptidos al ARN. Ver por ejemplo, Roberts y Szostak, Proc. Nati Acad Sci . USA 94:12297-303 81997). Más adelante, esto y los métodos relacionados son referidos colectivamente como "separación por exclusión del péptido del ARN" . Los métodos de separación por exclusión de dos híbridos de levadura pueden usarse también para identificar los péptidos de la invención que enlazan miostatina. Además, las colecciones de péptidos derivados químicamente han sido desarrolladas de tal forma que los péptidos se inmovilizan en materiales no biológicos estables tales como barras de polietileno o resinas permeables a los solventes. Otra colección de péptidos derivados químicamente usa fotolitografías para escanear los péptidos inmovilizados en portaobjetos de vidrio. Más adelante, estos y los métodos relacionados son referidos colectivamente como "separación por exclusión de péptidos químicos" . La separación por exclusión de péptidos químicos puede ser ventajosa debido a que permite el uso de aminoácidos D y otros análogos, así como a elementos no péptidos. Tanto los métodos biológicos como los químicos se revisan en Wells and Lowman, Curr Opin Biotechnol 3:355-62 (1992). Además, los péptidos seleccionados capaces de enlazar miostatina pueden mejorarse adicionalmente a través del uso de "diseño racional" . En esta metodología, los cambios en los pasos de las etapas se hacen para una secuencia del péptido y el efecto de la sustitución en la afinidad de enlace o específicamente del péptido o alguna otra propiedad del péptido se observa en un ensayo apropiado. Un ejemplo de esta técnica es sustituir un residuo simple en un momento con una alanina, referida como "circulación de la alanina" o una "exploración de alanina" . Cuando dos residuos se reemplazan, esto se refiere a una "circulación de alanina doble" . El péptido resultante que contiene sustituciones de aminoácidos se prueba para una actividad mejorada o alguna propiedad ventajosa adicional. Además, el análisis de la estructura de una interacción proteína-proteína, puede también ser usada para sugerir a los péptidos que imiten la interacción de una proteína más grande. En tal análisis, la estructura cristalina de una proteína puede sugerir la identidad y la orientación relativa de los residuos críticos de la proteína, a partir de la cual un péptido puede ser diseñado. Ver por ejemplo, Takasaki et al., Nature Biotech 15:1266 (1977). Estos métodos pueden usarse también para investigar la interacción entre péptidos y proteínas de direccionamiento seleccionados por el despliegue de fagos u otros procesos de selección de afinidad, sugiriendo así, modificaciones adicionales de péptidos para incrementar la afinidad de enlace y la capacidad del péptido para inhibir la actividad de la proteína . En una modalidad, los péptidos de la presente invención se generan como familias de péptidos relacionados. Ejemplos de péptidos se representan por la SEQ ID N0:1 hasta 132. Los ejemplos de estos péptidos se derivaron a través de un proceso de selección en el cual los mejores aglutinantes generados por la tecnología de . despliegue de fagos se analizaron además por el fago ELISA para obtener péptidos candidatos mediante una técnica de selección por afinidad tal como tecnología de despliegue de fagos descrita en la presente. Sin embargo, los péptidos de la presente invención pueden producirse mediante cualquier número de métodos conocidos que incluyen la síntesis química como se describe abajo . Los péptidos de la presente invención pueden mejorarse además mediante el proceso de "maduración por afinidad". Este procedimiento se refiere al incremento en la afinidad o actividad de los péptidos y pepticuerpos de la presente invención usando despliegue de fagos u otras tecnologías de selección. Basada en una secuencia de consenso, las colecciones del despliegue de fagos secundarias dirigidas por ejemplo, pueden generarse cuando los aminoácidos "núcleo" (determinados a partir de la secuencia de consenso) se mantienen constantes o están predispuestos a la frecuencia de ocurrencia. Alternativamente una secuencia de péptidos individuales puede usarse para generar una colección de despliegue de fagos dirigida predispuesta. El inmunoplaqueteo "panning" de tales colecciones bajo condiciones más severas pueden producir péptidos con un enlazado mejorado en la miostatina, enlazado selectivo para la miostatina o con algunas propiedades deseadas adicionales. Sin embargo, los péptidos que tienen las secuencias maduradas por afinidad pueden producirse entonces mediante cualquier número de métodos conocidos que incluyen la síntesis química o recombinante . Estos péptidos se usan para generar agentes de enlace tales como pepticuerpos de varias configuraciones que exhiben una mayor actividad inhibidora en ensayos basados en células y en ensayos in vivo. El ejemplo 6 de abajo describe la maduración por afinidad de los péptidos "primer ronda" descrita arriba para producir péptidos madurados por afinidad. Ejemplos de pepticuerpos madurados por afinidad se presentan en las Tablas IV y V. Los pepticuerpos lx y 2x resultantes hechos a partir de estos péptidos se caracterizaron además por afinidad de enlace, capacidad para neutralizar la actividad de la miostatina, especificidad para la miostatina opuesta a otros miembros de la familia ??? , y para la actividad in vitro e in vivo adicionales descritas abajo. Los péptidos y los pepticuerpos madurados por afinidad son referidos por el prefijo "m" antes de su nombre familiar para distinguirlos de la primer ronda de péptidos de la misma familia. Ejemplos de péptido de la primer ronda para la maduración por afinidad adicional de acuerdo a la presente invención incluye los siguientes péptidos : TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEC ID NO:33) y los péptidos lineales ME LDSLFELLKDMVPISKA lineal 2 (SEC ID NO:104) , HHG NYLRKGSAPQ FEAWV lineal 15 (SEC ID NO: 117) , RATLL DFWQLVEGYGDN lineal 17 (SEC ID N0:119) , YRE SMLEGLLDVLERLQHY lineal 20 (SEC ID NO: 122) HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ lineal 21 (SEC ID NO: 123) , EFFH LHNHRSEWHWLDMN LINEAL 24 (SEC ID NO: 126) . Las familias maduradas por afinidad de cada una de estas se presentan en las Tablas IV y V. Los péptidos de la presente invención abarcan también variantes y derivados de los péptidos seleccionados que son capaces de enlazar miostatina. Como se usa en la presente, el término "variante" se refiere a péptidos que tienen uno o más aminoácidos insertados, eliminados o sustituidos en la secuencia de aminoácidos original, y que son capaces incluso de enlazar a la miostatina. Las variantes de inserción y de substitución pueden contener aminoácidos naturales así como aminoácidos que no se presentan naturalmente. Como se usa en la presente, el término "variante" incluye fragmentos de péptidos que retienen incluso la capacidad de enlazar miostatina. Como se usa en la presente, el término "derivado" se refiere a péptidos que han sido modificados químicamente en alguna forma distinta a la de las variantes de la inserción, eliminación y substitución. Las variantes y derivados de los péptidos y pepticuerpos de la presente invención se describen de forma más detallada abajo.
Vehículos Como se usa en la presente, el término "vehículo" se refiere a una molécula que puede ser unida a uno o más péptidos de la presente invención. Preferiblemente, los vehículos confieren al menos una propiedad deseada en los agentes de enlace de la presente invención. Los péptidos solo son probablemente eliminados in vivo ya sea mediante la filtración renal, mediante los mecanismos de despeje celular en el sistema retículoendotelial , o mediante la degradación proteolítica. La unión de un vehículo mejora el valor terapéutico de un agente de enlace reduciendo la degradación del agente de enlace y/o incrementando la vida media, reducción de la toxicidad, reducción de la inmunogenicidad y/o el incremento de la actividad biológica del agente de enlace.
Ejemplos de vehículos incluyen los dominios Fe, polímeros lineales tales como polietilen glicol. (PEG) , polilisina, dextrano, un polímero de cadena ramificada (ver por ejemplo, la patente de los E.U. No. 4,289,872 por Denken alter et al., emitida el 15 de Septiembre de 1981, la patente de los E.U. No. 5,229,490 por Tam emitida el 20 de Julio de 1993; la WO 93/21259 por Frechet et al., publicada el 28 de Octubre de 1993) , un lípido, un grupo de colesterol (tal como un esteroide) ; un carbohidrato o un oligosacárido; o cualquier proteína sintética o natural, un péptido o polipéptido que enlaza a un receptor de salvamento. En una modalidad, los agentes que enlazan miostatina de la presente invención tienen al menos un péptido unido a al menos un vehículo (F1, F2) a través del término N, término C o una cadena lateral de los residuos de aminoácidos del péptido (s) . Los vehículos múltiples también pueden usarse; tales como un dominio Fe en cada término o un dominio Fe en un término y un grupo PEG en el otro término o una cadena lateral . Un dominio Fe es un vehículo preferido. Como se usa en la presente, el término "dominio Fe" abarca las moléculas variantes Fe y Fe nativas y secuencias definidas abajo. Como se usa en la presente, el término "Fe nativo" se refiere a un fragmento de enlace no antígeno de un anticuerpo o la secuencia de los aminoácidos del fragmento que se produce mediante técnicas de ADN recombinantes o mediante el desdoblamiento químico o enzimático de anticuerpos intactos. Un Fe preferido es un Fe completamente humano y puede originarse a partir de cualquiera de las inmunoglobulinas tales como IgGl e IgG2. Sin embargo, las moléculas Fe que son parcialmente de humano o se originan a partir de especies no humanas se incluyen también en la presente. Las moléculas Fe nativas se elaboran hasta de polipéptidos monoméricos que pueden ser enlazado en formas diméricas o multiméricas mediante la asociación covalente y no covalente (es decir, enlaces bisulfuro) . El número de enlaces de bisulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fe nativas se encuentran en el intervalo de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclases (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgAl, IgGA2) . Un ejemplo de un Fe nativo es un dímero enlazado al bisulfuro que resulta de la digestión de la papaína de un IgG (ver Ellison et al. (1982;, Nucí Acids Res 10:4071-9). El término "Fe nativo" como se usa en la presente se usa para referir a las formas monoméricas, diméricas y multiméricas. Como se usa en la presente, el término "variante Fe" se refiere a una forma modificada de una secuencia Fe nativa con tal de que enlace del receptor de salvamento se mantenga, como se describe por ejemplo en la WO 97/34631 y la WO 96/32478, ambas de las cuales se incorporan en la presente mediante la referencia. Las variantes Fe pueden construirse por ejemplo, mediante los residuos de sustitución o eliminación, residuos de inserción o porciones de truncamiento que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos pueden también ser aminoácidos alterados tales como aminoácidos D o peptidomiméticos . Las variantes Fe pueden ser deseables para una gran variedad de razones, varias de las cuales se describen abajo, las variantes Fe de ejemplo incluyen moléculas y secuencias en las que: 1. Los sitios involucrados en la formación de enlaces de bisulfuro se eliminan. Tal eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en las células hospedadoras usadas para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, el segmento que contienen cisteína en el término N puede ser truncado o los residuos de cisteína pueden ser eliminados o sustituidos con otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo) . Incluso, cuando los residuos de cisteína se remueven, los dominios Fe de la cadena sencilla puede inclusive formar un dominio Fe dimérico que se mantiene a la vez no covalentemente . 2. Un Fe nativo se modifica para hacerlo más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, uno puede remover la secuencia PA cerca del término N de un Fe nativo típico, que puede ser reconocido mediante una enzima digestiva en E. coli tal como la iminopéptidasa prolina. Uno puede agregar también un residuo de metionilo N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa recombinantemente en una célula bacteriana tal como la E. coli. 3. Una porción del término N de un Fe nativo se remueve para prevenir la heterogeneidad de la terminal N cuando se expresa en una célula hospedadora seleccionada. Para este propósito, se puede eliminar cualquiera de los primeros 20 residuos de aminoácidos en el término N, particularmente aquellos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5. 4. Uno o más sitios de glicosilación se remueven. Los residuos que se glicosilan típicamente (por ejemplo, asparagina) pueden conferir una respuesta citolítica. Tales residuos pueden ser eliminados o sustituidos con residuos no glicosilados (por ejemplo, alanina) . 5. Los sitios involucrados en interacción con el complemento, tal como el sitio de enlace Clq se remueve. Por ejemplo, se puede eliminar o sustituir la secuencia EKK del IgGl humano. El reclutamiento del complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención, de manera que pueden evitarse con una variante tal como Fe. 6. Los sitios que afectan el enlace de los receptores Fe distintos a los del receptor de salvamento se remueven. Un Fe nativo puede tener sitios para la interacción con ciertas células sanguíneas que no son requeridas para la fusión de las moléculas de la presente invención y para que puedan ser removidas . 7.. El sitio ADCC se remueve. Los sitios ADCC se conocen en el arte Ver por ejemplo, Molec Immunol 29 (5) :633-9 (1992) con respecto a los sitios ADCC en IgGl. Estos sitios también, no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y para que puedan ser removidas . 8. Cuando el Fe nativo se deriva de un anticuerpo no humano, la Fe nativa puede ser humanizada. Típicamente, para humanizar un Fe nativo, uno sustituirá los residuos seleccionados en el Fe nativo no humano con residuos que se encuentran normalmente en Fe nativo humano. Las técnicas para la humanización del anticuerpo son bien conocidas en el arte.
El término "dominio Fe" incluye moléculas en formas monoméricas o multiméricas ya sea digeridas a partir del anticuerpo completo o producidas por otros medios. Como se usa en la presente, el término "multímero" se aplica a dominios Fe o moléculas que comprenden dominios Fe referido a moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptidos asociadas covalentemente , no covalentes o mediante ambas interacciones covalentes o no covalentes . Las moléculas IgG forman típicamente dímeros; IgM, pentámeros, IgD, dímeros e IgA, monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Los multímeros pueden formarse mediante la explosión de la secuencia que resulta de la actividad de la fuente de Ig nativa del Fe o mediante la derivación tal como un Fe nativo. El término "dímero" cuando se aplica a dominios Fe o moléculas que comprenden dominios Fe se refiere a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptidos asociadas covalentemente o no covalentemente . Adicionalmente, un vehículo alternativo de acuerdo con la presente invención es una proteína de domino no Fe, polipéptido, péptido, anticuerpos, fragmento de anticuerpos o moléculas pequeñas (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de enlazar a un receptor de salvamento. Por ejemplo, se podría usar como un vehículo, un polipéptido descrito en la patente de los E.U. No. 5,739,277 emitida el 14 de Abril de 1998 por Presta et al. Los péptidos podrían también seleccionarse mediante el despliegue de fagos para enlazar al receptor de salvamento FcRn. Tales compuestos que enlazan receptores de salvamento se incluyen también dentro del significado del "vehículo" y se encuentran dentro del alcance de esta invención. Tales vehículos deben ser seleccionados para la vida media incrementada (por ejemplo, evitando las secuencia reconocidas mediante las proteasas) e inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, favoreciendo las secuencias no inmunogénicas, descubiertas en la humanización del anticuerpo) . Además, los vehículos polimericos pueden usarse también para construir los agentes de enlace de la presente invención. Distintos medios para unir las porciones químicas útiles como vehículos se encuentran disponibles actualmente, ver por ejemplo, la publicación Internacional ("PCT") del Tratado de Cooperación de Patentes No. WO 96/11953 titulado "N-Terminally Chemically odified Protein Compositions and ethods" , incorporada en la presente mediante la referencia en su totalidad. Esta publicación de PCT describe entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros solubles en agua para el término N de las proteínas . Un vehículo polímerico preferido es un polietilen glicol (PEG) . El grupo PE6 puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG estará preferiblemente del intervalo de aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 100 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 50 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG serán unidos generalmente a los compuestos de la invención vía la acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo en la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el compuesto inventivo (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster) . Una estrategia útil para la PEGilación de péptidos sintéticos consiste en combinar a través de la formación de un enlace conjugado en la solución, un péptido y una porción PEG, cada uno produce una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva con la otra. Los péptidos pueden prepararse fácilmente con una síntesis de fase sólida convencional conocida en el arte. Los. péptidos son "preactivados" con un grupo funcional apropiado en el sitio específico. Los precursores se purifican y se caracterizan completamente antes de reaccionar con la porción PEG. La ligación del péptido con pEG tiene lugar normalmente en fases acuosas que pueden monitorearse ' fácilmente mediante CLAR analítica de fase inversa. Los péptidos Pegilados pueden purificarse fácilmente mediante la preparación de CLAR y caracterizada mediante CLAR analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masa por desabsorción mediante láser. Los polímeros de polisacáridos son otro tipo de polímero soluble en agua que puede usarse para la modificación de las proteínas. Los dextranos son polímeros de polisacáridos que comprenden de subunidades individuales de glucosa enlazada predominantemente por 1 a 6 enlaces. El mismo dextrano está disponible en muchos intervalos de peso molecular y se encuentran fácilmente disponibles en pesos moleculares desde aproximadamente 1 kDa hasta aproximadamente 70 kDa. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para usarse en la presente invención como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe) . ver por ejemplo, la WO 96/11953 y O 96/05309. Se ha reportado el uso de dextrano conjugado a terapias o diagnósticos con inmunoglobulinas ; ver por ejemplo, la Publicación de patente europea No. 0 315 456, que se incorpora en la presente mediante la referencia. El dextrano de aproximadamente 1 kDa hasta aproximadamente 20 kDa se refieren cuando el dextrano se usa como un vehículo de acuerdo con la presente invención.
Agentes de ligado Los agentes de enlace de la presente invención pueden comprender opcionalmente además, un grupo "agente de ligado". Los agentes de ligado sirven principalmente como un espacio entre un péptido y un vehículo o entre dos péptidos de los agentes de enlace de la presente invención. En una modalidad, el enlace se realiza a partir de aminoácidos enlazados junto con los enlaces del péptido, preferiblemente desde aproximadamente 1 a 20 aminoácidos enlazados mediante enlaces de péptidos, en donde los aminoácidos se seleccionan a partir de 20 aminoácidos que se presentan naturalmente. Uno o más de estos aminoácidos pueden ser glicosilados , como se entiende por aquellos expertos en el arte. En una modalidad, los aminoácidos 1 a 20 se seleccionan a partir de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferiblemente, un enlace se hace de una mayoría de aminoácidos que no son obstaculizados estéricamente tales como glicina y alanina. Así, los agentes de ligado de ejemplo son poliglicinas (particularmente (Gly)5í (Gly) 8) , poli (Gly-Ala) y polialaninas . Como se usa en la presente, la designación "g" se refiere a agentes de ligado de homopéptidos de glicina. Como se muestra en la Tabla II, wgn" se refiere a un agente de ligado 5x gly en el término N, mientras que "ge" se refiere a un agente de ligado 5x gly en el término C. Las combinaciones de Gly y Ala también son preferidas. Una secuencia de agente de ligado de ejemplo útil para construir los agentes de enlace de la presente invención es la siguiente: gsgsatggsgstassgsgsatg (SEC ID NO: 305). Esta secuencia de agente de ligado se refiere como la "k" o secuencia lk. Las designaciones "kc" como se encuentran en la tabla II, se refieren al agente de ligado k en el término C mientras que la designación "kn" se refiere al agente de ligado k en el término N. Los agentes de ligado de la présente invención pueden también ser agentes de ligado de no péptidos. Pueden usarse por ejemplo, agentes de ligado de alquilo tales como -NH- (CH2) s-C (O) - , en donde s = 2-20. Estos agentes de ligado de alquilo pueden ser sustituidos adicionalmente por cualquier grupo no estéricamente obstaculizado tal como un alquilo inferior (por ejemplo, C!-C6) , acilo inferior, halógeno (por ejemplo., Cl, Br) , CN, H2, fenilo, etc. Un ejemplo de agente de ligado de no péptidos es un agente de ligado PEG, y tiene un peso molecular de 100 a 5000 kDa, preferiblemente 100 a 500 kDa. Los agentes de ligado de péptido pueden ser alterados para formar derivados en la misma forma que la anterior . Ejemplos de agentes de enlace Los agentes de enlace de la presente invención comprenden al menos un péptido capaz de enlazar miostatina. En una modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina se encuentra entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, en otra, entre aproximadamente 10 y 30 aminoácidos en longitud, y en otra, entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos en longitud. En una modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina comprende la secuencia de aminoácidos WMCPP (SEC ID NO: 633). En otra modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina comprende la secuencia de aminoácidos Caia2Wa3WMCPP (SEC ID NO: 352), en donde ai, a2 y a3 se seleccionan a partir de un aminoácido neutral hidrofóbico, polar neutral o básico. En otra modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina comprende la secuencia de aminoácidos Cbib2Wb3WMCPP (SEC ID NO: 353), en donde bx se selecciona a partir de cualquiera de uno de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona a partir de cualquiera de uno de R, S, Q b3 se selecciona a partir de cualquiera de uno de P, R y Q, y en donde el péptido se encuentra entre 10 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos.
En otra modalidad, el péptido que se enlaza a miostatina comprende la fórmula: c1c2C3C4C5c6Cc7C8 Cs MCPPc1oCi1c12Ci3 (SEC ID NO: 354) , en donde : Ci está ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral; c3 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral; c4 está ausente o es cualquier aminoácido, c5 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral, c6 está ausente o es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral, c7 es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral , c8 es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral , c9 es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral , y Cío a c13 es cualquier aminoácido; en donde el péptido se encuentra entre 20 y 50 aminoácidos en longitud y sales fisiológicamente aceptables de los mismos. Una modalidad relacionada con el péptido que se enlaza a miostatina comprende la fórmula: did2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WMCPPd1odi1di2d13 (SEC ID NO: 355), en donde di está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral; d3 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral; d4 está ausente o es cualquier aminoácido, d5 está ausente o es un aminoácido ácido, polar neutral o hidrofóbico neutral, de está ausente o es un aminoácido básico, polar neutral o hidrofóbico neutral, d7 se selecciona de cualquiera de uno de los aminoácidos T, I o R, d8 se selecciona de cualquiera de uno de R, S, Q, d9 se selecciona de cualquiera de uno de P, R y Q, y dio a dX3 se selecciona de cualquier aminoácido, y en donde el péptido se encuentra entre 20 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos . Las modalidades adicionales de agentes de enlace comprenden al menos uno de los siguientes péptidos : (1) un péptido capaz de enlazar a miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia WYeie2Ye3G, (SEC ID NO:356) en donde ei es P, S o Y, e2 es C o Q, y e3 es G o H, en donde el péptido se encuentra entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de las mismas, (2) un péptido capaz de enlazar miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia flEMLf2SLf3f4LL, (SEC ID NO: 455) , en donde fa es M o I, f2 es cualquier aminoácido, f3 es L o F, f4 es E, Q o D; y en donde el péptido se encuentra entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos; (3) un péptido capaz de enlazar miostatina en donde el péptido comprende la secuencia Lg1g2LLg3g4L, (SEC ID NO:456) , en donde gi es Q, D o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, g4 es L, W, F o Y, y en donde el péptido se encuentra entre 8 y 50 aminoácidos en longitud y sales fisiológicamente aceptables de los mismos; (4) un péptido capaz de enlazar miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia (SEC ID NO: 57) , en donde a es R o D, h2 es cualquier aminoácido, h3 es A, T, £3 o Q, h4 es L o , h5 es L o S, h6 es cualquier aminoácido, 7 es F o E, h8 es W, F o C, h9 es L, F, M o K, y en donde el péptido se encuentra entre 9 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos . En una modalidad, los agentes de enlace de la presente invención comprenden además al menos un vehículo tal como un polímero o un dominio Fe, y pueden comprender además al menos una secuencia de agente de ligado. En esta modalidad, los agentes de enlace de la presente invención se construyen de manera que al menos un péptido que se enlaza a miostatina se una covalentemente a al menos un vehículo. El péptido o péptidos se unen directamente o indirectamente a través de una secuencia de agente de ligado al vehículo en el C-terminal, N-terminal o a una cadena lateral de aminoácidos del péptido. En esta modalidad, los agentes de enlace de la presente invención tienen la siguiente estructura generalizada: (X1) a-F1- (X2) b/ o multímeros de los mismos; en donde F1 es un vehículo, y X1 y X2 se seleccionan independientemente a partir de -(L^c-P1; - (L1) e-P1- (L2) d-P2- (L3) xe-P3 ; y - (L^c-P1- (L2)d-P2- (L3)e-P3- (L )f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de enlazar miostatina, y L1, L2, L3 y L4 son cada uno agentes de ligado; , b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b sea 1. En una modalidad de los agentes de enlace que tienen esta estructura generalizada, los péptidos P1, P2, P3 y P4 pueden seleccionarse independientemente a partir de uno o más de cualquiera de los péptidos que comprenden las secuencias proporcionadas arriba. P1, P2, P3 y P4 pueden seleccionarse a partir de uno o más péptido que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO:353, SEQ ID NO.-354, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456, o la SEQ ID NO: 457. En una modalidad adicional, los vehículos de agentes de enlace que tienen la fórmula general de arriba son dominios Fe . Los péptidos son por lo tanto, fusionados a un dominio Fe ya sea directamente o indirectamente proporcionando de este modo pepticuerpos . Los pepticuerpos de la presente invención exhiben una afinidad de enlace alta para la miostatina y pueden inhibir la actividad de la miostatina ambas demostradas por ensayos in vitro y pruebas in vivo en animales proporcionados en la presente. La presente invención proporciona también moléculas de ácidos nucleicos que comprenden polinucleótidos que codifican a los peptidos, pepticuerpos, variantes de peptidos y pepticuerpos y derivados de la presente invención. Ejemplos de secuencias de nucleótidos se proporcionan abajo.
Variantes y derivados de peptidos y pepticuerpos Los agentes de enlace de la presente invención abarcan también variantes y derivados de los peptidos y pepticuerpos descritos en la presente. Puesto que ambos péptidos y pepticuerpos de la presente invención pueden describirse en términos de su secuencia de aminoácidos, puede decirse que los términos "variantes" y "derivados" se aplican a un péptido solo, o un péptido como un componente de un pepticuerpo. Como se usa en la presente, el término "variantes de péptido" se refiere a péptidos o pepticuerpos que tienen uno o más residuos de aminoácidos insertados, eliminados o sustituidos en la secuencia de aminoácidos original y que mantienen su capacidad para enlazar miostatina y modificar su actividad. Como se usa en la presente, los fragmentos de los péptidos o pepticuerpos se incluyen dentro de la definición de "variantes" . Se entiende que cualquiera del péptido o pepticuerpo dado puede contener uno, dos o los tres tipos de variantes. Las variantes insercionales o substitucionales pueden contener aminoácidos naturales, así como aminoácidos que no se presentan naturalmente o ambos . Las variantes de péptido o pepticuerpos incluyen también péptidos y pepticuerpos maduros en donde las secuencias de señal o líder se remueven, y las proteínas resultantes que tienen residuos aminoterminales adicionales, en los que los aminoácidos pueden ser naturales o no naturales. Se contemplan los pepticuerpos con un residuo metionilo adicional en la posición -1 de aminoácidos (pepticuerpo Met"1) son pepticuerpos con residuos de lisina y metionina adicionales en las posiciones -2 y -1 (Met"2-Lys_1) . Las variantes que tienen Met, et-Lys, residuos Lys (en general, uno o más residuos básicos) son particularmente útiles para la producción de la proteína recombinante mejorada en células hospedadoras bacterianas. Las variantes de péptido o pepticuerpos de la presente invención incluyen también los péptidos que tienen residuos de aminoácidos adicionales que surgen del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, el uso de vectores comercialmente disponibles que expresan un polipéptido deseado como parte del producto de fusión glutation-S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un residuo de glisina adicional en la posición 1 del aminoácido después de desdoblar el componente GST del polipéptido deseado. Las variantes que resultan de la expresión en otros sistemas del vector se contemplan también aquellos que incluyen en donde las etiquetas de histidina se incorporan en la secuencia de aminoácidos, generalmente en el término carboxi y/o amino de la secuencia. En un ejemplo, las variantes insercionales se proporcionan cuando uno o más residuos de aminoácidos, aminoácidos que se presentan naturalmente o no se presentan naturalmente, se añaden a una secuencia de aminoácidos del peptido. Las inserciones pueden localizarse en ambos términos de la protema, o pueden ser colocadas dentro de las regiones internas de la secuencia de los aminoácidos del pepticuerpo. Las variantes insercionales con residuos adicionales en ambos términos pueden incluir por ejemplo, las proteínas de fusión y proteínas que incluyen etiquetas o identificadores de aminoácidos. Las variantes insercionales incluyen péptidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos se añaden a la secuencia de aminoácidos del peptido o fragmento del mismo. Las variantes insercionales incluyen también las proteínas de fusión en donde el término amino y/o carboxi del péptido o pepticuerpo se fusiona a otro polipéptido, un fragmento del mismo o aminoácidos que no se reconocen generalmente por ser parte de cualquier secuencia de la proteína específica. Ejemplos de tales proteínas de fusión son polipéptidos inmunogénicos , proteínas con vida media de circulación prolongadas, tales como regiones constantes de inmunoglobulina , proteínas marcadoras, proteínas o polipéptidos que facilitan la purificación del péptido o pepticuerpo deseado y las secuencias del polipéptido que promueven la formación de proteínas multiméricas (tales como porciones de cremallera de leucina que son útiles en la formación/estabilidad del dímero) . Este tipo de variante insercional tiene generalmente toda o una porción substancial de la molécula nativa enlazada al término N o C, toda o una porción de un segundo polipéptido. Por ejemplo, las proteínas de fusión emplean típicamente secuencias líderes de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en una hospedadora heteróloga. Otra proteína de fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo tal como un epítopo de anticuerpo para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de desdoblamiento en o cerca del empalme de fusión facilitará la remoción del polipéptido externa después de la purificación. Otras fusiones útiles incluyen dominios funcionales tales como sitios activos de enzimas, dominios de glicosilación, señales de direccionamiento celular o regiones de transmembrana. Existen varios sistemas de expresión de la proteína de fusión disponibles comercialmente que pueden ser usados en la presente invención. Los sistemas particularmente útiles incluyen pero no se limitan al sistema de glutation-S-transferasa (GST) (Pharmacia) , el sistema de la proteína que enlaza maltosa (NEB, Beverly, MA) , el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT) , y el sistema 6X His (Qiagen, Chatsworth, CA) . Estos sistemas son capaces de producir péptidos recombinantes y/o pepticuerpos que producen solo un número pequeño de aminoácidos adicionales que improbablemente afectan significativamente la actividad del péptido o el pepticuerpo. Por ejemplo, tanto el sistema FLAG y el sistema 6xHis añade solamente las secuencias cortas, ambas de las cuales se conocen por ser poco antigénicas y que no afectan adversamente el pliegue de un polipéptido para su conformación nativa. Otra fusión en la terminal N que se contempla útil es la fusión de dipeptidos Met-Lys en la región terminal N de la proteína o los péptidos. Tal fusión puede producir incrementos beneficios en la actividad o expresión de la proteína. Otros sistemas de fusión producen híbridos del polipéptido cuando es deseable cortar el compañero de fusión del péptido deseado o pepticuerpo. En una modalidad, el compañero de fusión se enlaza al pepticuerpo recombinante mediante una secuencia del péptido que contiene una secuencia de reconocimiento específico para una proteasa. Ejemplos de secuencias adecuadas son reconocidas por la proteasa del virus de grabado del tabaco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) o factor Xa (New England Biolabs, Beverly, MA) . La invención proporciona también polipéptidos de fusión que comprenden todos o parte de un péptido o pepticuerpo de la presente invención en combinación con el factor del tejido truncado (tTP) . El tTF es un agente de direccionamiento vascular que consiste de una forma truncada de una proteína que induce la coagulación humana que actúa como un agente que coagula los vasos sanguíneos del tumor descrito en la patente de los E.U. Nos: 5,877,289, 6,004,555, 6,132,729, 6,132,730, 6,156,321 y la Patente europea No. EP 0988056. La fusión de tTF al péptido o al pepticuerpo de anti-miostatina o fragmentos de los mismos facilita el suministro de antagonistas de anti-miostatina en las células de direccionamiento, por ejemplo, células del músculo del esqueleto, células del músculo cardiaco, fibroblastos, pre- adipocitos y posiblemente adipocitos.
En otro aspecto, la invención proporciona variantes de eliminación en donde se remueven uno o más residuos de aminoácidos en un péptido o pepticuerpo. Las eliminaciones pueden ser afectadas en uno o ambos términos del pepticuerpo, o de la eliminación de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del pepticuerpo. Las variantes de eliminación incluyen todos los fragmentos de un péptido o pepticuerpo. Aún en otro aspecto, la invención proporciona variantes de substitución de péptidos y pepticuerpos de la invención. Las variantes de la substitución incluyen aquellos péptidos y pepticuerpos en donde uno o más residuos de aminoácidos se remueven y reemplazan con uno o más aminoácidos alternativos, en donde los aminoácidos pueden presentarse naturalmente o no naturalmente. Las variantes substitucionales generan péptidos o pepticuerpos que son "similares" para el péptido original o pepticuerpo en el que las dos moléculas tienen un cierto porcentaje de aminoácidos que son idénticos. Las variantes de substitución incluyen substituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 y 20 aminoácidos dentro de un péptido o pepticuerpo, en donde el número de substituciones puede ser de hasta diez por ciento de los aminoácidos del péptido o pepticuerpo. Sin embargo, en un aspecto, las sustituciones son conservadoras en la naturaleza, la invención abarca sustituciones que tambpoco son conservadoras e incluyen también aminoácidos no convencionales . La identidad y similitud de los péptidos relacionados y pepticuerpos pueden ser calculados fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. ., ed. , Academia Press, New York (1993); Computer Analysis- of Sequence Data, parte 1, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., ediciones., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academia Press (1987) ; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., ediciones., M. Stockton Press, New York (1991); y Carillo et al.,SIAM J. Applied Math, 48:1073 (1988) . Los métodos preferidos para determinar la relación o porcentaje de identidad de dos péptidos o polipéptidos , o un polipéptido y un péptido se diseñan para proporcionar la coincidencia más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en los programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programas de computadora preferidos para determinar la identidad entre las dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete de programa GCG que incluye GAP (Devereux et al., Nucí. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI , BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). El programa PLASTX está disponible públicamente a partir del Centro nacional para la Información de la Biotecnología (NCBI) y otras fuentes (Manual BLAST, Altschul et al, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, supra (1990)). El algoritmo Smith Waterman bien conocido puede usarse también para determinar la identidad. Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en la coincidencia de solo una región corta de dos secuencias, esta región alineada pequeña puede tener una identidad de secuencia muy alta aún a pesar de que no exista una relación entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, en ciertas modalidades, el método de alineación seleccionado resultará en un alineación que alcanza al menos el diez por ciento de la longitud completa del polipéptido de direccionamiento comparado, es decir, al menos 40 aminoácidos contiguos en donde las secuencias de al menos 400 aminoácidos se comparan, 30 aminoácidos contiguos en donde las secuencias de al menos 300 hasta aproximadamente 400 aminoácidos se comparan, al menos 20 aminoácidos contiguos en donde las secuencias de 200 hasta aproximadamente 300 aminoácidos se comparan, y al menos 10 aminoácidos contiguos en donde las secuencias de aproximadamente 100 a 200 aminoácidos que se comparan. Por ejemplo, usando el algoritmo de computación GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) , dos polipéptidos para los cuales el porcentaje de la identidad de secuencia que va a determinarse se alinea para la coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (el "espacio coincidente" determinado por el algoritmo) . En ciertas modalidades, una penalidad de abertura de espacio (que se calcula típicamente como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es el registro o número asignado para cada coincidencia perfecta de los aminoácidos mediante la matriz de comparación particular) y una penalidad de extensión de espacio (que es usualmente de 1/10 veces la penalidad de abertura de espacio) así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan junto con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff et al, Atlas of Protein Sequence and structure, 5 (3) (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc . Nati Acad Sci . USA, 89:10915-10919 81992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) se usa también mediante el algoritmo. En ciertas modalidades por ejemplo, los parámetros para comparar la secuencia del polipéptido pueden ser elaborados con lo siguiente: Algoritmo: Meedleman et al., J. Mol. Biol . , 48:443-453 (1970); matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., supra (1992); penalización por espacio: 12; penalización por longitud del espacio: 4; umbral de similitud: 0, junto con la no penalización para los espacios finales. En ciertas modalidades, los' parámetros para las comparaciones de la secuencia de la molécula del polinucleótido (opuesta a una secuencia de aminoácidos) pueden elaborarse con los siguientes: Algoritmo: Needleman et al., supra (1970); matriz de comparación: coincidencias = + 10, comparaciones = 0; penalización por espacio: 50; penalización por longitud del espacio: 3. Otros algoritmos de ejemplo, penalizaciones para la abertura de espacio, penalizaciones para la extensión del espacio, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc, pueden usarse incluyendo aquellos establecidos en el Manual del programa, paquete Wisconsin versión 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares serán aparentes por aquellos expertos en el arte y dependerán de la comparación especifica que va a hacerse tales como ADN a ADN, proteína a proteína, proteína a ADN; y adicionalmente ya sea que la comparación se encuentre entre pares dados de secuencias (en cuyo caso se prefiere generalmente GAP o BestFit) o entre una secuencia y una base de datos grande de secuencias (en cuyo caso se prefiere FASTA o BLASTA) . Los estereoisomeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales (que se presentan naturalmente) , aminoácidos que no se presentan naturalmente tales como aminoácidos a, a disustituidos, aminoácidos N alquilo, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes adecuados para los péptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos que no se presentan naturalmente incluyen por ejemplo: ácidos aminoadípicos , beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido aminobutírico, ácido piperidínico, ácido aminocaproico, ácido aminoheptanóico, ácido aminoisobutxrico, ácido aminopimélico, ácido diaminobutírico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo- idroxilisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, origina, 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetilisina, e-?-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3 -metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina y otros aminoácidos similares y aminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . Los residuos que se presentan naturalmente pueden dividirse en clases (traslapadas) basadas en propiedades de cadena lateral comunes . 1) hidrofóbico neutral: Met, Ala, Val, Leu, lie. Pro, Trp, Met, Phe; 2) Polar neutral: Cus, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Gly, 3) ácido: Asp, Glu, 4) básico: His, Lys, Arg, 5) residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro y 6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras, que producen péptidos que tienen características funcionales y químicas similares a aquellas del péptido original. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen intercambiar un miembro de una de las clases anteriores para otro miembro de la misma clase. Los cambios conservadores pueden abarcar residuos de aminoácidos no convencionales, que se incorporan típicamente mediante la síntesis del péptido químico en lugar de la síntesis en los sistemas biológicos . Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o reversibles de porciones de aminoácidos.
Las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de esta clase para un miembro de otra clase. Estos cambios pueden resultar en una modificación substancial en las características químicas y/o funcionales de los péptidos. Al hacer tales cambios de acuerdo a ciertas modalidades, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido ha sido asignado un índice hidropático basándose en su hidrofobicidad y características de carga: Estas son: isoleucina (+4.5), valina (+4.2), leucina (+3.8), fenilalanina (+2.8), cisteína/cistina (+2.5), metionina (+1.9), alanina (+1.8), glicina (-0.4), treonina (-0.7), serina (-0.8), triptofano (-0.9), tirosina (-1.3), prolina (-1.6), histidina (-3.2), glutamato (-3.5), glutamina (-3.5), aspartato (-3.5), asparagina (-3.5), lisina (-3.9) y arginina (-4.59. La importancia del índice de aminoácidos hidropático al conferir la función biológica interactiva en una proteína se entiende en el arte. Kyte et al, J". Mol., Biol . , 157 : 105-131 (1982) . Se conoce que " ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar o registro que mantiene una actividad biológica similar. Al hacer los cambios basándose en el índice hidropático, en ciertas modalidades, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos se encuentran dentro de ± 2. En ciertas modalidades, se incluyen aquellos que se encuentran dentro de ± 1, y en ciertas modalidades se incluyen dentro de ± 0.5. Se comprende también en el arte, que la substitución de tales aminoácidos puede hacerse efectivamente basándose en la hidrofilicidad, particularmente, cuando el péptido o pepticuerpo biológicamente funcional asi creado pretende usarse en las modalidades inmunológicas como en el presente caso. En ciertas modalidades, la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes se correlaciona con su antigenicidad e inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados para estos residuos de aminoácidos: arginina (+3.0), lisina (+3.0), aspartato (+3.0 ± 1), glutamato (+3.0 ± 1), serina (+0.3), asparagina (+0.2), glutamina (+0.2), glicina (0), treonina (-0.4), prolina (-0.5 ± 1), alanina (-0.5), histidina (-0.5), cisteína (-1.0), metionina (-1.3), valina (-1.5), leucina (-1.8), isoleucina (-1.8), tirosina (-2.3), fenilalanina (-2.5) y triptofano (-3.4). Al hacer los cambios basándose en los valores de hidrofilicidad similares, en ciertas modalidades, la sustitución de lso aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad se encuentran dentro de + 2 se incluyen en ciertas modalidades, se incluyen aquellos que se encuentran dentro de ± 1, y en ciertas modalidades se incluyen aquellos que se encuentran dentro de ± 0.5. Se pueden identificar también epítopos a partir de las secuencias de aminoácidos principales basándose en la hidrofilicidad. Estas regiones son referidas también como "regiones del núcleo epitópico" . Ejemplos de sustituciones de los aminoácidos se establecen en la Tabla 1 de abajo.
Sustituciones de aminoácidos Residuos Ejemplo de sustituciones Sustituciones originales preferidas Ala Val, Leu, lie Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln, Glu, Asp Gln Asp Glu, Gln, Asp Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn, Glu, Asp Asn Glu Asp, Gln, Asn Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg lie Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu Norleucina Leu Norleucina. lie, Val, lie Met, Ala, Phe Lys Arg, ácido 1,4 diamino- Arg butírico, Gln, Asn Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Val, lie, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val lie, Met, Leu, Phe, Ala, Leu Norleucina Un experto en el arte será capaz de producir variantes de péptidos y pepticuerpos de la presente invención mediante por ejemplo, una sustitución aleatoria, y probar el péptido resultante o pepticuerpo para la actividad de enlace usando ensayos descritos en la presente. Adicionalmente, un experto en el arte puede revisar los estudios de la función de la estructura o el análisis de la estructura tridimensional para identificar residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. En vista de tal comparación, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponde a los residuos de los aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en el arte puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes pronosticados . Las variantes pueden entonces ser separadas por exclusión usando ensayos de actividad descritos en la presente. Una variedad de publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Ver Moult J., Curr. Op. en Biotech, 7 (4) :422-427 (1996) , Chou et al, Biochemistry, 13 (2) :222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2) :211-222 (1974) ; Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. , 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem. , 47:251-276 y Chou et al, Biophys . J". , 26:367-384 (1979). Por otra parte, los programas de computadora están disponibles actualmente para asistir en la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en un modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor al 30%, o similitud mayor al 40% tienen frecuentemente topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos de la estructura de la proteina (PDB) ha proporcionado una predictabilidad mejorada de la estructura secundaria, que incluye el número potencial de pliegues dentro de una estructura de la proteína. Ver Holm et al., Nucí. Acid. Res., 27 (1) :244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol. 7(3):369-376 (1997)) que existe un número limitado de pliegues en una proteína dada y que una vez que un número crítico de estructuras han sido resueltas, la predicción estructural se volverá dramáticamente más exacta.
Los métodos adicionales de la estructura secundaria de predicción incluye "enhebrar" (Jones, D., Curr. Opin. struct. Biol., 7 (3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1) :15-19 (1996)), "análisis del perfil" (Bowie et al, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth Enzym. , 183 :146-159 (1990) ; Gribskov et al., Proc Nat . Acad. Sci, 84 (13) :4355-4358 (1987)), y "ligado evolutivo » (ver Holm, supra (1999) , y Brenner, supra (1997) . En ciertas modalidades, las variantes del péptido o pepticuerpo incluyen variantes de glicosilacion en donde uno o más sitios de glicosilacion tales como un sitio de glicosilacion N enlazado ha sido añadido al pepticuerpo. Un sitio de glicosilacion N enlazado se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de los aminoácidos designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácidos excepto prolina. La sustitución o adición de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un sitio nuevo potencial para la adición de una cadena de carbohidratos N enlazado. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia removerán una cadena de carbohidratos N enlazada. Se proporciona también una reconfiguración de cadenas de carbohidratos N enlazadas en donde uno o más sitios de glicosilación N enlazados (típicamente aquellos que se presentan naturalmente) se eliminan y se crean uno o más nuevos sitios N enlazados. La invención proporciona también "derivados" de los péptidos o pepticuerpos de la presente invención. Como se usa en la presente, el término "derivado" se refiere a las modificaciones distintas o adicionales a, inserciones, eliminaciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que mantienen la capacidad para enlazar miostatina. Preferiblemente, las modificaciones hechas a los péptidos de la presente invención para producir derivados son covalentes por naturaleza, e incluyen por ejemplo, un enlace químico con polímeros, lípidos, otros orgánicos y porciones inorgánicas. Los derivados de la invención pueden ser preparados para incrementar la vida media de circulación de un pepticuerpo, o puede ser diseñado para mejorar la capacidad de direccionamiento del pepticuerpo en las células deseadas, tejidos u órganos.
La invención abarca también agentes que enlazan derivados modificados covalentemente para incluir uno o más uniones de polímeros solubles en agua tales como polietilen glicol, polioxietilen glicol o polipropilen glicol, descritos en la patente de los E.U. Nos: 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 y 4,179,337. Aún otros polímeros útiles conocidos en el arte incluyen monometoxi-polietilen glicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli- (N-vinil-pirrolidona) -polietilen glicol, homopolímeros de propilen glicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilado (por ejemplo, glicol) y alcohol polininílico, así como mezclas de estos polímeros. Se prefieren particularmente los pepticuerpos modificados covalentemente con subunidades de polietilen glicol (PEG) . Los polímeros solubles en agua pueden ser enlazados en posiciones específicas, por ejemplo, en el término amino de los pepticuerpos, o unidos aleatoriamente en una o más cadenas laterales del polipéptido. El uso de PEG para mejorar la capacidad terapéutica para enlazar agentes, por ejemplo, pepticuerpos y para anticuerpos humanizados en particular, se describen en la patente de los E.U. No. 6, 133, 426 por Gonzales et al, emitida el 17 de Octubre de 2000. La invención contempla también la derivación del péptido y/o porción del vehículo de los agentes que enlazan miostatina. Tales derivados pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica y similar de los compuestos. Las porciones pueden eliminar alternativamente o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de los compuestos y similares. Ejemplos de derivados incluyen compuestos en los que : 1. El derivado o alguna porción del mismo es cíclico. Por ejemplo, la porción de péptido puede modificarse para contener dos o más residuos Cys (por ejemplo, en el agente de ligado) , que podrían ciclizarse mediante la formación de enlace bisulfuro. 2. El derivado se retícula o se vuelve capaz de reticular entre las moléculas. Por ejemplo, la porción del péptido puede modificarse por contener un residuo Cys y ser capaz entonces de formar un enlace bisulfuro intermolecular con una molécula tipo. El derivado puede también ser reticulado a través de su término C. 3. Uno o más agentes de ligado peptidilo [-C(0)NR-] (enlaces) se reemplazan por una ligadura no peptidilo. Ejemplos de ligaduras no peptidilos son -CH2-carbamato [-CH2-OC(0) R-], fosfonato, CH2-sulfonamida [-CH2-S (O) 2NR-] . urea [-NHC (O) H-] , -CH2-amina secundaria y péptido alquilado [-C(0)NRs en donde R6 es un alquilo inferior] . 4. El término N se somete a una derivación. Típicamente, el término N puede ser acilado o modificado a una amina sustituida. Ejemplos de grupos derivados N-terminal incluyen -NRR3. (diferentes a - H2) , -NRC(0)R!, - RC (O) ORi, - RS(0)2Ri, -NHC (0) NHRi, succinimida o benciloxicarbonil-NH- (CBZ- H) -) en donde R y Rl son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior y en donde el anillo fenilo puede ser sustituido con 1 a 3 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo Ci-C4 alcoxi C1-C4, cloro y bromo. 5. El término C libre se somete a una derivación. Típicamente, el término C se esterifica o amida. Por ejemplo, se pueden usar métodos descritos en el arte para añadir ( H-CH2-CH2-NH2) 2 a los compuestos de esta invención en el término C. Al igual, se pueden usar métodos descritos en el arte para añadir -NH2 (o "cierre" con un grupo - H2) a compuestos de esta invención en el término C. Ejemplos de grupos derivados C terminal incluyen "t- or ejemplo, -C(0)R2 en donde R2 es un alcoxi inferior o - R3R4 en donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo Ci-C8 (preferiblemente alquilo C3.-C4) . 6. Un enlace bisulfuro se reemplaza con otro, preferiblemente más estable, porción reticulada (por ejemplo, un alquileno) . Ver por ejemplo, Bhatnagar et al., J Med Chem 39:3814-9 (1996), Alberts et al, Thirteenth Am Pep Symp 357-9 (1993) . i 7. Uno o más residuos de aminoácidos individuales se modifican. Varios agentes de derivación se conocen por reaccionar específicamente con las cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales descritos en detalle abajo . Los residuos de lisinilo y los residuos amino terminales pueden reaccionar con anhídrido succínico o de otros ácidos carboxílicos que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar los residuos que contienen amino alfa incluyen imidoésteres tales como metil picolinimidato, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2, -pentanediona y una reacción catalizada por la transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo pueden modificarse mediante la reacción con cualquiera de uno o una combinación de varios reactivos convencionales que incluyen fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivación de los residuos de arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo epsilon-amino de la arginina. La modificación específica de los residuos de tirosilo ha . sido estudiada extensivamente con particular interés introduciendo etiquetas espectrales en los residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano . Más comúnmente, el N-acetilimidazol y el tetranitrometano se usan para formar especies de O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente . Los grupos de cadena lateral carboxi (aspartilo o glutamilo) pueden ser modificados selectivamente mediante una reacción con carbodiimidas (R' -N=C=N-R' ) tal como 1-ciclo exil-3 - (2 -morfolinil- (4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia-4 , 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos aspartilo y glutamilo pueden convertirse a residuos asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones de amonio . Los residuos de glutaminilo y asparaginilo pueden ser desanudados a los residuos aspartilo y glutamilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desaminan bajo condiciones ligeramente ácidas . Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención. Los residuos de cisteinilo pueden ser remplazados por residuos de aminoácidos u otras porciones ya sea para eliminar los enlaces de bisulfuro o, recíprocamente, para estabilizar la reticulación. Ver por ejemplo, Bhatnagar et al . , (supra) . La derivación con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de -soporte insoluble al agua o para otros vehículos macromoleculares . Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen por ejemplo, 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehido, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ásteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales que incluyen esteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano. Los agentes de derivación tales como metil-3-[(p-azidofenil) ditio] propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los substratos reactivos descritos en la patente de los E.U. No. 3,969,287, 3,691,016, 4,195,128, 4, 247,642, 4,229, 537 y 4,330,440 se emplean para la inmovilización de la proteína. Los grupos carbohidrato (oligosacáridos) pueden unirse convenientemente a los sitios que son conocidos por ser sitios de glicosilación en las proteínas. Generalmente, los oligosacáridos ligados a O, se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) mientras que los oligosacáridos ligados a N se unen a los residuos de asparagina (Asn) cuando forman parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos que se presentan naturalmente distintos a la prolina. Las estructuras de los ooligosacáridos ligados a O y ligados a N y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente es el ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico) . El ácido siálico es usualmente el residuo terminal de ambos, oligosacáridos ligados a 0 y ligados a N y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades acidas al compuesto glicosilado. Tal sitio (s) pueden incorporarse en el agente de ligado de los compuestos de esta invención y se glicosilan preferentemente por una célula durante la producción recombinante de los compuestos del polipéptido (por ejemplo, en células de mamíferos tales como CHO; BHK, COS) . Sin embargo, tales sitios pueden además ser glicosilados mediante procedimiento semi-sintéticos o sintéticos conocidos en el arte. Otras modificaciones posibles incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [ver por ejemplo, Creighton, Proteins: Structure and olecule Properties ( . H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983) ] . Los compuestos de la presente invención pueden cambiarse también al nivel del ADN. La secuencia de ADN de cualquier porción de compuesto puede cambiarse a codones más compatibles con la célula hospedadora seleccionada. Para la E. coli que es la célula hospedadora preferida, los codones optimizados se conocen en el arte. Los codones pueden ser sustituidos para eliminar los sitios de restricción o para incluir los sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar a procesar el ADN en la célula hospedadora seleccionada. El vehículo, agente de ligado y secuencias de ADN del péptido pueden modificarse para incluir cualquiera de los cambios de la secuencia anterior. Los derivados adicionales incluyen análogos que no son péptidos que proporcionan una estructura estabilizada o también se contempla una biodegradación disminuida. Los análogos miméticos del péptido pueden ser preparados basándose en un péptido inhibidor seleccionado mediante el reemplazo de uno o más residuos mediante porciones de no péptido. Preferiblemente, las porciones de no péptido permiten al péptido mantener su confirmación natural o estabilizar un preferida, por ejemplo, confirmación bioactiva que mantiene la capacidad para reconocer y enlazar miostatina. En un aspecto, los análogos/miméticos resultantes exhiben una afinidad de enlace incrementada para la miostatina. Un ejemplo de los métodos para la preparación de análogos miméticos de no péptido a partir de los péptidos se describe en Nachman et al., Regul Pept 57:359-370 (1995). Si se desea los péptidos de la invención pueden modificarse, por ejemplo, mediante glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación, o mediante la creación de sales de adición ácidas, amidas, ésteres, en particular esteres en la terminal C y derivados N acilo de los péptidos de la invención. Los pepticuerpos pueden también ser modificados para crear derivados de péptido formando complejos covalentes o no covalentes con otras porciones. Los complejos que se enlazan covalentemente pueden prepararse enlazando las porciones químicas a los grupos funcionales en las cadenas laterales de Leo aminoácidos que comprende los pepticuerpos, o a los términos N o C. En particular, se anticipa que los péptidos pueden ser conjugados a un grupo reportero, que incluye pero no se limita a una radioetiqueta, a una etiqueta fluorescente, a una enzima (por ejemplo, que cataliza a la reacción colorimétrica o fluorométrica) , a un substrato, matriz sólida, o un portador (por ejemplo, biotina o avidina) . La invención proporciona por lo tanto, una molécula que comprende una molécula del pepticuerpo, en donde la molécula comprende además, preferiblemente un grupo reportero seleccionado del grupo que consiste de una radioetiqueta, una etiqueta fluorescente, una enzima, un substrato, una matriz sólida y un portador. Tales etiquetas son bien conocidas por aquellos expertos en el arte, por ejemplo, se contemplan particularmente las etiquetas de biotina. El uso de tales etiquetas es bien conocido por aquellos expertos en el arte y se describe en, por ejemplo, la patente de los E.U. Nos: 3,817,837, 3,850,752, 3,996,345 y 4,277,437. Otras etiquetas que serán útiles pero no se limitan a etiquetas radioactivas, etiquetas fluorescentes y etiquetas quimioluminiscentes . El uso concerniente a las patentes de lo E.U. de tales etiquetas incluye por ejemplo, las patente de los E.U. Nos: 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350 y 3,996,345. Cualquiera de los anticuerpos de la presente invención puede comprender una, dos o más de cualquiera de estas etiquetas.
Métodos para elaborar péptidos y pepticuerpos . Los péptidos de la presente invención pueden generarse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, tales péptidos pueden sintetizarse en solución o en un soporte sólido de acuerdo con las técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos se encuentran disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con los protocolos conocidos. Ver por ejemplo, Stewart y Young (supra) ; Tam et al., J. An Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifiled, Science 232:341-347 81986) Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer, eds . , Academia Press, New York, 1-284; Banary et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 81987); y la patente de los E.U. No: 5,424,398 cada una de las cuales está incorporada en la presente por la referencia. Los métodos de síntesis de péptidos en fase sólida usan un copoli (estireno-divinilbenceno) que contiene 0.1-1.0 mM de aminas/g de polímero. Estos métodos para la síntesis del péptido usan butiloxicarbonil (t-BOC) o protección 9-fluorenilmetoxi-carbonil (FMC) de grupos alfa-amino. Ambos métodos involucran la síntesis en etapas por medio del cual un aminoácido sencillo se añade a cada etapa de partida a partir del término C del péptido (Ver, Coligan et al., Curr Prot Immunol. Wiley Interscience , 1991, Unidad 9) . Al término de la síntesis química, el péptido sintético puede ser desprotegido para remover los grupos que bloquean los aminoácidos t-BOC y FMOC y se desdoblan a partir del polímero mediante el tratamiento con ácido a temperatura reducida (por ejemplo, HF-10% de anisol líquido durante aproximadamente 0.25 a 1 horas a 0°C) . Después de la evaporación de los reactivos, los péptidos se extraen a partir del polímero con una solución de ácido acético al 1% que después se liofiliza para producir el material crudo. Esto puede purificarse normalmente mediante técnicas como la filtración con gel en Sephadex G-15 usando ácido acético al 5% como un solvente. La liofilización de las fracciones apropiadas de la columna producirán péptidos homogéneos o derivados de péptido, que puede después ser caracterizados mediante tales técnicas estándar como el análisis de aminoácidos, cromatografía de capa delgada, cromatografía líquida de alta resolución, espectroscopia de absorción ultravioleta, rotación molar, solubilidad y se cuantifica mediante la degradación Edman por fase sólida. Las técnicas de despliegue de fagos pueden ser particularmente efectivas para identificar los péptidos de la presente invención como se describe arriba. De manera breve, se prepara una colección de fagos (usando por ejemplo, 13 mi, fd, o un fago lambda) , desplegando insertos de 4 a 80 aminoácidos aproximadamente. Los insertos pueden representar por ejemplo, un arreglo predispuesto o degenerado completamente . Los insertos que producen fagos que enlazan al antígeno deseado se seleccionan y este proceso se repite a través de varios ciclos de reselección del fago que enlaza al antígeno deseado. La secuenciación del ADN se conduce para identificar las secuencias de los péptidos expresados. La porción lineal mínima de la secuencia que enlaza a los antígenos deseados puede determinarse en este forma. El procedimiento puede repetirse usando una colección predispuesta que contiene insertos que contienen parte o toda de la porción lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales en la dirección ascendente o descendente de los mismos. Estas técnicas pueden identificar péptidos de la invención incluso con una afinidad de enlace mayor para la miostatina en la que los agentes ya están identificados. Independientemente de la manera en la cual los péptidos se preparan, una molécula de ácidos nucleicos que codifica a cada péptido puede ser generada usando procedimientos de ADN recombinante estándar. La secuencia de nucleótidos de tales moléculas puede manipularse como sea apropiado sin cambiar la secuencia de aminoácidos que codifican para considerar la degeneración del código de los ácidos nucleicos así como considerar la preferencia del codón, en particular, las células hospedadoras . La presente invención proporciona también moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican a los péptidos y pepticuerpos de la presente invención. Estas moléculas de ácidos nucleicos incluyen vectores y constructos que contienen polinucleótidos que codifican a los péptidos y pepticuerpos de la presente invención, así como variantes de péptidos y pepticuerpos y derivados. Se proporcionan ejemplos de moléculas de ácidos nucleicos en los ejemplos de abajo. Las técnicas de ADN recombinante proporcionan también un método conveniente para preparar pepticuerpos de longitud completa y otros agentes que enlazan polipéptidos grandes de la presente invención, o fragmentos de los mismos. Un polinucleótido que codifica a un pepticuerpo o fragmento puede ser insertado en un vector de expresión que puede a su vez insertarse en una célula hospedadora para la producción de los agentes de enlace de la presente invención. La preparación de los ejemplos de pepticuerpos de la presente invención se describe en el ejemplo 2 de aba o. Una variedad de sistemas hospedadores/vectores de expresión pueden utilizarse para expresar los péptidos y pepticuerpos de la invención. Estos sistemas incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmidos o vectores de expresión de ADN cósmidos, levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insecto infectadas con los vectores de expresión del virus (por ejemplo, baculovirus) , sistemas de células de plantas transíectadas con vectores de expresión del virus (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor) CaMV, virus mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, Ti o plásmido pB 322) o sistemas de células animales. Una línea celular hospedadora preferida es una cepa E. coli 2596 (ATCC# 202174) , usada para la expresión de pepticuerpos descrita abajo en el ejemplo 2. Las células de mamíferos que son útiles en las producciones de la proteína recombinante incluyen pero no se limitan a células VERO, células HeLa, líneas de células de ovarios de hámster chino (CHO) , células COS (tales como COS-7) , W138, BHK, HepG2 , 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y células 293. El término "vector de expresión" se refiere a un plásmido, fago, virus o vector para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de polinucleótidos . Un vector de expresión puede comprender una unidad transcripcional que comprende un grupo de (1) un elemento genético o elementos que tienen un papel regulador en la expresión del gen, por ejemplo, promotores o mejoradores, (2) una secuencia estructural que codifica el agente de enlace que se transcribe en el mAR y se traduce en la proteína, y (3) iniciación de la transcripción apropiada y terminación de las secuencias . Las unidades estructurales pretenden usarse en levaduras o los sistemas de expresión eucarióticas incluyen preferiblemente una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida mediante una célula hospedadora. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, ¦ puede incluir un residuo metionilo amino terminal. Este residuo puede o no ser desdoblado posteriormente a partir de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto de péptidos final . Por ejemplo, los péptidos y pepticuerpos pueden ser expresados recombinantemente en levaduras que usan sistemas de expresión comercialmente disponibles, por ejemplo, el Sistema de Expresión Pichia (Invitrogen, San Diego, CA) , siguiendo las instrucciones de fabricación. Este sistema también cuenta con la secuencia pre-pro-alfa para la secreción directa, pero la transcripción de los insertos se conducen mediante el promotor de la oxidasa del alcohol (AOXI) luego de la inducción por el metanol . El péptido secretado se purifica a partir del medio de crecimiento de levaduras usando los métodos usados para purificar el péptido a partir de sobrenadantes de células de mamíferos y bacterianas . Alternativamente, el cADN que codifica al péptido y a los pepticuerpos puede ser clonado en el vector de expresión del baculovirus pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA) . Este vector puede usarse de acuerdo a las direcciones del fabricante (PharMingen) para infectar las células frugiperda Spodoptera en el medio libre de proteína sF9 y producir la protelna recombinante . La proteína recombinante puede purificarse y concentrarse a partir del medio usando una columna heparina-sefarosa (Pharmacia) . Alternativamente, el péptido o pepticuerpo puede ser expresado en un sistema de insectos. Los sistemas de insectos para la expresión de la proteína son bien conocidos por aquellos expertos en el arte. En un sistema tal, puede usarse el virus de polihedrosis nuclear californica autógrafo (AcNPV) puede usarse como un vector para expresar los genes externos en las células Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. El péptido que codifica la secuencia puede ser clonado en una región no esencial del virus, tal como el gen polihedrina y colocado bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa del péptido suministrará el gen polihedrina inactivo y producir el virus recombinante que carece del revestimiento de la proteína. Los virus recombinantes pueden ser usados para infectar las células S. frugiperda o Trichoplusia larvae en donde el péptido se expresa (Smith et al., J Virol 46:584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nati Acad Sci. USA 91 : 3224-7 (1994) ) . En otro ejemplo, la secuencia de ADN que codifica al péptido puede amplificarse por PCR y se clona en un vector apropiado por ejemplo, pGEX-3X (Pharmacia) . El vector pGEX se diseña para producir una proteína de fusión que comprende glutation-S-transferasa (GST) codificada por el vector y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los cebadores del PCR pueden generarse para incluir por ejemplo, un sitio de desdoblamiento apropiado. Cuando la porción de fusión se usa solamente para facilitar la expresión o por el contrario, no deseable como una unión del péptido de interés, la proteína de fusión recombinante puede entonces ser desdoblado a partir de la porción GST de la proteína de fusión. El constructo del péptido del agente de enlace pGEX-3X/específico se transforma en células Blue de E. coli XL-1 (Strategene, La Jolla CA) y transformantes individuales aislados y de crecimiento. El ADN de plásmido a partir de los transformantes individuales pueden purificarse y formar secuencias parcialmente usando un secuenciador automático para confirmar la presencia del agente de enlace específico deseado que codifica el inserto de ácidos nucleicos en la propia orientación. La proteína de fusión, que puede ser producida como un cuerpo de inclusión insoluble en la bacteria, puede ser purificada como sigue. Las células hospedadoras se recolectan mediante centrifugación; lavadas en NaCl 0.15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; y tratadas con 0.1 mg/ml lisozimas (Sigma, St. Luois MO) durante 15 minutos a la temperatura ambiente. El lisado puede ser limpiado mediante sonicación, y los desechos celulares pueden peletizarse mediante centrifugación durante 10 minutos a 12,000 x g. Las pelotillas que contienen proteínas de fusión pueden ser resuspendidas en 50 mM tris, pH 8, y EDTA 10 mM estratificada en glicerol al 50% y centrifugada durante 30 minutos a 6000 X g. Las pelotillas pueden ser resuspendidas en una solución salina amortiguada de fosfato estándar (PBS) libre de Mg++ y Ca++. La proteína de fusión puede ser purificada además mediante el fraccionamiento de las pelotillas resuspendidas en un SDS-PAGE (Sambrook et al., supra) . El gel puede ser empapado en 0.4 M KCl para visualizar la protexna que puede ser cortada y electroeluida en una solución amortiguadora que se maneja con gel carente de SDS. Si la proteína de GST/fusión se produce en bacterias como una proteína soluble, puede ser purificada usando el Modulo de Purificación GST (Pharmacia) . La proteína de fusión puede ser sometida a una digestión para el desdoblamiento del GST del péptido de la invención. La reacción de digestión (20-40 mg de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina de humano (4000 U/mg, Sigma) en 0.5 mi de PBS puede incubarse 16-48 horas a la temperatura ambiente y cargarse en un gel SDS-PAGE desnaturalizado para fraccionar los productos de la reacción. El gel puede ser empapado en 0.4 M de KCl para visualizar las bandas de proteínas. La identidad de la banda de proteínas que corresponde al peso molecular esperado del péptido puede confirmarse mediante el análisis de la secuencia de los aminoácidos usando un secuenciador automático (Applied Biosystems Modelo 473A, Foster City, CA) . Alternativamente, la identidad puede confirmarse realizando CLAR y/o espectrometría de masa de los peptidos. Alternativamente, una secuencia de ADN que codifica al péptido puede ser clonada en un plásmido que contiene un promotor deseado y, opcionalmente una secuencia líder (Better et al., Science 240:1041-43 (1988)). La secuencia de este constructo puede confirmarse mediante la secuenciación automática. El plásmido puede entonces ser transformado en la cepa E. coli MC1061 usando procedimientos estándar que emplean una incubación CaC12 y tratamiento de choque de calor de la bacteria (Sambrook et al., supra) . La bacteria transformada puede crecer en un medio LB suplementado con carbenicilina y producción de la proteína expresada puede ser inducida mediante el crecimiento en un medio adecuado. Si está presente, la secuencia líder puede efectuar la secreción del péptido y puede ser desdoblada durante la secreción. Los sistemas hospedadores de mamíferos para la expresión de péptidos recombinantes y pepticuerpos son bien conocidos por aquellos expertos en el arte. Las cepas de células hospedadoras pueden seleccionarse para una capacidad en particular, para procesar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones post-traducción que serán útiles para proporcionar la actividad de la proteína. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilaci n, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Distintas células hospedadoras tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138 y similares tiene un mecanismo celular específico y características mecánicas para tales actividades post-traduccionales que pueden seleccionarse para asegurar la correcta modificación y proceso de la proteína extranjera introducida. Se prefiere que las células transformadas se usen para la producción de la proteina de alto rendimiento a largo plazo. Una vez que tales células se transforman con vectores que contienen marcadores seleccionables así como el cásete de expresión deseado, las células pueden dejarse crecer de 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien al medio selectivo. El marcador seleccionable se diseña para permitir el crecimiento y recuperar las células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los grupos resistentes de células transformadas estables pueden proliferar usando técnicas del cultivo del tejido apropiadas a la línea celular empleada. Una variedad de sistemas de selección pueden usarse para recuperar las células que han sido transformadas para la producción de la proteína recombinante . Tales sistemas de selección incluyen pero no se limitan a, HSV timidina cinasa, fosforibosiltransferasa hipoxantina-guanina y genes de fosforibosiltranferasa adenina, en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, la resistencia anti-metabolito puede usarse como la base de selección para dhfr que confiere resistencia a metotrexato; gpt que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo que confiere resistencia al aminoglicósido G418 y confiere resistencia a clorsulfuron; e hygro que confiere resistencia a la higromicina. Los genes seleccionables adicionales que pueden ser útiles incluyen trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptofano o hisD, que permite- a las células utilizar histinol en lugar de histidina. Los marcadores que dan una indicación visual para la identificación de los transformantes incluyen antocianinas , ß-glucoronidasa y su substrato, GUS, luciferasa y su substrato, luciferina.
Purificación y replegado de los agentes de enlace En algunos casos, los agentes de enlace tales como los péptidos y/o pepticuerpos de esta invención pueden necesitar ser "replegados" y oxidarse en una estructura terciaria apropiada y enlaces bisulfuro generados para ser biológicamente activos . El repliegue puede realizarse usando un número de procedimientos bien conocidos en el arte. Tales métodos incluyen por ejemplo, exponer el agente de polipéptidos solubilizados a un pH usualmente arriba de 7 en presencia de un agente caotrópico. La selección del caotrópo es similar a los seleccionados usados para la inclusión de la solubilización corporal, sin embargo, un caotrópo se usa típicamente usado en una concentración inferior. Los agentes caotrópicos de ejemplo son guanidina y urea. En algunos casos, la solución de repliegue/oxidación contendrá también un agente de reducción más su forma oxidada en una relación específica para generar un particular potencial de óxido-reducción que permite revolver el bisulfuro para que se presente la formación de los puntes de cisterna . Algunas parejas de óxido-reducción usadas comúnmente cisteína/cistamina, glutation/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (bME) /ditio-bME. En algunos casos, un co-solvente puede usarse para incrementar la eficiencia del replegado. Los cosolventes usados comúnmente incluyen glicerol, polietilen glicol de varios pesos moleculares y arginina. Puede ser deseable purificar los peptidos y pepticuerpos de la presente invención. Las técnicas de purificación de proteína son bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Estas técnicas involucran en un nivel, el fraccionamiento crudo de las fracciones proteínicas y no proteínicas. Al haber separado los péptidos y/o pepticuerpos separados a partir de otras proteínas, el péptido o polipéptido de interés puede purificarse además usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación parcial o total (o purificación para la homogeneidad) . Los métodos analíticos adecuados particularmente para la preparación de pepticuerpos y péptidos o la presente invención son cromatografía de intercambio de ion, cromatografía de exclusión, electroforesis de gel de poliacrilamida, enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficiente para purificar péptidos es la cromatografía líquida de proteína rápida o incluso CIAR. Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en modalidades particulares, la purificación substancial de un pepticuerpo o péptido de la presente invención. El término "pepticuerpo purificado o péptido" como se usa en la presente, pretende referirse a una composición, aislable a partir de otros componentes, en donde el pepticuerpo o péptido se purifica para cualquier grado relativo de su estado naturalmente obtenible. Por lo tanto, un péptido o pepticuerpos purificado se refiere también a un pepticuerpo o péptido que está libre del ambiente en el cual se presenta naturalmente . Generalmente, "purificado" se referirá a una composición de péptidos o pepticuerpos que han sido sometidas a un fraccionamiento para remover distintos componentes y cuya composición mantiene substancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se usa el término "purificado substancialmente" esta designación se referirá a una composición de péptido o pepticuerpos en donde el pepticuerpo o péptido forma el principal componente de la composición tal como constituye aproximadamente el 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de las proteínas en la composición.
Varios métodos para cuantifxcar el grado de purificación del péptido o pepticuerpo serán bien conocidos por aquellos expertos en la técnica en vista de la presente descripción. Estos incluyen por ejemplo, determinar la actividad de enlace especifico de una fracción activa, o valorar la cantidad de péptidos o pepticuerpos dentro de un fracción mediante el análisis SDS/PAGE. Un método preferido para valorar la pureza de una fracción de péptidos o pepticuerpos es calcular la actividad de enlace de la fracción, para comparar la actividad de enlace del extracto inicial, y calcular así el grado de purificación, aquí valorado por un "número de purificación mediante pliegues" . Las unidades actuales usadas para representar la cantidad de actividad de enlace dependerá por supuesto de la técnica de ensayo particular seleccionada para seguir la purificación ya sea que el péptido o pepticuerpos exhiban o no una actividad de enlace detectable.
Varias técnicas adecuadas para usarse en la purificación serán bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Estas incluyen por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos (inmunoprecipitación) y similares o mediante la desnaturalización por calor, seguido por centrifugación; las etapas de cromatografía tales como cromatografía por afinidad (por ejemplo, Proteína-A-sefarosa) , intercambio de ion, filtración por gel, fase inversa, hidroxilpatita y cromatografía por afinidad, enfoque isoeléctrico; electroforesis por gel y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se conoce generalmente en el arte, se cree que el orden para conducir las distintas etapas de purificación pueden cambiarse o ciertas etapas pueden omitirse lo cual resultará en un método adecuado para la preparación de un agente de enlace purificado sustancialmente . No existen requerimientos generales en los que los agentes de enlace de la presente invención siempre se proporcionen en su estado más purificado. De hecho, se contempla que menos de substancialmente los productos del agente de enlace purificados tendrán una utilidad en ciertas modalidades. La purificación parcial puede realizarse usando pocas etapas de purificación en combinación o utilizando distintas formas del mismo esquema de purificación general . Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía de la columna de intercambio de cationes realizada utilizando un aparato de CLAR resultará generalmente en una mayor purificación "pliegue" que la misma técnica que utiliza un sistema de cromatogra ía a baja presión. Los métodos que exhiben un grado inferior de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del péptido o pepticuerpo, o manteniendo la actividad de enlace del péptido o pepticuerpo.
Se sabe que la migración de un péptido o polipéptido puede variar, algunas veces significativamente con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al., Biochem Biophys Res Co m. 76:425 (1997)) . Se apreciará por lo tanto, que bajo condiciones de electroforesis que difieren, puede variar el peso molecular aparente de los productos de expresión de los agentes de enlace purificados o purificados parcialmente.
Actividad de los agentes que enlazan miostatina Después de la construcción de los agentes de enlace de la presente invención, son probados por su capacidad para enlazar miostatina e inhibir o bloquear la actividad de la miostatina. Cualquier número de ensayos o pruebas animales pueden usarse para determinar la capacidad del agente para inhibir o bloquear la actividad de la miostatina. Varios ensayos para caracterizar los péptidos y pepticuerpos de la presente invenciones describen en el ejemplo de abajo. Un ensayo es el ensayo C2C12 pMARE-luc que hace uso de una línea celular sensible a la miostatina (mioblastos C2C12) transfectados con un vector reportero de la luciferasa que contienen elementos de respuesta a la miostatina/activina (MARE) . Ejemplos de pepticuerpos son ensayados mediante la preincubación de una serie de diluciones del pepticuerpo con miostatina y después exponer las células a la mezcla de incubación. La actividad de la luciferasa resultante se determina y una curva de titulación se genera a partir de una serie de diluciones del pepticuerpo. Se determinó entonces la IC50 (la concentración de un pepticuerpo para lograr el 50% de la inhibición de la actividad de la miostatina medida por la actividad de la luciferasa) . Un segundo ensayo descrito abajo es un ensayo BIAcore® para determinar los parámetros cinéticos Ka (constante de la relación por asociación) , k4 (disociación de la constante de relación) , y KD (disociación de la constante de equilibro) para los agentes que enlazan miostatina. Las constantes del equilibrio de disociación inferior ( D expresadas en n ) indicaron una mayor afinidad del pepticuerpo para la miostatina. Los ensayos adicionales incluyen ensayos de bloqueo, para determinar si un agente de enlace tal como un pepticuerpo se neutraliza (previene enlazando la miostatina a su receptor) , o no se neutraliza (no previene el enlace de la miostatina a su receptor) , ensayos de selectividad, los cuales determinan si los agentes de enlace de la presente invención se enlazan selectivamente a la miostatina y no a otros miembros de la familia GF ; y ensayos KinEx A™ o ensayos de equilibrio basados en una solución que determinan también el KD y se consideran ser más sensibles en algunas circunstancias. Estos ensayos se describen en el ejemplo 3. La figura 1 muestra la IC50 de un péptido comparado con la IC50 de la forma del pepticuerpo del péptido. Esto demuestra que el pepticuerpo es significativamente más efectivo para inhibir la actividad de la miostatina que únicamente con el péptido. Además, los pepticuerpos de afinidad madura exhiben generalmente valores IC50 y KD mejorados comparados con los pepticuerpos y péptidos progenitores. Los valores IC50 para una variedad de ejemplos de pepticuerpos madurados por afinidad se muestran en la Tabla VII. Además del ejemplo 7 de abajo y en algunos ejemplos, la elaboración de una versión 2x de un pepticuerpo, en donde los dos péptidos se unen en tándem, incrementa la actividad del pepticuerpo tanto in vitro como in vivo. Las actividades in vivo se demuestran en los ejemplos de abajo. Las actividades de los agentes de enlace incluyen una actividad anabólica que incrementa la masa muscular sin grasa en los modelos animales así como la disminución en la masa corporal con grasa con respecto al peso corporal total en modelos de animales tratados, que incrementa la fuerza muscular en los modelos animales .
Usos de los agentes que enlazan miostatina Los agentes que enlazan miostatina de la presente invención enlazan miostatina y bloquean o inhiben la señalización de la miostatina dentro de las células de direccionamiento . La presente invención proporciona métodos y reactivos para reducir la cantidad o actividad de miostatina en un animal que administra una dosificación efectiva de uno o más agentes que enlazan miostatina a los animales . En un aspecto, la presente invención proporciona métodos y reactivos para tratar trastornos relacionados con la miostatina en un animal que comprende administrar una dosificación efectiva de uno o más agente de enlace para los animales. Estos trastornos relacionados con la miostatina incluyen pero no se limitan a varias formas de desgaste muscular, así como los trastornos metabólicos tales como la diabetes y trastornos relacionados y las enfermedades degenerativas óseas tales como la osteoporosis . Como se muestra en el ejemplo 8 de abajo, los pepticuerpos de ejemplo de la presente invención incrementan dramáticamente la masa muscular sin grasa en el modelo de ratón nu/nu CD1. Esta actividad in vivo correlaciona al enlace in vitro y la actividad inhibidora descrita abajo para los mismos pepticuerpos. Los trastornos del desgaste muscular incluyen distrofias tales como la distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular del tipo Becker, distrofia muscular Dej erine-Landouzy, distrofia muscular de Erb y distrofia muscular neuroaxonal infantil. Por ejemplo, el bloqueo de la miostatina a través del uso de anticuerpos in vivo mejoran el fenotipo distrófico del modelo de ratón mdx de la distrofia muscular Duchenne (Bogdanovich et al, Nature 420:28, (2002)). Los pepticuerpos de la presente invención incrementan la masa muscular sin grasa como un porcentaje del peso corporal y disminuye la masa con grasa como porcentaje del peso corporal cuando se administra a un modelo de ratón mdx viej o . Los trastornos adicionales del desgaste muscular surgen de la enfermedad crónica tal como la esclerosis lateral amiotrópica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, SIDA, insuficiencia renal y artritis reumatoide . Por ejemplo, el desgaste muscular o caquexia y pérdida del peso corporal se indujo en ratones desnudos atímicos mediante miostatina administrada sistétnicamente (Zimmers et al., supra) . En otro ejemplo, se encontró que las concentraciones intramusculares y en suero de la proteína inmunoreactiva con miostatina se incrementaron hombres que exhibe un desgaste muscular relacionado con el SIDA y que está inversamente relacionado con la masa libre de grasa (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)). Condiciones adicionales que resultan del desgaste muscular pueden surgir de una inactividad debido a la invalidez tal como el confinamiento a una silla de ruedas, permanecer sentado durante mucho tiempo debido a apoplejía, enfermedad, lesión de la médula espinal, fracturas de huesos o traumas, atrofia muscular en un ambiente de microgravedad (evasión del espacio) . Por ejemplo, se encontró que la proteína inmunoreactiva de la miostatina del plasma se incrementa después de permanecer sentado durante mucho tiempo (Zachwieja et al., J Gravit Physiol. 6(2) :11 (1999). Se encontró también que los músculos de ratas expuestas a un ambiente de microgravedad durante el vuelo de la sonda espacial, expresan una cantidad superior de miostatina en comparación con los músculos de ratas que no fueron expuestas (Lalani et al., J. Endocrin 167 (3) :417-28 (2000)). Además, el incremento relacionado con la edad en las relaciones músculo-grasa y la atrofia muscular relacionada con la edad parece estar relacionada con la miostatina. Por ejemplo, la proteína inmunoreactiva con la miostatina de suero promedio se incrementa con la edad en los grupos de hombres y mujeres jóvenes (19-35 años de edad) , edad media (36-75 años de edad) y mayores (76-92 años de edad) , aun cuando la masa muscular promedio y la masa libre de grasa disminuye con la edad en estos grupos (Yarasheski et al. J". Nutr. Aging 6 (5) :343-8 (2002)) . Se ha demostrado también que el gen agénico de la miostatina en ratones incrementa la biogénesis y disminuye la adipogenesis (Lin et al., Biochem Biophys Res Común 291:701-6 (2002), lo que da como resultado adultos con masa muscular superior y una disminución en la acumulación de grasa y secreción de leptina. Ejemplos de pepticuerpos que mejoran la relación de masa muscular sin grasa y relación en grasa en ratones mdx viejos se muestran abajo . Además, se ha encontrado recientemente que la miostatina que va a ser expresada en niveles bajos en los músculos del corazón y su expresión se sobreregula tras el infarto en los cardiomiocitos (Sharma et al . , J Cell Physiol. 180 (1) :1-9(1999)). Por lo tanto, la reducción en los niveles de la miostatina en los músculos del corazón pueden mejorar la recuperación de los músculos del corazón después del infarto. La miostatina parece también influenciar los trastornos metabólicos que incluyen la diabetes del tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de la insulina, hiperglicemia y obesidad. Por ejemplo, la carencia de miostatina ha demostrado mejorar los fenotipos de la obesidad y diabéticos de dos modelos de ratón (Yen et al . , supra) . Se ha demostrado en los ejemplos de abajo que la disminución en la actividad de la miostatina mediante la administración de inhibidores de la presente invención disminuirá la relación de grasa-músculo en un animal, que incluyen modelos de animales viejos. Por lo tanto, al disminuir la composición de la grasa mediante la administración de inhibidores de la presente invención mejorará la diabetes, obesidad y condiciones hiperglicémicas en animales . Además, el incremento en la masa muscular mediante la reducción en los niveles de la miostatina mejora la fuerza ósea y reduce la osteoporosis y otras enfermedades degenerativas de los huesos. Se ha encontrado por ejemplo, que los ratones deficientes en miostatina mostraron un contenido mineral superior y una densidad del húmero en los ratones y un contenido de minerales superior tanto en el hueso cortical y trabecular en las regiones en donde los músculos se unen, así como un incremento en la masa muscular (Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(l):63-8 (2002)). La presente invención proporciona también métodos y reactivos para incrementar la masa muscular en los animales de alimento administrando una dosificación efectiva del agente que enlaza miostatina para los animales . Puesto que el polipéptido de miostatina C terminal maduro es idéntico en todas la especies probadas, los agentes que enlazan miostatina se esperaría que fueran efectivos para incrementar la masa muscular y reducir la grasa en especies agropecuarias importantes dentro de las que se incluyen, ganado, pollos, pavos y puercos . Los agentes de enlace de la presente invención pueden usarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para mejorar sus efectos terapéuticos o disminuir los efectos secundario potenciales . Los agentes de enlace de la presente invención poseen una o más combinaciones de propiedades deseables pero inesperadas para mejorar el valor terapéutico de los agentes. Estas propiedades incluyen la actividad incrementada, aumento en la solubilidad, degradación reducida, vida media incrementada, toxicidad reducida e inmunogenicidad reducida. Así, los agentes de enlace de la presente invención, son útiles para los regímenes de tratamiento prolongado. Además, las propiedades de hidrofilicidad e hidrofobicidad de los compuestos de la invención están bien balanceadas, mejorando así, su utilidad para ambos usos in vitro y especialmente in vivo. Específicamente, los compuestos de la invención tienen un grado apropiado de solubilidad en un medio acuoso que permite la absorción y biodisponibilidad en el cuerpo, mientras se obtiene un grado de solubilidad en los lípidos que permite que los compuestos atraviesen la membrana celular a un sitio putativo de acción, tal como una masa muscular en particular. Los agentes de enlace de la presente invención son útiles para tratar a un "sujeto" o cualquier animal, que incluye a los humanos, cuando se administra en dosificaciones efectivas en una composición adecuada. Además, los agentes que enlazan miostatina de la presente invención son útiles para detectar y cuantificar miostatina en una variedad de ensayos . Estos ensayos se describen con mayor detalle abajo. En general, los agentes de enlace de la presente invención son útiles como agentes de captura para enlazar e inmovilizar a la miostatina en una variedad de ensayos, similar a aquellas descritas por ejemplo, en Asai, ed. , Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993). El agente de enlace puede etiquetarse de alguna manera o puede reaccionar con una tercer molécula tal como un anticuerpo de un agente antienlace que se etiqueta para permitir que la miostatina sea detectada y cuantificad . Por ejemplo, un agente de enlace o una tercer molécula pueda modificarse con una porción detectable tal como una biotina que puede entonces encontrarse mediante una cuarta molécula tal como una estreptavidina etiquetada con una enzima u otras proteínas. (Akerstrom, J I unol 135:2589 (1985) ; Chaubert, Mod Pathol 19:585 81997) ) . Durante cualquier ensayo en particular, la incubación y/o etapas de lavado pueden requerirse después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar desde aproximadamente 5 segundos hasta varias horas, preferiblemente desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, volumen de solución, concentraciones y similares. Usualmente, los ensayos se llevarán a cabo en una temperatura ambiente a pesar de que pueden realizarse en un intervalo de temperaturas .
Ensayos de enlace no competitivos: Los ensayos de enlace pueden ser de un tipo no competitivo en los cuales la cantidad de la miostatina no capturada se mide directamente. Por ejemplo, en un ensayo preferido "intercalado", el agente de enlace puede enlazarse directamente a un substrato en donde este se inmoviliza. Estos agentes inmovilizados después se enlazan a la miostatina presente en la muestra de prueba. La miostatina inmovilizada se enlaza entonces con una gente etiquetado tal como un anticuerpo etiquetado contra la miostatina que puede detectarse. En otro ensayo preferido wintercalado" , puede agregarse un segundo agente especifico para el agente de enlace que contiene una porción detectable tal como la biot.ina en la cual una tercer molécula etiquetada puede enlazarse específicamente tal como la estreptavidina . (ver Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, capítulos 14 Gold Spring harbor Laboratory, Y (1988) , que está incorporada en la presente por la referencia) .
Ensayos de enlace Competitivos: Los ensayos de enlace pueden ser del tipo competitivo. La cantidad de miostatina presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de miostatina desplazado o competente fuera de un agente de enlace mediante la miostatina presente en la muestra. En un ensayo de enlace competitivo preferido, una cantidad conocida de miostatina usualmente etiquetada se añade a la muestra y la muestra se pone en contacto con el agente de enlace. La cantidad de miostatina etiquetada unida al agente de enlace es inversamente proporcional a la concentración de miostatina presente en la muestra. (Siguiendo los protocolos encontrados en por ejemplo, Harlow y lañe, Antibodies, A. Laboratory Manual, Capítulo 14, pp. 579-583, supra) . En otro ensayo de enlace competitivo preferido, el agente de enlace se inmoviliza en un substrato sólido. La cantidad de miostatína que se une a un agente de enlace puede determinarse ya sea midiendo la cantidad de miostatina presente en un complejo de agente de miostatina/enlace o alternativamente, midiendo la cantidad de miostatina restante no en complejo.
Otros ensayos de enlace La presente invención proporciona también métodos de inmunotransferencia Western para detectar o cuantificar la presencia de miostatina en una muestra. La técnica comprende generalmente separar las proteínas de la muestra mediante electrofóresis por gel basándose en el peso molecular y transferir las proteínas a un soporte sólido adecuado tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon o un filtro de nylon derivador. La muestra se incuba con agentes de enlace o fragmentos de los mismos que enlazan miostatina y se detecta el complejo resultante. Estos agentes de enlace se etiquetan directamente o alternativamente pueden ser detectados posteriormente usando anticuerpos etiquetados que enlazan específicamente al agente de enlace.
Ensayos de diagnóstico Los agentes de enlace o fragmentos de los mismos de la presente invención pueden ser útiles para el diagnóstico de las condiciones o enfermedades caracterizadas por cantidades superiores de miostatina. Los ensayos de diagnóstico para los niveles altos de miostatina incluyen métodos que utilizan un agente de enlace y una etiqueta para detectar miostatina en fluidos corporales humanos, extractos de células o extracto del tejido especifico. Por ejemplo, los niveles del suero de la miostatina pueden medirse en un individuo en el tiempo para determinar el ataque del desgaste muscular asociado con la edad o inactividad, descrita por ejemplo en Yarasheski et al., supra. Los agentes de enlace de la presente invención pueden ser útiles para monitorear por ejemplo, el incremento o disminución en los niveles de miostatina con un individuo dado en el tiempo. Los agentes de enlace pueden usarse en tales ensayos con o sin modificación. En un ensayo de diagnóstico preferido, los agentes de enlace serán etiquetados uniendo por ejemplo, una etiqueta o una molécula reportero. Una amplia variedad de etiquetas y moléculas reportero conocidas, algunas de las cuales han sido ya descritas en la presente. En particular, la presente invención es útil para el diagnóstico de las enfermedades humanas . Una variedad de protocolos para medir las proteínas de la miostatina que usan agentes de enlace de miostatina son bien conocidos en el arte. Ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Para las aplicaciones diagnósticas, en ciertas modalidades, los agentes de enlace de la presente invención se etiquetarán típicamente con una porción detectable. La porción detectable puede ser una que sea capaz de producir y sea directamente o indirectamente una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I, un compuesto quimioluminiscente o fluorescente tal como un isotiocianato de fluoresceína o luciferina, o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, ß galactosidasa o peroxidasa de raíz de rábano (Bayer et al., Meth Enz, 184: 138(1990)).
Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de agentes que enlazan miostatina tal como pepticuerpos descritos en la presente se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un agente que se enlaza a miostatina, fragmento, variante o derivado de los mismos como se describe en la presente, en una mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden agentes que enlazan antagonistas, que inhiben a la miostatina parcialmente o completamente en la mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable. Típicamente, los agentes que enlazan miostatina se purificarán suficientemente para la administración a un animal . La composición farmacéutica puede contener los materiales de formulación para modificar, mantener o preservar por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, relación de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobiales , antioxidante (tales como ácido ascórbico, sulfuro o sulfato ácido de sodio) , soluciones amortiguadoras (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, otros ácidos orgánicos) , agente de volumen (tales como manitol o glicina) , agentes quelantes (tales como ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) ) , agentes formadores de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) , rellenos, monoscáridos , disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa o dextrinas) , proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina) , colorantes, saborizantes y agentes de dilución, agentes de emulsificación, polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona) , polipéptidos de peso molecular bajo, contraiones que forman sales (tales como sodio) , conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidino, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) , solventes (tales como glicerina, propilen glicol o polietilen glicol) , alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol) , agentes de suspensión, tensoactivos o agentes de humectación (tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tloxapal) , agentes que mejoran la estabilidad (sucrosa o sorbitol) ; agente que mejoran la tonicidad (tales como haluros metálicos alcalinos (preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol) , vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (Remington Pharmaceutical Sciences, 18 edición, A. R. Gennaro ed, . Mack Publishing Company, 1990) . La composición farmacéutica óptima se determinará por un experto en el arte dependiendo de por ejemplo, la vía pretendida de administración, formato de suministro y dosificación deseada. Ver por ejemplo, Remington"s Pharmaceutical Sciences;, supra . Tales composiciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, proporción de liberación in vivo, y proporción de una depuración in vivo del agente de enlace. El vehículo o portador principal en una composición farmacéutica puede ser ya sea acuosa o no acuosa en naturaleza. Por ejemplo, un vehículo adecuado o portador puede ser agua para inyecciones, solución salina fisiológica o fluidos cerebroespinales artificiales, suplementados posiblemente con otros materiales conocidos en composiciones para la administración parenteral . La solución salina amortiguada neutral o salinas mezclada con albúmina de suero son ejemplos de vehículos adicionales. Otros ejemplos e composiciones farmacéuticas comprenden soluciones amortiguadoras Tri de aproximadamente un pH 7.0-8.5, o solución amortiguadora de acetato de aproximadamente 4.0-5.5, que pueden ser incluidas adicionalmente incluyen sorbitol o un sustituto adecuado de los mismos. En una modalidad de la presente invención, las composiciones del agente de enlace pueden prepararse para almacenarse mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, el producto del agente de enlace puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa. Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para el suministro parenteral . Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para la inhalación o para el suministro entérico tales como oralmente, auralmente, of álmicamente, rectalmente o vaginalmente . La preparación de tales composiciones f rmacéuticamente aceptables está al alcance de los expertos en el arte. Los componentes de la formulación se presentan en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, las soluciones amortiguadoras se usan para mantener la composición en un pH fisiológico o con un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un pH en el intervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8. Cuando la administración parenteral se contempla, las composiciones terapéuticas para usarse en esta invención pueden ser en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógeno, que comprende el agente de enlace deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la que un agente de enlace se formula como una solución isotónica estéril preservada apropiadamente . Incluso otra preparación puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente tal como microesferas inyectables, biopartículas bioerosionables , compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico) , perlas o liposomas, que proporcionan una liberación sostenida o controlada del producto el cual puede entonces ser suministrado vía una inyección de depósito. El ácido hialurónico puede también usarse y puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos para el suministro del fármaco implantables . En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en las soluciones amortiguadoras fisiológicamente compatibles tales como una solución de Hank, solución de Ringer o una solución salina fisiológicamente amortiguada. Las suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión tales como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol o dextrano . Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones apropiadas para inyección aceitosas. Los solventes lipofílicos adecuados o vehículos incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, és eres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Pueden usarse también para el suministro amino polímeros policatiónicos no lípidos . Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores adecuados o agentes para incrementar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En otra modalidad, puede formularse una composición farmacéutica para la inhalación. Las soluciones de inhalación de moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos pueden formularse también con un propulsor para el suministro de aerosol . En otra modalidad, las soluciones pueden ser nebulizadas . La administración pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT No. PCT/US94/001875 , que describe el suministro pulmonar de proteínas modificadas químicamente . Se contempla también que ciertas formulaciones pueden administrarse oralmente. En una modalidad de la presente invención, las moléculas del agente de enlace que se administran de esta forma pueden formularse con o sin aquellos portadores usados comúnmente en la formación de compuestos de formas de dosificación sólida tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en un punto del tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación presistémica se minimiza. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la molécula del agente de enlace. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes , ceras de punto de fusión bajo, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes que desintegran tabletas y aglutinantes . Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden formularse también usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el arte en dosificaciones adecuadas para la administración oral . Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas puedan formularse como tabletas, pildoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas aguadas, suspensiones y similares, para ser ingeridas por el paciente. Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral pueden obtenerse a través de combinar los compuestos activos con un excipiente sólido y procesar la mezcla resultante de los gránulos (opcionalmente, después de la molienda) obtener tabletas o núcleos de grageas. Si se desea, pueden añadirse auxiliares adecuados. Excipientes adecuados incluyen carbohidratos o rellenos para proteínas tales como azúcares que incluyen lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; almidón de maíz, arroz, papa u otras plantas; celulosa tales como metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa o carboximetilcelulosa de sodio; gomas que incluyen arábiga y tragacanto y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden agregarse agentes desintegrantes o de solubilización tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar y ácido algínico o sales de los mismos tales como alginato de sodio. Los núcleos de grageas pueden usarse junto con revestimientos adecuados tales como soluciones de azúcar concentradas que pueden contener también goma arábiga, talco, pólivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilen glicol, y/o dióxido de titanio, soluciones para barnizar y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes . Los pigmentos o materia colorante pueden añadirse a las tabletas o los revestimientos de grageas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad del compuesto activo, es decir, la dosificación. Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente también incluyen cápsulas de unión por presión hechas de gelatina, así como cápsulas suaves selladas hechas de gelatina y un revestimiento tal como glicerol o sorbitol . Las cápsulas de unión por presión pueden contener ingredientes activos mezclados con rellenadores o aglutinantes tales como lactosa o almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas suaves, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados tales como aceites grasos, líquidos, o polietilen glicol con o sin estabilizadores. Otra composición farmacéutica puede involucrar una cantidad efectiva del agente de enlace en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril u otros vehículos apropiados, las soluciones pueden prepararse en la forma de una dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa o fosfato de calcio o agentes de enlace tales como almidón, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes por aquellos expertos en el arte, que incluyen formulaciones que involucran moléculas del agente de enlace en formulaciones de suministro controlado o sostenido. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de suministro controlado o sostenido tales como portadores de liposomas, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito son conocidas también por aquellos expertos en el arte. Ver por ejemplo, PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropar ículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. Ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en la forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilacturos (U.S. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros del acido L-glutámico y etil-L-glutamato gamma (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed, Mater. Res., 15:167-277 (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105(1982)), vinil acetato de etileno (Langer et al., supra) o ácido poli-Di-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida incluyen también liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos adecuados conocidos en el arte. Ver por ejemplo., Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949. La composición farmacéutica para usarse en la administración in vivo típicamente debe ser estéril. Esta puede realizarse mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición es liofilizada, la esterilización que usa este método puede realizarse ya sea antes o después de la liofilización y la reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un frasco que tiene un supresor perforable mediante una aguja de inyección hipodermica. Una vez que la composición farmacéutica ha sido formulada, puede almacenarse en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólida o polvos liofilizado o deshidratado. Tales formulaciones pueden almacenarse ya sea en una forma lista para usarse o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere la reconstitución previa a la administración. En una modalidad específica, la presente invención se refiere a kits para producir una unidad de administración de dosis simple. Estos kits pueden contener cada uno tanto un primer contenedor que tiene una proteina seca y un segundo contenedor que tienen una formulación acuosa. También incluidos dentro del alcance de esta invención se encuentran los kits que contienen jeringas pre-rellenas con una cámara y múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas líquidas y liojeringas) . Una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que va a ser empleada terapéuticamente dependerá por ejemplo, del contexto terapéutico y objetivos. Un experto en el arte apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo en parte de la molécula suministrada, la indicación para la cual la molécula del agente de enlace se usa, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el médico puede titular la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.1 mg/kg de hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras modalidades, la dosificación puede estar en el intervalo de 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, o 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, o 5 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente ya sea en los ensayos del cultivo celular o en modelos animales tales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. Un modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración adecuado y la vía de administración. Tal información puede entonces ser usada para determinar dosis útiles y vías para la administración en humanos. La dosificación exacta se determinará a la luz de los factores relacionados con el tratamiento que requiere el sujeto. La dosificación y administración se ajusta para proporcionar niveles eficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se toman en cuenta incluyen la severidad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso y sexo del sujeto, tiempo y frecuencia de administración, combinación (es) del fármaco, sensibilidad a la reacción y respuesta a la terapia.
Las composiciones farmacéuticas que actúan en forma prolongada pueden administrarse de 3 a 4 días, cada semana, o quincenalmente dependiendo de la vida media y relación de depuración de la formulación en particular. La frecuencia de la dosificación dependerá entonces de los parámetros farmacocinéticos de la molécula del agente de enlace en las formulaciones usadas. Típicamente, una composición se administra hasta que se alcanza una dosis en la que se obtiene el efecto deseado. Por lo tanto, la composición puede administrarse como una dosis sencilla o como una dosis múltiple (con la misma o diferente concentraciones/dosis) en el tiempo, o como una infusión continua. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace de forma rutinaria. Las dosificaciones apropiadas pueden averiguarse a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados. La vía de administración de la composición farmacéutica se decide de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de la inyección mediante medios intravenosos, intraperitoneal , intracerebral (intra-parénquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial , intraportal, vías intralesionales , intramedular, intratecal, intraventricular, transdermal, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, uretral, vaginal o rectal, mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación. Cuando se desea, las composiciones pueden ser administradas mediante inyección del bolo o continuamente mediante infusión o mediante un dispositivo de implantación. Alternativamente o adicionalmente , la composición puede ser administrada localmente vía la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual la molécula deseada ha sido absorbida o encapsulada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado y el suministro de la molécula deseada puede ser vía la difusión, el bolo liberado en el tiempo o una administración continua. En algunos casos, puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas en una manera ex vivo. En tales casos, las células, tejidos u órganos que han sido removidos de los pacientes se exponen a las composiciones farmacéuticas después de que las células, tejidos y/o órganos se implantan posteriormente de nuevo al paciente.
En otros casos, un agente de enlace de la presente invención tal como un pepticuerpo puede ser suministrado mediante la implantación de ciertas células que han sido diseñadas genéticamente usando métodos tales como los descritos en la presente, para expresar y secretar los polipéptidos . Tales células pueden ser células de animales o de humanos, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. Opcionalmente , las células pueden ser inmortalizadas. Para disminuir el cambio de una respuesta inmunológica , las células pueden ser encapsuladas para evitar la infiltración de los tejidos que las rodean. Los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles , compartimientos o membranas poliméricas semipermeables que permiten la liberación del producto (s) de la proteína pero que evitan la destrucción de las células mediante el sistema inmune del paciente o mediante otros factores detrimentales de los tejidos que los rodean. Las composiciones farmacéuticas que contienen los agentes de enlace de la presente invención se administran a un sujeto para tratar cualquier trastorno relacionado con la miostatina. Estos incluyen trastornos del desgaste muscular que incluyen pero no se limita a distrofia muscular, desgaste muscular en el cáncer, SIDA, atrofia muscular, artritis reumatoide, insuficiencia renal/uremia, insuficiencia del corazón crónica, reposo prolongado, lesión de la médula espinal y sarcopenia relacionada con la edad. Además, estas composiciones se administran para tratar la obesidad, diabetes, hiperglicemia e incrementar la densidad ósea. La invención que se ha descrito ofrece los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no como una limitación .
Ejemplo 1 Identif cación de los péptidos que enlazan miostatina. Tres colecciones de fagos filamentosos TN8-1X (transformantes independientes 5 x 109), TN12-I (transformantes independientes 2.3 x 109) (Dyax Corp.) se usaron para seleccionar el fago que enlaza a la miostatina. Cada colección se incubó en superficies revestidas con miostatina y se sometieron a diferentes condiciones de inmunoplaqueteo : elución no específica y elución específica usando una quimera del receptor IIB/Fc de activina de humano recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), o elución de propéptido de miostatina descrita abajo. Para todas las tres colecciones, los fagos se eluyeron de una forma no específica para la primer ronda de selección, mientras que el receptor y la promiostatina se usó en la segunda y tercer rondas de selección. Los procedimientos de selección se llevaron a cabo como se describe abajo.
Preparación de miostafcina La proteína miostatina se produce recombinantemente en la cepa 2596 de E.coli K-12 (ATCC #202174) como sigue. Los polinucleótidos que codifican la molécula promiostatina humana se clonaron en el vector de expresión pAMG21 (ATCC No. 98113) , que se deriva del vector de expresión pCFM1656 (ATCC No. 69576) y el sistema de vector de expresión descrito en la Patente E.U.A. No. 4,710,473, siguiendo el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente Internacional publicada O 0/24782. Los polinucleótidos que codifican la promiostatina se obtienen de un vector de expresión de mamífero. La región codificada se amplifica usando un método PCR estándar y los siguientes cebadores PCR para introducir el sitio de restricción para iVdel y BamHI . Cebador 5': 5 ' -GAGAGAGAGCATATGAATGAGAACAGTGAGCAAAAAG-3 ' (SEQ ID NO: 292) Cebador 3': 5 'AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC-3 ' (SEQ ID NO: 293) . El producto PCR y el vector se digieren con ambas enzimas, se mezclan y se ligan. El producto del ligado se transformó en la cepa #2596 de E.coli. Las colonias sencillas se revisan por microscopio para expresión de proteína recombinante en forma de cuerpos de inclusión. El plásmido se aisló y se procesa en secuencia a través de la región codificadora del gen recombinante para verificar la fidelidad genética . La pasta bacterial se genera de una fermentación de 10L usando un método de lote a 37°C. El cultivo se induce con HSL a una densidad celular de 9.6 ODGoo y se cosecha seis horas más tarde a una densidad de 104 OD6oo- La pasta se almacena a -80°C. La pasta de E.coli que expresa la promiostatina se lisa en un microfluidizador a 16,000 psi (1124.8 Kg/cm2) , se centrifuga para aislar la fracción de cuerpo de inclusión insoluble . Los cuerpos de inclusión se vuelven a suspender en clorohidrato de guanidina que contiene ditiotreitol y se solubiliza a temperatura ambiente. Esto luego se diluye 30 veces en una solución amortiguadora acuosa. La promiostatina redoblada se concentra entonces y la solución amortiguadora se intercambia en Tris pH 8.0 20mM, y se aplica a una columna de intercambio de aniones. La columna de intercambio de aniones se eluye con un gradiente de cloruro de sodio incrementado. Las fracciones que contienen promiostatina se agrupan. A la promiostatina producida en E.coli le faltan los primeros 23 aminoácidos e inicia con una metionina antes del residuo 24 de asparagina. Para producir la miostatina madura, la promiostatina agrupada se desdobla enzimáticamente entre el prcpéptido y la terminal C de miostatina madura. La mezcla resultante se aplica entonces a una colutina C4-rpCL¾R usando un gradiente iixiranentado de acetonitrilo que contiene ácido trifluoroacético al 0.1%. Las fracciones que contienen miostatina madura se agrupan y se secan en un speed-vac . La miostatina madura recombinante producida de E.coli se probó en el ensayo basado en mioblasto C2C12 descrito abajo y se encuentra que es completamente activa cuando se compara con la miostatina de murino recombinante comercialmente producida en un sistema de células de mamífero (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota). La miostatina madura producida por E.coli se usa en los ensayos de separación pro exclusión y de exhibición de fago descritos abajo.
Preparación de Tubos Recubiertos de Miostatina La miostatina se inmoviliza en tubos Immuno® de 5 mi ( UNC) a una concentración de 8 ug de proteína de miostatina en 1 mi de solución amortiguadora de carbonato de sodio 0.1M (pH9.6). El tubo Immuno® recubierto con miostatina se incubó con agitación orbital durante 1 hora a temperatura ambiente. El tubo Immuno® recubierto con miostatina se bloqueó al agregar 5 mi de leche-PBS al 2% y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con rotación. El tubo Immuno® recubierto con miostatina resultante se lavó entonces tres veces con PBS antes de someterlo a procedimientos de selección. También se preparan tubos Immuno® adicionales para selecciones negativas (sin miostatina) . Para cada condición de inmunoplaqueteo, se sometieron cinco a diez tubos Immuno® al procedimiento anterior excepto que los tubos Immuno® se recubrieron con 1 mi de BSA-PBS al 2% en lugar de proteína miostatina.
Selección Negativa Para cada condición de inmunoplaqueteo, alrededor de 100 equivalentes de colección aleatoria para colecciones TN8-IX y TN12-I (5X1011 pfu para TN8-Ixd, y 1.4X1011 pfu para TN12-I) y alrededor de 10 equivalentes de colección aleatoria para la colección lineal (2.3X1010 pfu) se hicieron en alícuotas de la colección de reserva y se diluyeron hasta 1 mi con PBST (PBS con Tween-20 al 0.05%) . El 1 mi de colección de reserva se agregaron a un tubo Immuno® preparado para la selección negativa, y se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación orbital . El sobrenadante de fago se retiró y se agregó al segundo tubo Immuno® para otra etapa de selección negativa. De esta manera, cinco hasta diez etapas de selección negativa se realizaron.
Selección para Enlace de Miostatina Después de la última etapa de selección negativa anterior, el sobrenadante de fago se agregó a los tubos Immuno® recubiertos con miostatina preparados. El tubo Immuno® se incubó con agitación orbital durante una hora a temperatura ambiente, permitiendo que el fago específico se enlace a la miostatina. Después de que el sobrenadante se descartó, el tubo Immuno® se lavó alrededor de 15 veces con leche-PBS al 2%, 10 veces con PBST y dos veces con PBS para las tres rondas de selección con las tres colecciones (T 8-IX, TN12-I, y colecciones lineales) excepto que para la segunda ronda de selecciones con colecciones TM8-IX y TN12-I, el tubo Immuno® se lavó alrededor de 14 veces con leche-PBS al 2%, dos veces con BSA-PBS al 2%, 10 veces con PBST y una vez con PBS .
Elución no específica Después de la última etapa de lavado, los fagos enlazados se eluyeron del tubo Immuno® al agregar 1 mi de solución de trietilamina 100 M (Sigma, St . Louis, Missouri) con incubación de 10 minutos con agitación orbital. El pH del fago que contiene la solución se neutralizó entonces con 0.5 mi de tris-HCl 1 M (pH 7.5).
Elución del receptor (Receptor de Activina Humana) del fago enlazado Para la ronda 2 y 3 , después de la última etapa de lavado, los fagos enlazados se eluyeron del tubo Immuno® al agregar 1 mi de ?µ? de la proteína del receptor (receptor de activina humana recombinante IIB/Fc quimera, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) con una incubación de 1 hora para cada condición.
Elución del propéptido del fago de enlace Para la ronda 2 y 3, después de la última etapa de lavado, los fagos enlazados se eluyen del tubo Immuno® al agregar 1 mi de ?µ? de la proteina de propéptido (hecha como se describe arriba) con una incubación de 1 hora para cada condición.
Amplificación del Fago Se hace crecer cultivo fresco de E.coli (XL-1 Azul MRF' ) hasta ODeoo = 0.5 en medio LB que contienen 12.5 ug/ml de tetraciclína. Para cada condición de inmunoplaqueteo, 20 mi de este cultivo se enfrió en hielo y se centrifuga. El peletizado bacterial se vuelve a suspender en 1 mi de la solución de sales min A. Cada una de las mezclas de bacteria/fago que se hacen crecer durante la noche en una placa de agar NZCYM grande, se rasparon completamente en 35 mi de medio LB, y la placa de agar se enjuagó además con 35 mi adicionales de medio LB. La mezcla bacteria/fago resultante en medio LB se centrífugo para peletizar la bacteria. Se transfirieron 50 ul de sobrenadante de fago a un tubo fresco, y 12.5 mi de solución PEG (PEG8000 al 20%, acetato de amonio 3.5M) se agregó y se incubó en hielo durante 2 horas para precipitar los fagos . Los fagos precipitados se centrifugaron y se volvieron a suspender en 6 mi de la solución amortiguadora de resuspensión de fago (NaCL 250 rri , Tris pH8 100 mM, EDTA 1 m ) . Esta solución de fago se purificó además al centrifugar las bacterias restantes y precipitar el fago para el segundo tiempo al agregar 1.5 mi de la solución PEG. Después de la etapa de centrifugación, el peletizado de fago se volvió a suspender en 400 ul de PBS . Esta solución se sometió a una centrifugación final para deshacerse de las hebras de bacterias restantes. La preparación de fago resultante se tituló por un ensayo de formación de placa estándar (Molecualr Cloning, Maniatis et al., 3era edición).
Rondas adicionales de selección y amplificación En la segunda ronda, el fago amplificado (1011 pfu) de la primera ronda se usó como el fago de entrada para realizar las etapas de selección y amplificación. El fago amplificado (1011 pfu) de la segunda ronda se volvió a usar como' el fago de entrada para realizar la tercer ronda de selección y amplificación. Después de las etapas de elución de la tercera ronda, una fracción pequeña del fago eluido se sembró como en el ensayo de formación de placa de arriba. Las placas individuales se pincharon y se, colocaron en placas de microtitulación de 96 pozos que contienen 100 ul de la solución amortiguadora TE en cada pozo. Estas placas maestras se incuban a 4°C durante la noche para permitir que los fagos se eluyan en la solución amortiguadora TE.
Análisis de Clones ELISA de fago.. Los clones de fago se sometieron a un ELISA de fago y luego se procesaron en secuencia. Las secuencias se colocaron en intervalo como se discute abajo. El ELISA de fago se realizó como sigue. Un cultivo E.coli XL-1 Azul MRF ' se hizo crecer hasta OD60o alcanzando 0.5. Se procesó en alícuota 30 ul de este cultivo en cada pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos. Se agregaron 10 ul del fago eluido a cada pozo y se permitió que se infectara por bacterias durante 15 minutos a temperatura ambiente. Alrededor de 120 ul del medio LB que contiene 12.5 ug/ml de tetraciclina y 50 ug/ml de ampicilina se agregaron a cada pozo. La placa de microtitulación se incubó luego con agitación durante la noche a 37°C. La proteína de miostatina (2 ug/ml en solución amortiguadora de carbonato de sodio 0.1M, pH9.6) se permitió que se recubriera en placas Maxisorp® de 96 pozos (NUNC) durante la noche a 4°C. Como un control, se cubrió una placa Maxisorp® separada con BSA al 2% preparada en PBS . Al día siguiente, el líquido en la proteína que recubre las placas Maxisorp® se descartó, se lavó tres veces con PBS y cada pozo se bloqueó con 300 ul de solución de leche al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de leche se descartó, y los pozos se lavaron tres veces con la solución PBS . Después de la última etapa de lavado, alrededor de 50 ul de PBST-leche al 4% se agregó a cada pozo de las placas Maxisorp® recubiertas con proteína. Alrededor de 50 ul de los cultivos durante la noche de cada pozo en la placa de microtitulaicón de 96 pozos se transfirieron a los pozos correspondientes de las placas recubiertas con miostatina así como las placas recubiertas con BSA al 2% de control. Los 100 ul de la mezcla en los dos tipos de placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El líquido se descartó de las placas Maxisorp®, y los pozos se lavaron alrededor de tres veces con PBST seguido por dos veces con PBS. El anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amers ara Pharmacia Biotech) se diluyó hasta alrededor de 1:7,500, y 100 ul de la solución diluida se agregó a cada pozo de las placas Maxisorp® durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente. El líquido se descartó nuevamente y los pozos se lavaron alrededor de tres veces con PBST seguido por dos veces con PBS. Se agregó 100 ul del substrato quimioluminiscente LumiGlo® (KPL) a cada pozo de las placas Maxisorp® y se incubó durante alrededor de 5 minutos para que la reacción se presentara. La unidad de quimioluminiscencia de las placas Maxisorp® se lee en un lector de placa (Lab System) .
Procesado en secuencia de los clones de fago Para cada clon de fago, la plantilla de secuencia se preparó por un método PCR. Se usó el siguiente par de oligonucleótido para amplificar un fragmento de 500 nucleótidos: cebador #1: 5 ' -CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3 ' (SEQ ID NO: 294) y cebador #2: 5 'CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3 ' (SEQ ID NO: 295). La siguiente mezcla se preparó para cada clon. Reactivos Volumen ^L) /tubo ¾0 destilado 26.25 Glicerol al 50% 10 Solución amortiguadora PCR 10X (p/o 5 MgCl2) MgCl2 25 mM 4 Mezcla dNTP 10 mM 1 Cebador 1 100 µ? 0.25 Cebador 2 100 uM 0.25 Polimerasa Taq 0.25 Fago en TE (sección 4) 3 Volumen de reacción final 50 Se usó un termociclizador (sistema GeneAmp PCR 9700, Applied Biosystem) para correr el siguiente programa: [94°C durante 5 minutos; 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72 °C durante 45 segundos] x30 ciclos; 72 °C durante 7 minutos; enfriado a 4°C. El producto PCR de cada reacción se limpió usando el kit de purificación QIAquick Multiwell PCR (Qiagen) , siguiendo el protocolo del fabricante. El producto limpiado PCR se revisó al correr 10 ul de cada reacción PCR mezclada con 1 ul de pigmento (pigmento cargado en gel de agarosa 10X BBXS) en un gel de agarosa al 1%. El producto restante se procesó entonces en secuencia usando el Secuenciador ABI377 (Perkin Elmer) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante .
Colocación en intervalo y Análisis de Secuencia Las secuencias de péptido que se traducen de las secuencias de nucleótido se correlacionan con los datos ELISA. Los clones que muestran altas unidades quimioluminiscentes en los pozos recubiertos con miostatina y bajas unidades quimioluminiscentes en los pozos recubiertos con BSA al 2% se identifican. Las secuencias que presentan tiempos múltiples se identifican. Las secuencias candidato elegidas con base en estos criterios se someten a análisis adicionales como pepticuerpos . Aproximadamente 1200 clones individuales se analizan. De estos, aproximadamente 132 péptidos se eligen para generar los pepticuerpos de la presente invención. Estos se muestran en la Tabla I abajo. Los péptidos que tienen la SEQ ID NO: 1 hasta 129 se usan para generar pepticuerpos del mismo nombre. Los péptidos que tienen la SEQ ID NO: 130 hasta 141 mostrados en la Tabla 1 comprenden dos o más péptidos de la SEQ ID NO : 1 hasta 132 enlazados por una secuencia de agente de ligado. La SEQ ID NO: 130 hasta 141 también se usan para generar pepticuerpos del mismo nombre. Las secuencias de consenso se determinan para el grupo derivado de TN-8 de los péptidos. Estos son como sigue : KDXCXXWHW CKPX (SEQ ID NO WXXCXXXGFWCXNX (SEQ ID NO IXGCXW DXXCYXX (SEQ ID NO XXWCVSPXWFCXXX (SEQ ID NO XXXCPWFAXXCVDW (SEQ ID NO Para todas las secuencias d consenso anteriores , las "secuencias núcleo" subrayada de cada secuencia de consenso son los aminoácidos que empre se presentan en tal posición. "X" se refiere a cualquier aminoácido modificado o que se presenta naturalmente. Las dos cisteínas contenidas con las secuencias núcleo se fijan a los aminoácidos en la colección TN8-IX.
TABLA I NOMBRE DEL PEPTICUERPO SEQJD ?? SECUENCIA DEL PEPTIDO Miostatina -TN8-Conl 1 K.DKCKMWHWMCKPP Miostatina -TN8-Con2 2 K L ^MWHWMCKPP Miostatina-TN8-Con3 3 KDL miW WMCKPP Miostatina-TN8-Con4 4 KDLCKMWHWMC PK iostatina-T 8-Coii5 5 WYPCYEFHFWCYDL Miostatina -*TN8-Con6 6 WYPCYEGHFWCYDL Miostatina -TN8-Con7 7 EFGC WW VQCYQF .Miostatina -TN8-Con8 8 IFGC W DVDCYQF Miostatina -TN8-Con9 9 ADWCVSPN FCMVM Miostatina -TN8-ConlO 10 H FCPWWALFCWDF Miostatina -TN8-1 11 KDLC WHWMC PP Miostatina -TN8-2 12 mKCAIWGWMCPPL Miostatina -TN8-3 13 WYPCGEFGMWCLNV Miostatina -TN8-4 14 WFTCLWNCDNE Miostatina -TN8-5 15 H PCPWFAPLCVEW Miostatina -TN8-6 16 Jbü¿W RW .WMCKPH Miostatina -TN8-7 17 FETCPSWAYFCIDI Miostatina -T 8-8 18 AY CEANDWGCWWL Miostatina -TN8-9 19 NSWCEDQWHRC WL Miostatina -TN8-10 20 WS ACY AGHFWCYDL Miostatina -TN8-11 21 A WCVSPNWFCMVM Miostatina-TN8-12 22 WTBCYQQEFWCWNL Miostatina -TN8-13 23 ENTCERWKWMCPP Miostatina-TN8-14 24 WLPCHQEGFWCMNF Miostatina -TN8-15 25 STMCSQWHWMCNPF Miostatina-TN8-16 26 1 ¡KKKWWDVDCYQF Miostat¡na-TN8-17 27 [YGCKWWDIQCYDI Miostatina-T 8-18 28 PDWODPDWWC FW Miostatina-TN8-19 29 QGHCTR WMCIPPY Miostatina-TN8-20 30 WOECY EGFWCLOT Miostatina-TN8-21 31 HDCYGPC3EF CWSP iostatina-TN8-22 32 GVRCPKGHL CLYP Miostatina-*TN8-23 33 HWACX5YWPWSC WV Miostatina-T 8-2 34 GPACHSPWWWCVFG Miostatina-TN8-25 35 TTWCISPMWFCSOQ iostatina- N8-26 36 HKEOTWA1FCWDF Miostatina.-TN8-27 37 PD CVSPRWYCNMW Miostatina-TN8-28 38 VW CHWFGMDCEPT Miostatina-TN8-29 39 K35HCX3IWTWMGAPK ' Miostatina-TN8-30 40 WFOCGSTLFWCYNL Miostatina-TN8-31 41 WSPCYDHYFYCYTI Miostatina-TN8-32 42 SWMOG HVC V iostatina-TN8-33 43 EMLCMIHPVFCNPH Miostatina-TN8-34 44 I TCNLWFWMCPPL Miostatina-TN8-35 45 VVGC WYEA.WCYNK iostatina-TN8-36 46 PIHCTQ AWMCPPT iostatina-T 8-37 47 DSNCPVraPLSCVIF iostatina-TN8-38 48 HIWasnLAMM CVE iostatina-TN8-39 49 NLQCIYFLXJKCJYF Miostatina-TN8- 0 50 AWRCMWFSDVCTPG iostatina-TN8- 1 51 WE CFLDADWCTSV iostatina-T 8- 2 52 E ICOMWSWMGAPP Miostatina-TN8-43 53 WFYCHL SECTEP Miostatina-TN8- 4 54 FW CAIGIDKC RV iostatina-TN8-45 55 NIXKXWYEVWCFTY iostatina.-*EN8-46 56 IDLCN WEKJ CYPP iostatina-TN8-47 57 EMPC IWGWMCPPV Miostatina-TN12-l 58 WFRCVLTGrVDWSECFGL Miostatina-TN12-2 59 GFSCTFGLDEFYVDCSPF iostatina-TN12-3 60 LEWODXJVNADWGFCMLW iostatina-TN12-4 61 YPTCSEETWIYGO CVLW Mbstatina-TN12-5 62 LGPCPIHHGP PQYCVYW Miostatina-TN12-6 63 PFPCKEHQIS LGHCXSF iostatina-TN12-7 64 HWGCEDm SWHPLCR P iostatina-TN12-8 65 L LCDADMMPTIGFCVAY Mtastatina-TN12-9 66 SH CE-TTFWMNYA CVHA iostatina-TN12-I0 67 LPKCIHVPEDGGGPCLWY iostatina-T 12-ll 68 1¾S(^SPVSR0DMFCVFY iostatina-T 12-13 69 SII CEYSGWLQPLCYRP Miostatina-TN12-14 70 PWWCODNYVQHMLHCDSP Miostatina-TN12-15 71 WFRC L NSFDAFOCVSY Miostatina-TN12-16 72 PDACRIX3FWYMFMGCMLG Miostatina-TN12-l7 73 FI CFVEFELCFDS Miostatina-TN12-18 74 SAYCIIIESDPYVLCVPL Miostatina-TN12-19 75 PSICESYST WLPMCQH Miostatina-TN12-20 76 WUXSDDSWA T MCRSH Miostatina-TN12-21 77 YL CVMMNTSPFVECVEN Miostatina-TN12-22 78 YPWCIX3IMO^n 3 Y Miostatina-TN12-23 79 FDYCTWUÍGFKDWKCWSR Miostat¡na-TN12-24 80 LPLCNLKEISHVQACVIJF Miostatina-TN12-25 81 SPECAFARWLGEQOQRD Miostatina-TN12-26 82 YPOCE T fíTJJWTBCDWF Miostatina-TN12-27 83 RWRCEIYDSEELP CWEF Miostatina-T 12-28 84 LVGCDNV HRCKLF Miostatina-TN12-29 85 AG CHVWGEMFGMGCSAL Miostatina-TO12-30 86 HHECEWMARWMSLDCVGL Miostatina- N12-31 87 MCGIAGMKDFDFCVWY Miostatina-TN12-32 88 RDDCTFWPEWLWKLCBRP Miostatina-TN12-33 89 YNFCSYLFGVS EACQLP Miostat¡na-TN12-34 90 AHWCEQGPW YGNIC AY Miostatina-TN12-35 91 LVCGKISAWGDEACARA Miostat¡na-TN12-36 92 H1WCT1MGPSM WFCWND Miostatina-TN12-37 93 DI _AMWGWR^?WCQNS Miostat¡na-T 12-38 94 PPFCQ^NDMI^SLC LL Miostatina-TN12-39 95 WYDC VPl^I^GLCO LF iostatina-TN12-40 96 YGDCDQ HWMWPFItXSL Miostatina-TN12-41 97 GWMCHPDLHDWGATCOPD ¡ostat¡na-T 12-42 98 YFHCMFGGBEFEVHCESF Miostatina-TN12-43 99 AYWCWHGQCVRF Miostatina-Lineal -1 100 SEHWI' l'DWDG EWWVRPF iostatina-Lineal -2 101 MEMLDSU JJODMVPISKA Miostatina-Lineal -3 102 SPPEEALMEWLGWQYG FT Miostatina-Lineal -4 103 SPE II TOLYILMT 0EWYG Miostatina-Lineal -5 104 FHWEEGIPmVVTPYSYDRM Miostatina-Lineal -6 105 KRIX33QF DLAELVSGHS Miostatina-Lineal -7 106 DTRDALFQEFYEFVRSRLVI Miostatina-Lineal -8 107 R SAAPRPLTYRDIMDQYWH Miostatina-Lineal -9 108 NDKAHFFEMEMFDY mFVES Miostatina-Lineal -10 109 0TQAQKI1X>LWEL3LQSIRNQ Miostatina-Lineal -11 110 MI^EFEEFLG LVHRQEA Miostatina-Lineal -12 111 YTPKMGSEWTSFWHNEIHYL Miostatina-Lineal -13 112 LNDTT J .RHT .KMVLNSLSD Miostatina-Lineal -14 113 H)VEi^L-MRWLEGFMQSAAT Miostatina-Lineal -15 114 IfflG YIJRKGSAPQWFBAWV Miostatina-Lineal -16 115 VESLHQLQMWL QKLASGPH Miostatina-Lineal -17 116 RATT ,T . DFWQLVEGYGDN Miostatina-Lineal -18 117 BELLREFYKFVSAFDY Miostatina-Lineal -19 118 G IDEFSHFIAEQFYQ PGG Miostatina-Lineal -20 119 YRE^MI_ 3I1X»VIJ5RLQIÍY Miostatina-Lineal -21 120 HNSSQ LLSELMLVGSMMQ Miostatina-Lineal -22 121 WREHFIJ-ÍSDYIRDKLIAIDG Miostatina-Lineal -23 122 QFPFYVFDDLPAQLBYWIA Miostatina-Lineal -24 123 EPPHm-H HRSEVNEIWLDMN ; Miostatina-Lineal -25 124 EALFQ FFRDVLTLSEREY Miostatina-Lineal -26 125 QYWEWWMTYFRENGLHVOY Miostatina-Lineal -27 126 NQRMMLEDLWRIMTPMFGRS Miostatina-Lineal -29 127 FLDHT ,KAFJ .SRHYALDDLDE Miostatina-Lineal -30 128 GKIJEGIIlíEL OI-ETF PD Miostatina-Lineal -31 129 IIJLXDEY KDW SWF Miostatina-2xTN8-19 kc 130 QGHC FWMCPPYGSGSA GGS GSTASSGSGSATGQGHCT WPWM CPPY Miostaíina-2xTN8-con6 131 WYPCYEGHFWCTOLGSGSTASSG SGSATGWYPCYEGHFWCYDL Miostatina-2xT 8-5 kc 132 HTPCPWAPLCVB GSGSATGGSG STASSGSGSATGHTPCPWFAPLCV EW Miostatina-2xTN8-18 kc 133 PDWC3DPDWWC FWGSGSATGGS GSTASSGSGSATGPD CIDPDWW C FW Miostatina-2xTN8-ll kc 134 A1WCVSPNWFCMVMGSGSA GG SGSTASSGSGSATGANWCVSPNWF CMVM Miostatina-2x 8-25 kc 135 PDWCJDPD WCKFWGSGSATGGS GSTASSGSGSATGPDWCIDPDWW CKFW Miostatina-2xTN8-23kc 136 HWACGYWPWSCKWVGSGSATGG SGSTASSGSGSATGHWACGYWPW SCKWV Miostatina-TN8-29-i9 kc 137 KmCQlWTWMCAP GSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRWPWM CPPY M¡ostatina-TN8-19-29 kc 138 QGIICTRWPWMCPPYGSGSATGGS GSTASSGSGSATG KHCQIWTWM CAPK Miostatina-TN8-29-19 kn 139 KKHCXJIWTWMCAPKGSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRWPWM CPPY Miostatina-TN8-29-19-8g 140 KKHCQrWTWMCAPKGGGGGGGG QGHCTRWPWMCPPY M¡ostatina-TN8-19-29-6gc 141 QGHCTRWPWMCPPYGGGGGGKK HCQIWTWMCAPK Ejemplo 2 Pep icuerpos generados Construcción de proteínas de fusión Fc-péptido que codifican el ADN Los péptidos capaces de enlazar la miostatina se usan solos o en combinación uno con el otro para construir proteínas de fusión en las cuales un péptido se fusiona al dominio Fe del IgGl humano. La secuencia de aminoácidos de la porción Fe de cada pepticuerpo es como sigue (a partir de las terminaciones amino a las terminaciones carboxilo) : DKl¾TCPPCrAPEIJJ3GPSVH-PPP P M SHEDFBVE-FNVnfVIXWEVHNAK^ HQDWLNGKEYKCEV SNKALfMlE! KAKGQFKEi VYTLPPS M>ELTKNQVSLTCLVKOT DSIXJSFH^YSKLTVDKSRWQ^ LSPGK (SeqIDNo:26) El péptido se fusionó en la configuración N (el péptido se enlazó a la terminación N de la región Fe) , la configuración C (el péptido se enlazó a la terminación C de la región Fe), o la configuración N,C (el péptido se enlazó a las terminaciones N y C de la región Fe) . Se usaron vectores separados para expresar las fusiones de terminal N y las fusiones de terminal C. Cada pepticuerpo se construye al combinar en sus pares base pares de oligonucleótidos ("oligos") para el ácido nucleico del fago seleccionado para generar una secuencia de nucleótido de hebra doble que codifica el péptido. Estas moléculas de polinucleótido se construyen como fragmentos ApaL hasta Xhol . Los fragmentos se ligan a ya sea el vector de terminal N pAMG21-Fc para la orientación de terminal N, o el vector de terminal C pAMG2l-Fc para la orientación de terminal C que se ha digerido previamente con ApaLI y Xhol. Las mezclas de ligado resultantes se transforman por electroporación en la cepa 2596 de E.coli o células 4167 (una variante hsdR de células 2596 de cepa) usando procedimientos estándar. Los clones se separaron por exclusión para la capacidad de producir el producto de proteina recombinante y para poseer la fusión de gen que tiene una secuencia de nucleótido correcta. Un sencillo de tal clon se selecciona para cada uno de los péptidos modificados. Muchos de los constructos se crean usando un vector alternativo designado pAMG21-2x-Bs-N (ZeoR) Fe . Este vector es similar al vector arriba descrito excepto que la digestión del vector se realiza con BsiriBI . Algunas secuencias de péptido se fusionan a los constructos en ambos finales del Fe. En aquellos casos, el vector está compuesto de pAMG21-2xBs-N(ZeoR) fe y pAMG21-2xBs-C-Fc .
Construcción de pAMG21 El plásmido de expresión pAMG21 (ATCC No. 98113) se deriva del vector de expresión pCFM1656 (ATCC No. 69576) y el sistema de vector de expresión descrito en la Patente E.U.A.
No. 4,710,473, siguiendo el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente Internacional publicada O 00/24782, toda las cuales se incorporan en la presente para referencia.
Vector de terminal N Fe El vector de terminal N Fe se construye usando el vector pAMG21 Fc_Gly5_Tpo como la plantilla. Un cebador PCR 5' (abajo) se designa para remover la secuencia de péptido Tpo en pAMG Tpo Gly5 y se reemplaza con un poliagente de ligado que contiene los sitios ApaLl y Xhol . Usando este vector como la plantilla, el PCR se realiza con Polimerasa Larga Expandida, usando el siguiente cebador 5' y un cebador 3' universal : Cebador 5': 5 'ACAAACAAACATATTGGGTGCACAGAAAAGCGGCCGCAAAAAAA CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA-3 ' (SEQ ID NO: 297) Cebador 3': 5 ' GGTCATTACTGGACCGGATC-3 ' (SEQ ID NO: 298).
El producto PCR resultante se purificó con gel y se digirió con las enzimas de restricción Ndel y BsrGI . Tanto el plásmido y el polinucleótido que codifican el péptido de interés junto con su agente de ligado se purificaron en gel usando columnas de giro de purificación en gel Qiagen (Chatsworth, CA) . El plásmido y el inserto se ligaron entonces usando procedimientos de ligación estándar, y la mezcla de ligación resultante se transformó en células E.coli (cepa 2596) . Los clones sencillo se seleccionaron y se realizó el proceso en secuencia de ADN. El clon correcto se identifica y se usa como una fuente de vector para los péptidos modificados descritos en la presente.
Construcción del Vector de terminal C Fe El vector de terminal C Fe se construye usando el vector pAMG21 Fc_Gly5__Tpo como la plantilla. El cebador PCR 3' se designa para remover la secuencia del péptido Tpo y para reemplazar con un poliagente de ligado que contiene los sitios ApaLi y Xhol . El PCR se realizó con polimerasa de larga expansión usando un cebador 5 ' universal y el cebador 3' . Cebador 5': 5 ' -CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3 ' (SEQ ID NO : 299) Cebador 3' : 5 ' -TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTG TGCACCACCACCTCCACCTTTAC-3' (SEQ ID NO: 300) .
El producto PCR resultante se purificó en gel y se digirió con las enzimas de restricción BsrGI y Barriñl . Tanto el plásmido como el polinucleotido que codifican cada péptido de interés con su agente de ligado se purificaron con gel por medio de columnas de giro de purificación en gel Qiagen. El plásmido y el inserto se ligaron entonces usando procedimiento de ligado, y la mezcla de ligado resultante se transformó en células E.coli (cepa 2596) . La cepa 2596 (ATCC # 202174) es una cepa de E.coli K-12 modificada para contener el promotor lux y dos represores sensibles a la temperatura lambda, el represor cI857s7 y el lac IQ. Se seleccionaron clones sencillos y se realizó la secuencia de ADN. Un clon correcto se identificó y se usó como una fuente de cada pepticuerpo descrito en la presente .
Expresión en E.coli Los cultivos de cada uno de los constructos de fusión pAMG21-Fc en la cepa 2596 de E.coli se hacen crecer a 37°C en medio de caldo Terrífico (ver Tartof y Hobbs, "Improved media for growing plasmid and cosmid clones", Bethesda Research Labs Focus, Volumen 9, página 12, 1987, citado en la referencia de Sambrook et al . , anteriormente mencionada) . La inducción de la expresión del producto de gen a partir del promotor luxPR se realizó después de la adición del autoinductor sintético, N- (3 -oxohexanoil) -DL-homoserina lactona, al medio de cultivo hasta una concentración final de 20 nanogramos por mililitro (ng/ml) . Los cultivos se incubaron a 37°C durante seis horas adicionales. Los cultivos bacteriales se examinan entonces por microscopio para la presencia de cuerpos de inclusión y colectarlos por centrifugación. Los cuerpos de inclusión refractiles se observan en cultivos inducidos, lo que indica que las fusiones Fe son más posiblemente producidas en la fracción insoluble en E.coli. Los peletizados celulares se lisan directamente por resuspensión en solución amortiguadora de muestra Laemmli que contiene ß-mercaptoetanol al 10% y luego se analiza por SDS-PAGE. En la mayoría de los casos, una banda teñida con coomassie intensa del peso molecular apropiado se observa en un gel SDS-PAGE.
Pepticuerpos plegados y purificados Las células se rompen en agua (1/10 volumen por volumen) por homogenización de alta presión (3 pases a 15,000 PSI (1054.5 Kg/cm2) ) y los cuerpos de inclusión se cosechan por centrifugación (4000 RPM en J-6B durante 30 minutos) . Los cuerpos de inclusión se solubilizan en guanidina 6 M, Tris 8 50 mM, DTT 8 mM, pH 8.0 durante 1 hora a una relación 1/10 a temperatura ambiente. La mezcla solubilizada se diluye 25 veces en urea 4 M, glicerol al 20%, Tris 50 mM, arginina 160 mM, cisteína 3 mM, cistamina ImM, pH 8.5. La mezcla se incubó durante la noche en el frío. La mezcla se dializó entonces contra Tris 10 mM, pH 8.5, NaCl 50 mM, urea 1.5M. Después de una diálisis durante la noche, el pH del dialisado se ajustó hasta pH 5 con ácido acético. El precipitado se removió por centrifugación y el sobrenadante se cargó en una columna SP-Sepharose Fast Flow equilibrada en NaAc 10 mM, NaCl 50 mM, pH 5, 4°C) . Después de cargar, la columna se lavó hasta la línea base con NaAc 10 M, NaCl 50 mM, pH 5.2. La columna se desarrolla con un gradiente de volumen de columna 20 desde NaCl 50 mM-500 mM en la solución amortiguadora de acetato. Alternativamente, después de que se lavó hasta la línea base, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM pH 7.0 y la columna se desarrolló con un gradiente de volumen de columna 15 a partir de NaCl 0-400 mM en solución amortiguadora de fosfato. Las fracciones de columna se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones que contienen el pepticuerpo dimérico se agruparon. Las fraciones también se analizaron por filtración en gel para determinar si cualquier agregado está presente. Un número de pepticuerpos se prepara a partir de los péptidos de la Tabla I. Los péptidos se enlazan a la molécula IgGl Fe humana para formar los pepticuerpos en la Tabla II . Con respecto a los pepticuerpos en la Tabla II, la configuración C indica que el péptido nombrado se enlaza a la terminación C del Fe. La configuración N indica que el péptido nombrado se enlaza a la terminación N del Fe . La configuración N, C indica que un péptido se enlaza a la terminación N y uno a la terminación C en cada molécula Fe. La designación 2x indica que los dos péptidos nombrados se enlazan en tándem uno al otro y también se enlazan a la terminación N o C, o ambas N,C del Fe, separado por un agente de ligado indicado. Dos péptidos enlazados en tándem separados por un enlazados, se indican, por ejemplo, como Miostatina-TN8-29-19-8g, que indica que el péptido TN8-29 se enlaza por medio de un agente de ligado (gly) 8 al péptido T 8-19. Los péptidos se enlazan a Ec por medio de una secuencia de agente de ligado (gly) 5 salvo que se especifique de otra manera . En algunas instancias, los péptidos se enlazan por medio de un agente de ligado k. El agente de ligado designado k o lk se refiere a la secuencia de agente de ligado gsgsatggsgstassgsgsatg (SEQ ID NO: 301), con kc refiriéndose al agente de ligado unido a la terminal C del Fe, y kn refiriéndose al agente de ligado unido a la terminal N del Fe. En la Tabla II abajo, la columna 4 se refiere a la secuencia de agente de ligado que conecta el Fe al primer péptido y la quinta columna se refiere a la configuración N o C o ambas. Ya que la molécula Fe dimeriza en solución, el pepticuerpo se construye de manera que tenga uno péptido que actualmente sea un dímero con dos copias del péptido y dos moléculas Fe, y la versión 2X que tenga dos péptidos en tándem que actualmente sean dimeros con cuatro copias del péptido y dos moléculas Fe . Ya que los pepticuerpos dados en la Tabla II se expresan en E.coli, el primer residuo de aminoácido es met (M) . Por lo tanto, los pepticuerpos en la configuración N son Met-péptido-agente de ligado-Fc, o Met-péptido-agente de ligado-péptido-agente de ligado-Fc, por ejemplo. Los pepticuerpos en la configuración colocan como Met-Fc-agente de ligado-péptido o Met-Fc-agente de ligado-péptido-agente de ligado-péptido, por ejemplo. Los pepticuerpos en la configuración C,N son una combinación de ambos, por ejemplo, Met-péptido-agente de ligado-Fe-agente de ligado-péptido . Las secuencias de nucleótido que codifican pepticuerpos ejemplares se proporcionan abajo en la Tabla II. Las secuencias de polinucleótido que codifican un pepticuerpo ejemplar de la presente invención incluyen una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de polipéptido Fe tal como la siguiente : 5'-GAC AAACTCACACATCT CTGGCKXKJACCGTCAGTTTTC TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT^ AAGACCCTCAGGTCAAG TCAACIXJGIACG' ATGCX.AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAl^^ AAGTG AGGIX7TCCAACAAAGCCCTCCX¾ TCCLAAAGCX-IAAAGGGCAGCCCOGAGAACXIACAGGTGTACA TXXXXK3GATGAGCTGACCAAGAA<XAGGTt--AGCC GACCTGCCTC GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTC^ GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCXXGTXjCTGGACTCC^ TCCTCTACAGCAAGCTCAGCGIGGACAAGAG TCTCTCATX3_nGCGlX3ATGC^ GAGCCTCTCXXriGTCIXXX}GGTAAA-3'.(Scq ID No: 301) Además, los polinucleótidos que codifican el agente de ligado GGGGG tal como el siguiente se incluyen: 5 ' -GGTGGAGGTGGTGGT-3 ' (SEQ ID NO: 302) El polinucleótido que codifica el pepticuerpo también incluye el codón que codifica la metionina ATG y un codón de detención tal como TAA. Por lo tanto, la estructura del primer pepticuerpo en la Tabla II es TN8-Conl con una configuración C y un agente de ligado (gly)s es como sigue: M-Fc-GGGGG- DKCKMWH MCKPP (SEQ ID NO: 303) . Los polinucleótidos ejemplares que codifican este pepticuerpo serán: ACXjAAGA(XÍJrGAGGTCAAGTTCAACro ATAATGCCAAGACAAAGCCGCXKJGAGGAG ^ GTGGTCAGOJIXXTCACCGT^^ TACAAGTGCAAGG CTiXAACAAAGCCCTO^ ATCTCX^AAGCCAAAGGGCAGCCCXMA^ X-ATC X-X3GGATGAGCTOACCAAGAACCAGGT^ AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC^ CCXKJAGAAC-AACrACAAGAOCACGCClXXXXH'GCTO TTCITCCTCTACAGCAAGCIX^^ AACGTCTTCTGATGCIXXGTGATGCATC AGAAGAGCCTCIXXXTGTXJIXXXJGGTAAAGG GGAGG ATCCAAAATGTGGCACTGGATGTGCAAACCGOCG-3* (Seq ID No: 304) TABLA II Nombre del Pepticuerpo 3éptido Secuencia de Nucleótido (Seq ?) No) Miostatina-TN8- KDKC WHWMC PP AAAGACAAATGCAAAATGTGGCACTG S iy c conl GATGTGCAAACCGCCG (Seq. ID No: 147) Miostatina-TN8- KDLCAMWH CKPP AAAGACCTGTGCGCrATGTGGCACTG S gly c con2 GATGTGCAAACCGCCG (Seq. ID No: 148) Miostatina-TN8- KDLCiavíW WMCKPP AAAGACCTGTGCAAAATGTGGAAATG 5 giy c con3 GATGTGCAAACCGCCG (Seq ID No: 149) M¡ostat¡na-TN8- DLC WHW CKP AAAGACCTGTGCAAAATGTGGCACTG s gly c con4 GATGTGCAAACCGAAA (Seq ID No: 150) iostatina-T 8- WYPCYEFHFWCYDL TGGTAÍ CGTGCTACGAATTCCACTTC 5 giy c conS TGGTGCTACGACCTG (Seq ID No: 151) iostatina-TN8- WYPCYEFHFWCYDL TGGTAC!CCGIGCTACGAATTCX-ACrTC 5 giy N con5 TGGTGCTACGACCTG (Seq ID No: 152) WIiostatina-*ITí8- WYPCYEGHFWCYDL TGGfTA< CCGTGCTACGAAGGTCACTT 5 giy C con6 CTGGTGCTACGACCTG (Seq ID No: 153) Miostatina-TN8- YPCYEGHFWCYDL TGGTACCCGTGCTACX3AAGGTCACTT S ly N con6 CTGGTGCTACGACCTG (Seq ID No: 154) Miostatina-TN8- IFGCKW DVQCYQF ATC rcGGTTGCAAATGGTGGGACGT 5 iy C con.7 TCAGrGCTACCAGTTC (Seq ID No: 155) Miostatina-TN8- IFGCKWWDVDCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT 5 iy C con8 TGACTGCTACCAGTTC (Seq ID No: 156) Miostat¡na-TN8- IPGCKWWDVDCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT 5 giy N con8 TGACTGCTACCAGTTC (Seq ID No: 157) Miostatina-T 8- ADWCVSPNWFC VM GCtGACTGGTGCGTTTCCCCGAACTG 5 giy C con9 nTCTGCATGGTTATG (Scq ID No: 158) iostatina-TN8- U JKJFW WALtCWJU C^CAAATIXn3CXXX3TGGTGGGCTCr Sgiy c conlO QTTCTOCTOGQACrrC (Seq ID No: 159) Miostatina-TN8-l EOílJCSECMWHW CKIlP AAAGACXriXjTGCAAAATQTGQCACTG S iy c GATOTGCAAACCOCCG (Seq ID No: 160 Miostatina-TN8-2 [DKCA G MCPPL ATCGACAAAJGCGCTATCIGGGGTTG sgiy c OATdlGCXXXOCa TQ (Seq TD No: 161) Miostatina-1N8-3 WTfPCX3 ¾M CLNV rGGTAaXGTGCGGTGAATTCGGTAT giy c GTGOTOCCTGAACGTT fScq ID No: 162) Miostatina-TN8-4 FTCLWNCDNE IXJGTTCACCIX XKSTGGAACTGCGA S i c CAACGAAÍSoq ID No: 163) Miostatina-TN8-5 KI -F iAPLCVJsW C&CACCCCGTG<XCOTGGTTCGC^ sgi c GCTGTGCGTTOAATGG (SeqlDNo: 164) Miostatina-TN8-6 KEWCWEWK CKPE AAAGAATGGTCCTGGCGTTGGAAATG Sgly c GATGTGCAAACGGGAA (ScqlDNo: 165) Miostatina-TN8-7 FETCPSWAYPCLDI TXTOAAA<XTGCCCGTCCTGGGCTTA 5gly c Cl CTGCCrGGACATC (Scq ED No: 166) Miostatina-TN8-7 PETCPSWAYPCIJDI TTWAAACCIX XXXJTCCTGGGCTTA N CTTCTGCCTGGACATC (Seq ID No: 167) Miostatina-TN8-€ AYKCEANDWGCWWL GOTACAAATGCGAAGCrAACGACrG 5giy C GGGTK3CK3GTGGCTG (Seq C No: 168) Miostatina-TNS- NSWCEDQWHRCWWL AACIXXTIX3G GCGAAGACCAGTGGCA 5giy c CCGTTGCTGGTGGCTG (SeqlDNo: 169) Miostatina-TN8-10 WSACYAGHFWCYDL rGGTCX3CI GC AXK^ GGTCACrTC 5giy c TGGTGCTACGACCTG (Scq ED No: 170) M'iostafina-T 8-li ANWCVSPNWFCMV G rAACTGGTGCGTI CXXCGAACrG S iy c GT CTGCATGGTTATG (Seq IDNO: 171) iostatina-T 8-12 WTECYQQEFWCWNL TGGACCGAA GCTACAGGAGGAATT Sgiy c CTGGTGCTGGAACCTG (Se JNo: 172) Miostatina-TN8-13 ENTCERWKW CPPK GAAAAC^CCTGCGAACGTTGGAAATG 5giy c GATGTGCCCOCCGAAA (Scq E> No: 173) iostatina-TN8-14 WLPCHQEGFWCMNF TOGCTGCCGTGOCACCAGGAAGGTTT sgiy c CTGGTGCATGAACTTC (Seq JD No: 174) Miostatina-TN8-15 STMCSQWHWMCNPF TCXACXATGTGCTCCCAGTGGCACTG 5? c 0ATOT0CAACCO3TTC (Seq ID No: 175) Miostatina-TN8-l<S IKKZiiWWDVDCYQF ATCTIXXfGTroCCACTGGTGGGACGT 5?y c TOACTGCTAOCAGTTC (SeqlDNo: 176) Miostatina-TN8-17 IYQC WWDIQCYDI ATCTACGGTTGCAAATGG GGGACAT 5gly c CCAGTGCTACGACATC (Sc EDNo: 177) Miostatina-TN8-18 PD C3DPDWWC FW CXX jACTGGTGCATCGATCCGGACTG s? c GTGGTGCAAATTCTGG (SeqlDNo: 178) Miostatina-TN8-19 QGHCTR.WPWMCPPY CAGGGTCACTGCACCXXJTTGGCCGTG 5giy c GATGTGCOCGCCGTAC (SeqlDNo: 179) iostatina-T 8-20 WQECYREGFWCLQT rGG lAGGAATGCTAOGTGAAGGTTT 5giy c CTGGTGOCTGCAGACC (Scq TD No: 180) 17 CTGTGC lCGACTCC (Seq ID Na: 223) iostatina-TN12- SAYCn ESDPyVLCVP IXXXK^TACTG<^TCATCACCX3AAT8 5 gly N 18 L GACXXGTACGTTCTGrGCGTrCCGCTG (SeqE)No:224) Miostatina-TN12- PSICESYST LPMCQ <XXnXX-ATCIX3CGAAI€CTACTCCACX: 5 gly N 19 H ATXnX¾3CroCCGATGTX3CCAGCACAA C (ScqIDNo:225) Miostatina-TN12- WLDCHDDSWAWTKM TX TGGACTGCCACGACGACTCCTG 5 gly N 20 CRSH GGCTTGGACCLAAAATGTGCCXJITCCC AC (Sc IDNo:226 Miostatina.-T 12- YLNCVMM TSPFVEC TACCTGAACI.KX3TTATGATGAACAC 5 gly N 21 VFN CKXXX-XnTCGTTGAATGCGTTI CAA C <Seq ID No: 227) iostatina.-lN12- YP OX-FMIQQGTrC TA<XCGTGGTCCGACGGTTTCATGAT 5 gly N 22 FY CXLAGCAGGGTA CACO3CATGTTCr AC (SeqlDNo: 22S) Miostatina-T 12- FDYCTWLNGPE.DWKC TI XJACTACTGCACCTGGCTGAACGG 5 gly N 23 WSR TTTCAAAGACK¾3AAATGCTGG CCC GT (Se IDNo:229) iostatina-TN12- LP1X3ÍOCBCSHVQACVL C G(XX3ClX3TGCAA<XrrGAAAGAAAT 5 gly N 24 F CTCCCA.CXn CAGGCl G03TTCTGTT C <SeqIDNo:230) Miostatina-TN12- SPECAFAR LGTEQCQ TXXXGGAATGCGCITrcGCTCGTTGG 5 gly N 25 RD CTGGGTATCGAAGAGTGCCAGCGTGA C (SeqED o:231) Miostatina-TN12- YPQC!FM-HIJLEWTECD TACCOaCAGTGCTTCAACCTGCACCT 5 gly N 26 WF GCTGGAATGGACCGAATGCGACTGGT TC (Seq ID No: 232) Miostatina- N12- V¾CEIYDSEFLP CW CGTTGGCGTTGCGAAATCTACGACTC 5 gly N 27 EF CGAATTCCTGCCGAAATGCTGGTTCTT C (ScqIDNo:233) Miostatina-TN12- LVGCDNVWHRCKLF CTGGTTGGTTGCGACAACGTTTGGCA 5 gly N 28 CCX3TTGCAAACTGTTC (SeqlD o: 234) Miostatina.-TN12- AGWCHVWGEMFGMG GCTGGTTGGTGCCACGTTTGGGGTGA s iy N 29 CSAL AATCTTCGGTATGGGTTGCfCCGGTCT G (ScqIDNo:235) Miostatina-TN12- HHECEW ARW SLD C-ACCACGAATGCGAATGGATGGCTCG 5 gly N 30 CVGL T1X3GATGTCS^CTGGACTGCGTTGGTCT G (Se IDNo:236) Miostatina.- Nl2- EPMCGIAGMKDPDFCV TTCCCGATG GCGG ATCGCTGGTAT 5 gly N 31 WY GAAAGACTTCGACrrCTGCGTTTGGT AC (SeqlDNo: 237) Miostatina- N12- DIXnrWEWLWEJjC CGTGATGATTGTACITri GGCCAGAA 5 gly N 32 ERP TGGCITTGGAAACTTTGTGAACGTOC A (Scq ID No: 238) Miostatina-TN12- YNPCSYLFGVS EACQ TA ATirnm urrAitJiTm-aG-G 5 gly N 33 LP ITTCTAAAGAAGCTTG CAACTTCCA (Seq ID No: 239) iostatina-TN12- AHWCBQGPWRYGNIC GCIX^TIGG GTGAACAAGGTCCATG 5 gly N 34 MAY GCGTTATGGTAATATTTGTATGGCTTA C T (SeqlDNo: 240) Miostatina-TN12- LVCGKISA GDEACA AATCT GTTTGTGGTAAAATTTCTGCT 5 gly N 35 RA TGGGGTGATGAAGCTTGTGCTCGTGC T (Seq ID No: 241) Miostatina-TN12- H VCTI GPSM WFC CATAATGTTTGTACTATTATGGGTCCA 5 gly N 6 WND rCTATGAAATOGTrnXJTTGGAATGAT C (Seq ID No: 242) iostatina-TN12- ^LC¾MWGWRNTIWC AATGATXJll GlX3CTATX3TGGGGTrGG 5 gly N 7 QNS CGTAATACTATTTGGTGTCAAAATTCT C (Seq ID No: 243) ¡ostatina-TN12- PPPC1QND1«JDMLQSLCE CX^CCATmGTCAAAATGATAATOA Sgiy N 8 LL rATGHTCAATXTrC I GTAAACITCr G (SeqID o:244) M¡ostatina-TN12- WYDOWPNELLSGLCR ? 3????????????a???¾??t?? 5 gly N 9 LF ACnUni TOGTCl lílOGKTn T (SeqID o:245) Miostatina-TN12- YGIXI)Q HWM PFrC TATGGTOATTGTGATCAAAATCATTG 5gly N 0 LSL GATGTGG<IX^TTTACTTGTCTTTCTCT C G (Seq ©No: 246) Miostat¡na-TN12- GWMCHEDLHDWGAT GGTTGGATXnXjTCAT I GATCnXAT 5 gly N 1 CQPD GATTGGGGTGCTACTTGTCAACCAGA T (SeqID o: 247) iostatina-TN12- YFHCMFGGHEFEVHCB TATTTICATTGTATGTT GGTGGTCAT 5 gly N 2 SF GAATTTGAAGTTCATTGTGAATC1 TT C (Sea ID No: 24S) M¡ostatina-TN12- AYWCWHGQCVRF GCI ATTGGTGTTGGCATGGTGAATGT 5 gly N 43 GTTCGTTTT (SeqID o: 249) Miostatina-Lineal- SEHWTFTDWDGNEW TCCGAACACTGGACCTTCACCGACTG 5 gly N 1 WVKPF GGACGGTAACGAATGGTGGGTrcGTC CGTTC (Seq ID No: 250) Miostatina-Lineal- MEMUJSU^EI-LKDMVP ATGGAAATGCTGGACTCCCTXTI CGA Sgiy N 2 ISKA ACTGCTGAAAGACATCGTTCOJATCr OCAAAGCT (SeqID o: 251) Miostatina-Lineal- SPPEEALMEWLGWQY IXXCXKXX3GAAGAAGCTCTGATGGA 5 gly N 3 GKFT ATGGCTGGGTTGGCAGTACGGTAAAT TCACC (Seq ID Ño: 252) Miostatina-Lineal- SPENI-LNDLYILWr Q TCCCCGGAAAACCTGCTGAACG ACCT 5gly N 4 EWYG GTACATCCTGATGACCAAACAGGAAT GGTACGGT (SeqIDNo: 253) Miostatina-Lineal- FHWEEGIPFHWTPYS TTCXIACIXJGGAAGAAGGTATCCCXJTT 5gly N 5 YD M CGACGT GTTACCCCGTACTCCTACGA CCX5TATG (SeqIDNo: 254) Miostatina-Lineal- OU-IEQF lDLAELVS AAACGTCTGCTGGAACAGTTCATGAA 5gly N 6 GHS X3ACCTGGCTGAACTGGTrTCCGGTC ACTCC (SeqID o: 255) Miostatina-Lineal- DT DAi-PQEFYEFV S GACACCCGTGACGCTCTGTTCCAGGA 5gly N 7 RLVI GGTTA C (SeqID o: 256) Miostatina-Lineal- RMSAAPRPLTYRDIMD C n-ATGTCCGCTGCl Xn XlK^ 5gly N 8 QYWH AOC AOX3TGAC-ATCATGGACCAGTA CTGGCAC (SeqID o: 257) Miostatina-Lineal- NDKAHFHEMFMFDVH AACGACAAAGCTCACI ITCX5AAAT 5 gly N 9 FVES G TCATG TCGACGTTX!!ACAACTTCGT TGAATOC (Sea Id No: 258) iostatina-Lineal- QTQAQKIDGLWEUJQS CAGACCCAGGCTCAGAAAAIXXJACGG 5 gly N 10 B NQ TCTG GGGAACTGCTGCAGTX ATCC GTAACCAG (Seq ID No: 259) Miastatina-Lineal- MLSEFBEELGNLVH Q ATGGTGTCCGAATTCGAAGAATTCCT 5 gly N 11 EA GGGTAACCTGG TCACCG CAGGAAG CT (Seq ?) No: 260) Miostatina-Lineal- YTPKMGSEWTSFWHN TACACCCCGAAAATGGGTTCCGAATG 5 gly N 2 EUHYL GACCTCCI CrGGCACAACCGTATCC ACTACCTG (ScqIDNo:261) Miostatina-Lineai- C GAACGACAiXCTGCTGCGTGAACT 5gly N 3 SDM GAAAATGGTTCTGAACTCOCTGTCCG ACATGAAA (ScqlDNo: 262) Miostatina-Linea!- roVHlDIJ-mWlEGFM ITCGACGTTGAACGTGACCTGATGCG sgiy N 4 QSAAT riX3QCn 3AAGGriTGATGCAGTCGG CTGCTACC (Seq ID No: 263) Miostatina-Lineal- EfflGfWNYLR GSAPQW ^CCACGGTTGGAAC ACCrGCGTAA 5gly N 5 EEAWV AGGTTCCGCIO-XSC^GTGGTTCGAAG CITGGGTT (Seq ID No: 264) Miostatina-Lineal- VESLHQLQMWLDQKL GTTGAATOCXrTGCACCAGCTGCAGAT 5gly N 16 ASGPH GTGGCTGGACCAGAAACTGGC TCCG GTOCGCAC (Seq ID No: 265) iostatina-Lineal- ATLLKDFWQLVEGY CGTGCTA<XCTGCTGAAAGACTTCTG s iy N 17 GDN GCAGCIOGTTGAAGGTTACGGTGACA AC <SeqIDNo:266) Miostatina-Lineal- EELL EFYRFVSAFDY GAAGAACTGCrGCGTGAATTCrACCG ly N 18 TTTCGTTTi !GCrTTCGACTAC (Seq ED No:267) Miostatina-Lineal- GLLDEFSHFIAEQFYQ GGTCTGCTGGACXjAATTCrCCCACTTC 5giy N 19 MPGG ATCGCTGAACAGTTCTACCAGATGCC GGGTGGT (Scq ID No: 268) Miostatina-Lineal- YRE S LEQLLDYLER TACCXHGAAATGTCCATGCTGGAAGG 5gly N 20 LQHY TCTGCTGGACGTTCTGGAACGTCTGC AGCACTAC (Scq ID No: 269) Miostatina-Lineal- ÍÍNSSQ LLSELIMLVG CA_AACTCCTCCC GATGCrGCTGTC 5giy N 21 SMMQ CGAACTGATCATGCTGGTTGGTTCCA GATGCAG (Sc IDNo:270) Miostatina-Lineal- WREHFLNSDYERDKLI TGGC^TGAACACTTCCIGAACTCCGA 5giy N 22 AIDG CTACATCCGTGACAAACTGATCGCTA TCGACGGT (Seq ID No: 271) Miostatina-Lineal- QFPFYVEDDLPAQLEY CAGTTCCCG TCTACGT TTCGACGAG sgiy N 23 WIA CTG<-XXK3C11AGCTGGAATACTGGAT CGCT (SeoID o:272) Miostatina-Lineal- EFFHWLH HRSEVNH GAATTGT CGACTGGCTGCACAACCA 5giy N 24 LDMN CCGITCCGAAGTTAACCACTGGCTGG ACATGAAC (Scq BD No: 273) iostatina-Lineal- EAJLFQNFFRDVLTLSE GAAGCrCTTmx^AAAArmTl CGr 5giy N 25 BY GATG TCTTACTCTTTCTGAACGTGAA C TAT (SeqIDNo:274) Miostatina-Lineal- QYWEQQW TYFRENG CAATATTGGGAACAACAA GGATGAC 5 iy N -26 LHVQY TTATTTTCGTGAAAATGGTCTTCATGT TCAATAT (SeqIDNo:275) Miostatina-Lineal- NQRM LEDLWREMTP AATCAACGTA GATGCTTGAAGATCT 5giy N 27 MFGRS TTGGCGTATTATGACTOCAATGTTTGG C TCGTTCT (Seq ID No: 276) Miostatina-Lineal- FIJ3EL AELSRHYALD TTTCTTGATGAACTTAAAGCTGAACTT 5giy N 29 DLDE TCTXXnX^TTATGCTCITGATGATCTT GATGAA (SeqIDNo:277) Miostatina-Lineal- G T JFGIJLim QLETF GGTAAACTTATTGAAGGTCTTCTTAAT 5gly N 30 MPD GAACTTATGCAACTTGAAACTTI ATG C OCAGAT (S«sqlDNo:278) Miostatina-Lineal- ? ,T .T .DEY KD KSWF ATT ITCrTCT GATGAATATAAAAAA • 5gly N 31 GATTGGAAATCTTGGTTr (Seq ID No: 279) Ej emplo 3. Ensayos In vitro Ensayo de Actividad de Miostatina Basado en Células C2C12 Este ensayo demuestra la capacidad de neutralización de la miostatina del inhibidor que se prueba al medir el grado en que se inhibe el enlace de la miostatina a su receptor. Se generó una línea celular reportera responsable de la miostatina por transfección de células de miosblastos C2C12 (ATCC No: CRL-1772) con un constructo pMARE-luc. El constructo pMARE-luc se hizo al clonar doce repeticiones de la secuencia CAGA, que representan los elementos de la respuesta de la miostatina/activina (Dennler et al. EMBO 17:3091-3100 (1998)) en un vector reportero pLuc-MCS (Stratagene cat# 219087) en dirección descendente de la caja TATA. Las células C2C12 de raioblastos expresan naturalmente los receptores de la miostatina/activina en su superficie celular. Cuando la miostatina se enlaza a los receptores de células, se activa la trayectoria Stnad, y la Smad fosforilada se enlaza al elemento de respuesta (Macias-Silva et al Cell 87:1215(1996)), lo que resulta en la expresión del gen de lucerasa. Luego se mide la actividad de luciferasa usando un kit de un ensayo reportero de luciferasa comercial (cat # E4550, Promega, Madison, WI) de acuerdo al protocolo del fabricante. Una línea estable de células C2C12 que se había transfectado con p ARE-luc (C2C12/pMARE clon # 44) se usó para medir la actividad de la miostatina de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se colocaron números iguales de células reportero (C2C12/pMARE clon #44) en cultivos de 96 pozos. Una separación por exclusión de primera ronda usando dos diluciones de los pepticuerpos se efectúo con una concentración de miostatina fija a 4n . Se preincubó la miostatina madura recombinante durante 2 horas a temperatura ambiente con los pepticuerpos a 40nM y 400 nM respectivamente. Se trató el cultivo de la células reporteras con la miostatina con o sin los pepticuerpos por seis horas. Se midió la actividad de la miostatina al determinar la actividad de la luciferasa a los cultivos tratados. Se usó inicialmente este ensayo para identificar los aciertos de pepticuerpos que inhiben la actividad de señalización de miostatina en el ensayo reportero. Posteriormente, se generó una curva de titulación de nueve puntos con la concentración de miostatina fija a 4 nM. Se preincubó la miostatina con cada una de las siguientes concentraciones de pepticuerpos ·. 0.04 m , 0.4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM, 2 uM y 4 uM durante dos horas antes de agregar la mezcla al cultivo de célula reportero. Los valores IC50 fueron para un número de pepticuerpos ejemplares se suministran en la Tabla III y para pepticuerpos madurados para afinidad, en la Tabla VIII.
Ensayo BIAcore° Se efectuó un análisis de afinidad de cada pepticuerpo de miostatina candidato en un aparato BIAcore°3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) usando una microplaqueta sensora CM5, y 0.005 por ciento de tensoactivo P20 (Biacore, Inc.) como solución amortiguadora de corrida. La proteína de miostatina madura recombinante se inmovilizó a una plaqueta sensora CM5 grado de investigación (Biacore, Inc.) por medio de grupos amina primarios usando el kit de acoplamiento de aminas (Biacore, Inc.) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante . Se usaron los ensayos de enlace directo para separar por exclusión y clasificar los pepticuerpos en orden de su capacidad para enlazar a la miostatina inmovilizada. Se llevaron a cabo los ensayos de enlace por inyección de dos concentraciones (40 y 400 nM) de cada pepticuerpo de enlace a la miostatina candidato a la superficie inmovilizada de la miostatina a una relación de flujo de 50µ1/?tp.? por 3 minutos. Después de un tiempo de disociación de 3 minutos, se regeneró la superficie. Se compararon cualitativamente las curvas de enlace para una intensidad de señal de enlace, así como para las velocidades de disociación. Los parámetros cinéticos de enlace de pepticuerpos que incluyen Ka (constante de la tasa de asociación) , K¿ (constante de la tasa de disociación) y KD (constante de equilibrio de disociación) se determinaron usando el programa de computadora 3.1 de evaluación BIA (Biacore, Inc.). Entre menores las constantes de equilibrio de disociación (expresadas en nM) , mayor la afinidad del pepticuerpo para la miostatina. Se muestran los ejemplos de valores de pepticuerpo KD en la Tabla III y en la Tabla VI para pepticuerpos madurados por afinidad a continuación.
Ensayo de bloqueo en la superficie de ActRIIB/Fc Se llevaron a cabo ensayos de bloqueo usando ActRIIB/Fc inmovilizado (R&D Systems, Minneapolis , MN) y miostatina en presencia y ausencia de pepticuerpos con el sistema de ensayo © BIAcore . Se usaron los ensayos para clasificar los pepticuerpos como no neutralizadores (aquellos que no evitaron el enlace de la miostatina al ActRIIB/Fc) o neutralizadores (aquellos que evitan el enlace de la miostatina a ActRIIB/Fc) . El enlace de miostatina en la línea base-ActRIIB/Fc se determinó primero en ausencia de cualquier pepticuerpo . Para estudios tempranos de separación por exclusión, se diluyeron los pepticuerpos hasta 4nM, 40nM, y 400 nM, en una solución amortiguadora de muestra y se incubaron con miostatina 4 nM (también diluida en la solución amortiguadora de muestra) . Las mezclas de pepticuerpo y ligando se dejaron alcanzar el equilibrio a temperatura ambiente (al menos 5 horas) y luego se inyectaron sobre la superficie inmovilizada de ActRIIB/Fc durante 20 a 30 minutos a una relación de flujo de 10 uL/min. Una respuesta de enlace aumentada (sobre el enlace de control sin pepticuerpos) indicó que el enlace del pepticuerpo de la miostatina no era neutralizante. Una respuesta disminuida de enlace (comparada a la de control) indicó que el pepticuerpo en su enlace a la miostatina bloquea el enlace de miostatina a ActRIIB/Fc. Se caracterizaron además pepticuerpos seleccionados usando el ensayo de bloqueo de una serie de concentración completa con objeto de derivar los valores IC5o (para los pepticuerpos de neutralización) o EC50 (para los pepticuerpos no neutralizadores) . Se diluyeron en serie muestras de pepticuerpos desde 200 nM a 0.05 nM en una solución amortiguadora de muestra y se incubaron con miostatina 4 mM a temperatura ambiente hasta alcanzar el equilibrio mínimo de 5 horas antes de inyectarse sobre la superficie inmovilizada ActRIIB/Fc por 20 hasta 30 minutos a una relación de flujo de 10 uL/min. Siguiendo a la inyección de muestra, se dejó que el ligando enlazado se disociara del receptor durante 3 minutos. Al graficar la señal de enlace contra la concentración de pepticuerpo, se calcularon los valores IC50 para cada pepticuerpo en presencia de miostatina 4nM. Se encontró, por ejemplo, que los pepticuerpos TN8-19, L2 y L17 inhiben la actividad de la miostatina en un ensayo basado en células, pero el enlace de TN-8-19 no bloquea las interacciones de miostatina/ActRIIB/Fc , lo que indica que TN-8-19 se enlaza a un epítopo diferente a aquel observado para los otros dos pepticuerpos.
Binning de epítopo para pepticuerpos Se inmovilizó un pepticuerpo purificado en una microplaqueta BIAcore para capturar la miostatina antes de la inyección de un segundo pepticuerpo, y se determinó la cantidad del pepticuerpo secundario enlazada a la miostatina capturada. Solamente los pepticuerpos con diferentes epítopos se enlazarán a la miostatina capturada, permitiendo así el binning de pepticuerpos con propiedades de enlace al epítopo similares o diferentes. Por ejemplo, se demostró que los pepticuerpos TN8-19 y L23 se enlazan a diferentes epítopos en la miostatina.
Ensayos de selectividad Se llevaron a cabo estos ensayos usando la tecnología BIAcore° para determinar la selectividad de enlace de los polipéptidos a otros miembros de la familia TGFP . ActRIIB/Fc, TGF RII/Fc y BMPR-IA/Fc (todos obtenidos de R & D Systems, inneapolis , MN) se acoplaron covalentemente para microplaquetas sensoras grado de investigación de acuerdo al protocolo sugerido por el fabricante. Debido a que los ensayos BIAcore detectan cambios en el índice de refracción, la diferencia entre la respuesta detectada con la inyección sobre las superficies inmovilizadas del receptor, en comparación con la respuesta detectada con inyección sobre la superficie de control en ausencia de cualquier pepticuerpo, representa el enlace actual del Activina A, TGFpi, GF 3 y BMP4 a los receptores, respectivamente. Con la preincubación de los pepticuerpos y las moléculas TGFp, un cambio (incremento o disminución) en la respuesta de enlace indica un enlace del pepticuerpo a la familia GF de las moléculas. Los pepticuerpos de la presente invención se enlazan todos a la miostatina pero no a Activina A, GF i , GFP3 o BMP4.
Ensayos de Equilibrio de KinEx A Los ensayos de enlace de equilibrio basados en solución usando la tecnología KinExA™ (Sapidyne Instruments, Inc.) se usaron para determinar el equilibrio de disociación (KD) del enlace de miostatina a las moléculas de pepticuerpos . Este ensayo basado en solución se considera que es más sensible que el ensayo BIAcore en algunos casos. eacti-Gel™ 6X se precubrió con alrededor de 50 ug/ml ' de miostatina durante la noche y luego se bloqueó con BSA. Se incubaron muestras de 30pM y ????? de pepticuerpo con diversas concentraciones (0.5 p a 5nM) de miostatina en una solución amortiguadora de muestra a temperatura ambiente durante 8 horas antes de hacerse correr a través de las perlas recubiertas con la miostatina. La cantidad del pepticuerpo enlazado a las perlas se cuantificó por un anticuerpo antihumano Fe de cabra etiquetado fluorescente (Cy5) a 1 mg/ml en superbloque. La señal de enlace es proporcional a la concentración del pepticuerpo libre a equilibrio con una concentración dada de miostatina. Se obtuvo KD a partir de una regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de enlace homogéneo de un sitio de curva dual suministrado en el software KinEx A™ (Sapidyne Instruments, Inc.) .
Ej emplo 4 Comparación de los Inhibidores de Miostatina La capacidad de los tres pepticuerpos ejemplares de primera ronda para enlazarse a (KD) e inhibir (IC50) se compararon con los valores KD y IC50 obtenidos para la proteina del fusión del receptor soluble act IIB/Fc (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minn) . Los valores IC50 se determinaron usando ensayo basado en células pMAREluc descrito en el Ejemplo 3 y los valores KD se determinaron usando el ensayo Bracore® descrito en el Ejemplo 3.
TABLA III Los pepticuerpos tienen un IC50 que se mejora sobre el inhibidor Fc/receptor y las afinidades de enlace que son comparables en dos pepticuerpos con el receptor/Fc.
Ejemplo 5 Comparación de la Capacidad del Péptido y el Pepticuerpo para Inhibir la Miostatina. Se utilizó la siguiente secuencia de péptido: QGHCTR PWMCPPY (TN8-19) (SEQ ID NO: 33) para construir el pepticuerpo correspondiente TN8-19 (pb) de acuerdo al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 anterior. Tanto el péptido solo como el pepticuerpo se separaron por exclusión para la actividad de inhibición de miostatina usando el ensayo basado en C2C12 descrito en el Ejemplo 3 anterior. Se puede observar de la Figura 1 que el IC50 (concentración efectiva para un 50% de inhibición de miostatina) para el pepticuerpo es significativamente menor que aquella del péptido, y así se ha mejorado substancialmente la capacidad del péptido para inhibir la actividad de la miostatina al colocarla en la configuración del pepticuerpo.
Ej emplo 6 Generación de Peptidos y Pepticuerpos Madurados por Afinidad Varios de los péptidos de primera ronda usados para la generación de pepticuerpos se escogieron para una maduración por afinidad. Los péptidos seleccionados incluyen los siguientes: el TN8-19 limitado por cisterna QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 33), y péptidos lineales lineal-2 MEMLDSLFELL DMVP1 SKA ( SEQ ID NO: 104); lineal-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEQ ID NO: 117); lineal-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEQ ID NO: 119) ; lineal-20 YREMSMLEGLLDVERLQHY (SEQ ID NO: 122), lineal-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEQ ID NO: 123), lineal-24 EFFHWLHNHRSSEVNHWLDMN (SEQ ID NO: 126) . Con base en una secuencia de consenso, se generaron conexiones de despliegue de fagos secundarias dirigidas en las cuales los aminoácidos del "núcleo" (determinados a partir de la secuencia de consenso) se mantuvieron constantes o desviaron en frecuencia de ocurrencia. Alternativamente se pudo usar una secuencia individual de péptidos para mejorar una colección de despliegue de fagos dirigida, desviada. El inmunoplaqueteo de tales conexiones bajo condiciones más severas puede producir péptidos con un enlace mejorado a la miostatina, un enlace selectivo a la miostatina, o con alguna propiedad deseada adicional .
Producción de oligos dopados para colecciones Se sintetizaron oligonucleótidos en un sintetizador de ADN que estuvo en un 91% "dopado" en las secuencias de núcleo esto es, cada solución tenía 91% de la base representada (A, G, C, o T) y 3% de cada uno de los 3 nucleótidos. Para la familia TN8-19, por ejemplo, un oligo dopado del 91% usado para construcción de una colección secundaria de fagos fue el siguiente : 5 ' -CAC AGT GCA CAG GGT NNK NNK NNK caK ggK caK tgK acK cgK tgK ccK tgK atK tgK ccK taK NNK NNK NNK CAT TCT CTC GAG ATC A-3' (SEQ ID NO: 634) en donde "N" indica que cada uno de los cuatro nucleótidos A, T, C, y G se representaron igualmente, K indica que G y T se representaron igualmente y la letra minúscula representa una mezcla de 91% de la base indica y 3% de cada una de las otras bases. La familia de oligonucleótidos preparada de esta manera se amplificó por PCR como se describe arriba, ligada en vectores fagémidos, por ejemplo, un plásmido pCESl modificado (Dyax) , o cualquier vector fagémido disponible de acuerdo al protocolo antes descrito. Las colecciones secundarias de fagos generadas estaban todas dopadas al 91% y tuvieron entre 1 y 6.5 x 109 transformantes independientes. Se formaron inmunoplaquetas de las colecciones como se describe arriba, pero con las siguientes condiciones: Ronda 1 inmunoplaqueteo : Números de fagos de entrada: 1012 - 10 cfu de fagémido Método de selección: selección de tubo Immuno Nunc Selección negativa: 2 X con tubos Imtnuno Nunc recubiertos con 2% BSA a 10 minutos cada uno. Recubrimiento de inmunoplaqueto : cubierta con 1 9 de proteína de mxostatina en 1 mi de carbonato de sodio 0.1M solución amortiguadora (pH 9.6) Tiempo de enlace: 3 horas Condiciones de lavado: 6 x2% -Leche -PBST; 6 C PBST; 2 X PBS Condición de elución: elución de TEA 100 mM Ronda 2 Inmunoplaqueteo : Números de fagos de entrada: lO11 cfu de fagémido Método de selección: selección de tubo Immuno Nunc Selección negativa: 2 X con tubos Immuno Nunc recubiertos con 2% BSA a 30 minutos cada uno. Recubrimiento de inmunoplaqueto-. cubierta con 1 µ9 de proteína de mxostatina en 1 mi de carbonato de sodio 0.1M solución amortiguadora (pH 9.6) Tiempo de enlace: 1 horas Condiciones de lavado: 15 X2%-leche-PBST, 1 X2%-Leche-PBST por 1 hora, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X2%-BSA-PBST por 1 hora, 10 X PBST y 3 X PBS Condición de elución: elución de TEA 100 mM Ronda 3 inmunoplaqueteo: Números de fagos de entrada: 1010 cfu de fagémido Método de selección: selección de tubo Immuno Nunc Selección negativa: 6 X con tubos Immuno Nunc recubiertos con 2% BSA a 10 minutos cada uno. Recubrimiento de inmunoplaqueto : cubierta con 0.1 de proteina de miostatina en 1 mi de carbonato de sodio 0.1M solución amortiguadora (pH 9.6) Tiempo de enlace: 1 hora Condiciones de lavado: 15 X2%-leche-PBST, 1 X2%-Leche-PBST por 1 hora, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X2%-BSA-PBST por 1 hora, 10 X PBST y 3 X PBS Condición de elución: elución de TEA 100 mM El inmunoplaqueteo de las bibliotecas secundarias produjo péptidos con un enlace mejorado a la miostatina. Los clones seleccionados individuales se sometieron a un ELISA de fago, como se describe arriba y formaron secuencias . La siguiente familia TN8-19 madura de afinidad de péptidos se muestra en la Tabla IV a continuación.
TABLA IV Pepticuerpo madurado por SEQX ! Secuencia de péptido afinidad NO: mlN8-19-l 305 /ALHGQCTRWPWMCPPQREG a?G?8-19-2 306 i EQGLCIRWPW C-PPQTIA -BTN8-19-3 307 3LNQGHC R P MCPPQDSN mT 8-l9- 308 ^OTQGQCT WFWMCPPQPSa mTN8-19-5 309 ^GAQEHCTRWPW CAPNDWÍ mT 8-19-5 310 3VNQGQCTRWRWMCPPNGWE níTN8-19-7 311 U^HGOCIRWF MCPPEGWE mTN8-19-8 312 ttEQAQCT WP MCPPQRGG mT 8-l9-9 313 a_??8-19-10 314 V^(X1HCI1.WPW CPPQRW caTN8-19-ll 315 OTHDOCTIWF CPPQPYP mT 8-19-12 316 ST^QGQCTR PWMCPPQWRG mTN8-19-I3 317 MWQ^HCTR¾TWMCPPQGWG mTN8-I9-14 318 E9?TQ HCr WPWMC3?PQRSQ mTN8-I9-15 319 LDtJWQCTllWPWMCPPQGPS mTN8-19-16 320 VQTQGLCTRWPWMCPPQSQR mTN8-19-17 321 ESNQGQCTRWPW CPPQGGW mTN8-19-18 322 TDRGPCTRWPWMCPPQANG mTN8-19-19 323 VGTOGQCTRWP MCPPYETG mTN8-19-20 324 PYEQG CTRWP MCPPYEVE mTN8-l9-21 325 SEYOHJCTO'WFWMCPPQGWK mTN8-l9-22 326 IT^QGHCTRWPWMCPPOGWG mT 8-19-23 327 PGAHDHCTRWFWMCPPQSRY mTN8-19-2 328 VAEEWHCRRWPWMCPPQDWR ??G?8-19-25 329 VGTQGHCTRWP CPPQPAG mT 8-l9-26 330 EEDQAHCRSWFWMCPPQGWV mTN8-l9-27 331 ADTOGHCTRWFWMCPPQHWF mTN8-19-28 332 SGPQGHCTRWPW CAPQGWF rnTN8-19-29 333 rLVQGHCTRWPWMCPPQRWV mT 8-19-30 334 G AHGKCTRWAWMCPPQSW mTN8-19-31 335 ELYHGOCTR PW CPPQSWA mTN8-19-32 336 VADHOHCTRWPWMCPPQGWG mT 8-19-33 337 PES(XHCTR PWMCPPQGWG mTN8-19-34 338 IPAHGHCTRWPW CPPQR R mTN8-19-35 339 FTVHGHCTR PWMCyPYGWV mTN8-19-36 340 PDFPGHCTR R MCPPQGWE mTN8-19-37 341 QLWQGPCTQ FWMCPPKGRY mTN8-19-38 342 HANDGHCXR QWMC-PPQ GG cnTN8-19-39 343 ETDHGLCTRWP CPPYGAR mTN8-l9-40 344 GT QGljCTRWW-vlCPPQGWQ QiTN8-19 conl 345 VATQGOCnWP CPPQGWG mTN8-19 con2 346 VATQGQCTRWPW CPPQRWG mTN8 coa6-l 347 QREVm>CYGGHLWCYDLHKA nTN8 coa6-2 348 IS AWYSCY AGHFWCWDL Q mTN8 con6-3 349 WTGWYQCY GGHLWCYDLR K mTN8 ccra6-4 350 K3FWYPCYIX3HFWCYNL SS mTN8 con6-5 351 ES WYPCYEG£3LWC3?DL ET La secuencia de consenso derivada del TN-8-19-1 madurado por afinidad hasta el Con2 (excluyendo las secuencias mTN8 con6) que se muestran arriba es-. Caia2Wa3WMCPP (SEQ ID NO: 352) . Todos estos péptidos comprenden la secuencia MCPP (SEQ ID NO: 633) . Los aminoácidos subrayados representan los aminoácidos de núcleo presentes en todas las modalidades y aia2 y a3 se seleccionan de un aminoácido básico neutral polar o neutral hidrofóbico. En una modalidad, esta secuencia de consenso, Cbib2Wb3WMCPP (SEQ ID NO: 353), x se selecciona a partir de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de cualquiera de R, S, Q; y b3 se selecciona de cualquiera de P, R, y Q. Todos los péptidos comprenden la secuencia WMCPP (SEQ ID NO: 633) . Un análisis más detallado de la secuencias TN8 maduradas por afinidad que comprenden SEQ ID NO: 352 proporciona la fórmula siguiente: c1C2C3C4C5CsCc7c8 c9WMC PcioC1iC12Ci3 (SEQ ID NO: 354), en donde : cx está ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o es un aminoácido, neutral polar, neutral hidrofóbico o ácido c3 está ausente o es un aminoácido, neutral polar, neutral hidrofóbico o ácido; c4 está ausente o es cualquier aminoácido; c5 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o hidrofóbico neutral; c6 está ausente o es un aminoácido básico, neutral polar, o neutral hidrofóbico; c7 es un aminoácido básico, o neutral polar, neutral hidrofóbico ; c8 es un aminoácido básico, o neutral polar neutral hidrofóbico; c9 es un aminoácido básico, o neutral polar neutral hidrofóbico; y en donde c10 hasta Ci3 es cualquier aminoácido. En una modalidad de la formulación anterior, b7 se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; b8 se selecciona de cualquiera de R, S, Q; y b9 se selecciona de cualquiera de P, R, y Q. Esto proporciona la siguiente secuencia: d1d2d3d4d5dsCd7d8 d3WMCPPd10diid12d13 (SEQ ID NO: 355) . da está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido, neutral polar, neutral hidrofóbico o ácido ; d3 está ausente o es un aminoácido, neutral polar, neutral hidrofóbico o ácido; d4 está ausente o es cualquier aminoácido; d5 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar o hidrofóbico neutral; ds está ausente o es un aminoácido básico, neutral polar o neutral hidrofóbico; d7 se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I o R; d8 se selecciona de cualquiera de R, S, Q; d9 se selecciona de cualquiera de P, R, y Q; y dio a d13 se selecciona de cualquier aminoácido. La secuencia de consenso de la serie mTN8 con6 es WYe1e2Ye3G, (SEQ ID NO: 356) en donde ex es P, S o Y; e2 es C o Q y e3 es G o H. Además de la familia madurada por la afinidad TN-19, los péptidos madurados por afinidad adicionales se produjeron a partir de los péptidos L-2, L-15, L-17, L-20, L-21 y L-24 de primera ronda. Estas familias se presentan en la Tabla V a continuación.
TABLA V Pepticuerpo madurado por afinidad 3EQID Secuencia de péptido W: L2 104 MEMLDSLFELLKDMVPISKA mL2-Cortl 357 MEMLESU-ELLKBIVPMSKAO mL2-Con2 358 ElMEMLESIXEíXKEIVPMS AR mL2-l 359 E LESII-ELLKDIVP SKPS mL2-2 360 G EMLESLFELLQEIVPMSKAP mL2-3 361 ME LESLT J..TOIVPISNPP mL2-4 362 RJEMLEST IH.Í QETVPISKAE mL2-5 363 RMBMLQSLT J¾t.LKDIVPMSNAR mL2-ó 364 RMEMLESLLFT J .KETVPTSNGT mL2-7 365 MEMLESLFRTJ. EIVPMSKAG mL2-8 366 MEMLGSI í .?G.? .KEIVP S AR HÍL2-9 367 QMELJ. J3SLFELT . ETVFKSQPA mL2-10 368 RMEMLDSLLELLKEIVPMSNAR mL2-ll 369 MEMLSSI ,1. T ,T .HBIVPMSQAG mL2-12 370 QMEMLESLLQIJLKEIVPMSKAS mL2-13 371 RÍ.IE LDSLT f .1. X.-DMVPMTTGA mL2-14 372 IEMLESLLET J .KDMVPMAN AS niL2-15 373 RME ILESIXQIXNEIVPMSRAR mL2-l6 374 RMEMLESLFDLLKELVP SKGV mL2-17 375 RTK TP-ST I .KT.T.KDTVPTQ AR mL2-18 376 RAÍELLESLFHT, I .KDMVPMSDSS mL2-19 377 RMEMLESIIEVI JEWPRA GA mL2-20 378 RMEMII)SLLQLLNEIVP SHAR mL2-2l 379 ME 1SSLLELL DIVPMSNAG mL2-22 380 RME LQSL-rELLKGMVPIS AG mL2-23 381 R EMLEST ,?-?G .T . ETVPNSTAA mL2-24 382 EMLQSf ,1-HT LKEIVPISKAG mL2-25 383 R.1F.MT X)SLT JET X .NET ,VP SK AR 1^15 117 HHGW VLRKGSAPQ FEAWV mLl5-conl 384 QVESLQQIlJvIWLDQ LASGPQG mL15-l 385 R ELLBSLFEIX EMVPRS AV mU5-2 386 QAVSI^HIX WLDQKLASGPQH mL15-3 387 DEDStX^LLMWLDQELASGPQL mL15^ 388 PVASI^J-IWLDQIOAQGPHA mL15-5 389 mLI5-6 390 DVESI^I WLDHQLASGPHG mLlS-7 391 2VDSLQ^VIXWI£HKLALGPQV m 5-8 392 CHESI^HLLMWLEQELALGPHG mL15- 393 ¾IE T ?«*?? J J>T ,T RP VPMSNAF mL15-10 394 BVDSLQQIIATWLDQKLASGPQA mL15-ll 395 BDESU^IIJYI-D LSSGPQV HÍL15-12 396 AMDQIJEIQIJ-IWLDH LA-3GPQA mL15-13 397 EUEM ESIXELLDEIALIPKAW mU5-14 398 EVVSLQHLL Wr ??? ?. ASGPDG mLlS-15 399 GGESLQQIIJviWLDQQLASGPQR mL15-16 400 GVESIX^IJLIFLDH LVSGPHD mL15-17 401 ffVESIJEiHI- MWLERIXASGPYA mL15-l8 402 QVDSLQQLLIWLDHQLASGPKR mL15-19 403 EVKLQQIXMWLE-IEa-AQGPQG 10 mL15-20 404 EVDSLQQLLMmJXJKLASGPHA mL15-21 405 EVDS ^IIAIWLJXJQLASGPQK mL15-22 406 GVEQIi^LL WLEQKLASGPQR HÍL15-23 407 GEDSLQQIX W1L-OQQLAAGPQV mL15-24 408 ADDSLO3IX WLDRKLASGPHV mL15-25 409 PVDSllG^rxrWLDQKLASGPQG L-17 119 RATLLKDFWQLVEGYGDN mL17-conl 410 DWRATII EF QLVEGLGDNLV mL17-con2 411 QSRATLL EFWQLVEGlJGD QA mL17-l 412 DGRATLLTEF QLVQGLGQKEA mL17-2 413 LARA½XKEFWQLVEGLGE VV mL17-3 414 GSRDTLLKEF QLVVGLGDMQT mL17-4 415 DARATLLKEFWQLVDAYGDRMV mLI7-5 416 NDRAQDÜRDFWQLVDGI/JVKSW mL17-6 417 GVRETLLYELWYLL GLGANQG mL17-7 418 QARATLLKEFCQLVGCQGDKLS mL17-8 419 QERATIXEFWQLVAGLGQN R mU7-9 420 SGRATLL EbWQLVQGLOBYR mL17-10 421 IMRAT11-KEFWLFVDGQRE QW mL17-ll 422 GERATLL DFWQLVD GQGDNTG mU7-12 423 DERBTTX EFWQLVHGWGDNVA mL17-13 424 GGRATIX ELWQLLEGQGANLV mLl7-14 425 TARAIIXNELVQLV GYQD LV mL17-15 426 GMRATIJjQEF QLVGGQGDNWM mL17-16 427 STRATI NDLWQLM G AHDRG m 7-i7 428 SERATLLKEL QLVGGWGD FG mL17-18 429 VGRATLLKEFWQLVEGLVGQSR mL17-19 430 EIRATLL EF QLVDEWREQPN 25 Los péptidos madurados por afinidad proporcionados en las Tablas IV y V también se ensamblan en pepticuerpos como se describe arriba y se evalúan usando los ensayos in vivo. Los péptidos L2 madurados por afinidad comprenden una secuencia de consenso de fxE Lf2SLf3f4LL, (SEQ ID NO: 455), en donde fi es M o I; f2 es cualquier aminoácido; f3 es L o F; y f4 es E, Q o D. La familia del péptido L15 madurado por afinidad comprende la secuencia ¾ig2LLg3g4L , (SEQ ID NO: 456), en donde g es Q, D o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, y g es L, W, F, o Y.
La familia L17 madurada por afinidad comprende la secuencia: 1h2h3h4h5h6h7h8hs (SEQ ID NO: 457) en donde hx es o D; h2 es cualquier aminoácido; h3 es A, T, S o Q; ]¾ es L o M, h5 es L o S; h6 es cualquier aminoácido; h7 es F o E; he es W, F o C; y h9 es L, F, M o K. Las secuencias de consenso pueden también determinarse por las familias mL20, mL21 y mL24 de péptidos mostrados arriba. Los pepticuerpos se construyen a partir de estos péptidos madurados por afinidad como se describe arriba, usando un agente de ligado unido al dominio Fe del IgGl humano, que tiene la SEQ ID NO: 296, en la terminación N (configuración N) , y en la terminación C (configuración C) del Fe, o en las terminales tanto N como C (configuraciones N,C), como se describe en el Ejemplo 2 arriba, los péptidos nombrados se enlazan a las terminales C o N por medio de la glicina 5 (5G) , glicina 8 o la secuencia de agente de ligado k. en la versión del pepticuerpo 2X, los péptidos se enlazan con agentes de ligado tales como 5 gly, 8 gly o k. Los péptidos y pepticuerpos madurados por afinidad se designan con una "m" minúscula, tal como mTN8-19-22 por ejemplo. Los pepticuerpos de la presente invención contienen además dos sitios de empalme donde los péptidos se empalman en los vectores fagémidos. La posición de estos sitios de empalme son AQ—péptido—LE. Los pepticuerpos generalmente incluyen estos aminoácidos adicionales (no obstante que no se incluyen en las secuencias de péptido enlistadas en las tablas) . En algunos pepticuerpos los aminoácidos LE se remueven de las secuencias de péptidos. Estos pepticuerpos se designan —LE. Los pepticuerpos ejemplares, y secuencias de polinucleótido ejemplares que los codifican, se proporcionan en la Tabla VI abajo. Esta tabla incluye ejemplos de secuencias de pepticuerpo (al contrario de sólo péptido) , tal como el 2x mT 8-19-7 (SEQ ID NO: 615) y el pepticuerpo con las secuencias LE eliminadas (SEQ ID NO: 617) . A modo de explicación, las secuencias de agentes de ligado en las versiones 2x se refieren al agente de ligado entre los péptidos en tándem. Estas secuencias de pepticuerpos contienen las secuencias Fe, agentes de ligado, AQ y LE. La secuencia de nucleótido acompañante codifica la secuencia de peptido además de las secuencias de agentes de ligado AQ/LE, si está presente, pero no codifica el agente de ligado designado.
TABLA VI Nombre del Péptido Secuencia de (SEQJD No) pepticuerpo Nucleótido mL2-Conl RMEMLESLLELL CGTATOGAAATGCTTGAA CrcTTC 5 giy N KETVPMSKAG TTGAACTTCTTAAAGAAATI 3TTCC AATGTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 458) mL2-Con2 [ MEMT F- T ,T ?G..? . CGTATGGAAATGCTTGAATCrCTTC 5 giy N KEIVPMSKA irGAAC TCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEQ ID NO: 459)- mL2-l RMEMLESLLELL CGTATQGAAA GCTTGAATCTCrTC 5 giy N KDIVPMS PS ITGAACTTCrrAAAGATATTGTTCC AATGTCTAAACCATCT (SEQ ID NO: 460) mT.7—9 GMEMLESLFELL GGTATGGAAATGCITGAA CrCrTT 5 giy N QEIVPMSKAP ITGAACrrciTCAAGAAATTGTTCC AATX3TC AAAGCTCC " (SEQ ID NO: 461) mL2-3 RMEMLESLLELL Xn-ATGGAAATGCTTGAATCTCTTC s giy N KDIVPISNPP ITGAACTTCrTAAAGATATTGTrcC AA T CTAA OCACCA (SEQ ID NO: 462) UE LEST.THJQ < X3TA TGAAATGCTXOAA CTCTTC : 'giy N J 3IVPISKAE 1 [TGAACTTXnTCAAGAAATTGTTCC \ATTTCTAAAGCTGAA (SEQ ID NO: t 163) raL2-5 ! SMEMLQSIim. ( -XJTATGGAAATGCTTCAATCTCTTC ¡ >giy N ] OJIVPMSNAR 1 rTOAACTTCITAAAGATATrGTTCX: i VATGTCHAATGCTCGT (SEQIDNO: t 164) mUL-6 JMEMLESLLELL ( 3GTATXKJAAATGCTTGAATCrcrTC '. gly N KEIVPTSNGT rTGAACTTCITAAAGAAATTGTTCX: \ACT CTAATGGTACr (SEQIDNO: Í65) mL2-7 E LESLFELL ^GTATGGAAATGCrrGAATCTCITT . Eiy M KETVPMSKAO I GAACTTTCI AAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: Í66) mJ-S-8 EMD3SI-LELL CXnATGGAAATGCTTGGTTCTC TC N KETVPMSKAR ITGAAC TCn AAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCXCGT(SEQ JD NO: 467) mL2- QMELLDSLFELL CAAATGGAACTTXnTGA TCTCITT Sgiy N KEIVPKSQPA TTGAACTTCITAAAGAAATTGTTCC AAAATCTCAACCAGCT (SEQ ID NO: 468) mL2-10 RMEMLDSLLELL aSTATGGAAATOCTTGATrCTCTTC 5giy N KEIYPMSNAR TTGAACTTCITAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAATGCrCGT (SEQID O: 469) CQL2-11 EMEMLESLLELL CGTATGGAAATGOTGAATC TrrC Sgly N HETvT SQAG ITCAACTTCTTCATGAAA TGTTCC AATGTCTCAAGCTGGT (SEQ ID NO: 470) mL2-12 QMEMLESLLQLL CAAATGGAAATGCTTGAATCrCTTC Sgly N KEWP SKAS TTCAACrrCTTAAAGAAA rGTTCC AATGTCrAAAGCTTCr (SEQ ID NO: 471) mL2-13 MEMLDST.THJ. CGTATGGAAATGCTTGATTCTCTTC Sgly N KDMVPMTTGA TTGAACT CITAAAGATATGGTTCC AATGACrACTGGTGCr (SEQIDNO: 472) mL2-14 RIEMI-ESLIJELLK CGTATTGAAATGCTTGAAlCrCITC 5gly N DMVP ANAS ITGAACrTCrTAAAGATATGGTrcC AATGGCTAATGCITCr (SEQ ID NO: 473) mL2-15 RME LESLLQLL CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC 5giy N NETVPMS AR I CAACrTCTTAATGAAATTGTTCC AATGTCrcGTGCTCGT (SEQID O: 474) mL2-16 MEMLESLFDLL CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTT Sgiy N KELVPMSKGV nGATCrTCTTAAAGAACTTGTrcC AATGTCTAAAGGTGTT (SEQIDNO 475) mL2-17 RIEMLESIJ .H J CGTATTGAAATGCrrGAATCTCTTC 5giy N DIVHQKA TTOAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AA TCAAÁAAGCTCGT (SEQID NO: 476) mL2-18 I Í ELLESLFELL IXnATGGAACTTCirGAATCrCTTT .5g«y ! 5MVPMSDSS ITGAACrrCrTAAAGATATGGTTCC ^ATGTCrGATTCTTCr (SEQ ID NO: 177) mL2-19 ¾ME LESLLEVL 3GTATGGAAATGCTTOAATCrcr C 5gi 3ETVPRA GA nXJAAGTTCX CAAGAAATlO rCC (WDGTGCrAAAGGTGCT (SEQID NO:478) mL2~20 RMEMLDSLLQLL ^GTATGGAAATGCTTGAITCrcriTC sgiy N NEIVPMSHAR rTCAACTTCTTAATGAAATTGTTCC AATGTCICATGCTCGT (SEQ ID NO: 179) CQL2-21 MK TKS J- I. GTATGGAAATGCTTGAATCrciTC Sgiy fi SDIVPMSNAG I GAAC rCTTAAAGATA TGTTCC AATGTCTAATGCTGGT (SEQIDNO: 480) mL2-22 E LQSLFELL CGTATGGAAA GCITCAATCTCITr sgi tí KGMVPISKAG 1TGAACITCTTAAAGGTATGGTTCC AATTTCTAAAGCrGGT (SEQID NO: 81) cdL2-23 MEMUESIJKTJ. CGTATGGAAATGCTTGAATC TTrC Sgi N KEIVPNSTAA TTGAACircrTAAAGAAATiXjITCC AAATTCTACTX3CTGCT (SEQIDNO: 82) mL2-24 R EMLQSLLELL CGTA GGAAATOCTTCAA CnXXrTC 5giy N KEIVPISKAG ITGAACnxnTAAAGAAATrGrrCC AATTTCrAAAGCTGGT (SEQIDNO: 483) njL2-25 RIEMLDSLLELLN XJTATTGAAATGCTrGATTCTCTTC 5giy N ELVPMSKA ITOAACrTCT AATGAACTTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEQIDNO: 484) raL17-Conl DW ATLLKEFW GATTGGCGTGCTACTCITCTTAAAG SgJ N QLVEGDGDNLV AATITKK ^AACTTGTTGAAGGTCr IX 3TGATAATCTTGTT (SEQIDNO: 485) mL17-l DG ATLLTEFWQ GATGGTCXJTGCTACTCIlCiTACTG 5giy N LVQGLGQKEA AATTI GGCAACrrGTrCAAGGT r rGGTCAAAAAGAAGGT (SEQID NO:486) aiL17-2 LARATÍ J . KFWQ CTI GCTCGTGCTACI CTTAAAG Sgiy N LVEGLGEKW AAJTTTGGCAACTIjrTCAAGGTCT rGGTGAAAAAGTTGTT (SEQIDNO: 487) BiL17-3 GS DTLL EFWQ GGTTCTCGTGATACTCI CrrAAAG 5 iy N LWGLGDMQT AATTTTGGCAACI G TGTTGGTCr rOGTGATATGCAAACr (SEQIDNO: 488) _oL17-4 DARATLLKEFWQ ?ATGCrCGTGCTACTCI CrTAAAG S iy N LVDAYGDRMV AATTITGGCAACllX_n[TGATGCTTA rGGTGATCGTA GGTT (SEQID O: 489) mL17-5 NDRAQUJRDFWC AATGATCGTGCT -AACTTCrrCGTG 5gi LVDGLGVKSW ATTTI GGGAACTTGTTGATGGTCT TGGTGTTAAATCTTGG (SEQIDNO: 490) raL-7-6 C 3VRETLLYELWY Í 3GTGTTCGTGAAACTCITCITTATG 5 gly I JLKGLGANQG VA.CTT1X3GTATCTTCTTAAAGGTCT raGTGCTAATCAAGGT (SEQIDNO: m) mL17-7 ( JARATLLKEFCQ ( Z!AAGC OG GCrACTCTTCITAAAG 5 gly I .VGCQGDKLS ¡ \ATTTTGTC~AACTTGTTGGTTGTCA ^GGTGATAAACTTTCr (SEQIDNO: t92) mL17-S 3E ATLLKEFWQ 2AAGAACCTGCTACrcrTCTTAAA 5 giy NT -VAGLGQNMR 3AATTTTGGCAACrrG TGCTGGTC ITGGTCAAAATATGCGT (SEQID TO.-493) mL17- 3GRATLL EFWQ raOGTCGTGCrACTCTrCTTAAAG 5giy ) LVQGLGEYRW AATTTTGGCAACT GTTCAAGGTCT K JTGAATA CGTTGG (SEQIDNO: ) mL17-10 G????G JJCEFWL CTATGCGTGCTACTCI CI AAAG 5 gly N FVDQQREMQW AATri GGC IT IOTTGATGGTCA ACGTGAAATGCAATGG (SEQ ID NO: 495) mL17-ll GE ATLLNDFWQ GGTCAAOjTGGTACrCITCTTAATG 5 gly N LVDGQODNTG ATTTTTGGCAACTTGTTGATGGTCA AGGTGATAATACTGGT (SEQID NO.-496) mL17-I2 DERETLL EF Q GA GAACGTGAAACTCTTCrrTAAA 5 gly N LVHGWGDNVA GAATTTTGGCAACTTGTTCATGGTT GGGGTGATAATGTTGCT (SEQ ? NO: 497) mL17-13 GQ ATLLKELWQ GGTGGTCXJTGCTACTCTTCTTAAAG 5 gly N LLEGQGANLV AACirrGGCAACTTCTTGAAGGTCA AGGTGCTAATCTTGTT (SEQ ID NO: 498) mL17-14 TA AIXLNELVQ ACTGCTCX^GCTACTCrrCrrAATG 5 gly N LVKGYGD LV AACTTGTTCAACTTGTTAAAGGTTA TGGTGATAAACITGTT (SEQIDNO: 499) mL17-15 GMRATLLQEFWQ GGTA GCGTGCTACTCTTCITCAAG 5 gly N LVGGQODNWM AAT rTGGCAACTTG TGGTGGTCA AGGTGATAATTGGATG (SEQID NO.-500) mL17-16 STRATLLNDLWQ ICTACTCXjrlGCTACT r C rAATG 5 gly N L KGWAEDRG ATCTTTGG AA TTATGAAAGGTTG GGCTGAAGATCGTGGT (SEQID NO:501) mL17-17 SERATLI- ELWQ TCIOAACGTOCTAC CTTCTTAAAG 5 gly N LVGGWGDNFG AACTnjGCAACITGTTGGTGGTTG GGGTGATAATTTTGGT (SEQID O. 502) mL17-18 VGRATT J .KHFWQ GTTGGTO3TGCTACTCn AAAG 5 gly N LVEGLVGQSR AATTTTGGCAACT GTTGAAGG I TGTTGGTCAATCrCGT (SEQIDNO: 503) mLlS-2 ( JAVSLQHLL W CAGGCTGTTT(XCTGGAGCACX7rGC 2 >gly ( -» I JXJELASGPQH ] [X3ATCTGGCTGGACCAGAAACTGG C TXGGTOCGCAGCAC (SEQID I TO.-5I8) mLlS-3 3EDSLOQLLMWL ( 3ACGAAGACTCCCTGCAGCAGCK5 '. gty ( -» OQKLASGPQL ! -TOATGTGQCTGGACXZAGAAACTG ( 3CirOOGGTO33CAGCTG (SBQID ! STO:519) mLlS-4 PVASLQQLIIWL ( XGGTIGCITOX GCAGCAGCTGC >gly [ DQ LAQOPHA. [GA CTGGCrGGACCAGAAACTGG ^CAGGGTCa3CACGCT (SEQJP f 0:520) CQLIS-5 BVDEUQQULNWL 3AAGTTGACX3AACTGCAGCAGCTG ! 3gly ( DHKLASGPLQ ZnXJAACTGGCTGGACCACAAACrG C HlXXXK3 OCGCGCAG (SEQID HO:52I) mI.lS-6 DVESLEQLLMWL SACX3TTOAA OOCTGGAACAGCrG 5giy DHQLASGFHG CTGATGTGGCTGGACXIACCAGCTG GCITCOGG CCGCACGGT (SEQID NO.-522) mLlS-7 QVDSLQQVLLWL GAGGTTGACIXXXTGCAGCAGG T 5 ly c EHKLALGPQV CTGCTGTGGCTGGAACACAAACTG aCK X3GGTOCGCAGGTT (SEQED NO:523) mL15-8 GDESLQHLLMWL GGTGACGAATCCCTGCAGCACCTG 5gjy c EQKLAUGPHG GTGAGTGGCTGGAACAGAAACTG GCTCTGGGTXXGCACGGT (SEQID NO:52 mL15-9 QIEMLESIXDLL CAGATXX3AAATGCTGGAATCCCTG 5giy c DMVPMSNAF CIXJGACCTGCTGCGTGACATGGTTC CGATGTCCAACGCTTTC (SEQ3D NO:S25) mL15-10 EVDSI/5QI1A1WL OAAGTTGACT(XCrGCAGCAGCTG 5gly c DQKLASGPQA CTGA GTGGCrGGACCAGAAACTG OCTTCGGTCCGCAGGCT (SEQID NO:526) mL15-H EDESLQQIHYLD GAAGACGAATOCCTX3CAGCAGGTG 5gly c KMLSSGPQV CnXSATCTACCTGGACAAAATGCTG rCCrCCGGTCCGCAGGTT (SEQDD NO:527) _aL15-12 AMDQLHQUIWL GCTATGGACCAGCrGCACCAGCTG 5 iy c DHKLASGPQA CTGATCTGGCTGGACCACAAACTG GCTTOCGGTOCGCAGGCr (SEQDD NO:528) mL15-13 EUEMLESIIH.J.D CXJTATCGAAATGCTGGAA CCCTG 5giy c E3AL3PKAW CIGGAACTGCTGGACGAAATCGCT CTGATCXX3AAAGCTTGG (SEQ ID NO-.529) mL-5-14 ETVYSLQHLLMWL QAAGTTmraXTOCAGCACCrGC Sgiy c EHKLASGFDG rGATGTGGCTGGAACACAAACTGG CnrCCGGTCCGGACGGT (SEQID NO:530) mL15-15 OGESLQQLLMWL . GGTGGTGAATCCCTGCAGCAGCTG Sgly c DQQLASQPQ CTGATGTOGCTGGAOCAGCAGCTG GCnXXX-KjTCCXjCAGCGT (SEQID NO:S31) mL17-22 ! íYRATLLKEF Q ACrACCGTGCTACCCTGCTGAAA L.VDGLREQGFV SAATTCTOGCAGCTGG IOACGGT TGCGTGAACAGGGTGTT (SEQ1D >ÍO:S46) mL17-23 3S VT REFWQ 3AGTCm3TGT A(XC GCra X?rG LVESYRETVN ^AITCTGGCAGCTGGTTGAATOCTA CGTCCGATOQTTAAC (SEQ ID NO: S47) mL17-24 LS ATLLNEFWQ KnXXXJIGCTACCCTGCrGAACG Sgiy 7VTK3QRDKRM AATTCTGGCAGTTOGTTOACX 3TCA 3CGTGACAAACGTATG (SEQID ??:54ß) mL17-25 WDRATLLNDFW rQGGACCGTGCrACCCTGCTGAAC Sgiy EiLMEELSQKPG 3ACTTCIGQCACCTGATGGAAGAA CTXJTOOCAGAAACCGGGT (SEQID NO:549) mL17-26 QERATLLKEF R CAGGAACGTGCTACOCTGCTGAAA 5giy MVEGLG NRG GAATTCTOGCXn'ATGGlTGAAGGT CTOGGTAAAAACXXJrGGT (SEQID NO:550) mL17-27 ERATTLLREFWQ AACGAAGGTGKnAGCCTGC GCGT 5gly c LVGGYGVNQR GAATTCIXjGGAGCrGGTTGGTGGTT ACX3GTGTTAACCAGCGT (SEQID NO:551) mTN8Con6-l QKEWYPCYGGHL GAGCGTGAATOGTAOCCGTGCTAC 5gly c WCYDLHKA GGTGGTCACCTC GGTGC ACGAC CTGCACAAAGCT (SEQ ID NO: 552) mTN8Con6-2 [SAWYSCYAGHF ATCTCCCC TGGTACTCCTGCrACG 5 iy c WCWDLKQ CTGGTCACTTCTGG GCrGGGACCT GAAACAGAAA (SEQIDNO: 553) mTNSCon6-3 WTG YQCYGGH rGGACCGGTTGGTACCAQTGCTAC c LWCYDLKK QGTGGTCACCTGTGGTGC ACGAC CTGCGTCGTAAA (SEQ ?> NO: 554) mTN8Con6- I ITWYPCYDGHF AAAACCTTCIXjGTACCXXiTGCrAC Sgiy c WCYNLKSS GACGGTCACITCroGTGCTACAAC CTGAAATC3TOC (SEQ ID NO: 545) mTN8Con6-5 ESRWYPCYEGHL GAA CCCGTTGGTAOCCGTGCTAC 5gi c WCFDLTET QAAGGTCACCTGTGGTGCTTCGAC CTGACCGAAAOC (SEQ ?5 NO: 546) mL24-l NVFPQWVQKHG AATOi l lTnt!-AAltjGti AAA 5gly c RWYQWLDI V AACATGGTCGTGTTGTTTATCAATG GCTTGATATTAATGTT (SEQID O: 557) mL24-2 FDFLQWLQNH S irTGA l l 'lCAATGGCTICAAA 5giy c EVEHWLV DV ATCATXXJITCTGAAGTTGAACATTG GCTTGTTAGGATGTT (SEQID O: 558) mL20-l HQRDMSMLWEL CATCLAACGTOATAIGTCTATGCTIT 5gly c LDYL GLRQYS GGGAACTKTrGATGTTCTTGATGG TCTTCGTCAATATTCT (SEQIDNO: S59) mL20-2 TQRD S LDGLL ACTCAACGTOATATG CTATGCTTQ ISgiy c BVLDQLRQQR ATGG CTTCTTGAAGTTCITGATCA ACTTCGTCAACAACGT (SEQID NO.-560) mL20-3 rS DMSLL ELL *iXICCCGTGACATGTCXXnX3CTGT s giy c -ELDRLGHQ JGGAACTGCTGOAAGAACTGGACC 31XnX3GGTXlACCAGCGT (SEQJD NO:561) CQL20- 'viQHDMSMLYOL A3t3CAA<^TOATATGTCTAlX3CI*rT s iy VELLESLGHQI A-TGG CTIXJITOAACTTCTTGAATC ICTTGGTCATCAAATT (SEQIDNO: S62) mL20-5 WNRDMRMLESL 1XKJAATCX5TGATATGCGTATGCTTG 5giy PEVLDGLRQOV AA C CTTTI GAAGTICTTGATGG rcrTCGTCAACAAGTT (SEQ ID NO: 563) tnL20-6 SYRDMSMLEGLL G jI ATCGTGATATGTCrATGCTTG sgiy C AVLDBLOPQL AAGG CT CTrGCTGlTCrTGATCG TCTTGGTCCACAACTT (SEQIDNO: 564) mL20Conl TQRDMSMLEGLL ACTCAACQTGATATGTCTATGCTTG 5giy c BVLDEUGQQR AAGG C ICI GAAGTTCTTGATCG TCITGGTCAACAACGT (SEQIDNO: 565) EnL20 Con2 WYRDMSMLEQL TGGTACCGTGACATGTCCATG rG 5giy c LEVLDRLGQQR GAAGGTCTGC GGAAGTTCrOGAC CGTCTGGGTCAGCAGCGT (SEQDD NO:566) mL21-l TQNSRQ LLSDF ACTCAAAATTClXXnCAAATGCITC 5giy c MMLVGSMIQG 1TTCTG Al i'L'lATGATGCTI rTGG rTCTATGATTCAAGGT (SEQIDNO: 567) mL21-2 MQTSRHILLSEFM ATGCAAACTICTCGTC&TATTCTrC 5giy c MLVGS HG TTrCTGAATTTATGATGCITGTTGG TTCTATTATGCATGGT (SEQIDNO: 568) mL21-3 HDNSRQMLLSDL CACGACAACTCCCOTCAGATGCTG 5gi c LHLVGTMIQG CTGTCa3Aa^GCTGCACXTGGTrG GTACCATGATCCAGGGT (SEQID NO: 569) mL21-4 ME SRQNLLREII ATGGAAAACTCCCGTCAGAACCTG 5giy c MLVGNMSHQ CroCGTGAACTGATCATGCTGGTTG GTAACATGTCCCAOCAG (SEQID NO-.570) caL21-5 QDTSRHMLLREF C^GGACACCTiXXXJ CACATGCrG 5giy c MMLVGEMIQG CTGCGTGAAITCATGATGCTGGTTG GTGAAA GATCCAGGGT (SEQID NO:571) mL21 Conl DQNSRQMLLSDL GACX^GAACTCCCGTCAGATGCTG 5giy c MELVGSMIQG CTGTCa3ACCTGATCA CCTGGTTG QTTOCATGATCCAGGGT (SEQED NO:572) mTN8-19-l VALHGQCTRWP GT1X3CTCTTCATGGTC-AATGTACTC 5giy c WMCPPQREG Q TGGOCATGGATGTGTOCACCAC AACGTGAAGGT (SEQIDNO: 573) mTN8-19-2 -TEQGLCTRWPW rATCX-AGAACAAGGTCTTIOTACTC 5 gly ( 1 vlCPPQTLA ( 3TTGGCCATGGATGTGTCCACCAC i YAACTCTTGCT (SEQE>N:S74) mTN8-1 -3 ( NQGHCTR P JGTC GAACXZAGGGTC-ACTGCACC 5 gly ( WMCPPQDSN _XnTG<30CmX 5ATGTXKXXXKXX3 AGGACTCCAAC (SEQ K) NO: 575) mTN8-19-4 raxjGQcrRWPW ^TGAT ACK^GGTCAATGTACTC 5 gly MCPPQPSO JI GGCCATGGATGTGTOIIACCAC ^ACGA CTGGT (SEQIDNO: 576) mTN8-19-5 AGAQEHCTRWP SCIX nXKTTCAGGAACACK ^ACX] 5 gly WMCAP DWI COITQQOCmQQamQCGCIOCO AACGACTGGATC (SEQIDNO: 577) mTN8-19-6 aVNQQQCTKWR 3GTGTTAACCAGGGTCAGTGCACC 5 gly < W CPPNGWE X7I GGCGTTGGATGTGCC 3CCG AACGGTTGGGAA (SEQIDNO: 578) mTN8-i9-7 LADHGQORWPW 5 gly c MCPPEGWE CTGGCTGACCACX 3TCAGTGCATC CGTTGG GTGGATGTGCCCGCCG GAAGGTTGGGAA (SEQ ID NO: 579) mTN8-19-8 ILEQAQCTRWPW ATCCTGGAACLAGGCrCAGTGCACC 5 gly C CPPQRGG 8TTGGCCGTX¾}ATGTGCCCGCCG CAGCX3TGGTGGT (SEQ ID NO: 580) mTN8-19-9 rOTHAQCT WP ACnOAAACTCATGCTCAA G ACTC 5 gly c W CPPQWEG GTTGGOC^TGGATGTGTCCACCAC AATGGGAAGGT (SEQ ?> NO: 581) mT 8-19-10 VVTQGHCTLWP GTTGTTACTCAAGGTCA GTACTC 5 gly c WMCPPQRWR IT KX1ATGGATGTGTCCACCACA ACGTTGGCGT (SEQID O: 582) mTN8-19-ll IYPHDQCT WPW A I ATCCAGAGATCAATG ACTC s gly c CPPQPYP GTTGGCCA GGATG GCCACCAC AACCATATCCA (SEQ ?) NO: 583) .TN8-19-12 SY QGQCTRWP IXTTATTGG AAGGTCAATGTACTC 5 gly c WMCFPQWRG GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AATGGCGTGGT (SEQ JD NO: 584) mTN8-19-13 MWQQGHC RWP ATGTGGCAACAAGGTCATTGTACT 5 giy C W CPPQGWG CXB TGGCCATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 585) mTN8-19-14 EFTQWHCT P GAA T AOC-AGTGG-ACTGCACC 5 gly c WMCPPQRSQ CXnTGG XXjTGGATCTGCCCGCCG CAGCGTTCCCAG (SEQ ?) NO: 586) mTN8-19-15 LDDQWQCTRWP CTCH3AOSACX^GTGGCAGTGCACC 5 gly C WMCPPQGFS CGTTG ¾XmX5GATOTGCCCGCCG CAOGQ ITCrCC (SEQIDNO: 587) mTN8-19-16 YQTQGLCTRWP rATCAAACrcAAGOTCT rG ACTC 5 gly C WMCPPQSQR GTTGGCCATGGATGTXJTCCACCAC AATCrCAACGT (SEQ ID NO: 588) mTN8-19-17 ESNQGQCTRWP GAATCTAATCAAGGTCAATGTACT 5 gly C WMCPPQGGW CGTTG<3CCATGGATCnOTCCACCA CAAGGTGGTTGG (S Q ID NO: 589) 2X mTN8-1 -33 FC-5G-AQ- CCAGAATCTCAAGGTCAT GTACrC 1 C PESQGHCT WPW OTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC CPPQGWGLEGS AAGG TGGGGTCrcGAGGGTTOCG GSATGGSGSTASS GTTCCGCTACCGGOGGCrCrGGCTC GSOSATGPESQG CACTOCTTCrrcXX3GTTXX2GGTTI-T HCTRWPSV CPP QCTACIOGTCCGGAATCCCAGGGT QGWG1E (SEQ ^tCTGCACC nTGGCCGTGGATG -DNO.-629) IKXm GCAGGGTrGGGGTCTG GAA (SEQIDNO: 630) 2XmTN&-1 -33 FC-5G-AQ- CCAGAATCTCAAGGTCATTGrACTC 1 c ST— GGdcI2x PESQGHCTR PW GTTGGCCATGGATGTXJTCCACCAC LE CPPQG GGSGS AAGGTTGGGGTGG TCCGG TCCG ATGGSGGGASSG CTACCGGO3GCKTrG0CGGTGGTG SGSATGPESQOH OTCTTccGGm xKmCTocrAc CTRWFWMCP rGGTCCGGAATCXXAGGGTCACTG PQGWG (SEQID CACCCGTTGGCCGTGGATGTGTCC NO:631) ACX¾CAAGGTTGGGGT (SEQID NO:632) 8 Ejemplo 7 Separación por exclusión in vitro de pepticuerpos madurados por afinidad Los siguientes pepticuerpos ejemplares se separaron por exclusión de conformidad con los protocolos establecidos arriba para obtener los siguientes valores KD e IC50. La Tabla VII muestra el intervalo de valores KD para pepticuerpos madurados por afinidad seleccionados comparados con los pepticuerpos precursores, como se determina por los ensayos basados en solución KinExA® o ensayos BIAcore® . Estos valores demuestran una afinidad de enlace incrementada de los pepticuerpos madurados por afinidad para miostatina en comparación con los pepticuerpos precursores. La Tabla VIII muestra valores IC50 para un número de pepticuerpos madurados por afinidad. Un intervalo de valores se da en esta tabla.
TABLA VII TABLA VII Ejemplo 8 Actividad Anabólica In vivo de Pepticuerpos Ejemplares El modelo de ratón nu/nu CD1 (Charles River Laboratories, Massachusettes) se usa para determinar la eficacia in vivo de los pepticuerpos de la presente invención que incluye la región Fe humana (huFc) . Este modelo responde a los inhibidores de la presente invención con una respuesta anabólica rápida que se asocia con una masa muscular seca incrementada y un incremento en las proteínas miofibrilares, pero no se asocia con la acumulación en el contenido de agua corporal . En un ejemplo, la eficacia del pepticuerpo lx mTN8-19-21 in vivo se demuestra por el siguiente experimento. Un grupo de 10 ratones nu/nu CD1 de 8 semanas de edad se trataron dos veces a la semana o una vez a la semana con dosis de 1 mg/kg, 3 mg/kg (inyección subcutánea) . El grupo de control de 10 ratones nu/nu CD1 de 8 semanas de edad recibió una inyección dos veces a la semana (subcutánea) de huFc (vehículo) a 10 mg/kg. Los animales se pesaron cada otro día y se determinó la masa corporal magra por RMN el día 0 y el día 13. Los animales se sacrifican entonces el día 14 y el tamaño del músculo gastroenemico se determina. Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3. La Figura 2 muestra el incremento en el peso corporal total del ratón durante 14 días para las diversas dosis del pepticuerpo en comparación con el control . Como puede observarse de la Figura 2 , todas las dosis muestran un incremento en el peso corporal en comparación con el control, con todas las dosis mostrando incrementos estadísticamente importantes sobre el control por el día 14. La Figura 3 muestra el cambio en la masa corporal magra el día 0 y el día 13 como se determina por la RMN, así como el cambio en el peso del músculo gastrocnémico extirpado de los animales el día 14. En otro ejemplo, el pepticuerpo lx mTN8-19-32 se administra a ratones nu/nu CD1 en una inyección cada dos semanas de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, y 30 mg/kg en comparación con el huFc de control (vehículo) . Los animales tratados con pepticuerpo muestran un incremento en el peso corporal total ( no mostrado) asó como masa corporal magra en el día 13 en comparación con el día 0 como se determina por las mediciones de RMN. El incremento en la masa corporal magra se muestra en la Figura 4. En otro ejemplo, el pepticuerpo madurado por afinidad lx se compara con el pepticuerpo madurado por afinidad 2x para una eficacia anabólica in vivo. Se tratan ratones nu/nu CD1 machos (10 animales por grupo) con inyecciones dos veces a la semana de 1 mg/kg y 3 mg/kg de lx mTN8-19-7 y 2x mTN8-19-7 durante 35 días, mientras que el grupo de control (10 animales) recibió inyecciones dos veces a la semana de huFc (3 mg/kg) . Como se muestra en la Figura 5, él tratamiento con el pepticuerpo 2x resulta en ganancia de peso corporal mayor y peso de carcasa magro la necropsia en comparación con el pepticuerpo lx o control .
Ejemplo 9 Incremento en la fuerza muscular Se trataron ratones C57B/6 machos de 4 meses de edad agrupados por edad normales durante 30 días con 2 inyecciones por semana de inyecciones subcutáneas de 5 mg/kg por semana de 2x mTN8-19-33, 2x mTN8-19-7, y un grupo de control de vehículo huFc (10 animales/grupo) . Los animales se permite que se recuperen sin ninguna inyección adicional . La fuerza de agarre se midió el día 18 del periodo de recuperación. La fuerza de agarre se mide usando un medidor de Columbra Instruments, modelo 1027 dsm (Columbus, Ohio) . El tratamiento con pepticuerpo resulta en un incremento importante en la fuerza de agarre, con animales pretratados con 2x mTN8 -19-33 lo que muestra un incremento importante en la fuerza de agarre en comparación con los ratones tratados con control, mientras que 2x mTN8-19-7 muestra un incremento del 15% en la fuerza de agarre en comparación con los ratones tratados con control .
Ejemplo 10 Farmacocinéticos Se realizan experimentos farmacocinéticos in vivo usando pepticuerpos representativos sin las secuencias LE. Se administran dosis de 10 mg/kg y 5 mg/kg a ratones nu/nu CD1 y se determinan los siguientes parámetros: Cmax /ug/mL) , área bajo la curva (AUC) (ug-hr/mL) , y vida media (hr) . Se encuentra que las versiones 2x de los pepticuerpos madurados por afinidad tienen una vida media significativamente mayor que las versiones lx. Por ejemplo, el mTN8-19-22 madurado por afinidad lx tiene una vida media en los animales de alrededor de 50.2 horas, mientras que 2x mTN8-19-22 tiene una vida media de alrededor de 106 horas.
Ejemplo 11 Tratamiento de Ratones mdx Los pepticuerpos de la presente invención muestran una masa muscular magra incrementada en un animal y son útiles para el tratamiento de una variedad de trastornos que involucran la atrofia muscular. La distrofia muscular es uno de aquellos trastornos. El modelo de ratón para la distrofia muscular Duchenne es el ratón mdx Duchenne (Jakson Laboratories, bar Harbor, Maine) . Se inyectan ratones mdx maduros (10 meses de edad) ya sea con el pepticuerpo lx mTN8-19-33 (n=8/grupo) o con el vehículo de proteína uFc (N=6/grupo) durante un periodo de tiempo de tres meses. El programa de dosificación fue cada otro día, 10 mg/kg, por inyección subcutánea. El tratamiento con pepticuerpo tiene un efecto positivo en el incremento y mantenimiento de la masa corporal para los ratones mdx maduros . Un incremento importante en el peso corporal se observa en el grupo tratado con pepticuerpo en comparación con el grupo de control tratado con hu-Fc, como se muestra en la Figura 6A. Además, el análisis de RMN revela que la masa corporal magra a relación de masa grasa también se incrementa significativamente en los ratones mdx maduros como resultados del tratamiento con pepticuerpo, en comparación con el grupo de control, y que el porcentaje de grasa de peso corporal se reduce en los ratones tratados con pepticuerpo en comparación con el grupo de control, como se muestra en la Figura 5B . La presente invención no se limita en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, que se pretenden como ilustraciones sencillas de aspectos individuales de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes son invención. Al contrario, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente, serán aparentes para aquellos expertos en el arte a partir de la descripción anteriormente mencionada y los dibujos acompañantes. Tales modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la miostatina en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos WMCPP (SEQ ID NO: 633) . 2. El agente de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido está entre 5 y 50 aminoácidos de longitud. 3. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Ca1a2Wa3 MCPP (SEQ ID NO: 352) , en donde alf a2 y a3 se seleccionan de un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o básico, y en donde el péptido tiene entre 10 y 50 aminoácidos de longitud. 4. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia Cb^WbaWMCPP (SEQ ID NO: 353) , en donde bi selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 selecciona de cualquiera de R, S, Q; b3 selecciona de cualquiera de P, R, y Q, y en donde el péptido tiene entre 10 y 50 aminoácidos de longitud. 5. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia c1C2C3C4C5c6Cc7C8Wc9 MC PcioC1iCi2Ci3 (SEQ ID NO: 354), en donde: Ci est ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico; c3 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico; c4 está ausente o es cualquier aminoácido; c5 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o hidrofóbico neutral; c6 está ausente o es un aminoácido básico, neutral polar neutral hidrofóbico; c7 es un aminoácido básico, o neutral polar, neutral hidrofóbico; c8 es un aminoácido básico, neutral polar neutral, o hidrofóbico; c9 es un aminoácido básico, neutral polar; o neutral hidrofóbico; y Cío hasta ci3 es cualquier aminoácido; y en donde el péptido tiene entre 20 y 50 aminoácidos de longitud. 6. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la rniostatina, en donde el péptido comprende la secuencia d1d2d3d4dsd6Cd7d8Wd9WMCPPdiod11d12di3 (SEQ ID NO: 355), en donde di está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico; d3 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico ; d está ausente o es cualquier aminoácido; d5 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o hidrofóbico neutral; d6 está ausente o es un aminoácido básico, neutral polar, o neutral hidrofóbico ; d7 se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, l o R; da se selecciona de cualquiera de R, S, Q; dg se selecciona de cualquiera de P, R, y Q, y dio a. di3 se selecciona de cualquier aminoácido, y en donde el péptido es de entre 20 y 50 aminoácidos de longitud. 7. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la rniostatina, en donde el péptido comprende la secuencia WYeie2Ye3G, (SEQ ID NO: 356) en donde e es P, S, o Y, e2 es C o Q, y e3 es G o H, y en donde el péptido es de entre 7 y 50 aminoácidos de longitud. 8. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia fxEMLf2SLf3f4LL, (SEQ ID NO: 455) en donde fx es M o I , f2 es cualquier aminoácido, f3 es L o F, f es E, Q o D; y en donde el péptido es de entre 7 y 50 aminoácidos de longitud. 9. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia, Lg1g2LLg3gL, (SEQ ID NO: 456) , en donde gi es Q, D o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, g4 es L, W, F, o Y, y en donde el péptido es de entre 8 y 50 aminoácidos de longitud. 10. Un agente de enlace, caracterizado porque comprende al menos un péptido capaz de enlazar a la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia, h1h2h3h4h5h6h7h8h9 , (SEQ ID NO: 457), en donde hx es R o D, h2 es cualquier aminoácido, h3 es A, T S o Q, h4 es L o M, h5 es L o S, h6 es cualquier aminoácido, h7 es F o E, h8 es , F o C, h9 es L, F, M o K, y en donde el péptido es de entre 9 y 50 aminoácidos de longitud. 11. Un agente de enlace, caracterizado porque tiene la estructura : (X1) a-F1- (X2)b, o multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 son cada uno independientemente seleccionados de -(L^e-P1; - (L^c-P1- (L2)d-P2- (L3)xe-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)xe-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de enlazarse a la miostatina, en donde L1, L2, L3 y L4 son cada uno agentes de ligado; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1 con la condición de que al menos uno de a y b es 1, 12. El agente de enlace de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque uno o más de los péptidos de enlace a la miostatina comprenden la secuencia de aminoácidos WMCPP (SEQ ID NO: 633), y en donde el péptido tiene entre 10 y 50 aminoácidos de longitud. 13. El agente de enlace de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque uno o más de los péptidos de enlace a la miostatina comprenden la secuencia de aminoácidos de Caia2Wa3WMCPP (SEQ ID NO: 352) , en donde alr a2 y a3 se seleccionan de un aminoácido hidrofóbico neutral, neutral polar, o básico, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud. 14. El agente de enlace de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque uno o más de los péptidos de enlace a la miostatina comprende Cbib2Wb3WMCPP (SEQ ID NO: 353), en donde bx se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de cualquiera de R, S, Q; b3 se selecciona de cualquiera de P, R, y Q, y en donde el péptido tiene entre 10 y 50 aminoácidos en longitud. 15. El agente de enlace de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque uno o más de los péptidos de enlace de miostatina, comprende cada uno independientemente la secuencia CiC2C3C4C5c6CC7C8Wc9WMCPPCioCiiCi2Ci3 (SEQ ID NO: 354), en donde: Ci está ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico; c3 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico; c4 está ausente o es cualquier aminoácido; c5 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, hidrofóbico neutral; c6 está ausente o es un aminoácido básico, neutral polar, neutral hidrofóbico; c7 es un aminoácido básico, neutral polar, o neutral hidrofóbico,· Ce es un aminoácido básico, neutral polar, o neutral hidrofóbico ; Cg es un aminoácido básico, neutral polar, o neutral hidrofóbico; y Cío hasta ci3 es cualquier aminoácido; y en donde el péptido tiene entre 20 y 50 aminoácidos de longitud. 16. El agente de enlace de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque uno o más de los péptidos de enlace a la miostatina comprenden cada uno independientemente la secuencia did2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WiyiCPPdiod1idi2di3 (SEQ ID NO: 355), en donde di está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico; d3 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o neutral hidrofóbico; d4 está ausente o es cualquier aminoácido; d5 está ausente o es un aminoácido ácido, neutral polar, o hidrofóbico neutral ; ds está ausente o es un aminoácido básico, neutral polar, o neutral hidrofóbico; d7 se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I o R; d8 se selecciona de cualquiera de R, S, Q; d9 se selecciona de cualquiera de P , R, y Q, y dio a di3 se selecciona de cualquier aminoácido, y en donde el péptido es de entre 20 y 50 aminoácidos de longitud. 17. Un agente de enlace, caracterizado porque tiene la estructura: (X1) a-F1- (X2) b, o multlmeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 son cada uno independientemente seleccionados de - (L^ c-P1 ; xe- 3 ; y - (L^c-P1- (L2)d-P2-(L3)xe-P3- (L4)f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de enlazarse a la miostatina, y en donde uno o más de P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de: (a) un péptido que comprende la secuencia de aminoácido Yeie2Ye3G, (SEQ ID NO: 356) , en donde ei es P, S, o Y, e2 es C o Q, y e3 es G o H; (b) un péptido que comprende la secuencia de aminoácido fxEMLf2SLf3f4LL, (SEQ ID NO: 455), en donde fx es M o I, f2 es cualquier aminoácido, f3 es L o F es f4 es E, Q o D; (c) un péptido que comprende la secuencia de aminoácido Lg1g2LLg3g4L, (SEQ ID NO: 456) , en donde gx es Q, D, o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, y g4 es L, W, F, o Y; y (d) un péptido que comprende la secuencia de aminoácido hih2h3h4h5 6h7 8 9 (SEQ ID NO: 457), en donde hx es R o D, h2 es cualquier aminoácido, h3 es A, T, S, o Q, h4 es L o M, h5 es L o S, hs es cualquier aminoácido, h7 es F o E, h8 es W, F o C, y h9 es L, F, M o K; en donde el péptido es de entre 9 y 50 aminoácidos de longitud, en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno agentes de ligado; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b es 1. 18. Un agente de enlace, caracterizado por el agente tiene la estructura: (X1) a-F1- (X2)b o multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 son cada uno independientemente seleccionados de - (L^c-P1; -(L^c-P^ÍL^d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)xe-P3; y - (L1) c-P1- (L2) d-P2- (L3)xe-P3- (L4) f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de enlazarse a la miostatina, y se seleccionan independientemente de SEQ ID NO: 305 hasta 351 y SEQ ID NO: 357 hasta 454; en donde L1, L2, L3 y L4 son cada uno agentes de ligado; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b es 1. 19. El agente de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 18, caracterizado porque el vehículo es un dominio Fe. 20. Una secuencia de polinucleótidos, caracterizada porque codifica para el agente de enlace de conformidad con la reivindicación 19. 21. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 20. 22. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 21. 23. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque es una célula procariótica . 2 . La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque es una célula eucariótica . 25. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva del agente de enlace de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones 1 ó 11 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable de los mismos . 26. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el vehículo es un dominio Fe . 27. Un método para la inhibición de la actividad de la miostatina en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva del agente de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 3 u 11 al sujeto. 28. Un método para incrementar la masa muscular sin grasa en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 25 al sujeto. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el sujeto es un animal de alimento. 30. Un método para incrementar la relación de masa muscular sin grasa a grasa en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 25 al sujeto. 31. Un método para el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 25 al sujeto. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad se selecciona de distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardiaca crónica, cáncer, SIDA, insuficiencia renal, uremia, artritis reumatoide, sarcopenia relacionada con la edad, y desgaste muscular debido a un reposo prolongado, lesiones en la espina dorsal, apoplejía, fractura de huesos y envejecimiento. 33. Un método para el tratamiento de un trastorno metabólico relacionado con la miostatina en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 25 al sujeto. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el trastorno metabólico se selecciona de la diabetes, obesidad, hiperglicemia, y pérdida ósea. 35. Un método para la detección de la miostatina en una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con un agente de enlace de conformidad con las reivindicaciones 1 u 11, y detectar el complejo enlazado. 36. Un método para medir la miostatina en una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con un agente de enlace de conformidad con las reivindicaciones 1 u 11, y medir el complejo enlazado. 37. Un método para el diagnóstico del trastorno relacionado con la miostatina en un sujeto, caracterizado porque comprende poner en contacto una muestra tomada del sujeto con un agente de enlace de conformidad con las reivindicaciones 1 u 11 y detectar el complejo enlazado.
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