EA009056B1 - Связывающие агенты, ингибирующие миостатин - Google Patents

Связывающие агенты, ингибирующие миостатин Download PDF

Info

Publication number
EA009056B1
EA009056B1 EA200501000A EA200501000A EA009056B1 EA 009056 B1 EA009056 B1 EA 009056B1 EA 200501000 A EA200501000 A EA 200501000A EA 200501000 A EA200501000 A EA 200501000A EA 009056 B1 EA009056 B1 EA 009056B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
myostatin
peptide
amino acid
binding
amino acids
Prior art date
Application number
EA200501000A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501000A3 (ru
EA200501000A2 (ru
Inventor
ХКью Хан
Хосунг Мин
Томас Чарлз Бун
Original Assignee
Амген, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген, Инк. filed Critical Амген, Инк.
Publication of EA200501000A2 publication Critical patent/EA200501000A2/ru
Publication of EA200501000A3 publication Critical patent/EA200501000A3/ru
Publication of EA009056B1 publication Critical patent/EA009056B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/06—Anabolic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении предлагаются связывающие агенты, включающие пептиды, способные связывать миостатин и ингибировать его активность. В одном варианте связывающий агент включает по крайней мере один миостатинсвязывающий пептид, присоединенный непосредственно или косвенно по меньшей мере к одному носителю, такому как полимер или Fc домен. Связывающие агенты настоящего изобретения при введении животным продуцировали повышенную массу тощих мышц и обуславливали снижение соотношения жира и мышц. Терапевтические композиции, содержащие связывающие агенты настоящего изобретения, пригодны для лечения расстройств, связанных с потерей мышечной массы, и других метаболических заболеваний, в том числе диабета и ожирения.

Description

Изобретение относится к факторам роста и, в частности, к фактору роста - миостатину и агентам, которые связывают миостатин и ингибируют его активность.
Уровень техники
Известно, что миостатин, известный также как фактор 8 роста/дифференциации (ΟΌΡ-8), являющийся представителем группы трансформирующих β-факторов роста (ТОР-β), участвует в регулировании массы скелетных мышц. Большинство представителей ΤΟΡ-β-ΟΌΡ семейства неспецифически экспрессируются в тканях различных типов и проявляют различные плейотропические воздействия. Тем не менее миостатин экспрессируется, в основном, в клетках тканей развивающихся или находящихся во взрослом состоянии скелетных мышц и играет особую роль, оказывая отрицательное влияние на рост скелетных мышц (МсРкетгоп е! а1. №1Шгс (Ьопбоп) 387, 83-90 (1997)). Недавние исследования показали, что невысокие уровни экспрессии миостатина можно зафиксировать в ткани сердца и жировой и преджировой тканях.
В процессе эволюции миостатин как белок практически не претерпел изменений (МсРкетгоп е! а1. ΡΝΆ8 И8А 94:12457-12461 (1997)). Последовательности биологически активного С-концевого участка миостатина у человека, мыши, крысы, коровы, цыпленка, индюка имеют 100%-ю идентичность. Функция миостатина, по-видимому, так же хорошо сохранилась независимо от вида (животного). Это очевидно, исходя из фенотипов животных, имеющих мутацию в гене миостатина. Для двух пород крупного рогатого скота, Ве1щап В1ие (Напке! К., Микс1е НуреДторку о! Сепебс Опдш апб Нк Ике 1о 1шртоуе Вее! Ртобисбоп, ебк, Кшд, Т\У.С.& Мешкает, Р. (N^^ΗоΓΓ. Тке Надие, Тке №1кег1апбк) рр. 437-449 и Р1ебшоп1е8е (Макоего, О. & Рои)агб1еи, В, Микс1е НуреДторку о! Оепебс Опдш апб 1!к Ике !о 1шртоуе Вее! Ртобисбоп, ебк, Кшд, Р\У.С.& Мешкает, Р. (^Око!! Тке Надие, Тке №1кег1апбк). рр.450-459) характерен фенотип двойных (парных) мышц» и увеличение мышечной массы. Показано, что у этих пород есть мутации в кодирующей части гена миостатина (МсРкеггоп е! а1. (1997), там же). Кроме того, у мышей со специально осуществленной делецией гена, кодирующего миостатин (Мк!п), наблюдали резкое увеличение мышечной массы без соответствующего нарастания массы жира. Вес отдельных мышц Мк1п - мышей приблизительно на 100-200% больше, чем соответствующих мышц контрольных животных, как результат гипертрофии и гиперплазии мышечного волокна (21штегк е! а1. 8с1еисе, 296, 1486 (2002)).
Показано, что введение миостатина некоторым видам мышей приводит к состоянию, сходному с разрушающими мышечные ткани расстройствами, которые, как установлено, сопровождают такие заболевания как, например, рак, ВИЧ и мышечная дистрофия. Миостатин, введенный бестимусным бесшерстным мышам в виде продуцирующих миостатин СНО клеток, производил опустошающее действие с высокой степенью потери веса, приведя к снижению на 50% массы скелетной мускулатуры помимо потери жира и сильной гипогликемии (21ттетк е! а1., там же).
Убыль миостатина, по-видимому, приводит к сохранению мышечной массы и уменьшению накопления жира в процессе старения. Установлено, что обусловленные старением увеличение массы жировой ткани и снижение мышечной массы пропорциональны уровня миостатина, что определено путем сопоставления массы жира и мышечной массы МкШ мышей по сравнению с Мк!п-/- взрослыми нокаут-мышами (МсРетгоп е! а1. 1. С1ш. 1пуек!. 109, 595 (2002)). Для МкШ - мышей было характерно пониженное накопление жира в процессе старения по сравнению с МкШ мышами.
Помимо этого миостатин может участвовать в сохранении уровня содержания глюкозы в крови и может оказывать влияние на развитие диабета в некоторых случаях. Известно, например, что устойчивость скелетной мышцы инсулинстимулируемому подъему уровня глюкозы представляет собой самый ранний известный симптом неинсулинзависимого диабета (типа 2) (Сотгедап е! а1. Еибос^уио1оду, 128:1682 (1991)). В настоящее время установлено, что снижение миостатина отчасти ослабляет фенотипическое проявление ожирения и диабета у двух модельных типов мышей, агути летальной желтой (Ау) (Уеп е! а1. РА8ЕВ 1., 8:479 (1994)) и тучных (ЬероЬ/оЬ). Накопление жира и общей массы тела Ау/а, МкШ - мыши с двойной мутацией было намного меньше, чем у Ау/а, Мк!п+/+ мыши (МсРкегоп е! а1., (2002), там же). Помимо этого, уровни глюкозы в крови у Ау/а, Мк!п-/- мышей был гораздо ниже, чем у Ау/а, Мк!п+/+ мышей после экзогенного поступления глюкозы, что показывало, что снижение миостатина усиливает метаболизм глюкозы. Аналогично ЬероЬ/оЬ Мк!п-/- мыши показали снижение накопления жира по сравнению с ЬероЬ/оЬ МкШ фенотипом.
Поэтому с учетом фенотипов животных со сверхэкспрессией и нокаут-животных можно с уверенностью утверждать, что миостатин определенным образом задействован в ряде метаболических расстройств, включая заболевания, приводящие к разрушению мышц, диабет, тучность и гипергликемию.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающим агентам, которые связывают миостатин и ингибируют его активность. Связывающие агенты включают по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин. Миостатинсвязывающие пептиды имеют аминокислотную последовательность, включающую предпочтительно от около 5 до около 50 аминокислот, более предпочтительно от около
- 1 009056 до около 30 аминокислот и наиболее предпочтительно от около 10 до около 25 аминокислот. Один вариант миостатинсвязывающего пептида включает аминокислотную последовательность АМСРР (8ЕЦ ГО N0: 633). В другом варианте миостатинсвязывающие пептиды включают аминокислотную последовательность Са1 а2Аа3АМСРР (8Е0 ГО N0: 352), где а1, а2 и а3 выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты. В другом варианте миостатинсвязывающий пептид включает последовательность СЬ1Ь2АЬ3АМСРР (8Е0 ГО N0: 353), где Ь1 выбрана как любая из аминокислот Т, I или В; Ь2 выбрана из В, 8, О: Ь3 выбрана из Р, В, О. причем пептид включает от 10 до 50 аминокислот, и ее физиологически приемлемые соли. В другом варианте миостатинсвязывающий пептид соответствует соединению формулы с1 с2 с3 с4 с5 с6 С_с7 с8 А с9 АМСРР с10 с11 с12 с13 (8ЕЦ ГО N0: 354), где с1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту, с7 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с8 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с9 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, а с10-с13 представляют собой любые аминокислоты, причем протяженность пептида составляет от 20 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемым солям.
Похожий вариант миостатинсвязывающего пептида соответствует соединению формулы
62 63 64 65 6б С67 68 №_6д ХУМСРР 610 би 612 613 (81Ϊ0) ГО N0: 355), где 61 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
66 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,
67 выбран из аминокислот Т, I или В,
68 выбран из В, 8, О,
69 выбран из Р, В и Ц, а
610-61з представляют собой любые аминокислоты, причем протяженность пептида составляет от до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемым солям.
Дополнительные варианты связывающих агентов включают по крайней мере один из следующих пептидов:
(1) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательности
АУС|С2 Уе3 О, (81(0) ГО N0: 356), где βι представляет собой Р, 8 или Υ, е2 представляет собой С или Ц, а е3 представляет собой О или Н, протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;
(2) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательности £ι ЕМЬ £2 8Ь £3 £4 ЬЬ (8ЕО) ГО N0: 455), где £ι представляет собой М или I, £2 - любая аминокислота, £3 представляет собой Ь или Е, £4 представляет собой Е, О или Ό, протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;
- 2 009056 (3) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательности ё2 ЬЪ ёз ё4 Ь, <8ЕО ГО N0: 456), где д представляет собой 0. Ό или Е, д2 представляет собой 8, 0, Ό или Е, д3 - любая аминокислота, д4 представляет собой Ь, ^, Е или Υ, протяженность пептида составляет от 8 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;
(4) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательности
Ь1 Ь2 Ь3 Ь4 Ь5 Ь6 Ь Ь8 Ьэ (81 А) ГО N0: 457), где Ь1 представляет собой К или Ό,
Ь2 - любая аминокислота,
Ь3 представляет собой А, Т, 8 или О,
Ь4 представляет собой Ь или М,
Ь5 представляет собой Ь или 8,
Ь6 - любая аминокислота,
Ь7 представляет собой Е или Е,
Ь8 представляет собой ^, Е или С,
Ьэ представляет собой Е, Е, М или К, протяженность пептида составляет от 9 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли.
Как вариант изобретения связывающие агенты данного изобретения включают также по меньшей мере один носитель, такой как полимер или Ес домен, и могут, кроме этого, включать по меньшей мере одну линкерную последовательность. Согласно этому варианту связывающие агенты настоящего изобретения конструируют так, чтобы по меньшей мере один миостатинсвязывающий пептид был присоединен по меньшей мере к одному носителю. Пептид или пептиды присоединяют непосредственно или через линкерную последовательность к носителю за счет Ν-концевой, С-концевой аминокислоты или состоящей из аминокислот боковой цепи пептида. В этом варианте связывающие агенты настоящего изобретения имеют следующую обобщенную структуру:
(Х1)а - Е1 - (Х2)Ь или ее мультимеры, где Е является носителем,
Х1 и Х2, каждый независимо, выбран из (Ь1)с-Р1, (Е1)с-Р1-(Ь2)4-Р2, (Е1)с-Р1-(Е2)4-Р2-(Е3)е-Р3 и (Е1)с-Р1-(Е2)4-Р2-(Е3)е-Р3-(Ь4)£-Р4, где Р1, Р2, Р3 и Р4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, а Ь1, Ь2, Ь3 и Ь4 каждый являются линкерами, а, Ь, с, 6, е и £, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или Ь является 1, и их фармацевтически приемлемые соли.
В других вариантах связывающих агентов, соответствующих этой обобщенной структуре, пептиды Р1, Р2, Р3 и Р4 могут быть независимо выбраны из одного или нескольких любых пептидов вышеприведенных последовательностей. Р1, Р2, Р3 и Р4 независимо выбраны из одного или нескольких пептидов, отвечающих любой из следующих последовательностей: 8Е0 ГО N0: 633, 8Е0 ГО N0: 352, 8Е0 ГО N0: 353, 8ЕО ГО N0: 354, 8ЕО ГО N0: 355, 8ЕО ГО N0: 356, 8ЕО ГО N0: 455, 8ЕО ГО N0: 456, 8ЕО ГО N0: 457.
Согласно другому варианту изобретения связывающие агенты включают пептиды, присоединенные к Ес домену с помощью чего-либо или непосредственно, что приводит к образованию пептидных антител. Пептидные антитела настоящего изобретения проявляют высокую связывающую аффинность по отношению к миостатину и могут ингибировать активность миостатина, как показано и исследованиями ίη νίίτο на клетках, так и с помощью животных.
Настоящее изобретение относится также и к нуклеиновым кислотам, включающим полинуклеотиды, кодирующие пептиды, пептидные антитела, а также варианты и производные пептидов и пептидных антител настоящего изобретения.
Настоящее изобретение охватывает также фармацевтически приемлемые композиции, включающие один или несколько связывающих агентов настоящего изобретения.
Связывающие агенты настоящего изобретение ингибируют активность миостатина ίη νίίτο и ίη νίνο. Связывающие агенты настоящего изобретения повышают массу тощих мышц у испытуемых животных и снижают массу жира как часть веса тела животного. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения повышают мышечную силу исследуемых модельных животных.
Настоящее изобретение предусматривает также способы ингибирования активности миостатина у животных, включая человека, путем введения субъекту эффективной дозы одного или нескольких свя
- 3 009056 зывающих агентов. Настоящее изобретение предусматривает способы повышения массы тощих мышц у животных, включая человека, путем введения эффективной дозы одного или нескольких связывающих агентов. Данное изобретение предусматривает также способы лечения миостатинзависимых расстройств путем введения пациенту терапевтически эффективной дозы одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов в виде фармацевтически приемлемой композиции. Настоящее изобретение обеспечивает способы лечения разрушающих мышцы заболеваний, включающих мышечную дистрофию, разрушение мышц вследствие рака, ВИЧ, ревматоидный артрит, почечную недостаточность, уремию, хроническую сердечную недостаточность, возрастную саркопению, состояние в результате длительного постельного режима, перелом позвоночника, удар, переломы костей. Настоящее изобретение предусматривает способы лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, таких как ожирение, диабет, гипергликемия, остеопороз.
Данное изобретение включает также способ повышения мышечной массы употребляемых в пищу животных путем введения животным эффективной дозы одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов.
Настоящее изобретение предусматривает также исследования с помощью одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов для идентификации и количественного определения миостатина в образце. Такие анализы могут быть диагностическим определением, служащим для измерения или мониторинга уровней миостатина у лиц с миостатинзависимым расстройством или заболеванием.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана активность миостатина, определенная по активности экспрессируемой люциферазы (Υ-ось) против концентрации (Х-ось) ΤΝ8-19 пептида ΟΟΗί.’ΤΒ\νΡ\νΜί.’ΡΡΥ (8ЕЦ ΙΌ N0: 32) и ΤΝ8-19 пептидного антитела (рЬ) для определения 1С50 для каждого анализа с использованием С2С12 рМАКЕ люциферазы, описанного ниже в примерах. Пептидное антитело имеет более низкую величину 1С50, чем пептид.
На фиг. 2 представлена кривая, показывающая увеличение общей массы тела для СИ 1 пи/пи мышей, получивших лечение повышенными дозами 1хт ΤΝ8-19-21 пептидного антитела в течение 14 дней, по сравнению с мышами, получившими лечение 1шРе контролем, как описано в примере 8.
На фиг. ЗА показано повышение массы гастрокнемиальной мышечной массы при вскрытии мышей, леченных как указано в пояснении к фиг. 2 (пример 8).
На фиг. ЗВ показано увеличение тощих мышц при определении с помощью ЯМР на день 0 по сравнению с 13-м днем опыта, описанного в примере 8.
На фиг. 4 показано увеличение массы тощих мышц как для СИ 1 пи/пи мышей, получавших дважды в неделю инъекции повышающихся доз 1хт ΤΝ8-19-32 пептидного антитела, при определении с помощью ЯМР на день 0 и 13-й день опыта, описанные в примере 8.
На фиг. 5 А показано увеличение массы тела для СЭ1 пи/пи мышей, получавших дважды в неделю инъекции 1хт ΤΝ8-19-7, по сравнению с 2хт ΤΝ8-19-7 и контрольными животными в течение 35 дней как описано в примере 8.
На фиг. 5В показано увеличение веса каркаса тощих мышц при вскрытии 1х и 2х вариантов при 1 и 3 мг/кг по сравнению с животными, получившими среду (1шРе) (контроль).
На фиг. 6А показано увеличение массы тощих мышц по сравнению с массой тела у старых тбх мышей, получавших лечение или аффинно зрелым 1хт ΤΝ8-19-33 пептидным антителом, или 1шРе средой, при дозе 10 мг/кг, вводимой подкожно через день в течение трех месяцев. На фиг. 6В показано изменение массы жиры по сравнению с массой тела, определенное с помощью ЯМР для тех же самых мышей после 3 месяцев лечения.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающим агентам, способным связывать миостатин и ингибировать его активность. Связывающие миостатин агенты можно использовать для определений, идентификации, количественного анализа или мониторинга содержания миостатина у животных. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения понижают активность миостатина. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения увеличивают массу тощих мышц животных, снижают массу жира как часть веса тела и повышают мышечную силу. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения могут использоваться для лечения многих метаболических расстройств, в которых участвует миостатин, включающих расстройства, сопровождающиеся разрушением мышц, например мышечная дистрофия, разрушение мышц вследствие рака, ВИЧ, ревматоидный артрит, почечная недостаточность, уремия, хроническая сердечная недостаточность, состояние в результате длительного постельного режима, перелом позвоночника, удар, возрастная саркопения, а также другие метаболические расстройства, включающие диабет, ожирение, гипергликемию и остеопороз, путем введения субъекту терапевтической дозы одного или нескольких связывающих агентов в виде фармацевтически приемлемой композиции.
Миостатин
Известно, что миостатин, фактор роста, известный как СЭР-8, является обратным (негативным) регулятором тканей скелетных мышц. Миостатин синтезируется как неактивный препропротеин, кото
- 4 009056 рый активируется протеолитическим расщеплением (Ζίιηιικπ, е! а1., см. выше (2002)). Протеинпредшественник расщепляется с образованием ИН2-концевого протеина в форме гомодимера с молекулярной массой около 25 кДа, который является зрелой, активной формой протеина (Ζίιηιικπ, е! а1., см. выше (2002)). В настоящее время полагают, что зрелый димер циркулирует в крови как неактивный латентный комплекс, связанный с пропептидом (Ζίιηιικπ, е! а1., см. выше (2002)).
В соответствии с использованным здесь значением термин «полноразмерный миостатин» соответствует последовательности полноразмерного препропротеина, описанного МеРйеггои е! а1. (см. выше (1997)), а также родственным полноразмерным пептидам, в том числе аллельным вариантам и межвидовым гомологам, которые также описываются МеРйеггои е! а1. (1997). В соответствии с использованным здесь значением термин «продомен» или «пропептид» относится к неактивному ИН2-концевому протеину, который отщепляется с образованием активного СООН-концевого протеина. В соответствии с использованным здесь значением термин «миостатин» или «зрелый миостатин» относится к зрелому биологически активному СООН-концевому полипептиду в мономерной, димерной, мультимерной или иной форме. «Миостатин» или «зрелый миостатин» относится также к фрагментам биологически активного зрелого миостатина, а также родственным, сходным полипептидам, включая аллельные варианты, сплайс-варианты и слитые пептиды и полипептиды. Были сообщения о том, что последовательность СООН-концевого протеина, являющегося зрелым миостатином, на 100% идентична в отношении многих видов животных, включая человека, мышь, цыпленка, свинью, индюка и крысу (Ьее е! а1., ΡΝΆ8 98, 9306 (2001)). Миостатин может включать или может не включать концевые остатки, например, последовательности направленного действия или остатки метионина и лизина и/или последовательности меченых или слитых белков, в зависимости от способа его получения.
В используемом здесь значении термин «способный связывать миостатин» или «обладающий связывающей аффинностью в отношении миостатина» означает связывающий агент или пептид, который связывается с миостатином, как показано с помощью фагового ЕЬ18А-исследования, В1Асоге® или ΚίηΕχΑ™ исследований, описанных ниже в примерах.
В используемом здесь значении термин «способный модифицировать активность миостатина» относится к действию такого агента, как агонист или антагонист, в отношении по крайней мере одной биологической активности миостатина. В используемом здесь значении активность «агониста» или «миметика» относится к агенту, обладающему биологической активностью, сравнимой с активностью протеина, который взаимодействует с представляющим интерес белком, как описано, например, в Международной заявке \¥О 01/83525, поданной 2 мая 2001 г., которая упоминается здесь как ссылка.
В используемом здесь значении термин «ингибирующая миостатин активность» или «имеющий антагонистическую активность» относится к способности пептида или связывающего агента уменьшать или блокировать активность миостатина или подавать сигнал, что показано ίη νίΐτο исследованиями, такими как, например, анализ активности миостатина с помощью рМАКЕС2С12 - клеток или ίη νινο исследованиями на животных, как показано ниже.
Структура связывающих миостатин агентов
В одном варианте изобретения связывающие агенты настоящего изобретения включают по меньшей мере один связывающий миостатин пептид, ковалентно присоединенный по меньшей мере к одному носителю, такому как полимер или Ес домен. Присоединение миостатинсвязывающих пептидов по меньшей мере к одному носителю предназначается для того, чтобы повысить эффективность связывающего агента как терапевтического средства путем увеличения биологической активности агента и/или уменьшения разрушения ίη νινο, увеличения периода полужизни ίη νινο, уменьшения токсичности или иммуногенности ίη νινο. Связывающие агенты настоящего изобретения могут также включать линкерную последовательность, соединяющую пептид и носитель.
Пептид или пептиды присоединяют непосредственно или через линкерную последовательность к носителю за счет Ν-концевой, С-концевой аминокислоты или состоящей из аминокислот боковой цепи пептида. В этом варианте связывающие агенты настоящего изобретения имеют следующую обобщенную структуру:
(Х1),, - Е1 - (Х2)й или ее мультимеры, где Е1 является носителем, а
X1 и X2, каждый независимо, выбран из (Ь')с-Р1, (Е1)с-Р1-(Ь2)а-Р2, (Е1)с-Р1-(Е2)а-Р2-(Ь3)е-Р3 и (Е1)с-Р1-(Е2)й-Р2-(Е3)е-Р3-(Ь4)£-Р4, где Р1, Р2, Р3 и Р4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, а Ь1, Ь2, Ь3 и Ь4 каждый являются линкерами, а, й, с, 6, е и £, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или й является 1.
Любой пептид, содержащий цистеиновый остаток, может быть поперечно сшит другим Су 5содержащим пептидом, каждый из них или оба могут быть присоединены к носителю. Любой пептид,
- 5 009056 содержащий более одного Сук остатка, также может образовывать внутрипептидную дисульфидную связь (мостик).
В одном из вариантов носителем является Рс домен, который будет описан ниже. Такой вариант называют «пептидное антитело». В используемом здесь значении термин «пептидное антитело» относится к молекуле, включающей антительный Рс домен, соединенный по меньшей мере с одним пептидом. Получение пептидных антител в общем описано в РСТ публикации АО 00/24782, опубликованной 4 мая 2000 г., включенной здесь как ссылка. Примеры пептидных антител представляют собой 1х и 2х конфигурации с одним пептидом или двумя пептидами (соединенными тандемно) соответственно согласно описанному ниже в примерах.
Пептиды
Согласно используемому здесь значению термин «пептид» относится к веществам, молекулы которых состоят из приблизительно 5-90 аминокислот, связанных пептидными связями. Пептиды настоящего изобретения (по протяженности) включают предпочтительно от примерно 5 до примерно 50 аминокислот, более предпочтительно около 10-30 аминокислот и наиболее предпочтительно около 1025 аминокислот и способны связываться с миостатином.
Пептиды настоящего изобретения могут включать часть последовательности протеинов природного происхождения, могут быть рандомизированными последовательностями, полученными на основе встречающихся в природе протеинов или могут быть полностью рандомизированными последовательностями. Пептиды настоящего изобретения могут быть получены любыми способами, известными в данной области, включая химический синтез, переваривание протеинов (ферментные методы) или рекомбинантные технологии. Метод фагового дисплея и РНК-пептидный скрининг, а также другие методы аффинного скринирования особенно подходят для получения пептидов, способных связывать миостатин.
Технология фагового дисплея описана, например, 8сой с1 а1. 8с1епсе 249:386 (1990); Ωονίίη с1 а1. 8с1епсе 249:404 (1990); И8 патент № 5223409, выдан 29 июня 1993; И8 патент № 5733731, выдан 31 марта 1998; И8 патент № 5498530, выдан 12 марта 1996; И8 патент № 5432018, выдан 11 июля 1995; И8 патент № 5338665, выдан 16 августа 1994; И8 патент № 5922545, выдан 13 июля 1999; АО 96/40987, опубл. 10 декабря 1996; АО 98/15833, опубл. 16 апреля 1998, каждый из которых приведен здесь как ссылка. С использованием библиотеки фагов показываются случайные последовательности пептидов, полученные слиянием с поверхностными протеинами нитчатого фага. Обычно выставленные пептиды являются аффинно элюируемыми со специфичностью или без специфичности по отношению к молекуле-мишени. Сохраняемые фаги могут пополняться за счет успешных циклов аффинной очистки и пересевов. Самые лучшие связывающие пептиды отбирают для дальнейшего анализа, например, используя фаговый ЕЫ8Л, описанный ниже, а затем секвенируют. Необязательно, могут быть созданы библиотеки вследствие мутагенеза, которые затем подвергают скринированию для дальнейшей оптимизации последовательностей наилучших связывающих пептидов (Боутап, Апп. Кеу. ВюрБук. Вюшо1. δίπια. 26:401-24 (1997)).
Другие методы создания миостатинсвязывающих пептидов включают дополнительные способы аффинного отбора, известные в данной области. Пептидная библиотека может быть слита с С-концом 1ас-репрессора и экспрессирована в Е. сой. Другой способ на основе Е. соБ обеспечивает дисплей на наружной мембране клеток за счет слияния с пептидо-гликан-ассоциированным липопротеином (РАБ). Здесь и далее эти и подобные методы обобщенно называются «Е. сой дисплей». В другом способе трансляция случайной РНК обрывается до выхода из рибосомы, приводя к созданию библиотеки полипептидов с их ассоциированной РНК, пока присоединенной. Ниже этот и подобные методы в целом обобщенно называются «рибосомный дисплей». В других способах используется химическое связывание пептидов с РНК. См. например, КоБейк и 8Бок!ак, Ргос. №111. Асай. δα И8А, 94:12297-303 (1997). Далее этот и подобные методы обобщенно называются «РНК-пептидной скрининг». Методы скрининга двугибридных дрожжей также могут использоваться для идентификации заявляемых в данном изобретении пептидов, которые связывают миостатин. Кроме этого, разработаны библиотеки химически модифицированных пептидов, которые получают иммобилизацией на стабильных небиологических материалах, таких как полиэтиленовые стержни или проницаемые для растворителя смолы. Другая библиотека химически модифицированных пептидов использует фотолитографию для сканирования пептидов, иммобилизованных на слайдах из стекла. Далее эти и подобные методы обобщенно называются «скрининг химически модифицированных пептидов». Скрининг химически модифицированных пептидов имеет то преимущество, что позволяет использовать Ό-аминокислоты и иные аналоги, также как и непептидные элементы. И биологический, и химический методы описаны Ае11к и Боутап, Сигг Орш Вю1есБпо1 3: 355-62 (1992).
Кроме этого выбранные пептиды, способные связывать миостатин, могут быть дополнительно усовершенствованы путем так называемого «рационального конструирования». Этот подход характеризуется тем, что производятся постепенные изменения последовательности пептида и при соответствующем исследовании наблюдают влияние, оказываемое замещением, на аффинность связывания или специфичность пептида или некоторые другие его свойства. Примером этого метода является замеще
- 6 009056 ние какого-либо одного остатка за (один) раз аланином, который называется «прогулка (проход) аланина» или «сканирование аланина». Если замещают два остатка, этот метод называют «двойная аланиновая прогулка». Получающиеся в результате пептиды, имеющие замещения аминокислот, проверяют на повышенную активность или другие дополнительные полезные свойства.
Помимо этого анализ структуры взаимодействия между одним белком и другим белком может также использоваться для того, чтобы определить пептиды, которые взаимодействуют аналогично протеинам больших размеров. При таком анализе по кристаллической структуре протеина можно получить представление об идентичности и относительной ориентации практически важных остатков молекулы протеина, исходя из которых можно сконструировать пептид. См. например, Таказап с1 а1., №1Шгс Βίο1сс11 15:1266 (1977). Этим методы могут также использоваться для изучения взаимодействия между целевым белком и пептидами, отобранными фаговым дисплеем или другими способами аффинного отбора, приводя тем самым к дальнейшим предположениям возможных модификации пептидов с целью увеличения аффинности связывания и способности пептида ингибировать активность протеина.
В одном варианте изобретения пептиды настоящего изобретения создают как семейства родственных пептидов. Примерами таких пептидов являются представленные 8ЕО ΙΌ N0: с 1 по 132. Эти пептиды получены методом отбора, при котором полученные методом фагового дисплея самые лучшие связывающие агенты подвергали последующему анализу с помощью фагового ΕΌΙ8Α, чтобы получить кандидатные пептиды с помощью аффинной избирательной технологии, например, описанным здесь методом фагового дисплея. Однако пептиды настоящего изобретения можно получить различными известными способами, включая и химический синтез, что описано ниже.
Пептиды настоящего изобретения могут быть затем улучшены способом «созревания аффинности». Эта процедура направлена на повышение аффинности или активности пептидов и пептидных антител настоящего изобретения с помощью фагового дисплея или других методов отбора. На основе консенсусной последовательности могут быть получены ориентированные вторичные фагдисплейные библиотеки, в которых «коровые» аминокислоты (установленные по консенсусной последовательности) сохраняются постоянными или имеют систематические отклонения. Или же конкретная пептидная последовательность может использоваться для получения ориентированной фагдисплейной библиотеки с систематическими отклонениями. «Просеивание» (сортировка) таких библиотек при более жестких условиях может приводить к получению пептидов с повышенной способностью связывать миостатин, селективностью связывания с миостатином или другими дополнительными желательными свойствами. Однако пептиды, имеющие последовательности, соответствующие аффинной зрелости, могут быть затем получены любым из известных способов, включая химический синтез и рекомбинантные методы. Эти пептиды используются для создания связывающих агентов, таких как пептидные тела самых различных конфигураций, которые проявляют более высокую ингибиторную активность в исследованиях на клетках ίη νινο.
В примере 6, приводимом ниже, описывается созревание аффинности пептидов первого раунда, описанных выше, с получением аффинно зрелых пептидов. Примеры аффинно зрелых пептидных антител представлены в табл. IV и V. Получившиеся 1х и 2х пептидные антитела, полученные из этих пептидов, были затем охарактеризованы по аффинности связывания, способности нейтрализовать активность миостатина, специфичности по отношению к миостатину, по сравнению с другими представителями семейства ΤΝΕβ и, кроме того, по активности ίη νίΐτο и ίη νινο, как описано ниже. Аффинно зрелые пептиды и пептидные антитела обозначаются префиксом «т» перед наименованием их семейства для того, чтобы отличить их от пептидов первого раунда того же семейства.
Примерные пептиды первого круга, выбранные для последующего созревания аффинности, согласно изобретению включали следующие пептиды: ΤΝ8-19 ОСНСТВ\УР\УМСРРУ (8Е0 ΙΌ N0: 33) и линейные пептиды Ьшеат-2 ΜΕΜΕΌδΕΡΕΕΌΚΌΜνΡΙδΚΑ (8Е0 ΙΌ N0: 104), Ьшеат-15
НН6\\Л'ΥΕΗΚ(.ιδΑΡΟ\\Ί;ΕΑ\Υν (8Ер ГО N0: 117), Ьшеат-17 ΠΑΤΕΕΚΟΕΑΟΕνΕΟΥΟΟΝ (8ЕО ΙΌ N0: 119), Ьшеат-20 ΥΡΕΜδΜΕΕΟΡΕΟνΡΕΡΟΗ Υ (8ЕО ΙΌ N0: 122), Ьшеат-21 Н№8рМЬЬ8ЕЬРМЖО8ММр (8ЕО ΙΌ N0: 123), Ьшеат-24 ΕΡΡΗ\^ΗNΗΒδΕVNΗ\^^ΜN (8ЕО ΙΌ N0: 126).
Аффинно зрелые семейства каждого из них представлены ниже в табл. Ιν и V. Пептиды настоящего изобретения включают также и варианты и производные отобранных пептидов, которые обладают способностью связывать миостатин. В используемом здесь значении термин «вариант» относится к пептидам с одной или несколькими аминокислотными инсерциями, делениями или замещениями исходной аминокислотной последовательности, которые способны связывать миостатин. Варианты с инсерциями или заменами могут содержать природные аминокислоты, а также аминокислоты, не встречающиеся в природе. В используемом здесь значении термин «вариант» включает фрагменты пептидов, которые еще сохраняют способность связывать миостатин. В используемом здесь смысле термин «производное» относится к пептидам, которые химически модифицированы иным путем, чем варианты с инсерциями, делениями и замещениями. Варианты и производные пептидов и пептидных антител настоящего изобретения описываются ниже более подробно.
- 7 009056
Носители
В используемом здесь значении термин «носитель» означает вещество (молекулу), которое может быть присоединено к одному или нескольким пептидам настоящего изобретения. Предпочтительно носители придают по меньшей мере какое-нибудь одно желаемое свойство связывающим агентам настоящего изобретения. Пептиды сами по себе вероятно удаляются ίη νίνο либо почечной фильтрацией с помощью механизмов клеточного очищения ретикулоэндотелиальной системы, либо путем протеолитического расщепления. Присоединение к носителю повышает терапевтическую ценность связывающего агента в результате снижения степени разрушения связывающего агента и/или повышения времени полужизни, уменьшения токсичности, снижения иммуногенности и/или повышения биологической активности связывающего агента.
Примерами носителей являются Ес домены, линейные полимеры, например, полиэтиленгликоль (РЕС). полилизин, декстран; полимер с разветвленной цепью (см. например И8 патент № 4289872 ЭепкеиетаИсг с1 а1., выданный 15 сентября 1981, ϋδ патент № 5229490 Тат, выданный 20 июля 1993, АО 93/21259 Егес11е1 е1 а1., опубл. 28 октября 1995); липид; семейство холестеролов (например, стероиды); углевод или олигосахарид или любой природный или синтетический протеин, полипептид или пептид, который связывается с сохранившимся рецептором.
В одном варианте связывающие миостатин агенты настоящего изобретения имеют по меньшей мере один пептид, присоединенный по меньшей мере к одному носителю (Е1, Е2) через Ν-конец, Сконец или боковую цепочку одного из аминокислотных остатков пептида(-ов). Могут использоваться разные носители, такие как Ес домен на каждом конце или Ес домен на одном конце и РЕС-группа на другом конце боковой цепочки.
Ес домен является предпочтительным носителем. В используемом здесь значении под термином «Ес домен» понимают молекулы нативного Ес и вариантов Ес и последовательности, определенные ниже. В используемом здесь смысле термин «нативный Ес» относится к неантигенному связывающему фрагменту антитела или аминокислотной последовательности этого фрагмента, которую получают методами рекомбинантных ДНК или энзиматическим или химическим расщеплением интактных антител. Предпочтительный Ес - это фактически Ес человека, он может происходить из любого из иммуноглобулинов, таких как 1дС1 и 1дС2. Однако Ес молекулы, которые лишь частично имеют происхождение от человека или имеют происхождение от других организмов (не от человека), могут включаться в это понятие. Молекулы нативного Ес представляют собой мономеры - полипептиды, которые могут быть ковалентно (то есть в помощью дисульфидных связей) или нековалентно связаны с димерные или мультимерные формы. Количество межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами молекул нативного Ес колеблется от 1 до 4 в зависимости от класса (например, 1д, С, 1дА, 1дЕ) или подкласса (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дА1, 1дА2).
Примером нативного Ес является содержащий дисульфидные связи димер, получающийся как результат обработки 1дС папаином (см. ЕШкоп е1 а1. (1982), ΝιιΟ Ас1б Век 10:4071-9). Термин «нативный Ес» используется здесь для мономерных, димерных и мультимерных форм.
В используемом здесь значении термин «Ес вариант» означает модифицированную форму последовательности нативного Ес при условии, что связывание с сохранившимся рецептором сохраняется, как описано, например, в АО 97/34631 и АО 96/32478, которые приведены здесь в качестве ссылок. Ес варианты могут создаваться, например, замещением или делецией остатков, инсерцией остатков или усечением частей, содержащихся в данном сайте. Введенные или замещенные остатки могут также замещаться аминокислотами, такими как пептидомиметики или Ό-аминокислоты. Ес варианты могут быть предпочтительны по целому ряду причин, некоторые из которых описываются ниже. Примерные Ес варианты включают молекулы и последовательности, в которых:
1. Сайты, участвующие в образовании дисульфидных связей, удаляют. Такого удаления можно избежать реакцией с другими цистеинсодержащими протеинами, присутствующими в клетке-хозяине, используемой для продуцирования заявляемых веществ. Для этой цели цистеинсодержащий сегмент на Ν-конце может быть отсечен или цистеиновые остатки могут быть делегированы или замещены другими аминокислотами (например, аланином или серином). Даже когда цистеиновые остатки удаляют, единственная цепочка Ес доменов еще может образовать димерный Ес домен, которые удерживаются вместе не за счет валентной связи.
2. Нативный Ес домен модифицируют, чтобы сделать его более совместимым с выбранной клеткой-хозяином. Например, можно удалить РА последовательность около Ν-конца типичного нативного Ес, который можно распознать с помощью переваривающего энзима в Е. сой, такого как пролиниминопептидаза. Можно добавить Ν-концевой остаток метионина, особенно, если молекула экспрессируется рекомбинантным способом в бактериальных клетках, например, Е. сой.
3. Часть Ν-конца нативного Ес удаляют, чтобы предотвратить гетерогенность при экспрессировании в выбранной клетке-хозяине. С этой целью можно произвести делецию любой из первых 20 аминокислотных остатков на Ν-конце, особенно тех, что находятся в положениях 1, 2, 3, 4 и 5.
- 8 009056
4. Удаляют один или несколько сайтов гликозилирования. Остатки, которые обычно являются гликозилируемыми (например, аспарагиновый), могут давать в ответ цитолитическую реакцию. Такие остатки можно делегировать или замещать негликозилируемыми остатками (например, аланиновыми).
5. Сайты, вовлеченные во взаимодействие с комплементом, такие как С1с| связывающий сайт, удаляют. Например, можно делегировать или замещать ЕКК последовательность человеческого 1дО1. Набор средств для комплемента может оказаться неблагоприятным для веществ данного изобретения и потому можно избежать этого с Ес вариантом.
6. Удаляют сайты, которые влияют на связывание с Ес рецепторами, отличными от выбранного рецептора. Нативный Ес может иметь сайты для взаимодействия с некоторыми белыми кровяными тельцами, которые не требуются для связывания молекул веществ настоящего изобретения и потому могут быть удалены.
7. АЭСС сайт удаляют. АЭСС сайты известны в данной области. См., например, Мо1ес 1ттипо1 29(5): 633-9 (1992) в части АЭСС в 1дО1. Эти сайты также не нужны для связывания веществ данного изобретения и потому могут быть удалены.
8. Если нативный Ес получают из антитела, происходящего не от человека, нативный Ес может быть гуманизирован. Как правило, чтобы гуманизировать нативный Ес, следует произвести замещение выбранных остатков в нативном Ес, происходящем не от человека, остатками, которые обычно присутствуют в Ес человека. Технология гуманизации антител хорошо известна в данной области.
Термин «Ес домен» включает молекулы димерной или мультимерной формы, независимо от того, отщеплены ли они от целого антитела или получены иными способами и средствами. В указанном здесь значении термин «мультимер», применяемый по отношению к Ес доменам или веществам, содержащим Ес домены, означает молекулы, содержащие две или более полипептидных цепочки, связанные ковалентным путем, нековалентным или и ковалентным, и нековалентным путем одновременно. 1дО молекулы обычно образуют диамеры, 1дМ - пентамеры, 1§ϋ - димеры, а 1дА - мономеры, димеры, тримеры или тетрамеры. Мультимеры можно получить, исходя из последовательности с активностью нативного 1дС источника Ес, или выделяя такой нативный Ес. Термин «димер» применительно к Ес доменам, относится к веществам, имеющим две полипептидные цепочки, связанные ковалентно или нековалентно.
Кроме этого, возможным носителем согласно данному изобретению является не -Ес доменный протеин, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела или небольшая молекула (например, пептидомиметик), способные связываться с выбранным рецептором. Например, в качестве носителя использовался полипептид, что описано в И8 патенте № 5739277, выданном Ргез1а е1 а1. 14 апреля 1998. Пептиды могут быть отобраны методом фагового дисплея для связывания с ЕсРп выбранным рецептором. Такие связывающиеся с выбранным рецептором соединения также включаются в понятие «носитель» и входят в объем данного изобретения. Такие носители могут выбираться по увеличенному времени полужизни (например, избегая последовательностей, на которые воздействуют протеазы) и по пониженной иммуногенности (например, предпочитая неиммуногенные последовательности, что обнаруживается при гуманизации антитела).
Помимо этого, для получения связывающих агентов настоящего изобретения могут использоваться полимерные носители. В настоящее время в качестве носителей доступны различные средства для присоединения остатков химических веществ (молекул), см. например опубликованную Международную заявку РСТ кО 96/11953 под названием «Ν-ТегтшаИу С11е1шса11у МобШеб Рго1еш Сотрозбюп апб Мебюбз». полностью упомянутую здесь как ссылка. В этой РСТ публикации описывается, помимо прочего, селективное присоединение водорастворимых полимеров к Ν-концу протеинов.
Предпочтительным полимерным носителем является полиэтиленгликоль (РЕО). РЕО группа может иметь любую подходящую молекулярную массу и может быть линейной или разветвленной. Средняя молекулярная масса РЕО должна предпочтительно варьировать от около 2 до около 100 кДа, более предпочтительно от около 5 до около 50 кДа, наиболее предпочтительно от около 5 до около 10 кДа. РЕО-группы должны вообще присоединяться к соединениям данного изобретения ацилированием или восстановительным алкилированием с помощью реакционноспособных групп РЕО-остатка (например, альдегидной, аминной или эфирной группы). Полезная стратегия пэгилирования синтетических пептидов заключается в комбинировании за счет создания в растворе конъюгатного соединения на основе пептида и РЕО-остатка, каждый из которых несет свою функциональность, что обуславливает их взаимодействие друг с другом. Пептиды могут быть легко получены известным в данной области методом твердофазного синтеза. Пептиды «преактивируют» с помощью соответствующей функциональной группы в специфическом сайте. Предшественники очищают и полностью определяют их свойства до взаимодействия с РЕО-остатком. Лигирование пептида с РЕО обычно осуществляют в водной фазе и легко контролируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Пэгилированные пептиды могут быть легко очищены с помощью препаративной ВЭЖХ, охарактеризованы с помощью аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и лазерной десорбционной масс-спектрометрии.
Другим типом водорастворимых полимеров, которые могут использоваться для модификации протеинов, являются полимеры полисахаридной природы. Декстраны и полисахаридные полимеры со
- 9 009056 стоят из субъединиц глюкозы, предварительно соединенных α-1-б-связями. Сам декстран пригоден при различных значениях молекулярной массы, удобно использовать декстран с молекулярной массой от около 1 до около 70 кДа. Декстран - подходящий водорастворимый полимер для использования в настоящем изобретении в качестве носителя как сам по себе, так и в сочетании с другими носителями (например, Ес). См., например, У0 96/11953 и У0 96/05309. Описано использование декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами, см., например, ЕР публикацию № 0315456, которая включена здесь как ссылка. При использовании декстрана как носителя согласно настоящему изобретению предпочтителен декстран с молекулярной массой от около 1 до около 20 кДа.
Линкеры
Связывающие агенты настоящего изобретения необязательно могут также содержать линкерную группу. Линкер в первую очередь служит спейсером между пептидом и носителем или между двумя пептидами связывающих средств настоящего изобретения. В одном варианте линкер состоит из аминокислот, соединенных пептидными связями, предпочтительно из 1-20 аминокислот, соединенных пептидными связями, причем аминокислоты выбраны из 20 природных аминокислот. Одна или несколько этих аминокислот могут быть гликозированы, как это известно специалистам. В одном варианте эти 120 аминокислот выбраны из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Предпочтительно линкер получен из ряда аминокислот, которые не создают стерических затруднений, например глицина и аланина. Таким образом, примерные линкеры - это полиглициновые (в частности (С1у)5, (С1у)8), поли(С1у-А1а) и полиаланиновые. В используемом здесь значении обозначение «д» относится к глицин-гомопептидным линкерам. Как показано в табл. II, «дп» означает 5 х д1и линкер на №конце, в то время как «дс» означает 5 х д1у линкер на С-конце. Комбинации С1у и А1а предпочтительны. Последовательность примерного линкера, используемого для получения связывающих агентов настоящего изобретения, следующая: д8д8айдд8д8йа88д8д8айд (8ЕС ГО N0: 305). Последовательность этого линкера обозначается «к» или 1к последовательность. Обозначение «кс», как указано в табл. II, относится к к линкеру на С-конце, в то время как обозначение «кп» относится к к линкеру на Ν-конце.
Линкеры настоящего изобретения могут быть также и непептидными. Например, могут использоваться алкильные линкеры, такие как -ЛН-(СН2)8-С(О)-, где 8=2-20. Эти алкильные линкеры могут также быть замещены любой стерически не затрудняющей группой, например, низший алкил (т.е. С1-С6)низшим ацилом, галогеном (т.е. С1, Вг), СК, ΝΗ2, фенилом и пр. Возможным непептидным линкером является РЕС линкер с молекулярной массой 100-5000 кДа, предпочтительно 100-500 кДа. Пептидные линкеры могут быть модифицированы для получения производных так же, как описано выше.
Примеры связывающих агентов
Связывающие агенты настоящего изобретения включают по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин. В одном варианте миостатинвязывающий пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую предпочтительно от около 5 до около 50 аминокислот, в другом - от около 10 до около 30 аминокислот и наконец - от около 10 до около 25 аминокислот. Один вариант миостатинсвязывающего пептида включает аминокислотную последовательность УМСРР (8ЕС ГО N0: 633). В другом варианте миостатинсвязывающий пептид включает аминокислотную последовательность
Сащ^аэ УМСРР (8Ер ГО N0: 352), где а1, а2 и а3 выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты.
В другом варианте миостатинсвязывающий пептид включает последовательность СЬ-ЬАУЬАУМСРР (8ЕУ) ГО N0: 353), где Ь1 выбрана как любая из аминокислот Т, I или В;
Ь2 выбрана из В, 8, О;
Ь3 выбрана из Р, В, О.
причем последовательность пептида включает от 10 до 50 аминокислот, и ее физиологически приемлемые соли.
В другом варианте миостатинсвязывающий пептид соответствует соединению формулы с1 с2 с3 с4 с5 с6 Сс7 с8 Ус9 УМСРР с10 с11 с12 с13 (8еС ГО N0: 354), где с1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,
- 10 009056 с7 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с8 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с9 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, а с10-с13 представляют собой любые аминокислоты, причем протяженность пептида составляет от 20 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемым солям.
Похожий вариант миостатинсвязывающего пептида соответствует соединению формулы άι й2 йз йд Й5 Йе С Й7 й8 А Й9 АМСРР йю йц Й12 Й13 (81 А) ГО N0: 355), где й1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, й2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, й3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, й4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, й5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, й6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту, й7 выбран из аминокислот Т, I или К, й8 выбран из К, 8, О.
й9 выбран из Р, К и О, а й10-й13 представляют собой любые аминокислоты, причем протяженность пептида составляет от 20 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемым солям.
Дополнительные варианты связывающих агентов включают по крайней мере один из следующих пептидов:
(1) пептид, способный связывать миостатин. причем данный пептид соответствует последовательности
АУе^ Уез С, (81 А) ГО N0: 356), где е1 представляет собой Р, 8 или Υ, е2 представляет собой С или О, а е3 представляет собой С или Н, протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;
(2) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательности
Г1 ЕМЬ Г2 8Ь Г3 Г4 ЬЬ (8ЕС) ГО N0: 455), где Г представляет собой М или I,
Г2 - любая аминокислота,
Г3 представляет собой Ь или Е,
Г4 представляет собой Е, О или Ό, протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот. и его физиологически приемлемые соли;
(3) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательности
Ьё1 ё2 ЕЪ ёэ ёд Ь, (8Е6) ГО N0: 456), где д1 представляет собой О, Ό или Е, д2 представляет собой 8, О, Ό или Е, д3 - любая аминокислота, д4 представляет собой Ь, А, Е или Υ, протяженность пептида составляет от 8 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;
(4) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательности
Ь1 И2 Ь3 Ид Ь5 Ь6 И И8 И9 (81 А) ГО N0: 457), где И1 представляет собой К или Ό,
И2 - любая аминокислота,
113 представляет собой А, Т, 8 или О,
И4 представляет собой Ь или М,
И представляет собой Ь или 8,
И6 - любая аминокислота,
11- представляет собой Е или Е,
118 представляет собой А, Е или С,
И9 представляет собой Ь, Е, М или К, протяженность пептида составляет от 9 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли.
- 11 009056
Как вариант изобретения, связывающие агенты данного изобретения включают также по меньшей мере один носитель, такой как полимер или Рс домен, и могут, кроме этого, включать по меньшей мере одну линкерную последовательность. Согласно этому варианту связывающие агенты настоящего изобретения конструируют так, чтобы по меньшей мере один миостатинсвязывающий пептид был присоединен по меньшей мере к одному носителю. Пептид или пептиды присоединяют непосредственно или через линкерную последовательность к носителю за счет Ν-концевой, С-концевой аминокислоты или состоящей из аминокислот боковой цепи пептида. В этом варианте связывающие агенты настоящего изобретения имеют следующую обобщенную структуру:
(Х1),, - Р1 - (Х2)Ь или их мультимеры, т-1 где Р является носителем, а
X1 и X2, каждый независимо, выбран из (Е)с-Р1, (Ь1)с-Р1-(Ь2)а-Р2, (Ь1)с-Р1-(Ь2)а-Р2-(Ь3)е-Р3 и (Ь1)с-Р1-(Ь2)<3-Р2-(Ь3)е-Р3-(Ь4)£-Р4, где Р1, Р2, Р3 и Р4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, а Ь1, Ь2, Ь3 и Ь4 каждый являются линкерами, а, Ь, с, б, е и £, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или Ь является 1.
В одном варианте связывающих агентов, соответствующих этой обобщенной структуре, пептиды Р1, Р2, Р3 и Р4 могут быть независимо выбраны из одного или нескольких любых пептидов вышеприведенных последовательностей. Р1, Р2, Р3 и Р4 независимо выбраны из одного или нескольких пептидов, отвечающих любой из следующих последовательностей: 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 633, 8ЕЦ ГО Ν0: 352, 8ЕЦ ГО Ν0: 353, 8ЕЦ ГО Ν0: 354, 8ЕЦ ГО Ν0: 355, 8ЕЦ ГО Ν0: 356, 8ЕЦ ГО Ν0: 455, 8ЕЦ ГО Ν0: 456, 8ЕЦ ГО Ν0: 457.
В другом варианте носители связывающих агентов, соответствующие вышеприведенной общей формуле, являются Рс доменами. Таким образом пептиды сливают с Рс доменом, косвенным путем или непосредственно, получая в результате пептидные антитела. Пептидные антитела настоящего изобретения обладают высокой аффинностью связывания с миостатином и могут ингибировать активность миостатина, как показано с помощью ίπ νίίτο исследований и ш νίνο испытаний на животных.
Настоящее изобретение предусматривает также молекулы нуклеиновых кислот, включающие полинуклеотиды, кодирующие пептиды, пептидные антитела и варианты пептидов и пептидных антител, а также их производные. Примерные нуклеотидные последовательности даны ниже.
Варианты и производные пептидов и пептидных антител
Связывающие агенты настоящего изобретения включают также варианты и производные пептидов и пептидных антител, описываемых здесь. Так как и пептиды, и пептидные антитела настоящего изобретения могут быть охарактеризованы соответствующей аминокислотной последовательностью, можно сказать, что термины «варианты» и «производные» применяют к самому пептиду как таковому и к пептиду как компоненту пептидного антитела. В используемом здесь смысле термин «пептидные варианты» относят к пептидам или пептидным антителам с одной или несколькими аминокислотными инсерциями, делениями или замещениями в первоначальной аминокислотной последовательности, и которые сохраняют способность связывать миостатин и изменять его активность. В данном здесь значении фрагменты пептидов или пептидных антител включаются в понятие «варианты».
Понятно, что любой данный пептид или пептидное антитело может содержать один, два или все три типа вариантов. Варианты с инсерциями или с замещениями могут содержать природные аминокислоты, также как и неприродные аминокислоты или и те, и другие.
Варианты пептидов и пептидных антител также могут включать зрелые пептиды и пептидные антитела, в которых удалены лидерные или сигнальные последовательности, и получившиеся в результате протеины с дополнительными аминоконцевыми остатками, аминокислоты которых могут быть как природного, так и неприродного происхождения. Пептидные антитела с дополнительным метионильным остатком в аминокислотном положении - 1 (МеГ1 - пептидное антитело) тщательно рассматривают, т.к. есть пептидные антитела с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и -1 (МеГ2 - Ьу§-1 -). Варианты с дополнительными остатками Мек Ме! - Ьу§, Ьу§ (или с одним или более основными остатками, в общем) являются особенно полезными для повышенного продуцирования рекомбинантного белка в бактериальных хозяйских клетках.
Варианты пептидов или пептидных антител настоящего изобретения включают также пептиды, имеющие дополнительные аминокислотные остатки, которые являются результатом использования специальных экспрессионных систем. Например, использование коммерчески доступных векторов, которые экспрессируют желаемый полипептид как часть продукта слияния с помощью глутатион-8трансферазы (Ο5Τ), обеспечивает желаемый полипептид, имеющий дополнительный глициновый остаток в аминокислотном положении -1 после отщепления СЕН компонента от желаемого полипептида. Варианты, которые получаются как результат экспрессии в других векторных системах, также тща
- 12 009056 тельно изучаются, включая те, где гистидиновые метки включены в аминокислотную последовательность, обычно в карбокси- и/или аминосодержащий конец последовательности.
В примере инсерционные варианты получаются, когда один или несколько аминокислотных остатков встречающихся или не встречающихся в природе аминокислот добавляются к аминокислотной последовательности пептида. Инсерции могут быть либо на каком-нибудь конце протеина, либо на обоих концах или могут быть внутри аминокислотной последовательности пептидного антитела. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на одном или обоих концах могут включать, например, слитые протеины и протеины с аминокислотными метками и ярлычками. Инсерционные варианты включают пептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавляют в аминокислотную последовательность пептида или его фрагмента.
Инсерционные варианты могут также включать слитые белки, в которых амино- и/или карбоксисодержащие концы пептида или пептидного антитела слит (слиты) с другим полипептидом, его фрагментом или аминокислотами, в отношении которых вообще неизвестно, являются ли они частью какойлибо определенной последовательности протеина. Примерами таких слитых белков являются иммуногенные полипептиды, протеины с продолжительным временем полужизни, такие как константные области иммуноглобулинов, маркерные белки, протеины или полипептиды, которые облегчают выделение целевого пептида или пептидного антитела, и последовательности полипептидов, которые являются промоторами образования мультимерных протеинов (таких как лейцин-зипперные мотивные последовательности, которые используют при создании и стабилизации димеров).
Такой тип инсерционного варианта вообще представляет собой всю или существенную часть нативной молекулы, связанную по Ν- или С-концу со вторыми полипептидом (целиком или с его частью). Например, в слитых белках обычно используются лидерные последовательности от других видов, допускающих рекомбинантную экспрессию белка в гетерологичном хозяине. Другие полезные слитые белки включают добавленный иммунологически активный домен, например эпитоп антитела, для облегчения выделения слитого белка. Включение сайта расщепления в точку слияния или вблизи нее облегчит удаление ненужного, чужеродного полипептида после выделения. Другие полезные сливания включают связывания функциональных доменов, например, активных центров ферментов, доменов гликозилирования, специально намеченных клеточных сигналов или трансмембранных областей.
Существуют различные коммерчески доступные системы экспрессии слитых белков, которые могут использоваться в настоящем изобретении. Особенно полезные системы включают, например, глутатион-8-трансферазную (О8Т) систему (Рйагтас1а), мальтозную систему связывания белков (ΝΕΒ, Веуег1еу, МА), ЕЬАО систему (ΙΒΙ, Не\у Науеп, СТ) и 6 х Н18 систему (О|;щсп. Οι;·ι15\\όγ11ι. СА). Эти системы способны продуцировать рекомбинантные пептиды и/или пептидные антитела, несущие только небольшое количество дополнительных аминокислот, которые, похоже, не оказывают заметного влияния на активность пептида или пептидного антитела. Например, и РЬАО система, и 6 х Нщ система добавляют только короткие последовательности, о которых известно, что они являются слабоантигенными и не могут быть помехой для «складывания» полипептида, обеспечивающего нативную конформацию. Другим типом Ν-концевого слияния, которое анализируется, насколько оно полезно, является слияние Ме1-Ьу5 дипептида в Ν-концевой области протеина или пептидов. Такое слияние может вызывать благоприятное повышение экспрессии белка или его активности.
Другие системы слияния продуцируют гибридные полипептиды, причем желательно отсечь слитый компонент от целевого пептида или пептидного антитела. В одном варианте слитый компонент связан с рекомбинантным пептидным антителом пептидной последовательностью, содержащей специфическую узнаваемую протеазой последовательность. Примерами таких пригодных последовательностей являются распознаваемые с помощью протеазы вируса гравировки табака (ЬгТе Тесйпо1од1е8, ОаИйегаЬшд, МИ) или Ха Еас1ог (Ес\у ЕпДапй Вю1аЬ§, Веуег1еу, МА).
Изобретение также предусматривает слитые белки, которые представляют собой пептид или пептидное антитело настоящего изобретения в комбинации с усеченным тканевым фактором ((ТЕ). (ТЕ представляет собой васкулярный нацеливающий агент, состоящий из усеченной формы вызывающего коагуляцию белка человека, который действует как коагулянт в кровеносных сосудах опухолей, что описано в И8 патентах 5877289, 6004556, 6132729, 6132730, 6156321 и Европейском патенте ЕР 0988056. Слияние (ТЕ с антимиостатиновым пептидным антителом, или белком, или их фрагментами облегчает доставку антимиостатиновых антагонистов к клеткам-мишеням, например клеткам скелетных мышц, клеткам мышечной ткани сердца, фибробластам, преадипоцитам и, возможно, андроцитам.
В другом аспекте изобретения предлагаются делеционные варианты, которые характеризуются тем, что в пептиде или пептидном антителе удалено один или несколько аминокислотных остатков. Делеции могут осуществляться на одном или на обоих концах антитела или за счет удаления одного или более остатков внутри аминокислотной последовательности пептидного антитела. Делеционные варианты обязательно включают все фрагменты пептида или пептидного антитела.
Еще в одном варианте изобретения предлагаются варианты пептидов или пептидных антител, характеризующиеся заменами. Такие варианты с заменами включают такие пептиды и пептидные антитела, в которых один или несколько аминокислотных остатков удаляют и заменяют одним или несколь
- 13 009056 кими другими аминокислотами, причем эти аминокислоты могут быть как природного, так и неприродного происхождения. Варианты с заменами порождают пептиды или пептидные антитела, которые «подобны» первоначальным пептидам или пептидным антителам, при том, что две молекулы имеют определенную долю аминокислот, которые идентичны. Варианты с заменами включают замещения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 и 20 аминокислот в пептиде или пептидном антителе, причем число замен может достигать 10% аминокислот пептида или пептидного антитела. В одном варианте эти замены являются по природе своей консервативными, изобретение также включает замены, которые являются неконсервативными, и также включает и замены нетрадиционного характера.
Идентичность и подобие рассматриваемых пептидов и пептидных антител может быть легко рассчитана известными способами. Такие методы включают (но не ограничиваются ими) те, что описаны в Сотри1а1юиа1 Мо1еси1аг Βίοίοβν. Ье8к, А.М., еб., ОхГогб ишусгЩу Рге88, №\ν Уогк (1988); Вюсотри!1пд; 1пГогта!к8 апб Сепоте РгоЦсК Бтйй, Ό.ν., еб., Асабетк Рге88, Иете Уогк (1993); Сотри1ег Апа1у818 оГ Бециепсе Иа1а, Раг! 1, СггГйт, А.М., апб СпГГш, Н.С., еб8., Нитапа Рге88, Иете 1ег8еу (1994); Бесщенсе Апа1у818 ш Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Нещ)е, С., Асабетк Рге88 (1987); Бециепсе Апа1у818 Рптег Сг1Ь8коу, М. апб Пеуегеих., к, еб8., М. 81оск1оп Рге88, Иете Уогк (1991); и СагШо е! а1., Б1АМ 1. АррНеб МаШ., 48:1073(1988).
Предпочтительные способы для определения гомологичности или процентной идентичности двух пептидов или полипептидов, или полипептида и пептида предназначены для того, чтобы показать наибольшее соответствие между исследуемыми последовательностями. Методы для определения идентичности описаны в коммерчески доступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные методы для установления идентичности между двумя последовательностями включают (но не ограничиваются) пакет программ ССР, в том числе САР (Эеуегеих е! а1., Иис1. Ас1б. К.е8., 12:387 (1984); Сеие1к8 Сотрикг Сгоир, Ишуегайу оГ ^18сои81и, Маб18оп, VI, ВЬАБТК, ВГАБТГЫ, апб ГАБТА (А1!8ски1 е! а1., I. Мо1. Вю1., 215:403-410 (1990). ТНе ВЬАБТХ ргодгат 18 риЬ1к1у ауабаЫе Ггот !11е №Шопа1 Сеп1ег Гог ЭюЮсйпокду 1пГогта!юп (ИСВ1) апб о1кег 8оигсе8 (ВЬАБТ Мапиа1, Л1!8с1и.11 е! а1. ИСВ/ИТМ/МН Ве1йе8ба, МИ 20894; Л1!8с1и.11 е! а1., 8ирга (1990)). Известная программа Бтйй \Уа1егтап также может использоваться для определения идентичности.
Некоторые схемы подгонки для выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут приводить к сопоставлению только короткого участка двух последовательностей, и этот небольшой выравненный участок может обладать очень высокой (долей) идентичности последовательностей, даже несмотря на то, что отсутствует сколько-нибудь существенная связь между полноразмерными последовательностями. Соответственно в некоторых вариантах выбранный метод подгонки будет приводить к выравниванию, которое при совмещении будет занимать промежуток, соответствующий по меньшей мере 10% полной длины целевого полипептида, например по меньшей мере 40 смежных аминокислот при сравнении последовательностей длиной по меньшей мере 400 аминокислот, 30 смежных аминокислот при сравнении последовательностей по меньшей мере от 300 до 400 аминокислот, по меньшей мере 20 смежных аминокислот при сравнении последовательностей от 200 до около 300 аминокислот и по меньшей мере 10 смежных аминокислот при сравнении последовательностей от около 100 до 200 аминокислот. Например, с помощью компьютерной программы САР (Сепе!к8 Сошри1ег Сгоир, ишуег811у оГ \V^8Соп8^п. Маб18оп, XVI) два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательностей, выравнивают для оптимального сопоставления их соответственных аминокислот («сопоставлений «шакйеб 8рап», по определению программы). В некоторых вариантах брешь, открывающая пенальти (которая обычно вычисляется как 3Х средняя диагональ; «средняя диагональ» представляет собой среднее диагонали используемой матрицы сравнения; «диагональ» - это множество или число, приписываемое каждому произведенному аминокислотному сопоставлению конкретной матрицей сравнения), и брешь расширения пенальти (которое обычно 1/10 бреши, открывающей пенальти), также как и матрицу сравнения, например, РАМ 250 или ВЬОБИМ 62 используют вместе с программой. В некоторых вариантах стандартную матрицу сравнения (см. ИауйоГГ е! а1., А!1а8 оГ Ргокш Бесщенсе апб 81гис1иге, 5(3) (1978) для РАМ 250 матрицы сравнения; НешкоГГ е! а1. Ргос. №1!1. Асаб. 8ск И8А, 89:10915-10919 (1992) для ВЬОБИМ 62 матрицы сравнения) также используют в программе.
В некоторых вариантах, например, условия сравнения полипептидных последовательностей могут быть реализованы с помощью следующего: Алгоритм: Nееб1етаи е! а1., 1. Мо1. Вю1., 48:443-453 (1970); матрица сравнения: ВЬОБИМ 62 от НешкоГГ е! а1., см. выше (1992); ГЭП - пенальти: 12; Сар Ьепд!11 Репа1!у: 4; Порог гомологии : 0; далее без какого-либо пенальти за концевые ГЭПЫ.
В некоторых вариантах условия сопоставления последовательностей молекул полинуклеотидов (в противоположность аминокислотной последовательности) реализуют следующим образом: Алгоритм Nееб1етаи е! а1., см. выше (1970); матрица сравнения: матчей = +10, мис-матчей = 0; Сар Репа1!у: 50; Сар Ьепд!11 Репа1!у: 3.
Другие возможные программы (алгоритмы), ГЭП, открывающие пенальти, матрицы сравнения, порог гомологии и т.д., могут быть использованы и те, которые изложены в Руководстве и Программе, V^8сои8^и Раскаде, Уегаюп 9, БеркшЬег, 1997.
- 14 009056
Конкретный выбор, который нужно сделать, будет оговорен для специалиста в данной области и будет зависеть от того, какое конкретное сравнение нужно выполнить, например, ДНК-ДГК, протеинпротеин, протеин-ДНК, и, кроме того, оттого, сравниваются ли определенные части последовательностей (в этом случае САР или Век+й в целом предпочтительны) или некая последовательность и обширная база данных последовательностей (в этом случае РА8ТА или ВЬА8ТА предпочтительны).
Стереоизомеры (например, Ό-аминокислот) двадцати традиционных (встречающихся в природе) аминокислот, не встречающихся в природе аминокислот, например α,α-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочной кислоты и других нетрадиционных аминокислот также могут быть пригодными исходными компонентами для пептидов настоящего изобретения. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают, например, аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бетааминопропионовую аминокислоту, аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокапроновую кислоту, аминогептановую кислоту, аминоизомасляную кислоту, аминопимелиновую кислоту, диаминомасляную кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, диаминопропионовую кислоту, Ν-этилглицин, Ν-этиласпарагин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, Ν-метилглицин, саркозин, Ν-метилизолейцин, Ν-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин, 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, Офосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Νметиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и аминокислоты (например, 4-гидроксипролин).
Остатки природных (незаменимых) аминокислот могут быть распределены на (перекрывающиеся) классы в зависимости от свойств, обусловленных боковыми цепями:
1) нейтральные гидрофобные: Мек А1а, Уа1, Ьеи, 11е, Рго, Тгр, Мс1. РНе:
2) нейтральные полярные: Сук, 8ег, ТНг, Аки, С1п, Туг, С1у:
3) кислые: Акр, С1и:
4) основные: Ηίκ, Ьук, Агд;
5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: С1у, Рго:
6) ароматические Тгр, Туг, РНе.
Замены аминокислот могут быть консервативными, в результате которых получаются пептиды, имеющие функциональные и химические характеристики, подобные характеристикам исходного пептида. Консервативные аминокислотные замены включают замену представителя одного из вышеперечисленных классов другим представителем того же класса. Консервативные изменения охватывают остатки нетрадиционных аминокислот, которые обычно соединяют химическим способом пептидного синтеза, а не синтезом в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие измененные и инвертированные формы аминокислотных остатков.
Неконсервативные замены могут включать обмен представителя одного из этих классов на представителя другого класса. Эти замены могут приводить к существенному изменению функциональных и/или химических характеристик пептидов. Осуществляя такого рода изменения, согласно некоторым вариантам изобретения, можно рассчитать гидропатический индекс аминокислот. Каждой аминокислоте приписан свой гидропатический индекс, исходя из ее гидрофобных и электростатических характеристик. Они таковы: изолейцин (+4,5): валин (+4,2): лейцин (+3,8): фенилаланин (+2,8): цистеин/цистин (+2,5): метионин (+1,9): аланин (+1,8): глицин (-0,4): треонин (-0,7): серин (-0,8): триптофан (-0,9): тирозин (-1,3): пролин (-1,6): гистидин (-3,2): глутамат (-3,5): глутамин (-3,5): аспартат (-3,5): аспарагин (-3,5): лизин (-3,9): аргинин (-4,5).
Значение гидропатического аминокислотного индекса, придающего белку согласованность его биологических функций, общепризнана специалистами. Ку1е е1 а1., I. Мо1. Вю1., 157:105-131 (1982). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами с аналогичным или близким по значению гидропатическим индексом и все же сохраняющими аналогичную биологическую активность. При осуществлении изменений, основанных на гидропатическом индексе, в некоторых вариантах возможна замена аминокислот, у которых гидропатические индексы в пределах ±2. В некоторых вариантах включают аминокислоты с индексами ±1, а в других ±0,5.
Специалистам в данной области понятно также, что замена таких аминокислот может быть эффективно осуществлена на основе гидрофильности, особенно, когда есть намерение использовать созданное биологически функциональное пептидное антитело или пептид в иммунологической практике, как в данном случае. В определенных вариантах самая большая непосредственная средняя гидрофильность протеина, установленная по гидрофильности его смежных аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, то есть с биологическим свойством протеина.
Нижеследующие значения гидрофильности были установлены для следующих аминокислотных остатков: аргинин (+3,0), лизин (+3,0), аспарат (+3,0±1), глутамат (+3,0±1), серин (+0,3), аспарагин (+0,2), глутамин (+0,2), глицин (0), треонин (-0,4), пролин (-0,5±1), аланин (-0,5), гистидин (-0,5), цистеин (-1,0), метионин (-1,3), валин (-1,5), лейцин (-1,8), изолейцин (-1,8), тирозин (-2,3), фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При осуществлении изменений, основанных на близких к этим значениям гидрофильности, в некоторых вариантах возможны замены аминокислот, значения гидрофильности кото
- 15 009056 рых находятся в диапазоне ± 2, в некоторых вариантах - те, которые находятся в диапазоне ± 1, а в других вариантах - в диапазоне ± 0,5. Можно также идентифицировать эпитопы по первичным аминокислотным последовательностям на основе гидрофильности. Такие участки называют также «эпитопные коровые области».
Примерные замены аминокислот приведены в табл. 1 ниже.
Таблица 1
Аминокислотные замены
Исходные остатки Примерные замены Предпочтительные замены
А1а Уа1, Ьеи, Не Уа1
Аг§ Ьуз, Ст, Азп Ьуз
Азп С1п, О1и, Азр С1п
Азр О1и, О1п, Азр С1и
Суз 8ег, А1а Зег
С1п Азп, С1и, Азр Азп
С1и Азр, О1п, Азп Азр
С1у Рго, А1а А1а
Н18 Азп, С1п, Ьуз, Аг§ Аг§
Т1~ Т ЛЛХ+ А1о ΌΙλω Т
ЛХС' кьи, ν αι, рулсч, /τια, х υν, норлейцин
Ьеи норлейцин, Не, Уа1, Ме!, А1а, РЬе Не
Ьуз Аг§, 1,4 -диаминомасляная кислота, С1п, Азп Аг§
Ме! Ьеи, РЬе, Не Ьеи
РЬе Ьеи, Уа1, Не, А1а, Туг Ьеи
Рго А1а С1у
Зег ТЬг, А1а, Суз ТЬг
ТЬг Зег Зег
Τιρ Тут, РЬе Туг
Туг Тгр, РЬе, ТЬг, Зег РЬе
Уа1 Не, Ме!, Ьеи, РЬе, А1а, норлейцин Ьеи
Специалист в данной области сумеет получить варианты пептидов и пептидных антител настоящего изобретения, например, путем произвольных замен и проверки получившихся пептидов и пептидных антител на связывающую активность, используя описанный здесь метод анализа.
Кроме того, специалист сможет проанализировать исследования структуры и функции или исследование трехмерной структуры для того, чтобы идентифицировать остатки в схожих полипептидах, значимые для активности или структуры. Ввиду такого сопоставления можно предугадать важную роль аминокислотных остатков в протеине, которые соответствуют аминокислотным остаткам, которые важны для активности или структуры подобных белков. Специалист может сделать выбор химически схожих аминокислотных замен для таких заранее определенных важных аминокислотных остатков. Эти варианты могут быть проверены скринированием по данным анализа активности, как описано здесь.
Ряд научных публикаций посвящено прогнозированию вторичной структуры. См. Мои1!. 1., Сигг. Ор. т Вю!есБ, 7(4): 422-427 (1996), СБои е! а1., ВюсБет181гу, 13(2):222-245 (1974); СБои е! а1., ВюсБет1з!гу, 113(2):211-222 (1974); СБои е! а1., Абу. Епгуто1. Ке1а!. Агеаз Мо1. Вю1., 47:45-148 (1978); СБои е! а1., Апп. Кеу. ВюсБет, 47:251-276 апб СБои е! а1., ВюрБуз. I., 26:367-384 (1979). Кроме того, в настоящее время компьютерные программы могут помочь в предсказании вторичной структуры. Один метод
- 16 009056 прогнозирования вторичной структуры основан на моделировании гомологов. Например, два полипептида или белка, которые имеют последовательности, идентичные более чем на 30%, или подобие более 40% часто имеют аналогичную структурную топологию. Наблюдаемое в последние годы увеличивающееся количество информационных баз данных по структуре белков (РОВ) обеспечило повышенную возможность предсказания вторичной структуры, включая и возможное число изгибов в структуре белка. См. Но1т еί а1., N^1. Лс16. Кез, 27(1):244-247 (1999). Было высказано предположение о том, что конкретный протеин имеет ограниченное количество изгибов цепи и что определенное число структур является урегулированным, поэтому прогнозирование структуры должно стать гораздо более точным.
Другие способы прогнозирования вторичной структуры включают метод «протягивания нити» (1опез, Ό., Сигг. 0ρίη. 81гис1. Βίο1., 7(3):377-87(1997); 8ίρρ1. еί а1., 8йисШге, 4(1):15-19 (1996)), «анализ профиля» (Βο\\Ή еί а1., 8^1^, 253:164-170 (1991), Οποίον еί а1., Ме111. Еηζут. 183:146-159 (1990); Οποίον еί а1., Ргос. №11 Лсаб. 8ск, 84(13):4355-4358 (1987)) и метод «эволюционной связи» (См. Ηο^, см. выше (1999) и ΒΓοηηοΓ, см. выше (1997)).
В некоторых вариантах изобретения варианты пептидов или пептидных антител включают их разновидности, полученные гликозилированием, когда один или несколько сайтов гликозилирования, например сайт ^связанного гликозилирования, вносят в пептидное антитело. Сайт гликозилирования по №связи характеризуется последовательностью Аз1'1-Х-8ег или Азп-Х-ТЬг, где аминокислотный остаток, обозначенный X, может быть остатком любой аминокислоты, кроме пролина. Замена или добавление аминокислотных остатков для создания этой последовательности обеспечивает эффективный новый сайт для присоединения ^связанной углеводной цепочки. Или же замены, которые устраняют эту последовательность, будут обеспечивать удаление существующего ^связанной углеводной цепи. Также предусматривается перестановка ^связанных углеводных цепей, при которой один или несколько ^связанных сайтов гликозилирования (обычно тех, что являются природными) удаляются, а один или несколько новых ^связанных сайтов создаются.
Изобретением также предусматриваются «производные» пептидов или пептидных антител настоящего изобретения. В данном здесь значении термин «производное» относится к модификациям, отличным или дополняющим инсерции, делеции или замены аминокислотных остатков, которые сохраняют способность связывать миостатин.
Предпочтительно модификации, которым подвергаются пептиды настоящего изобретения для получения производных, являются ковалентными по своей природе и включают, например, химическое связывание с полимерами, липидами, другими остатками органической и неорганической природы. Производные данного изобретения могут быть получены для повышения «времени полужизни» циркулирования пептидного антитела или могут предназначаться для улучшения нацеливания пептидного антитела на выбранные клетки, ткани или органы.
Изобретение также касается и производных связывающих агентов, ковалентно модифицированных для включения одного или нескольких присоединяемых водорастворимых полимеров, например, полиэтиленгликоля, полиоксиэтиленгликоля или полипропиленгликоля, как описано в И8 патентах 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. Помимо этого специалистам известны и другие пригодные полимеры, которые включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов, гомополимеры поли(№винилпирролидон)полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, полипропиленоксид/этилен оксидный сополимер, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси этих полимеров. Особенно предпочтительными являются пептидные антитела, ковалентно модифицированные полиэтиленгликолевыми (РЕО) субъединицами. Водорастворимые полимеры могут быть присоединены в определенных положениях, например, по аминоконцам пептидных антител, или произвольно присоединены к одной или нескольким боковым цепям полипептида. Использование РЕО для улучшения терапевтической способности связывающих агентов, например, пептидных антител и гуманизированных антител, описано в И8 патенте 6133426, выданном ΟοηζηΕδ е1. а1., 17 октября 2000 г.
Изобретение также включает процесс получения пептидных производных (их дериватизацию) и/или части носителя миостатинсвязывающих агентов. Такие производные могут улучшать растворимость, поглощение, биологическое «время полужизни» и т.п. для данных соединений. Эти остатки могут устранять или ослаблять любой нежелательный побочный эффект соединений. Возможно, приемлемые производные включают соединения, в которых:
1. Производное или какая-то его часть является циклической структурой. Например, пептидная часть может быть модифицирована, чтобы содержать два или более Суз остатков (например, в линкере), которую можно сделать циклической путем образования дисульфидных связей.
2. Производное является поперечно-сшитым или его делают способным к поперечному сшиванию молекул. Например, пептидная часть может быть модифицирована таким образом, чтобы в ней содержался один Суз остаток и вследствие этого она была бы способна образовать межмолекулярную дисульфидную связь с подобной молекулой. Это производное может быть также поперечно-сшитым через его С-концы.
- 17 009056
3. Одна или несколько пептидных |-С.'(0)ЛВ-| связей заменяется непептидной связью. Возможными пептидными связями являются -СН2-карбамат [-СН2-0С(0)ПВ-], фосфонатная, -СН2- сульфонамид [-СН2-8(0)2ЛВ-], мочевино[-ЛНС(0)ХН-], -СН2- втор-аминная и алкилпептидная [-С(0)ПВ6-, где В6 низший алкил].
4. Л-конец дериватизируют. Как правило, Л-конец может быть ацилирован или модифицирован до замещенного амина. Примерные N-концевые группы включают А ВЦ (отличные от -ЛН2), -NВС(0)В1, -ЛВС(0)0В1, -N^8(0)^, -ЛНС(0)ЛНВ1, сукцинимидную или бензилоксикарбонил (ΟΒΖ -ИН-), где В и Вь каждый независимо, представляет собой водород или низший алкил и где фенильное кольцо может быть замещено 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из С1-С4алкила, С1-С4-алкокси, хлора и брома.
5. Свободный С-конец дериватизируют. Обычно С-конец этерифицируют или амидируют. Например, можно использовать известные и описанные методы, чтобы присоединить (ЛН-СН2-СН2-ЛН2)2 к соединениям данного изобретения по С-концу. Аналогично можно использовать уже описанные методы, чтобы присоединить -ЛН2 (или «кэппинг» с -МН2-группой) к соединениям данного изобретения к их С-концу. Подходящими С-концевыми деривативными группами являются, например, -С(0)В2, где В2 - низший алкокси или -N^^/1, где В3 и В4 являются независимо водородом или С1-С8-алкилом (предпочтительно С1-С4-алкил).
6. Дисульфидная связь заменяется другой, предпочтительно более стабильным поперечносшивающим остатком (например, алкиленовым). См. например, ВйаШадаг с1 а1., 1. Ме6. Сйсш. 39:38149 (1996), А1Ьей е1 а1., Т1иг1ееп111 Ат Рер 8утр, 357-9 (1993).
7. Один или несколько конкретных аминокислотных остатков модифицируют. Известны различные дериватизирующие агенты, специфически взаимодействующие с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками, как описывается ниже.
Остатки лизина и остатки, содержащие на своем конце аминогруппу, могут прореагировать с ангидридами янтарной или другой карбоновой кислоты, которые меняют заряд остатков лизина на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-аминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как пиколин-имидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфокислота, 0-метилизомочевину и глиоксилат в реакции, катализируемой трансаминазой.
Аргинильные остатки могут быть модифицированы реакцией с одним или несколькими обычно применяемыми в комбинации агентами, включающими фенилглиоксаль, 2-3-бутандион, 1,2циклогександион и нингидрин. Для дериватизации остатков аргинина требуется, чтобы ее проводили в щелочных условиях из-за высокого рКа функциональной гуанидиновой группы. Более того, эти реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина.
Специфическая модификация остатков тирозина хорошо изучена, причем особый интерес вызывает введение спектральных меток в остатки тирозина реакцией с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. Главным образом N-ацетилимидазол и тетранитрометан используют для получения 0-ацетилпроизводных тирозина и 3-нитропроизводных соответственно.
Карбоксильные группы боковых цепей (аспартил или глутамил) могут быть селективно модифицированы реакцией с карбодиимидами (В'-N=С=N-В'), например, 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4этил)карбодиимидом или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимидом. Кроме этого, остатки аспартата и глутамата могут быть переведены в остатки аспарагина и глутамина путем взаимодействия с ионами аммония.
Остатки глутамина и аспарагина могут быть деамидированы в соответствующие остатки глутамата и аспартата. Или же эти остатки могут быть деамидированы в мягких кислых условиях. Любая форма этих остатков подпадает под объем данного изобретения.
Остатки цистеина могут быть заменены аминокислотными или другими остатками либо для исключения дисульфидного связывания, либо, наоборот, чтобы стабилизировать поперечное сшивание. См., например, Вйа1падаг е1 а1. (выше).
Дериватизация бифункциональными агентами применяется для поперечного пришивания пептидов или их функциональных производных к матрице водонерастворимого носителя (подложки) или другим макромолекулярным носителям. Обычно используемыми поперечно-сшивающими реагентами являются, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидные эфиры, например, эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, позволяют получать активируемые светом производные, которые способны образовать поперечные сшивки на свету. Альтернативно реакционноспособные водонерастворимые матрицы, такие как активированные цианобромидом углеводы, и реакционноспособные субстраты, описанные в И8 патентах 3969287, 3691016, 4195128, 4247642, 4229537 и 4330440, используются для иммобилизации протеинов.
- 18 009056
Углеводные (олигосахаридные) группы обычно можно присоединить к сайтам, известным как сайты гликозилирования в протеинах. Обычно О-связанные олигосахариды присоединяют к остаткам серина (8ег) или треонина (ТЬг), несмотря на то, что Ν-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина (Аки), если они являются частью последовательности Акп-Х-8ег/ТЬг, где Х может быть любой аминокислотой кроме пролина. Х является предпочтительно одной из 19 незаменимых аминокислот кроме пролина. Структуры Ν-связанных и О-связанных олигосахаридов и сахаридные остатки в каждом типе различаются. Общим сахаридом для обоих типов является Νацетилнейраминовая кислота (называемая сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком и Ν-связанных и О-связанных олигосахаридов и вследствие своего отрицательного заряда может придавать кислые свойства гликозилизованному соединению. Такие сайты (сайт) могут быть включены в линкер соединений данного изобретения и предпочтительно гликозилируются клеткой в процессе рекомбинантного продуцирования полипептидов (например, клетками млекопитающего, такими как СНО, ВНК, СО8). Однако такие сайты, кроме этого, могут быть гликозилированы синтетическими или полусинтетическими способами, известными в данной области.
Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серина или треонина, окисление атома 8 в Сук, метилирование альфа-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина [см., например, СгефЫоп. Рго!ешк: 81гис1иге апб Мо1еси1е Ргорегйек (ν.Η. Ргеетап & Со., 8ап Егапаксо), рр. 79-86 (1983)].
Соединения настоящего изобретения могут быть также изменены и на ДНК-уровне. В последовательности ДНК любой части соединения могут быть изменены кодоны - на более совместимые с выбранной хозяйской клеткой. Для Е. сой, которая является предпочтительной клеткой-хозяином, оптимизируемые кодоны уже известны. Кодоны могут быть заменены, чтобы исключить сайты рестрикции или чтобы включить «молчащие» сайты рестрикции (их можно включать при процессинге ДНК в выбранной клетке-хозяине). Носитель, линкер и ДНК последовательности пептидов могут быть модифицированы для осуществления любого из вышеприведенных изменений последовательностей.
Другие производные, включающие непептидные аналоги, которые обеспечивают стабилизированную структуру или уменьшение биодеградации, также здесь рассматриваются. Пептидные аналогимиметики можно получить на основе выбранного ингибирующего пептида заменой в нем одного или нескольких остатков остатками непептидной природы. Предпочтительно непептидные остатки позволяют пептиду сохранить свою природную конформацию или стабилизировать предпочтительную, например, биоактивную структуру, благодаря чему сохраняется способность распознавать и связывать миостатин. Один пример из способов получения из пептидов непептидных миметических аналогов описан №1с1ппап е! а1., Кеди1. Рер1. 57:359-370 (1995). При желании пептиды настоящего изобретения могут быть модифицированы, например, гликозилированием, амидированием, карбоксилированием или фосфорилированием или созданием кислых солей, амидов, эфиров, в особенности С-концевых эфиров и Ν-ацильных производных пептидов данного изобретения. Пептидные антитела также могут быть модифицированы для получения пептидных производных путем образования ковалентно или нековалентно связанных комплексов с другими остатками. Ковалентно-связанные комплексы могут быть получены сшиванием остатков химических молекул с функциональными группами боковых цепей аминокислот, входящих в состав пептидных антител, или Ν- или С-концевых участков.
В частности, предполагают, что пептиды можно конъюгировать с репортерной группой, включающей (но без ограничения) радиоактивную метку, флуоресцентную метку, энзим (например, который катализирует колориметрическую или флуорометрическую реакцию), субстрат, твердую матрицу или носитель (например, биотин или авидин). Данное изобретение предусматривает соответственно молекулу, которая включает молекулу пептидного антитела, причем эта молекула, кроме того, предпочтительно включает репортерную группу, выбранную из радиоактивной метки, флуоресцентной метки, энзима, субстрата, твердой матрицы и носителя. Такие метки хорошо известны специалистам в данной области, например биотиновые метки особенно приемлемы. Использование таких меток известно и описано, например, в И8 патентах 3817837, 3850752, 3996345 и 4277437. Другие метки, которые тоже могут быть использованы, включают радиоактивные метки, флуоресцентные метки и хемилюминесцентные метки. В И8 патентах рассматривается использование таких меток, например, в И8 патентах 3847837, 3850752, 3939350 и 3996345. Любое из пептидных антител настоящего изобретения может включать одну, две или более каких-либо меток из числа перечисленных.
Способы получения пептидов и пептидных антител
Пептиды настоящего изобретения могут быть получены самыми разнообразными способами, известными в данной области. Например, такие пептиды можно синтезировать в растворе или на твердой подложке в соответствии с известными методиками. Различные синтетические синтезаторы являются коммерчески доступными и могут использоваться согласно известным инструкциям. См., например, 81е\гаг1 апб Уоипд (кирга); Тат е! а1., 1 Ат СЬет 8ос, 105:6442, (1983); Метйе1б, 8аепсе 232:341-347 (1986); Вагапу апб Метйе1б, Тпе Рерббек, Огокк апб Ме1епйо£ег, ебк, Асабетю Ргекк, Кед Уогк, 1-284; Вагапу е! а1., 1п! 1 Рер Рго!еш Кек, 30:705-739 (1987); и И8 патент 5424398, включенные здесь как ссылки.
- 19 009056
Методы твердофазного синтеза пептидов используют стирол-дивинилбензольные сополимеры, содержащие 0,1-1,0 мМ аминов/г полимера. В этих методах пептидного синтеза используется бутилоксикарбонильная (!-ВОС) или 9-флуоренилметилоксикарбонильная (ЕМОС) защита альфа-аминогрупп. Оба метода включают постадийный синтез, при котором на каждой стадии, начиная с С-конца пептида, прибавляют по одной аминокислоте (См. Οο1ί8ηη е! а1., Сигг Рго! Iттиηο1, ^Иеу Ιη^ΐΈ^ι^. 1991, υηίΐ 9). По завершении химического синтеза снимается защита синтетического пептида удалением блокирующих аминогрупп !-ВОС или ЕМОС-групп и проводится отсоединение пептида от полимера путем обработки кислотой при пониженной температуре (например, жидким НЕ-10% анизолом в течение от около 0,25 до около 1 ч при 0°С). После выпаривания реагентов пептиды экстрагируют с полимера 1% раствором уксусной кислоты и затем лиофилизируют, получая грубый неочищенный продукт. Он может быть нормально очищен такими методами как гель-фильтрация на Сефадексе С-15 с использованием 5% уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация соответствующих фракций с колонки приведет к получению гомогенных пептидов или производных пептидов, которые затем можно охарактеризовать с помощью таких стандартных способов как аминокислотный анализ, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, ультрафиолет-абсорбционная спектроскопия, молярная ротация, растворимость, и количественно оценить с помощью твердофазного расщепления по методу Ебтаи.
Метод фагового дисплея может быть особенно эффективным при идентификации пептидов настоящего изобретения, как описано выше. Кратко говоря, библиотеку фагов создают (используя, например, т1 13, Гб или лямбда фаг), выставляя инсерты от 4 до примерно 80 аминокислотных остатков. Инсерты могут представлять собой, например, абсолютно вырожденные или смещенные фрагменты. Выбирают несущие фаг инсерты, которые связывают желаемый антиген, и этот процесс повторяют на протяжении нескольких циклов реселекции фагов, которые связывают этот выбранный антиген. ДНК секвенирование проводят для того, чтобы идентифицировать последовательности экспрессируемых белков. Таким путем может быть установлена минимальная линейная часть последовательности, которая связывается с желаемым антигеном. Эта процедура может быть повторена с использованием библиотеки, содержащей инсерты, включающие часть или всю целиком минимальную линейную часть плюс один или более дополнительных вырожденных остатков в направлении вверх «по течению» (ир81геат) или «вниз по течению» (άοтеи8!^еат). Этими методами можно идентифицировать пептиды данного изобретения с еще большей аффинностью связывания миостатина, чем уже упомянутые здесь средства.
Безотносительно способа, которым получают пептиды, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая каждый такой пептид, может быть создана с использованием стандартных методов рекомбинантных ДНК. Нуклеотидную последовательность таких молекул можно соответственно использовать без изменения аминокислотной последовательности, которую они кодируют для объяснения вырожденности кода нуклеиновой кислоты, а также для того, чтобы получить представление о предпочтительных кодонах в конкретных хозяйских клетках.
Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидные последовательности, которые кодируют пептиды и пептидные антитела данного изобретения. Эти нуклеиновые кислоты включают векторы и конструкции, содержащие полинуклеотиды, кодирующие пептиды и пептидные антитела данного изобретения, также как и варианты и производные этих пептидов и пептидных антител. Примеры таких нуклеиновых кислот приводятся далее в примерах.
Метод рекомбинантных ДНК обеспечивает удобный способ получения полноразмерных пептидных антител и других крупных полипептидных связывающих агентов данного изобретения или их фрагментов. Полинуклеотид, кодирующий пептидное антитело или его фрагмент, может быть инсертирован в вектор экспрессии, который, в свою очередь, может быть введен в клетку-хозяин для получения связывающих агентов настоящего изобретения. Получение примерных пептидных антител настоящего изобретения описывается далее в примере 2.
Целый ряд экспрессионных систем «вектор/хозяин» может использоваться для экспрессии пептидов и пептидных антител данного изобретения. Такие системы включают (но не только): микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидным или космидным ДНК векторами экспрессии; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; системы клеток насекомых, инфицированных вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусами); системы растительных клеток, трансфицированные вирусными векторами экспрессии (например, вирусом табачной мозаики, ТМУ) или трансформированные бактериальными векторами экспрессии (например, Т1 или ВК 322 плазмидой) или системы животных клеток. Линия предпочтительных хозяйских клеток представляет собой штамм Е. той 2596 (АТСС № 202174), используемый для экспрессии пептидных антител, как описано далее в примере 2. Клетки млекопитающих, пригодные для получения рекомбинантных белков, включают (но не только) УЕКО клетки, НеЬа клетки, линии клеток хозяина китайского хомяка (СНО), СО8-клетки (такие как СО8-7), 138, ВНК, НерС2, 3Т3, ΚΙΝ,
МЭСК, А549, РС12, К562 и 293 клетки.
- 20 009056
Термин «вектор экспрессии» относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору для экспрессирования полипептида на основе полинуклеотидной последовательности. Вектор экспрессии может включать транскрипционный элемент, включающий совокупность (1) генетического элемента или элементов, играющих регуляторную роль при экспрессии гена, например, промоторов или энхансеров, (2) структуру или последовательность, которая кодирует связывающий агент, который транскрибируется в мРНК и транслируется в белок и (3) соответственные последовательности начала и завершения транскрипции. Структурные элементы, которые предназначаются для использования в дрожжевых или эукариотических экспрессионных системах, предпочтительно включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточное выделение транслируемого белка клеткой-хозяином. Или же, если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать остаток метионина на аминосодержащем конце. Этот остаток впоследствии можно отсоединить (или можно не отсоединять) от экспрессионного рекомбинантното белка для получения целевого пептидного продукта.
Например, пептиды или пептидные антитела могут быть рекомбинантно экспрессированы в дрожжах с использованием коммерчески доступной экспрессионной системы, например, РюЫа Ехргеккюп 8ук!ет (Iиν^!^одеи, 8ап П1едо, СА), согласно инструкциям производителя. Эта система при управлении выделением зависит также от пре-про-альфа последовательности, а транскрипция инсерта запускается алкоголь-оксидазным (АОХ1) промотором после индукции метанолом. Секретированный пептид выделяют из культуральной среды с помощью способов, используемых для выделения пептидов из супернатантов бактериальных культур или культур клеток млекопитающих.
Альтернативно, кДНК, кодирующая пептид и пептидные антитела, может быть клонирована в бакуловирусном векторе экспрессии рУБ1393 (Ρка^-М^идеи, 8ап П1едо, СА). Этот вектор можно использовать в соответствии с указаниями производителя (Ркаг-Мтдец) для того, чтобы инфицировать клетки 8робор!ега !гид1регба в кР9 безбелковой среде и получить рекомбинантный белок. Этот рекомбинантный белок можно выделить из среды и сконцентрировать с помощью колонки с гепарин-Сефарозой (Ркагтааа).
Альтернативно, пептид или пептидное антитело может экспрессироваться в системе клеток насекомых. Такие системы на основе клеток насекомых для экспрессии белков хорошо известны специалистам в данной области. В одной из таких систем может использоваться вирус ядерного полиэдроза Аи!одгарка саШогшса (Ас№У) как вектор для экспрессирования чужеродных генов в клетках 8робор!ега !гид1регба или в Тпскор1ик1а 1агуае. Кодирующая пептид последовательность может быть клонирована в несущественном участке вируса, таком как ген полиэдрина, и помещена под контроль полиэдринового промотора. Успешная инсерция пептида инактивирует ген полиэдрина и приводит к созданию белковой оболочки рекомбинантного вируса. Рекомбинантные вирусы могут использоваться для инфицирования клеток 8. !гид1регба или Тпскор1ик1а 1агуае, в которых экспрессируется белок (8ιηί11ι е! а1., 1. Упо1. 46:584 (1983); Епде1кагб е! а1., Ргос. №1. Асаб. 8а (И8А) 91:3224-7 (1994)).
В другом примере последовательность ДНК, кодирующая пептид, может быть амплифицирована с помощью ПЦР и клонирована в соответствующем векторе, например, рОЕХ-3Х (Рйагтааа). рОЕХ вектор предназначают для продуцирования слитого белка, включающего глутатион-8-трансферазу (О8Т), кодируемую вектором, и белок, кодируемый фрагментом ДНК, инсертированного в сайт клонирования вектора. Праймеры ПЦР могут быть созданы такими, чтобы включать, например, соответствующий сайт расщепления. Если слитый остаток используется исключительно для облегчения экспрессии или иначе говоря, он является нежелательным остатком, присоединяемым к интересующему пептиду, рекомбинантный слитый белок может быть отщеплен от О8Т-части слитого белка. рОЕХ-3Х конструкцию специфического пептидного связывающего агента трансформируют в Е. сой ХЬ-1 В1ие се11к (8йа1адепе, Ьа 1о11а СА) и отдельные конкретные трансформанты, выделенные и культивируемые. Плазмидная ДНК от конкретных трансформантов может быть выделена и частично секвенирована с помощью автоматического секвенатора для подтверждения местонахождения в соответствующем участке нуклеотидного инсерта, кодирующего последовательность специфического интересующего связывающего агента.
Слитый белок, который может быть получен как нерастворимые тельца включения в бактериях, может быть выделен и очищен следующим образом. Хозяйские клетки собирают центрифугированием; промывают 0,15 М №С1, 10 мМ Трис-буфером, рН 8,1 мМ ЭДТА и обрабатывают 0,1 мг/мл раствором лизоцима (81дта, 8!. Ьошк, МО) в течение 15 мин при комнатной температуре. Лизат можно очистить ультразвуковой обработкой, а клеточные остатки можно осадить центрифугированием в течение 10 мин при 12000 хд. Осадок, содержащий слитый белок, можно ресуспендировать в 50 мМ Трисе, рН 8 и 10 мМ ЭДТА, на котором наслоен 50% глицерина, и процентрифугировать в течение 30 мин при 6000 хд. Осадок можно снова ресуспендировать в стандартном солевом фосфатном буферном растворе (РВ8) без ионов Мд44 и Са++. Слитый белок может быть затем выделен фракционированием ресуспендированного осадка в денатурирующем 8Э8-РАСЕ (8атЬгоок е! а1., см. выше). Гель может быть насыщен 0,4 М КС1 для визуализации протеина, который можно иссечь и подвергнуть электроэлюированию при пропускании через гель буфера, не содержащего 8Ό8. Если С8Т/слитый белок продуцируется бак
- 21 009056 териями в виде растворимого протеина, его можно выделить с помощью С8Т Модуля Выделения (РБагтааа).
Слитый белок может быть подвергнут перевариванию для того, чтобы отщепить С8Т от пептида настоящего изобретения. Реакцию переваривания (20 - 40 мг слитого пептида, 20 - 30 единиц тромбина человека (4000 и/мг, 81дта) в 0,5 мл ΡΒδ проводят при инкубировании в течение 16-48 ч при комнатной температуре и нагружают на денатурирующий δΌδ-РАСЕ гель для фракционирования продуктов реакции. Этот гель может быть пропитан 0,4 М КС1 для визуализации полос белка. Идентичность полос белков, соответствующих пептидам с ожидаемой молекулярной массой, может быть подтверждена анализом аминокислотной последовательности с помощью автоматического секвенирующего устройства (АррБеб Вюкуйетк Мобе1 473А, Еойег СБу, СА). Альтернативно эта идентичность может быть установлена путем проведения ВЭЖХ и/или масс-спектрометрии пептидов.
В другом случае последовательность ДНК, кодирующая пептид, может быть клонирована в плазмиде, содержащей желаемый промотор, и необязательно - лидерную последовательность (ВеБег е1 а1., 8с1епсе, 240:1041-43 (1988)). Последовательность этого конструкта может быть подтверждена автоматическим секвенированием. Плазмиду можно затем трансформировать в штамм Е. соБ МС1061 с помощью стандартных методов, в которых применяется инкубация в СаС12 и обработка бактерий тепловым шоком (8атЬгоок е1 а1., см. выше). Трансформированные бактерии можно выращивать в ЬВ среде с добавлением карбенициллина, а продуцирование экспрессируемого белка может быть индуцировано культивированием в подходящей среде. Лидерная последовательность, в случае ее присутствия, может способствовать выделению пептида и отщепляться в процессе его выделения.
Системы хозяйских клеток животного происхождения для экспрессии рекомбинантных пептидов и пептидных антител хорошо известны специалистам в данной области. Штаммы клеток-хозяев можно подбирать с учетом их индивидуальной способности вырабатывать экспрессируемый протеин или продуцировать определенные посттрансляционные модификации, которые должны оказаться полезными для обеспечения активности белка. Такие модификации белка включают (но не только) ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Различные хозяйские клетки, такие как СНО, НеЬа, МОСК, 293, А138 и подобные, имеют специфические клеточные приспособления и обеспечивают характерные механизмы таких посттрансляционных видов активности и могут специально подбираться для того, чтобы обеспечить корректное модифицирование и процессинг интродуцированного чужеродного белка.
Предпочтительным является использование трансформированных клеток в течение продолжительного периода времени при высоком выходе продуцируемого белка. Такие клетки трансформируют векторами, которые содержат отобранные специально маркеры, а также желаемую кассету экспрессии, затем клеткам дают подрасти в течение 1-2 дней на обогащенных средах прежде, чем перевести на селективные среды. Селектируемый маркер предназначен для того, чтобы обеспечить рост и выделение клеток, которые успешно экспрессируют включенные последовательности. Устойчивые колонии стабильно трансформированных клеток могут быть размножены с помощью методов культур тканей, соответствующих применяемым клеточным линиям.
Множество селекционных систем может использоваться для выделения клеток, которые были трансформированы для производства рекомбинантных белков. Такие системы селекции включают (но не только): гены Н8У тимидинкиназы, гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы в !к-, Бдрй- или арй-клетках соответственно. Антиметаболитная устойчивость также может использоваться как основа селекции в отношении б11Гг, который придает устойчивость по отношению к метотрексату, др!, который придает устойчивость по отношению к микофеноловой кислоте, пео, который придает устойчивость к аминогликозиду С418 и придает устойчивость к хлорсульфурону, и Будто, который придает устойчивость к гигромицину. Другими генами, которые можно успешно использовать для селекции, являются БрВ, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или ЫкЭ, который позволяет клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина. Маркеры, которые обеспечивают визуальную индикацию при идентификации трансформантов, включают антоцианины, β-глюкуронидазу и ее субстрат, СИ8, люциферазу и ее субстрат-люциферин.
Выделение и повторное сворачивание (аминокислотной цепи) связывающих агентов
В некоторых случаях для того, чтобы связывающие агенты, такие как пептиды и/или пептидные антитела, данного изобретения были активными, может понадобиться их «сворачивание» и окисление, чтобы воспроизвести соответствующую третичную структуру с дисульфидными связями. «Сворачивание» можно осуществить с помощью известных в данной области способов. Такие способы включают, например, выдерживание солюбилизированного полипептидного средства при рН, обычно равного около 7, в присутствии хаотропного агента. Выбор хаотропа подобен выбору, который делается для солюбилизации телец включения, однако хаотроп обычно применяют при более низких концентрациях. Примерами хаотропных агентов являются гуанидин и мочевина. В большинстве случаев раствор для «сворачивания»/окисления должен также содержать восстанавливающий агент вместе с его окисленной формой в определенном их соотношении для создания конкретного окислительно-восстановительного потенциала, что позволит произойти дисульфидной перестройке, приводящей к образованию цистеи
- 22 009056 новых мостиков. Некоторые часто используемые редокс-пары включают цистеин/цистамин, глутатион/дитиобис С8Н. хлорид меди, дитиотреитол ДТТ/дитиан ДТТ и 2-меркаптоэтанол (ЬМЕ)/дитио-ЬМЕ. Во многих случаях можно использовать сорастворитель для увеличения эффективности «сворачивания». Наиболее часто применяемые сорастворители включают глицерин, полиэтиленгликоль самых различных молекулярных масс и аргинин.
Может быть желательным выделение пептидов или пептидных антител данного изобретения. Методы выделения белков хорошо известны специалистам в данной области. Эти методы включают, с одной стороны, грубое фракционирование белковых и небелковых фракций. Отделив пептиды и/или пептидные антитела от других белков, можно потом выделить интересующий пептид или полипептид, используя хроматографические или электрофоретические способы, чтобы добиться частичной или полной очистки (или очистки до гомогенного состояния). Аналитические методы, особенно пригодные для получения пептидных антител и пептидов настоящего изобретения, включают ионообменную хроматографию, разделительную хроматографию, электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективным методом очистки пептидов является быстрая жидкостная хроматография белков или ВЭЖХ.
Определенные аспекты настоящего изобретения касаются очистки, и в отдельных вариантах - существенной очистки пептидного антитела или пептида настоящего изобретения. Подразумевается, что термин «очищенное пептидное антитело или пептид» в употребляемом здесь значении означает композицию, которую можно отделить от других компонентов, причем пептидное антитело или пептид очищены до степени, которая соотносится с его природной формой. «Очищенное пептидное антитело или пептид» относится также и к пептидному антителу или пептиду, который свободен от примесей и иных веществ, которые он может содержать в природном состоянии.
Вообще термин «очищенный» следует относить к композиции пептидов или композиции пептидных антител, которая была подвергнута фракционированию, чтобы удалить различные другие компоненты, и при этом в существенной степени сохранила свою экспрессируемую биологическую активность. При использовании термина «существенно очищенный» это обозначение следует относить к пептидной композиции или композиции пептидных антител, в которой пептидное антитело или пептид является главным компонентом композиции, составляя таким образом около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 95% или более белков в композиции.
Для оценки степени очистки пептида или пептидного антитела специалистам в данной области должны быть известны самые различные методы в свете раскрытия данного изобретения. Они включают, например, определение специфической связывающей активности активной фракции или определение количества пептида или пептидного антитела во фракции с помощью 8Ό8/ΡΑ6Ε анализа. Предпочтительный способ определения чистоты фракции пептида или пептидного антитела состоит в вычислении связывающей активности этой фракции, сравнении ее со связывающей активностью первоначального экстракта и дальнейшем подсчете степени очистки, названной здесь « - кратная степень очистки». Фактические величины, используемые для характеристики величины связывающей активности, будут, конечно, зависеть от конкретного способа анализа, выбранного для оценки степени очистки, и от того, проявляет ли пептидное антитело или пептид связывающую активность, которую можно детектировать.
Различные способы, пригодные для использования с целью очистки, хорошо известны специалистам в данной области. Они включают, например, осаждение сульфатом аммония, ПЭГ, антитела (иммунопреципитация) и т. д. или тепловая денатурация с последующим центрифугированием, постадийная хроматография, например аффинная хроматография (например, на протеин А - сефарозе), ионообменная, гель-фильтрационная, с обращенной фазой, гидроксиапатитная и аффинная хроматография, изоэлектрическое фокусирование, гель-электрофорез и комбинации этих и других методов. Как в принципе известно специалистам, полагают, что порядок проведения различных процедур очистки может быть изменен, а некоторые стадии исключены, что все равно обеспечит в результате приемлемый способ получения существенно очищенного связывающего агента.
Необязательно, чтобы связывающие агенты настоящего изобретения были самой высокой степени очистки. На самом деле предполагается, что менее очищенные связывающие агенты настоящего изобретения будут использоваться в некоторых вариантах. Частичная очистки обеспечивается за счет комбинации меньшего числа стадий очистки или использования различных форм одной и той же общей схемы выделения.
Например, отмечается, что катионообменная колоночная хроматография, выполняемая при использовании ВЭЖХ аппаратуры, будет приводить к большей степени очистки, чем тот же способ, использующий хроматографическую систему низкого давления. Методы, обеспечивающие более низкую степень относительной очистки, могут иметь преимущества в отношении всего процесса выделения пептида или пептидного антитела в целом или в отношении поддержания связывающей активности пептида или пептидного антитела.
Известно, что миграция пептида или полипептида может колебаться, иногда существенно, при различных условиях 8Ό8/ΡΑ6Ε (Сара1й1 е1 а1., ВюсНеш. ВюрНуз. Кез. Сотт, 76:425 (1977)). Поэтому
- 23 009056 отмечается, что при различающихся условиях проведения электрофореза явные молекулярные массы очищенных или частично очищенных продуктов экспрессии связывающих агентов могут варьироваться.
Активность миостатинсвязывающих агентов
Полученные связывающие агенты настоящего изобретения проверяются в отношении способности связывать миостатин и ингибировать или блокировать активность миостатина. Любое числе анализов или тестов на животных может быть использовано для определения способности конкретного агента ингибировать или блокировать активность миостатина. Различные исследования, используемые для определения свойств пептидов и пептидных антител настоящего изобретения, описываются ниже в примерах. Одно исследование представляет собой С2С12рМАКЕ - 1ис анализ, в котором используется линия миостатин-чувствительных клеток (С2С12 миобласты), трансфицированных люциферазным репортерным вектором, содержащим элементы реакции миостатин/активин (МАКЕ). Возможные пептидные антитела исследуют, проводя преинкубирование серий разведении пептидных антител с миостатином и затем выдерживая клетки в инкубационной смеси. Активность получившейся в результате люциферазы определяют и на основе серий разведении пептидных антител строят калибровочную кривую. Затем определяют 1С50 (концентрация пептидного антитела, при которой достигается 50% ингибирование активности миостатина, определяемое по активности люциферазы). Второе исследование, описанное ниже, представляет собой В1Асоге® - анализ для определения кинетических параметров ка (постоянная скорости ассоциации), кб (постоянная скорости диссоциации) и Кс (постоянная равновесия диссоциации) миостатинсвязывающих агентов. Более низкие константы равновесия (Кс, выражаемая в мМ) показали более высокую аффинность пептидного антитела к миостатину. Другие исследования включают анализ блокирования - для определения, является ли связывающий агент, такой как пептидное антитело, нейтрализующим (предотвращает или связывание миостатина с его рецептором) или ненейтрализующим (не предотвращает связывание миостатина с его рецептором); анализ селективности, с помощью которого узнают, селективно ли связывают миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения или неселективно - другие представители ТОЕв-семейства; и К1пЕх А™ - анализы или анализы равновесия раствора, в которых также определяются Кс, и делается заключение о большей их чувствительности при некоторых обстоятельствах. Эти анализы описаны в примере 3.
На фиг. 1 показана 1С50 пептида по сравнению с 1С50 формы пептидного антитела этого пептида. Это показывает, что пептидное антитело значительно более эффективно при ингибировании активности миостатина, чем один пептид. Кроме того, аффинно зрелые пептидные антитела в целом показывают улучшенные значения величин 1С50 и Кс в сравнении с их исходными родительскими пептидами и пептидными антителами. Величины 1С50 для ряда аффинно зрелых пептидных антител показаны в таблице VII, примере 7 ниже. Кроме того, в некоторых случаях, производя 2 х версии пептидного антитела, когда два пептида тандемно соединены, увеличивают активность пептидного антитела как ш уйго, так и ш у1уо.
1п у1уо активности показаны в примерах ниже. Активности связывающих агентов включают анаболическую активность, повышающую массу тощих мышц у модельных животных и повышение мышечной силы у этих животных.
Применение миостатинсвязывающих агентов
Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения связывают миостатин и блокируют или ингибируют передачу сигнала миостатином внутри намеченных клеток. Данное изобретение предлагает способы и реагенты для снижения количества или активности миостатина у животных путем введения животному эффективной дозы одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы и средства для лечения миостатинзависимых расстройств у животных, включающие введение животному эффективной дозы одного или нескольких связывающих агентов. Эти миостатинзависимые расстройства включают (но не только) различные формы потери мышечной массы, а также метаболические расстройства, например диабет и связанные с ним расстройства, и дегенеративные заболевания костной системы, например остеопороз.
Как показано в примере 8 ниже, пептидные антитела из примеров настоящего изобретения очень существенно повышают массу тощих мышц в эксперименте на мышах С1 пи/пи. Эта ш у1уо активность коррелирует с ш уйго связывающей и ингибиторной активностью, тех же пептидных антител, описанными ниже.
Расстройства, характеризующиеся потерей мышечной массы, включают различные виды дистрофии, такие как Эисйепп'з мышечная дистрофия, прогрессирующая мышечная дистрофия, Вескег'з типичная мышечная дистрофия, □е)еппе-Бапбоиху мышечная дистрофия, Бгй'з мышечная дистрофия и детская (инфантильная) нейроаксональная дистрофия. Например, блокирование миостатина с помощью антител ш у1уо улучшило дистрофический фенотип тбх у модельных мышей с Энсйепп мышечной дистрофией. (Водбапоуюй е! а1., №1иге, 420, 28 (2002)). Пептидные антитела настоящего изобретения повышают массу тощих мышц по отношению к массе тела и снижают жировую массу по отношению к массе тела при введении их взрослым тбх модельным мышам.
- 24 009056
Другие разрушающие мышцы расстройства возникают из-за хронических заболеваний, таких как амиотрофический латеральный склероз, застойное обструктивное легочное заболевание, рак, ВИЧ, почечная недостаточность и ревматоидный артрит. Например, у бестимусных бесшерстных мышей вызвали кахексию или истощение мышц и потерю массы тела путем систематического введения миостатина (ΖίιηιηοΐΈ ей а1., см. выше). В другом примере было обнаружено, что сывороточное и внутримышечные концентрации миостатин-иммунореактивного белка были повышенными у людей, страдающих от обусловленной ВИЧ потери мышечной массы, и были обратно-пропорциональны количеству безжировой массы (Соигакд-СаЕауйЕ ей а1., РNА8 И8А, 95:14938-14943 (1998)). Дополнительные условия, приводящие к потере мышечной массы, могут возникать вследствие бездеятельности, пассивности, обусловленной ограничением возможности движения и неспособности двигаться из-за использования инвалидной коляски, продолжительного пребывания в постельном режиме вследствие удара, болезни, повреждения позвоночника, перелома костей или травмы и состояния невесомости (в космическом полете). Например, было установлено, что содержание миостатин-иммунореактивного белка в плазме увеличивается после продолжительного периода постельного режима (Уас11\\зе)а ей а1., 1. Сгауйй РЕукйок, 6(2): 11 (1999)). Установлено также, что в мышцах крыс, пребывавших в состоянии невесомости во время космического полета, экспрессировалось повышенное количество миостатина по сравнению с тем, что было в мышцах крыс, которые не были в состоянии невесомости (ЬаЬапй ей а1., й. ЕиЕосгйи. (67(3):417-28 (2000)).
Кроме того, обусловленное старением повышение соотношения между массой жира и мышечной массой и связанная с возрастом атрофия мышц, по-видимому, зависит от миостатина. Например, среднее количество сывороточного миостатин-иммунореактивного белка повышалось с возрастом в группах молодых (19-35 лет), среднего возраста (36-75 лет) и старшей возрастной группы (76-92 года) мужчин и женщин, тогда как средние величины мышечной массы и безжировой массы снижались с возрастом в этих группах (йагакйеуккй ей а1., й. М.11г Адйид 6(5):343-8 (2002)). Было также показано, что нокаут гена миостатина мыши повышал миогенез и понижал адипогенез (Ьш ей а1., ВйосЕеи ВйорЕук. Век. Соттии. 291(3):701-6 (2002)), приводя у взрослых особей к повышению мышечной массы, снижению накопления жира и выделению лептина. Пептидные антитела, представленные в примерах, повышают соотношение масс мышц и жира у взрослых тЕх мышей согласно показанному ниже.
Помимо вышесказанного в настоящее время установлено, что миостатин экспрессируется в мышце сердца и в кардиомиоцитах экспрессия окончательно регулируется после инфаркта (8Еагта ей а1., й. С1ш. РЕу5Йо1. 100(1):1-9 (1999)). Поэтому снижение уровня миостатина в сердечной мышце может улучшить восстановление сердечной мышцы после инфаркта.
Похоже, миостатин также влияет на метаболические расстройства, включая диабет 2 типа, инсулин-независимый диабет, гипергликемию и ожирение. Например, на двух питательных типах мышей показано, что убыль миостатина улучшала фенотип при ожирении и диабете (Уеи ей а1., см. выше). В примерах, приводимых ниже, показано, что снижение активности миостатина путем введения ингибиторов настоящего изобретения будет приводить у животных к снижению соотношения масс жира и мышц, включая и старых модельных животных. Следовательно, снижение содержания жирового компонента введением ингибиторов настоящего изобретения будет улучшать состояние животных при диабете, ожирении и гипергликемии.
Кроме этого, повышение мышечной массы в результате снижения уровней миостатина может улучшить силу костей, уменьшить остеопороз и другие дегенеративные заболевания костей. Установлено, что у дефицитных по миостатину мышей наблюдалось повышенное содержание минералов и плотность плечевой кости мыши и повышенное содержание минералов трабекулярной и кортикальной костей в участках прикрепления мышц, а также повышенная мышечная масса (НатЬпк ей а1., Са1сйГ. Тйккие йий, 71(1):63-8 (2002)).
Настоящее изобретение обеспечивает также методы и средства его повышения мышечной массы животных, мясо которых употребляется в пищу, путем введения животному эффективной дозы миостатинсвязывающего агента. Так как зрелый С-концевой полипептид миостатина идентичен во всех исследованных видах, следует предположить, что миостатинсвязывающие агенты будут эффективными для повышения мышечной массы и снижения доли жира в любых видах сельскохозяйственных животных, включая крупный рогатый скот, цыплят, индюков и свиней.
Связывающие агенты настоящего изобретения могут использоваться сами по себе или в комбинации с другими терапевтическими средствами для повышения их терапевтического действия или снижения возможных побочных эффектов. Связывающие агенты настоящего изобретения обладают одним или несколькими желательными, но неизвестными ранее неожиданными сочетаниями свойств, улучшающими терапевтическую ценность этих средств. Эти свойства включают повышенную активность, увеличенную растворимость, пониженную способность к деградации, увеличенное время полужизни, сниженную токсичность и сниженную иммуногенность. Таким образом, связывающие агенты настоящего изобретения пригодны для применения в режимах продолжительного лечения. Кроме того, гидрофильность и гидрофобность соединений данного изобретения хорошо сбалансированы, что повышает их пригодность для использования как йи уййго, так и йи уйуо в особенности. В частности, соединения
- 25 009056 настоящего изобретения обладают соответствующей степенью растворимости в водных средах, что обеспечивает поглощение и биодоступность в организме, несмотря на то, что, обладая также определенной растворимостью в липидах, эти соединения могут проникать через клеточные мембраны в направлении к предполагаемому месту действия, например к конкретной мышечной массе.
Связывающие агенты настоящего изобретения пригодны для лечения «субъекта» (пациента) или какого-либо животного, включая человека, путем введения их в виде подходящей композиции и в эффективных дозах.
Кроме того, миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения могут применяться для детектирования и количественного определения миостатина в ряде аналитических процедур. Эти анализы более детально описаны ниже.
Вообще связывающие агенты настоящего изобретения используются как «средства захвата», чтобы связать и иммобилизовать миостатин в целом ряде исследований, подобных тем, что описываются, например, Азак ей., Ме1койз ίη Се11 Вю1оду, 37, ЛпйЬоФез ίη Се11 Вю1оду. Лсайешю Ргезз, 1пс., №и 1огк (1993). Связывающие агенты могут быть каким-то образом помечены или могут взаимодействовать с третьим веществом, таким как антитело к связывающему агенту, которое является меченым, чтобы обеспечить детектирование и количественное определение миостатина. Например, связывающий агент или третье вещество (третья молекула) может быть модифицирована детектируемым остатком, например, биотином, который потом может связаться с четвертой молекулой, например, меченным энзимом стрептавидином или другими белками (Лкегйгош, 1. 1шшипо1. 135:2589 (1985); СкаиЬей, Мой. Ра1ко1. 10:585 (1997)).
Во время проведения любого конкретного исследования стадии инкубирования и/или промывания могут потребоваться после каждого сочетания реагентов. Стадии инкубации могут продолжаться от около 5 с до нескольких часов, предпочтительно от около 5 мин до около 24 ч. Однако время инкубации будет зависеть от масштаба исследования, объема раствора, концентраций и т.п. Обычно эти анализы проводятся при комнатной температуре, хотя они могут проводиться в широком диапазоне температур.
Анализ неконкурентного связывания
Исследование связывания может быть анализом неконкурентного связывания, при котором непосредственно измеряют количество захваченного миостатина. Например, в одном предпочтительном «сэндвич»-анализе связывающий агент может быть непосредственно связан с твердой подложкой и таким образом он становится иммобилизованным. Такие иммобилизованные агенты затем связывают миостатин, содержащийся в испытуемом образце. Иммобилизованный миостатин затем связывают с метящим средством, таким как меченое антитело к миостатину, который теперь можно определить. В других предпочтительных «сэндвич»-анализах может добавляться второй агент, специфичный к связывающему агенту, содержащий детектируемый остаток, например, биотин, к которому может специфически присоединяться третье меченое вещество, такое как стрептавидин (См. Наг1оте апй Ьапе, ЛпкЬой1ез, Л ЬаЬога1огу Мапиа1, Ск. 14, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу, ΚΥ (1988), которое включено здесь как ссылка).
Анализ конкурентного связывания
Анализ связывания может быть анализом конкурентного связывания. Количество миостатина, содержащегося в образце, измеряют непосредственно путем определения количества миостатина, замещенного или вытесненного от связывающего агента миостатином, содержащимся в образце. В одном предпочтительном анализе связывания известное количество миостатина, как правило меченого, добавляют к образцу и образец потом взаимодействует со связывающим агентом. Количество меченого миостатина, связанного со связывающим агентом, обратно пропорционально концентрации миостатина, содержащегося в образце (после протокольных записей, приведенных, например, в руководстве Наг1оте апй Ьапе, ЛпйЬоФез Л ЬаЬога1огу Мапиа1, Ск 14, рр. 579-583, см. выше).
В другом предпочтительном анализе конкурентного связывания связывающий агент иммобилизуют на твердой подложке. Количество миостатина, связанного со связывающим агентом, можно определить, либо измеряя количество миостатина, содержащегося в комплексе миостатин/связывающий агент, либо, как альтернатива, измеряя количество оставшегося миостатина, не вошедшего в состав комплекса.
Другие анализы связывания
Настоящее изобретение предусматривает также Вестерн-блот методы для того, чтобы детектировать или количественно определять присутствие миостатина в образце. Метод в целом включает выделение белков пробы гель-электрофорезом на основе молекулярной массы и перенос белков на подходящую твердую подложку, например, нитроцеллюлозный фильтр, нейлоновый фильтр или фильтр на основе производных нейлона. Образец инкубируют со связывающими агентами или их фрагментами, которые связывают миостатин, и детектируют получившийся комплекс. Эти связывающие агенты могут быть непосредственно меченными или могут в последующем определяться с помощью меченых антител, которые специфически связываются со связывающими агентами.
- 26 009056
Диагностические исследования
Связывающие агенты или их фрагменты настоящего изобретения могут применяться для диагностики состояний или заболеваний, которые могут характеризоваться повышенными количествами миостатина. Диагностические исследования при высоких уровнях миостатина включают методы, использующие связывающий агент и метку, чтобы детектировать миостатин в жидкостях организма человека, клеточных экстрактах и специфических тканевых экстрактах. Например, уровни миостатина в сыворотке можно измерять у пациента в течение некоторого времени, чтобы определить начало потери мышечной массы, обусловленное старением или обездвиженностью, как описано, например, у Уага511С51<1 е1 а1., см. выше. Показано, что повышенные уровни миостатина коррелируют со средней уменьшившейся мышечной массой и безжировой массой в группах мужчин и женщин преклонного возраста (Уага511С5к| е1 а1., см. выше). Связывающие агенты настоящего изобретения могут оказаться полезными при мониторинге увеличения или снижения уровня содержания миостатина у данного конкретного индивидума в течение времени, например. Связывающие агенты могут использоваться в таких исследованиях с модификациями или без модификаций. В предпочтительном диагностическом исследовании связывающие агенты следует пометить, присоединив, например, метку или репортерную молекулу. Известно огромное количество меток и репортерных молекул, некоторые из которых уже описаны здесь. В частности, настоящее изобретение может применяться для диагностики заболеваний человека.
Известен ряд предложений для измерения уровней миостатиновых белков с помощью миостатинсвязывающих агентов. Примеры включают энзимсвязанный иммуносорбентный метод анализа (ЕЬ18А), радиоиммуноанализ (К1А) и сортинг флуоресцентно-активированных клеток (ЕАС8).
Для применения в диагностике в некоторых вариантах связывающие агенты настоящего изобретения обычно следует пометить детектируемым остатком. Детектируемый остаток может быть любым, но способным продуцировать, прямо или косвенно, сигнал, который можно уловить. Например, детектируемый остаток может быть радиоизотопом, таким как 3Н, 14С, 32Р или 125Ι, флуоресцирующим или хемилюминесцирующим соединением, например, изотиоцианатом флуоресцеина, родамином или люциферином, или ферментом, таким как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или пероксидаза хрена (Вадег е1 а1., Ме111. Епх. 184:138 (1990)).
Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции миостатинсвязывающих агентов, таких как пептидные антитела, описанные здесь, подпадают под объем настоящего изобретения. Такие композиции включают терапевтически или профилактически эффективное количество миостатинсвязывающего агента, его фрагмента, варианта или производного, согласно описанному здесь, в смеси с фармацевтически приемлемым средством. В предпочтительном варианте фармацевтические композиции включают антагонистсвязывающие агенты, которые ингибируют миостатин частично или полностью в смеси с фармацевтически приемлемым средством. Обычно миостатинсвязывающие агенты должны быть существенно очищенными при введении животным.
Фармацевтическая композиция может содержать компоненты состава для модификации, сохранения или предохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или выделения, поглощения или проникновения композиции. Такие подходящие компоненты включают (но не имеют ограничивающего характера) аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); антимикробные средства; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или кислый сульфит натрия); буферы (такие как боратный, бикарбонатный, трис НС1, цитратный, фосфатный, на других органических кислотах); придающие объем средства (такие как маннитол или глицин), хелатирующие агенты (например, этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА)), комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклобекстрин); наполнители; моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители; ароматизирующие и разбавляющие агенты; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (например, натрий); консерванты (например, бензалконий - хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимерозал, фенэтиловый спирт, метилпарабен; пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (например, манитол или сорбитол); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажнители (такие как плуроникс, ПЭТ, эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, прометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); повышающие стабильность агенты (сахароза или сорбитол); повышающие тонус средства (такие как галоиды щелочных металлов (предпочтительно натрий или калий хлорид, маннитол, сорбитол)); средства доставки; разбавители; наполнители и/или фармацевтические адъюванты (КеттдФп'к Рйагтасеийса1 Заепсек, 184Ь Εάίΐίοη, А.К. Сеппаго, ей., Маск РиЬШЫпд Сотрапу, 1990).
Оптимальная фармацевтическая композиция должна быть составлена специалистом в данной области, в зависимости, например, от предполагаемого способа введения, масштаба доставки и желаемой
- 27 009056 дозы. См. например, КетшдФп'к Ркагтасеибса1 Еаепсек, см. выше. Такие композиции могут оказывать влияние на достижение состояния, стабильность, скорость ш νίνο выделения, скорость ш νίνο клиренса связывающего агента.
Основной носитель (средство доставки) или связующее в фармацевтической композиции может быть либо водным, либо неводным по своей природе. Например, подходящим носителем или средством доставки может быть вода для инъекций, физраствор или искусственная цереброспинальная жидкость, возможно, дополненные другими веществами, обычно применяемыми в композициях для парентерального введения. Нейтральные солевые буферы или соли, смешанные с сывороточным альбумином, также представляют собой хорошие носители. Другие примерные фармацевтические композиции включают трис-буфер с рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН примерно 4,0-5,5, которые могут также включать сорбитол или его подходящий заменитель. В одном варианте настоящего изобретения композиции связывающих агентов могут готовиться для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с необязательными компонентами состава Кетшд1оп'§ РЬагтасеибса1 Еаепсек (см. выше) в форме лиофилизированной таблетки или водного раствора. Далее продукт на основе связывающего агента может быть приготовлен как лиофилизированное средство с использованием соответствующих наполнителей, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции могут подбираться и для парентерального введения. Альтернативно композиции могут подбираться для ингаляций или для энтерального введения, такого как орального, ушного, офтальмологического, ректального или вагинального. Приготовление таких фармацевтических композиций несложно для специалистов в данной области.
Компоненты содержатся в концентрациях, которые приемлемы для места введения композиции. Например, используются буферы для поддержания композиции при физиологических значениях рН или при слегка пониженных рН, обычно в пределах интервала рН от около 5 до около 8.
Если предполагается парентеральное введение, терапевтические композиции для использования в данном изобретении могут быть в форме апирогенного парентерально приемлемого водного раствора, включающего желаемый связывающий агент в фармацевтически приемлемой среде. Особенно пригодной средой для парентерального введения является стерильная дистиллированная вода, в которой содержится связывающий агент, и композиция представляет собой стерильный изотонический раствор, надлежащим образом предохраненный от порчи. Еще один тип препарата может включать композицию желаемого вещества с таким средством, как, например, инъецируемые микросферы, частицы, способные к биоразложению, полимерные соединения (полимолочная кислота, полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые обеспечивают контролируемое или непрерывное выделение продукта, который может затем доставляться через инъекционное депо. Гиалуроновая кислота также может использоваться и это может способствовать увеличению продолжительности циркулирования. Другие пригодные свойства для введения желаемого вещества включают свойства доставки лекарств, которые можно имплантировать.
В другом аспекте изобретения фармацевтические составы, пригодные для парентерального введения, могут быть составлены в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как НапкС раствор, раствор Рингера или физиологический солевой буферный раствор. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, например карбоксиметилцеллюлоза, сорбитол или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть приготовлены как соответствующие масляные инъекционные суспензии. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные кислоты, такие как кунжутное масло или эфиры синтетических жирных кислот, например этилолеат, триглицериды или липосомы. Нелипидные поликатионные аминополимеры также могут использоваться для доставки. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или средства, чтобы увеличить растворимость соединений и обеспечить получение высококонцентрированных растворов. В другом варианте фармацевтическая композиция может быть приготовлена для ингаляции. Например, связывающий агент может быть в форме сухого порошка для ингаляции. Ингаляционные растворы на основе полипептидов или нуклеиновых кислот могут также быть с пропеллантом для обеспечения аэрозольной доставки. В другом варианте растворы могут быть распылены. Легочное введение описано в РСТ заявке РСТ/ИЕ 94/001875, где охарактеризована доставка в легкие химически модифицированных белков.
Предполагают, что некоторые составы могут вводиться орально. В одном варианте настоящего изобретения молекулы связывающего агента, которые надо ввести таким образом, можно соединить (или можно не соединять) с носителями, обычно используемыми при изготовлении твердых дозировочных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, капсула может быть предназначена для выделения активного элемента композиции в определенной точке желудочно-кишечного тракта, когда биодоступность максимизирована, а пресистемная деградация минимизирована. Могут быть включены дополнительные агенты, чтобы облегчить поглощение молекулы связывающего агента. Разбавители, ароматизаторы, низкоплавящиеся воска, растительные масла, любриканты, суспендирующие агенты, дезинтегрирующие таблетку агенты (разрыхлители) и связующие также могут применяться.
- 28 009056
Фармацевтические композиции для орального введения могут готовиться с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области в дозировках, приемлемых для орального введения. Такие носители дают возможность изготовить фармацевтические композиции как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкие растворы, гели, сиропы, пюре, суспензии и т.п. для проглатывания пациентом.
Фармацевтические композиции для орального использования могут быть получены объединением активного компонента с твердым наполнителем и обработкой получившейся смеси гранул (необязательно после размалывания) с получением таблеток и дражированных сердцевинок. При желании могут быть добавлены подходящие вспомогательные вещества. Подходящие наполнители включают углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, например, лактозу, сахарозу, маннитол и сорбитол, крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений, целлюлозу, например, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу или натрий-карбоксиметилцеллюлозу, камеди, включая аравийскую и трагакант, белки, такие как коллаген и желатин. При желании могут быть добавлены дезинтегрирующие и солюбилизирующие агенты, такие как поперечносшитый поливинилпирролидон, агар и альгиновая кислота или ее соль, например, альгинат натрия.
Сердцевинки драже могут использоваться вместе с подходящими покрытиями, например, концентрированными сахарными растворами, которые могут также содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть также добавлены к таблеткам или покрытиям драже для идентификации продукта или для характеристики количества активного вещества, например дозы.
Фармацевтические препараты, которые могут использоваться орально, включают также «заталкиваемые» («рикй-ίϊΐ») капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие запечатанные капсулы, изготовленные из желатина с покрытием из глицерина и сорбитола. «Заталкиваемые» капсулы могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителями или связующими, такими как лактоза или крахмалы, любриканты, такие как тальк или стеарат магния и, необязательно, стабилизаторы. В мягких капсулах активные ингредиенты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как масла, жидкие растворы или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без них.
Другая фармацевтическая композиция может включать эффективное количество связывающего агента в смеси с нетоксичными наполнителями, которые пригодны для производства таблеток. Растворив таблетки в стерильной воде или другой соответствующей среде, можно приготовить растворы в форме единичной дозы. Подходящие наполнители включают (но без ограничения) инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактозу или фосфат кальция, или связывающие агенты, такие как крахмал, желатин или (камедь) акации, или смазывающие средства, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Другие фармацевтические композиции должны быть очевидны специалистам в данной области, в их составы водят молекулы связывающих агентов в виде средств непрерывной или регулируемой доставки. Способы приготовления целого ряда других средств непрерывной и регулируемой подачи (доставки), такие как липосомные носители, биоразлагающиеся микрочастицы или пористые гранулы и инъекционное депо - хорошо известны специалистам. См., например, РСТ/ϋδ 93/00829, где описано контролируемое выделение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтической композиции. Другие примеры непрерывно выделяющихся препаратов включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде частиц определенной формы, например пленок или микрокапсул. Непрерывно выделяющие лекарство капсулы могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (ϋδ 3773919, ЕР 58481), сополимеры ϋ-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Е-глутамата (81бтап е1 а1., Вюро1утегк, 22:547-556 (1983)), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Ьапдег е1 а1., I. Вютеб. Ма1ег. Кек., 15:167-277 (1981): Ьапдег е1 а1., СНет. ТесН., 12:98-105 (1982)) этиленвинил-ацетат (Ьапдег е1 а1., см. выше) или Ό(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133988). Непрерывно выделяющиеся композиции включают также липосомы, которые можно приготовить любым известным в данной области способом. См., например, ЕрркЮю е1 а1., РЫА8 (ША), 82:3688 (1985): ЕР 36676, ЕР 88046, ЕР143949.
Фармацевтические композиции, которые следует использовать для ш у|уо введения, как правило, должны быть стерильными. Это может быть достигнуто фильтрованием через стерильные фильтрационные мембраны. Если композицию лиофилизируют, стерилизация, которую проводят этим способом, может проводиться либо до, либо после лиофилизации и восстановления. Композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизированной форме или в растворе. Кроме того, парентеральные композиции вообще должны находиться в емкости со стерильным входом для доступа, например, в сумке для внутривенного раствора или в сосуде с пробкой, которую можно проколоть гиподермической инъекционной иглой.
Как только фармацевтическая композиция получена, ее можно хранить в стерильных сосудах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизи
- 29 009056 рованного порошка. Такие составы могут храниться либо в готовой для использования форме, или в форме (например, лиофилизированной), требующей восстановления перед введением.
В конкретном варианте настоящее изобретение касается наборов для производства единичных доз для введения. Наборы могут содержать по две емкости: одну - с высушенным белком, другую - с водным составом. В объеме данного изобретения включаются также наборы, содержащие единичные и мультикамерные предварительно заполненные шприцы (например, жидкостные шприцы и лиошприцы).
Эффективное количество фармацевтической композиции, предназначенной для терапевтического применения, будет зависеть, например, от терапевтической цели и обстоятельств. Специалисту должно быть понятно, что соответствующие уровни доз для лечения будут, таким образом, зависеть частично от доставляемого вещества, индикации, какой связывающий агент используется, способа введения и размера (веса тела, поверхности тела или размера органа) и состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. Соответственно врач может подкорректировать дозу и модифицировать тип введения для достижения оптимального терапевтического эффекта. Обычная доза может колебаться от около 0,1 до около 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. В других вариантах доза может колебаться от 0,1 до около 100 мг/кг, или от 1 до около 100 кг/кг, или от 5 до около 100 мг/кг.
Для любого соединения терапевтически эффективная доза может быть определена сначала с помощью исследований на культурах клеток или на модельных животных, таких как мыши, крысы, кролики, собаки, свиньи или обезьяны. Животные могут также использоваться для определения соответствующего диапазона концентраций и способа введения. Такая информация может потом использоваться для установления приемлемых доз и путем введения человеку.
Точные дозы следует определять исходя из факторов, связанных с субъектом, которому требуется лечение. Дозы и путь введения регулируются, чтобы обеспечить существенные уровни активного соединения или поддержать желаемый эффект. Факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают тяжесть заболевания, общее состояние здоровья больного, возраст, вес, пол, время и частота введения, лекарственное сочетание (сочетания), реакционную чувствительность и реакцию на лечение. Долго действующие фармацевтические композиции могут вводиться каждые 3-4 дня, каждую неделю или раз в две недели в зависимости от времени полужизни и скорости клиренса конкретного состава.
Частота дозирования будет зависеть от фармакокинетических параметров молекулы связывающего агента в используемом составе. Обычно композицию вводят до тех пор, пока применяемая доза не даст возможности достичь желаемого эффекта. Композиция может, следовательно, вводиться в виде единичной дозы или как мультидоза (при той же или другой концентрации/дозах) за раз или как непрерывная инфузия. Подкорректировать соответствующую дозу нетрудно. Убедиться, что дозы являются уместными, можно используя соответствующие данные по их эффективности.
Способы введения фармацевтической композиции соответствуют известным способам, например, орально, инъекции внутривенные, внутрибрюшинные, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутримышечно, интраокулярно, интраартериально, интрапортально, интралезиональным путем, интрамедулярно, интратекально, интравентрикулярно, трансдермально, подкожно, внутрибрюшинно, интраназально, энтерально, местно, сублингвально, уретрально, вагинально или ректально, с помощью средств непрерывной доставки или путем имплантируемых средств. При желании композиции могут вводиться инъекцией болюса или непрерывно - инфузией или с помощью имплантируемого средства.
Альтернативно или дополнительно - композиции могут вводиться локально путем имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором желаемая молекула адсорбирована или инкапсулирована. Если используется имплантируемое средство, то оно может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, и доставка желаемого вещества происходит посредством диффузии, выделения с течением времени из болюса или непрерывного введения.
В некоторых случаях желательно использовать фармацевтические композиции ех νίνο способом.
Тогда клетки, ткани или органы, которые были удалены у пациента, выдерживают в фармацевтических композициях, после чего указанные клетки, ткани и/или органы впоследствии имплантируют обратно пациенту.
В других случаях, связывающий агент настоящего изобретения, такой как пептидное антитело, может быть доставлен имплантированием определенных клеток, были генетически трансформированы с помощью методов, подобных тем, что описаны здесь, чтобы экспрессировать полипептид и обеспечить его выделение. Такие клетки могут быть животными или от человека, они могут быть автологичными, гетерологичными или ксеногенными. Необязательно клетки могут быть иммортализованными. Для того чтобы уменьшить возможность иммунологической реакции, клетки могут быть инкапсулированы с тем, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. Инкапсулирующие материалы должны быть в целом совместимыми, полупроницаемыми полимерными контурами или мембранами, которые позволяют выделяться белковому продукту (продуктам), но предохраняют от деструкции клетки за счет иммунной системы пациента или других причиняющих вред факторов окружающих тканей.
Фармацевтические композиции, содержащие связывающие агенты настоящего изобретения, вводят субъекту для лечения какого-либо миостатинзависимого расстройства. Они включают расстрой
- 30 009056 ства, связанные с потерей мышечной массы, включая (но не только) мышечную дистрофию, потерю мышечной массы при раке, СПИД, мышечную атрофию, ревматоидный артрит, почечную недостаточность/уремия, хроническую сердечную недостаточность, продолжительный постельный режим, поражения позвоночника, удар и обусловленную старением саркопению. Кроме этого, эти компоненты вводят при лечении ожирения, диабета, гипергликемии и для увеличения плотности костей.
Далее изобретение описано с помощью нижеследующих примеров, которые предназначены для иллюстрации и не носят ограничивающего характера.
Пример 1.
Идентификация миостатинсвязывающих пептидов
Для того чтобы выбрать фаг, связывающий миостатин, использовали библиотеки трех нитчатых фагов: 'ΓΝ8-ΙΧ (5х109 изолированных трансформантов), 'ΓΝ12-Ι (1,4-10 изолированных трансформантов) и линейный (2,3 х109 изолированных трансформантов) (Эуах Согр.). Каждую библиотеку инкубировали на поверхностях с нанесенным миостатином и подвергли различным процедурам дифференцированного отделения: неспецифическое элюирование и специфическое элюирование с использованием рекомбинантного химерного 11В/Рс рецептора активина человека (К & Ό 8ук!етк, 1пс, Мтпеаро11к, Мтпеко1а) или элюирование пропептидом миостатина, как описано ниже. Для всех трех библиотек проводили элюирование фагов в первом раунде селекции неспецифическим путем, в то время как рецептор и промиостатин использовали во втором и третьем раундах селекции. Операции по селекции проводили, как описано ниже.
Получение миостатина
Миостатиновый белок получали рекомбинантным путем в Е.сой К-12 штамм 2596 (АТСС # 202174) следующим образом. Полинуклеотиды, кодирующие человеческий промиостатин, клонировали в рАМО21 векторе экспрессии (АТСС №98113), который был получен из вектора экспрессии рСРМ 1656 (АТСС № 69576) и экспрессионной векторной системы, описанной в ϋδ патенте № 4710473, с последующей процедурой, описанной в опубликованной международной заявке на патент ШО 00/24782. Полинуклеотиды, кодирующие промиостатин, были получены на основе экспрессионного вектора млекопитающего. Кодирующая область была амплифицирована стандартным ПЦР методом и следующих ПЦР праймеров для того, чтобы включить сайт рестрикпии для Ν^ I и ВатН1.
5'- праймер:
5'- СгАСАСАСАССАТАТСААТСгАСААСАбТСтАССАААААС-З' (8Е() ГО Νο:
292
3'-праймер :
5'-АОАОАСССАТССАТТАТОАОСАСССАСА<ЗССеТС-3' (8Ες ГО Νο:293)
ПЦР продукт и вектор подвергли перевариванию обоими ферментами, смешали и лигировали. Продукт лигирования был трансформирован в Е.сой штамм # 2596. Одиночные колонии подвергали микроскопированию с целью проверки на экспрессию рекомбинантного белка в виде телец включения. Плазмиду выделяли и секвенировали кодирующую область рекомбинантного гена, чтобы удостовериться в генетической точности.
Бактериальную массу получали путем ферментации в объеме 10 л периодическим способом при 37°С. Культивирование начинали с Н8Ь при плотности клеток 9,6 ΟΌ600 и собирали клеточную массу спустя 6 ч при плотности 104 ΟΌ600. Эту пасту хранили при -80°С. Пасту Е.сой, экспрессирующую промиостатин, лизировали с помощью микрофлюидизирующего устройства при 16000 пси, центрифугировали, чтобы выделить фракцию нерастворимых телец включения. Тельца включения ресуспендировали в гуанидин-хлориде, содержащем дитиотреитол, и солюбилизировали при комнатной температуре. Затем разбавили все это в 30 раз водным буфером. Разбавленный таким образом промиостатин был затем сконцентрирован, буфер заменили на 20 мМ Трис рН 8,0 и нанесли полученный раствор на колонку с анионообменным сорбентом. Элюцию с анионообменной колонки проводили хлоридом натрия в повышающемся градиенте. Фракции, содержащие промиостатин, собирали. Промиостатин, продуцированный в Е.сой, получается с пропуском первых 23 аминокислот и начинается с метионина перед остатком 24 аспарагина. Чтобы получить зрелый миостатин, собранный промиостатин был энзиматически расщеплен в точке между пропептидом и С-концом зрелого миостатина. Получившуюся смесь затем нанесли на С4- грИРБС колонку, используя увеличивающийся градиент ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты. Фракции, содержащие зрелый миостатин, собрали и высушили в скоростной вакуумной сушилке.
Рекомбинантный зрелый миостатин, полученный с помощью Е.сой, подвергли исследованию с помощью миобластов С2С12, и установили, что он полностью активен по сравнению с рекомбинантным мышиным миостатином, полученным в системе клеток млекопитающего (К & Ό 8ук!етк, 1пс, Мтпеаройк, Мтпеко1а). Полученный на основе Е.сой, зрелый миостатин использовали в исследованиях фагового дисплея и скринирования, описанных ниже.
- 31 009056
Получение пробирок с покрытием миостатина
Миостатин иммобилизовали на 5 мл 1ттипо™ ТиЬек (пробирках) (НυNС) при концентрации 8 ид миостатина в 1 мл 0,1 М натрий карбонатного буфера (рН 9,6). Покрытые миостатином 1ттипо™ ТиЬек инкубировали в вертикальном положении при встряхивании (на качалке) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем 1ттипо ТиЬе с покрытием миостатина блокировали добавлением 5 мл 2% молочного ΡΒδ и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч при встряхивании. Полученную в результате 1ттипо™ ТиЬек с покрытием миостатина затем трижды промыли ΡΒδ прежде, чем подвергнуть процедурам отбора. Другие 1ттипо ТиЬек были также подготовлены для негативного отбора (без миостатина). Для каждой отсеивающей (проверочной) процедуры от пяти до десяти 1ттипо™ ТиЬек были подвергнуты выше описанной подготовке за исключением того, что вместо миостатина на 1ттипо™ ТиЬек наносили покрытие с помощью 1 мл 2% ΒδА-ΡΒδ.
Негативный отбор
Для каждого режима отсеивания около 100 произвольных эквивалентов ТЖ-ΙΧ и ТД12-1 библиотек (5х10п рГи для ΊΝ8-ΙΧ и 1,4x10 для ТД12-1) и около 10 случайных библиотечных эквивалентов линейной библиотеки (2,3 х 1010 рГи) были отобраны аликвотами из фонда библиотеки и разбавлены до 1 мл ΡΒδТ (ΡΒδ с 0,05% Твин-20). 1 мл разбавленной дозы фонда библиотеки добавили к 1ттипо™ ТиЬе, подготовленной для негативного отбора, инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в вертикальном положении. Фаговый супернатант отделяли и добавляли во вторую 1ттипо™ ТиЬе для другой стадии негативного отбора. Таким образом осуществляли от 5 до 10 стадий негативного отбора.
Отбор по связыванию миостатина
После последней стадии вышеописанного негативного отбора фаговый супернатант добавляли к приготовленным 1ттипо ТиЬек с покрытием миостатина. 1ттипо ТиЬе инкубировали при вертикальном встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре, позволяя определенному фагу связаться с миостатином. После отбрасывания супернатанта 1ттипо™ ТиЬе промывали около 15 раз 2% молочным ΡΒδ, 10 раз ΡΒδТ и дважды ΡΒδ во время трех раундов селекции со всеми тремя библиотеками (ΈΝ8IX, ΊΝ12-Ι и линейной библиотеками) за исключением того, что во втором раунде отбора (селекции) с ТЖ-ΙΧ и ΊΝ12-Ι библиотеками 1ттипо™ ТиЬе промывали около 14 раз 2% молочным ΡΒδ, дважды 2% ΒδА-ΡΒδ, 10 раз ΡΒδТ и один раз ΡΒδ.
Неспецифическая элюция
После последней промывочной стадии связанные фаги элюировали с 1ттипо™ ТиЬе добавлением 1 мл 100 мМ раствора триэтиламина ^1дта, δΐ. Ьошк, Мткошг) с 10-минутным инкубированием при вертикальном встряхивании. рН содержащего фаг раствора был затем нейтрализован 0,5 мл 1М ТрисНСЬ (рН 7,5).
Элюция связанного фага рецептором (активиновым рецептором человека)
Во время раундов 2 и 3, после последней промывочной стадии связанные фаги элюировали с 1ттипо™ ТиЬе добавлением 1 мл 1цМ рецепторного белка (рекомбинантный человеческий активиновый рецептор ΙΙΒ/Ес химерный, В & Ό δуκΐетκ, 1пс, М1ппеаро11к, Мтпекой!) с 1-часовым инкубированием для каждого режима.
Элюция связанного фага пропептидом
Во время раундов 2 и 3, после последней промывочной стадии связанные фаги элюировали с Ιιηтипо™ ТиЬе добавлением 1 мл 1цМ пропептида (полученного, как указано выше) с 1-часовым инкубированием для каждого режима.
Амплификация фага
Свежую культуру Е.сой (ХЬ-1 Бке МВЕ’) выращивали до ОО600=0,5 в ΕΒ среде, содержащей 12,5 ид/т1 тетрациклина. Для каждого режима отсеивания 20 мл этой культуры охлаждали на льду и центрифугировали. Осадок бактерий ресуспендировали в 1 мл раствора тш А солей.
К концентрированным образцам бактерий добавляли по отдельности пробы от смеси, полученной в результате различных способов элюции, и инкубировали при 37°С в течение 15 мин. 2 мл NΖСΥМ среды (2 х NΖСΥМ, т.е. ид/мл ампициллина) добавляли к каждой смеси и инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Полученные 4 мл раствора наносили на большую NΖСΥМ агаровую плашку с содержанием 50 ид/т1 ампицилина и инкубировали в течение ночи при 37°С.
Каждую из смесей бактерии/фаги, которые выращивали на больших NΖСΥМ агаровых плашках, счищали в ΕΒ среду объемом по 35 мл и агаровые пластинки промывали дополнительно 35 мл ΕΒ среды. Полученную смесь бактерии/фаги в ΕΒ среде центрифугировали, чтобы осадить массу бактерий. 50 и1 фагового супернатанта переносили в новую пробирку, добавляли 12,5 мл ΡЕС раствора (20% ΡЕС 8000, 3,5 М ацетат аммония) и инкубировали на льду в течение 2 ч, чтобы осадить фаги. Осажденные фаги отцентрифугировали и перерастворили в 6 мл ресуспензирующего фаги буфера (250 мМ ЖС1, 100 мМ Трис рН 8, 1мМ ЭДТА). Этот раствор с фагами затем очищали центрифугированием для удаления оставшихся бактерий и осаждением фагов, добавляя во второй раз 1,5 мл ΡЕС раствора. После стадии центрифугирования осадок фагов ресуспендировали в 400 и1 ΡΒδ. Этот раствор подвергали конечному
- 32 009056 центрифугированию, чтобы отсеять остатки клеток бактерий. Получившийся фаговый препарат оттитровывали стандартным методом образования бляшек (Мο1еси1а^ (Ίοιιίιιρ, Машайз е! а1., 3-г6 Εάΐίΐοη).
Дополнительные режимы селекции и амплификации
Во втором раунде амплифицированный фаг (1011 рГи) от первого раунда использовали как исходный для осуществления стадии селекции и амплификации. Амплифицированный фаг (1011 рГи) от второго раунда в свою очередь использовался как исходный фаг для осуществления третьего раунда селекции и амплификации. После стадии элюции третьего раунда небольшую фракцию элюированного фага высевали на чашки, как в вышеупомянутом методе бляшкообразования. Отдельные бляшки были собраны и помещены на 96-луночный планшет для микротитрования, содержащий 100 и1 ТЕ буфера на лунку. Эти планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи, чтобы обеспечить элюцию фагов в ТЕ буфер.
Анализ клонов Фаговый ЕЫ8А
Клоны фагов подвергли методу фагового ЕЫ8А и затем секвенировали. Последовательности были ранжированы как указано ниже. Фаговый ЕЫ8А осуществляли следующим образом.
Культуру Εχο1ΐ ХЙ-1 В1ие МКЕ' культивировали до достижения ОВ600 0,5. 30 и1 этой культуры аликватно было внесено в каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрования. 10 и1 элюированного фага добавляли в каждую лунку для инфицирования бактерий в течение 15 мин при комнатной температуре. Около 120 и1 ЬВ среды, содержащей 12,5 ид/т1 тетрациклина и 50 ид/т1 ампициллина, добавили в каждую лунку. Планшет для микротитрования затем инкубировали при встряхивании в течение ночи и при 37°С. Миостатин (3 ид/т1 в 0,1 М натрий карбонатном буфере, рН 9,6) наслаивали в 96-луночные ΤΕιχίεοιρ™ планшеты (ΝΗΝν) в течение ночи при 4°С. В качестве контроля в отдельный ΤΕιχίεοιρ™ планшет был наслоен 2% В8А, приготовленный на РВ8.
На следующий день жидкостной слой в ΤΕιχίεοιρ ™ планшетах с нанесенными белками удаляли, трижды промывали их РВ8 и в каждую лунку для блокирования наносили по 300 и1 2% молочного раствора при комнатной температуре в течение 1 ч. Молочный раствор удаляли и лунки три раза промывали РВ8 раствором. После последней промывки в каждую лунку ΤΕιχίεοιρ™ планшетов, содержащих покрытие из белка, добавляли около 50 и1 РВ8Т-4% молочного раствора. Около 50 и1 культур, полученных в течение ночи, из каждой лунки в 96-луночном планшете для микротитрования перенесли в соответствующие лунки планшетов с покрытием миостатина, а также контрольных планшетов с покрытием 2% В8А. 100 и1 смеси в двух типах планшетов инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Жидкость из ΤΕιχίεοιρ ™ планшетов отбрасывали, а лунки три раза промывали РВ8Т и два раза РВ8. НКР-конъюгированные анти-М13 антитела (Атегзйат РйагтаОа Вю1есй) разбавили примерно до 1:7500 и 100 и1 разбавленного раствора добавили в каждую лунку ΤΕιχίεοιρ™ планшетов и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Затем жидкость снова удаляли и лунки три раза промывали РВ8Т, а затем два раза РВ8. 100 и1 Ιπιιηί Ο1ο™ Сйет^1ит^иеδсеиΐ 8иЙ8йа1е (ККЙ) добавили в каждую лунку νΐίΐχίεοιρ ™ планшетов и инкубировали в течение около 5 мин для протекания реакции. Хемилюминесцентная доза ΤΕιχίδοιρ™ планшетов считывалась специальным считывающим устройством (йай 8уз1:ет).
Секвенирование фаговых клонов
Для каждого клона методом ПЦР была приготовлена матрица. Следующая олигонуклеотидная пара использовалась, чтобы амплифицировать 500-нуклеотидный фрагмент: праймер #1:5'СООСОСААСТАТСООТАТСААОСТО-3' (8Ер ΙΟ №: 294) и праймер #2:5'САТОТАССОТААСАСТОАОТТТСОТС-3' (8ЕР II) NО: 294). Следующие смеси готовили для каждого клона
реагенты Объем (цл)/пробирка
дистиллированная вода 26,25
50% глицерин 10
10Х ПЦР буфер ( М§С12) 5
25 мМ М§С12 4
10 мМ 6ΝΤΡ смесь 1
100 мМ праймер 1 0,25
100 мМ праймер 2 0,25
Тад полимераза 0,25
Фаг в ТЕ (секция 4) 3
Конечный реакционный объем 50
- 33 009056
Термоциклер (Степе Атр РСК 8уз1ет 9700, АррНес1 Вюзуз1ет) использовался для прогона следующей программы: [94°С в течение 5 мин; 94°С за 30 с; 55°С за 30 с; 72°С за 45 с]хЗО циклов; 72°С в течение 7 мин; охлаждение до 4°С. РСК продукт от каждой реакции очищали с помощью (ДАс|шск МиШхуеП РСК Рипйсайоп 1<ίI ((^адеи) согласно инструкции производителя. Очищенный РСК продукт проверяли, пропуская 10Х и1 каждой РСК реакционной смеси вместе 1и1 красителя (10 ВВХ8 агарозный гель с нанесенным красителем) в 1% агарозном геле. Оставшийся продукт был подвергнут секвенированию с помощь ΑΒΙ 337 8ес|иепсег (Регкт Е1тег) согласно рекомендациям и инструкциям производителя.
Выравнивание последовательностей и анализ
Последовательности пептидов, которые были транслированы с нуклеотидных последовательностей, соотнесли с данными ΕΕΙ8Α. Были идентифицированы клоны, которые показали высокие значения люминесценции в миостатин - покрытых лунках и низкую хемилюминесцентность в лунках с покрытием 2% В8А. Идентифицировались последовательности, которые встречались несколько раз. Кандидатные последовательности, отобранные по этим критериям, подвергали дальнейшему анализу как пептидные антитела. Проанализировали приблизительно 1200 индивидуальных клонов. Из них приблизительно 132 пептида были отобраны для получения пептидных антител настоящего изобретения. Они представлены в табл. I, приведенной ниже. Пептиды с 8 ЕС) ГО ΝΟ: 1-129 использовались для производства пептидных антител того же наименования. Пептиды с 8 ЕС) ГО ΝΟ: 1-141, показанные в табл. I, включают два или несколько пептидов с 8 ЕС) ГО N0: 130-132, соединенных линкерной последовательностью. 8 ЕС) ГО N0: 130-141 использовались также для производства пептидных антител того же наименования.
Консенсусные последовательности устанавливали по ΤΝ-8 группе пептидов:
КРХСХХАУНАУМСКРХ
АУХХСХХХОРАУСХЛХ
1ХС?СХАУАУРХХСУХХ
ХХАУСУ8РХАУРСХХХ ХХХСРАУЕАХХСУРАУ
Во всех вышеприведенных консенсусных последовательностях подчеркнутые «коровые последовательности» из каждой консенсусной последовательности представляют собой аминокислоты, которые всегда находятся в этих положениях, «X» означает любую встречающуюся в природе или модифицированную аминокислоту. Два цистеина, не выходящие из границ коровой последовательности, были зафиксированными аминокислотами в ΤΝ8-ΙΧ библиотеке.
(Зед 1ΡΝο:142)
ГО Νο:143) (8ец ГО Νο:144) (8ец ГО Νο.145) (8ед!Р Νο:146)
Таблица I Наименование пептида /8Е() ГО N0/ Последовательность пептида
Миостатин-ТХ8-Соп 1 1 КРКСКМАУНАУМСКРР
Миостатин-ТХ8-Соп2 2 КРЬСАМАУНАУМСКРР
Миостатин-ΤΝ 8-СопЗ 3 КРЬСКМАУКАУМСКРР
Миостатин-ΤΝ 8 -Соп4 4 КРЕСКММГОУ'МСКРК
Миостатин-ТХ8-Соп5 5 АУУРСУЕРНРАУСУРЬ
Миостатин-ТХ8-Соп6 6 АУУРСУЕСНРАУСУРЬ
Миостатин-ТХ8-Соп7 7 1РССКАУААГОУС)СУС)Р
Миостатин-ТХ8-Соп8 8 1Р6СКАУАУРУРСУ(^Р
Миостатин-ΤΝ 8 -Соп9 9 АРАУСУ δΡΝΑΑΤΟΜνΜ
Миостатин-ТХ8-Соп 10 10 НКРСРАУАУАЬРСАУРР
Миостатин-ΤΝδ-1 11 КРЬСКМАУНАУМСКРР
Миостатин-ТХ8-2 12 1РКСА1АУСАУМСРРЕ
Миостатин-ТЛ8-3 13 АУУРССЕГСМАУСЬКУ
Миостатин-ТХ8-4 14 АУРТСЬАУЖРЖ
Миостатин-ТХ8-5 15 НТРСРАУРАРЬСУЕАУ
Миостатин-Т№8-6 16 КЕАУСАУКАУКАУМСКРЕ
Миостатин-ТМ8-7 17 РЕТСР8АУАУРСЬР1
Миостатин-ТХ8-8 18 АУКСЕАМЭАУОСАУАУЕ
Миостатин-ТШ-О 19 Х8АУСЕРС)АУНКСАУАУЕ
Миостатин-ΤΝ 8-10 20 АУЗАСУАСНРАУСУРЬ
Миостатин-ΤΝδ-11 21 АЯАУСУЗРМУГСМУМ
Миостатин-ΤΝδ -12 22 АУТЕХУС)ОЕЕАУСАУХЕ.
Миостатин-ΤΝδ-13 23 ЕЖСЕКАУКАУМСРРК
Миостатин-ТП8-14 24 АУЬРСНС)ЕОРАУСМ№
-34009056
Мностатин-ΤΝδ-15 25 зтмсзрупутлсмре
М ио стати н-ΤΝ8-16 26 1Е6СШ¥УГОУГ)СУрЕ
Миостатан-ΤΝδ-Ι Ί 27 ггоскужтлрсуш
Миостатин-ТП8-18 28 РОУ'СТОРОУУРСКЕЖ
Μ иостатин-ΤΝδ-19 29 ОСНСТКЖРЖМСРРУ
Миостатин-ТЖ-20 30 Υ'ΟΕΟΥΚΕΟΤννΟΈΟΤ
Миостатин-1Ы§-21 31 УЕОСУСРОЕКСУ^Р
Миостатин-ΤΝ 8-22 32 СУКСРКОНЬТ/СЕУР
Миостатин-ΤΝ8-23 33 НУАСбУЖЖСКУЛ'
Мио стати н-ΤΝ8-24 34 ораснзрууудусуео
Миостатин-1Ы8-25 35 ТТЛ'С18РМД¥ЕС8ОР
Миостатин-ΤΝ 8-26 36 НКРСРРААГРСУГОР
Миостатин-ТП8-27 37 РО\УСУ8РКУА’СЫМУ’
Миостатин-1Т48-28 38 УУ'К СНУ’РОМРСЕРТ
Мностатин-ΤΝδ-29 39 ККНСрГУ'ТУ'МСАРК
Миостатин-ТЖ-ЗО 40 ЖРССЗТЬЕЖЗУИЕ
Миостатин-ТЖ-31 41 У^РСУОНУЕУСУП
Миостатин-ТЖ-3 2 42 8У'МСОРРКЕУСМУГУ
Миостатин-ΤΝ 8-33 43 1еМЬСМ1НРУГСКРН
Миостатин-ТЖ-34 44 ТКТСЖАУРУ’МСРРТ
М иостата н - ΤΝ8 -3 5 45 ννθΟΚ\¥ΥΕΑ\νεΥΝΚ
М и остати н -ΤΝ 8 -3 6 46 РШСТрЗУАЛУМСРРТ
М и о стати н-ΤΝ 8-3 7 47 ВЗЖРУ/УРТЗСАТЕ
М и остати Η-ΤΝ8-3 8 48 НГУСЖАММКСУЕМ
Миостатин-ТЖ-3 9 49 Ж(2С1УГЕСКС1УГ
М и остати н-ΤΝ 8-4 0 50 ААУКСМУТЗОУСТРС
Ми остати н-ΤΝ 8-41 51 УФКСЕЬОАЕЖСТЗУ
Миостатин-ТЖ-42 52 ЕК1СрМЛУ83УМСАРР
Миостатин-ΤΝ 8-43 53 УТУСНЕЬЖЗЕСТЕР
М ио статин-Т№-44 54 Г\УКСАЮ11ЖСКВУ
Ми остати н -ΤΝ 8-45 55 №οοκλνΥΕνν/α·τγ
М и остати н -ΤΝ 8-46 56 ГОЕСКМУТОСМСУРР
М иостатин-ΤΝ 8 -47 57 ЕМРСИГУ^СУ/МСРРУ
Миостатин-ТТ412-1 58 УТКСУЕТ61УОУГ8ЕСР6Ь
Миостатин-ТМ12-2 59 СР8СТГ6ЕОЕГУУОС8РГ
М иостатин-ΤΝ 12-3 60 ЬРУ/СНОрУКАОАУСРСМЕЗУ
Миостатин-ТМ12-4 61 УРТСЗЕКРУЖСрТСУЕЛУ
Мио статин -ΤΝ 12 - 5 62 ЬОРСРШНОРУ/РОУСУУАУ
Мностатин-Т1912-6 63 ΡΓΡΟΕΤΗ(}Ι8\νΕ(3ΗϋΕ8Ε
М иостатин-ΤΝ 12-7 64 НУ^СЕОЕМЖУ/НРЕСККР
Миостатин-ΤΝ 12-8 65 ЬРЕСОАНММРТЮГСУАУ
Миостатин-ТТ412-9 66 8Ηλ¥ΟΕΤΤΕλ¥ΜΝΥΑΚϋνΐΤΑ
Миостатин-ТЫ12-10 67 ЕРКСТНУРЕОООаГСЬХУУ
Миостатин-ΤΝ 12-11 68 Р8 8СЖРУЖООМРСУЕУ
Миостатин-ТМ12-13 69 ЗНКСЕУЗСУЪрРТСУКР
1Миостатан-Т№2-14 70 РУЖССЮ^У0НМЕНСО8Р
Миостатин-ΤΝ 12-15 71 УТКСМЕМЛ8ГОАЕрСУ8У
М иостатин-ΤΝ 12-16 72 РОАСКОрРУгуМЕМОСМЕС
Миостатин-ТТ412-17 73 ' ЕЪАСЕУЕРЕЕСГОЗ
Миостатин-ТЫ12-18 74 ; 8АУСПТЕ8ОРУУЕСУРЬ
Миостатин-ΤΝ 12-19 75 ! Р81СЕ8У8ТМУТРМСр№
Миостатин-ТМ12-20 76 ЖПСНООЗУ'АЖГКМСКЗН
Миостатин-ТМ12-21 77 ΥΕΝ0νΜΜΝΤ8ΡΕνΕ0νΕΝ
Миостатин-ΤΝ 12-22 78 тржтосемкзрсгтсмру
-35 009056
Миостатин-ΤΝ 12-23 79 РРУСТЗУЬКОРКРЛУКСЗУЗК
Миостатин-ΤΝ 12-24 80 ЬРЬС\ЪКЕ18ЕГУрАСУЬР
Миостатин-ΤΝ 12-25 81 8РЕС.АРАК\УЬС1ЕрСОКР
Миостатин-ΤΝΙ 2-26 82 ΥΡΟΟΓΝΙΉΙΧΕλνΤΕΟΡΥΤ
Миостатин-ΤΝ 12-27 83 КЛУКСЕГУОБЕРЬРКСУТР
Миостатин-ΤΝ 12-28 84 ЬУОСРРТЛУНКСКЬР
Миостатин-ΤΝ 12-29 85 АСЗУСНУЗУСЕМРСМССЗАЬ
Миостатин-ΤΝΙ 2-30 86 ННЕСЕАУМАК^МЗЬРСУОЬ
Миостатин-ΤΝ 12-31 87 РРМС61АСМКРРРРСУУ/У
Миостатин-ΤΝ 12-3 2 88 КРРСТЕЗУРЕ^УЬЗУКЬСЕКР
М иостати н-ΤΝΙ 2-3 3 89 УМРСЗУЬРОУЗКЕАСрЬР
Миостатин-ΤΝ 12-34 90 АШУСЕрСРЗУЙУСМСМАУ
Миостатин-ΤΝ 12-3 5 91 КТУССККА^ООЕАСАКА
Миостатин-ΤΝ 12-36 92 нкусттмсрзмкитсзуяр
Миостатин-ΤΝΙ 2-37 93 ХРЬСАМ \νσ\νΚΝΤΙ\νθρΝ8
Миостатин-ΤΝ 12-38 94 РРРСрМЖОМЬрЗЬСКЬЬ
Миостатин-ΤΝ 12-39 95 3ΥΥΡΟΝνΡΝΕΕΕ8σΤΟΚΕΡ
Миостатин-ΤΝ 12-40 96 УСРСРСОЧНУ/МУ/РРТСЕЗЬ
Миостатин-ΤΝΙ 2-41 97 СЗУМСНРРЬНРАУСАТСОРР
М иостатин-ΤΝ 12-42 98 УРНСМРОСНЕРЕУНСЕЗР
Миостатин-ΤΝ 12-43 99 ΑΥΧνΟΥΗΟζΚίνΚΡ
М иостатин Έ шеаг -1 100 8ΕΗΨΤΡΤΡ\νΡ6ΝΕν/\ννΚΡΡ
.Мио стати н-Ьш еаг- 2 101 МЕМЬР8ЬРЕЬЬКРМУР18КА
М иостати н - Ьт еаг- 3 102 ЗРРЕЕАЬМЕЗУЬОЗУрУСКРТ
М иостати н-Е теаг-4 103 5ΡΕΝΤΕΝΡΕΥΙΕΜΤΚΟΕΥΓΥΟ
.Миостатин-Етеаг-5 104 ΡΗΥΉΕΟΙΡΡΗννΤΡΥδΥΡΚΜ
!миостатин-Ь1пеаг-6 105 ККЬЬЕ0РМКРЬАЕЬУ86Н8
М иостати н-Ьш еаг-7 106 РТКРАЬР0ЕРУЕЕУК8КЬУ1
М и остати н-Ьт еаг- 8 107 КМ8ААРКРЬТУКР1МР9УЗУН
М и о стати н -Етеат-9 108 ΝΡΚΑΗΡΡΕΜΡΜΡΡνί-ΙΝΡνΕδ
Миостатин-Ешеаг-10 109 (Ж АОКЮСЬУ/ЕЬЬОЗ ΙΚΝς
Миостатин Έ ш еаг-11 110 МЬЗЕРЕЕРЬСМУНКрЕА
М иостати н-Ь ΐ пеаг-12 111 ΥΤΡΚΜΟ8 Ε\νΤ8 РЗУНКГКШУЬ
Миостатин-1лпеаг-13 112 ЬЖ)ТЕЕКЕЬКМУЬР8Ь8РМК
Мио стати н-Ьшеаг-14 113 ЕРУЕКГ>ЬМКД¥ЬЕСЕМ.(?8ААТ
Миостатин-Ьшеаг-15 114 Η11Θ\\Τ\ΑΤΚΚ€τ8ΑΡ0ν/ΡΕΑλνν
М и остати н-Етеаг-] 6 115 УЕЗЬНОЕС/МУ/ЬРрКЬА 86ΡΗ
Миостатии-Ьгпеаг-17 116 КАТЬЬКРРУ/рЬУЕОУаРЦ
М иостати н-Ьшеаг-18 117 ЕЕЬЬКЕРУКРУЗАРРУ
М иостати н -Ь теаг-19 118 СгЕЕРЕР8НР1АЕрРУрМР(ЗО
Миостатин-Ьшеаг-20 119 УКЕМЗМЬЕОЬЕРУЬЕКЬОНУ
Миостатин-Ьшеаг-21 120 ΗΝ880ΜΕΕ8ΕΕΙΜΕνθ8ΜΜς
;Миостатин-Ьтеат-22 121 ίλνΚΕΗΓΕΝ5ΡΥΙΚΡΚΠΑΤΡΟ
Μ иостати н -Ьше аг-23 122 ОррруУЕРРЕРАрЕЕУУЛА
Миостатин-Етеаг-24 123 ЕРРН\УЕНЫНК8 Е νΝΗλΥΕΡΜΝ
Μ и остати н -Ь ι пеаг -2 5 124 ΕΑΕΡζ)ΝΡΡΚΡνΕΤΕ8ΕΚΕΥ
Мио стат и н-Е1 пе аг-26 125 ОУЗУЕррЗУМТУРКЕМСЬНУрУ
М и остати н-Етеаг-27 126 ΝρΚΜΜΕΕΡΕΥΤΗΜΤΡΜΡΟΚδ
Мио стати н -Ьш еаг-2 9 127 РЬРЕЬКАЕЬЗКНУАЬРРЬРЕ
М и остати н - Ьш е аг- 3 0 128 СКЫЕСЬЬХЕЬМОЬЕТРМРР
Миостатин-Ьтеат-31 129 1ЕЬЬРЕУККРЗУК8У/Р
Миостатин-2хТЛ8-19 кс 130 рОНСТКУ/РУТИСРРУСЗСЗАТС Ст868ТА88С8С8АТСрСНСТКУ/
-36009056
РУ/МСРРУ
Μποοτητηη-2χΤΝ8-οοπ6 131 АУУРСУЕОНЕА¥СУОЕО8<38ТА88 08С8АТО\УУРСУЕОНЕ\УСУОЕ
Миостатин-2хТУ8-5 кс 132 НТРСРкЕЖЕСАТЖОЗСЗАТСтСт 8(Э8ТА88О8О8АТОНТРСРУТАР ЬСУЕУ’
Миостатин-2хТИ8-18 кс 133 РОЖ1ГОРВ^ШЖЕШ38С8АТО О8<л8ТА88С8О8АТОРтУСГОРО ЖУСКЕАУ
Миостатин-2хТМ8-11 кс 134 АЕП¥СУ8РЯД¥ГСМУМО8О8АТ6 Θ8Ο8ΤΑ8 8Θ8Ο8 АТОАРАУСУЗР ЕГкЕСМУМ
Миостатин-2хТЫ8-25 кс 135 РПУ/СГОРШтСКЕ\УО8С8АТС О8О8ТА88О8С8АТОРО\УСГОРО ААУСКРк
Миостатин-2хТЪГ8-23 кс 136 Н^АССУУТШСГОУУСЗбЗАТ СС8О8ТА88С8С8АТСНЛУАС(лУ кРШСКДУУ
Миостатин-ТУ8-29-19 кс 137 ККНСрПУТЗУМСАРКОЗОЗАТО О8С8ТА88О868АТОрСНСТ1Ш РУ'МСРРУ
Миостатин-1Ы8-19-29 кс 138 рСНСТКкРкМСРРУСЗСЗАТС А8О8ТА88С18С18АТ6ККНСС)1\У ТЛУМСАРК
Миостатин-Т18[8-29-19кп 139 ККНСрПУТАУМСАРКС8С8АТО О8О8ТА88О8О8АТСр<ЗНСТКАУ РАУМСРРУ
Миостатин-ТИ8-29-19-8§ 140 ККНСрПУТкМСАРКОССббССт ОрОНСТКАУРУ'МСРРУ
Миостатин-Т148-19-29-6§с 141 рОНСТК\УР>МСТРУООС6ОО ККНСфТУГПУМСАРК
Пример 2. Получение пептидных антител.
Конструкция ДНК, кодирующей пептид Ес слитые белки
Пептиды, способные связывать миостатин, применялись сами по себе или в комбинации с какимлибо другим, при этом ставится цель создать слитые белки, в которых пептид слит с Ес доменом человеческого 1дО1. Аминокислотная последовательность Ес части каждого пептидного антитела является следующей (от аминосодержащего конца к карбоксисодержащемуся концу):
ОКТНТСРРСРАРЕЬЬСОРЗУГЬГРРКРКПТЬМККТРЕУТСУУУОУ δΗΕΟΡΕνΚΕΝλνΥνΏσνΕνΗΝΑΚΤΚΊ’ΚΕΕφΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕ НфОкАЖЖЕУКСКУБККАЬРАРШКТККАКОрРИЕРрУУТЕРРЗ КВЕЕТКУ0У8ЬТСЕУКС;ГУР8О1АУЕУУ5УС}рРЕУУУКТТРРУЬ П8ОС8ГГЕУ8КЕТУОК8КШ^ОИУЕ8С8УМНЕАЕН1ЧНУТ9К8Е8 Ь8РОК (8ες ГО Νο: 296)
Пептид был слит в Ν-конфигурации (пептид был присоединен к Ν-концам Ес области). Сконфигурации (пептид был присоединен к С-концу Ес области) или в Ν, С-конфигурации (пептид был присоединен к обоим Ν- и С-концу Ес области). Для экспрессии Ν- концевых слияний и С- концевых слияний использовали разные (отличающиеся) векторы. Каждое пептидное антитело получали отжигом пар олигонуклеотидов («ОЛИГО») к нуклеиновой кислоте отобранного фага, чтобы получить двухцепочную нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид. Эти полинуклеотидные молекулы были сконструированы как фрагменты от Арак до Хйо1. Фрагменты лигировали или в рАМО21- Ес Νтерминальный вектор для Ν-концевой ориентации, или в рАМО21- Ес-С-терминальный вектор для Сконцевой ориентации, который был предварительно переварен АраЫ и Хйо1. Получившиеся в результате лигированные смеси электропорацией вводили в клетки Е.со11 штамм 2596 или 4167 (й§бК - вариант клеток штамма 2596) с помощью стандартных процедур. Затем клоны скринировали на способность продуцировать рекомбинантный белковый продукт и на наличие гена слияния с правильной нуклеотидной последовательностью. Для каждого из модифицированных пептидов был отобран такой единичный клон.
Много конструкций было создано с использованием альтернативного вектора, обозначенного рАМО21-2 х Β§Ν (2еоК)Ес. Этот вектор подобен вышеописанному вектору за исключением того, что векторное переваривание осуществляли с помощью В§т В1. В некоторых конструкциях сливали пеп
- 37 009056 тидные последовательности на обоих концах Ес. В таких случаях вектор был композицией рАМС21-2 х ВзА' (^οΚ^ и рАМС21 -2 хВз-С-Ес.
Конструкция рАМС21
Экспрессионную плазмиду рАМС21(АТСС №98113) получали из вектора экспрессии рСЕМ1656 (АТСС № 69576) и экспрессионной векторной системы, описанной в и8 патенте 4710473, с последующей процедурой, описанной в опубликованной Международной заявке на патент \\’0 00/24782, которые приведены здесь как ссылки.
Ес ^терминальный вектор
Ес ^терминальный вектор был сконструирован с помощью рАМС21 Ес С1у 5 Тро вектора в качестве матрицы. 5' РСК праймер (ниже) был предназначен для перемещения Тро пептидной последовательности рАМС21 Ес С1у 5 и замены ее полилинкером, содержащим АраЫ и ΧΙιοΙ сайты. Используя этот вектор как матрицу, проводили РСК с использованием Ехраис! Ι,οης Рο1уте^азе, а также следующего 5'-праймера и универсального 3'-праймера.
’ праймер: 5 ’ - АС АААС АААС АТ АТСОСТСС АС АСАААОСССССОС ААААА АА СТССАОООТССАОССССТССССАСА-З’ (δες ГО Νο: 297)
3’ праймер: 5’-ОСТСАТТАСТССАСССОАТС-3’ (δες ГО Νο: 298)
Полученный РСК продукт был очищен с помощью геля и переварен рестрикционными ферментами NάеI и Взг ΟΙ. И плазмида, и полинуклеотид, кодирующий интересующий пептид, вместе с его линкером были подвергнуты гелевой очистке с помощью Спарен (Сйаίзνο^ίй, СА) гелевых вращающихся колонок. Плазмида и инсерт были затем лигированы с помощью стандартных процедур лигирования, и получившейся лигированной смесью трансформировали клетки Е/^й (штамм 2596). Отбирали отдельные клоны и проводили секвенирование ДНК. Идентифицировали подходящий клон и использовали его как основу для вектора для модифицированных пептидов, описанных здесь.
Конструирование Ес С-концевого вектора
Ес С-концевой вектор был сконструирован с помощью рАМС21 Ес С1у 5 Тро вектора как матрицы. 3' РСК праймер был предназначен для перемещения Тро пептидной последовательности и замены ее полилинкером, содержащим АраЫ и ΧΙιοΙ сайты. РСК проводили, используя Ехра^ Ροης Рο1утегазе, а также с помощью универсального 5'-праймера и 3'-праймера.
5' Праймер: 5'-ССТАСАССТТТАСССААСААААТСС-3' (8Ер ГО N0: 299)
3' Праймер: 5'-ТТТСТТССАТССАТТАСТССАСТТТТТТТССССССССТ ТТСТСТССАССАССАССТССАССТТТАС-3' (8Ер ГО N0: 300)
Полученный РСК продукт был очищен с помощью геля и переварен рестрикционными ферментами Взг ΟΙ и ВатН1. И плазмида, и полинуклеотид, кодирующий каждый интересующий пептид вместе с его линкером были подвергнуты гелевой очистке с помощью С)1аеел1 гелевых вращающихся колонок. Плазмида и инсерт были затем лигированы с помощью стандартных процедур лигирования и получившейся лигированной смесью трансформировали клетки Е.^й (штамм 2596). Штамм 2596 (АТСС Ψ 202174) представляет собой штамм Η.οο1ί К-12, модифицированный и содержащий 1их промотор и два лямбда чувствительных к температуре репрессора, с1857з7 и 1ас 1^ репрессор. Отдельные клоны отбирали и проводили секвенирование ДНК. Идентифицировали подходящий клон и использовали его как основу для каждого описанного здесь пептидного антитела.
Экспрессия в Η.οο1ί
Культуры каждого из рАМС21-Ес слитых конструктов в Ρ.οο1ί (штамм 2596) выращивали при 37°С в Теглйс ВгоШ среде (см. Тагк)Г а η 6 11()ЬЬз, «I ηιρΓοννχΙ те61а ίο г ςϊΌνίης р1азт16 а η 6 сюзит! с^иез», ВеШезйа Кезеагсй ЬаЬз Еοсиз, Vο1ите 9, раде 12, 1987, упомянутый в вышеуказанной ссылке 8ι:^γοοΕ еί а1.). Индукция экспрессии продукта гена от 1ихРК промотора достигалась вследствие добавления синтетического аутоиндуктора, ^р-оксогексаноил^ОЕ-гомосеринлактона, в культуральную среду до конечной концентрации 20 нанограмм на миллиметр (нг/мл). Культуры инкубировали при 37°С еще 6 ч. Бактериальные культуры затем проверяли микроскопированием на присутствие телец включения и собирали центрифугированием. В полученных культурах наблюдались рефрактивные тельца включения, что свидетельствует о том, что в нерастворимой фракции в Η.οο1ί более всего продуцируются, видимо, продукты Ес-сливания. Клеточный осадок лизировали, ресуспендируя его непосредственно в йаеттй буфере, содержащем 10% β-меркаптоэтанола, и анализируя его затем с помощью 81)8-РЛСЕ. В большинстве случаев на 808-РАСЕ геле наблюдалась полоса, интенсивно окрашенная кумасси, характерная для соответствующей молекулярной массы.
Сворачивание (складкообразовательное) и очистка пептидных антител
Клетки разрушали в виде (1/10 объема на объем), применяя гомогенизацию под высоким давлением (3 прогона при 15000 пси), и собирали тельца включения центрифугированием (4000 об/мин в 1-6В за 30 мин). Тельца включения солюбилизировали в 6М гуанидине с 50 мМ Трис, 8 мМ ΏΤΤ, рН 8,0 в течение 1 ч при соотношении 1/10 и при комнатной температуре. Солюбилизированную смесь разбавили в 25 раз 4М мочевиной с 20% глицерина, 50 мМ Трис, 160 мМ аргинина, 3 мМ цистеина, 1 мМ цистамина, рН 8,5. Эту смесь инкубировали в течение ночи на холоде. Смесь затем подвергли диализу
- 38 009056 против 10 мМ Трис рН 8,5,50 мМ №С1, 1,5 М мочевины. После диализа в течение ночи рН диализата подрегулировали до рН 5 уксусной кислотой. Осадок удаляли центрифугированием, а супернатант наносили на 8Р-8ерБагозе Раз! Р1оу колонку, уравновешенную 10 мМ №Ас, 50 мМ №С1, рН 5,4°С. После загрузки колонку промывали до базовой линии 10 мМ №Ас, 50 мМ №С1, рН 5,2. Затем через колонку пропускали 20 колоночных объемов ацетатного буфера с повышающимся градиентом 50 мМ-500 мМ №С1. Или же после промывки до базовой линии колонку промывали 5 объемами 10 мМ натрий фосфата рН 7,0 и затем пропускали 15 объемов фосфатного буфера с повышающимся градиентом ХаС1 0-400 мМ. Фракции с колонки анализировали с помощью 8Э8-РАОЕ. Собирали фракции, содержащие димерное пептидное антитело. Фракции затем анализировали гель-фильтрацией, чтобы определить, есть ли какие-нибудь агрегаты.
Ряд пептидных антител был получен на основе пептидов табл. II. Пептиды присоединяли к молекуле Рс 1дО1 человека с получением пептидных антител, приведенных в табл. II. Что касается пептидных антител табл. II, то С-конфигурация показывает, что указанный пептид присоединен к С-концу Рс. Ν-конфигурация говорит о том, что указанный пептид присоединен к Ν-концу Рс. Ν, С-конфигурация говорит о том, что один пептид присоединен к Ν-концу, а один - к С-концу каждой Рс молекулы. Обозначение 2х означает, что два указанных пептида тандемно соединены между собой и присоединены к N или С-концам Рс молекулы или к обоим ее концам одновременно через указанный линкер. Два пептида, тандемно соединенные, разделенные линкером, обозначаются, например, как Миостатин - ΤΝ829-19-8д, что означает, что ΤΝ8-29 присоединен через (д1у)8 линкер к ΤΝ8-19 пептиду. Этот пептид(-ы) присоединены к Рс через последовательность (д1у)5 линкера, если иное не указано.
В некоторых случаях пептиды соединяются через к линкер. Линкер, обозначенный как к или 1к, означает линкерную последовательность дздза!ддздз!азздздза!д (8ЕО II) NО: 301), причем кс относится к линкеру, присоединенному к С-концу Рс, а Кп относится к линкеру, присоединенному к Ν-концу Рс. В табл. II, приводимой ниже, в колонке 4 приведены линкерные последовательности, соединяющие Рс с первым пептидом, а 5-ая колонка относится к конфигурациям Ν или С или ΝΌ.
Так как молекула Рс в растворе димеризуется, пептидное антитело, сконструированное так, чтобы включать один пептид, будет в действительности димером с двумя копиями пептида и двумя Рс молекулами, а 2х версия, имеющая два пептида в тандеме будет фактически димером с четырьмя копиями пептида и двумя Рс молекулами.
Так как пептидные антитела, представленные в табл. II, экспрессируются в Е.соН, первым аминокислотным остатком является Ме! (М). Поэтому пептидные антитела Ν-конфигурации представляют собой Ме!-пептид-линкер-Рс или Ме!-пептид-линкер-пептид-линкер-Рс, например. Пептидные антитела С-конфигурации представляют собой, например, Ме!-Рс-линкер-пептид или Ме!-Рс-линкер-пептидлинкер-пептид. Пептидные антитела С, Ν-конфигурации являются сочетанием обеих конфигураций, например Ме!-пептид-линкер-Рс-линкер-пептид.
Нуклеотидные последовательности примерных пептидных антител приводятся в табл. II. Последовательности полинуклеотидов, кодирующих примерные пептидные антитела настоящего изобретения, включают нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность Рс, такую как, например, следующая:
5’-САСААААСТСАСАСАТСТССАССТТОСССАССАССТ6ААСТС СТОСССОСАСССТСАОТТТТССТСТТССССССААААСССААОСАСАСССТСА ТСАТСТСССССАССССТСАСОТСАСАТССОТССТСбТСбАССТСАСССАСС ААСАСССТСАССТСААОТТСААСТССТАССТССАСССССТССАОСТССАТА АТСССААОАСАААССССССССАССАОСАОТАСААСАССАССТАСССТСТС СТСАСССТССТСАСССТССТОСАССАССАСТОССТСААТСССААССАСТАС ААСТОСААССТСТССААСАААОСССТСССАССССССАТСОАОААААССАТС ТССАААОССАААССССАСССССОАСААССАСАСОТСТАСАСССТССССССА ТССССОСАТСАССТСАССААОААССАССТСАСССТСАССТСССТОСТСААА СССТТСТАТСССАОССАСАТСССССТССАОТООСАСАССААТССОСАОССО САСААСААСТАСААСАССАССССТССССТССТССАСТСССАССССТССТТС ТТССТСТАСАОСААССТСАССОТООАСААОАССАССТСОСАОСАСОСОААС ОТСТТСТСАТОСТСССТСАТССАТСАОССТСТССАСААССАСТАСАСССАСА АСгАСгССТСТСССТСТСТСССССТААА-З’ (δες ГО Νο: 301)
Кроме того, полинуклеотиды, кодирующие ддддд линкер, включают последовательность, такую как, например, следующая: 5'-ООТООАООТООТООТ-3' (8ЕР ГО NО: 302).
Полинуклеотид, кодирующий пептидное антитело, также включает кодон, кодирующий метионин АТО и стоп-кодон, такой как ТАА.
Следовательно, структура первого пептидного антитела в табл. II такова: Т\’8-Соп 1 в Сконфигурации, а (д1у)5 линкер следующий: М-Рс-ООООО-КЭКСКМ-АИАМСКРР (8Е() ГО NО: 303).
Примерные нуклеотиды, кодирующие это пептидное антитело, должны быть
- 39 009056 ’ - АТООАСААААСТС АС АС АТСТСС АССТТОССС АОС АССТСАА
СТССТООООООАССОТСАОТТТТССТСТТССССССААААСССААООАСАСССТСАТС АТСТСССОСАССССТ6АС;СТСАСАТ(зС6ТОСгТ6СгТ6САССТ6АСтССАССА.А(ЗАССС ТОАООТСААОТТСААСТООТАСОТООАСООСОТООАООТОСАТААТОССААОАСА ААОССОСООСАОСАССАСТАСААСАОСАСОТАССаТОТСОТСАОСОТССТСАССО ТССТОСАССАООАСТООСТСААТООСААООАОТАСААОТОСААОСТСТССААСАА АОСССТСССАОСССССАТСОАОААААССАТСТССАААСССАААОбОСАССССССА ОААССАСАСОТОТАСАСССТОСССССАТСССОООАТОАбСТОАССААОААССАООТ САОССТСАССТОССТССТСАААООСТТСТАТСССАбСбАСАТССССОТбСАСТССО АСАОСААТОСОСАОСССОАСААСААСТАСААОАССАСОССТСССОТОСТСОАСТС СОАСООСТССТТСТТССТСТАСАОСААОСТСАСССТООАСААСАОСАООТООСАСС АООООААССТСТТСТСАТОСТССОТСАТССАТОАООСТСТОСАСААССАСТАСАСО САОААСАСССТСТСССТОТСТСССООТАААОаТСОАООТОбТСЮТААОАСАААТОС ААААТСТООСАСТООАТОТОСАААССОССС-З’ (ЗедГОИо: 304)
Таблица II
Наименование пептидных антител Пептид Нуклеотидная последовательность (δες ГО Νο)
Миостатин-ΤΝδсоп1 КГЖСКМУМШМСКРР АААСАСАААТССААААТСТОССАСТО САТСТССАААСССССб (δες. ГО Νο: 147) 5 НУ С
Миостатин-ΤΝδсоп2 К1)ЕСАМ\¥Н%-МСКРР ААА6АССТОТССОСТАТСТОССАСТС САТОТОСАААССОССО (δες. ГО Νο; 148) 5§1У с
Миостатин-ΤΝδ- сопЗ КВЕСКМАКЛУМСКРР АААОАССТСТОСААААТСТОСАААТО САТСТОСАААССОСС6 (δες ГО Νο: 149) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδ соп4 ШЛАКМАНЗТМСКРК АААОАССТОТОСААААТСТООСАСТО ОАТСТССАААССОААА (δες ГО Νο: 150) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδсоп5 ЗУУРСУЕРНРДУСУОЬ ТОСТАСССОТССТАССААТТССАСТТС ТССгТСгСТАССАССТС (δες ГО Νο: 151) 5 Ну с
Миостатин-ТЫ8соп5 \А¥РСУЕГНРАСТОЕ ТССТАССССТССТАСОААТТССАСТТС ТССТОСТАС6АССТ6 (δες ГО Νο: 152) 5 Ну N
Миостатин-ΤΝδсопб ЗЕУРСУЕСтНЕШСУТЬ ТСтСТАССССТСгСТАССЕААбСгТСАСТТС ТООТОСТАССАССТО (8ες ГО Νο: 153) 5 Ну С
Миостатин-ΤΝδсопб ^УРСУЕСННУСУОЬ ТООТАСССОТОСТАССААООТСАСТТС ТОСТОСТАССАССТС (δες ГО Νο: 154) 5 Ну N
Миостатин-ΤΝ 8 соп7 ιροεκλνν/ϋνρογρρ АТСТТСООТТОСАААТООТОООАССТТ САСТОСТАССАСТТС (δες ГО Νο: 155) 5 Ну С
Миостатин-ΤΝδсоп8 1РОСКУЛУОУОСУрР АТСТТСОСТТОСАААТОСТОСОАСОТТ САСТОСТАССАОТТС (8ες ГО Νο: 156) 5 Ну С
Миостати н-ΤΝ 8 соп8 ιροοκλνλνονοογςρ АТСТТСОСТТССАААТбОТОССАССТТ САСТССТАССАОТТС (δες ГО Νο: 157) 5 Ну N
Миостатин-ΤΝ 8 соп9 АОЗЕСУЗРМШЕСМУМ ОСТСАСТСгОТССОТТТСССССААСТОС ТТСТОСАТ6СТТАТО (δες ГО Νο: 158) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδсоп10 НКГСРЗУ\ААЬЕС\УОР САСАААТТСТССССбТСОТОСССТСТС ТТСТССТбССАСТТС (δεςΙΏΝο: 159) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝ 8 - 1 КГОЬСКМЧУШУМСКРР АААСАССТСТССААААТОТООСАСТС САТСТОСАААСССССО (δες ГО Νο: 160 5 Ну с
Миостатин-ΤΝ 8 - 2 ГОКСАПУОАУМСРРЬ АТС6АСАААТОС6СТАТСТООСОТТС ОАТСтеССССССССТС (δες ГО Νο: 161) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδз ЗУУРССЕРСКШСЬГУ ТСОТАССССТССОСТСААТТСОСТАТО ТООТОССТСААСОТТ (δες ГО Νο: 162) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝ 8 - 4 λνΡΤΟΕννΝΌΟΝΕ ТСгСТТСАССТОССТСТОСААСтеСОАС ААСОАА (δες ГО Νο: 163) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδ- 5 НТРСРУУРАРЕСУЕЗУ САСАСССССТОСССОТООТТСОСТССО СТСТОССТТСААТОС (δεςΙΌΝο: 164) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδ- 6 КЕ'Л'СУЗиСК'Л'МСКРЕ АААСААТССТССТООССТТОСАААТО САТСТССАААССООАА (8ες ГО Νο: 165) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδ- 7 РЕТСР8У7АУРС1ГО1 ТТСОАААССТОСССОТССТОСОСТТАС ТТСТОССТСтСгАСАТС (δεςΙϋΝο: 166) 5 Ну с
Миостатин-ΤΝδ- 7 РЕТСР8\УА¥РСЕ1)1 ГТССАААССТССССОТССТССОСТТАС ГТСТСССТОСАСАТС (δες ΙΟ Νο: 167) 5 Ну N
Миостатин-ΤΝδ- 8 А¥КСЕА¥ШГОСУЛУЕ ОСТТАСАААТОССААССТААСОАСТО ООбТТОСТООТООСТО (δεςΙΟΝο: 168) 5 Ну | С
Миостатин-ΤΝδ- 9 \τ5\νθΕΌς¥ΉΚ.Ο\νλνΕ ААСТССТССТСССААОАССАСгТСССА ССОТТОСТССТСбСТС (δεςΙϋΝο: 169) 5 Ну
- 40 009056
Миостатин-ΤΝδ- 10 УЗАСУАОНЕ^СТОЬ ТООТССОСТТССТАСОСТОСТСАСТТС ТООТОСТАСОАССТО (δεςΙΟΝο: 170) 5 е1у С
Миостатин-ΤΝ 8 - 11 АТГУСУЗРТГУЕСМУМ ОСТААСТООТСССТТТССССОААСТОО ТТСТОСАТООТТАТО (δες ГО Νο: 171) 5 §1у С
Миостатин-ΤΝδ- 12 УТЕСУрРЕГУСУКЬ ТОСАСССААТОСТАССАОСАССААТТ СТООТОСТООААССТО (8ες ГО Νο: 172) 5 §1у с
Миостатин-ΤΝ 8 - 13 ЕЖСЕКУКУМСРРК СААААСАССТОСОААСОТТООАААТО ОАТОТОСССОСССААА (δεςΙΌΝο: 173) 5 АУ с
Миостатин-ΤΝδ- 14 УЬРСНРЕОРУСМКР ТООСТСССОТСССАССАООААООТТТС ТООТССАТОААСТТС (8ες ГО Νο: 174) 5 §1у с
Миостатин-ΤΝδ- 15 ЗТМСЗрУНУМСМРЕ ТССАССАТОТССТСССАОТООСАСТОС АТОТОСААССССТТС (8ед ГО Νο: 175) 5 АУ с
Миостатин-ΤΝδ- 16 1РОСНУУЕ)\Т)СУрр АТСТТСООТТОССАСТОСТСОСАСОТТ 16АСТ6СТАССАСТТС (8εςΙΌΝο: 176) 5 §1у с
Миостатин-ΤΝδ- 17 1УОСКУУ1)1РСУ01 АТСТАСОСТТОСАААТСОТООСАСАТ ССАОТОСТАССАСАТС (δεςΙΌΝο: 177) 5 §1у с
Миостатин-ΤΝδ- 18 РОУСГОРОУУСКЕУ ССССАСТООТОСАТССАТСССОАСТО СТОСТОСАААТТСТСС (8ες ГО Νο: 178) 5 АУ с
Миостатин-ΤΝδ- 19 рОНСТКА¥РШ4СРР¥ 1 САОСОТСАСТОСАССССТТОСЗСССТС САТОТССССОСССТАС (8ες ГО Νο: 179) 5 &1у с
Миостатин-ΤΝδ- 20 !УрЕСУКЕОРУСЬрТ ТООСАОСААТОСТАСССТСААООТТТ СТСбТСССТОСЛСтАСС (8ες ГО Νο: 180) 5 §1у с
Миостатин-ΤΝδ- 21 УРОСУСРОРКСУ8Р ТСОТТСОАСТОСТАСООТССООСгТТТС АААТОСТОСТССССО (δεςΙΌΝο: 181) 5 81у с
Миостатин-ΤΝδ - 22 оувсрканьусьур ООТСТТСОТТОССССАААООТСАССТО ТОСТСССТСТАСССС (8ες ГО Νο: 182) 5 §1У с
Миостатин-ΤΝ 8 - 23 НУАССУУРУЗСКУУ САСТООССТТбСбСТТАСТООССОТОС ТССТОСАААТОСЮТТ (8ες ГО Νο: 183) 5 81у с
Миостатин-ΤΝδ- 24 СРАСНЗРУУУСУРС ОСТСССОСТТОССАСТССССОТОСТОО ТООТОССТТТТСССТ (δεςΙΌΝο: 184) 5 §1у с
Миостатин-ΤΝδ- 25 ТТУСКРМУРСЗОР АССАССТООТ6САТСТССССОАТОТОС ТТСТОСТСССАОСАС (δεςΙΌΝο: 185) 5 §1У с
Миостатин-ΤΝδ- 26 НКРСРРУА1РСУОР САСАААТТСТОССССССОТОООСТАТС ТТСТбСТСгССАСТТС (δεςΙΏΝο: 186) 5§1У N
Миостатин-ΤΝδ- 27 РОУСУЗРКУУСММУ ССОСАСТСОТОСОТТТССССбСОТТОО ТАСТССААСАТОТОС (8ες ГО Νο: 187) 5 АУ N
Миостатин-ΤΝδ- 28 УУКСНУРСМОСЕРТ ОТТТООАААТОССАСТООТТСОСТАТС САСТОСОААССОАСС (δεςΙΌΝο: 188) 5 В1У N
Миостатин-ΤΝδ- 29 ККНСрГУТУМСАРК ААААААСАСТСССАСРАТСТОСАССТО 6АТСТОСОСТССОААА (δες ГО Νο: 189) 5 е1у N
Миостатин-ΤΝδ- 30 УррСОЗТЕРУСУИЬ ТС6ТТССА6ТОС66ТТССАСССТСТТС ТвСТОСТАСААССТО (δες ГО Νο: 190) 5 §1у N
Миостатин-ΤΝδ- 31 У8РСУОНУЕУСУТ1 ТССТСССССТОСТАСОАССАСТАСТТС ТАСТОСТАСАССАТС (δες ГО Νο: 191) 5 е1у N
Миостатин-ΤΝδ- 32 ЗУМССЕГКЕУСМУУ ТССТСОАТОТОСОСТТТСТТСАААОАА ОТТТОСАТОТОООТТ (δες ГО Νο: 192) 5 ё1у N
Миостатин-ΤΝδ- 33 ЕМЕСМШРУРСМРН ОАААТССТОТОСАТОАТССАСССООТТ ГТСТОСААСССОСАС (δες ГО Νο: 193) 5 81у N
Миостатин-ΤΝδ- 34 СКТСЫЬА¥Р5¥МСРРЬ СТОААААССТОСААССТОТОСССОТа ЭАТСТССССОССОСТС (δες ГО Νο: 194) 5 ё1у N
Миостатин-ΤΝδ- 35 ; УУОСКУУЕАУСУЖ ЗТТОТТООТТОСАААТОСТАССААОСТ ГОСТОСТАСААСААА (δεςΙΌΝο: 195) 5 §1у N
Мио статин-ΤΝ 8 - 36 РШСТрУАУМСРРТ РСОАТССАСТССАСССАОТОООСТТОС АТОТ6СССОССОАСС (δεςΙΌΝο: 196) 5 йДу N
Миостатин-ΤΝδ- ОЗКСРУУРЬЗСУТР [ОАСТССААСТОСССОТОСТАСТТССТС 5§1у N
- 41 009056
37 ТССТОСОТТАТСТТС (5ες ГО Νο: 197)
Μηοοτητηη-ΤΝ8- 38 НГУУСКЕАММКСУЕМ САСАТСТОСТОСААССТООСТАТСАТО АААТОСОТТОАААТО (δεςΙΟΝο: 198) 5§1У N
Миостатин-ΤΝδ- 39 νεοοιυγεοκοιυγ ААССТОСАОТОСАТСТАСТТССТОООТ АААТСгСАТСТАСТТС (δες ГО Νο: 199) 5§1У N
Μ иостатин-ΤΝ 8 - 40 Азжсмитзпустрс ОСТТООСС.ТТбСАТОТССТТСТССОАС СТТТаСАССССОООТ (δες ГО Νο: 200) 5 §1У N
Миостати н-ΤΝ 8 - 41 ЖКСРЕПАНУУСТЗУ ТООТТТСОТГОТТТГСТТОАТОСТСАТТ ОСТОТАСТТСТОТТ (8ες ГО Νο: 201) 5 §1у N
Μ и остати Η-ΤΝ8 - 42 ЕК1СфМ\У8\УМСАРР ОААААААТТТОТСАААТОТООТСТТСО ЛТОТОТССТССЛССЛ (δες ГО Νο: 202) 5 &1у N 1 I
Миостатин -ΤΝ 8 - 43 \¥РУСНЬЖ8ЕСТЕР ТООТТТТАТТаТСАТСТТААТАААТСТ ОААТСТАСТОААССА (8ες ГО Νο: 203) 5е1у N ! 1
М иоста ти н-ΤΝ 8 - 44 РУУКСАГОГОКСККУ ТТТТСОСОТТСТССТАТТССТАТТОАТ АААТОТАААСОТСТТ (δες ГО Νο: 204) 5 §1у Ν 1
М иостатин -ΤΝ 8 - )45 ΝΣΟϋΚΡΎΕνλνΤΓΤΥ ААТСТТООТТОТАААТООТАТСААСТТ ТООТСТТТТАСТТАТ (3ες ГО Νο: 205) 5β1γ N
Ми остати! 1-ΤΝ8 - 46 ЮБСММТООМСУРР АТТОАТСТГТОТААТАТСТСОСАТООТ АТСТОТТАТССАССА (δες ГО Νο: 206) I N
Миостати -ΤΝ 8 - 47 ЕМРСКЛУСТУМСРРУ СААЛТОССАТаТААТАТТГООООТТОО АТ0Т6ТС САССА ОТТ (8ες ГО Νο: 207) 5 §1У _ N ί
Миостатин- ΤΝ12-1 \УРКСУЕТО1УТ>УУ8ЕСР σι. ТООТТССОТТОСОТТСТОАССООТАТС ОТТОАСТООТССОААТОСТТСаОТСТО (8ες ΙΟΝο:208) 5 Ду N '
Ми остати н- :ΤΝ12-2 ОГЗСТРОЕБЕГУ\Т)С8Р Р ООТТТСТССТОСАССТТСаСТСТООАС ОААТТСТАССТТСАСТОСТССССаТТС (δες ГО Νο: 209) 5 &1у N
Миостатин- ΤΝ12-3 еру»'СегоС)\с4аоу/сес МЬУУ СТСССОТОатОССАСОАССА ОСТТАА састоАСТоооотттстосАТССтста Ο (8ες ГО Νο: 210) 5ё1у N
Миостатин- ΤΝ12-4 γρτσδΕκτνίΥΟφτσν ьи? ТАСССОАССТОСТССОААААЛТТСТОС АТСТАССОТСАОАССТОСОТГСТОТСО (δες ΙϋΝο:211) 5 §1у Ν 1 ί
М иостатин- ΤΝ 12-5 ЬСРСРТННОРХУРрУСУ У\У СТсаОТССОТОССССгАТССАССАСаСТ 5 ё]у ССОТООССОСАСТАСТСС6ТТТАСТСО (δες ГО Νο: 212) ( 1 Ν | ί
М иостатин- ΤΝ 12-6 РГРСЕТНР18АУЕОНСЬ8 р : 1 СССТТСССОТОСОАААСССАССАСАТС ТССТОССТСООТСАСТСССТОТССТТС (δες ГО Νο: 213) 561у : Ν ί
М иостатин- ΤΝ 12-7 Н\¥ОСЕОЕ.М\¥2\УНРЕС №Р САСТООаОГТОСОААОАССТОАТОТО ; ОТССТСОСАСССОСТОТСССОТССТСС О (8ες ГО Νο: 214) 5 Ду Ν
Миостатин- ΤΝ12-8 ЕРЕСОАОММРТЮРСУ ΑΥ СТОССОСТОТСССАСОСТОАСАТОАТО ссоАССАТсаотттстасаттосттАС (δες Ιϋ Νο: 215) 1 5 В1У | Ν
Миостатин- ΤΝ12-9 ЗШ¥СЕТТР\УМНУАКС УНА ТСССАСТООТОСОАААССАССТТСТОО 5 ^1у АТОААСТАСОСТААЛТОСОТТСАСОСТ ' (δες ГО Νο: 216) | ί
М и остати н- ΤΝ12-10 ЕРКСТНУРРОООСТСЕ \УУ СТОССОАААТОСАСССАСОТТСССТТС 5 Ду ιΝ 1 САССАОСбТООТТТСТСССТОТООТАС (5ες ΙΟ Νο: 217) '
Миостатин- ΤΝ12-11 Р58СХУ5РУ8ВДОМРСТ ΐ РУ ί ГТСТССТССТОСТООТССССООТТТССС 5 §1у N ЗТСАООАСАТОТТСТаСОТТТТСТАС , 3εςΓΟΝο:218) 1
Миостатин- 8НКСЕУ8ОУ7ЬрРЬСУЯ ΤΝ12-13 Р ГСССАСАААТОСОААТАСТССООТТОС 5 §1у |Ν ЕТССАОССОСТОТОСТАСССТССС 1 ! δες ГО Νο:219) |
Миостатин- Ρνανθ(?ηΝΥνθΗΜΕΗ ССОТООТООТОССАбОАСААСТАССТ :5 §1у ,Ν ΤΝ12-14 СО8Р 'ТСАОСАСАТОСТОСАСТОССАСТСССС1 1 6 (8ες ГО Νο: 220)
-42009056
Миостатин- ΤΝ12-15 АУРКСМЬМШРБАРрС νδΥ ТООТТСССТТССАТОСТОАТОААСТСС ТТССАССтСТТТССАСТСССТТТССТАС (δες ГО Νο: 221) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-16 ΡΟΑΟΚΟςΡλνΥΜΡΜΟΟ мьс ССООАСОСТТСССОТСАССАОСССТО ОТАСАТОТТСАТОООТТОСАТОСТООС Т (8ες ГО Νο: 222) 5 £1у N
Миостатин- ΤΝ12-17 РЕАСРУЕРЕЕСРОЗ ТТССТООСТТаСТТСОТТСААТТССАА СТОТОСТТСОАСТСС (8ες ГО Νο: 223) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-18 ЗАУСПТЕЗОРУУЬСУР Е ТСС6СТТАСТОСАТСАТСАССОААТСС СтАСССОТАССтТТСТСтТПССтТТСССтСТСт (δες ГО Νο: 224) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-19 Р81СЕ8У8ТМ\¥ЕРМС(^ ΗΝ ССОТССАТСТОСОААТССТАСТССАСС АТ0ТС6СТССССАТСТСССАССАСАА С (8ες ГО Νο: 225) 5 §1У N
Миостатин- ΤΝ12-20 ^ЬБСНББЗАУАХУТКМ СК8Н ТООСТОСАСТОССАСОАСОАСТССТС СССТТООАССААААТОТОССОТТСССА С (8ες ГО Νο: 226) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-21 УЬИСУММИТЗРРУЕС νΓΝ I ТАССТОААСТОССТТАТОАТОААСАСС ТССССОТТСОТТОААТОСОТТТТСААС (δες ГО Νο; 227) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-22 [УРАУСООРМадОГГСМ ΡΥ ТАСССОТОСТОСОАСООТТТСАТСАТС САССАСССТАТСАССТССАТСТТСТАС (8ες ГО Νο; 228) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-23 ΡΟΥΟΤν/ΕΝΟΡΚϋλνΚΟ λνδκ ТТССАСТАСТОСАССТООСТОААСОСТ ТТСАААОАСТОСАААТОСТО6ТСССОТ (8ες ГО Νο: 229) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-24 ЬРЬаЩКЕКНУРАСУЬ Ρ СТСССССТОТОСААССТОАААСАААТ СТСССАСОТТСАООСТТОССТТСТСТТ С (8ες ГО Νο: 230) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-25 ЗРЕСАГАКЛУЬСНЕРСР КБ ТССССССААТССССТТТСССТСбТТОС СТОСОТАТС6ААСАСТОССАОСОТ6А С (8ες ГО Νο: 231) 5 81У N
Миостатин- ΤΝ12-26 ΥΡςΟΡΝΕΗΕΕΕλΥΤΕΟϋ λΥΡ ТАСССОСАСТОСТТСААССТОСАССТО СТООААТООАССОААТОСОАСТООТТ С (8ες ГО Νο: 232) 5 §1У N
Миостатин- ΤΝ12-27 КАЖСЕ1УБ8ЕРЬРКС¥7 РР ССТТСОССТТССОАААТСТАССАСТСС ОААТТССТОСССАААТОСТССТТСТТС (δεςΙΏΝο: 233) 5 ё1у N
Миостатин- ΤΝ12-28 ЕУ<ЗСОМУ\¥НК.СКЕР СТеСТТСОТТОСОАСААСОТТТООСАС ССТТОСАААСТСТТС (8ες ГО Νο: 234) 5§1У N
Миостатин- ΤΝ12-29 АОАУСНУТУОЕМРОМО С8АЬ ССТОСТТОСТОССАСОТТТОСгООТОАА АТОТТССОТАТОСОТТОСТССОСТСТС (8ες ГО Νο: 235) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-30 ННЕСЕ\УМАК\УМ8ЬО |САССАССААТОСОААТООАТООСТСО СУСЬ (ТТОСАТСТСССТООАСТОСбТТОСТСТ Ιθ (8ες ГО Νο: 236) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-31 РРМСО1АОМКБРОРСУ ;ттсссоатотосоотатсостоотатс ΨΥ АААОАСТТС6АСТТСТССОТТТООТАС Ι(8εςΙϋΝο: 237) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-32 ЕШБСТГАУРЕШЛУКЬС ЕКР .( СОТОАТОАТТОТАСТТТТТООССАСАА ГООСТТТОСАААСТТТОТОААСОТССА '8ες ГО Νο: 238) 5§1у N
Миостатин- ΤΝ12-33 УБРСЗУЬРСЗУЗКЕАСС) ' ТАТААТТТТТаТТСТТАТСТТТТТаСТб ЬР ТТТСТААА6АА6СТТСТСААСТТССА ϊ(8ες ГО Νο: 239) 5 81у N
Миостатин- ΤΝ12-34 ΑΗλνΟΕςΟΡν/ΚΥΟΝίε ι остсаттсототоаасааоотссато ΜΑΥ 6С6ТТАТССТААТАТТТ6ТАТООСТТА Т (δεςΙΏΝο: 240) 5 §1у N0
Миостатин- ΤΝ12-35 ) ΜΕνϋΟΚΙδΑν/ΟΟΕΑΟΑ,ΑΑΤΟΤΤαΤΤΤΟΤΘσΤΑΑΑΑΤΤΤΟΤΟΟΤ кА ТООСОТСАТСААОСТТОТССТССТОСТ (8ες ГО Νο: 241) 5 §1у N
- 43 009056
Миостатин- ΤΝ12-36 НЫУСТ1М6Р8МК1УГС ν/ΝΟ САТААТСТТТОТАСТАТТАТСООТССА ТСТАТОАААТООТТТТОТТООААТОАТ (δες ГО Νο: 242) 5 §1у N0
МиостатинΤΝ12-37 ΝΟΣΟΑΜλνΟΑνΕΝΤΙλνί ζ)Ν8 ААТОАТСТТТСТССТАТСТОССЮТТОС ССТААТАСТАТТТООТОТСААААТТСТ (δες ГО Νο: 243) 5 §1у N0
Миостатин- ΤΝ12-38 рррсрыояимьрзьск ьь ССАССАТТТТОТСААААТОАТААТОАТ АТОСТТСААТСТСТТТОТАААСТТСТТ (8ες ГО Νο: 244) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-39 жуиснурнЕидбьск ЬР ТСОТАТОАТТОТААТОТТССАААТОАА СТТСТТТСТООТСТТТОТСОТСТТТТТ (8ες ГО Νο: 245) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-40 УСОСИРЫНТ/МТ/РРТС Ь8Ь ТАТООТОАТТОТОАТСААААТСАТТОО АТОТООССАТТТАСТТОТСТТТСТСТТ (8ες ГО Νο: 246) 5 ё1у ΝΟ
Миостатин- ΤΝ12-41 СЖМСНРОЕЕГО9/6АТ срри ООТТООАТОТОТСАТТТТОАТСТТСАТ ОАТТООООТОСТАСТТОТСААССАОАТ (8ες ГО Νο: 247) 5 §1у N
Миостатин- ΤΝ12-42 УЕНСМЕООНЕЕЕУНСЕ ДР 1 ТАТТТТСАТТОТАТОТТТСОТОСТСАТ ОААТТТОААОТТСАТТОТОААТСТТТТ (8ες ГО Νο: 248) 5 §1у ΝΟ
Миостатин- ΤΝ12-43 АУЗУСЗУНОРСУКР ОСТТАТТООТОТТООСАТОСТСААТОТ ОТТСОТТТТ (δεςΙϋΝο: 249) 5 §1у N
Миостатин- Ыпеаг-1 δΕΗλνΤΕΤϋλνϋΟΝΕΨ λννκ,ρρ ТССОААСАСТООАССТТСАССОАСТОО ОАСООТААСОААТООТаООТТССТСС ОТТС (8ες ГО Νο: 250) 5 §1у N
Миостатин- Ьтеаг-2 МЕМЬОЗЕГЕЕЬКИМУР Ι8ΚΑ АТООАААТОСТООАСТСССТОТТСОАА СТОСТОАААОАСАТООТТССОАТСТСС АААОСТ (8ες ГО Νο: 251) 5 §1у N
Миостатин- Ыпеаг-3 δΡΡΕΕΑΡΜΕν/Ε(3\ν0Υ (ЖЕТ ТССССОССООААОААОСТСТОАТООА АТ6ОСТОО6ТТООСАОТАСООТАААТ ТСАСС (8ες ГО Νο: 252) 5 §1у N
Миостатин- Ыпеаг-4 8ΡΕΝΕΕΝΟΕΥΙΕΜΤΚΡ ЕУУУО ТССССООААААССТССТОААСОАССТ ОТАСАТССТОАТОАССАААСАСОААТ ССТАСОСТ (8ες ГО Νο: 253) 5 §1у N
Миостатин- Ыпеаг-5 ΡΡίν/ΕΕΟΙΡΡΗννΤΡΥδ УИКМ ТТССАСТОООААОААОСТАТСССОТТС САСОТТОТТАССССОТАСТССТАСОАС СОТАТС (δεςΙΟΝο: 254) 5 §1у N
Миостатин- Ыпеаг-6 ККЕЬЕРГМКИЕАЕЬУЗ ОН8 АААСОТСТОСТОСААСАОТТСАТОАА СОАССТООСТОААСТООТТТССООТСА СТСС (δες ГО Νο: 255) 5 §1у N
Миостатин- Ьшеаг-7 ΟΤΡΒΑΕΡρΕΡΥΕΡνΚδ РЕ VI САСАССССТСАСОСТСТСТТССАОСА АТТСТАСОААТТСОТТСОТТСССОТСТ ООТТАТС (δες ГО Νο: 256) 5 §1у N
Миостатин- Ыпеаг-8 КМЗААРКРЬТУКИПУГО ςγλνΗ ССТАТОТССОСТОСТССОСОТССОСТО АССТАСССТОАСАТСАТООАССАОТА СТООСАС (δες ГО Νο: 257) 5 §1у N
Миостатин- Ьшеаг-9 ΝϋΚΑΗΕΕΕΜΓΜΕϋνΗ ΝΓνΕδ ААСОАСАААОСТСАСТТСТТСОАААТ ОТТСАТОТТСОАССТТСАСААСТТСОТ ТОААТСС (δες Ιά Νο: 258) 5 §1у N
Миостатин- Ыпеаг-10 ρτοΛΟΚίοσίΛνΕίχοδ 1ΕΝ0 САОАСССАООСТСАОААААТСОАСОО ТСТСТООСААСТОСТССАСТССАТССО ТААССАС (δες ГО Νο: 259) 5 §1У N
Миостатин- Гдпеаг-11 МЕЗЕРЕЕРЬОНЕУНРр ΕΑ АТОСТОТССОААТТССААОААТТССТО ЗОТААССТООТТСАССОТСАООААОС Г (δες ГО Νο: 260) 5 §1у N
Миостатин- 1лпеаг-12 ΥΤΡΚΜΟδΕίΥΤδΓλΥΗΝ ЫНУЬ ГАСАСССССААААТ6ОСТТСС6ААТС ЭАССТССТТСТООСАСААССОТАТССА СТАССТО (δες ГО Νο: 261) 5 §1У N
Миостатин- Ьтеаг-13 РЕГОТЬЕРРЕЕКМУЕКЗЕ 8ИМК СТОААСОАСАСССТОСТОСОТОААСТ ЗААААТООТТСТОААСТСССТОТССОА Р'АТОААА (δεςΙΟΝο: 262) 5 §1У N
- 44 009056 βΐγ
Ν
МиостатинЬтеаг-14
РРУЕВРЕМКУ/ЕЕОРМ ςδΑΑΤ
МиостатинЬшеаг-15
ΗΗανΝΥΕΡΚΟδΑΡΟν РЕАХУу
МиостатинЬшеаг-16
УЕЗЕНРЬРМХУЬОРКЕ
Α8ΟΡΗ
МиостатинЫпеаг-17
ВАТЬЬКОР^ОЕУЕОУ
ΟΡΝ
МиостатинЬтеат-18
ЕЕЬЬВЕРУКРУЗАРРУ
МиостатинЬтеаг-19
ΟΕΕΡΕΡ8ΗΡΙΑΕζ)ΡΥζ)
МРОО
МиостатинЬтеаг-20
УКЕМЗМЬЕОЬЕОУЬЕК.
Εζ)ΗΥ
МиостатинЬтеаг-21
Н№8рМЕЕ8ЕЫМЬУО зммц
МиостатинЬшеаг-22
ХУКЕНРЬХЗРУШРКЫ
ΑΙΡΟ
МиостатинЬтеаг-23 ρΡΡΡΥνΡΡΡΕΡΑζ)ΕΕΥ νΐΑ
МиостатинЫпеаг-24
ЕРРШУЬНРНВЗЕУИН νΐΣ)ΜΝ
Миостатин1лпеаг-25
ТТСОАСОТТОААССТОАССТОАТОСОТ ТООСТООААООТТТСАТОСАОТССОСТ ОСТАСС (Зед ΙΡ Νο: 263)_____________
САССАСООТТООААСТАССТОСОТАА АООТТССОСТССОСАОТООТТСОААОС ТТОООТТ (Зед ΙΡ Νο: 264)____________
ОТТСААТСССТОСАССАОСТОСАОАТО ТООСТООАССАОАААСТООСТТССОО ТССССАС (Зед ДР Νο: 265)____________ ' СОТОСТАСССТОСТОАААОАСТТСТОО САОСТООГТОААООТТАСООТОАСАА С (8ед ΙΡ Νο: 266)______________________ ’ ОААОААСТОСТОСОТОААТТСТАССОТ
ТТССТТТССССТТТСОАСТАС (8ед ΙΡ Νο: 267)________________________________ ’ ООТСТОСТООАСОААТТСТСССАСТТС
АТСОСТОААСАОТТСТАССАОАТОССО
ООТООТ (8ед ΙΡ Νο: 268)_____________ 'ТАССОТОАААТОТССАТОСТООААОО
ТСТОСТООАСОТТСТООААСОТСТОСА
ОСАСТАС (Зед ΙΡ Νο: 269)____________
САСААСТССТСССАОАТОСТОСТОТСС ОААСТОАТСАТОСТООТТООТТССАТО АТОСА С (Зед ΙΡ Νο: 270)_____________
ТООСОТОААСАСТТССТОААСТССОАС' ТАСАТССОТОАСАААСТОАТСОСТАТС ОАСООТ (Зед ΙΡ Νο: 271)_____________
САОТТСССОТТСТАСОТТТТСОАСОАС ’ СТОССООСТСАОСТООААТАСТООАТС ОСТ (Зед ΙΡ Νο: 272)__________________
ОААТТСТТССАСТООСТОСАСААССАС ’ СОТТССОААОТТААССАСТООСТООАС АТОААС (Зед ΙΡ Νο: 273) §1у §1у ё!у
5§1у §1у §1у
81У §1У е1у 5 §1у
МиостатинЬтеаг -26
МиостатинЬтеаг-27
МиостатинЫпеаг-29
МиостатинЫпеаг-30
МиостатинЬшеаг-31
Миостатин2ХТЫ8-19кс ! ΕΑΕΡζ)ΝΡΡΒΡνΕΤΕδΕΚ ОААОСТСТТТТТСААААТТТТТТТСОТ
ΕΥ 6АТОТТСТТАСТСТТТСТОААСОТОАА !ΤΑΤ (Зед ΙΡ Νο: 274)___________________ ’ СААТАТТОООААСААСААТООАТОАС
ТТАТТТТСОТОААААТООТСТТСАТОТ
ТСААТАТ (8ед ΙΡ Νο: 275)____________ ' ААТСААСОТАТОАТОСТТОААСАТСТТ
ТСОСОТАТТАТОАСТССААТОТТТООТ
СОТТСТ (Зед ΙΡ Νο: 276)______________ ' ТТТСТТОАТОААСТТАААОСТОААСТТ
ТСТСОТСАТТАТОСТСТТОАТОАТСТТ ОАТОАА (Зед ΙΡ Νο: 277)_____________ ’ ООТАААСТТАТТОААООТСТТСТТААТ
ОААСТТАТОСААСТТОАААСТТТТАТО ССАОАТ (Зед ΙΡ Νο: 278)_____________
АТТСТТСТТСТТОАТОААТАТАААААА ОАТТООАААТСТТООТТТ (8ед ΙΡ Νο: 279)______________________________________
САОООССАСТОТАСТСОСТООССОТО ОАТОТОСССОССОТАСООТТСТООТТС СОСТАССООТООТТСТООТТССАСТОС
ТТСТТСТООТТССОСТТСТОСТАСТООТ
САСООТСАСТССАСТСОТТООССАТОО
АТОТСТССАСССТАТ (8ед ΙΡ Νο: 280)
ΟΥνΕΟΟνΜΤΥΡΚΈΝΟ
ЬНУЦУ
ΝςΚΜΜΕΕΌΕνΚΙΜΤΡ
ΜΡΟΚ.8
РЕВЕЕКАЕЬЗРНУАТР
РЬРЕ
СКЫЕОЬЕХЕЕМОЬЕТР
Ιμρρ !ЕШ)ЕУККРЧУК8Х¥Р
- ςοΗθτκ.νρ νΜΟΡΡ υο 8Ο8ΑΤΟΟ8Ο8ΤΑ88Ο8Ο ЗАТОЦОНСТВЗУРХУМС ,ΡΡΥ §1у §1У §1У е1у
5§1У §1у
1к
ΝΟ
ΝΟ
ΝΟ
Миостатин2ΧΤΝ8-ΟΟΝ6 νΥΡΟΥΕΟΗΡνΟΥΒΕΟ 80δΤΑδ80808ΑΤ0νΥ ΡΟΥΕΟΗΡΥ/ΟΥΡΙ, §1у
- 45 009056
Νο:281)
Миостатин- 2ΧΤΝ8-5 кс НТРСРЖАРЬСУЕТУОЗ О8АТОО808ТА88О8О8 АТОНТРСРЖАРГСУЕ САСАСТССОТОТССОТООТТТОСТССО СТОТОСОТТОААТООООТТСТООТТСС ОСТАСТООТОСТТССООТТССАСТОСТ ТСТТСТООТТССООТТСТОСААСТООТ САСАСССССТОСССОТООТТТОСАССО СТОТОТОТАОАОТОО (8ες ГО Νο: 282) 1к С
Миостатин- 2ХТЫ8-18кс РЦЖЖРОЖУСКГУУО 808АТ00808ТА88080 ЗАТОРОАУСЮРОЖУС КЕЗУ ССООАТТООТОТАТСОАСССООАСТО ОТООТОСАААТТСТООООТТСТООТТС СОСТАССООТООТТССООТТССАСТОС ТТСТТСТООТТССООТТСТОСААСТОО ТССООАСТООТОСАТССАСССООАТТО ОТООТОТАААТТТТОО (8ες ГО Νο: 283) 1к С
Миостатин- 2ΧΤΝ8-11 кс АЖУСУЗРМУЕСМУМ О8О8АТОО8О8ТА88О8 Ο8ΑΤΟΑΝλν0ν8ΡΝ\νΡ СМУМ ССООАТТООТОТАТСОАСССООАСТО ОТООТОСАААТТСТООООТТСТООТТС СОСТАССООТООТТССООТТССАСТОС ТТСТТСТООТТССООТТСТОСААСТОО ТССООАСТОСТОСАТСОАСССООАТТО ОТООТОТАААТТТТОО (8ες ГО Νο; 284) 1к с
Миостатин- 2ΧΤΝ8-25 кс РО\¥СГОРОЖ¥СКЖУО 8О8АТОО8О8ТА88О8О ЗАТОРЭТУСГОРОЖУС κπν АССАСТТООТОСАТСТСТССОАТОТОО ТТСТОСТСТСАССАОООТТСТООТТСС АСТОСТТСТТСТОСТТССООТТСТОСА АСТОСТАСТАСТТООТСТАТСТСТССА АТОТООТПТОТТСТСАОСАА (8ες ГО Νο: 285) 1к с
Миостатин- 2ΧΤΝ8-23 кс ШУАСОУ'УР'УЗСКЖУ О8О8АТОО8О8ТА88О8 СЗАТОНЖкССУЖР'Ж СКЖ/ САСТОООСАТОТООСТАТТООССОТОО ТССТОСАААТОООТТООТТСТООТТСС ОСТАССООТСОТТССООТТССАСТОСТ ТСТТСТООТТССООТТСТОСААСТООТ САСТОООСТТОСООТТАСТООССОТОО ТСТТОТАААТОООТТ ($еЧ ГО Νο: 286) 1к с
Миостатин-ΤΝ 8 - 29-19 кс κκΗοςπντννΜΟΑΡκσ 8О8АТОО8О8ТА88О8О ЗАТОООНСТКЛУРЖМС ΡΡΥ ААААААСАСТОТСАОАТСТООАСТТО ОАТОТОСОСТССОАААООТТСТООТТС СОСТАССООТООТТСТООТТССАСТОС ТТСТТСТООТТССООТТССОСТАСТОО ТСАОООТСАСТОСАСТСОТТООССАТО ОАТОТОТССОССОТАТ (8ες ГО Νο: 287) 1к с
Миостатин-ΤΝ 8- 19-29 кс φΟΗΟΤΚΨΡΨΜΟΡΡΥΟ 8О8АТОО8О8ТА88О8О 8АТОККНСЦ1ЖГ\УМС АРК САОООТСАСТОСАСССОТТООССОТО ОАТОТОСССОСССТАСООТТСТООТТС СОСТАССООТООТТСТООТТССАСТОС ТТСТТСТООТТССООТТСТОСТАСТООТ ААААААСАСТОССАОАТСТООАСТТО ОАТОТОСОСТССОААА (8ες ГО Νο: 288) 1к с
Миостатин-ΤΝδ- 29-19 кп ККНСОГЖГХУМСАРКО 8О8АТОО808ТА88О8О ЗАТОфОНСТКЛУРЖМС ! ΡΡΥ ААААААСАСТОТСАОАТСТООАСТТО ОАТОТОСОСТССОАААООТТСТООТТС СОСТАССООТООТТСТООТТССАСТОС ТТСТТСТООТТССООТТССОСТАСТОО ГСАОООТСАСТОСАСТСОТТООССАТО ОАТОТОТССОССОТАТ (8ες ГО Νο; 289) 1к N
Миостатин-ΤΝδ- 29-19-8§ ЕСКНСОПУТЖЛСАРКО зососоосонсткж <УМСРРУ ААААААСАСТОССАОАТСТООАСТТО ЗАТОТОСССТССОАААОСТОаТООТа ОТООТООСООТООССАООСТСАСТСС УСССОТТООССОТООАТОТОТССОССО ГАТ (δες ГО Νο: 290) 8 Ду С
Миостатин-ΤΝδ19-29-6дс К 1 ЭОНСТКЖЖМСРРУС ЗООООККИСЦПУТАУМ ΖΑΡΚ САОООТСАСТОСАСССОТТООССОТО ЗАТОТОСССОССОТАСООТООТООТО ЗТООТООСААААААСАСТОССАОАТС ГООАСТТООАТОТОСОСТССОААА 8ες ГО Νο: 291) | 6 Ду с
Пример 3. 1п У1!го исследования.
Анализ активности миостатина с использованием С2С12 клеток
Это исследование показывает, что способность исследуемого ингибитора нейтрализовать миостатин, определяемая степенью связывания миостатина с рецептором, ингибируется.
Линию миостатин-чувствительных маркерных клеток получали трансфицированием С2С12 миобластных клеток (АТСС ΝΟ:ΟΚΣ-1772) с помощью рМАКЕ-1ис конструкта. рМАКЕ-1ис конструкт получали клонированием двенадцати повторов САОА последовательности, представляющих собой элемен
- 46 009056 ты реакции на миостатин/активин (Оеппе1ег е! а1. ЕМΒО 17:3091-3100 (1998)), в р^ис-МСδ репортеорном векторе ^Ба1адепе са! ± 219087) в направлении выше ТАТА Ьох. Миобластные С2С12 клетки естественным образом экспрессируют на своей поверхности рецепторы на миостатин/активин. При связывании миостатина с клеточными рецепторами активируется δтаб путь обмена, и фосфорилированный δтаб связывает элемент ответа (МааакАШа е! а1. Се11 87,1215 (1996)), приводя к экспрессии гена люциферазы. Далее измеряется активность люциферазы с помощью коммерческого набора для исследования с меченой люциферазой (са! # Е 4550, Ρ^οтеда, МабБоп, ΑΙ) согласно инструкции производителя. Стабильную клеточную линию С2С12, которая была трансфицирована рМАВЕ - 1ис (С2С12/рМАВЕ клон # 44) использовали для измерения активности миостатина согласно следующей методике.
Равные количества репортерных клеток (С2С12/рМАВЕ клон # 44) помещали в лунки 96луночного планшета. Первый раунд скринирования, где использовали два разведения пептидных антител, проводили с миостатином в концентрации, зафиксированной при 4 нМ. Рекомбинантный зрелый миостатин преинкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с пептидными антителами при 40 нМ и 400 нМ соответственно. Культуру репортерных клеток обрабатывали миостатином в присутствии или без пептидных антител в течение 6 ч. Активность миостатина определяли, измеряя активность люциферазы в обработанных культурах. Этот анализ использовали для того, чтобы сначала идентифицировать попадания пептидных антител, которые ингибировали активность миостатина при исследовании репортерных клеток. Впоследствии получили девять точек калибровочной кривой при фиксированной концентрации миостатина 4 нМ. Миостатин преинкубировали с каждой из следующих девяти концентраций пептидных антител: 0,04 мМ, 0,4 нМ, 4 нМ, 20 нМ, 40 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 2 иМ и 4 иМ в течение 2 ч прежде, чем добавить смесь к культуре репортерных клеток. Величины ΙΟ50 для ряда примерных пептидных антител показаны в табл. ΙΙΙ, а для аффинно зрелых пептидных антител в табл. УШ.
Β^^ιό® анализ
Исследование аффинности каждого кандидатного пептидного антитела к миостатину выполняли на БМсоге® 3000 (Шосою, Шс., Ρ^8саΐа^ау, ΝΥ), аппарате, снабженном сенсорным чипом СМ5 и в котором 0,005% Р20 сурфактант ^асою, Шсх.) используется как проточный буфер. Рекомбинантный зрелый миостатиновый белок иммобилизовали на аналитическом СМ5 сенсорном чипе ^асою, Мс.) с помощью первичных аминогрупп, используя Атте СоирБпд КН ^асот, Шс.) в соответствии с инструкциями производителя.
Анализы по прямому связыванию использовались, чтобы отобрать и ранжировать пептидные антитела в соответствии с их способностью связываться с иммобилизованным миостатином. Анализы по связыванию выполнялись путем впрыскивания двух концентраций (40 и 400 нМ) каждого кандидатного миостатинсвязывающего пептидного антитела на поверхность с иммобилизованным миостатином со скоростью 50 μ л/мин в течение 3 мин. После 3-минутного периода поверхность регенеровали. Кривые связывания сравнивали по качеству с интенсивностью связывания, а также скоростью диссоциации. Кинетические параметры связывания пептидных антител, включая ка (постоянная скорости ассоциации), кб (постоянная скорости диссоциации) и Кс (постоянная равновесия диссоциации) определяли с помощью ΒΜ оценочной 3.1 компьютерной программы ^асою, Шс). Чем ниже константы равновесия диссоциации (выраженные в нМ), тем выше аффинность пептидного антитела к миостатину. Примерные величины Кс пептидных антител показаны ниже в табл. ΙΙΙ и табл. νΙ для аффинно зрелых пептидных антител.
Анализ блокирования на АсΐВIIΒ/Ρс поверхности
Исследования блокирования проводили, используя иммобилизованный АсΐВIIΒ/Ρс (В&И δу8ΐет8, М1ппеаро118, М№) и миостатин, в присутствии и в отсутствие пептидных антител с помощью БМсоге® аналитической системы. Исследования проводились, чтобы классифицировать пептидные антитела как ненейтрализующие (те, которые не предотвращают связывания миостатина с Ас!^®^) или нейтрализующие (те, которые предотвращают связывание миостатина с АсΐВIIΒ/Ρс). Базовую степень связывания миостатина с АсΐВIIΒ/Ρс сначала определяли без пептидного антитела.
Для первоначальных отборочных стадий пептидные антитела разбавляли до 4 нМ, 40 нМ и 400 нМ в пробе буфера и инкубировали с 4 нМ миостатина (также разбавленного в пробе буфера). Пептидное антитело: смесям лигандов давали достичь равновесия при комнатной температуре (по крайней мере 5 ч) и затем впрыскивали на поверхность с иммобилизованным АсΐВIIΒ/Ес в течение от 20 до 30 мин при скорости 10 и1/мин. Повышенная степень связывания (по сравнению с контролем без пептидного антитела) показывала, что связывание пептидного антитела с миостатином было ненейтрализующим. Пониженная степень связывания (по сравнению с контролем) показывала, что связывание пептидного антитела с миостатином блокировало связывание миостатина с АсΐВIIΒ/Ρс. Отобранные пептидные антитела далее характеризовали с помощью исследования блокирования всей серией концентраций для того, чтобы получить величины ΙΟ'50 (для нейтрализующих пептидных антител) или ЕС50 (для ненейтрализующих пептидных антител). Пробы антител серийно разбавляли с 200 нМ до 0,05 мМ в пробе буфера и инкубировали с 4 нМ миостатина при комнатной температуре, чтобы достичь равновесия (минимум - 5 ч) прежде, чем осуществить впрыскивание на поверхность с иммобилизованным
- 47 009056
АсЖПВ/Рс в течение 20-30 мин со скоростью 10 и1/мин. После вспрыскивания пробы связанным лигандам позволяли диссоциировать и отсоединиться от рецептора в течение 3 мин. Нанося показатели связывания против концентрации пептидного антитела, вычисляли величины 1С50 для каждого пептидного антитела в присутствии 4 нМ миостатина. Установлено, например, что пептидные антитела ΤΝ819, Ь2 и 1.17 ингибируют активность миостатина в исследовании на клетках, но связывание ΤΝ-8-19 не блокирует взаимодействий миостатин/Ас1К11В/Ес, показывая, что ΤΝ-8-19 связывается с другим эпитопом, отличающимся от эпитопов других двух пептидных антител.
Эпитопное связывание пептидных антител
Очищенное пептидное антитело иммобилизовали на КА^ге пше, чтобы захватить миостатин перед впрыскиванием второго пептидного антитела, и количество второго пептидного антитела, связанного с «захваченным» миостатином было установлено. Только пептидные антитела с отличающимися эпитопами будут связывать «захваченный» миостатин, таким образом давая возможность связывания пептидных антител с аналогичными или различающимися по эпитопам связывающими свойствами. Например, установлено, что пептидные антитела ΤΝ8-19 и Е23 связывают разные эпитопы миостатина. Анализ селективности
Эти анализы выполняли, используя ШАссие® технологию, для определения селективности связывания пептидных антител с другими представителями ΤΘΡβ-семейства. АсЖЛВ/Ес, ΤΘΡβΒΙΙ/Ес и ВМРК1А/Рс (все получены от К&1) ЗузГОшз, М^ииеарο1^8, М№) были ковалентно связаны с сенсорными чипами для исследований в соответствии с рекомендациями производителя. Благодаря ШАссие анализам детектируются изменение коэффициента преломления, разница между ответом, детектируемым при впрыскивании на поверхности с иммобилизованным рецептором, сравнивалась с ответом, детектируемым при впрыскивании на контрольную поверхность при отсутствии пептидного антитела, что показывает фактическое связывание Активина А, ΤΘΡβ1, ΤΘΡβ3 и ВМР4 с рецепторами, соответственно. При преинкубации пептидных антител и ΤΘΡβ3 молекул изменение (увеличение или уменьшение) реакции связывания говорит о том, что пептидное антитело связывается с представителями ΤΘΡβсемейства. Пептидные антитела настоящего изобретения все связываются с миостатином и не связываются с Активином А ΤΟΕβί, ΤΘΡβ3 и ВМР4.
ΚΐηΕχ А™ равновесный анализ
Для определения равновесия диссоциации (Ко) миостатинсвязывающих пептидных антител проводили исследования по равновесному связыванию в растворе с использованием КтЕх А™ технологии (Зарц|уие Iи8ΐ^итеиΐ8, 1ис.). Считается, что этот основанный на использовании растворов анализ во многих случаях более чувствительный, чем ШАссие анализ. Кеас11Ое1™ 6Х проинкубировали с примерно 50 ид/т1 миостатина в течение ночи, а затем блокировали ВЗА. Пробы, содержащие 30 пМ и 100 пМ пептидных антител инкубировали с миостатином в различных концентрациях (0,5 пМ - 5 нМ) в пробе буфера при комнатной температуре в течение 8 ч прежде, чем пропустить через покрытые миостатином гранулы. Количество связавшихся с гранулами пептидных антител количественно определяли с помощью флуоресцентно меченых (Су 5) антител козы к Ес человека при концентрации 1 мг/мл в суперблоке. Сигнал связывания пропорционален концентрации свободного пептидного антитела при равновесии с данной концентрацией миостатина. Ко устанавливали по нелинейной регрессий кривых, используя гомогенную модель одноточечного связывания с двумя графиками, представляемую К1иЕх А™ программным обеспечением (Зарц|уие Iи8ΐ^итеиΐ8, 1ис.).
Пример 4. Сравнение ингибиторов миостатина.
Способность трех потенциальных пептидных антител первого раунда связывать (Ко) и ингибировать (1С50) сравнивали с величинами Ко и 1С50, полученными для растворимого белка, слитого с рецептором АсЖПВ/Рс (К&1) Зу81етз, 1ис., М^ииеарο1^8, М!ии). Величины 1С50 определяли, используя анализ с помощью рМАКЕ1ис клеток, описанный в примере 3, а КБ определяли с помощью ΡίηοοίΌ® анализа, описанного в примере 3.
Таблица III
Ингибитор 1С50 (нМ) Ко (нМ)
АсГЕИВ/Рс -83 ~7
2хТИ8-19-КС ~9 ~2
ΤΝ8-19 -23 -2
ΤΝ8-29 -26 -60
ΤΝ12-34 -30 -
Ьтеаг-20 - И -
- 48 009056
Пептидные антитела имеют 1С50, лучшие по сравнению ингибитором рецептора/Ес, и аффинность связывания, которые сопоставимы у двух пептидных антител с рецептором/Ес.
Пример 5. Сравнение способности пептида и пептидного антитела ингибировать миостатин.
Следующая пептидная последовательность: ^СΗСΤΚ\Р\МСРРΥ (ТЖ-19) (8Е0 ΙΌ N0: 33) использовалась для создания соответствующего пептидного антитела ТШ-ЕДрЬ) согласно процедуре, описанной выше в примере 2. И сам пептид, и пептидное антитело проверяли на миостатинингибирующую активность, используя основанный на С2С12 анализ, описанный выше в примере 3. На фиг. 1 можно увидеть, что 1С50 (эффективная концентрация для 50%-го ингибирования миостатина) пептидного антитела значительно меньше, чем для пептида, так что способность пептида ингибировать активность миостатина существенно улучшена включением его в структуру пептидного антитела.
Пример 6. Создание аффинно зрелых пептидов и пептидных антител.
Несколько из пептидов первого раунда, использованных для создания пептидных антител, были отобрано по аффинной зрелости. Отобранные пептиды включали цистеин-ограниченный ТЖ-ЕЛ
ОСИ ΚΊΈ\\'Ε\\'\1(ΊΨΥ (ТЖ-19) (8ЕО ΙΌ N0: 33) и линейные пептиды Етеаг-20
МЕМЬП8ЬЕЕЬЬКОМУР18КЛ (8ЕО ΙΌ N0: 104); Ьшеаг-15
ННС\\ЛЛЕ1ККд8Л1ЧЖЕЕЛ\\'\· (8ЕЕ) ΙΌ N0: 117); Ьшеаг-17 (8ЕЕ) ΙΌ N0: 119); Етеаг-20
ΥΚЕМ8М^ЕС^^^V^ЕΚ^^ΗΥ (8ЕО ΙΌ N0: 122); Етеаг 21
11080)2212.812 2\1Е\С8\1\1С) (8ЕО ΙΌ N0: 123); Етеаг 24
ЕΕΕΗ\^ΗNΗΚ8ЕVNΗ\^^МN (8ЕО ΙΌ N0: 126).
Основываясь на консенсусной последовательности, были созданы регулируемые вторичные библиотеки фагового дисплея, в которые «коровые» аминокислоты (установленные по консенсусной последовательности) либо удерживались постоянными, либо систематически смещенными. Или же конкретная пептидная последовательность могла использоваться для создания регулируемой со смещением библиотеки фагового дисплея. Выравнивание таких библиотек при более жестких условиях может приводить к пептидам с повышенной способностью связывать миостатин, селективностью связывания миостатина или какими-либо другими желательными свойствами.
Получение смешанных олигонуклеотидов для библиотек
Олигонкулеотиды синтезировали в ДНК-синтезаторе, при 91% «смешении» с коровыми последовательностями, т.е. каждый раствор содержал 91% представленного определенного основания (Л, С, С или Т) и 3% каждого из трех нуклеотидов. Для ТЖ-19 семейства, например, 91% смешанных олигонуклеотидов использовали для создания вторичной фаговой библиотеки
5'-САС ЛСТССЛ СЛС ССТ NNΚ NNΚ NNΚ саК ддК саК ί§Κ асК сдК 1дК ссК :§К а!К 1§К ссК ссК ίаΚ NNΚ NNΚ NNΚ
СЛТ ТСТ СТС СЛС ЛТС Л-3' (8Е0 ΙΌ N0: 634), где «Ж> показывает, что каждый из четырех нуклеотидов А, Т, С и С равно представлены, К показывает, что С и Т были равно представлены, а маленькая буква означает смесь 91% указанного основания и 3% каждого из остальных оснований. Семейство олигонуклеотидов, полученное таким образом, было РСК амплифицировано, как описано выше, лигировано в фагмидных векторах, например, модифицированная рСЕ81 плазмида (Эуах) или любой другой подходящий фагмидный вектор согласно инструкциям, описанным выше. Вторичные фаговые созданные библиотеки были на 91% смешанными и имели 1 # 6,5х109 независимых трансформантов. Библиотеки были подвергнуты сортированию как описано выше, но при нижеследующих условиях:
Раунд 1 сортирования:
Вводимое количество фага: 1012-1013 с£и плазмиды
Метод селекции: Жпс Iттиηο ТиЬе зекс:^
Негативная селекция: 2Х №пс Iттиηο ТиЬез, покрытие 2% В8Л на 10 мин каждая
Покрытие для сортировки: Покрытие с 1 цг миостатина в 1 мл
0,1 М натрийкарбонатного буфера (рН 9,6)
Время связывания: 3 ч
Условия промывки: 6х2%-Молоко-РВ8Т; 6хРВ8Т; 2хРВ8
Условия элюции: 100 мМ ТЕЛ элюции
Раунд 2 сортирования:
Вводимое количество фага: 1011 с£и фагмиды
Метод селекции: Nиηс Iттиηο ТиЬе зекс:^
Негативная селекция: 2Х Жпс Iттиηο ТиЬез, покрытие 2% В8Л на 30 мин каждая
Покрытие для сортировки: Покрытие с 1 цг миостатина в 1 мл
0,1М натрийкарбонатного буфера (рН 9,6)
Время связывания: 1 ч
- 49 009056
Условия промывки: 15х2%-Молоко-РВ8Т; 15х2%-молоко-РВ8Т в течение 1 ч; 10х2%-В8А-РВ8Т; 1х2%-В8А-РВ8Т в течение 1 ч; 10хРВ8Т и 3хРВ8
Условия элюции: 100 мМ ТЕА элюции
Раунд 3 сортирования:
Вводимое количество фага: 1011 с£и фагмиды
Метод селекции: Шпс Рптипо ТиБе ке1ес!юп
Негативная селекция: 6Х Шпс йптипо ТиБек, покрытие 2% В8А на 10 мин каждая
Покрытие для сортировки: Покрытие с 0,1 цг миостатина в 1 мл
0,1 М натрийкарбонатного буфера (рН 9,6)
Время связывания: 1 ч
Условия промывки: 15х2%-Молоко-РВ8Т; 1х2%-молоко-РВ8Т в течение 1 ч; 10х2%-В8А-РВ8Т; 1х2%-В8А-РВ8Т в течение 1 ч; 10хРВ8Т и 3хРВ8
Условия элюции: 100 мМ ТЕА элюции
Отсеивание во вторичных библиотеках привело к получению пептидов с повышенной способностью связывать миостатин. Отдельные отобранные клоны были подвергнуты фаговому ЕЫ8А, как описано выше, и секвенированы.
Семейство ΊΝ8-19 аффинно зрелых пептидов показано ниже в табл. IV.
- 50 009056
Таблица IV
Аффино зрелое пептидное антитело 8Ε9 ГО ΝΟ: Последовательность пептида
πιΤΝ8-19-1 305 УАЕН60СТК\\ТШ4С’РРрЕЕ6
Π1ΤΝ8-19-2 306 УРЕООЕСТЕУФАМСРРрТЕА
ιηΤΝ8-19-3 307 ΠΕΝΟΟΗΟΤΗνΤΑΜΟΡΡΟΟΗΝ
ιηΤΝ8-19-4 308 МТТрООСТКАРАМСРРрРБС
Π1ΤΝ8-19-5 309 АСАрЕНСТКАРАМСАРУОА!
тТ\8-19-6 310 ΟνΝρορΟΤΚΙλΉΑΜΟΡΡΝαΑΕ
ΙΪ1ΤΝ8-19-7 311 ЬАПНбрСЖАРАМСРРЕСАЕ
Π1ΤΝ8-19-8 312 И-ЕрАОСТЕАРЗАМСРРрКаО
γπΤΝ8-19-9 313 ТрТНАрСТКАРАМСРРрАЕС
Π1ΤΝ8-19-10 314 УУТрСНСТЬАРАМСРР(}ЙАК
Π1ΤΝ8-19-Н 315 ГУРНПрСТКАРАМСРРрРУР
1ΏΤΝ8-19-12 316 БУАСЮрСТКАРАМ СРРрАКС
Π1ΤΝ8-19-13 317 МАрраНСТВАРАМСРРрСАС
Π1ΤΝ8-19-14 318 ЕГТрАНСгГК\\Т\УМСРРрК8Р
Π1ΤΝ8-19-15 319 ЬООрАрСТКАРАМСРРрОГЗ
ιηΤΝ8-19-16 320 УрТрОЬСТКАУРАМСРРрЗрК
Π1ΤΝ8-19-17 321 Ε8ΝραροτκχνρλνΜθΡΡραθλν
Π1ΤΝ8-19-18 322 \νΤϋΚΟΡΕΤΚ.λνΡΨΜσΡΡΡΑΝΟ
Π1ΤΝ8-19-19 323 УСТрСрСТКАРАМСРРУЕТС
Π1ΤΝ8-19-20 324 РУЕрбКСТКАРАМСРРУЕУЕ
Β1ΤΝ8-19-21 325 ЗЕУрСЪСТКАРАМСРРра^К
Π1ΤΝ8-19-22 326 ТРБОСНСТКУТАМСРРОСАСт
Π1ΤΝ8-19-23 327 Р6 АНОН ста АРАМСРРрЗВУ
Π1ΤΝ8-19-24 328 УАЕЕ^ЪСЕК АР АМСРРрО Ай.
Π1ΤΝ8-19-25 329 уотрснстй-арамсррррас
тТ№-19-26 330 ЕЕОрАНСКЗАРАМСЕРрСАУ
1тТ№-19-27 331 АОТрСНСТЯАРАМСРРрН АЕ
ιπΤΝ8-19-28 332 БСРрСгНСТКАТАМСАРрОАГ
|ΐτιΤΝ8-19-29 333 ТЕУрСНСТК.АРАМСРРрК.АА/'У
|ιηΤΝ8-19-30 334 6МАНСКСТКАААМСРРр5\УК
|ιπΤΝ8-19-31 335 ЕЕУНСрСТКАРАМСРРрБАА
3ηΤΝ8-19-32 336 УАОНОНСТКАРАМСРРрбА’С
πϊΓΝ8- 19-33 337 РЕБрСНСТКАРАМСРРрСАО
ηιΤΝ8-19-34 338 1РАНСНСТКАРАМСРРрЕАК
ιηΤΝ8-19-35 339 ЕТУНСНСТКАРА’МСРРУСАУ
γπΤΝ8-19-36 340 РОРРСНСТКАКАМСРРРСАЕ
тТК8-19-37 341 рЬАрОРСТрАрАМСРРКбКУ
ЩТП8-19-38 342 НАЕГОСНСТК.А()АМСРРрАСС
Π1ΤΝ8-19-39 343 ЕТРНОЕСТКАРАМСРРУСАК
Π1ΤΝ8-19-40 344 □ТАрОЕСТВАРАМСРР<ЗОАр
ηΤΝδ-19 соп1 345 νΑΤρσςΟΤΚΑΡΑΜΟΡΡρΟΑΟ
ηιΤΝ8-19οοη2 ! 346 УАТОС^СТКАРАМСРРОКАС
Π1ΤΝ8 сопб-1 347 РКЕАУРСУОСНЕАСУЛЬНКА
ΠΪΓΝ8 сопб-2 348 18ААУ8СУАОНЕАСАЕ>ЕКрК
Π1ΤΝ8 сопб-3 349 АТСтТ/СУОСНЕАСУОЕЖК
Π1ΤΝ8 сопб-4 350 КТГАУРСУЕЮНЕАСУЖКЗЗ
Π1ΤΝ8 сопб-5 351 ЕЗКАУРСУЕСНЕАСЕОЕТЕТ
Консенсусная последовательность, полученная из аффинно зрелого ΤΝ-8-19-1 посредством Соп2 (исключив Π1ΤΝ8 сопб последовательности) такова: СащэУУа^УУМСРР (8ЕО Ш N0: 352). Все эти пептиды включают последовательность ХУМСРР (8Εζ) Ш N0: 633). Подчеркнутые аминокислоты представляют собой коровые аминокислоты, присутствующие во всех вариантах, аь а2 и а3 выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислот. В одном варианте этой консенсусной последовательности, СЬ1Ь->УУЬ7УУМСРР (8Εζ) Ш N0: 353), Ьх выбрано из аминокислот Т, I или К; Ь2 выбрано из аминокислот К, 8, ζ); Ь3 выбрано из Р, К и (). Все пептиды включают последова
- 51 009056 тельность АМСРР (8Εζ) Ш N0: 633). Более детальный анализ аффинных зрелых ΤΝ8 последовательностей, включающих 8Εζ) Ю N0: 352, приводит к следующей формуле:
С1 с2 с3 с4 с5 с6 Сс7 с8 Асу АМСРР Сю Си ο!2 (8Εζ) Ш ΝΟ: 354), где С1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
Сз отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,
С5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
Сб отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту, с7 нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с8 нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с9 нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, а С10-С13 представляют собой любые аминокислоты.
В одном варианте вышеприведенного соединения Ь7 выбрано из аминокислот Τ, I или В; Ь8 выбрано из В, 8, ζ); Ь9 выбрано из Р, В и С- Это дает следующую последовательность:
άι й2 й3 й4 й5 ф С й7 й8 А й9 АМСРР йю йп ά12 ά13 (8ЕС Ш N0: 355), где Й1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, й2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, йз отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, й4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, й5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, йб отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту, й7 выбран из аминокислот Τ, I или В, й8 выбран из В, 8, Сй9 выбран из Р, В и ζ), а йю-й1з представляют собой любые аминокислоты.
Консенсусная последовательность ΠΪΓΝ8 соиб серий такова: АУеюз Уе3 6, (8Εζ) Ш N0: 356), где е£ представляет собой Р, 8 или У, е2 представляет собой С или С- е3 - это С или Н.
Помимо аффинно зрелого семейства ΤΝ-19 дополнительные аффинные зрелые пептиды были получены из Ь-2, Ь-15, Ь-17, Ь-20, Ь-21 и Ь-24 пептидов первого раунда. Эти семейства представлены ниже в табл. V.
Таблица V
Аффино зрелое пептидное антитело 8Ε() ΙΟ ΝΟ: Последовательность пептида
Ь2 104 МЕМЕО5ЕЕЕЕЕКХ)МУР18КА
тЬ2-Соп1 357 ВМЕМЕЕЗЕЬЕЬЬКЕГУРМЗКАб
т1.2-Соп2 358 ВМЕМЬЕЗЬЬЕЬЬКЕГУРМЗКАВ
тБ2-1 359 ВМЕМБЕ8 ΕΕΕΕΕΚΟΐνΡΜ8ΚΡ8
тЬ2-2 360 (тМЕМЕЕ8ЕЕЕЕЕ0Е1УРМ8КАР
тЕ2-3 361 ВМЕМБЕ8ЕЕЕЕЕКХ)1УР18МРР
П1Е2-4 362 В1ЕМЕЕ8ЕЬЕЬЬрЕ1УР18КАЕ
тБ2-5 363 ВМЕМЬр8ЬЬЕЬЬКО1УРМ8ХАК
Π1Ε2-6 364 ВМЕМЬЕ8ЕЬЕШ<Е1УРТ8МСТ
тБ2-7 365 ВМЕМЬЕЗ ЕРЕЕЬКЕ1УРМ8КАО
тЬ2-8 366 ВМЕМШ8ЕЬЕЕЬКЕ1УРМ8КАВ
тЬ2-9 367 СМЕЕТЕ 8 ЬГЕБЕКЕТУРКЗСРА
-52009056
шЬ2-10 368 К.МЕМЬО8ЬЬЕЬЬКЕ1УРМ8МАК
тЬ2-11 369 КМЕМЬЕ8ЕЕЕЕЬНЕ1УРМ8рАО
тЬ2-12 370 рМЕМЕЕЗЕЬфЕЕКЕГУРМЗКАЗ
тЬ2-13 371 ЕМЕМЕОЗЕЕЕЕЕКОАЖРМТТСА
тЬ2-14 372 К1ЕМЕЕ8ЬЕЕЕЬКОМУРМАМА8
тЬ2-15 373 КМЕМЕЕ8ЕЕрЕЕНЕ1УРМ8ЖЕ
тЬ2-16 374 КМЕМЕЕЗЕЕОЕЕКЕЕУРМЗКОУ
тЬ2-17 375 ΚΙΕΜΕΕδΕΕΕΕΕΚΏΐνΡΙφΚΑΚ
тЬ2-18 376 КМЕЕЕЕ8ЕЕЕЕЕКГ)МУРМ8О88
тЬ2-19 377 КМЕМЕЕ8Е1АУЕС)Е1УРКАКСгА
тЬ2-20 378 ΕΜΕΜΕΟδΕΕρΕΕΝΕίνΡΜδΗΑΚ.
тЬ2-21 379 ΕΜΕΜΕΕδΕΕΕΕΕΚΟίνΡΜδΝΑθ
тЬ2-22 380 КМЕМЕф8ЕЕЕЕЕКСМУР18КАС
тЬ2-23 381 ΕΜΕΜΕΕδΕΕΕΕΕΚΕίνΡΝδΤΆΑ
тЬ2-24 382 ΚΜΕΜ^^δ^^Ε^^ΚΕIVΡIδΚΑС^
тЬ2-25 383 ΚΙΕΜΕΟδΕΕΕΕΕΝΕΕνΡΜδΚΑΚ
Ь-15 117 ННСЖУЕККСЗАРрЖЕАЖ
тЫ5-соп1 384 ^VΕ8^^^^^Μ^V^^^Κ^Α8СΡ^σ
тЫ5-1 385 К.МЕЕЕЕ8ЕЕЕЕЕКЕМУРК8КАУ
ШЁ15-2 386 А V ДЬЦНЬЬМ кЬЕХ^КЬАЬОРфН
тЫ5-3 387 ОЕО8ЕДфЕЕМ\УЕОС)КЕА8СтРС)Е
тЫ5-4 388 РУА8Ьф()ЕЕ1ШГОрКЕАр(ЗРНА
тЫ5-5 389 ΕνϋΕΕφφΕΕΝν/ΕϋΗΚΕΑδΘΡΕΡ
тЬ15-6 390 ОУЕЗЕЕрЗУМЗУЕОНОЕАЗСРНС
тЫ5-7 391 (ЖОЗЬрС^УЕЕЖЕНКЕАЕОРрУ
тЫ5-8 392 6ПЕ8ЕрНЕЕМЖЕрКЕАЕОРНС1
тЬ15-9 393 φΙΕΜΕΕδΕΕΟΕΕΙΕΟΜνΡΜδΝΑΕ
тЫ5-10 394 ΕV^8^^^^^ΜЖ^^Κ^Α8СΡ^Α
тЫ5-11 395 ΕΟΕδΕΟΡΕΕΙΥΕΟΚΜΕδδΘΡρν
тЬ15-12 396 ΑΜϋφΕΗΟΕΕΠνΕΕΡΙΚΕΑδΟΡρΑ
тЫ5-13 397 МЕМЕЕЗЬЕЕЕЕВЕШЯРКАУ/
тЫ5-14 398 Ενν8ΕφΗΕΕΜ\νΕΕΗΚΕΑδ(3ΡΟθ
тЫ5-15 399 ООЕ8Еф(2ЕЕМЖО(2РЕА8аР(2К.
тЫ5-16 400 СУЕ8Ьр(ЧЕЕ1РЕОНМЕУ8СРНО
тЫ5-17 401 МУЕ8ЕЕНЕММкЪЕКЬЕА8СРУА
тЫ5-18 402 ^V^δ^^^^^IV/^^Η^^ΑδС^ΡΚΚ
тЫ5-19 403 ЕУЕЗЕрДЕЕМкЕЕНКЕАрСРрб
тЫ5-20 404 ΕV^8^^^^^ΜλV^^^Κ^Α8ΘΡΗΑ
тЬ15-21 405 ЕУВЗЬРфЬЕМЖЕОСЗфЕАЗОРрК
тЬ15-22 406 ^VΕ^^Ρ^^^Μ^V^Ε^Κ^Α8ΟΡ^Κ
тЫ5-23 407 ЗЕОЗЕфДЕЕМШЖОЕААОРСШ
тЫ5-24 408 ΑϋΟδΕφΡΕΕΜννΑΟΚΚΕΑδΟΡΗν
И1Ы5-25 409 РУО 8ΕΡ9ΕΕΙ\νΕϋΟΚΕΑδ6ΡφΟ
Ь-17 119 ΕΑΤΕΕΚϋΙΑνρΕνΕσΥΟΟΝ
тЬ17-соп1 410 □УЖТЕЕКЕРкрЕУЕСЕЗОНЕУ
и1Ы7-соп2 411 ЗЗКАТЕЕКЕРЖ^УЕСЕСОКрА
тЬ17-1 412 ООКАТЬЕТЕРЖЕУфСЕСфКЕА
тЫ7-2 413 РАКАТЕЬБСЕЕЖЬГЕОЬОЕКУУ
тЫ7-3 414 ЗЗКОТЕЕКЕЕЖЧЕУУСЕСОМОТ
- 53 009056
тЬ17-4 415 ϋΑΚΑΤΕΕΚΕΡ\νηΕνθΑΥ6ΟΚΜν
шЫ7-5 416 ΝΟΚΑρΕΕΚΟΓ^ΕνϋσΕσνΚδλν
П1Ы7-6 417 σνΚΕΤΕΕΥΕΕλνΥΕΕΚΟΕΟΑΝςΟ
тЫ7-7 418 РАКАТЕБКЕРСС^ЕУОСрООКЕЗ
тЕ17-8 419 ςΕΚΑΤΕΕΚΕΡλνςΕνΑΟΕΘρΝΜΚ
тЫ7-9 420 8СКАТЕЕКЕРШ2ЕУ(2СЕСЕУ1Ш
тЫ7-10 421 ΤΜΚΑΤΕΕΚΕΕλνΕΓνϋΟςΚΕΜςλν
тЫ7-11 422 (ЖВАТЕЕЖ)ЕШ2ЕУПОР®ЖГО
тЬ17-12 423 ΟΕΚΕΤΕΕΚΕΓλνρΕνΗσν/σϋΝνΑ
тЫ7-13 424 СОЕАТЕЕКЕЕУ'СЕЕЕбрСАКЕУ
тЫ7-14 425 ΤΑΚΑΤΕΕΝΕΕνςΕνκσΥΟϋΚΕν
тЫ7-15 426 ОМКАТЕЕСЕРХУрЕУСбрСГОШУМ
И1Ы7-16 427 δΤΚΑΤΕΕΝΟΕλνςΕΜΚΟλνΑΕϋΚΟ
тЫ7-17 428 ЗЕКАТЕЕКЕЕА'рЕУССАСОАРб
тЕ17-18 429 УСКАТЕЕКЕЕАУрЬУЕСЕУСрЗК
И1Ы7-19 430 ΕΙΚΑΤΕΕΚΕΓΑνρΕνϋΕνΤΚΕρΡΝ
тЫ7-20 431 (ЗЕКАТЕЕКЕГЕрЕУНСЕСЕТОЗ
тЬ 17-21 432 Т(2КАТЕЕКЕРШ2Е1ЕОЕССКНУ
тЕ 17-22 433 НУРАТЕБКЕРШ^ЕУОСЕКЕС^СУ
тЬ17-23 434 Р8КУТЕЕКЕЕУ/СБУЕ8УКР1УИ
тБ 17-24 435 Ε8ΚΑΤΕΕΝΕΡ\νρΡνϋΘρΜ)ΚΚΜ
тЫ7-25 436 λνϋΚΑΤΕΕΝΟΡλ¥ΗΕΜΕΕΕ8(2ΚΡσ
тЬ17-26 437 ΡΕΚΑΤΕΕΚΕΡν/ΚΜνΕΘΕΟΚΝΚσ
тЫ7-27 438 КЕКАТЕЕКЕР\¥С)ЕУССУСУН(>
Ь-20 122 ΥΚΕΜδΜΕΕΘΕΕϋνΕΕΒΙ^ΗΥ
тЬ20-1 439 НСКОМ8МЕЖЕ1.АОУ.ЕОСЕК.С)У8
тЬ20-2 440 Т(Ж>М8МЕООЕЕЕУЕОрЕ1адК
тЬ20-3 441 ΤδΚΟΜδΕΕΨΕΕΕΕΕΕϋΚΕθΗρΚ
тЬ20-4 442 ΜηΗϋΜδΜΕΥΟΕνΕΕΕΕδΕΘΗρί
тЬ20-5 443 ААКОМКМЕЕЗЕРЕУЕОСЕЕССУ
тЬ20-б 444 6УК.ОМ8МЕЕСЕЕАУЕОКЕСР9Е
тЬ20 соп1 445 ΤρΚΙ)Μ8ΜΕΕΟΕΕΕ\/ΤΕ.ΟΚΕΟζ)ρΚ
тЕ20 соп2 446 АУКОМ8М1АСЕЕЕУЕОКЕС()()К.
Ь-21 123 ΗΝδδί^ΜΕΕδΕΣΙΜΕνσδΜΜρ
,^Т О 1 1 1 1 л л п / ΤΓΥΚΤ0Γ) ГТЛ/ТТ Τ 0ΤΛΤ7ΆΛΛ/ΓΤ λ7ΓΕ0Ά/ΤΤΓ4Γ2. ι Ίνχινχχ^ V ^Οΐν±±\/Ό
тЬ21-2 448 ΜρΤδΚΗΙΕΕδΕΡΜΜΕνΟδΙΜΗΟ
тЬ21-3 449 НОМ8Р0МЕЕ.8ОЕЕНЕУ6ТМ1С)С
тЬ21-4 450 ΜΕΝδΚΟΝΕΕΚΕΕΙΜΕνΟΝΜδΗρ
тЬ21-5 451 ΕΟΤδΚΉΜΕΕΚΕΡΜΜΕλΑΕΜίρθ
тЬ21 соп! 452 ΟρΝδΚρΜΕΕδϋΕΜΙΕνΟδΜίρσ
Ь-24 126 ΕΡΡΗΑΕΗΝΗΚδΕΥΑΗΥ-ΕϋΜΝ
тЬ24-1 453 ХУРРСЖ^КНСКУУУрШГОШУ
тЬ24-2 1 454 ГОРЕрЗЕЕрЕНКЗЕУЕНАЕУМОУ
Аффинные зрелые пептиды, представленные в табл. IV и V, были использованы для сборки пептидных антител, как описано выше, и оценивались с помощью ίη νίνο исследований.
Аффинные зрелые Ь2 пептиды включают консенсусную последовательность ί'1 ЕМЬ Г2 8Ь £3 1'4 ЕЕ (81 А) Ш N0: 455), где ί'1 - это М или I; Г2 - это любая аминокислота; Г3 - это Ь или Е; Г4 - это Е, О или Ό.
Аффинно зрелые Ь15 пептиды включают последовательность Ьд1 д2 1.1. д3 д4 I., (81 А) Ш N0: 456), где д1 - это О, Ό или Е, д2 - это 8, О, Ό или Е, д3 - это любая аминокислота, а д4 - это Ь, \, Е или Υ. Аффинно зрелые пептиды Ы7 семейства включают последовательность: Ь1 Ь2 Ь3 Ь4 Ь5 Ь6 Ь7 Ь8 Ь9 (8ЕР ΙΌ N0: 457), где Ь1 - это К или Ό, Ь2 - любая аминокислота, Ь3 - это А, Т, 8 или О, Ь4 - это Ь или М, Ь5 - это Ь или 8, Ь6 - это любая аминокислота, Ь7 - это Е или Е, Ь8 - это \, Е или С, Ь9 - это Ь, Е, М или К. Консенсусные последовательности могут быть также установлены для тЬ20, тЬ21, тЬ24 семейств пептидов, приведенных выше.
Пептидные антитела создавали из этих аффинно зрелых пептидов, как описано выше, используя линкер, имеющий 8ЕР Ш N0: 296, присоединенный к Ес домену человеческого 1дСТ, по Ж концу конфигурация), по С-концу (С-конфигурация) Ес или по обоим N и С-концу С-конфигурация), как
- 54 009056 описано в примере 2 выше. Указанные пептиды присоединяли к С или N концам через 5 глицин (5О), 8 глицин или к линкерную последовательность. В 2х версии пептидных антител пептиды были пришиты линкерами 5 д1у, 8 д1у или к. Аффинно зрелые пептиды и пептидные антитела обозначали маленькой «т», например тТЫ8-19-22. Пептидные антитела кроме этого содержат два сплайс-сайта, в которых пептиды разрезались в фагмидных векторах. Положение этих сплайс-сайтов: АР-пептид-ЬЕ. Пептидные антитела вообще включают эти дополнительные аминокислоты (несмотря на то, что они не включены в пептидные последовательности, приводимые в таблицах). В некоторых пептидных антителах ЕЕ аминокислоты были удалены из пептидных последовательностей. Эти пептидные антитела обозначают - ЬЕ.
Примерные пептидные антитела и примерные последовательности полинуклеотидов, кодирующие их, приводятся ниже в табл. VI. Эта таблица включает примеры последовательностей пептидных антител (в противоположность пептидным), например 2х т ТЫ8-19-7 (8ЕР ГО N0: 615) и пептидного антитела с делетированной ЕЕ последовательностью (8ЕР ГО N0: 617). Коротко говоря, линкерные последовательности в 2х версиях относятся к линкеру между тандемными пептидами. Последовательности этих антител содержат Ес линкеры, Ар и ЕЕ последовательности. Сопутствующая нуклеотидная последовательность кодирует последовательность пептида в дополнение к АО/ЕЕ линкерным последовательностям, в случае присутствия, но не кодирует указанный линкер.
Таблица VI
Наименова ние антитела Пептид Нуклеиновая последовательность (8Е(2 ГО Νο) Линкер (Конец
тЬ2-Соп1 КМЕМЬЕЗЕЬЕЕЬК Е1УРМ8КАО СОТАТСОАААТССТТСААТСТСТ ТСТТСААСТТСТТАААСАААТТО ТТССААТОТСТАААССТОСТ (ЗЕр ГО N0: 458) 5 §1у N
тЬ2-Соп2 КМЕМЬЕЗЕЬЕЕЕК Е1УРМ8КАК СОТАТСОАААТССТТСААТСТСТ ТСТТСААСТТСТТАААСАААТТО ТТССААТОТСТАААОСТСОТ (8Εζ) ГО N0: 459) 5 §1У N
тЬ2-1 КМЕМЬЕЗЬЬЕЕЕК О1УРМ8КР8 СОТ АТСО АААТССТТОААТСТСТ ТСТТОААСТТСТТАААОАТАТТО ТТССААТОТСТАААССАТСТ (8Е(2 ГО N0: 460) 5 §1У N
тЬ2-2 СтМЕМЕЕЗЕРЕЕЕО Е1УРМ8КАР СОТАТОСАААТОСТТОААТСТСТ ТТТТОААСТТСТТСААОАААТТС ТТССААТОТСТАААОСТССА (8Ες ГО N0: 461) 5 §1у N
тЬ2-3 КМЕМЕЕЗЕЕЕЕЕК ϋΐνΡΙδΝΡΡ 1 1 СОТАТОСАААТОСТТОААТСТСТ ТСТТОААСТТСТТАААОАТАТТО ТТССААТТТСТААТССАССА (8Е(2 ГО N0: 462) 5 §1У N
1Т1Е2-4 1 ΚΙΕΜΕΕ8ΕΕΕΕΕζ)ΕΙ ί УР18КАЕ ССТАТТСАААТССТТОААТСТСТ ТСТТСААСТТСТТСААОАААТТО ТТССААТТТСТАААОСТСАА (ЗЕС) ГО N0: 463) 5 §1у N
тЬ2-5 РМЕМЕрЗЕЕЕЕЕК ϋΐνΡΜδΝΑΚ СОТАТОСАААТОСТТОААТСТСТ ТСТТОААСТТСТТАААОАТАТТО ТТССААТСТСТААТОСТСОТ (8Е<2 ГО N0: 464) 5 §1У N
гпЕ2-б 1. КМЕМЕЕ8ЕЕЕЕЕК ΕίνΡΤδΝΟΤ СОТАТСОАААТССТТСААТСТСТ ТСТТСААСТТСТТАААСАААТТО ТТССААСТТСТААТОСТАСТ (8Εζ) ГО N0: 465) 5 §1У N
тЬ2—7 : 1 ЕСМЕМЬЕЗЬЕЕЕЬКЕ [УРМ8КАО ' 1 СОТАТОСАААТОСТТОААТСТСТ ТТТТОААСТТСТТАААСАААТТО ГТССААТОТСТАААОСТООТ (8Εζ) ГО N0: 466) 5 §1у N
тЬ2-8 ' КМЕМЕО8ЕЕЕЕЕК |< Е1УРМ8КАК. ' ( ССТАТССАААТССТТОСТТСТСТ . ТСТТСААСТТСТТАААСАААТТО ГТССААТОТСТАААОСТСОТ(8Е 5 ГО N0: 467) 1 5 §1у N
тЬ2-9 < 1 1 ЗМЕЕЕОЗЬРЕЕЬКЕ < УРК50РА ' (( САААТООААСТТСТТОАТТСТСТ '5 §1у [Ν ГТТТСААСТТСТТАААОАААТТС ГТССААААТСТСААССАОСТ 1 :8Е<р ГО N0: 468) |
- 55 009056
тЬ2-10 КМЕМЬОЗЬЬЕЬЬК ΕΙΥΡΜδΝΑΚ ССТАТООАААТОСТТОАТТСТСТ ТСТТСААСТТСТТАААСАААТТС ТТССААТСТСТААТОСТССТ (8ЕЦ ГО N0: 469) 5 §1у N
тЬ2-11 КМЕМЕЕЗЬЕЕЕЕН ЕГУРМ8()АС ССТАТССАААТССТТСААТСТСТ ТСТТОААСТТСТТСАТОАААТТО ТТССААТОТСТСААОСТООТ (8ЕЦ ГО N0: 470) 5 §1У N
тЬ2-12 рМЕМЕЕЗЕЕрЕЕК Е1УРМ8КА8 САААТООАААТССТТОААТСТС ТТСТТСААСТТСТТАААСАААТТ СТТССААТСТСТАААССТТСТ (ЗЕЦГОИО: 471) 5 ё!у N
тЬ2-13 КМЕМЕШЕЕЕЕЕК ОМУРМТТСА ССТАТООАААТОСТТОАТТСТСТ ТСТТОААСТТСТТАААСАТАТСС ТТССААТСАСТАСТССТССТ (8ЕЦ ГО ΝΟ: 472) 5 §1у N
тЬ2-14 ЮЕМЕЕЗЕЕЕЕЕКВ МУРМАЫАЗ СОТАТТОАААТОСТТСААТСТСТ ТСТТС1ААСТТСТТАААСАТАТСО ТТССААТООСТААТССТТСТ (8ЕЦ ГО N0: 473) 5 §1у N
тЬ2-15 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΟΕΕΝ Е1УРМ8КАК ССТАТСЮАААТССТТСгААТСТСТ ТСТТСААСТТСТТААТСгАААТТС ТТССААТОТСТССТССТССТ (8ЕЦ ГО N0: 474) 5 §1у N
тЬ2-16 КМЕМЕЕЗЬЕПЬЕК ЕЕУРМЗКбУ ССТАТООАААТОСТТСААТСТСТ ТТТТОАТСТТСТТАААОААСТТО ТТССААТСТСТАААССТСТТ (8ЕЦ ГО N0: 475) 5 §1у N
тЬ2-17 БПЕМЬЕЗЕЕЕЕЬКЫ УРК^КАК ССТАТТОАААТССТТОААТСТСТ ТСТТОААСТТСТТАААОАТАТТО ТТССААТТСАААААОСТСОТ (8ЕЦ ГО N0: 476) 5 §1у N
тЬ2-18 КМЕЕЬЕЗЕРЕЕЕКО МУРМЗОЗЗ ССТАТССААСТТСТТОААТСТСТ ТТТТСААСТТСТТАААСАТАТОС ТТССААТСТСТСАТТСТТСТ (8ЕЦ ГО N0: 477) 5 §1у N
тЬ2-19 К.МЕМЕЕ8ЕЕЕУЕ0 Е1УРКАКОА ССТАТСОАААТОСТТОААТСТСТ ТСТТОААОТТСТТСАА6АААТТО ТТССАСОТОСТАААСОТОСТ (8ЕЦ ГО N0: 478) 5 §1у 1 N
тЬ2-20 ΙΕΜΕΜΕΟ8ΕΕζ)ΕΕΝ Е1УРМ8НАК ССТАТОСАААТОСТТСАТТСТСТ ТСТТСААСТТСТТААТОАААТТО ТТССААТОТСТСАТОСТСОТ (8Еф ГО N0: 479) 5 §1у N
тЬ2-21 1 КМЕМЕЕЗЕЬЕЕЕК ΟΙΥΡΜδΝΑΟ ' I ССТАТООАААТССТТОААТСТСТ ТСТТОААСТТСТТАААСАТАТТО ТТССААТСТСТААТОСТООТ (8ЕЦ ГО N0: 480) 5 §1У N
тЬ2-22 1 ( ЕМЕМЕОЗЕГЕЕЬК < ЗМУР18КАО ' ССТАТСЮАААТССТТСААТСТСТ . ТТТТСААСТТСТТАААООТАТОС ГТССААТТТСТАААСтСТССТ 5 §1у ‘ N
- 56 009056
(ЗЕрШЕЮ: 481)
тЬ2-23 КМЕМЬЕЗЬЬЕЬЬК ΕίνΡΝδΤΑΑ СОТАТООАААТОСТТСААТСТСТ ТСТТСААСТТСТТАААСтАААТТС ТТССАААТТСТАСТОСТОСТ (8Ер ГО N0: 482) 5 Ду N
тЬ2-24 НМЕМЕрЗЕЕЕЕЕК Е1УР18КАО ССТАТООАААТССТТСААТСТСТ ТСТТСгААСТТСТТАААОАААТТС ТТССААТТТСТАААОСТООТ (8Ер ГО N0: 483) 5 Ду N
тЬ2-25 МЕМЬОЗЬЬЕЬЬМЕ ЬУРМЗКАВ СОТАТТОАААТОСТТОАТТСТСТ ТСТТОААСТТСТТААТОААСТТО ТТССААТСТСТАААОСТССТ (8Ер ГО ΝΟ: 484) 5 Ду N
тЬ17-Соп1 ОА-КАТЕЕКЕЕЛУрЕ УЕОЬООЖУ САТТббСбТОСТАСТСТТСТТАА АСААТТТТСССААСТТОТТСгАА ООТСТТООТ6АТААТСТТОТТ (8Ер ГО N0: 485) 5 Ду N
тЬ17-1 ООКАТЕЕТЕГАрЕ УРСЬСРКЕА ОАТООТСОТОСТАСТСТТСТТАС ТОААТТТТОССААСТТСТТСААС ОТСТТООТСАААААОААОСТ (ЗЕр ГО N0: 486) 5 Ду N
тЫ7-2 ЬАКАТЕЕКЕРАрЕ УЕОЬСЕКУУ СТТОСТСОТОСТАСТСТТСТТАА АСААТТТТСССААСТТСТТС1АА ООТСТТСОТОАААААОТТОТТ (ЗЕр ГО N0: 487) 5 Ду N
тЬ17-3 ОЗГГОТЕЬКЕЕАрЕ УУСЕСОМрТ ООТТСТСОТОАТАСТСТТСТТАА АСААТТТТ6ОСААСТТ0ТТОТТ6 СТСТТОСТОАТАТОСАААСТ (ЗЕр ГО N0: 488) 5 Ду N 1
тЬ17-4 ОАВАТЕЬКЕГАрЕ УОАУСОКМУ ОАТОСТСОТОСТАСТСТТСТТАА АСААТТТТОСгСААСТТСгТТСгАТСг СТТА'ГбСТбАТССТАТООТТ (ЗЕР ГО N0: 489) 5 Ду N
тЫ7-5 ШКАрЕЕКВЕАрЕ УООЪОУКБШ ААТОАТСОТОСТСААСТТСТТСО ТОАТТТТТООСААСТТОТТОАТО ОТСТТООТОТТАААТСТТОО (ЗЕр ГО N0: 490) 5 Ду N
тЫ7-6 ОУКЕТЕЬУЕЬАУЕ ЬКСЕОАНрО ООТОТТСОТОАААСТСТТСТТТА ТОААСТТТООТАТСТТСТТАААО ОТСТТООТОСТААТСААООТ (ЗЕР ГО N0: 491) 5 ДУ N
тЫ7-7 рАКАТЕЬКЕГСрЬ УОСРОЦКЬЗ СААССТССТОСТАСТСТТСТТАА АСААТТТТОТСААСТТОТТООТТ ОТСААООТОАТАААСТТТСТ ДЕР ГО N0: 492) 5 ДУ N
тЫ7-8 (ЗЕКАТЬЬКЕР^Ь УА ΘΕΟ ДАМЕ . ЕААОААСОТОСТАСТСТТСТТАА АОААТТТТООСААСТТОТТОСТО ОТСТТООТСААААТАТОСОТ ДЕр ГО N0: 493) 5 ДУ N
- 57 009056
шЬ17-9 ЗСЖАТЕЕКЕРЖЬ УрОЬСЕУКЖ ТСТООТСОТОСТАСТСТТСТТАА АОААТТТТООСААСТТСТТСААС СТСТТСОТСААТАТССТТОО (8Е() ГО ΝΟ: 494) 5 §1у N
тЫ7-10 ТМЕАТЬЕКБЕАБГ УОСтОЕЕМрА- АСТАТОССТОСТАСТСТТСТТАА АОААТТТТООСТТТТТОТТОАТО СТСААСОТОАААТОСААТОО (8Е(2 ГО ΝΟ: 495) 5 £1у N
тЫ7-11 ΟΕΚΑΤΕΕΝΟΡ^Ε νοοςθϋΝτο ССТОААССТОСТАСТСТТСТТАА ТОАТТТТТООСААСТТСТТОАТО ОТСААООТОАТААТАСТОСТ (8Е(} ГО ΝΟ: 496) 5 §1у N
тЫ7-12 ОЕКЕТЕЕКЕРЖЕ УНОЖГОХУА ОАТОААСОТОАААСТСТТСТТА ААОААТТТТООСААСТТОТТСАТ ООТТООООТОАТААТОТТОСТ (8Εζ) ГО ΝΟ: 497) 5 §1у N
тЫ7-13 бСЖАТЕЕКЕЕЖГО БЕСрОАЖУ ООТООТСОТОСТАСТСТТСТТАА АОААСТТТООСААСТТСТТОАА ООТСААООТОСТААТСТТОТТ (8Е(2 ГО N0: 498) 5 §1У N
тЫ7-14 ТАКАТЕЬЖЬУрЕ УКОУООКЬУ АСТССТССТОСТАСТСТТСТТАА ТОААСТТОТТСААСТТСТТАААО ОТТАТООТОАТАААСТТОТТ (8Εζ) ГО N0: 499) 5 §1у N
тЬ17-15 СМКАТЕЕОЕЕЖЬ УССтСЮОКАУМ 60ТАТ0С0Т0СТАСТСТТСТТСА АСААТТТТООСААСТТОТТОСТО ОТСААООТОАТААТТОСАТС (8Е(2 ГО N0: 500) 5 §1у N
тЫ7-16 ЗТЕАТЕЕЖЕЖГО ΜΚΟΑΑΕΌΚΘ ТСТАСТСОТОСТАСТСТТСТТАА ТОАТСТТТООСААСТТАТОАААС ОТТОООСТОААОАТСОТООТ (8Е(2 ГО N0: 501) 5 §1У N
тЫ7-17 ЗЕКАТЕЬКЕЬЖЬ УООШГОЖО ТСТОААСОТОСТАСТСТТСТТАА АСААСТТТОССААСТТСТТООТО СТТООССТОАТААТТТТОСТ (8Ες ГО N0: 502) 5 §1у N
тЫ7-18 \<ЖАТ1±КЕРЖЕ УЕСБУССЖ ОТТООТСОТОСТАСТСТТСТТАА АСААТТТТООСААСТТОТТОАА ООТСТТОТТООТСААТСТССТ (8Е(} ГО N0: 503) 5 §1у ! N
2х Π1ΤΝ8- Οοη6-(Ν)1К 1 М-СтАСБ- УУРСУЕОНРЖУ □Е38О8АТСО8О8ТА8 ЗСЗОЗАТО- УУРСУЕОНРЖУ ОЬ-ЕЕ-50-РС ;8ЕЭ ГО N0: 504) ГООТАТССОТОТТАТОАОООТСА СТТСТООТОСТАСОАТСТОООТТ СТОСТТССАСТОСТТСТТСТООТ ГССОСТТССОСТАСТООТТООТА СССОТОСТАССААОСТСАСТТТТ ЗОТОТТАТОАТСТО (8Е(2 ГО ΝΟ: 505) 1К N
- 58 009056
2χ πιΤΝ8- Сопб-(С)- 1К РС-50-Ας\¥УРСУЕСНЕ\УСУ РЬ- СЗС8АТСС8С8ТА8 8О8О8АТОАУУРСУЕСНЕАУСУ ОЫЬЕ (8Е(2 ГО N0: 506) ТООТАТССОТОТТАТСАОСОТСА СТТСТОСТОСТАСОАТСТСООТТ СТССТТССАСТССТТСТТСТОСТ ТССССТТССОСТАСТССТТССТА СССОТОСТАССААОСТСАСТТТТ ССТСТТАТСАТСТС (8Εζ) ГО ΝΟ: 507) МК С
2х Π1ΤΝ8- Соп7-(Ы)- 1К Μ-ΟΑζ)ιρσοκλνλνϋνρογς Р- С8О8АТСС8С8ТА8 8Ο8Θ8ΑΤΟ- ГРССКАУГОУрСУЁ Р-ЬЕ-50-РС (8Εζ) ГО N0: 508) АТСТТТСССТСТАААТООТСОО • АССТТСА0ТССТАССА6ТТСССТ ТСТССТТССАСТССТТСТТСТСС ТТССССТТССССТАСТССТАТСТ ТСОСТТОСААСТССТОССАТСТ ' АСАСТСТТАТСАСТТТ (8Εζ) ГО ΝΟ: 509) 1К N
2х Π1ΤΝ8- Соп7-(С)- 1К РС-5С-АР,1РОСЮУМГОУрСУр Р- С8О8АТОО8О8ТА8 8С8С8АТС1Г(ЗСКУДУЕ>УрСУр Р-ЬЕ (ЗЕрГОЯО: 510) АТСТТТСССТСТАААТССТСОО АСОТТСАОТОСТАССАОТТСОеТ ТСТССТТССАСТССТТСТТСТОО ТТССССТТССССТАСТССТАТСТ ТССОТТОСААСТССТСССАТСТ АСАСТСТТАТСАСТТТ (8Ер ГО ΝΟ: 511) 1К С
2х ιώΤΝ8- Соп8-(Ы)~ 1К Μ-ΟΑζ)1РССКУДУПУОСУ(2 Р- С8С8АТСС8С8ТА8 8Сг8Сг8АТСг1РС.СК\У\УОУОСУС) Р-ЬЕ-5С-РС (8Ер ГО N0: 512) АТСТТТСОСТСТААОТОСТССС АССТТСАСТССТАССАСТТССОТ ТСТССТТССАСТССТТСТТСТОО ТТССООТТССОСТАСТООТАТСТ ТСООТТОСАААТООТОООАСОТ ТОАТТОТТАТСАОТТТ (8Е<3 ГО ΝΟ: 513) 1К N
2х ιηΤΝ8- Соп8-(С}- 1К РС-5С-АР- 1РС,СК\УУГОУОСУР Р- С8Ст8АТСгСг8Сг8ТА8 8С8О8АТС1ЕССКУДУОУПСУр Р-ЬЕ (8Ες ГО ΝΟ: 514) АТСТТТООСТОТААОТООТООО АССТТОАСТОСТАССАОТТСООТ ТСТООТТССАСТОСТТСТТСТОО ТТССООТТССОСТАСТООТАТСТ ТСООТТОСАААТООТОООАСОТ ТОАТТОТТАТСАОТТТ (8Е(^ ГО ΝΟ: 515) 1К С
МЫ 5- Соп1 ' рУЕЗЬС^ЕЕМШТО ρκι,Αδσρςσ САОСТТОААТСССТОСАОСАОС ТОСТОАТОТООСТООАССАОАА АСТСОСТТССООТССОСАООСТ (8Е(} ГО ΝΟ: 516) 5 §1у С
мы 5-1 : ЕШЕЕЕЕЗЬРЕЬЬКЕ МУР1ЫКАУ ί 1 СОТАТООААСТОСТООААТССС ТОТТСОААСТОСТОАААСАААТ ООТТССОСОТТССАААОСТОТТ (δΕςίϋΝΟ: 517) 5 §1у С
тЫ5-2 ι 1 рАУЗЕрНЕЕМШТО ι рКЕАЗСтРрН < < I САОССТОТТТСССТОСАССАССТ . ОСТОАТОТООСТООАССАОААА СТООСТТССООТССОСАОСАС ;8Ες ГО N0: 518) 5 £1У 1 с
- 59 009056
тЫ5-3 ОЕОЗЬС^ЬЬМАУЫ) (^КЬА8ОР(2Ь САССААОАСТСССТОСАОСАОС ТССТ6АТ6ТС6СТ0САССАСАА АСТООСТТССОСТССОСАОСТО (ЗЕрГОЫО: 519) 5 §1у С
тЬ15-4 РУА8Ь(даЫУШ)(^ КЬАрОРНА ССССТТССТТСССТбСАОСАССТ ОСТОАТСТООСТОСАССАОААА СТСОСТСАСОСгТССССАСССТ (8Е() ГО N0: 520) 5 £1у с
тЫ5-5 ЕУОЕЕрОЕЕУ’УТО НКЕА8СРЕ<3 ΖΆ * Α ΖΤΤΙΓΤΛζ—Ч А А А Ζ~4 А /~Л Ζ—Ч А /Т/~Ч щлло 11 илсилас ι сгслсгслете ТОСТСААСТОСгСТОСАССАСАА АстсесттсссстссестссАс (8Е<2 ГО N0: 521) 5 §1у с
тЬ15-6 ОУЕЗЕЕРЕЕМУ'ЕО ΗςίΑδΟΡΗΟ САССТТСААТСССТССААСАСС ТССТОАТСТССгСТОСАССАССА ССТООСТТСССОТССССАСОСТ (8Ες ГО ΝΟ: 522) 5 §1у с
тЬ15-7 ОУОЗЕррУЕЕХУЕЕ НКЬАЬСРрУ САССТТ'САСТСССТССАССАСб ТТСТОСТСТСССТССААСАСАА АСТООСТСТСОСТССОСАОСТТ (8Ες ГО ΝΟ: 523) 5 §1у с
тЫ5-8 ООЕЗЕОНЕЕМУ/ЕЕ рКЬАЬОРНО ООТСАСОААТСССТОСАОСАСС ТССТОАТОТСОСТССААСАСАА АСТОСгСТСТСССгТССССАССтСЧ (8Εζ) ГО ΝΟ. 524) 5 §1у с
И1Ы5-9 (Ζ)ΙΕΜΕΕ8ΕΕΟΕΕ№ ΜνΡΜδΝΑΓ САОАТСОАААТОСТССААТССС ТОСТООАССТОСТСССТСАСАТ С6ТТССОАТОТССААСССТТТС (8Ες ГО ΝΟ: 525) 5 §1У с
тЫ5-10 ЕУОЗЬррЬЬМЖЕ) 9КЬА8ОР(2А СААСТТСАСТСССТОСАССАСС ТССТСАТОТСОСТООАССАСАА АСТОССТТСССбТССОСАСОСТ (8Εζ) ГО N0: 526) 5 §1у с
тЫ5-11 1 ΕΟΕ8Ερζ)ΕΕΙΥΕϋΚ МЬЗЗСРрУ ОААСАСОААТСССТОСАОСАОС Т6СТСАТСТАССТССАСААААТ ССТОТССТССООТССССАССТТ (8Е() ГО ΝΟ: 527) 5 §1у с
тЫ5-12 АМОрЬНрЬиУШ) НКЬАЗСРрА ОСТАТСОАССАССТОСАССАОС ТСгСТСАТСТбССТСтСАССАСАА АСТООСТТССООТССОСАОССТ (8Ες ГО N0: 528) 5 §1у с
И11Л5-13 Е1ЕМЕЕ8ЕЬЕЕЕОЕ1 > ΑΕΙΡΚΑΎ ССгТАТССгАААЧ’СгСТССААТССС ГСгСТОСгААСТССТОСгАССАААТ СОСТСТСтАТССССт АА А ОСТТОСт £Е(2 ГО N0: 529) 1 5 §1у с 1 1 1
тЫ5-14 г ЕУУЗЕрНЬЕМШЕЕ НКЬАЗОРОО ЗАА6ТТОТТТСССТОСАОСАССТ ЭСТСгАТСгТООСТСгОААСАСААА ЧТОССТТССООТСССОАСООТ ;8Е(} ГО N0. 530) 5 §1у 1 С 1 1 1
тЬ15-15 ЭСЕЗЕррЬЬМтаО 5рЬА8ОРрК ЗСТССТСААТСССТССАССАСС ГССТОАТСТОССТССАССАССА ЗСТСССТТССОСТССССАСССТ 5 §1у
- 60 009056
(8Е() ГО N0: 531)
тЬ15-16 оУЕЗЬфрьыгиэн МБУЗСРЕГО ООТСгТТСААТСССТСгСАССАОС ТОСТОАТСТТССТССгАССАСАТО СТСОТТТССССТССССАССАС (8Е(2 ГО N0: 532) 5 §1у С
тЫ5-17 ΚΑΈδΙ.ΕΗΕΜΜΑΉΕ КБЕАЗбРУА ААССТТОААТСССТООААСАСС ТСАТОАТСТООСТОСААСОТСТ ССТООСТТССООТССОТАСССТ (8Εζ) ГО ΝΟ: 533) 5 §1у с
тЬ15-18 рУОЗЕфрЕЕПУЪВ НфЬАЗОРКК САССТТОАСТСССТССАОСАСС ТССТОАТСТСССТССАССАССА ОСТООСТТСССОТССОАААССТ (8Εζ) ГО N0: 534) 5 §1у с
тЬ15-19 БУЕ^рЕРМУ/ЬЕ НКЬА(ЖрС СААОТТСААТСССТОСАССАОС ТОСТОАТСТООСТООААСАСАА АСТООСТСАСООТССОСАОООТ (8Ες ГО N0: 535) 5 §1У с
тЫ5-20 ЕУОГОрСХЕЕМУЕО (ЗКЬАЗОРНА СгААСТТСгАСТСССТСгСАСгСАОС ТССТОАТОТООСТОСАССАОАА АСТООСТТССООТССССАСОСТ (8Ер ГО N0: 536) 5 £1у с
тЫ5-21 ЕУШЬЭрЕЕМУЪО ффЕА8СРфК СААСТТСАСТСССТОСАССАСС ТССТСАТОТСОСТССАССАОСА ССТООСТТССОСТССССАСААА (8Εζ) ГО N0: 537) 5 §1У с
П1Ы5-22 СгУЕфЕРфЕЕМЛУЕЕ рКЪАЗОРфК ОСТСТТСААСАОСТСССССАСС ТССТСАТОТСОСТООААСАСАА АСТООСТТССОСТССССАСССТ (8ΕΡΙΟΝΟ: 538) 5 §1у с ί
тЫ5-23 ΟΕΜΕΟφΕΕΜλνΕϋ (^ЬААОРрУ ОСгТСгААСАСТСССТСгСАССАСгС ТОСТСАТвТввСТССАССАССА ССТСССТССТССТСС6САООТТ (8Е(} ГО N0: 539) 5 §1У с
тЫ5-24 АШЗЕррЕЕМУЪО ККБАЗСРНУ ОСТСАССАСТСССТОСАССАОС ТССТОАТСТСССТСОАССОТАА АСТСССТТССС6ТСС0САС6ТТ (8Εζ) ГО N0: 540) 5 §1у с
тБ 15-25 ΡνϋδΕΡφΕΕΠνΕΟς) КЕАЗСРрб ССООТТОАСТСССТССАССАОСТ ССТОАТСТСОСТССАССАОААА СТбССТТССССТССССАСОСТ (8Εζ) ГО N0: 541) 5§1У с
тЫ7-Соп2 рЗВАТЕЕКЕЕШ/Е УЕ6ЕСОКС)А САСТСССОТОСТАСССТОСТСАА АСгААТТСТСгССАССТССТТСАА □СТСТСССТбАСАААСАбССТ (8Ες ГО N0: 542) 5 §1у с
тЫ7-19 Е1КАТЕБКЕЕ^ЕУ □ΕΑΉΕ0ΡΝ ЗАААТССОТОСТАСССТОСТСА ААОААТТСТОССАОСТООТТОА СОААТООСОТОААСАОССОААС (8Е(2 ГО N0: 543) , 5 §1У с
- 61 009056
тЪ17-20 (>КАТЬЬКЕРЬ(;)Ь\/ ΗΟΡΟΕΤϋδ Γ САОСТОСОТОСТАСССТОСТОА ААОААТТССТОСАОСТОСТТСА СООТСТОООТОАААССОАСТСС (δΕΟ ГО ΝΟ: 544) 5 §1у с
П1Ы7-21 токатрекеру/ое! ЕОЕООКНУ АСССАОССТОСТАСССТОСТОА ААОААТТСТООСАОСТОАТСОА АСОТСТОООТООТАААСАСОТТ (δΕΟ ГО ΝΟ: 545) 5 §1у с
тЫ7-22 НУКАТЬЬКЕР^Ь УПОЬКЕООУ САСТАССОТОСТАСССТОСТОАА АОААТТСТООСАОСТООТТСАС ОСТСТОСОТОААСАСООТОТТ (δΕΟ ГО ΝΟ: 546) 5 §1у с
тЫ7-23 (ЖУТЬЬКЕГУЮЬ νΕδΥΚΡίνΝ САОТСССОТОТТАСССТОСТОСО ТСААТТСТООСАОСТООТТОААТ ССТАССОТССОАТССТТААС (δΕζ) ГО ΝΟ: 547) 5 §1у с
тЫ7-24 ΕδΚΑΤΕΕΝΕΡ\νΓ)Ρ УОООМЖКМ СТОТСССОТОСТАСССТОСТОАА СОААТТСТООСАОТТСОТТОАСО ОТСАОСОТОАСАААССТАТО (δΕΟ ГО ΝΟ: 548) 5 §1у с
тЫ7-25 ШЖАТЕЬЖФУТНЬ ΜΕΕΕδζίΚΡΟ ТОООАССОТОСТАСССТОСТОА АСОАСТТСТООСАССТОАТООА АОААСТОТСССАОАААССОООТ (δΕΟ ГО ΝΟ: 549) 5 §1у с
тЬ17-2б ОЕКАТЕЬКЕЕУОРМ \ΈΟΕΟΚΝΚΟ САСОААСОТОСТАСССТОСТОА ААОААТТСТООССТАТОСТТСА АООТСТОООТАААААССОТООТ (δΕΟ ГО ΝΟ: 550) 5 §1у с
П1Ы7-27 МЕИАТРЕКЕРУ/ОЬ ναογονΝΟκ ААСОААСОТОСТАСССТОСТОС 5 §1у ΟΤΟΑ АТТСТООС АОСТООТТООТ1 ООТТАСООТОТТААССАОСОТ ί (8Е0ГО N0:551) | с
тТЫ8Сопб -1 ΟΚΕλΥΥΡΟΥΟΟΡΙΡ АУСУОЬНКА САОСОТОААТООТАСССОТОСТ АСООТООТСАССТОТООТОСТА СОАССТОСАСАААОСТ (δΕζ) ГО ΝΟ: 552) 5§1у С
ηϊΓΝδΟοηό -2 1 ΙδΑλΥΥδΟΥΑΟΗΓλν САУОЬКОК АТСТССОСТТОСТАСТССТОСТА СОСТООТСАСТТСТООТОСТООО АССТОАААСАОААА (δΕ() ГО ΝΟ: 553) 5 ё1у 'С , 1 1
ιηΤΝδΟοηό АУТОУ^ОСУОСНЬ ' -3 ,ΨΟΥϋΙΉΚΚ . , 1 ТСОАСССОТТООТАССАСТОСТ '5 §1у ι АСООТООТСАССТОТООТОСТА ССАССТОСОТСОТААА (δΕΟ ГО ΝΟ: 554) с
ιηΤΝδΟοηό ’ -4 ΚΤΡ/ΥΥΡΟΥΒΟΡΙΡ . ΎΟΥΝΕΚδδ ι ] ААААССТТСТООТАСССОТОСТА 5 §1у < СОАСОСТСАСТТСТООТОСТАСА А.ССТОАААТССТСС (δΕΟ ГО ΝΟ: 545) с
тТШСопб ] -5 < ΕδΚ\ΥΥΡΟΥΕΟΗΡλν < ΡΡΟΕΤΕΤ < < ЗААТССССТТООТАССССТОСТА 5 §1у < РОААООТСАССТОТОСТССТТС 1 ЗАССТОАССОАААСС (δΕΟ ГО 3
- 62 009056
N0: 546)
тЬ24-1 МУРРЭУУ'РКНСЖ ννγςννΣϋΐΝν ААТОТТТТТТТТСААТССОТТСА ААААСАТСОТСОТОТТСТТТАТС ААТСгСгСТТСАТАТТААТСТТ (8Е(2 ГО N0: 557) 5 §1у С
тЬ24-2 ΡϋΡΣςλνΕςΝΗΚδΕ УЕНХУЕУМОУ ТТТСАТТТТСТТСААТСОСТТСА АААТСАТССТТСТОААСТТОАА САТТССгСТТСТТАТООАТОТТ (8Εζ) ГО ΝΟ: 558) 5 §1у С
тЬ20-1 НрКВМЗМЕУ/ЕЕЕ ОУЬООЫЮУЗ САТСААСОТОАТАТСТСТАТОСТ ТТССОААСТТСТТСгАТСТТСТТО АТОСТСТТССтТСААТАТТСТ (8Εζ)Π)ΝΟ: 559) 5 §1у с
тЬ20-2 ТрКРЖЗМЬООЬЬЕ УЕОрЕКррК АСТСААСОТОАТАТОТСТАТОСТ ТОАТООТСТТСТТСААОТТСТТО АТСААСТТССТСААСААССТ (8Е<2 ГО ΝΟ: 560) 5 §1у с
тЬ20-3 Т8КВМ5ЬЬУ/ЕЕЬЕ ЕЬОКЕОНрК АССТССССТОАСАТОТСССТОСТ ОТОООААСТОСТОСААОААСТО СлАСССгТСТОСгОТСАССАОССТ (8Е(2 ГО ΝΟ: 561) 5 §1у с
тЬ20-4 МС/НОМУМЕУСЕУ ЕЬЕЕ8ЕОН(21 АТССААСАТСАТАТ6ТСТАТССТ ТТАТООТСТТСТТСААСТТСТТО ААТСТСТТОСТСАТСАААТТ (8Ер ГО ΝΟ: 562) 5 §1у с
тЬ20-5 ШЖОМКМЕЕЗЬРЕ уыэсыаду ТСОААТСОТСАТАТОСОТАТОСТ ТСААТСТСТТТТТ6ААСТТСТТО АТОСТСТТС6ТСААСААСТТ (8Е(2 ГО ΝΟ: 563) 5 §1у с
тЕ20-6 бУШЖЗМЕЕбЕЬА УЕОКЕбРрЕ ССТТАТСОТСАТАТСТСТАТССТ ТСААСОТСТТСТТОСТСТТСТТС АТССТСТТССТССАСААСТТ τη ΝΤΟ- «ΑζΠ ту 5 И1У с
тЕ20 Соп1 ТРКОМЗМЕЕСЕЕЕ ЕЕЛКЕСОЭК АСТСААССТСАТАТОТСТАТОСТ ТСААССТСТТСТТСААСТТСТТС АТССТСТТСбТС’ААСААСбТ (8Е<2 ГО N0: 565) 5 §1у с
тЬ20 Соп2 ΑΎΒϋΜ8ΜΕΕ6ΕΕΕ УЕОКЪССда ТСОТАСС6Т6АСАТСТССАТОСТ ОСААОСТСТССТССААСТТСТО САССбТСТООСТСАОСАССОТ (8Е0 ГО N0: 566) 5 §1у с
тЬ21-1 Τ0Ν8Κ.ζ)ΜΕΕ8ΟΡΜ МЬУОЗМЩС АСТСААААТТСТСОТСАААТОСТ ГСТТТСТОАТТТТАТСАТОСТТС ГТСгСТТСТАТСАТТСААСтСТ (8ЕС2 ГО N0: 567) 5 §1У с
тЬ21-2 Ί М9Т8КН1ЬЬ8ЕРМ УЕУСг81МН6 АГССАААСТТСТССТСАТАТТСТ ГСТТТСТСгААТТТАТСгАТСгСТТС ГТСОТТСТАТТАТОСАТОСТ ;8Е(} ГО N0: 568) 5 §1У с
- 63 009056
тЬ21-3 ΗϋΝδΚςΜΕΕδϋΙΉ НБУСТМ^С САССАСААСТСССОТСАОАТОС ТССТСТСССАССТССТССАССТС СТТОСТАССАТОАТССАСООТ (8Е() ГО N0: 569) 5 §1у С
тЬ21-4 МЕЖКЭЖЬКЕЫ ΜΕνθΝΜ8ΗΟ АТССААААСТСССОТСАСААСС ТССТОССТОААСТСАТСАТОСТС СТТ6СТААСАТСТСССАССАС (8Е<р ГО N0: 570) 5 §1у с
тЬ21-5 (ЗОТЗИНМЕБКЕЕМ МЕУОЕМ1(}Ст САС6АСАССТССССТСАСАТ6С ТССТОСОТОААТТСАТСАТОСТО ОТТОСТОАААТОАТССАОООТ (8ЕЭ ГО ΝΟ: 571) 5 §1у с
тЬ21 Соп1 Οζ)Ν8Κ()ΜΕΕ8ΒΕΜ 1БУО8МЮС САССАОААСТСССОТСАОАТОС ТССТСТСССАССТСАТСАТССТС СТТОСТТССАТСАТССАСООТ (8Е(3 ГО ΝΟ: 572) 5 £1у с
ΙΠΤΝ8-19-1 УАЕНС()СТ1ШРУ7 ΜΟΡΡςκΕσ СТТОСТСТТСАТССТСААТеТАС ТСОТТООССАТОСАТОТСТССАС САСААСОТСААСОТ (8Εζ) ГО N0: 573) 5 §1у с
ηιΤΝ8-19-2 УРЕрОБСТВДУРУ/ МСРР(])ТЕА ТАТССАСгААСААСгСТСТТТСТАС ТССТТООССАТООАТСТСТССАС САСАААСТСТТСгСТ (8Е(} ГО Ν: 574) 5 §1У с
тТА8- 19-3 6ЕНрСНСТК\УРА' ΜϋΡΡζΗΟδΝ ССТСТСААССАООСТСАСТСгСА СССОТТООСССТССАТОТОССС ОССОСАОСАСТССААС (8ЕЭ ГО N0: 575) 5 §1У с
1Τ1ΤΝ8-19-4 1 | М1ТрО(2СТ1ШРУ7 МСРР()Р8Сг АТСАТТАСТСААССТСААТСТА СТСОТТООССАТООАТОТОТССА ССАСААССАТСТОСТ (8Е(^ ГО N0: 576) 5 §1у с
Π1ΤΝ8-19-5 АСАрЕНСТКАРХУ ΜϋΑΡΝΟΑΙ ССТСОТССТСАСОААСАСТОСА ССССТТООСССТССАТСТОСССТ ССОААСОАСТСгОАТС (8Εζ) ГО N0: 577) 5 §1У с
ΙΠΤΝ8-19-6 суырорсткутш ΜΟΡΡΝΟΑΈ СтСТСгТТААССАСОбТСАСТССА ССССТТССССТТССАТСтТССССС СССААСОСТТСгОСАА (8Εζ) ГО N0: 578) 5 §1У с
Π1ΤΝ8-19-7. ΕΑϋΗΟςΟΙΚΑΡΑ МСРРЕОАЕ ь 1 СТООСТОАССАСОСТСАОТОСА ТСССТТСОССОТОСАТОТССССО ССОСААСОТТОООАА (8Ер ΙΒ N0: 579) 5 §1у 1 с
Π1ΤΝ8-19-8: 1 [ЕЕрАрСТКАРАМ . СРРрКСС ΐ 1 АТССТССААСАООСТСАОТОСА СССбТТСОСАСТССАТбТСССС ЭССССАОССТСОТССТ (8ЕС) ГО N0: 580) 5 §1у 1 с
тТК8-19--9' 1 ГрТНАС^СТВЛУРА . МСРРрАЕС ' АСТСАААСТСАТССТСААТеТАС: ГСОТТССтССАТССАТСТСТССАС 5 §1У < 3
- 64 009056
САСААТООСААССТ
N0: 581)
Π1ΤΝ8-1910
УУТрСНСТЬУТРУ/
МСРРфКЛУК
Π1ΤΝ8-1911 ιηΤΝ8-1913
Π1ΤΝ8-1914
ЕРТОУ/НСТКЛУРАУ
ΜϋΡΡ(2Κ.8(2
1ΏΤΝ8-1915
ЬООрУ/рСТКЛУРУ/ мсрррорз
1ΏΤΝ8-1916
УрТрСЬСТКУУРУУ мсрррзрк
ΠΪΓΝ8-1917
Е8Ж)СрСТКЛ¥Р\¥
ΜϋΡΡί^οσλν
Π1ΤΝ8-1918
ШТОКСРСТКУТЖ
ΜϋΡΡ(2ΑΝσ
Π1ΤΝ8-1919
УОТРСРСТКЛУРЗУ
МСРРУЕТС
Π1ΤΝ8-1920 руерсксткуфуа
МСРРУЕУЕ
1УРН^СТЕ\УРАМ
ΟΡΡρΡΥΡ
Π1ΤΝ8-19· зуу/рррстклурду
МСРРфУУКС
МЗУррОНСТКУ/РАУ
МСРРрО\УС
САСААСОТТООСОТ (δΕςίϋ
N0: 582)________________________ ' АТТТАТССАС АТСАТС А АТСТАС
ТССТТСРССАТССАТСТОТССАС САСААССАТАТССА (8Ер ГО N0: 583)______________________________ ’ ТСТТАТТРССААОСТСААТОТАС ТСОТТООССАТООАТСТСТССАС САСААТСОССТООТ (8Еф ГО N0: 584)________________________ ' АТСТСОС ААС АА6СТС АТТ6ТА СТССТТССгССАТССАТСТСТССА ССАСААОСТТСССОТ (8Ер ГО N0: 585)
СгСССгСАОССТТСССАС
N0: 586)
СССОСАСССТТТСТСС (8Ер ГО N0: 587)________________________ ’ ТАТСАААСТСААСОТСТТТСТАС
ТССТТСгСССАТОСАТСТОТССАС САСААТСТСААС6Т (8Е() ГО N0: 588)________________________ ' СААТСТААТСААССТС ААТСТА
СТСОТТООССАТОСАТОТОТССА ССАСААОСТОСТТСС (8ЕС) ГО N0: 589)________________________
ТССАСССАСССТССТСССТССА ССССТТООССРТССАТСТСССС
С1СС6СА66СТААСССТ (8Ер ГО N0: 590)
ССССТАССАААСССОТ
ГО N0: 591)
ОСССТАССААОТТСАА (8ЕР ГО N0: 592)
ΙΠΤΝ8-1921
ЗЕУрСЕСТРЖРЕУ
Μορρςσνζκ
ОССОСАОООТТООААА
N0: 593)
- 65 009056
χηΤΝ8-19- 22 ТРЗфСНСТКЖЖ МСРРфСШЗ АССТТСТСССАООСТСАСТССАС ССОТТОСССОТСОАТСТССССС ссесАсооттооеот (ЗЕрго N0: 594) : 5 Ду С
Π1ΤΝ8-19- 23 РЗАНОНСТВЖк МСРРфЗКУ СССОСТССТСАССАССАСТССА сссоттсессетооАтстоссс ОССОСАОТСССОТТАС (8ЕРГО ΝΟ: 595) 5 Ду с
Π1ΤΝ8-19- 24 УАЕЕкНСВВЛУРк ΜϋΡΡφϋλνΚ СТТОСТСААОААТООСАСТОСС СТССТТСбССбТОбАТЗТСССС ОССОСАСОАСТОССОТ (ЗЕРГО ΝΟ: 596) 5 Ду с
Π1ΤΝ8-19- 25 УСТСЖНСТКкРУ/ МСРРфРАО СТТССгТАСССАСОСТСАСТССА СССОТТССССРТОСАТОТОССС ОССОСАОССООСТООТ (8Ер го ΝΟ: 597) 5 £1у с
Π1ΤΝ8-19- 26 ΕΕϋφΑΗΟΚδλνΡλν МСРРрСДУУ 6ААСААОАССАСССТСАСТОСС СТТССТООССОТООАТОТОСССС ССОСАОООТТСООТТ (ЗЕрГО N0: 598) 5 Ду с
ιηΤΝ8-19- 27 АВТрОНСТВЛУРАУ МСРРрНЛУЕ ССТОАСАСССАСССТСАСТССА ссссттеоссбтссАтетоссс ОССССАОСАСТСгОТТС (8ЕР ГО N0: 599) 5 ДУ с
Π1ΤΝ8-19- 28 ЗОРрОНСТВЛУРк7 МСАРрОУФ ТССОСТССОСАСОСТСАСТССА СССОТТООССОТОСАТОТОСОСТ ССССАСССТТССТТС (ЗЕрГО N0: 600) 5 ДУ с
111ΤΝ8-19- 29 ТЕУрСНСТВУ7Р\У МСРРрВЖУ АСССТСЮТТСАОСОТСАСТОСА ССССТТСОССОТСОАТСТСССС ОССССАСССТТСООТТ (8Ер ГО N0: 601) 5 Ду с
Π1ΤΝ8-19- 30 СМАНСКСТКШАХУ МСРРрЗЖ ССТАТСОСТСАСООТАААТОСА СССОТТООССТТООАТОТОСССО СС0СА0ТССТ6СААА (ЗЕрГО ΝΟ: 602) 5 ДУ с
Π1ΤΝ8-19- 31 ЕЬУНСрСТКАУРЗУ МСРРрЗУ/А ОААСТСТАССАСООТСАСТССА ССССТТСОСССТОСАТСТСССС ОССССАОТССТСООСТ (ЗЕр ГО N0: 603) 5 Ду с
ιηΤΝ8-19- 32 : УАОНСНСТКАУРЧУ МСРРрОШг СТТССТСАССАСССТСАСТССА СССОТТООСССТООАТОТОССС ОССССАСООТТООООТ (ЗЕр ГО N0: 604 5 Ду с
ηϊΓΝ8-19- : зз : РЕЗРСНСТКЖУУ 1 МСРРрОШЗ 1 1 ССОСААТСССАООСТСАСТССА ССССТТСССССТОСАТСТОССС ЗСССгСАСтССТТССОСтТ (ЗЕр II) N0: 605) 5 Ду с
Π1ΤΝ8-19- : 34 ι (РАНОНСТВАУРАУМ СРРДВ.ХУВ. . 1 АТСССООСТСАСООТСАСТОСА ЗЖбТТСОСССТСОАТЗТСССС 5 ДУ С
- 66 009056
ОССОСАОСОТТООСОТ (8Е(}ГО ΝΟ: 606)
Π1ΤΝ8-19- 135 РТУНбНСТКЖРУ МСРРУОТУ ТТСАССОТТСАСООТСАСТССАС ССОТТООССОТООАТОТОСССО ССОТАСООТТОООТТ (8Е(2ГО ΝΟ: 607) 5 §1У с
Π1ΤΝ8-19- 36 ΡϋΡΡΟΗΟΤΚλνΚλν МСРРРОАУЕ ССАОАТТТТССАСгСТСАТТОТАС ТСОТТООСОТТОСАТОТОТССАС САСААООТТООСАА (8Е(} ГО ΝΟ: 608) 5 §1у с
Π1ΤΝ8-19- 37 ОЬШЗОРСТрАУРАУ МСРРКСгКУ САСгСТОТОСтСАСгОСТСССТОСА СССАОТООССОТООАТОТОССС ОССОАААССТСОТТАС (8Е(2 ГО ΝΟ: 609) 5 £1у с
Π1ΤΝ8-19- 38 НАЖЮНСТКШЖ МСРР(Ж6<Э САСОСТААСОАСООТСАСТОСА СССОТТСОСАОТСОАТСТОССС ОССОСАОТООСОТОСТ (8Е<3 ГО ΝΟ: 610) 5 §1У с
ιηΤΝ8-19- 39 ЕТОБЮЬСТКЖРУУ МСРРУСАК ОАААССОАССАСООТСТОТОСА СССОТТСОССОТОСАТОТСССС ОСССТАСОСТОСТСОТ (8Е(2 ГО ΝΟ: 611) 5 §1у с
Π1ΤΝ8-19- 40 ОТШ^СЬСТКЛУРАУ МСРР(2СЖ(3 ООТАССТООСАОООТСТОТОСА СССОТТООССОТООАТОТОССС ОССССАСССгТТСгСгСАС (8Ες го ΝΟ: 612) 5 §1у с
Π1ΤΝ8-19 Соп1 νΑΤ(2Ο(2<2ΤΚ.·\νΡΑν МСРРС)0\У6 СТТСгСТАСССАОСгСгТСАОТСгСА ССССТТООССОТССАТСТОССС ОССОСАОСОТТООСОТ (8Εζ) ГО N0:613) 5 §1у с
Π1ΤΝ8-19 Соп2 УАТ(2(К)СТКЛУР\У МСРРСЖШл СТТОСТАСССАОООТСАОТОСА ССССТТООССОТОСАТОТОССС ОССОСАОСОТТООООТ (8Εζ) ГО ΝΟ: 614) 5 §1у с
2ΧμΤΝ8- ' 19-7 . 1 ( ЕС-50-Ας- РАОНС1С)С1ГОУР\У МСРРЕС1\УЕРЕСг8О 8АТ6О8О8ТА88О8 □ЗАТбРАЭНСОа КЛУРУШСРРЕСАУЕ ’ -ЬЕ (8Е<3 ГО N0: ' 515) | ί СТТОСТОАТСАТООТСААТСТАТ ТС0ТТ00ССАТ00АТ6Т6ТССАС САСАА00ТТОО6ААСТССА666 ТТССОСТТССОСТАССССССССТ СТ0ССТССАСТ6СТТСТТСС00Т ТСССОТТСТОСТАСТСОТСТООС ТОАССАСООТСАОТОСАТССОТТ ООСССТССАТСТСССССССССА АООТТОООААСТОСАА (8Е(^ ГО N0: 616) 1К с
- 67 009056
2Х ιηΤΝ8- 19-7 8Т— ОО йе12х ЕЕ ЕС-50-Αζ)- ЕАЛНОрС1К.АУРАУ ΜΟΡΡΕΟλΥΕΟδΟδΑ ТОС8ОООА88С8О ЗАТОЬАОНСССЖ АУРУ/МСРРЕСАУЕ (8ЕО ГО N0: 617) СТТОСТСАТСАТООТСААТСТАТ ТСОТТСОССАТООАТСТСТССАС САОААООТТОООААООТТССОО ТТССОСТАССООСОССТСТООСС отоососттсттссооттссоот ТСТОСТАСТООТСТООСТОАССА СОСТСАОТОСАТССОТТООССОТ ООАТОТОТССАССАОААООТТО (ЭСгАА (8ЕС ГО N0: 618) 1К с
2Х Π1ΤΝ8- 19-21 РС-50-Αζ)- ЗЕУРОЬСТКЛУРАУ МСРРрОУ7КЬЕО8О 8АТОО8О8ТА88О8 ОЗАТОЗЕУрОЬСТ клуру/мсррооаук -ЬЕ (8Ες ГО N0: 619) ТСТОААТАТСААОСТСТТТОТАС ТСОТТООССАТООАТСТОТССАС САСААООТТООАААСТСОАООСт ТТССООТТССОСТАССООСООСТ СТООСТССАСТОСТТСТТССООТ ТССОСТТСТОСТАСТСОТТСТСА СТАТСААООССТСТОТАСТСОСТ ООССАТОСАТОТОТССАССАСА АООСТООААОСТООАА (8Е(^ ГО N0: 620) 1К с
2Х ιηΤΝ8- 19-21 8Т— ОС с!е12х ЬЕ ГС-5 С-А р- ЗЕУрОЬСТКДУРАУ МСРРОСЖКС8С8А ТОС8ОООА88О8О 8АТО8ЕУрОЬСТК УУРАУМСРРС^ОАУК (8Е(} ГО ΝΟ: 621) ТСТСААТАТСААООТСТТТСТАС ТСОТТООССАТООАТСТОТССАС САСААССТТССААЛССТТСССС ТТССССТАССССССОСТСТОССО атсасасттсттссоаттссаат ТСТССТАСТОСТТСТСАСТАТСА АССССТСТСТАСТСССТССССАТ ССАТСТОТССАССАСААССТТС СгААА (8Εζ) ГО N0: 622) 1К с
2Х тТЫ8- 19-22 РС-5С-А0ТРЗрОНСТГОУРУР МСРРСС\Г6ЕЕС8Сг 8АТОО8О8ТА88О8 ОЗАТОТРЗООНСТ КЛУРАУМСРРрСШл -ЬЕ (8Εζ) ГО N0: 623) АСТТТТТСТСААССТСАТТСТАС ТССТТСОССАТССАТСТСТССАС САСААССТТСОССТСТССАССО ТТСССОТТССССТАССОСССССТ СТСССТССАСТССТТСТТССССТ ТССССТТСТССТАСТССТАСТТТ ТТСТСААСгОССАТТСгТАСТССгСТ ССССАТОСАТСТСТССАССАСА АОССТОООСССТССАА (8Ες ГО N0: 624) 1К с
2Х Π1ΤΝ8- 19-32 ЕС-5С-АС)- УАЛНОНСТКЛУРАУ МСРРООШТОЕСЗС ЗАТОО8О8ТА88О8 ОЗАТСУАЛНОНСТ КДУРЧУМСРР(20\УС -ЬЕ {8Εζ) ГО N0: 625) р СТТОСТСАТСАТОСТСАТТСТАС ТССТТССССАТСОАТСТСТССАС САСААССТТССССТСТСОАССО ГТССОСТТССССААССООССССТ СТСССТССАСТССТТСТТССССТ ГССССТТСТССТАСТССТСТТСС ГСАССАСССТСАСТССАССССТТ СССССТССАТСТСССССССССА ЗСОТТССССТСТССАА (ЗЕО ГО МО: 626) 1К I ί с
- 68 009056
2Х Π1ΤΝ819-32 8Т— ОС с1е!2х ЬЕ РС-5С-А0- УАСНСНСТКУ/Р V/ МСРРрОЗУаСЗСЗА ТСС8ООСА88С8С ЗАТСУАОНСНСТК АРАУСРРрСАС (ЗЕр ГО N0: 627) СТТССТСАТСАТССТСАТТСТАС ТССТТССССАТССАТСТСГССАС САСААССТТСааСТССТТСССС ТТССОСТАССССССССТСТОССС СТССТССТТСТТССССТТССССТ ТСТССТАСТССТСТТССТСАССА СССТСАСТССАССССТТСССССГ СССТСТСТССАССАСААССТТС ОСОТ (ЗЕр ГО N0: 628) 1К с
2Х ΠΪΓΝ8- 19-33 РС-5ОАСРЕЗрСНСТКУ/РАУ МСРРрОШЗЬЕСЗС 8АТСО8С8ТА88О8 СЗАТСРЕЗрСНСТ ВАРАМСРРрСАС ЬЕ (ЗЕр ГО N0: 629) ССАСААТСТСААССТСАТТСТА СТСаТТССССАТССАТСТСТССА ССАСААССТТССССТСТССАСа СТТССССТТССССТАСССОСССС ТСТСССТССАСТССТТСТТСССС ТТССССТТСТССТАСТССТСССС ААТСССАСССГСАСТССАСССС ттсассстасАтатсссссссс САСССТТСССаТСТССАА (ЗЕр ГО N0: 630) 1К с
2Х Π1ΤΝ8- 19-33 8Т— СС де12х ЬЕ ГС-5С-АРРЕЗРОНСТКАРА МСРРрОАСОЗСЗА тасзсссАЗзсзс ЗАТСРЕЗрСНСТК. АР АМСР РРСАС (ЗЕр ГО ΝΟ: 631) ССАСААТСТСААССТСАТТСТА СТССТТССССАТССАТСТСТССА ССАСААССТТССССТССТТССС СТТССССТАССССССССТСТССС сатсстссттсттссссттсссс ТТСТССТАСТССТССССААТССС АСССТСАСТССАССССТТСаСС аТССАТСТСТССАССАСААССТ ТССССТ (ЗЕр ГО N0: 632) 1К с
Пример 7. 1п У1!го скринирование аффинно зрелых пептидных антител.
Следующие примерные пептидные антитела были скринированы согласно вышеизложенным инструкциям для того, чтобы получить величины следующих Ко и 1С50. В табл. VII показан уровень величин Ко для отобранных аффинно зрелых пептидных антител, сравниваемых с родительскими пептидными антителами, определенный КтЕхА™ исследованием или В1Асоге® анализом. Эти величины демонстрируют повышенную аффинность связывания аффинно зрелых пептидных антител по отношению к миостатину по сравнению с родительскими пептидными антителами. В табл. VIII показаны величины 1С50 для ряда аффинно зрелых пептидных антител. Уровень значений охарактеризован в этой таблице.
Таблица VII
Пептидные антитела к0
ΤΝ8-19 (рагеп!) > 1 пМ
2χιηΤΝ8-19 (рагеп!) > 1 пМ |
1х Π1ΤΝ8-19-7 10 рМ
2х ιηΤΝ8-19-7 12 рМ
1ΧΠ1ΤΝ8-19-21 6 рМ
2х ιηΤΝδ-19-21 6 рМ
1χιηΤΝ8-19-32 9 рМ
1ΧΠ1ΤΝ8-19-33 21 рМ
2χιπΤΝ8-19-33 ЗрМ
1ΧΠ1ΤΝ8-19-22 4рМ
1х πιΤΝ8-19-οοη1 20 рМ
- 69 009056
Таблица VIII
Аффинно зрелое пептидное антитело 1С50(пМ)
ιτιΤΝ8-19ϋοη1 1.0-4.4
Η1ΤΝ8-19-2 7.508-34.39
1Ι1ΤΝ8-19-4 16.74
Π1ΤΝ8-19-5 7.743-3.495
ΠΪΤΝ8-19-6 17.26
Π1ΤΝ8-19-7 1.778
Η1ΤΝ8-19-9 22.96-18.77
1ΗΤΝ8-19-10 5.252 - 7.4
Π1ΤΝ8-19-11 28.66
ι-ηΤΝδ-19-12 980.4
Π1ΤΝ8-19-13 20.04
Π1ΤΝ8-19-14 4.065-6.556
Π1ΤΝ8-19-16 4.654
ιηΤΝ8-19-21 2.767-3.602
Η1ΤΝ8-19-22 1.927-3.258
Π1ΤΝ8-19-23 6.584
1ΗΤΝ8-19-24 1.673-2.927
Π1ΤΝ8-19-27 4.837-4.925
1Ι1ΤΝ8-19-28 4.387
Π1ΤΝ8-19-29 6.358
ιηΤΝ8-19-32 1.842-3.348
Η1ΤΝ8-19-33 2.146-2.745
тТЫ8-19-34 5.028-5.069
шТЫ8Сопб-3 86.81
тТИ8Соп6-5 2385
тТЫ8-19-7(-ЬЕ) 1.75-2.677
ιηΤΝ8-19-21(-ΕΕ) 2.49
ιώΤΝ8-19-33(-ΕΕ) 1.808
2χπίΤΝ8-19-7 0.8572 -2.649
2χπιΤΝ8-19-9 1.316-1.228
2χιηΤΝ8-19-14 1.18-1.322
2χηϊΓΝ8-19-16 0.9903 -1.451
2χπιΤΝ8-19-21 0.828 -1.434
2χιηΤΝ8-19-22 0.9937-1.22
2χηιΤΝ8-19-27 1.601-3.931
2χιηΤΝ8-19-7(-ΕΕ) 1.077-1.219
2χιηΤΝ8-19-21(-ΕΕ) 0.8827-1.254
2χηιΤΝ8-19-33(-ΕΕ) 1.12-1.033
Π1Ε2-7 90.24
тЬ2-9 105.5
тЬ15-7 32.75
тЬ15-9 354.2
тЬ20-2 122.6
тЬ20-3 157.9
тЬ20-4 160
Пример 8. Οι νίνο анаболическая активность примерных пептидных антител.
С1)1 ηιι ηιι мышей (СЬаг1ез КАег ^аЬο^аίο^^ез, МаззасЬпзеИез) использовали для определения ίη νίνο эффективности пептидных антител настоящего изобретения, которые включали Ес область человека (ЬиЕс). Эта модель реагировала на ингибиторы настоящего изобретения с быстрым анаболическим ответом, который бы ассоциировался с повышенной массой сухих мышц и повышением уровня миофибриллярных протеинов, но не был связан с аккумулированием влаги в организме.
В одном примере эффективность 1х пептидного антитела тТ^-ГО^ ίη νίνο была продемонстрирована следующим экспериментом. Группа из 10 8-недельных С1)1 ηιι ηιι мышей получала дважды в неделю или один раз в неделю дозы 1, 3 и 10 мг/кг (подкожная инъекция). Контрольная группа из 10 8-недельных С1)1 ηιι ηιι мышей получала дважды в неделю (подкожно) инъекцию ЬиЕс (носитель) 10 мг/кг. Животных через день взвешивали и с помощью ЯМР определяли массу тощих мышц на день 0 и
- 70 009056 день 13. Затем животных умерщвляли на 14-й день и определяли величину гастрокнемиальной мышцы. Результаты показаны на фиг. 2 и 3. На фиг. 2 показано увеличение общей массы тела мышей на 14-й день после различных дозировок пептидных антител по сравнению с контролем. Как видно на фиг. 2, все дозировки показали повышение массы тела по сравнению с контролем, причем все дозировки показали статистически существенное превышение над контролем к 14-му дню. На фиг. 3 показано изменение массы тощих мышц на день 0 и день 13, что определяли с помощью ЯМР, а также изменение веса гастрокнемиальной мышцы, иссеченной у животных на день 14.
В другом примере 1хт ΤΝ8-19-32 пептидное антитело вводили 0Ό1 ии/ш мышам инъекционно 2 раза в неделю при дозах 1, 3, 10 и 30 мг/кг в сравнении с йиЕс контролем (носитель). У получивших пептидное антитело животных повысилась общая масса тела (не показано), а также масса тощих мышц на 13 день по сравнению с днем 0, что было определено с помощью ЯМР. Увеличение массы тощих мышц показано на фиг. 4.
В другом примере 1х аффинно зрелое пептидное антитело сравнивали с 2х аффинно зрелым пептидным антителом по ίη νινο анаболической эффективности. 0Ό1 ии/ии мышам (10 животных на группу) инъекционно вводили дважды в неделю 1 мг/кг и 3 мг/кг 1χιηΤΝ8-19-7 и 2χιηΤΝ8-19-7 в течение 35 дней, в то время как контрольная группа (10 животных) получала дважды в неделю инъекции йиЕс (3 мг/кг). Как показано на фиг. 5, введение 2х пептидного антитела привело к большему повышению веса тела и веса тощих мышц (при вскрытии) по сравнению с 1х пептидным антителом или контролем.
Пример 9. Увеличение мышечной силы.
Нормальным подобранным по возрасту 4-месячным мышам-самцам С57В/6 вводили подкожно инъекции 1 раз в неделю при дозе 5 мг/кг 2хтТ№-19-33, 2χιηΤΝ8-19-7 и йиЕс (носитель) как контроль (10 животных в группе). Животным давали восстановиться без каких-либо еще инъекций. Силу сжатия определяли на 18-й день восстановительного периода. Силу сжатия определяли с помощью датчика Ο’ο1ιιιηΝ;·ι 1и81гцтеи!8 те!ег, модель 1027 бзт (^Итй^, οΐιίο). Введение пептидных антител приводило к значительному повышению силы сжатия, при обработке 2χιηΤΝ8-19-33 у животных наблюдалось 14% повышение силы сжатия по сравнению с мышами, получившими контроль, тогда как обработка 2χιηΤΝ8-19-7 давала 15% повышение силы сжатия в сравнении с контрольными мышами.
Пример 10. Фармакокинетика.
Ιη νινο фармакокинетические эксперименты выполняли с использованием типичных пептидных антител без ЬЕ последовательностей. 0Ό1 ии/ии мышам вводили дозы 10 и 5 мг/кг и определяли следующие параметры: Стах (ид/т1), площадь под кривой (АиС) (ид.1юиг/т1) и время полужизни (ч). Установили, что 2х версии аффинно зрелых пептидных антител имеют существенно более продолжительное время полужизни, чем 1х версии. Например, 1х аффинно зрелое 111ΤΝ8-19-22 имеет время полужизни у животных около 50,2 ч, тогда как 2χтΤNЕ-19-22 имеет время полужизни около 85,2 ч. Аффинно зрелое 1χтΤN8-7 имеет время полужизни около 65 ч, тогда как 2χтΤNЕ-19-7 имеет время полужизни около 106 ч.
Пример 11. Лечение тбх мышей.
Пептидные антитела настоящего изобретения показали повышение массы тощих мышц у животных и оказались пригодными для лечения множества расстройств, характеризующихся потерей мышечной массы. Мышечная дистрофия - одно из этих расстройств. Мышиная модель для мышечной дистрофии Писйеиие - это Писйеиие тбх мышь (ΕκΚδοη ^айο^а!οπе8, Ваг ΗηώοΓ Маше). Стареющим (10-месячным) тбх мышам вводили либо пептидное антитело 1χιηΤΝ8-19-33 (и=8/группа), либо йиЕс (М6/группа) в течение трех месяцев. Введение осуществляли через день в дозе 10 мг/кг, подкожно. Лечение пептидными антителами имело положительный эффект в плане повышения и поддержания массы тела для старых тбх мышей. Значительное повышение массы тела наблюдали в группе, леченной с помощью пептидных антител, по сравнению с йи-Ес-леченной контрольной группой, как показано на фиг. 6А. Кроме того, ЯМР анализ показал, что отношение массы тощих мышц к массе жира у старых тбх мышей также существенно увеличилось как результат лечения с помощью пептидных антител, в сравнении с контрольной группой, а также, что доля жира в массе тела уменьшилась у мышей, леченных с помощью пептидных антител в сравнении с контрольной группой, как показано на фиг. 6В.
Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными описанными здесь вариантами, которые следует рассматривать только как имеющие иллюстративное значение при характеристике конкретных аспектов изобретения и функционально эквивалентных методов и составляющих частей изобретения. Фактически любые модификации данного изобретения, помимо показанных и описанных здесь, станут очевидными для специалистов в данной области на основе приведенного описания и прилагаемых чертежей. Такие модификации следует рассматривать как подпадающие под объем формулы изобретения.

Claims (37)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает аминокислотную последовательность АМСΡΡ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 633).
  2. 2. Связывающий агент по п.1, отличающийся тем, что пептид содержит от 5 до 50 аминокислот.
  3. 3. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает аминокислотную последовательность С& а2Аа3АМСΡΡ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 352), где а1, а2 и а3 выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты и пептид содержит от 10 до 50 аминокислот.
  4. 4. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает последовательность (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 353), где Ь1 вы- брана как любая из аминокислот Т, Ι или В; Ь2 выбрана из В, δ, О; Ь3 выбрана из Р, В, Ц, причем пептид включает от 10 до 50 аминокислот.
  5. 5. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает последовательность с1 с2 с3 с4 с5 с6 Сс7 с8 Ас9 АМСΡΡ с10 с11 с12 с13 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 354), где с1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту, с7 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с8 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с9 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, а с1о-с13 представляют собой любые аминокислоты, и причем пептид включает от 20 до 50 аминокислот.
  6. 6. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает последовательность б1 б2 б3 б4 б5 б6 С б7 б8 А б9 АМСΡΡ б10 б11 б12 б13 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 355), где б1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,
    62 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
    63 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
    64 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,
    65 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
    66 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,
    67 выбран из аминокислот Т, Ι или В,
    68 выбран из В, δ, Ц,
    69 выбран из Р, В и Ц, а б|0-б|3 представляют собой любые аминокислоты, и причем пептид включает от 20 до 50 аминокислот.
  7. 7. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает последовательность
    АΥе1е2 Υез С, (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 356), где е1 представляет собой Р, δ или Υ, е2 представляет собой С или Ц, а е3 представляет собой С или Н, и причем пептид включает от 7 до 50 аминокислот.
  8. 8. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает последовательность
    Г ΕΧ11. Г2 δΌ Г3 Г4 ЬЬ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 455), где Г1 представляет собой М или Ι,
    Г2 - любая аминокислота,
    Г3 представляет собой Ь или Е,
    - 72 009056 £4 представляет собой Е, О или Ό, и причем пептид включает от 7 до 50 аминокислот.
  9. 9. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает последовательность
    Её1 ё2 ЕЕ ёэ ё4 к, (8ЕЦ ГО 456), где §1 представляет собой Ц, Ό или Е, д2 представляет собой δ, Ц, Ό или Е, д3 - любая аминокислота, д4 представляет собой Ь, А, Р или Υ, и причем пептид включает от 8 до 50 аминокислот.
  10. 10. Связывающий агент, включающий по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин, причем пептид включает последовательность
    Б Б2 Б3 Б4 Б5 Бе Б7 Б8 Б9 (8ЕЦ ГО 457), где Б! представляет собой К или Ό,
    Б2 - любая аминокислота,
    Б3 представляет собой А, Т, δ или Ц,
    Б4 представляет собой Ь или М,
    Б5 представляет собой Ь или δ,
    Б6 - любая аминокислота,
    Б7 представляет собой Р или Е,
    Б8 представляет собой А, Р или С,
    Б9 представляет собой Ь, Р, М или К, и причем пептид включает от 9 до 50 аминокислот.
  11. 11. Связывающий агент, который имеет следующую структуру:
    (Х1)а - Р1 - (Х2)б или ее мультимеры, где Р1 является носителем, а
    X1 и X2, каждый независимо, выбран из (Ь1)с-Р1, (Ь1)с-Р1-(Ь2)б-Р2, (Ь1)с-Р1-(Ь2)б-Р2-(Ь3)е-Р3 и (Ь1)с-Р1-(Ь2)б-Р2-(Ь3)е-Р3-(Ь4)£-Р4, где Р1, Р2, Р3 и Р4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, а Ь1, Ь2, Ь3 и Ь4 каждый являются линкерами, а, Б, с, б, е и £, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или Б является 1.
  12. 12. Связывающий агент по п.11, у которого один или несколько миостатинсвязывающих пептидов включают аминокислотную последовательность АМСРР (δΕρ ГО NО: 633), и причем пептид включает от 10 до 50 аминокислот.
  13. 13. Связывающий агент по п.11, у которого один или несколько миостатинсвязывающих пептидов включают аминокислотную последовательность Са1 а2Аа3АМСРР (δΕρ ГО NО: 352), где аь а2 и а3 выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты и пептид содержит от 10 до 50 аминокислотных остатков.
  14. 14. Связывающий агент по п.11, у которого один или несколько миостатинсвязывающих пептидов каждый независимо включает аминокислотную последовательность СБ1Б2АБ3АМСРР (δΕρ ГО NО: 353), где Б1 выбрана как любая из аминокислот Т, I или К; Б2 выбрана из К, δ, О; Б3 выбрана из Р, К, Ц, причем пептид включает от 10 до 50 аминокислот.
  15. 15. Связывающий агент по п.11, у которого один или несколько миостатинсвязывающих пептидов каждой независимо включает последовательность
    Οι с2 с3 с4 с5 с6 Сс7 с8 Ас9 АМСРР Ою 0ц θι2 0ι3 (δΕρ ГО NО: 354), где с1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту, с5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту, с6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту, с7 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с8 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, с9 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, а с10-с13 представляют собой любые аминокислоты, и
    - 73 009056 причем пептид включает от 20 до 50 аминокислот.
  16. 16. Связывающий агент по п.11, у которого один или несколько миостатинсвязывающих пептидов каждый независимо включает последовательность б1 б2 б3 б4 б5 б6 С б7 б8 А б9 АМСРР б10 бц б12 б13 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 355), где б1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,
    62 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
    63 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
    64 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,
    65 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,
    66 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,
    67 выбран из аминокислот Т, Ι или В,
    68 выбран из В, δ, О,
    69 выбран из Р, В и О, а б10-б13 представляют собой любые аминокислоты, и причем пептид включает от 20 до 50 аминокислот.
  17. 17. Связывающий агент, который имеет структуру (Х1), - Е1 - (Х2)Ь или ее мультимеры, где Е является носителем, а
    Χ1 и Χ2, каждый независимо, выбран из ήΥ-ρ1, (όΥ-ρΉόΉ-ρ2, (Ь1)с-Р1-(Ь2)б-Р2-(Ь3)е-Р3 и (Ь1)с-Р1-(Ь2)б-Р2-(Ь3)е-Р3-(Ь4)г-Р4, где Р1, Р2, Р3 и Р4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, и причем один или несколько из Р1, Р2, Р3 и Р4, каждый независимо, выбран из группы, состоящей из:
    (a) пептида, включающего аминокислотную последовательность АΥе1е2 Υе3 С, (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 356), где е1 представляет собой Р, δ или Υ, е2 представляет собой С или О, а е3 представляет собой С или Н;
    (b) пептида, включающего аминокислотную последовательность Г ΕМ^ Г2 δΌ Г3 Г4 ЬЬ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 455), где β представляет собой М или Ι, Г2 - любая аминокислота, Г3 представляет собой Ь или Е, а Г4 представляет собой Е, О или Ό;
    (c) пептида, включающего аминокислотную последовательность Ьдх д2 ЬЬ д3 д4 Ь, (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 456), где д1 представляет собой О, Ό или Е, д2 представляет собой δ, О, Ό или Е, д3 - любая аминокислота, а д4 представляет собой Ь, А, Е или Υ; и (б) пептида, включающего аминокислотную последовательность Ь1 Ь2 113 Ь4 Ь5 Ь611- Ь8 Ь9 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 457), где 1 представляет собой В или Ό, Ь2 - любая аминокислота, Ь3 представляет собой А, Т, δ или О, Ь4 представляет собой Ь или М, Ь5 представляет собой Ь или δ, Ь6 - любая аминокислота, представляет собой Е или Е, Ь8 представляет собой А, Е или С, Ь9 представляет собой Ь, Е, М или К; причем пептид включает от 9 до 50 аминокислот, Ь2, Ь3 и Ь4 каждый являются линкерами, а, Ь, с, б, е и Г, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или Ь является 1.
  18. 18. Связывающий агент, который имеет структуру (Х1), - Е1 - (Х2)Ь или ее мультимеры, где Е является носителем, а
    Χ1 и Χ2, каждый независимо, выбран из (Ь1)с-Р1, (ь1)с-Р1-(ь2)б-Р2, (Ь1)с-Р1-(Ь2)б-Р2-(Ь3)е-Р3 и (Ь1)с-Р1-(Ь2)б-Р2-(Ь3)е-Р3-(Ь4)г-Р4, где Р1, Р2, Р3 и Р4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, и они независимо выбраны из последовательностей δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 305 до 351 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 357 до 454, причем Ц, Ь2, Ь3 и Ь4 каждый являются линкерами, а, Ь, с, б, е и Г, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или Ь является 1.
  19. 19. Связывающий агент по любому из пп.11-18, у которого носитель представляет собой Ес домен.
  20. 20. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая связывающий агент по п.19.
  21. 21. Вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по п.20.
  22. 22. Клетка-хозяин, включающая вектор экспрессии по п.21.
  23. 23. Клетка-хозяин по п.22, которая является прокариотической клеткой.
  24. 24. Клетка-хозяин по п.22, которая является эукариотической клеткой.
    - 74 009056
  25. 25. Фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество связывающего агента по любому из пп.1 или 11 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
  26. 26. Фармацевтическая композиция по п.25, у которой носитель представляет собой Рс домен.
  27. 27. Способ ингибирования активности миостатина у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества связывающего агента по любому из пп.1, 3 или 11.
  28. 28. Способ повышения массы тощих мышц у субъекта, включающий введение субъекту композиции по п.25.
  29. 29. Способ по п.28, при котором субъектом является животное, которое можно употребить в пищу.
  30. 30. Способ повышения соотношения массы мышц к жиру у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции по п.25.
  31. 31. Способ лечения заболевания, сопровождающегося потерей мышечной массы у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективной количества композиции по п.25.
  32. 32. Способ по п.31, при котором заболевание выбрано из мышечной дистрофии, амиотрофического латерального склероза, застойного обструктивного легочного заболевания, хронической сердечной недостаточности, рака, ВИЧ, почечной недостаточности, уремии, ревматоидного артрита, возрастной саркопении, потери мышечной массы из-за продолжительного по времени постельного режима, перелома позвоночника, удара, перелома костей и старения.
  33. 33. Способ лечения миостатинзависимого метаболического расстройства у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции по п.25.
  34. 34. Способ по п.33, при котором метаболическое расстройство выбрано из диабета, ожирения, гипергликемии и потери костной массы (остеопороза).
  35. 35. Способ детектирования миостатина в пробе, включающий контактирование пробы со связывающим агентом по п.1 или 11 и детектирование связанного комплекса.
  36. 36. Способ количественного определения миостатина в пробе, включающий контактирование пробы со связывающим агентом по п.1 или 11 и количественное определение связанного комплекса.
  37. 37. Способ диагностики миостатинсвязанного расстройства у субъекта, включающий контактирование пробы, взятой у субъекта, со связывающим агентом по п.1 или 11 и определение связанного комплекса.
EA200501000A 2002-12-20 2003-12-19 Связывающие агенты, ингибирующие миостатин EA009056B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43592302P 2002-12-20 2002-12-20
PCT/US2003/040781 WO2004058988A2 (en) 2002-12-20 2003-12-19 Binding agents which inhibit myostatin

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200501000A2 EA200501000A2 (ru) 2006-06-30
EA200501000A3 EA200501000A3 (ru) 2007-04-27
EA009056B1 true EA009056B1 (ru) 2007-10-26

Family

ID=32682298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501000A EA009056B1 (ru) 2002-12-20 2003-12-19 Связывающие агенты, ингибирующие миостатин

Country Status (28)

Country Link
US (7) US7511012B2 (ru)
EP (2) EP1581649B1 (ru)
JP (3) JP4959137B2 (ru)
KR (9) KR101304718B1 (ru)
CN (2) CN102382172A (ru)
AR (2) AR042545A1 (ru)
AT (1) ATE496938T1 (ru)
AU (2) AU2003301195B2 (ru)
BR (1) BR0317538A (ru)
CA (2) CA2774928A1 (ru)
CY (1) CY1111388T1 (ru)
DE (1) DE60335915D1 (ru)
DK (1) DK1581649T3 (ru)
EA (1) EA009056B1 (ru)
ES (1) ES2359562T3 (ru)
HK (1) HK1084419A1 (ru)
IL (3) IL169168A0 (ru)
ME (1) MEP57508A (ru)
MX (1) MXPA05006521A (ru)
NO (2) NO335982B1 (ru)
NZ (1) NZ541253A (ru)
PL (1) PL383616A1 (ru)
PT (1) PT1581649E (ru)
RS (1) RS52815B (ru)
SI (1) SI1581649T1 (ru)
TW (1) TWI328456B (ru)
WO (1) WO2004058988A2 (ru)
ZA (1) ZA200505481B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2710156C2 (ru) * 2010-05-26 2019-12-24 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела против gdf8 человека

Families Citing this family (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU773891C (en) 1998-10-23 2005-02-17 Kirin-Amgen Inc. Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to MP1 receptor and having thrombopoietic activity
TW200526779A (en) * 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
MXPA04008150A (es) 2002-02-21 2005-06-17 Wyeth Corp Gasp1: una proteina que contiene dominio de folistatina.
AU2003216345A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-09 Wyeth Follistatin domain containing proteins
US7193069B2 (en) * 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
ATE461275T1 (de) * 2002-09-16 2010-04-15 Univ Johns Hopkins Metalloproteaseaktivierung von myostatin und verfahren zur modulation der myostatinaktivität
AR047392A1 (es) * 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AU2003301195B2 (en) 2002-12-20 2010-01-07 Amgen Inc. Binding agents which inhibit myostatin
US7785587B2 (en) * 2003-06-02 2010-08-31 Wyeth Therapeutic methods for muscular or neuromuscular disorders
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
KR20060120229A (ko) 2003-12-31 2006-11-24 쉐링-프라우 리미티드 중화 에피토프계 성장 증진 백신
US20100183695A1 (en) * 2004-05-27 2010-07-22 John Knopf Cerberus/coco derivatives and uses thereof
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
JP2008505928A (ja) * 2004-07-08 2008-02-28 アムジェン　インコーポレーテッド 治療用ペプチド
CN101103045B (zh) * 2004-09-24 2015-11-25 安姆根有限公司 修饰的Fc分子
JP2008526201A (ja) 2004-12-30 2008-07-24 シェーリング−プラウ・リミテッド 中和エピトープベースの成長増強ワクチン
NZ538097A (en) * 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
JP2008537488A (ja) * 2005-03-23 2008-09-18 ワイス Ｇｄｆ−８モジュレート物質の検出
WO2006107611A2 (en) * 2005-03-23 2006-10-12 Wyeth Detection of an immune response to gdf-8 modulating agents
MX2007015476A (es) 2005-06-14 2008-02-25 Amgen Inc Formulaciones de proteina autoamortiguadoras.
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
CA2624976A1 (en) 2005-10-06 2007-04-19 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
UA92504C2 (en) * 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US20090163579A1 (en) * 2005-10-14 2009-06-25 Daniel Raederstorff Novel use of nutraceutical compositions
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
MX2008007324A (es) * 2005-12-06 2009-03-04 Amgen Inc Usos de antagonistas de miostatina.
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
BRPI0716249A2 (pt) * 2006-09-05 2013-09-03 Lilly Co Eli anticorpos antimiostatina
US20090252703A1 (en) * 2006-10-19 2009-10-08 Gegg Jr Colin V Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
AU2007332819A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Acceleron Pharma Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
WO2013106175A1 (en) 2011-12-19 2013-07-18 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
JP5591691B2 (ja) 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
WO2009015345A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
EP3251694A1 (en) 2007-08-03 2017-12-06 Summit (Oxford) Limited Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009029795A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
BRPI0911960B1 (pt) 2008-05-14 2022-03-22 Agriculture Victoria Services Pty Limited Uso de angiogenina no preparo de uma composição, suplemento alimentar ou nutracêutico para promover o crescimento e melhora muscular
PT2370463T (pt) 2008-11-26 2016-11-04 Amgen Inc Variante estabilizada do receptor da activina iib
SG176963A1 (en) 2009-06-22 2012-02-28 Amgen Inc Refolding proteins using a chemically controlled redox state
WO2010151688A2 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Amgen Inc. Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system
US8945511B2 (en) * 2009-06-25 2015-02-03 Paul Weinberger Sensitive methods for detecting the presence of cancer associated with the over-expression of galectin-3 using biomarkers derived from galectin-3
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
EA024052B1 (ru) 2010-06-07 2016-08-31 Эмджен Инк. Устройство для доставки лекарственного средства
CN105440134A (zh) 2010-08-16 2016-03-30 安姆根公司 结合肌肉生长抑制素的抗体、组合物和方法
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
PT2699293T (pt) 2011-04-20 2019-05-21 Amgen Inc Aparelho de autoinjeção
WO2012153337A2 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anti-microbial peptides and uses of same
EA030868B1 (ru) 2011-10-14 2018-10-31 Эмджен Инк. Инжектор и способ его сборки
MX361039B (es) 2011-10-26 2018-11-26 Amgen Inc Métodos para reducir o eliminar modificación de proteína y degradación que surge de la exposición a luz ultravioleta.
FR2982860B1 (fr) 2011-11-18 2015-07-10 Ass Fr Contre Les Myopathies Utilisation de la fibromoduline et du lumican pour augmenter la masse musculaire
US9598474B2 (en) 2012-03-26 2017-03-21 Axcella Health, Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
US9605040B2 (en) 2012-03-26 2017-03-28 Axcella Health Inc. Nutritive proteins and methods
AU2013240271A1 (en) 2012-03-26 2014-10-02 Axcella Health Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
WO2013148329A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Charged nutritive proteins and methods
AU2013204740C1 (en) 2012-05-10 2015-10-01 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Methods of treating cancer using angiogenin or an angiogenin agonist
CA2880649C (en) 2012-08-01 2023-03-14 Elizabeth MCNALLY Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (ltbp4)
JP2015535464A (ja) 2012-11-21 2015-12-14 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置
WO2014119753A1 (ja) * 2013-01-31 2014-08-07 学校法人 東京薬科大学 マイオスタチン阻害ペプチド
SG11201505960VA (en) 2013-02-01 2015-08-28 Santa Maria Biotherapeutics Inc Administration of an anti-activin-a compound to a subject
ES2973257T3 (es) 2013-03-15 2024-06-19 Amgen Inc Casete de fármaco, autoinyector y sistema de autoinyector
BR112015022042B1 (pt) 2013-03-15 2023-01-10 Amgen Inc Injetor para injetar um produto terapêutico
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
SG11201507878SA (en) 2013-03-22 2015-10-29 Amgen Inc Injector and method of assembly
KR101523065B1 (ko) * 2013-06-19 2015-05-27 한국기초과학지원연구원 입자크기가 제어된 금 나노입자의 제조방법 및 제조된 금 나노입자를 이용한 비색식 강산 검출방법
WO2015035405A1 (en) * 2013-09-09 2015-03-12 Pinta Biotherapeutics, Inc. Myostatin antagonist for treatment of pew in esrd patients
AU2014324897A1 (en) 2013-09-25 2016-05-19 Axcella Health Inc. Compositions and formulations for maintaining and increasing muscle mass, strength, and performance and methods of production and use thereof
JP7051293B2 (ja) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド 温度感知制御を伴う薬剤送達システム
ES2744837T3 (es) 2013-10-24 2020-02-26 Amgen Inc Inyector y procedimiento de ensamblaje
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
BR112016025852B1 (pt) 2014-05-07 2022-11-01 Amgen Inc Dispositivo de injeção para aplicação de fármaco
KR102416904B1 (ko) 2014-06-03 2022-07-04 암겐 인코포레이티드 약물 전달 디바이스에 의해 수집된 데이터를 원격으로 프로세싱하기 위한 시스템들 및 방법들
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
WO2016073853A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
JP2018519250A (ja) * 2015-04-23 2018-07-19 ワシントン ステイト ユニバーシティー 治療薬としてのｓｍａｄ７遺伝子送達
CN106191215B (zh) * 2015-04-29 2020-03-24 中国科学院上海生命科学研究院 肌肉萎缩相关的蛋白质分子标记Dkk-3的筛选及其应用
ES2964640T3 (es) 2015-08-13 2024-04-08 Amgen Inc Filtración en profundidad cargada de proteínas de unión al antígeno
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP3400240A2 (en) 2016-01-08 2018-11-14 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent myostatin antibodies and methods of use thereof
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
RU2613420C1 (ru) * 2016-04-13 2017-03-16 Сергей Михайлович Юдин Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
JP7094223B2 (ja) * 2016-04-25 2022-07-01 ファイブ プライム セラピューティクス， インコーポレイテッド 病的な筋肉減少および筋力低下の処置のためのｎｏｐｅ
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US10150115B2 (en) * 2016-07-21 2018-12-11 Spacepharma SA System and method for rehydrating powder and delivering the rehydrated powder to a reactor
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
BR112019007858A2 (pt) 2016-10-21 2019-07-02 Amgen Inc formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
PL3565592T3 (pl) * 2017-01-06 2023-08-21 Scholar Rock, Inc. Leczenie chorób metabolicznych poprzez inhibicję aktywacji miostatyny
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
HUE063805T2 (hu) 2017-03-28 2024-01-28 Amgen Inc Dugattyúrúd és fecskendõ összeállító rendszer és eljárás
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
CA3079197A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368338B2 (en) 2017-11-16 2024-07-25 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
IL273638B2 (en) 2017-11-16 2024-10-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
EP3569614A1 (en) 2018-05-18 2019-11-20 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Compounds and methods for the immobilization of myostatin-inhibitors on the extracellular matrix by transglutaminase
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
KR102042352B1 (ko) 2018-07-16 2019-11-07 강릉원주대학교산학협력단 땅콩 껍질 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물
KR102259645B1 (ko) 2018-07-16 2021-06-02 강릉원주대학교산학협력단 구멍쇠미역 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
TWI824026B (zh) 2018-10-05 2023-12-01 美商安進公司 具有劑量指示器之藥物遞送裝置
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
KR20210076935A (ko) 2018-10-15 2021-06-24 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
MX2021004510A (es) 2018-10-23 2021-06-08 Amgen Inc Calibracion automatica y mantenimiento automatico de modelos espectroscopicos de raman para predicciones en tiempo real.
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
EP3897689A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
WO2020139977A1 (en) 2018-12-26 2020-07-02 Northwestern University Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20230071627A1 (en) 2020-02-03 2023-03-09 Amgen Inc. Multivariate Bracketing Approach for Sterile Filter Validation
MX2023013640A (es) 2021-05-21 2023-11-30 Amgen Inc Metodo de optimizacion de una receta de llenado para un contenedor de medicamento.
TW202326113A (zh) 2021-10-27 2023-07-01 美商安進公司 使用光譜學進行的基於深度學習的預測
WO2023096233A1 (ko) * 2021-11-25 2023-06-01 (주)네오크레마 신규 펩티드 및 이의 용도
WO2023096232A1 (ko) * 2021-11-25 2023-06-01 (주)네오크레마 신규 펩티드 및 이의 용도

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993006843A1 (en) * 1991-10-08 1993-04-15 Duke University Peptides corresponding to antigenic determinants of htlv
WO2000024782A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
WO2000077206A2 (en) * 1999-06-10 2000-12-21 Abbott Laboratories The myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof
US6369201B1 (en) * 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5750375A (en) 1988-01-22 1998-05-12 Zymogenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
WO1994021681A1 (en) 1993-03-19 1994-09-29 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US6607884B1 (en) 1993-03-19 2003-08-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-8
ATE442436T1 (de) * 1997-07-14 2009-09-15 Univ Liege Mutationen im myostatingen steigern muskelmasse in säugetieren
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
GB2333706A (en) 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals
US6368597B1 (en) * 1998-05-06 2002-04-09 Matamorphix, Inc. Methods of treating diabetes
WO2000007038A2 (en) * 1998-07-30 2000-02-10 Universite De Montreal Protein fragment complementation assays
NZ513642A (en) * 1999-01-21 2004-02-27 Metamorphix Inc Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
PL353855A1 (en) * 1999-07-20 2003-12-01 Pharmexa A/Spharmexa A/S Method for down-regulating gdf-8 activity
AU782925B2 (en) 2000-01-18 2005-09-08 Orico Limited Myostatin and mimetics thereof
CA2402780A1 (en) * 2000-03-29 2001-10-04 Dgi Biotechnologies, L.L.C. Insulin and igf-1 receptor agonists and antagonists
EP1348026A2 (en) * 2000-12-23 2003-10-01 Dyax Corp. Fibrin binding moieties useful as imaging agents
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
AU2003301195B2 (en) * 2002-12-20 2010-01-07 Amgen Inc. Binding agents which inhibit myostatin
US7785587B2 (en) 2003-06-02 2010-08-31 Wyeth Therapeutic methods for muscular or neuromuscular disorders
CA2541237C (en) 2003-10-06 2015-12-01 Monash University Modulation of activin to alter inflammatory responses
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
WO2005084699A1 (en) 2004-03-02 2005-09-15 Acceleron Pharma Inc. Alk7 and myostatin inhibitors and uses thereof
CA2558805C (en) 2004-03-23 2011-09-27 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
CN101103045B (zh) * 2004-09-24 2015-11-25 安姆根有限公司 修饰的Fc分子
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1915397B1 (en) 2005-08-19 2015-01-14 Wyeth LLC Antagonist antibodies against gdf-8 and uses in treatment of als and other gdf-8-associated disorders
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993006843A1 (en) * 1991-10-08 1993-04-15 Duke University Peptides corresponding to antigenic determinants of htlv
US6369201B1 (en) * 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers
WO2000024782A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
WO2000077206A2 (en) * 1999-06-10 2000-12-21 Abbott Laboratories The myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SE-JIN LEE ET AL: "Regulation of myostatin activity and muscle growth", Proc. Natl. Acad. Sci. (PNAS), USA, July 31, 2001, v. 98, n. 16, p. 9306-9311 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2710156C2 (ru) * 2010-05-26 2019-12-24 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела против gdf8 человека

Also Published As

Publication number Publication date
NZ541253A (en) 2010-03-26
KR20120037517A (ko) 2012-04-19
EA200501000A3 (ru) 2007-04-27
EP1581649B1 (en) 2011-01-26
WO2004058988A2 (en) 2004-07-15
AU2010201389A1 (en) 2010-04-29
AU2003301195A1 (en) 2004-07-22
TWI328456B (en) 2010-08-11
US20040181033A1 (en) 2004-09-16
KR20160045936A (ko) 2016-04-27
US20120083442A1 (en) 2012-04-05
KR101304718B1 (ko) 2013-09-05
JP2006524034A (ja) 2006-10-26
IL205265A0 (en) 2011-07-31
US20100330072A1 (en) 2010-12-30
NO20141479L (no) 2005-09-08
US20130230515A1 (en) 2013-09-05
KR20050091015A (ko) 2005-09-14
IL205265A (en) 2017-01-31
BR0317538A (pt) 2005-11-29
IL169168A0 (en) 2007-07-04
RS20050530A (en) 2007-09-21
KR20140004805A (ko) 2014-01-13
ZA200505481B (en) 2008-01-30
NO20053545L (no) 2005-09-08
US7803923B2 (en) 2010-09-28
KR20130036378A (ko) 2013-04-11
DE60335915D1 (de) 2011-03-10
KR20110086881A (ko) 2011-08-01
SI1581649T1 (sl) 2011-09-30
US7511012B2 (en) 2009-03-31
WO2004058988A3 (en) 2007-11-15
US7928075B2 (en) 2011-04-19
CA2510893C (en) 2012-07-10
US20090220491A1 (en) 2009-09-03
NO20053545D0 (no) 2005-07-19
US20090227517A1 (en) 2009-09-10
CA2510893A1 (en) 2004-07-15
TW200505474A (en) 2005-02-16
CY1111388T1 (el) 2015-08-05
EP2272864A2 (en) 2011-01-12
PT1581649E (pt) 2011-04-13
CA2774928A1 (en) 2004-07-15
AR042545A1 (es) 2005-06-22
CN101287484A (zh) 2008-10-15
AU2003301195B2 (en) 2010-01-07
EP1581649A2 (en) 2005-10-05
NO335982B1 (no) 2015-04-13
US8920798B2 (en) 2014-12-30
KR20150013350A (ko) 2015-02-04
US8071538B2 (en) 2011-12-06
ATE496938T1 (de) 2011-02-15
JP2013048622A (ja) 2013-03-14
KR20120060250A (ko) 2012-06-11
CN102382172A (zh) 2012-03-21
KR20150107899A (ko) 2015-09-23
JP4959137B2 (ja) 2012-06-20
MEP57508A (en) 2011-05-10
PL383616A1 (pl) 2008-04-14
EA200501000A2 (ru) 2006-06-30
DK1581649T3 (da) 2011-05-02
CN101287484B (zh) 2012-10-10
EP2272864A3 (en) 2011-02-16
ES2359562T3 (es) 2011-05-24
MXPA05006521A (es) 2005-08-26
EP1581649A4 (en) 2008-10-08
RS52815B (sr) 2013-10-31
US20150175687A1 (en) 2015-06-25
HK1084419A1 (en) 2006-07-28
IL205266A0 (en) 2011-07-31
AR097588A2 (es) 2016-03-23
JP2010193888A (ja) 2010-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009056B1 (ru) Связывающие агенты, ингибирующие миостатин
KR101993714B1 (ko) 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법
US7329646B2 (en) Derivatives of the insulinotropic peptide exendin-4 and methods of production thereof
TWI250988B (en) Thrombopoietic compounds
EA013470B1 (ru) Терапевтические агенты на основе токсичных пептидов
US8895003B2 (en) Pharmaceutical composition comprising EDA-1 Fusion Protein
JP2016094427A (ja) ミオスタチン・アンタゴニストの使用
JP2016516064A (ja) ヒト対象におけるミオスタチンの拮抗
EA017085B1 (ru) Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела
JP2003531632A (ja) グルカゴンアンタゴニスト
JP2009213483A (ja) 可溶性ｍｈｃ複合体とその利用法
JP2003530870A (ja) Ａｐｏ−ＡＩ／ＡＩＩペプチド誘導体
AU690421B2 (en) Anti-inflammatory CD14 peptides
KR20170080526A (ko) Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
AU2013216655B2 (en) Binding agents which inhibit myostatin
WO2002042448A1 (fr) Nouveau polypeptide
WO2005017151A1 (ja) アポトーシスを誘導するip3受容体タンパク質の末端切断型変異体
AU2016202981A1 (en) Binding agents which inhibit myostatin

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU