JP2016516064A - ヒト対象におけるミオスタチンの拮抗 - Google Patents
ヒト対象におけるミオスタチンの拮抗 Download PDFInfo
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Abstract
治療有効量のミオスタチンの拮抗薬を投与することを含む、前立腺癌患者において悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または下肢筋肉量を増加させる方法が開示される。さらに、ミオスタチン拮抗薬のペプチボディ配列及びペプチボディの製剤が開示される。【選択図】図13
Description
関連出願の相互参照
[0001]
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/799,928号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦支援の研究または開発に関する声明
[0002]
該当なし。
配列表
[0003]
本出願は、EFS−Webを介して提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2014年3月13日に作成された当該ASCIIコピーは、26324PCT_sequencelisting.txtという名称であり、200,000バイトのサイズである。
発明の分野
[0004]
前立腺癌患者における悪液質の治療のために、ミオスタチン拮抗薬、例えば、ミオスタチン結合ペプチボディを使用する方法に関する。
[0001]
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/799,928号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦支援の研究または開発に関する声明
[0002]
該当なし。
配列表
[0003]
本出願は、EFS−Webを介して提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2014年3月13日に作成された当該ASCIIコピーは、26324PCT_sequencelisting.txtという名称であり、200,000バイトのサイズである。
発明の分野
[0004]
前立腺癌患者における悪液質の治療のために、ミオスタチン拮抗薬、例えば、ミオスタチン結合ペプチボディを使用する方法に関する。
[0005]
成長因子の形質転換成長因子(TGF)βスーパーファミリーは、筋肉組織の発達及びホメオスタシスを調節する多数の成長因子及び分化因子からなる。TGF−βスーパーファミリーの一員であるミオスタチンは、ほぼ骨格筋内のみで発現され、筋成長の負の調節因子として作用する(Roth and Walsh,2004、Thomas et al,2000)。ミオスタチンは、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害因子(例えば、p21)の上方制御を生じさせ、それが次いでCDK2の下方制御及びG0/G1での細胞周期停止をもたらすことによって筋芽細胞の増殖を阻害する。さらに、ミオスタチンは、MyoDの発現の減少を通して筋芽細胞分化を負に調節する(Langley et al,2002)。
[0006]
ミオスタチン遺伝子における機能喪失突然変異を有するマウス及びウシからの観察(Roth and Walsh,2004、Grobet et al,1998、Szabo et al,1998、Grobet et al,1997、Kambadur et al,1997、McPherron and Lee,1997、McPherron et al,1997)、ならびにミオスタチンの両対立遺伝子に影響を及ぼす機能喪失突然変異を有するヒト小児を記述する最近の症例報告(Schuelke et al,2004)は、ミオスタチンが周産期の骨格筋の発達を調節するのに重要な役割を果たすという強力な証拠を提供する。成体マウスの筋肉において、ミオスタチンは、再生衛星細胞の活性化を阻害するように思われる(McCroskery et al,2003)。特に興味深いのは、筋特異的な条件付きのミオスタチン遺伝子の不活性化アプローチによって、一般の筋肉肥大は、構成的にミオスタチン欠損のノックアウトマウスにおける筋肉肥大と同様の程度まで、マウスにおいて生後に誘導され得る(Grobet et al,2003)。
[0007]
骨格筋の消耗は、様々な状態及び病状、例えば、癌悪液質、アンドロゲン欠乏、末期腎疾患による腎悪液質、慢性閉塞性肺疾患、心臓悪液質、HIV/AIDS、ステロイド性ミオパチー、廃用性萎縮、高齢及び術後免疫療法によるサルコペニアにおいて、高頻度に見られ、臨床的に影響を及ぼす(Muscaritoli et al,2006、Alibhai et al,2006、Morley et al,2006、MacDonald et al,2003、Roubenoff et al,1997)。骨格筋の消耗は、筋力低下、身体的及び精神的障害、ならびに生活の質の低下をもたらす(Muscaritoli et al,2006、Roubenoff et al,1997)。食欲刺激薬、栄養補給、コルチコステロイド、同化ステロイドホルモン、及び成長ホルモンを含む、病気または不動性の状況において筋肉の消耗に対して使用される現行の治療選択の有用性は限られており、著しい全身性副作用を伴い得る(Muscaritoli et al,2006、MacDonald et al,2003)。
[0008]
前立腺癌は、米国では、男性において最も一般的な悪性腫瘍であり、男性において癌に関連した2番目に多い死因である(American Cancer Society,2005)。ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)作動薬の投与によるアンドロゲン枯渇療法(ADT)は、転移性前立腺癌に対する治療の主力である。(Sharafi et al JAMA2005)ネオアジュバント/アジュバントADTは、中程度のリスク及び高リスクの早期の前立腺癌に対する放射線療法を受けている男性における生存率を向上させる。アジュバントADTはまた、リンパ節陽性疾患に罹患している男性における前立腺切除術後の生存率の向上とも関連している。現代の臨床診療において、生化学的再発において一般的に見られる、GnRH作動薬による長期間治療は、アンドロゲン枯渇療法の最も一般的な形態である。(Sharafi et al JAMA2005
[0009]
ADTは、体重増加、体脂肪量の増加、除脂肪体重の減少、及び疲労を含む、様々な副作用を有する。(Hematol Oncol Clin North Am,2006Aug;20(4):909−23。前向き臨床研究において、ADTは、除脂肪体重及び筋肉サイズの減少ならびに体脂肪の増加を伴う。(Smith et al,2002、Smith et al,2001)。身体組成の変化は、治療の最初の6カ月以内で明らかであり、長期療法中、継続するように思われる。(Smith et al JCO2012)。筋肉量及び筋力の低下は、前立腺癌を有する男性において、総合的な疲労及び生活の質の低下の一因となり得る。身体組成における治療に関連する変化はまた、ADTがインスリン感受性の低下及びADTに関連した糖尿病になるより高いリスクの一因となり得る。(Smith et al2006JCEM、Keating et al2006JCO、Braga−Basaria et al2006)。
[0010]
AMG745は、新規の抗ミオスタチンペプチボディである。構造的に、それは、N末端でヒトFcを有し、C末端でミオスタチンを中和する生物活性ペプチドを有する融合タンパク質である。AMG745及び/またはAMG745のネズミサロゲートであるAMG745/Mu−Sは、正常マウス、免疫欠損マウス、MDXマウス(デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデル)、結腸26担腫瘍マウス(癌悪液質モデル)、後肢懸垂マウス(廃用性萎縮モデル)、及び睾丸摘出マウス(アンドロゲン欠乏マウスモデル)を含む、様々なマウスモデルにおいて試験されている。これらのモデルにおけるAMG745及び/またはAMG745/Mu−Sの効果には、対照マウスと比較して、体重増加の増加、骨格筋量の増加または維持の向上、及び体力の増加が含まれた。アンドロゲン欠乏に関連する筋力低下及び脂肪蓄積を特徴とする性腺機能低下症の疾患モデルである、睾丸摘出マウスにおける前臨床研究は、核磁気共鳴(NMR)画像によって評価すると、AMG745/Mu−Sの投与が除脂肪体重の減少及び脂肪の蓄積を著しく弱化したことを示し、そしてさらに、インビボのミオスタチン阻害がアンドロゲン非依存性機構を介して骨格筋の成長を増進し得ることを示した。
[0011]
ミオスタチン拮抗薬及びそれらの使用は、第WO/2004/058988号として公開され、2003年12月19日に出願された、国際特許出願第PCT/US2003/040781号、及び第WO2007/067616号として公開され、2006年12月6日に出願された第PCT/US2006/046546号、ならびに関連する国内段階の出願において記載されている。
成長因子の形質転換成長因子(TGF)βスーパーファミリーは、筋肉組織の発達及びホメオスタシスを調節する多数の成長因子及び分化因子からなる。TGF−βスーパーファミリーの一員であるミオスタチンは、ほぼ骨格筋内のみで発現され、筋成長の負の調節因子として作用する(Roth and Walsh,2004、Thomas et al,2000)。ミオスタチンは、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害因子(例えば、p21)の上方制御を生じさせ、それが次いでCDK2の下方制御及びG0/G1での細胞周期停止をもたらすことによって筋芽細胞の増殖を阻害する。さらに、ミオスタチンは、MyoDの発現の減少を通して筋芽細胞分化を負に調節する(Langley et al,2002)。
[0006]
ミオスタチン遺伝子における機能喪失突然変異を有するマウス及びウシからの観察(Roth and Walsh,2004、Grobet et al,1998、Szabo et al,1998、Grobet et al,1997、Kambadur et al,1997、McPherron and Lee,1997、McPherron et al,1997)、ならびにミオスタチンの両対立遺伝子に影響を及ぼす機能喪失突然変異を有するヒト小児を記述する最近の症例報告(Schuelke et al,2004)は、ミオスタチンが周産期の骨格筋の発達を調節するのに重要な役割を果たすという強力な証拠を提供する。成体マウスの筋肉において、ミオスタチンは、再生衛星細胞の活性化を阻害するように思われる(McCroskery et al,2003)。特に興味深いのは、筋特異的な条件付きのミオスタチン遺伝子の不活性化アプローチによって、一般の筋肉肥大は、構成的にミオスタチン欠損のノックアウトマウスにおける筋肉肥大と同様の程度まで、マウスにおいて生後に誘導され得る(Grobet et al,2003)。
[0007]
骨格筋の消耗は、様々な状態及び病状、例えば、癌悪液質、アンドロゲン欠乏、末期腎疾患による腎悪液質、慢性閉塞性肺疾患、心臓悪液質、HIV/AIDS、ステロイド性ミオパチー、廃用性萎縮、高齢及び術後免疫療法によるサルコペニアにおいて、高頻度に見られ、臨床的に影響を及ぼす(Muscaritoli et al,2006、Alibhai et al,2006、Morley et al,2006、MacDonald et al,2003、Roubenoff et al,1997)。骨格筋の消耗は、筋力低下、身体的及び精神的障害、ならびに生活の質の低下をもたらす(Muscaritoli et al,2006、Roubenoff et al,1997)。食欲刺激薬、栄養補給、コルチコステロイド、同化ステロイドホルモン、及び成長ホルモンを含む、病気または不動性の状況において筋肉の消耗に対して使用される現行の治療選択の有用性は限られており、著しい全身性副作用を伴い得る(Muscaritoli et al,2006、MacDonald et al,2003)。
[0008]
前立腺癌は、米国では、男性において最も一般的な悪性腫瘍であり、男性において癌に関連した2番目に多い死因である(American Cancer Society,2005)。ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)作動薬の投与によるアンドロゲン枯渇療法(ADT)は、転移性前立腺癌に対する治療の主力である。(Sharafi et al JAMA2005)ネオアジュバント/アジュバントADTは、中程度のリスク及び高リスクの早期の前立腺癌に対する放射線療法を受けている男性における生存率を向上させる。アジュバントADTはまた、リンパ節陽性疾患に罹患している男性における前立腺切除術後の生存率の向上とも関連している。現代の臨床診療において、生化学的再発において一般的に見られる、GnRH作動薬による長期間治療は、アンドロゲン枯渇療法の最も一般的な形態である。(Sharafi et al JAMA2005
[0009]
ADTは、体重増加、体脂肪量の増加、除脂肪体重の減少、及び疲労を含む、様々な副作用を有する。(Hematol Oncol Clin North Am,2006Aug;20(4):909−23。前向き臨床研究において、ADTは、除脂肪体重及び筋肉サイズの減少ならびに体脂肪の増加を伴う。(Smith et al,2002、Smith et al,2001)。身体組成の変化は、治療の最初の6カ月以内で明らかであり、長期療法中、継続するように思われる。(Smith et al JCO2012)。筋肉量及び筋力の低下は、前立腺癌を有する男性において、総合的な疲労及び生活の質の低下の一因となり得る。身体組成における治療に関連する変化はまた、ADTがインスリン感受性の低下及びADTに関連した糖尿病になるより高いリスクの一因となり得る。(Smith et al2006JCEM、Keating et al2006JCO、Braga−Basaria et al2006)。
[0010]
AMG745は、新規の抗ミオスタチンペプチボディである。構造的に、それは、N末端でヒトFcを有し、C末端でミオスタチンを中和する生物活性ペプチドを有する融合タンパク質である。AMG745及び/またはAMG745のネズミサロゲートであるAMG745/Mu−Sは、正常マウス、免疫欠損マウス、MDXマウス(デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデル)、結腸26担腫瘍マウス(癌悪液質モデル)、後肢懸垂マウス(廃用性萎縮モデル)、及び睾丸摘出マウス(アンドロゲン欠乏マウスモデル)を含む、様々なマウスモデルにおいて試験されている。これらのモデルにおけるAMG745及び/またはAMG745/Mu−Sの効果には、対照マウスと比較して、体重増加の増加、骨格筋量の増加または維持の向上、及び体力の増加が含まれた。アンドロゲン欠乏に関連する筋力低下及び脂肪蓄積を特徴とする性腺機能低下症の疾患モデルである、睾丸摘出マウスにおける前臨床研究は、核磁気共鳴(NMR)画像によって評価すると、AMG745/Mu−Sの投与が除脂肪体重の減少及び脂肪の蓄積を著しく弱化したことを示し、そしてさらに、インビボのミオスタチン阻害がアンドロゲン非依存性機構を介して骨格筋の成長を増進し得ることを示した。
[0011]
ミオスタチン拮抗薬及びそれらの使用は、第WO/2004/058988号として公開され、2003年12月19日に出願された、国際特許出願第PCT/US2003/040781号、及び第WO2007/067616号として公開され、2006年12月6日に出願された第PCT/US2006/046546号、ならびに関連する国内段階の出願において記載されている。
[0012]
悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または体脂肪を減少させる及び/または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法が、本明細書に記載されており、当該方法は、当該対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、ヒト対象は、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号635に記載のアミノ酸配列(MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE)からなるポリペプチドを含むペプチボディからなり、ミオスタチン拮抗薬は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75において製剤化され、ミオスタチン拮抗薬は、0.3mg/kg、1.0mg/kg、または3.0mg/kgの用量で、週1回、4週間皮下投与される。
[0013]
また、悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または体脂肪を減少させる及び/または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法も記載されており、当該対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、ヒト対象は、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号311に記載のアミノ酸配列(LADHGQCIRWPWMCPPEGWE)からなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号635に記載のアミノ酸配列(MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE)からなるポリペプチドを含むペプチボディからなる。他の実施形態において、配列番号635に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列からなるペプチボディからなるミオスタチン拮抗薬。
[0014]
本方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、大腸菌において不溶性封入体で発現され、細胞採取、細胞溶解、封入体の可溶化、リフォールディング、濃縮、及びクロマトグラフィー精製を介して単離されるペプチボディであり得る。
[0015]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる化合物に複合される。
[0016]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、薬学的組成物において製剤化される。例としては、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む薬学的組成物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、製剤は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75であり得る。
[0017]
本方法は、例えば、非経口でまたは経口でまたは皮下での投与を使用し得る。
[0018]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、0.01〜10.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3〜3.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3、1.0、もしくは3.0mg/kgの用量で投与される。ミオスタチン拮抗薬は、例えば、1日2回、1日1回、週2回、週1回、月2回、または月1回、投与され得る。いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、週1回、4週間投与される。
[0019]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる薬剤、例えば、抗前立腺癌剤と共投与される。
悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または体脂肪を減少させる及び/または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法が、本明細書に記載されており、当該方法は、当該対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、ヒト対象は、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号635に記載のアミノ酸配列(MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE)からなるポリペプチドを含むペプチボディからなり、ミオスタチン拮抗薬は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75において製剤化され、ミオスタチン拮抗薬は、0.3mg/kg、1.0mg/kg、または3.0mg/kgの用量で、週1回、4週間皮下投与される。
[0013]
また、悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または体脂肪を減少させる及び/または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法も記載されており、当該対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、ヒト対象は、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号311に記載のアミノ酸配列(LADHGQCIRWPWMCPPEGWE)からなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号635に記載のアミノ酸配列(MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE)からなるポリペプチドを含むペプチボディからなる。他の実施形態において、配列番号635に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列からなるペプチボディからなるミオスタチン拮抗薬。
[0014]
本方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、大腸菌において不溶性封入体で発現され、細胞採取、細胞溶解、封入体の可溶化、リフォールディング、濃縮、及びクロマトグラフィー精製を介して単離されるペプチボディであり得る。
[0015]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる化合物に複合される。
[0016]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、薬学的組成物において製剤化される。例としては、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む薬学的組成物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、製剤は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75であり得る。
[0017]
本方法は、例えば、非経口でまたは経口でまたは皮下での投与を使用し得る。
[0018]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、0.01〜10.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3〜3.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3、1.0、もしくは3.0mg/kgの用量で投与される。ミオスタチン拮抗薬は、例えば、1日2回、1日1回、週2回、週1回、月2回、または月1回、投与され得る。いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、週1回、4週間投与される。
[0019]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる薬剤、例えば、抗前立腺癌剤と共投与される。
[0033]
本発明は、アンドロゲン治療法を受けている前立腺癌患者において、配列番号311のミオスタチン結合ペプチドを含むミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号635からなるペプチボディの投与によって悪液質を治療する方法を提供する。
本発明は、アンドロゲン治療法を受けている前立腺癌患者において、配列番号311のミオスタチン結合ペプチドを含むミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号635からなるペプチボディの投与によって悪液質を治療する方法を提供する。
ミオスタチン
[0034]
GDF−8としても知られている成長因子であるミオスタチンは、TGF−βファミリーの一員である。ミオスタチンは、骨格筋組織の負の調節因子であることが知られている。ミオスタチンは、タンパク質分解切断によって活性化される不活性なプレプロタンパク質として合成される(Zimmers et al.,上記(2002))。前駆体タンパク質が切断されて、NH2末端不活性プロドメイン、及び約25kDaのホモ二量体の形態である成熟活性型のおよそ109アミノ酸のCOOH末端タンパク質が生じる(Zimmers et al,上記(2002))。現在、成熟二量体は、プロペプチドに結合した不活性潜在性複合体として血液中で循環すると考えられている(Zimmers et al,上記(2002))。
[0035]
本明細書で使用される「全長ミオスタチン」という用語は、McPherron et al.PNAS USA94,12457(1997)に記載される全長ヒトプレプロタンパク質配列、ならびに対立遺伝子変異体及び種間相同体を含む、関連全長ポリペプチド(McPherron et al.上記(1997))を指す。本明細書で使用される「プロドメイン」または「プロペプチド」という用語は、切断されて、活性COOH末端タンパク質を放出する、不活性NH2末端タンパク質を指す。本明細書で使用される「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」という用語は、単量体、二量体、多量体型、または他の型の、成熟な生物学的に活性であるCOOH末端ポリペプチドを指す。「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」はまた、生物学的に活性な成熟ミオスタチンの断片、ならびに対立遺伝子変異体、スプライス変異体、ならびに融合ペプチド及びポリペプチドを含む、関連ポリペプチドも指す。成熟ミオスタチンCOOH末端タンパク質は、ヒト、マウス、ニワトリ、ブタ、七面鳥、及びラットを含む多くの種間で100%配列同一性を有すると報告されている(Lee et al.,PNAS98,9306(2001))。ミオスタチンは、どのように調製されたかに応じて、標的配列等のさらなる末端残基、またはメチオニン残基及びリジン残基、ならびに/あるいはタグまたは融合タンパク質配列を含んでも、含まなくてもよい。
[0034]
GDF−8としても知られている成長因子であるミオスタチンは、TGF−βファミリーの一員である。ミオスタチンは、骨格筋組織の負の調節因子であることが知られている。ミオスタチンは、タンパク質分解切断によって活性化される不活性なプレプロタンパク質として合成される(Zimmers et al.,上記(2002))。前駆体タンパク質が切断されて、NH2末端不活性プロドメイン、及び約25kDaのホモ二量体の形態である成熟活性型のおよそ109アミノ酸のCOOH末端タンパク質が生じる(Zimmers et al,上記(2002))。現在、成熟二量体は、プロペプチドに結合した不活性潜在性複合体として血液中で循環すると考えられている(Zimmers et al,上記(2002))。
[0035]
本明細書で使用される「全長ミオスタチン」という用語は、McPherron et al.PNAS USA94,12457(1997)に記載される全長ヒトプレプロタンパク質配列、ならびに対立遺伝子変異体及び種間相同体を含む、関連全長ポリペプチド(McPherron et al.上記(1997))を指す。本明細書で使用される「プロドメイン」または「プロペプチド」という用語は、切断されて、活性COOH末端タンパク質を放出する、不活性NH2末端タンパク質を指す。本明細書で使用される「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」という用語は、単量体、二量体、多量体型、または他の型の、成熟な生物学的に活性であるCOOH末端ポリペプチドを指す。「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」はまた、生物学的に活性な成熟ミオスタチンの断片、ならびに対立遺伝子変異体、スプライス変異体、ならびに融合ペプチド及びポリペプチドを含む、関連ポリペプチドも指す。成熟ミオスタチンCOOH末端タンパク質は、ヒト、マウス、ニワトリ、ブタ、七面鳥、及びラットを含む多くの種間で100%配列同一性を有すると報告されている(Lee et al.,PNAS98,9306(2001))。ミオスタチンは、どのように調製されたかに応じて、標的配列等のさらなる末端残基、またはメチオニン残基及びリジン残基、ならびに/あるいはタグまたは融合タンパク質配列を含んでも、含まなくてもよい。
ミオスタチン拮抗薬
[0036]
本明細書に記載される治療方法は、配列番号311のミオスタチン結合ペプチドを含むミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号635からなる少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディ、例えば、ペプチボディAMG−745を使用する。
[0037]
本明細書で使用される「ミオスタチン拮抗薬」という用語は、「ミオスタチン阻害剤」と互換的に使用される。本発明によるミオスタチン拮抗薬は、ミオスタチンの少なくとも1つの活性を阻害または遮断するか、あるいは、ミオスタチンまたはその受容体の発現を遮断する。ミオスタチン活性の阻害または遮断は、例えば、ミオスタチンとその受容体との結合を妨げる、及び/またはミオスタチンのその受容体への結合を得られるシグナル伝達を遮断する、1つ以上の阻害剤を使用することによって達成され得る。拮抗薬には、ミオスタチンそれ自体に結合する薬剤、またはミオスタチン受容体に結合する薬剤が含まれる。
[0038]
ミオスタチン拮抗薬の他の例としては、ホリスタチン、ミオスタチンプロドメイン、成長分化因子11(GDF−11)プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合する拮抗抗体、アクチビンIIB型受容体と結合する拮抗抗体(複数を含む)断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体(可溶性リガンド)、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、及びミオスタチン結合剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらは以下で詳細に説明される。
[0039]
ホリスタチンは、例えば、Amthor et al.,Dev Biol270,19−30(2004)及び米国特許第6,004,937号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される、ミオスタチンを阻害する。他の阻害剤には、例えば、Hill et al.,Mol.Endo.17(6):1144−1154(2003)に記載される、成長分化因子関連血清タンパク質−1(GASP)を含むTGF−β結合タンパク質が含まれる。ミオスタチン拮抗薬には、PCT公開第WO02/09641号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される、GDF−11を含むミオスタチン及び関連GDFタンパク質のプロペプチド領域が含まれる。ミオスタチン拮抗薬は、例えば、Bogdanovisch et al,FASEB J19,543−549(2005)に記載される、プロドメインのFc領域を含む修飾及び安定化プロペプチドがさらに含まれる。さらなるミオスタチン拮抗薬には、単量体型または二量体型である、ミオスタチンプロタンパク質及び/または成熟タンパク質を含むミオスタチンに結合する及び阻害するまたは中和させる抗体または抗体断片が含まれる。そのような抗体は、例えば、米国特許出願第US2004/0142383号、及び米国特許出願第2003/1038422号、及びPCT公開第WO2005/094446号、PCT公開第WO2006/116269号に記載されており、当該出願のすべては、参照により本明細書に組み込まれる。拮抗ミオスタチン抗体には、ミオスタチンプロタンパク質と結合し、成熟活性型への切断を防ぐ抗体がさらに含まれる。
[0040]
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体(例えば、Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane(eds),Cold Spring Harbor Press,(1988)を参照のこと)及びモノクローナル抗体(例えば、米国特許第RE32,011号、同第4,902,614号、同第4,543,439号、及び同第4,411,993号、ならびにMonoclonal Antibodies:A New Dimension in Biological Analysis,Plenum Press,Kennett,McKearn and Bechtol(eds.)(1980)を参照のこと)を含む無傷抗体を指す。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、F(ab)、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、Fc、及び一本鎖抗体、またはこれらの組み合わせ等の抗体の断片も指し、それらは組換えDNA技術によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成される。「抗体」という用語はまた、2つの異なる重/軽鎖対及び2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である二重特異性抗体または二官能性抗体も指す。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’断片の連結を含む、様々な方法により産生され得る。(Songsivilai et al,Clin.Exp.Immunol.79:315−321(1990)、Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547−1553(1992)を参照のこと)。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、1つ以上の非ヒト可変抗体免疫グロブリンドメインに結合されるヒト定常抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体またはその断片(例えば、米国特許第5,595,898及び米国特許第5,693,493号を参照のこと)である、キメラ抗体も指す。「抗体」という用語はまた、「ヒト化」抗体(例えば、米国特許第4,816,567号及び第WO94/10332号を参照のこと)、ミニボディ(第WO94/09817号)、一本鎖Fv−Fc融合(Powers et al.,J Immunol.Methods251:123−135(2001))、及びトランスジェニック動物によって産生される抗体も指し、トランスジェニック動物は、ヒト抗体産生遺伝子の割合を含むが、ヒト抗体を産生することができる内因性抗体の産生を欠いている(例えば、Mendez et al.,Nature Genetics15:146−156(1997)及び米国特許第6,300,129号を参照のこと)。「抗体」という用語はまた、多量体抗体、またはタンパク質の高次複合体、例えば、ヘテロ二量体抗体も含まれる。また、「抗体」には、抗イディオタイプ抗体も含まれる。
[0041]
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチンに結合し、少なくとも1つの活性を阻害する可溶性受容体がさらに含まれる。本明細書で使用される「可溶性受容体」という用語には、修飾された、またはそうでなければ、ミオスタチンに特異的に結合し、かつミオスタチンシグナル伝達を遮断または阻害することができる、ミオスタチン受容体の一部切除型または断片が含まれる。ミオスタチン受容体のこれらの一部切除型には、例えば、天然存在可溶性ドメイン、ならびにN末端またはC末端のタンパク質分解による変形が含まれる。可溶性ドメインには、単独の、あるいはさらなるペプチドまたは修飾に結合した、受容体の細胞外ドメインのすべてまたは一部が含まれる。ミオスタチンは、Lee et al,PNAS98(16),9306−9311(2001)に記載される、アクチビンIIB型受容体(ActRIIB)及びアクチビンIIA型受容体(ActRIIA)を含むアクチビンに結合する。可溶性受容体融合タンパク質、例えば、米国特許出願公開第2004/0223966号及びPCT公開第WO2006/012627号(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載される、可溶性受容体Fcもまた、拮抗薬として作用し得る。
[0042]
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチン受容体への結合に関してミオスタチンと競合する可溶性リガンドがさらに含まれる。本明細書で使用される「可溶性リガンド拮抗薬」という用語は、ミオスタチンアクチビンIIB型受容体(またはActRIIA)に結合し、ミオスタチンと競合することによって、ミオスタチン受容体シグナル伝達を遮断することができる、可溶性のペプチド、ポリペプチド、またはペプチド模倣体を指す。可溶性リガンド拮抗薬には、リガンドに対する実質的な相同性を維持するが、リガンドの活性を維持しない、N末端またはC末端切断、置換、欠失、及びアミノ酸残基に対する非アミノ酸ペプチド模倣体の置換等のアミノ酸配列における他の改変を含む、「ミオスタチン類似体」とも称される、ミオスタチンの変異体が含まれる。可溶性リガンド拮抗薬は、例えば、受容体に結合可能であってもよいが、シグナル伝達を可能にしない。本発明の目的のため、タンパク質は、アミノ酸配列において、互いに少なくとも80%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%同一である場合、別のタンパク質に「実質的に類似」である。
[0043]
ミオスタチン拮抗薬には、ポリヌクレオチド拮抗薬がさらに含まれる。これ拮抗薬には、標的mRNA(センス)またはDNA(アンチセンス)配列に結合可能な一本鎖ポリヌクレオチド配列(RNAまたはDNAのいずれか)を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明に従って、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチンもしくはその受容体、転写因子、またはミオスタチンもしくはその受容体の発現に関与する他のポリヌクレオチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列の断片を含む。そのような断片は、一般的に、少なくとも約14ヌクレオチド、典型的には、約14〜約30ヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードする核酸配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein and Cohen,Cancer Res.48:2659,1988及びvan der Krol et al.BioTechniques6:958,1988に記載される。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、RNAse HによるmRNAの分解増進、スプライシングの阻害、転写もしくは翻訳の未成熟な終結、または他の手段を含むいくつかの手段のうちの1つによって、タンパク質の発現を遮断するまたは阻害する二重鎖の形成をもたらす。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を遮断するために使用され得る。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖(または第WO91/06629号に記載されるもの等の他の糖連結)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖連結は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖連結を持つ、そのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である(すなわち、酵素分解に抵抗可能である)が、標的ヌクレオチド配列に結合可能な配列特異性を保持する。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、第WO90/10448号に記載されるもの等の有機部分、及びポリ−(L)−リジン等の、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に、共有結合されたオリゴヌクレオチドが含まれる。さらになお、エリプチシン等の挿入剤、及びアルキル化剤または金属複合体を、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
[0044]
例えば、リポフェクション、CaPO4媒介性DNAトランスフェクション、エレクトロポレーションを含むいずれかの遺伝子トランスファー法によって、あるいはエプスタインバーウイルスまたはアデノウイルス等の遺伝子トランスファーベクターを用いることによって、標的核酸を含有する細胞に、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。第WO91/04753号に記載される、リガンド結合分子との複合体を形成することによっても、標的核酸を含有する細胞に、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。好適なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の複合は、リガンド結合分子が、その対応する分子または受容体に結合する能力に実質的に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその複合型の細胞内への進入を実質的に遮断しない。あるいは、第WO90/10448号に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸を含有する細胞に、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって、細胞内で解離される。
[0045]
ミオスタチンまたはミオスタチン受容体の発現を防止するためのさらなる方法は、例えば、Bosher et al.,Nature Cell Biol2,E31−E36(2000)に記載されるような、特異的小干渉RNA(siRNA)の導入によって生じるRNA干渉(RNAi)である。
[0046]
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチンまたはその受容体のいずれかに結合する、小分子拮抗薬がさらに含まれる。小分子は、ミオスタチンまたはその受容体への結合に関してスクリーニングし、その後、本明細書に記載される結合剤の選択と同様に、特異的及び非特異的溶出を行うことによって選択される。
[0047]
本明細書で使用される「ミオスタチンに結合可能な」または「ミオスタチンに結合親和性を有する」という用語は、以下の実施例に記載されるファージELISAアッセイ、BIAcore(登録商標)またはKinExA(商標)アッセイによって示されるような、ミオスタチンに結合する本明細書に記載される結合剤等のミオスタチン拮抗薬を指す。
[0048]
本明細書で使用される「ミオスタチン活性を修飾可能」という用語は、ミオスタチンの少なくとも1つの生物学的活性に関する作動薬または拮抗薬のいずれかとしての薬剤の作用を指す。本明細書で使用される「作動薬」または「模倣薬」活性は、例えば、2001年5月2日に出願された国際公開第WO01/83525号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるような、対象となるタンパク質と相互作用するタンパク質に匹敵する生物学的活性を有する薬剤を指す。
[0049]
本明細書で使用される「ミオスタチン活性を阻害する」または「ミオスタチン活性を拮抗する」という用語は、例えば、pMARE C2C12細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ等のインビトロアッセイによって、または以下に記載されるインビボ動物試験によって示されるように、ミオスタチン拮抗薬のミオスタチン活性またはシグナル伝達を減少させるかまたは遮断する能力を指す。
[0036]
本明細書に記載される治療方法は、配列番号311のミオスタチン結合ペプチドを含むミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号635からなる少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディ、例えば、ペプチボディAMG−745を使用する。
[0037]
本明細書で使用される「ミオスタチン拮抗薬」という用語は、「ミオスタチン阻害剤」と互換的に使用される。本発明によるミオスタチン拮抗薬は、ミオスタチンの少なくとも1つの活性を阻害または遮断するか、あるいは、ミオスタチンまたはその受容体の発現を遮断する。ミオスタチン活性の阻害または遮断は、例えば、ミオスタチンとその受容体との結合を妨げる、及び/またはミオスタチンのその受容体への結合を得られるシグナル伝達を遮断する、1つ以上の阻害剤を使用することによって達成され得る。拮抗薬には、ミオスタチンそれ自体に結合する薬剤、またはミオスタチン受容体に結合する薬剤が含まれる。
[0038]
ミオスタチン拮抗薬の他の例としては、ホリスタチン、ミオスタチンプロドメイン、成長分化因子11(GDF−11)プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合する拮抗抗体、アクチビンIIB型受容体と結合する拮抗抗体(複数を含む)断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体(可溶性リガンド)、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、及びミオスタチン結合剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらは以下で詳細に説明される。
[0039]
ホリスタチンは、例えば、Amthor et al.,Dev Biol270,19−30(2004)及び米国特許第6,004,937号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される、ミオスタチンを阻害する。他の阻害剤には、例えば、Hill et al.,Mol.Endo.17(6):1144−1154(2003)に記載される、成長分化因子関連血清タンパク質−1(GASP)を含むTGF−β結合タンパク質が含まれる。ミオスタチン拮抗薬には、PCT公開第WO02/09641号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される、GDF−11を含むミオスタチン及び関連GDFタンパク質のプロペプチド領域が含まれる。ミオスタチン拮抗薬は、例えば、Bogdanovisch et al,FASEB J19,543−549(2005)に記載される、プロドメインのFc領域を含む修飾及び安定化プロペプチドがさらに含まれる。さらなるミオスタチン拮抗薬には、単量体型または二量体型である、ミオスタチンプロタンパク質及び/または成熟タンパク質を含むミオスタチンに結合する及び阻害するまたは中和させる抗体または抗体断片が含まれる。そのような抗体は、例えば、米国特許出願第US2004/0142383号、及び米国特許出願第2003/1038422号、及びPCT公開第WO2005/094446号、PCT公開第WO2006/116269号に記載されており、当該出願のすべては、参照により本明細書に組み込まれる。拮抗ミオスタチン抗体には、ミオスタチンプロタンパク質と結合し、成熟活性型への切断を防ぐ抗体がさらに含まれる。
[0040]
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体(例えば、Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane(eds),Cold Spring Harbor Press,(1988)を参照のこと)及びモノクローナル抗体(例えば、米国特許第RE32,011号、同第4,902,614号、同第4,543,439号、及び同第4,411,993号、ならびにMonoclonal Antibodies:A New Dimension in Biological Analysis,Plenum Press,Kennett,McKearn and Bechtol(eds.)(1980)を参照のこと)を含む無傷抗体を指す。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、F(ab)、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、Fc、及び一本鎖抗体、またはこれらの組み合わせ等の抗体の断片も指し、それらは組換えDNA技術によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成される。「抗体」という用語はまた、2つの異なる重/軽鎖対及び2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である二重特異性抗体または二官能性抗体も指す。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’断片の連結を含む、様々な方法により産生され得る。(Songsivilai et al,Clin.Exp.Immunol.79:315−321(1990)、Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547−1553(1992)を参照のこと)。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、1つ以上の非ヒト可変抗体免疫グロブリンドメインに結合されるヒト定常抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体またはその断片(例えば、米国特許第5,595,898及び米国特許第5,693,493号を参照のこと)である、キメラ抗体も指す。「抗体」という用語はまた、「ヒト化」抗体(例えば、米国特許第4,816,567号及び第WO94/10332号を参照のこと)、ミニボディ(第WO94/09817号)、一本鎖Fv−Fc融合(Powers et al.,J Immunol.Methods251:123−135(2001))、及びトランスジェニック動物によって産生される抗体も指し、トランスジェニック動物は、ヒト抗体産生遺伝子の割合を含むが、ヒト抗体を産生することができる内因性抗体の産生を欠いている(例えば、Mendez et al.,Nature Genetics15:146−156(1997)及び米国特許第6,300,129号を参照のこと)。「抗体」という用語はまた、多量体抗体、またはタンパク質の高次複合体、例えば、ヘテロ二量体抗体も含まれる。また、「抗体」には、抗イディオタイプ抗体も含まれる。
[0041]
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチンに結合し、少なくとも1つの活性を阻害する可溶性受容体がさらに含まれる。本明細書で使用される「可溶性受容体」という用語には、修飾された、またはそうでなければ、ミオスタチンに特異的に結合し、かつミオスタチンシグナル伝達を遮断または阻害することができる、ミオスタチン受容体の一部切除型または断片が含まれる。ミオスタチン受容体のこれらの一部切除型には、例えば、天然存在可溶性ドメイン、ならびにN末端またはC末端のタンパク質分解による変形が含まれる。可溶性ドメインには、単独の、あるいはさらなるペプチドまたは修飾に結合した、受容体の細胞外ドメインのすべてまたは一部が含まれる。ミオスタチンは、Lee et al,PNAS98(16),9306−9311(2001)に記載される、アクチビンIIB型受容体(ActRIIB)及びアクチビンIIA型受容体(ActRIIA)を含むアクチビンに結合する。可溶性受容体融合タンパク質、例えば、米国特許出願公開第2004/0223966号及びPCT公開第WO2006/012627号(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載される、可溶性受容体Fcもまた、拮抗薬として作用し得る。
[0042]
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチン受容体への結合に関してミオスタチンと競合する可溶性リガンドがさらに含まれる。本明細書で使用される「可溶性リガンド拮抗薬」という用語は、ミオスタチンアクチビンIIB型受容体(またはActRIIA)に結合し、ミオスタチンと競合することによって、ミオスタチン受容体シグナル伝達を遮断することができる、可溶性のペプチド、ポリペプチド、またはペプチド模倣体を指す。可溶性リガンド拮抗薬には、リガンドに対する実質的な相同性を維持するが、リガンドの活性を維持しない、N末端またはC末端切断、置換、欠失、及びアミノ酸残基に対する非アミノ酸ペプチド模倣体の置換等のアミノ酸配列における他の改変を含む、「ミオスタチン類似体」とも称される、ミオスタチンの変異体が含まれる。可溶性リガンド拮抗薬は、例えば、受容体に結合可能であってもよいが、シグナル伝達を可能にしない。本発明の目的のため、タンパク質は、アミノ酸配列において、互いに少なくとも80%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%同一である場合、別のタンパク質に「実質的に類似」である。
[0043]
ミオスタチン拮抗薬には、ポリヌクレオチド拮抗薬がさらに含まれる。これ拮抗薬には、標的mRNA(センス)またはDNA(アンチセンス)配列に結合可能な一本鎖ポリヌクレオチド配列(RNAまたはDNAのいずれか)を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明に従って、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチンもしくはその受容体、転写因子、またはミオスタチンもしくはその受容体の発現に関与する他のポリヌクレオチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列の断片を含む。そのような断片は、一般的に、少なくとも約14ヌクレオチド、典型的には、約14〜約30ヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードする核酸配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein and Cohen,Cancer Res.48:2659,1988及びvan der Krol et al.BioTechniques6:958,1988に記載される。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、RNAse HによるmRNAの分解増進、スプライシングの阻害、転写もしくは翻訳の未成熟な終結、または他の手段を含むいくつかの手段のうちの1つによって、タンパク質の発現を遮断するまたは阻害する二重鎖の形成をもたらす。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を遮断するために使用され得る。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖(または第WO91/06629号に記載されるもの等の他の糖連結)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖連結は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖連結を持つ、そのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である(すなわち、酵素分解に抵抗可能である)が、標的ヌクレオチド配列に結合可能な配列特異性を保持する。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、第WO90/10448号に記載されるもの等の有機部分、及びポリ−(L)−リジン等の、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に、共有結合されたオリゴヌクレオチドが含まれる。さらになお、エリプチシン等の挿入剤、及びアルキル化剤または金属複合体を、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
[0044]
例えば、リポフェクション、CaPO4媒介性DNAトランスフェクション、エレクトロポレーションを含むいずれかの遺伝子トランスファー法によって、あるいはエプスタインバーウイルスまたはアデノウイルス等の遺伝子トランスファーベクターを用いることによって、標的核酸を含有する細胞に、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。第WO91/04753号に記載される、リガンド結合分子との複合体を形成することによっても、標的核酸を含有する細胞に、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。好適なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の複合は、リガンド結合分子が、その対応する分子または受容体に結合する能力に実質的に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその複合型の細胞内への進入を実質的に遮断しない。あるいは、第WO90/10448号に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸を含有する細胞に、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって、細胞内で解離される。
[0045]
ミオスタチンまたはミオスタチン受容体の発現を防止するためのさらなる方法は、例えば、Bosher et al.,Nature Cell Biol2,E31−E36(2000)に記載されるような、特異的小干渉RNA(siRNA)の導入によって生じるRNA干渉(RNAi)である。
[0046]
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチンまたはその受容体のいずれかに結合する、小分子拮抗薬がさらに含まれる。小分子は、ミオスタチンまたはその受容体への結合に関してスクリーニングし、その後、本明細書に記載される結合剤の選択と同様に、特異的及び非特異的溶出を行うことによって選択される。
[0047]
本明細書で使用される「ミオスタチンに結合可能な」または「ミオスタチンに結合親和性を有する」という用語は、以下の実施例に記載されるファージELISAアッセイ、BIAcore(登録商標)またはKinExA(商標)アッセイによって示されるような、ミオスタチンに結合する本明細書に記載される結合剤等のミオスタチン拮抗薬を指す。
[0048]
本明細書で使用される「ミオスタチン活性を修飾可能」という用語は、ミオスタチンの少なくとも1つの生物学的活性に関する作動薬または拮抗薬のいずれかとしての薬剤の作用を指す。本明細書で使用される「作動薬」または「模倣薬」活性は、例えば、2001年5月2日に出願された国際公開第WO01/83525号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるような、対象となるタンパク質と相互作用するタンパク質に匹敵する生物学的活性を有する薬剤を指す。
[0049]
本明細書で使用される「ミオスタチン活性を阻害する」または「ミオスタチン活性を拮抗する」という用語は、例えば、pMARE C2C12細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ等のインビトロアッセイによって、または以下に記載されるインビボ動物試験によって示されるように、ミオスタチン拮抗薬のミオスタチン活性またはシグナル伝達を減少させるかまたは遮断する能力を指す。
ミオスタチン結合剤
[0050]
本発明の方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、例えば、少なくとも1つのミオスタチン結合ペプチド、例えば、配列番号311、例えば、ペプチボディAMG−745を含むミオスタチン結合剤を含む。
[0051]
一実施形態において、本発明の結合剤は、ポリマーまたはFcドメイン等の少なくとも1つのビヒクルに共有結合した少なくとも1つのミオスタチン結合ペプチドを含む。ミオスタチン結合ペプチドの少なくとも1つのビヒクルへの結合は、結合剤の生物学的活性を増加させ、そして/またはインビボでの分解を減少させ、インビボでの半減期を増加させ、インビボでの毒性または免疫原性を減少させることによって、療法剤としての結合剤の有効性を増加させることを意図する。結合剤は、ペプチド及びビヒクルを連結するリンカー配列をさらに含み得る。ペプチド(複数を含む)が、直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのN末端、C末端、またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに結合される。本実施形態において、本発明の結合剤は、以下の構造:
(X1)a−F1−(X2)b、またはその多量体を有し、
式中、F1は、ビヒクルであり、X1及びX2は、各々独立して、
−(L1)c−P1、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3、
及び−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3−(L4)f−P4から選択され、
式中、P1、P2、P3、及びP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、
L1、L2、L3、及びL4は、各々リンカーであり、a、b、c、d、e、及びfは、各々独立して、0または1であるが、但し、a及びbのうちの少なくとも1つは1である。
[0052]
システイニル残基を含有するペプチドはいずれも、別のCys含有ペプチドと架橋されることも可能であり、これらのいずれかまたは両方がビヒクルに連結されてもよい。1より多いCys残基を有するペプチドはいずれも、ペプチド内ジスルフィド結合を形成することもまた、可能である。
[0053]
一実施形態において、ビヒクルは、以下に定義されるFcドメインである。本実施形態は、「ペプチボディ」と称される。本明細書で使用される「ペプチボディ」という用語は、少なくとも1つのペプチドに結合した抗体Fcドメインを含む分子を指す。ペプチボディの産生は、2000年5月4日に公開されたPCT公開第WO00/24782号に一般的に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。典型的なペプチボディは、以下の実施例に記載されるように、それぞれ、1コピー及び2コピーのペプチド(タンデムに結合される)を有する、1×及び2×の形態として提供される。
[0050]
本発明の方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、例えば、少なくとも1つのミオスタチン結合ペプチド、例えば、配列番号311、例えば、ペプチボディAMG−745を含むミオスタチン結合剤を含む。
[0051]
一実施形態において、本発明の結合剤は、ポリマーまたはFcドメイン等の少なくとも1つのビヒクルに共有結合した少なくとも1つのミオスタチン結合ペプチドを含む。ミオスタチン結合ペプチドの少なくとも1つのビヒクルへの結合は、結合剤の生物学的活性を増加させ、そして/またはインビボでの分解を減少させ、インビボでの半減期を増加させ、インビボでの毒性または免疫原性を減少させることによって、療法剤としての結合剤の有効性を増加させることを意図する。結合剤は、ペプチド及びビヒクルを連結するリンカー配列をさらに含み得る。ペプチド(複数を含む)が、直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのN末端、C末端、またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに結合される。本実施形態において、本発明の結合剤は、以下の構造:
(X1)a−F1−(X2)b、またはその多量体を有し、
式中、F1は、ビヒクルであり、X1及びX2は、各々独立して、
−(L1)c−P1、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3、
及び−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3−(L4)f−P4から選択され、
式中、P1、P2、P3、及びP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、
L1、L2、L3、及びL4は、各々リンカーであり、a、b、c、d、e、及びfは、各々独立して、0または1であるが、但し、a及びbのうちの少なくとも1つは1である。
[0052]
システイニル残基を含有するペプチドはいずれも、別のCys含有ペプチドと架橋されることも可能であり、これらのいずれかまたは両方がビヒクルに連結されてもよい。1より多いCys残基を有するペプチドはいずれも、ペプチド内ジスルフィド結合を形成することもまた、可能である。
[0053]
一実施形態において、ビヒクルは、以下に定義されるFcドメインである。本実施形態は、「ペプチボディ」と称される。本明細書で使用される「ペプチボディ」という用語は、少なくとも1つのペプチドに結合した抗体Fcドメインを含む分子を指す。ペプチボディの産生は、2000年5月4日に公開されたPCT公開第WO00/24782号に一般的に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。典型的なペプチボディは、以下の実施例に記載されるように、それぞれ、1コピー及び2コピーのペプチド(タンデムに結合される)を有する、1×及び2×の形態として提供される。
ペプチド
[0054]
一実施形態において、配列番号311からなるペプチドを含むミオスタチン拮抗薬を使用する。
[0055]
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結される約5〜約90アミノ酸の分子を指す。本発明のペプチドは、好ましくは、約5〜約50アミノ酸長、より好ましくは約10〜30アミノ酸長、最も好ましくは約10〜25アミノ酸長であり、ミオスタチンタンパク質に結合することが可能である。
[0056]
本発明のペプチドは、天然存在タンパク質の配列の部分を含んでもよく、天然存在タンパク質由来のランダム化配列であってもよく、または完全にランダム化配列であってもよい。本発明のペプチドは、化学合成、タンパク質の消化、または組換え技術を含む、当該技術分野で知られている任意の方法によって生成され得る。ミオスタチンに結合可能なペプチドを生成するには、ファージディスプレイ及びRNA−ペプチドスクリーニング、及び他の親和性スクリーニング技術が、特に有用である。
[0057]
ファージディスプレイ技術は、例えば、Scott et al.Science249:386(1990)、Devlin et al.,Science249:404(1990)、1993年6月29日に発行された米国特許第5,223,409号、1998年3月31日に発行された米国特許第5,733,731号、1996年3月12日に発行された米国特許第5,498,530号、1995年7月11日に発行された米国特許第5,432,018号、1994年8月16日に発行された米国特許第5,338,665号、1999年7月13日に発行された米国特許第5,922,545号、1996年12月19日に公開された第WO96/40987号、1998年4月16日に公開された第WO98/15833号に記載されており、当該特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ファージライブラリーを用いて、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって、ランダムペプチド配列をディスプレイする。典型的には、ディスプレイされたペプチドは、標的分子に対して特異的または非特異的に親和性溶出される。保持されたファージを、親和性精製及び再増殖の連続周期によって濃縮してもよい。例えば、以下に記載されるファージELISAを用い、配列決定することによって、さらなる分析のために、最適結合ペプチドが選択される。任意に、突然変異誘発ライブラリーを生成して、スクリーニングし、最適結合剤の配列をさらに最適化することも可能である(Lowman,Ann Rev Biophys Biomol Struct26:401−24(1997))。
[0058]
ミオスタチン結合ペプチドを生成する他の方法には、当該技術分野に知られているさらなる親和性選択技術が含まれる。ペプチドライブラリーをlacリプレッサーのカルボキシル末端で融合させて、大腸菌で発現させることも可能である。大腸菌に基づく別の方法は、ペプチドグリカン会合リポタンパク質(PAL)との融合によって、細胞の外膜上でのディスプレイを可能にする。以下、これらの方法及び関連法は、集合的に、「大腸菌ディスプレイ」と称する。別の方法において、リボソーム放出前にランダムRNAの翻訳を停止して、会合するRNAがまだ付着したポリペプチドのライブラリーを生じる。以下、この方法及び関連法は、集合的に、「リボソームディスプレイ」と称する。他の方法は、RNAに対するペプチドの化学的連結を使用する。例えば、Roberts and Szostak,Proc Natl Acad Sci USA,94:12297−303(1997)を参照のこと。以下、この方法及び関連法は、集合的に、「RNA−ペプチドスクリーニング」と称する。酵母2ハイブリッドスクリーニング法もまた、ミオスタチンに結合する本発明のペプチドを特定するのに使用され得る。さらに、化学的に得られるペプチドライブラリーが開発されてきており、ここでは、ペプチドは安定な非生物学的物質、例えばポリエチレンロッドまたは溶媒浸透性樹脂上に固定されている。別の化学的に得られるペプチドライブラリーは、フォトリソグラフィーを用いて、スライドガラス上に固定されたペプチドをスキャンする。以下、これらの方法及び関連法は、集合的に、「化学的ペプチドスクリーニング」と称する。化学的ペプチドスクリーニングは、D−アミノ酸及び他の類似体、ならびに非ペプチド物質の使用を可能にする点で有利であり得る。生物学的方法及び化学的方法は両方とも、Wells and Lowman,Curr Opin Biotechnol3:355−62(1992)に概説される。
[0059]
さらに、ミオスタチンに結合可能な選択されたペプチドを、「合理的設計」の使用を通じて、さらに改善することもできる。このアプローチでは、ペプチド配列を段階的に変化させて、ペプチドの結合親和性または特異性、あるいはペプチドの何らかの他の特性に対する置換の影響を、適切なアッセイで観察する。この技術の一例は、「アラニンウォーク」または「アラニンスキャン」と称される、一度に1つの残基をアラニンで置換することである。2つの残基を置き換える場合は、「二重アラニンウォーク」と称される。アミノ酸置換を含有する得られたペプチドを、活性増進または何らかのさらなる有益な特性に関して試験する。
[0060]
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析を用いて、より大きいタンパク質の相互作用を模倣するペプチドを示唆することも可能である。そのような分析において、タンパク質の結晶構造は、タンパク質の非常に重要な残基の同一性及び相対的な配向を示唆することも可能であり、この結晶構造からペプチドを設計してもよい。例えば、Takasaki et al.,Nature Biotech15:1266(1977)を参照のこと。これらの方法を用いて、標的タンパク質と、ファージディスプレイまたは他の親和性選択プロセスによって選択されたペプチドとの間の相互作用を調べ、それによって、結合親和性及びペプチドがタンパク質の活性を阻害する能力を増加させる、ペプチドのさらなる修飾を示唆することもまた、可能である。
[0061]
一実施形態において、ペプチドは、関連ペプチドのファミリーとして生成される。典型的なペプチドは、配列番号1〜132によって表される。これらの典型的なペプチドは、選択プロセスを通じて得られたものであり、選択プロセスでは、本明細書に記載されるような、ファージディスプレイ等の親和性選択技術によって、ファージディスプレイ技術により生成された最適結合剤をファージELISAでさらに分析して、候補ペプチドを得た。しかしながら、本発明のペプチドは、以下に記載される化学合成を含むいかなる公知の方法によっても生成され得る。
[0062]
ペプチドは、「親和性成熟」のプロセスによってさらに改善可能である。この手順は、ファージディスプレイまたは他の選択技術を用いて、本発明のペプチド及びペプチボディの親和性または活性を増加させることに関する。例えば、コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸(コンセンサス配列から決定される)が一定に保持されるかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイライブラリーを生成することが可能である。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイライブラリーを生成することが可能である。よりストリンジェントな条件下での、そのようなライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの所望の特性を持つ、ペプチドを生じることが可能である。しかしながら、次いで、化学的合成または組換え的合成を含む、いくつもの既知の方法によって、親和性成熟配列を有するペプチドを産生してもよい。これらのペプチドを用いて、細胞に基づくアッセイ及びインビボアッセイにおいて、より高い阻害活性を示す、多様な形態のペプチボディ等の結合剤を生成する。
[0063]
以下の実施例6は、親和性成熟ペプチドを産生するための、上述の「第1周期」ペプチドの親和性成熟を記載する。典型的な親和性成熟ペプチボディを表IV及びVに示す。次いで、これらのペプチドから作製されて得られた1×及び2×ペプチボディを、結合親和性、ミオスタチン活性を中和する能力、アクチビン等の特定の他のTGF−βファミリーメンバーと対照的な、ミオスタチンに対する特異性、ならびに以下に記載される、さらなるインビトロ及びインビボ活性に関して、さらに特徴付けした。親和性成熟ペプチド及びペプチボディは、同じファミリーの第1周期ペプチドと区別するために、それらのファミリー名の前に接頭辞「m」を付けて称される。
[0064]
本発明に従ってさらなる親和性成熟のために選択される、典型的な第1周期ペプチドには、以下のペプチドが含まれた:
TN8−19QGHCTRWPWMCPPY(配列番号33)
直鎖−2MEMLDSLFELLKDMVPISKA(配列番号104)
直鎖−15HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV(配列番号117)
直鎖−17,RATLLKDFWQLVEGYGDN(配列番号119)
直鎖−20YREMSMLEGLLDVLERLQHY(配列番号122)
直鎖−21HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ(配列番号123)
直鎖−24EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN(配列番号126)。
[0065]
これら各々の親和性成熟ファミリーを以下の表IV及びVに示す。
[0066]
本発明のペプチドにはまた、ミオスタチンに結合可能な選択したペプチドの変異体及び誘導体が含まれる。本明細書で使用される「変異体」という用語は、元来のアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、そしてなおミオスタチンに結合可能なペプチドを指す。挿入変異体及び置換変異体は、天然アミノ酸、ならびに非天然存在アミノ酸を含有してもよい。本明細書で使用される「変異体」という用語には、ミオスタチンに結合する能力をなお保持するペプチド断片が含まれる。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、挿入変異体、欠失変異体、及び置換変異体とは何らかの点で異なる、化学的に修飾されたペプチドを指す。本発明のペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体が以下により完全に記載される。
[0054]
一実施形態において、配列番号311からなるペプチドを含むミオスタチン拮抗薬を使用する。
[0055]
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結される約5〜約90アミノ酸の分子を指す。本発明のペプチドは、好ましくは、約5〜約50アミノ酸長、より好ましくは約10〜30アミノ酸長、最も好ましくは約10〜25アミノ酸長であり、ミオスタチンタンパク質に結合することが可能である。
[0056]
本発明のペプチドは、天然存在タンパク質の配列の部分を含んでもよく、天然存在タンパク質由来のランダム化配列であってもよく、または完全にランダム化配列であってもよい。本発明のペプチドは、化学合成、タンパク質の消化、または組換え技術を含む、当該技術分野で知られている任意の方法によって生成され得る。ミオスタチンに結合可能なペプチドを生成するには、ファージディスプレイ及びRNA−ペプチドスクリーニング、及び他の親和性スクリーニング技術が、特に有用である。
[0057]
ファージディスプレイ技術は、例えば、Scott et al.Science249:386(1990)、Devlin et al.,Science249:404(1990)、1993年6月29日に発行された米国特許第5,223,409号、1998年3月31日に発行された米国特許第5,733,731号、1996年3月12日に発行された米国特許第5,498,530号、1995年7月11日に発行された米国特許第5,432,018号、1994年8月16日に発行された米国特許第5,338,665号、1999年7月13日に発行された米国特許第5,922,545号、1996年12月19日に公開された第WO96/40987号、1998年4月16日に公開された第WO98/15833号に記載されており、当該特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ファージライブラリーを用いて、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって、ランダムペプチド配列をディスプレイする。典型的には、ディスプレイされたペプチドは、標的分子に対して特異的または非特異的に親和性溶出される。保持されたファージを、親和性精製及び再増殖の連続周期によって濃縮してもよい。例えば、以下に記載されるファージELISAを用い、配列決定することによって、さらなる分析のために、最適結合ペプチドが選択される。任意に、突然変異誘発ライブラリーを生成して、スクリーニングし、最適結合剤の配列をさらに最適化することも可能である(Lowman,Ann Rev Biophys Biomol Struct26:401−24(1997))。
[0058]
ミオスタチン結合ペプチドを生成する他の方法には、当該技術分野に知られているさらなる親和性選択技術が含まれる。ペプチドライブラリーをlacリプレッサーのカルボキシル末端で融合させて、大腸菌で発現させることも可能である。大腸菌に基づく別の方法は、ペプチドグリカン会合リポタンパク質(PAL)との融合によって、細胞の外膜上でのディスプレイを可能にする。以下、これらの方法及び関連法は、集合的に、「大腸菌ディスプレイ」と称する。別の方法において、リボソーム放出前にランダムRNAの翻訳を停止して、会合するRNAがまだ付着したポリペプチドのライブラリーを生じる。以下、この方法及び関連法は、集合的に、「リボソームディスプレイ」と称する。他の方法は、RNAに対するペプチドの化学的連結を使用する。例えば、Roberts and Szostak,Proc Natl Acad Sci USA,94:12297−303(1997)を参照のこと。以下、この方法及び関連法は、集合的に、「RNA−ペプチドスクリーニング」と称する。酵母2ハイブリッドスクリーニング法もまた、ミオスタチンに結合する本発明のペプチドを特定するのに使用され得る。さらに、化学的に得られるペプチドライブラリーが開発されてきており、ここでは、ペプチドは安定な非生物学的物質、例えばポリエチレンロッドまたは溶媒浸透性樹脂上に固定されている。別の化学的に得られるペプチドライブラリーは、フォトリソグラフィーを用いて、スライドガラス上に固定されたペプチドをスキャンする。以下、これらの方法及び関連法は、集合的に、「化学的ペプチドスクリーニング」と称する。化学的ペプチドスクリーニングは、D−アミノ酸及び他の類似体、ならびに非ペプチド物質の使用を可能にする点で有利であり得る。生物学的方法及び化学的方法は両方とも、Wells and Lowman,Curr Opin Biotechnol3:355−62(1992)に概説される。
[0059]
さらに、ミオスタチンに結合可能な選択されたペプチドを、「合理的設計」の使用を通じて、さらに改善することもできる。このアプローチでは、ペプチド配列を段階的に変化させて、ペプチドの結合親和性または特異性、あるいはペプチドの何らかの他の特性に対する置換の影響を、適切なアッセイで観察する。この技術の一例は、「アラニンウォーク」または「アラニンスキャン」と称される、一度に1つの残基をアラニンで置換することである。2つの残基を置き換える場合は、「二重アラニンウォーク」と称される。アミノ酸置換を含有する得られたペプチドを、活性増進または何らかのさらなる有益な特性に関して試験する。
[0060]
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析を用いて、より大きいタンパク質の相互作用を模倣するペプチドを示唆することも可能である。そのような分析において、タンパク質の結晶構造は、タンパク質の非常に重要な残基の同一性及び相対的な配向を示唆することも可能であり、この結晶構造からペプチドを設計してもよい。例えば、Takasaki et al.,Nature Biotech15:1266(1977)を参照のこと。これらの方法を用いて、標的タンパク質と、ファージディスプレイまたは他の親和性選択プロセスによって選択されたペプチドとの間の相互作用を調べ、それによって、結合親和性及びペプチドがタンパク質の活性を阻害する能力を増加させる、ペプチドのさらなる修飾を示唆することもまた、可能である。
[0061]
一実施形態において、ペプチドは、関連ペプチドのファミリーとして生成される。典型的なペプチドは、配列番号1〜132によって表される。これらの典型的なペプチドは、選択プロセスを通じて得られたものであり、選択プロセスでは、本明細書に記載されるような、ファージディスプレイ等の親和性選択技術によって、ファージディスプレイ技術により生成された最適結合剤をファージELISAでさらに分析して、候補ペプチドを得た。しかしながら、本発明のペプチドは、以下に記載される化学合成を含むいかなる公知の方法によっても生成され得る。
[0062]
ペプチドは、「親和性成熟」のプロセスによってさらに改善可能である。この手順は、ファージディスプレイまたは他の選択技術を用いて、本発明のペプチド及びペプチボディの親和性または活性を増加させることに関する。例えば、コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸(コンセンサス配列から決定される)が一定に保持されるかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイライブラリーを生成することが可能である。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイライブラリーを生成することが可能である。よりストリンジェントな条件下での、そのようなライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの所望の特性を持つ、ペプチドを生じることが可能である。しかしながら、次いで、化学的合成または組換え的合成を含む、いくつもの既知の方法によって、親和性成熟配列を有するペプチドを産生してもよい。これらのペプチドを用いて、細胞に基づくアッセイ及びインビボアッセイにおいて、より高い阻害活性を示す、多様な形態のペプチボディ等の結合剤を生成する。
[0063]
以下の実施例6は、親和性成熟ペプチドを産生するための、上述の「第1周期」ペプチドの親和性成熟を記載する。典型的な親和性成熟ペプチボディを表IV及びVに示す。次いで、これらのペプチドから作製されて得られた1×及び2×ペプチボディを、結合親和性、ミオスタチン活性を中和する能力、アクチビン等の特定の他のTGF−βファミリーメンバーと対照的な、ミオスタチンに対する特異性、ならびに以下に記載される、さらなるインビトロ及びインビボ活性に関して、さらに特徴付けした。親和性成熟ペプチド及びペプチボディは、同じファミリーの第1周期ペプチドと区別するために、それらのファミリー名の前に接頭辞「m」を付けて称される。
[0064]
本発明に従ってさらなる親和性成熟のために選択される、典型的な第1周期ペプチドには、以下のペプチドが含まれた:
TN8−19QGHCTRWPWMCPPY(配列番号33)
直鎖−2MEMLDSLFELLKDMVPISKA(配列番号104)
直鎖−15HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV(配列番号117)
直鎖−17,RATLLKDFWQLVEGYGDN(配列番号119)
直鎖−20YREMSMLEGLLDVLERLQHY(配列番号122)
直鎖−21HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ(配列番号123)
直鎖−24EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN(配列番号126)。
[0065]
これら各々の親和性成熟ファミリーを以下の表IV及びVに示す。
[0066]
本発明のペプチドにはまた、ミオスタチンに結合可能な選択したペプチドの変異体及び誘導体が含まれる。本明細書で使用される「変異体」という用語は、元来のアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、そしてなおミオスタチンに結合可能なペプチドを指す。挿入変異体及び置換変異体は、天然アミノ酸、ならびに非天然存在アミノ酸を含有してもよい。本明細書で使用される「変異体」という用語には、ミオスタチンに結合する能力をなお保持するペプチド断片が含まれる。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、挿入変異体、欠失変異体、及び置換変異体とは何らかの点で異なる、化学的に修飾されたペプチドを指す。本発明のペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体が以下により完全に記載される。
ビヒクル
[0067]
本明細書で使用される「ビヒクル」という用語は、本発明の1つ以上のペプチドに結合することが可能な分子を指す。好ましくは、ビヒクルは、本発明の結合剤に少なくとも1つの所望の特性を与える。ペプチドは、単独では、腎臓濾過、細網内皮系における細胞性クリアランス機構、またはタンパク質分解的分解のいずれかによって、インビボで除去される可能性が高い。ビヒクルへの結合は、結合剤の分解を減少させ、そして/または半減期を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、そして/または結合剤の生物学的活性を増加させることによって、結合剤の治療的価値を改善する。
[0068]
典型的なビヒクルには、Fcドメイン;ポリエチレングリコール(PEG)、ポリリジン、デキストラン等の直鎖ポリマー;分枝鎖ポリマー(例えば、1981年9月15日に発行されたDenkenwalterらの米国特許第4,289,872号;1993年7月20日に発行されたTamらの米国特許第5,229,490号;1993年10月28日に公開されたFrechetらによる第WO93/21259号を参照のこと);脂質;コレステロール群(ステロイド等);炭水化物またはオリゴ糖;あるいはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然または合成タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが含まれる。
[0069]
一実施形態において、本発明のミオスタチン結合剤はペプチド(複数を含む)のアミノ酸残基の1つのN末端、C末端、または側鎖を通じて、少なくとも1つのビヒクル(F1、F2)に結合した少なくとも1つのペプチドを有する。複数のビヒクルもまた使用され得、例えば、各末端にFcドメインが、または1つの末端にFcドメインが、そしてもう一方の末端または側鎖にPEG基があってもよい。
[0067]
本明細書で使用される「ビヒクル」という用語は、本発明の1つ以上のペプチドに結合することが可能な分子を指す。好ましくは、ビヒクルは、本発明の結合剤に少なくとも1つの所望の特性を与える。ペプチドは、単独では、腎臓濾過、細網内皮系における細胞性クリアランス機構、またはタンパク質分解的分解のいずれかによって、インビボで除去される可能性が高い。ビヒクルへの結合は、結合剤の分解を減少させ、そして/または半減期を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、そして/または結合剤の生物学的活性を増加させることによって、結合剤の治療的価値を改善する。
[0068]
典型的なビヒクルには、Fcドメイン;ポリエチレングリコール(PEG)、ポリリジン、デキストラン等の直鎖ポリマー;分枝鎖ポリマー(例えば、1981年9月15日に発行されたDenkenwalterらの米国特許第4,289,872号;1993年7月20日に発行されたTamらの米国特許第5,229,490号;1993年10月28日に公開されたFrechetらによる第WO93/21259号を参照のこと);脂質;コレステロール群(ステロイド等);炭水化物またはオリゴ糖;あるいはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然または合成タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが含まれる。
[0069]
一実施形態において、本発明のミオスタチン結合剤はペプチド(複数を含む)のアミノ酸残基の1つのN末端、C末端、または側鎖を通じて、少なくとも1つのビヒクル(F1、F2)に結合した少なくとも1つのペプチドを有する。複数のビヒクルもまた使用され得、例えば、各末端にFcドメインが、または1つの末端にFcドメインが、そしてもう一方の末端または側鎖にPEG基があってもよい。
Fcドメイン
[0070]
Fcドメインは、1つの好ましいビヒクルである。本明細書で使用される「Fcドメイン」という用語は、天然Fc及びFc変異体分子、ならびに以下に定義されるような配列が含まれる。本明細書で使用される「天然Fc」という用語は、組換えDNA技術によって、または無傷抗体の酵素的またはもしくは化学的切断によって産生される、抗体の非抗原結合断片、またはその断片のアミノ酸配列を指す。好ましいFcは、完全ヒトFcであり、IgG1及びIgG2等の免疫グロブリンのいずれに由来してもよい。しかしながら、部分的にヒトであるか、または非ヒト種に由来するFc分子もまた、本明細書に含まれる。天然Fc分子は、共有結合(すなわち、ジスルフィド結合)及び非共有結合によって二量体型または多量体型に連結されることも可能な、単量体ポリペプチドで構成される。天然Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス(例えば、IgG、IgA、IgE)またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)に応じて、1〜4の範囲である。天然Fcの一例は、IgGのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である(Ellison et al.(1982),Nucl Acids Res10:4071−9を参照のこと)。本明細書で使用される「天然Fc」という用語は、単量体型、二量体型、及び多量体型を指すように用いられる。
[0071]
本明細書で使用される「Fc変異体」という用語は、例えば、第WO97/34631号及び第WO96/32478号に記載され、これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる、サルベージ受容体への結合が維持されるという条件付きの天然Fc配列の修飾型を指す。Fc変位体は、例えば、残基を置換するかまたは欠失させるか、残基を挿入するか、あるいは部位を含有する部分を切断することによって、構築され得る。挿入残基または置換残基はまた、ペプチド模倣体またはD−アミノ酸等の改変されたアミノ酸であり得る。Fc変異体は、いくつかの理由で望ましくあり得、理由のいくつかが以下に記載される。典型的なFc変異体には、以下の分子及び配列が含まれる:
[0072]
1.ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去されている。そのような除去は、本発明の分子を産生するのに用いる宿主細胞に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応が回避し得る。この目的のため、N末端のシステイン含有セグメントを一部切除してもよいし、あるいはシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸(例えば、アラニル、セリル)で置換してもよい。システイン残基を除去する場合であっても、一本鎖Fcドメインはなお、非共有的に一緒に保持される二量体Fcドメインを形成することも可能である。
[0073]
2.選択した宿主細胞に、より適合するように、天然Fcが修飾されている。例えば、典型的な天然FcのN末端近傍に位置し、プロリンイミノペプチダーゼ等の大腸菌の消化酵素によって認識され得る、PA配列を除去してもよい。分子が大腸菌等の細菌細胞で組換え的に発現される場合は特に、N末端メチオニル残基を付加してもよい。
[0074]
3.選択した宿主細胞で発現した際、N末端が不均一になるのを防止するため、天然FcのN末端部分が除去されている。この目的のため、N末端の最初の20アミノ酸残基のいずれか、特に、1位、2位、3位、4位、及び5位のものを欠失させてもよい。
[0075]
4.1つ以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的にグリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は、細胞溶解反応を与え得る。そのような残基を欠失させるか、または非グリコシル化残基(例えば、アラニン)で置換してもよい。
[0076]
5.補体との相互作用に関与する部位、例えば、C1q結合部位が除去されている。例えば、ヒトIgG1のEKK配列を欠失させるかまたは置換してもよい。本発明の分子には、補体動員は有利でない可能性もあり、したがって、そのようなFc変異体によってこれを回避することもあり得る。
[0077]
6.サルベージ受容体以外のFc受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去されている。天然Fcは、特定の白血球と相互作用するための部位を有する可能性があり、こうした部位は、本発明の融合分子には必要ではなく、したがって、除去してもよい。
[0078]
7.ADCC部位が除去されている。ADCC部位は、当該技術分野で知られている。例えば、IgG1におけるADCC部位に関しては、Molec Immunol29(5):633−9(1992)を参照のこと。これらの部位もまた、本発明の融合分子には必要ではなく、したがって、除去してもよい。
[0079]
8.天然Fcが非ヒト抗体に由来する場合、天然Fcをヒト化してもよい。典型的には、天然Fcをヒト化するために、非ヒト天然Fcの選択残基を、ヒト天然Fcに通常見られる残基で置換する。抗体をヒト化する技術は、当該技術分野で周知である。
[0080]
「Fcドメイン」という用語には、全抗体から消化されたか、または他の手段によって産生された、単量体型または多量体型の分子が含まれる。本明細書で使用される「多量体」という用語は、FcドメインまたはFcドメインを含む分子に適用されるとき、共有結合、非共有結合、または共有結合と非共有結合の両方の相互作用によって連結された2つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。IgG分子は、典型的には二量体を形成し、IgMは五量体、IgDは二量体、IgAは単量体、二量体、三量体、または四量体を形成する。多量体は、Fcの天然Ig供給源の配列と得られた活性を利用することによって、またはそのような天然Fcを誘導体化することによって、形成され得る。FcドメインまたはFcドメインを含む分子に適用されるとき、「二量体」という用語は、共有結合または非共有結合によって連結された2つのポリペプチド鎖を有する分子を指す。
[0070]
Fcドメインは、1つの好ましいビヒクルである。本明細書で使用される「Fcドメイン」という用語は、天然Fc及びFc変異体分子、ならびに以下に定義されるような配列が含まれる。本明細書で使用される「天然Fc」という用語は、組換えDNA技術によって、または無傷抗体の酵素的またはもしくは化学的切断によって産生される、抗体の非抗原結合断片、またはその断片のアミノ酸配列を指す。好ましいFcは、完全ヒトFcであり、IgG1及びIgG2等の免疫グロブリンのいずれに由来してもよい。しかしながら、部分的にヒトであるか、または非ヒト種に由来するFc分子もまた、本明細書に含まれる。天然Fc分子は、共有結合(すなわち、ジスルフィド結合)及び非共有結合によって二量体型または多量体型に連結されることも可能な、単量体ポリペプチドで構成される。天然Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス(例えば、IgG、IgA、IgE)またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)に応じて、1〜4の範囲である。天然Fcの一例は、IgGのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である(Ellison et al.(1982),Nucl Acids Res10:4071−9を参照のこと)。本明細書で使用される「天然Fc」という用語は、単量体型、二量体型、及び多量体型を指すように用いられる。
[0071]
本明細書で使用される「Fc変異体」という用語は、例えば、第WO97/34631号及び第WO96/32478号に記載され、これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる、サルベージ受容体への結合が維持されるという条件付きの天然Fc配列の修飾型を指す。Fc変位体は、例えば、残基を置換するかまたは欠失させるか、残基を挿入するか、あるいは部位を含有する部分を切断することによって、構築され得る。挿入残基または置換残基はまた、ペプチド模倣体またはD−アミノ酸等の改変されたアミノ酸であり得る。Fc変異体は、いくつかの理由で望ましくあり得、理由のいくつかが以下に記載される。典型的なFc変異体には、以下の分子及び配列が含まれる:
[0072]
1.ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去されている。そのような除去は、本発明の分子を産生するのに用いる宿主細胞に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応が回避し得る。この目的のため、N末端のシステイン含有セグメントを一部切除してもよいし、あるいはシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸(例えば、アラニル、セリル)で置換してもよい。システイン残基を除去する場合であっても、一本鎖Fcドメインはなお、非共有的に一緒に保持される二量体Fcドメインを形成することも可能である。
[0073]
2.選択した宿主細胞に、より適合するように、天然Fcが修飾されている。例えば、典型的な天然FcのN末端近傍に位置し、プロリンイミノペプチダーゼ等の大腸菌の消化酵素によって認識され得る、PA配列を除去してもよい。分子が大腸菌等の細菌細胞で組換え的に発現される場合は特に、N末端メチオニル残基を付加してもよい。
[0074]
3.選択した宿主細胞で発現した際、N末端が不均一になるのを防止するため、天然FcのN末端部分が除去されている。この目的のため、N末端の最初の20アミノ酸残基のいずれか、特に、1位、2位、3位、4位、及び5位のものを欠失させてもよい。
[0075]
4.1つ以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的にグリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は、細胞溶解反応を与え得る。そのような残基を欠失させるか、または非グリコシル化残基(例えば、アラニン)で置換してもよい。
[0076]
5.補体との相互作用に関与する部位、例えば、C1q結合部位が除去されている。例えば、ヒトIgG1のEKK配列を欠失させるかまたは置換してもよい。本発明の分子には、補体動員は有利でない可能性もあり、したがって、そのようなFc変異体によってこれを回避することもあり得る。
[0077]
6.サルベージ受容体以外のFc受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去されている。天然Fcは、特定の白血球と相互作用するための部位を有する可能性があり、こうした部位は、本発明の融合分子には必要ではなく、したがって、除去してもよい。
[0078]
7.ADCC部位が除去されている。ADCC部位は、当該技術分野で知られている。例えば、IgG1におけるADCC部位に関しては、Molec Immunol29(5):633−9(1992)を参照のこと。これらの部位もまた、本発明の融合分子には必要ではなく、したがって、除去してもよい。
[0079]
8.天然Fcが非ヒト抗体に由来する場合、天然Fcをヒト化してもよい。典型的には、天然Fcをヒト化するために、非ヒト天然Fcの選択残基を、ヒト天然Fcに通常見られる残基で置換する。抗体をヒト化する技術は、当該技術分野で周知である。
[0080]
「Fcドメイン」という用語には、全抗体から消化されたか、または他の手段によって産生された、単量体型または多量体型の分子が含まれる。本明細書で使用される「多量体」という用語は、FcドメインまたはFcドメインを含む分子に適用されるとき、共有結合、非共有結合、または共有結合と非共有結合の両方の相互作用によって連結された2つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。IgG分子は、典型的には二量体を形成し、IgMは五量体、IgDは二量体、IgAは単量体、二量体、三量体、または四量体を形成する。多量体は、Fcの天然Ig供給源の配列と得られた活性を利用することによって、またはそのような天然Fcを誘導体化することによって、形成され得る。FcドメインまたはFcドメインを含む分子に適用されるとき、「二量体」という用語は、共有結合または非共有結合によって連結された2つのポリペプチド鎖を有する分子を指す。
非Fcビヒクル
[0081]
さらに、本発明に従って別のビヒクルは、サルベージ受容体に結合可能な非Fcドメインタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子(例えば、ペプチド模倣体化合物)である。例えば、1998年4月14日に発行された、Prestaらの米国特許第5,739,277号に記載される、ポリペプチドをビヒクルとして使用され得、また、FcRnサルベージ受容体に対する結合に関して、ファージディスプレイによってペプチドが選択され得る。そのようなサルベージ受容体結合化合物もまた、「ビヒクル」の意味の中に含まれ、本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、半減期を増加させ(例えば、プロテアーゼによって認識される配列を回避することによって)、免疫原性を減少させる(例えば、抗体ヒト化において発見されるような、非免疫原性配列を好むことによって)ように選択されるべきである。
[0082]
さらに、ポリマービヒクルもまた、本発明の結合剤を構築するために使用され得る。ビヒクルとして有用な化学部分を結合させる多様な手段が現在利用可能であり、例えば、特許協力条約(「PCT」)国際公開第WO96/11953号、表題「N−Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods」を参照されたく、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。このPCT公報は、とりわけ、タンパク質のN末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示する。
[0083]
好ましいポリマービヒクルは、ポリエチレングリコール(PEG)である。PEG基は、いかなる好適な分子量のものであってもよく、直鎖であってもまたは分枝鎖であってもよい。PEGの平均分子量は、好ましくは約2kDa〜約100kDa、より好ましくは約5kDa〜約50kDa、最も好ましくは約5kDa〜約10kDaの範囲であろう。PEG基は、一般的に、アシル化または還元的アルキル化を介し、PEG部分上の反応基(例えば、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、またはエステル基)を通じて、本発明の化合物上の反応基(例えば、アルデヒド基、アミノ基、またはエステル基)に対して、本発明の化合物と結合されるであろう。合成ペプチドのPEG化のために有用な戦略は、溶液中で複合連結を形成することを通して、各々が他方に対して相互に反応性である特殊な官能性を担う、ペプチドとPEG部分とを結合することからなる。ペプチドは、当該技術分野で知られているような従来の固相合成で容易に調製可能である。ペプチドは、特定の部位において適切な官能基で「前活性化」されている。PEG部分と反応させる前に、前駆物質を精製し、十分に特徴付ける。ペプチドとPEGのライゲーションは、通常、水相で行われ、逆相分析HPLCによって、容易にモニターすることができる。PEG化ペプチドは分取HPLCによって容易に精製でき、分析HPLC、アミノ酸分析、及びレーザー脱着質量分析によって特徴付けることができる。
[0084]
多糖類ポリマーは、タンパク質修飾に使用され得る別の種類の水溶性ポリマーである。デキストランは、a1−6連結によって主に連結されたグルコースの個々のサブユニットからなる、多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約1kD〜約70kDの分子量のものが容易に入手できる。デキストランは、それ自体でまたは別のビヒクル(例えば、Fc)と組み合わせて、ビヒクルとして、本発明で使用するのに適した水溶性ポリマーである。例えば、第WO96/11953号及び第WO96/05309号を参照のこと。治療用または診断用免疫グロブリンに複合したデキストランの使用が報告されている;例えば、欧州特許公開第0 315 456号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。デキストランを本発明に従ってビヒクルとして用いる場合、約1kDa〜約20kDaのデキストランが好ましい。
[0081]
さらに、本発明に従って別のビヒクルは、サルベージ受容体に結合可能な非Fcドメインタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子(例えば、ペプチド模倣体化合物)である。例えば、1998年4月14日に発行された、Prestaらの米国特許第5,739,277号に記載される、ポリペプチドをビヒクルとして使用され得、また、FcRnサルベージ受容体に対する結合に関して、ファージディスプレイによってペプチドが選択され得る。そのようなサルベージ受容体結合化合物もまた、「ビヒクル」の意味の中に含まれ、本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、半減期を増加させ(例えば、プロテアーゼによって認識される配列を回避することによって)、免疫原性を減少させる(例えば、抗体ヒト化において発見されるような、非免疫原性配列を好むことによって)ように選択されるべきである。
[0082]
さらに、ポリマービヒクルもまた、本発明の結合剤を構築するために使用され得る。ビヒクルとして有用な化学部分を結合させる多様な手段が現在利用可能であり、例えば、特許協力条約(「PCT」)国際公開第WO96/11953号、表題「N−Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods」を参照されたく、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。このPCT公報は、とりわけ、タンパク質のN末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示する。
[0083]
好ましいポリマービヒクルは、ポリエチレングリコール(PEG)である。PEG基は、いかなる好適な分子量のものであってもよく、直鎖であってもまたは分枝鎖であってもよい。PEGの平均分子量は、好ましくは約2kDa〜約100kDa、より好ましくは約5kDa〜約50kDa、最も好ましくは約5kDa〜約10kDaの範囲であろう。PEG基は、一般的に、アシル化または還元的アルキル化を介し、PEG部分上の反応基(例えば、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、またはエステル基)を通じて、本発明の化合物上の反応基(例えば、アルデヒド基、アミノ基、またはエステル基)に対して、本発明の化合物と結合されるであろう。合成ペプチドのPEG化のために有用な戦略は、溶液中で複合連結を形成することを通して、各々が他方に対して相互に反応性である特殊な官能性を担う、ペプチドとPEG部分とを結合することからなる。ペプチドは、当該技術分野で知られているような従来の固相合成で容易に調製可能である。ペプチドは、特定の部位において適切な官能基で「前活性化」されている。PEG部分と反応させる前に、前駆物質を精製し、十分に特徴付ける。ペプチドとPEGのライゲーションは、通常、水相で行われ、逆相分析HPLCによって、容易にモニターすることができる。PEG化ペプチドは分取HPLCによって容易に精製でき、分析HPLC、アミノ酸分析、及びレーザー脱着質量分析によって特徴付けることができる。
[0084]
多糖類ポリマーは、タンパク質修飾に使用され得る別の種類の水溶性ポリマーである。デキストランは、a1−6連結によって主に連結されたグルコースの個々のサブユニットからなる、多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約1kD〜約70kDの分子量のものが容易に入手できる。デキストランは、それ自体でまたは別のビヒクル(例えば、Fc)と組み合わせて、ビヒクルとして、本発明で使用するのに適した水溶性ポリマーである。例えば、第WO96/11953号及び第WO96/05309号を参照のこと。治療用または診断用免疫グロブリンに複合したデキストランの使用が報告されている;例えば、欧州特許公開第0 315 456号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。デキストランを本発明に従ってビヒクルとして用いる場合、約1kDa〜約20kDaのデキストランが好ましい。
リンカー
[0085]
本発明で使用されるミオスタチン作動薬は、任意に、「リンカー」基をさらに含む。一実施形態において、リンカーは、配列GGGGGAQ(配列番号636)からなる。
[0086]
リンカーは、主に、ペプチド及びビヒクルの間のスペーサー、または本発明の結合剤の2つのペプチドの間のスペーサーとして働く。一実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によってともに連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された1〜20アミノ酸で構成され、アミノ酸は20の天然存在アミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの1つ以上は、当業者に理解されるように、グリコシル化され得る。一実施形態において、1〜20アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、立体障害とならない、グリシン及びアラニン等のアミノ酸で大部分が構成される。したがって、典型的なリンカーは、ポリグリシン(特に(Gly)5、(Gly)8)、ポリ(Gly−Ala)、及びポリアラニンである。本明細書で使用される、記号表示「g」はグリシンホモペプチドリンカーを指す。表IIに示される、「gn」は、N末端の5×glyリンカーを指し、一方、「gc」は、C末端の5×glyリンカーを指す。Gly及びAlaの組み合わせもまた好ましい。本発明の結合剤を構築するのに有用な1つの典型的なリンカー配列は、以下の通りである:gsgsatggsgstassgsgsatg(配列番号305)。このリンカー配列は、「k」または1k配列と称される。表IIに見られるような記号表示「kc」は、C末端のkリンカーを指し、一方、記号表示「kn」は、N末端のkリンカーを指す。
[0087]
本発明のリンカーはまた、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、−NH−(CH2)s−C(O)−(式中s=2〜20)等のアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル(例えば、C1〜C6)低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニル等のような立体障害とならない基のいずれかによってさらに置換されていてもよい。典型的な非ペプチドリンカーは、PEGリンカーであり、100〜5000kDa、好ましくは100〜500kDaの分子量を有する。ペプチドリンカーを改変して、上と同じ方式で誘導体を形成してもよい。
[0085]
本発明で使用されるミオスタチン作動薬は、任意に、「リンカー」基をさらに含む。一実施形態において、リンカーは、配列GGGGGAQ(配列番号636)からなる。
[0086]
リンカーは、主に、ペプチド及びビヒクルの間のスペーサー、または本発明の結合剤の2つのペプチドの間のスペーサーとして働く。一実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によってともに連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された1〜20アミノ酸で構成され、アミノ酸は20の天然存在アミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの1つ以上は、当業者に理解されるように、グリコシル化され得る。一実施形態において、1〜20アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、立体障害とならない、グリシン及びアラニン等のアミノ酸で大部分が構成される。したがって、典型的なリンカーは、ポリグリシン(特に(Gly)5、(Gly)8)、ポリ(Gly−Ala)、及びポリアラニンである。本明細書で使用される、記号表示「g」はグリシンホモペプチドリンカーを指す。表IIに示される、「gn」は、N末端の5×glyリンカーを指し、一方、「gc」は、C末端の5×glyリンカーを指す。Gly及びAlaの組み合わせもまた好ましい。本発明の結合剤を構築するのに有用な1つの典型的なリンカー配列は、以下の通りである:gsgsatggsgstassgsgsatg(配列番号305)。このリンカー配列は、「k」または1k配列と称される。表IIに見られるような記号表示「kc」は、C末端のkリンカーを指し、一方、記号表示「kn」は、N末端のkリンカーを指す。
[0087]
本発明のリンカーはまた、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、−NH−(CH2)s−C(O)−(式中s=2〜20)等のアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル(例えば、C1〜C6)低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニル等のような立体障害とならない基のいずれかによってさらに置換されていてもよい。典型的な非ペプチドリンカーは、PEGリンカーであり、100〜5000kDa、好ましくは100〜500kDaの分子量を有する。ペプチドリンカーを改変して、上と同じ方式で誘導体を形成してもよい。
典型的なミオスタチン拮抗薬、例えば、結合剤
[0088]
ミオスタチン作動薬、例えば、本明細書に記載される方法で使用される結合剤は、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチド、例えば、配列番号311に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
[0089]
一実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、約5〜約50アミノ酸長であり、別の態様において、約10〜30アミノ酸長であり、別の態様において、約10〜25アミノ酸長である。一実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列WMCPP(配列番号633)を含む。他の実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ca1a2 Wa3 WMCPP(配列番号352)を含み、式中、a1、a2、及びa3は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸から選択される。別の実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)を含み、式中、b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され、b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され、b3は、P、R、及びQのいずれか1つから選択され、10〜50アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
[0090]
他のミオスタチン結合ペプチドは、式:
c1c2c3c4c5c6Cc7c8 Wc9 WMCPPc10c11c12c13(配列番号354)を提供し、式中
c1は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
c7は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c8は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c9は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c10〜c13は、任意のアミノ酸であり、20〜50アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
[0091]
他のミオスタチン結合ペプチドは、式:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8 Wd9 WMCPPd10d11d12d13(配列番号355)であって、式中
d1は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
d2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
d5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
d7は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、
d8は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、
d9は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択され、
d10〜d13は、任意のアミノ酸から選択され、
20〜50アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
[0092]
他のミオスタチン結合ペプチドは、以下のペプチドのうちの少なくとも1つを含む:
(1)ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列WYe1e2 Ye3G(配列番号356)であって、
式中、e1は、P、S、またはYであり、
e2は、CまたはQであり、
e3は、GまたはHである、当該配列を含み、7〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
[0088]
ミオスタチン作動薬、例えば、本明細書に記載される方法で使用される結合剤は、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチド、例えば、配列番号311に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
[0089]
一実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、約5〜約50アミノ酸長であり、別の態様において、約10〜30アミノ酸長であり、別の態様において、約10〜25アミノ酸長である。一実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列WMCPP(配列番号633)を含む。他の実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ca1a2 Wa3 WMCPP(配列番号352)を含み、式中、a1、a2、及びa3は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸から選択される。別の実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)を含み、式中、b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され、b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され、b3は、P、R、及びQのいずれか1つから選択され、10〜50アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
[0090]
他のミオスタチン結合ペプチドは、式:
c1c2c3c4c5c6Cc7c8 Wc9 WMCPPc10c11c12c13(配列番号354)を提供し、式中
c1は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
c7は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c8は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c9は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c10〜c13は、任意のアミノ酸であり、20〜50アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
[0091]
他のミオスタチン結合ペプチドは、式:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8 Wd9 WMCPPd10d11d12d13(配列番号355)であって、式中
d1は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
d2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
d5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
d7は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、
d8は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、
d9は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択され、
d10〜d13は、任意のアミノ酸から選択され、
20〜50アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
[0092]
他のミオスタチン結合ペプチドは、以下のペプチドのうちの少なくとも1つを含む:
(1)ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列WYe1e2 Ye3G(配列番号356)であって、
式中、e1は、P、S、またはYであり、
e2は、CまたはQであり、
e3は、GまたはHである、当該配列を含み、7〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
(2)ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列f1 EMLf 2 SLf3f4 LL(配列番号455)であって、
式中、f1は、MまたはIであり、
f2は、任意のアミノ酸であり、
f3は、LまたはFであり、
f4は、E、Q、またはDである、当該配列を含み、
7〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
式中、f1は、MまたはIであり、
f2は、任意のアミノ酸であり、
f3は、LまたはFであり、
f4は、E、Q、またはDである、当該配列を含み、
7〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
(3)ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列Lg 1 g 2 LLg3g4 L(配列番号456)であって、式中
g1は、Q、D、またはEであり、
g2は、S、Q、D、またはEであり、
g3は、任意のアミノ酸であり、
g4は、L、W、F、またはYである、当該配列を含み、8〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
g1は、Q、D、またはEであり、
g2は、S、Q、D、またはEであり、
g3は、任意のアミノ酸であり、
g4は、L、W、F、またはYである、当該配列を含み、8〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
(4)ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列h1h2h3h4h5h6h7h8h9(配列番号457)であって、式中
h1は、RまたはDであり、
h2は、任意のアミノ酸であり、
h3は、A、T S、またはQであり、
h4は、LまたはMであり、
h5は、LまたはSであり、
h6は、任意のアミノ酸であり、
h7は、FまたはEであり、
h8は、W、F、またはCであり、
h9は、L、F、M、またはKである、当該配列を含み、9〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
[0093]
他のミオスタチン結合ペプチドは、一般化された構造:
(X1)a−F1−(X2)b、またはその多量体を有し、
式中、F1は、ビヒクルであり、X1及びX2は、各々独立して、
−(L1)c−P1、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3、
及び−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3−(L4)f−P4から選択され、
式中、P1、P2、P3、及びP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、L1、L2、L3、及びL4は、各々リンカーであり、a、b、c、d、e、及びfは、各々独立して、0または1であるが、但し、a及びbのうちの少なくとも1つは1である。
[0094]
他のミオスタチン結合ペプチドは、この一般化された構造を有し、提供されるペプチドから選択され得るペプチドP1、P2、P3、及びP4は、配列番号633、配列番号352、配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号455、配列番号456、または配列番号457の配列のうちのいずれかを含む1つ以上のペプチドから選択され得る。別の実施形態において、P P1、P2、P3、及びP4は、独立して、配列番号305〜351及び配列番号357〜454の配列のうちのいずれかを含む1つ以上のペプチドから選択される。
[0095]
さらなる実施形態において、上の一般式を有する結合剤のビヒクルは、Fcドメインである。ペプチドは、したがって、直接的または間接的のいずれかでFcドメインに融合し、それによってペプチボディを提供する。本発明のペプチボディは、ミオスタチンに高い結合親和性を示し、本明細書に提供されるインビトロアッセイ及び動物におけるインビボ試験によって示されるように、ミオスタチンの活性を阻害可能である。
h1は、RまたはDであり、
h2は、任意のアミノ酸であり、
h3は、A、T S、またはQであり、
h4は、LまたはMであり、
h5は、LまたはSであり、
h6は、任意のアミノ酸であり、
h7は、FまたはEであり、
h8は、W、F、またはCであり、
h9は、L、F、M、またはKである、当該配列を含み、9〜50アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
[0093]
他のミオスタチン結合ペプチドは、一般化された構造:
(X1)a−F1−(X2)b、またはその多量体を有し、
式中、F1は、ビヒクルであり、X1及びX2は、各々独立して、
−(L1)c−P1、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2、
−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3、
及び−(L1)c−P1−(L2)d−P2−(L3)e−P3−(L4)f−P4から選択され、
式中、P1、P2、P3、及びP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、L1、L2、L3、及びL4は、各々リンカーであり、a、b、c、d、e、及びfは、各々独立して、0または1であるが、但し、a及びbのうちの少なくとも1つは1である。
[0094]
他のミオスタチン結合ペプチドは、この一般化された構造を有し、提供されるペプチドから選択され得るペプチドP1、P2、P3、及びP4は、配列番号633、配列番号352、配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号455、配列番号456、または配列番号457の配列のうちのいずれかを含む1つ以上のペプチドから選択され得る。別の実施形態において、P P1、P2、P3、及びP4は、独立して、配列番号305〜351及び配列番号357〜454の配列のうちのいずれかを含む1つ以上のペプチドから選択される。
[0095]
さらなる実施形態において、上の一般式を有する結合剤のビヒクルは、Fcドメインである。ペプチドは、したがって、直接的または間接的のいずれかでFcドメインに融合し、それによってペプチボディを提供する。本発明のペプチボディは、ミオスタチンに高い結合親和性を示し、本明細書に提供されるインビトロアッセイ及び動物におけるインビボ試験によって示されるように、ミオスタチンの活性を阻害可能である。
ペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体
[0096]
ミオスタチン作動薬、例えば、本明細書に記載される結合剤はまた、本明細書に記載されるペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体も包含する。本発明のペプチド及びペプチボディの両方が、アミノ酸配列に関して記載されることも可能であるため、「変異体」及び「誘導体」という用語は、ペプチドのみ、またはペプチボディの構成要素としてのペプチドに適用して述べることも可能である。本明細書で使用される「ペプチド変異体」という用語は、元来のアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸残基が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、ミオスタチンに結合し、その活性を修飾する能力を保持するペプチドまたはペプチボディを指す。本明細書で使用されるペプチドまたはペプチボディの断片は、「変異体」の定義内に含まれる。
[0097]
例えば、本方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、配列番号635に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディを含むことができる。
[0098]
いかなる所定のペプチドまたはペプチボディが1つまたは2つまたは3つすべての種類の変異体を含有してもよいことが理解される。挿入変異体及び置換変異体は、天然アミノ酸、ならびに非天然存在アミノ酸、または両方を含有してもよい。
[0099]
ペプチド及びペプチボディ変異体はまた、リーダー配列またはシグナル配列が除去された、成熟ペプチド及びペプチボディを含み、得られたタンパク質は、アミノ酸が天然であっても、非天然であってもよい、さらなるアミノ末端残基を有する。アミノ酸1位に追加メチオニル残基を有するペプチボディ(Met−1−ペプチボディ)が企図され、2位及び1位に追加メチオニル残基及びリシン残基を有するペプチボディ(Met−2−Lys−1−)も企図される。追加のMet、Met−Lys、Lys残基(または、通常1つ以上の塩基性残基)を有する変異体は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生を高めるために特に有用である。
[0100]
本発明のペプチドまたはペプチボディ変異体はまた、特定発現系を使用して生ずる追加アミノ酸残基を有するペプチドも含む。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合産物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用は、所望のポリペプチドからGST成分を切断後、アミノ酸1位に追加グリシン残基を有する所望のポリペプチドを提供する。ヒスチジンタグを、通常配列のカルボキシ及び/またはアミノ末端でアミノ酸配列に組み込んだものを含む他のベクター系での発現により生ずる変異体も企図される。
[0101]
一例において、天然存在または非天然存在アミノ酸のいずれかの1つ以上のアミノ酸残基がペプチドアミノ酸配列に付加される、挿入変異体が提供される。挿入は、タンパク質の片方または両方の末端に位置してもよいし、あるいはペプチボディアミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。片方または両方の末端に追加残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、及びアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれ得る。挿入変異体には、1つ以上のアミノ酸残基がペプチドアミノ酸配列に付加されているペプチドまたはその断片が含まれる。
[0102]
挿入変異体はまた、ペプチドまたはペプチボディのアミノ及びまたはカルボキシ末端が別のポリペプチド、その断片、または特定のタンパク質配列の一部として通常認識されないアミノ酸に融合している、融合タンパク質も含む。そのような融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域等の長い循環半減期を有するタンパク質、マーカータンパク質、所望のペプチドまたはペプチボディの精製を容易にするタンパク質またはポリペプチド、及び多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列(二量体形成/安定性に有用なロイシンジッパーモチーフ等)である。
[0103]
この種の挿入変異体は、一般的に、N末端またはC末端で連結された天然分子の全部または実質的部分を有する。例えば、融合タンパク質は、典型的には、他の種由来のリーダー配列を使用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え体発現を可能にする。別の有用な融合タンパク質には、融合タンパク質の精製を容易にする免疫学的活性ドメイン、例えば抗体エピトープの付加が含まれる。融合接合部またはその近傍に切断部位を含むと、精製後の外来ポリペプチドの除去が容易になるであろう。他の有用な融合には、酵素由来の活性部位等の機能ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞性標的シグナル、または膜貫通領域の連結が含まれる。
[0104]
本発明で使用され得る、多様な市販の融合タンパク質発現系がある。特に有用な系には、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)系(Pharmacia)、マルトース結合タンパク質系(NEB、Beverley,MA)、FLAG系(IBI、New Haven,CT)、及び6×His系(Qiagen、Chatsworth,CA)が含まれるが、これらに限定されない。これらの系は、少数の追加アミノ酸しか持たない組換えペプチド及び/またはペプチボディを産生することが可能であり、ペプチドまたはペプチボディの活性に有意に影響を及ぼす可能性が低い。例えば、FLAG系及び6×His系は両方とも、抗原性に乏しいことが知られており、ポリペプチドの天然配座へのフォールディングに悪影響を及ぼさない短い配列のみを付加する。有用であることが企図される別のN末端融合は、タンパク質またはペプチドのN末端領域でのMet−Lysジペプチドの融合である。そのような融合により、タンパク質発現または活性の有益な増加を生じ得る。
[0105]
他の融合系は、ポリペプチドハイブリッドを生じ、そこでは所望のペプチドまたはペプチボディから融合パートナーを切除することが望ましい。一実施形態において、融合パートナーは、プロテアーゼの特異的認識配列を含有するペプチド配列によって、組換えペプチボディに連結される。適切な配列の例は、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ(Life Technologies,Gaithersburg,MD)または因子Xa(New England Biolabs,Beverley,MA)によって認識されるものである。
[0106]
本発明はまた、一部切除組織因子(tTF)と組み合わせて、本発明のペプチドまたはペプチボディのすべてまたは部分を含む融合ポリペプチドも提供する。tTFは、米国特許第5,877,289号、同第6,004,555号、同第6,132,729号、同第6,132,730号、同第6,156,321号、及び欧州特許第EP0988056号に記載されるように、腫瘍血管凝固剤として作用する、ヒト凝血誘導タンパク質の一部切除型からなる血管標的剤である。tTFを抗ミオスタチンペプチボディまたはペプチド、あるいはその断片に融合させると、標的細胞、例えば骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、前脂肪細胞、及び場合によって脂肪細胞への抗ミオスタチン拮抗薬の送達が促進される。
[0107]
別の態様において、本発明は、ペプチドまたはペプチボディ中の1つ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、ペプチボディの片方または両方の末端で、あるいはペプチボディアミノ酸配列内の1つ以上の残基の除去により生じ得る。欠失変異体には、必ず、ペプチドまたはペプチボディのすべての断片が含まれる。
[0108]
さらに別の態様において、本発明は、本発明のペプチド及びペプチボディの置換変異体を提供する。置換変異体には、1つ以上のアミノ酸残基が除去され、1つ以上の別のアミノ酸と置き換えられているペプチド及びペプチボディが含まれ、これらのアミノ酸は、天然存在であっても、非天然存在であってもよい。置換変異体は、2つの分子が、特定の割合で同一のアミノ酸を有する点で、元来のペプチドまたはペプチボディに「類似」であるペプチドまたはペプチボディを生成する。置換変異体は、ペプチドまたはペプチボディ内の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、及び20アミノ酸の置換を含み、置換の数は、ペプチドまたはペプチボディのアミノ酸の10パーセントまでであることも可能である。1つの態様において、置換の性質は保存的であるが、本発明は、非保存的置換もまた含み、非従来アミノ酸もまた含む。
[0109]
関連ペプチド及びペプチボディの同一性及び類似性は、既知の方法によって容易に計算可能である。そのような方法には、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York(1988)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)、Computer Analysis of Sequence Data,Part1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994)、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press(1987)、Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York(1991)、及びCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に記載されるものが含まれる。
[0110]
2つのペプチドもしくはポリペプチドの関連性または同一性パーセント、またはポリペプチド及びペプチドの関連性または同一性パーセントを決定する好ましい方法を設計して、試験する配列間の最大のマッチを得る。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記述されている。2つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、GAP(Devereux et al.,Nucl.Acid.Res.,12:387(1984)、Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI,BLASTP,BLASTN,and FASTA(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403−410(1990))を含む、GCGプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されない。BLASTXプログラムは、米国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他のソース(BLAST Manual,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,MD20894、Altschul et al.,上記(1990))から公的に利用可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
[0111]
2つのアミノ酸配列をアライメントするためのある特定のアライメントスキームは、2つの配列の短い領域のみのマッチングを生じることも可能であり、2つの全長配列間に有意な関係がない場合であっても、この小さいアライメント領域が非常に高い配列同一性を有する可能性もある。したがって、ある特定の実施形態において、選択されるアライメント法は、比較している標的ポリペプチドの全長の少なくとも10パーセント、すなわち少なくとも400アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも40の隣接アミノ酸、少なくとも300〜約400アミノ酸の配列を比較している場合は、30の隣接アミノ酸、200〜約300アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも20の隣接アミノ酸、そして約100〜200アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも10の隣接アミノ酸にわたるアライメントを生じるであろう。例えば、コンピュータアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)を用いて、配列同一性パーセントを決定しようとする2つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の最適マッチング(アルゴリズムによって決定されるような「マッチング化スパン」)のためにアライメントする。ある特定の実施態様において、ギャップ開始ペナルティ(通常、3×平均対角要素(diagonal)として計算される;「平均対角要素」とは、使用される比較マトリックスの対角要素の平均値である;「対角要素」とは、特定の比較マトリックスにより完全アミノ酸マッチにそれぞれ割り当てられるスコアまたは数値である)、ギャップ伸長ペナルティ(通常、ギャップ開始ペナルティの1/10倍)が、例えば、PAM250またはBLOSUM62等の比較マトリックスとともに、アルゴリズムと併せて使用される。ある特定の実施形態において、標準比較マトリックス(PAM250比較マトリックスに関して、Dayhoff et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,5(3)(1978)、BLOSUM62比較マトリックスに関して、Henikoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:10915−10919(1992)を参照のこと)もまた、アルゴリズムにより使用される。
[0112]
ある特定の実施形態において、例えば、ポリペプチド配列の比較のためのパラメータは、アルゴリズム:Needleman et al.,J.Mol.Biol.,48:443−453(1970)、比較マトリックス:Henikoff et al.,上記(1992)からのBLOSUM62;ギャップペナルティ:12、ギャップ長ペナルティ:4、類似性の閾値:0、エンドギャップに対してはペナルティなし、を用いて作成され得る。
[0113]
ある特定の実施形態において、(アミノ酸配列ではなく)ポリヌクレオチド分子配列比較のパラメータは、アルゴリズム:Needleman et al.,上記(1970);比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0;ギャップペナルティ:50:ギャップ長ペナルティ:3、を用いて作成され得る。
[0114]
Program Manual,Wisconsin Package,Version9,September,1997に記載されるものを含む、他の典型的なアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較マトリックス、類似性の閾値等が、使用され得る。行うべき特定の選択は、当業者には明らかであり、DNA−対−DNA、タンパク質−対−タンパク質、タンパク質−対−DNA等の、行おうとする特定の比較に応じて、さらに、比較が所定の配列対間である(この場合、一般的にはGAPまたはBestFitが好ましい)か、または1つの配列及び大きな配列データベース間である(この場合、FASTAまたはBLASTAが好ましい)かに応じるであろう。
[0115]
20個の従来(天然存在)アミノ酸の立体異性体(例えば、D−アミノ酸)、α−,α−二置換アミノ酸等の非天然存在アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来アミノ酸もまた、本発明のペプチドに適した構成要素であり得る。非天然存在アミノ酸の例には、例えば、アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、N−エチルグリシン、N−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、N−メチルグリシン、サルコシン、N−メチルイソロイシン、N−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン(orithine)、4−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−N,N,N−トリメチルリジン、ε−N−アセチルリジン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリン、N−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリジン、σ−N−メチルアルギニン、及び他の類似のアミノ酸、及びアミノ酸(例えば、4−ヒドロキシプロリン)が含まれる。
[0116]
天然存在残基は、共通の側鎖特性に基づいて、(重複する)種類に分けることも可能である:
1)中性疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Met、Phe;
2)中性極性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Gly;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:His、Lys、Arg;
5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;及び
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
[0117]
アミノ酸の置換は、保存的であることが可能であり、そのような置換は、元来のペプチドと類似の機能的特性及び化学的特性を有するペプチドを生じる。保存的アミノ酸置換は、上記の種類の1つのメンバーと、同じ種類の別のメンバーを交換することを伴う。保存的変化は、非従来アミノ酸残基を含むことも可能であり、これは、典型的には、生物学的系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって取り込まれる。これらには、ペプチド模倣体、及びアミノ酸部分の他の逆転(reversed)型または反転(inverted)型が含まれる。
[0118]
非保存的置換は、これらの種類の1つのメンバーと別の種類のメンバーとの交換を伴い得る。これらの変化は、ペプチドの機能的特性及び/または化学的特性に著しい変更を生じ得る。そのような変化を加える場合、ある特定の態様に従うと、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);スレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸塩(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸塩(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);及びアルギニン(−4.5)である。
[0119]
タンパク質に対して相互作用の生物学的機能を付与する際のアミノ酸ヒドロパシー指数の重要性は当該技術分野で理解されている。Kyte et al.,J.Mol.Biol.,157:105−131(1982)。ある特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され、なお類似の生物学的活性を保持し得ることは公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を加える場合、ある特定の実施態様において、ヒドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある特定の実施形態において、±1以内であるものが含まれ、ある特定の実施態様において、±0.5以内であるものが含まれる。
[0120]
また、類似アミノ酸の置換は、親水性に基づいて、特にそれによって生成される生物学的に機能性のあるペプチボディまたはペプチドが本発明のように、免疫学的実施態様における使用を目的とする場合には効果的になされ得ることも当該技術分野で理解されている。ある特定の実施形態において、隣接するアミノ酸の親水性により決定されるタンパク質の最高局所的平均親水性(local average hydrophilicity)は、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に相関している。
[0121]
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸塩(+3.0±1);グルタミン酸塩(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);及びトリプトファン(−3.4)。類似の親水性値に基づいて変化を加える場合、ある特定の実施態様において、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある特定の実施形態において、±1以内であるものが含まれ、ある特定の態様において、±0.5以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定してもよい。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
[0122]
典型的なアミノ酸を以下の表Aに示す。
[0096]
ミオスタチン作動薬、例えば、本明細書に記載される結合剤はまた、本明細書に記載されるペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体も包含する。本発明のペプチド及びペプチボディの両方が、アミノ酸配列に関して記載されることも可能であるため、「変異体」及び「誘導体」という用語は、ペプチドのみ、またはペプチボディの構成要素としてのペプチドに適用して述べることも可能である。本明細書で使用される「ペプチド変異体」という用語は、元来のアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸残基が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、ミオスタチンに結合し、その活性を修飾する能力を保持するペプチドまたはペプチボディを指す。本明細書で使用されるペプチドまたはペプチボディの断片は、「変異体」の定義内に含まれる。
[0097]
例えば、本方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、配列番号635に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディを含むことができる。
[0098]
いかなる所定のペプチドまたはペプチボディが1つまたは2つまたは3つすべての種類の変異体を含有してもよいことが理解される。挿入変異体及び置換変異体は、天然アミノ酸、ならびに非天然存在アミノ酸、または両方を含有してもよい。
[0099]
ペプチド及びペプチボディ変異体はまた、リーダー配列またはシグナル配列が除去された、成熟ペプチド及びペプチボディを含み、得られたタンパク質は、アミノ酸が天然であっても、非天然であってもよい、さらなるアミノ末端残基を有する。アミノ酸1位に追加メチオニル残基を有するペプチボディ(Met−1−ペプチボディ)が企図され、2位及び1位に追加メチオニル残基及びリシン残基を有するペプチボディ(Met−2−Lys−1−)も企図される。追加のMet、Met−Lys、Lys残基(または、通常1つ以上の塩基性残基)を有する変異体は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生を高めるために特に有用である。
[0100]
本発明のペプチドまたはペプチボディ変異体はまた、特定発現系を使用して生ずる追加アミノ酸残基を有するペプチドも含む。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合産物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用は、所望のポリペプチドからGST成分を切断後、アミノ酸1位に追加グリシン残基を有する所望のポリペプチドを提供する。ヒスチジンタグを、通常配列のカルボキシ及び/またはアミノ末端でアミノ酸配列に組み込んだものを含む他のベクター系での発現により生ずる変異体も企図される。
[0101]
一例において、天然存在または非天然存在アミノ酸のいずれかの1つ以上のアミノ酸残基がペプチドアミノ酸配列に付加される、挿入変異体が提供される。挿入は、タンパク質の片方または両方の末端に位置してもよいし、あるいはペプチボディアミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。片方または両方の末端に追加残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、及びアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれ得る。挿入変異体には、1つ以上のアミノ酸残基がペプチドアミノ酸配列に付加されているペプチドまたはその断片が含まれる。
[0102]
挿入変異体はまた、ペプチドまたはペプチボディのアミノ及びまたはカルボキシ末端が別のポリペプチド、その断片、または特定のタンパク質配列の一部として通常認識されないアミノ酸に融合している、融合タンパク質も含む。そのような融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域等の長い循環半減期を有するタンパク質、マーカータンパク質、所望のペプチドまたはペプチボディの精製を容易にするタンパク質またはポリペプチド、及び多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列(二量体形成/安定性に有用なロイシンジッパーモチーフ等)である。
[0103]
この種の挿入変異体は、一般的に、N末端またはC末端で連結された天然分子の全部または実質的部分を有する。例えば、融合タンパク質は、典型的には、他の種由来のリーダー配列を使用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え体発現を可能にする。別の有用な融合タンパク質には、融合タンパク質の精製を容易にする免疫学的活性ドメイン、例えば抗体エピトープの付加が含まれる。融合接合部またはその近傍に切断部位を含むと、精製後の外来ポリペプチドの除去が容易になるであろう。他の有用な融合には、酵素由来の活性部位等の機能ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞性標的シグナル、または膜貫通領域の連結が含まれる。
[0104]
本発明で使用され得る、多様な市販の融合タンパク質発現系がある。特に有用な系には、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)系(Pharmacia)、マルトース結合タンパク質系(NEB、Beverley,MA)、FLAG系(IBI、New Haven,CT)、及び6×His系(Qiagen、Chatsworth,CA)が含まれるが、これらに限定されない。これらの系は、少数の追加アミノ酸しか持たない組換えペプチド及び/またはペプチボディを産生することが可能であり、ペプチドまたはペプチボディの活性に有意に影響を及ぼす可能性が低い。例えば、FLAG系及び6×His系は両方とも、抗原性に乏しいことが知られており、ポリペプチドの天然配座へのフォールディングに悪影響を及ぼさない短い配列のみを付加する。有用であることが企図される別のN末端融合は、タンパク質またはペプチドのN末端領域でのMet−Lysジペプチドの融合である。そのような融合により、タンパク質発現または活性の有益な増加を生じ得る。
[0105]
他の融合系は、ポリペプチドハイブリッドを生じ、そこでは所望のペプチドまたはペプチボディから融合パートナーを切除することが望ましい。一実施形態において、融合パートナーは、プロテアーゼの特異的認識配列を含有するペプチド配列によって、組換えペプチボディに連結される。適切な配列の例は、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ(Life Technologies,Gaithersburg,MD)または因子Xa(New England Biolabs,Beverley,MA)によって認識されるものである。
[0106]
本発明はまた、一部切除組織因子(tTF)と組み合わせて、本発明のペプチドまたはペプチボディのすべてまたは部分を含む融合ポリペプチドも提供する。tTFは、米国特許第5,877,289号、同第6,004,555号、同第6,132,729号、同第6,132,730号、同第6,156,321号、及び欧州特許第EP0988056号に記載されるように、腫瘍血管凝固剤として作用する、ヒト凝血誘導タンパク質の一部切除型からなる血管標的剤である。tTFを抗ミオスタチンペプチボディまたはペプチド、あるいはその断片に融合させると、標的細胞、例えば骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、前脂肪細胞、及び場合によって脂肪細胞への抗ミオスタチン拮抗薬の送達が促進される。
[0107]
別の態様において、本発明は、ペプチドまたはペプチボディ中の1つ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、ペプチボディの片方または両方の末端で、あるいはペプチボディアミノ酸配列内の1つ以上の残基の除去により生じ得る。欠失変異体には、必ず、ペプチドまたはペプチボディのすべての断片が含まれる。
[0108]
さらに別の態様において、本発明は、本発明のペプチド及びペプチボディの置換変異体を提供する。置換変異体には、1つ以上のアミノ酸残基が除去され、1つ以上の別のアミノ酸と置き換えられているペプチド及びペプチボディが含まれ、これらのアミノ酸は、天然存在であっても、非天然存在であってもよい。置換変異体は、2つの分子が、特定の割合で同一のアミノ酸を有する点で、元来のペプチドまたはペプチボディに「類似」であるペプチドまたはペプチボディを生成する。置換変異体は、ペプチドまたはペプチボディ内の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、及び20アミノ酸の置換を含み、置換の数は、ペプチドまたはペプチボディのアミノ酸の10パーセントまでであることも可能である。1つの態様において、置換の性質は保存的であるが、本発明は、非保存的置換もまた含み、非従来アミノ酸もまた含む。
[0109]
関連ペプチド及びペプチボディの同一性及び類似性は、既知の方法によって容易に計算可能である。そのような方法には、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York(1988)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)、Computer Analysis of Sequence Data,Part1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994)、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press(1987)、Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York(1991)、及びCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に記載されるものが含まれる。
[0110]
2つのペプチドもしくはポリペプチドの関連性または同一性パーセント、またはポリペプチド及びペプチドの関連性または同一性パーセントを決定する好ましい方法を設計して、試験する配列間の最大のマッチを得る。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記述されている。2つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、GAP(Devereux et al.,Nucl.Acid.Res.,12:387(1984)、Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI,BLASTP,BLASTN,and FASTA(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403−410(1990))を含む、GCGプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されない。BLASTXプログラムは、米国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他のソース(BLAST Manual,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,MD20894、Altschul et al.,上記(1990))から公的に利用可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
[0111]
2つのアミノ酸配列をアライメントするためのある特定のアライメントスキームは、2つの配列の短い領域のみのマッチングを生じることも可能であり、2つの全長配列間に有意な関係がない場合であっても、この小さいアライメント領域が非常に高い配列同一性を有する可能性もある。したがって、ある特定の実施形態において、選択されるアライメント法は、比較している標的ポリペプチドの全長の少なくとも10パーセント、すなわち少なくとも400アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも40の隣接アミノ酸、少なくとも300〜約400アミノ酸の配列を比較している場合は、30の隣接アミノ酸、200〜約300アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも20の隣接アミノ酸、そして約100〜200アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも10の隣接アミノ酸にわたるアライメントを生じるであろう。例えば、コンピュータアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)を用いて、配列同一性パーセントを決定しようとする2つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の最適マッチング(アルゴリズムによって決定されるような「マッチング化スパン」)のためにアライメントする。ある特定の実施態様において、ギャップ開始ペナルティ(通常、3×平均対角要素(diagonal)として計算される;「平均対角要素」とは、使用される比較マトリックスの対角要素の平均値である;「対角要素」とは、特定の比較マトリックスにより完全アミノ酸マッチにそれぞれ割り当てられるスコアまたは数値である)、ギャップ伸長ペナルティ(通常、ギャップ開始ペナルティの1/10倍)が、例えば、PAM250またはBLOSUM62等の比較マトリックスとともに、アルゴリズムと併せて使用される。ある特定の実施形態において、標準比較マトリックス(PAM250比較マトリックスに関して、Dayhoff et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,5(3)(1978)、BLOSUM62比較マトリックスに関して、Henikoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:10915−10919(1992)を参照のこと)もまた、アルゴリズムにより使用される。
[0112]
ある特定の実施形態において、例えば、ポリペプチド配列の比較のためのパラメータは、アルゴリズム:Needleman et al.,J.Mol.Biol.,48:443−453(1970)、比較マトリックス:Henikoff et al.,上記(1992)からのBLOSUM62;ギャップペナルティ:12、ギャップ長ペナルティ:4、類似性の閾値:0、エンドギャップに対してはペナルティなし、を用いて作成され得る。
[0113]
ある特定の実施形態において、(アミノ酸配列ではなく)ポリヌクレオチド分子配列比較のパラメータは、アルゴリズム:Needleman et al.,上記(1970);比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0;ギャップペナルティ:50:ギャップ長ペナルティ:3、を用いて作成され得る。
[0114]
Program Manual,Wisconsin Package,Version9,September,1997に記載されるものを含む、他の典型的なアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較マトリックス、類似性の閾値等が、使用され得る。行うべき特定の選択は、当業者には明らかであり、DNA−対−DNA、タンパク質−対−タンパク質、タンパク質−対−DNA等の、行おうとする特定の比較に応じて、さらに、比較が所定の配列対間である(この場合、一般的にはGAPまたはBestFitが好ましい)か、または1つの配列及び大きな配列データベース間である(この場合、FASTAまたはBLASTAが好ましい)かに応じるであろう。
[0115]
20個の従来(天然存在)アミノ酸の立体異性体(例えば、D−アミノ酸)、α−,α−二置換アミノ酸等の非天然存在アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来アミノ酸もまた、本発明のペプチドに適した構成要素であり得る。非天然存在アミノ酸の例には、例えば、アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、N−エチルグリシン、N−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、N−メチルグリシン、サルコシン、N−メチルイソロイシン、N−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン(orithine)、4−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−N,N,N−トリメチルリジン、ε−N−アセチルリジン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリン、N−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリジン、σ−N−メチルアルギニン、及び他の類似のアミノ酸、及びアミノ酸(例えば、4−ヒドロキシプロリン)が含まれる。
[0116]
天然存在残基は、共通の側鎖特性に基づいて、(重複する)種類に分けることも可能である:
1)中性疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Met、Phe;
2)中性極性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Gly;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:His、Lys、Arg;
5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;及び
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
[0117]
アミノ酸の置換は、保存的であることが可能であり、そのような置換は、元来のペプチドと類似の機能的特性及び化学的特性を有するペプチドを生じる。保存的アミノ酸置換は、上記の種類の1つのメンバーと、同じ種類の別のメンバーを交換することを伴う。保存的変化は、非従来アミノ酸残基を含むことも可能であり、これは、典型的には、生物学的系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって取り込まれる。これらには、ペプチド模倣体、及びアミノ酸部分の他の逆転(reversed)型または反転(inverted)型が含まれる。
[0118]
非保存的置換は、これらの種類の1つのメンバーと別の種類のメンバーとの交換を伴い得る。これらの変化は、ペプチドの機能的特性及び/または化学的特性に著しい変更を生じ得る。そのような変化を加える場合、ある特定の態様に従うと、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);スレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸塩(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸塩(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);及びアルギニン(−4.5)である。
[0119]
タンパク質に対して相互作用の生物学的機能を付与する際のアミノ酸ヒドロパシー指数の重要性は当該技術分野で理解されている。Kyte et al.,J.Mol.Biol.,157:105−131(1982)。ある特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され、なお類似の生物学的活性を保持し得ることは公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を加える場合、ある特定の実施態様において、ヒドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある特定の実施形態において、±1以内であるものが含まれ、ある特定の実施態様において、±0.5以内であるものが含まれる。
[0120]
また、類似アミノ酸の置換は、親水性に基づいて、特にそれによって生成される生物学的に機能性のあるペプチボディまたはペプチドが本発明のように、免疫学的実施態様における使用を目的とする場合には効果的になされ得ることも当該技術分野で理解されている。ある特定の実施形態において、隣接するアミノ酸の親水性により決定されるタンパク質の最高局所的平均親水性(local average hydrophilicity)は、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に相関している。
[0121]
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸塩(+3.0±1);グルタミン酸塩(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);及びトリプトファン(−3.4)。類似の親水性値に基づいて変化を加える場合、ある特定の実施態様において、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある特定の実施形態において、±1以内であるものが含まれ、ある特定の態様において、±0.5以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定してもよい。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
[0122]
典型的なアミノ酸を以下の表Aに示す。
[0123]
当業者は、例えば、ランダム置換によって本発明のペプチド及びペプチボディの変異体を産生し、本明細書に記載されるアッセイを用いて、結合活性に関して、得られたペプチドまたはペプチボディを試験することも可能であろう。
[0124]
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である残基を類似のポリペプチド中で特定するために、構造−機能研究または三次元構造分析を検討することができる。そのような比較を考慮して、類似のタンパク質において、活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのようにして予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択してもよい。次いで、本明細書に記載される活性アッセイを用いて、変異体をスクリーニングすることができる。
[0125]
多数の科学的刊行物が二次構造の予測に当てられている。Moult J.,Curr.Op.in Biotech.,7(4):422−427(1996)、Chou et al.,Biochemistry,13(2):222−245(1974)、Chou et al.,Biochemistry,113(2):211−222(1974)、Chou et al.,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,47:45−148(1978)、Chou et al.,Ann.Rev.Biochem.,47:251−276、及びChou et al.,Biophys.J.,26:367−384(1979)を参照のこと。さらに、二次構造を予測するのを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する1つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、30%を超える配列同一性、または40%を超える類似性を有する、2つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。タンパク質の構造内の可能性のある折り畳みの数を含む、二次構造の予測可能性が向上したタンパク質構造データベース(PDB)が最近開発された。Holm et al.,Nucl.Acid.Res.,27(1):244−247(1999)を参照のこと。所与のタンパク質における折り畳みの数は限られており、決定的な数の構造が解明されたら、構造予測は劇的により正確になるであろうと示唆されている(Brenner et al.,Curr.Op.Struct.Biol.,7(3):369−376(1997))。
[0126]
二次構造を予測するさらなる方法には、「縫合」(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377−87(1997)、Sippl et al.,Structure,4(1):15−19(1996))、「プロファイル分析」(Bowie et al.,Science,253:164−170(1991)、Gribskov et al.,Meth.Enzym.,183:146−159(1990)、Gribskov et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,84(13):4355−4358(1987))、及び「進化的連結」(Holm,上記(1999)及びBrenner,上記(1997)を参照のこと)が含まれる。
[0127]
ある特定の実施形態において、ペプチドまたはペプチボディ変異体には、グリコシル化変異体が含まれ、変異体では、N結合型グリコシル化部位等の1つ以上のグリコシル化部位がペプチボディに付加されている。N結合型グリコシル化部位は、配列:Asn−X−SerまたはAsn−X−Thrによって特徴付けられ、ここで、Xで表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のあらゆるアミノ酸残基であり得る。この配列が生ずるようにアミノ酸残基の置換または付加により、N結合型炭水化物鎖を付加するための潜在的な新規の部位が提供される。あるいは、この配列を除去する置換は、存在するN結合型炭水化物鎖を除去するであろう。また、1つ以上のN結合型グリコシル化部位(典型的には天然存在のものである)を除去し、1つ以上の新規のN結合型部位を生成する、N結合型炭水化物鎖の再配置も提供される。
当業者は、例えば、ランダム置換によって本発明のペプチド及びペプチボディの変異体を産生し、本明細書に記載されるアッセイを用いて、結合活性に関して、得られたペプチドまたはペプチボディを試験することも可能であろう。
[0124]
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である残基を類似のポリペプチド中で特定するために、構造−機能研究または三次元構造分析を検討することができる。そのような比較を考慮して、類似のタンパク質において、活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのようにして予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択してもよい。次いで、本明細書に記載される活性アッセイを用いて、変異体をスクリーニングすることができる。
[0125]
多数の科学的刊行物が二次構造の予測に当てられている。Moult J.,Curr.Op.in Biotech.,7(4):422−427(1996)、Chou et al.,Biochemistry,13(2):222−245(1974)、Chou et al.,Biochemistry,113(2):211−222(1974)、Chou et al.,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,47:45−148(1978)、Chou et al.,Ann.Rev.Biochem.,47:251−276、及びChou et al.,Biophys.J.,26:367−384(1979)を参照のこと。さらに、二次構造を予測するのを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する1つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、30%を超える配列同一性、または40%を超える類似性を有する、2つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。タンパク質の構造内の可能性のある折り畳みの数を含む、二次構造の予測可能性が向上したタンパク質構造データベース(PDB)が最近開発された。Holm et al.,Nucl.Acid.Res.,27(1):244−247(1999)を参照のこと。所与のタンパク質における折り畳みの数は限られており、決定的な数の構造が解明されたら、構造予測は劇的により正確になるであろうと示唆されている(Brenner et al.,Curr.Op.Struct.Biol.,7(3):369−376(1997))。
[0126]
二次構造を予測するさらなる方法には、「縫合」(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377−87(1997)、Sippl et al.,Structure,4(1):15−19(1996))、「プロファイル分析」(Bowie et al.,Science,253:164−170(1991)、Gribskov et al.,Meth.Enzym.,183:146−159(1990)、Gribskov et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,84(13):4355−4358(1987))、及び「進化的連結」(Holm,上記(1999)及びBrenner,上記(1997)を参照のこと)が含まれる。
[0127]
ある特定の実施形態において、ペプチドまたはペプチボディ変異体には、グリコシル化変異体が含まれ、変異体では、N結合型グリコシル化部位等の1つ以上のグリコシル化部位がペプチボディに付加されている。N結合型グリコシル化部位は、配列:Asn−X−SerまたはAsn−X−Thrによって特徴付けられ、ここで、Xで表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のあらゆるアミノ酸残基であり得る。この配列が生ずるようにアミノ酸残基の置換または付加により、N結合型炭水化物鎖を付加するための潜在的な新規の部位が提供される。あるいは、この配列を除去する置換は、存在するN結合型炭水化物鎖を除去するであろう。また、1つ以上のN結合型グリコシル化部位(典型的には天然存在のものである)を除去し、1つ以上の新規のN結合型部位を生成する、N結合型炭水化物鎖の再配置も提供される。
誘導体
[0128]
本発明はまた、本発明のペプチドまたはペプチボディの「誘導体」も提供する。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、ミオスタチンへの結合能力を保持する、アミノ酸残基への挿入、欠失、または置換以外の、またはこれらに加えた修飾を指す。一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる化合物に複合される。
[0129]
好ましくは、誘導体を産生するために本発明のペプチドに行う修飾は、共有性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、及び無機部分との化学的結合が含まれる。本発明の誘導体は、ペプチボディの循環半減期を増加させるように調製され得るか、またはペプチボディが、所望の細胞、組織、または臓器を標的とする能力を改善するように設計され得る。
[0130]
本発明は、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号、及び同第4,179,337号に記載されるように、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコール等の1つ以上の水溶性ポリマー付着物を含むように共有結合的に修飾された誘導体結合剤をさらに含む。本技術分野で知られているさらに他の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ−(N−ビニルピロリドン)−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)及びポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物が含まれる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール(PEG)サブユニットで共有結合的に修飾されたペプチボディである。水溶性ポリマーを、特定位置、例えばペプチボディのアミノ末端で結合され得るか、またはポリペプチドの1つ以上の側鎖にランダムに付着され得る。結合剤、例えばペプチボディ、及び特にヒト化抗体の治療能力を改善するためのPEGの使用が、2000年10月17日に発行されたGonzalesらの米国特許第6,133,426号に記載されている。
[0131]
本発明はまた、ミオスタチン結合剤のペプチド及び/またはビヒクル部分を誘導体化することも企図する。そのような誘導体は、化合物の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改善し得る。部分は、別の方式で、化合物等のいかなる望ましくない副作用等も除去するかまたは減弱し得る。典型的な誘導体には、以下のような化合物が含まれる:
1.誘導体またはそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分を修飾して2つ以上のCys残基(例えば、リンカー中に)を含有させてもよく、これをジスルフィド結合形成によって環状化することが可能である。
[0128]
本発明はまた、本発明のペプチドまたはペプチボディの「誘導体」も提供する。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、ミオスタチンへの結合能力を保持する、アミノ酸残基への挿入、欠失、または置換以外の、またはこれらに加えた修飾を指す。一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる化合物に複合される。
[0129]
好ましくは、誘導体を産生するために本発明のペプチドに行う修飾は、共有性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、及び無機部分との化学的結合が含まれる。本発明の誘導体は、ペプチボディの循環半減期を増加させるように調製され得るか、またはペプチボディが、所望の細胞、組織、または臓器を標的とする能力を改善するように設計され得る。
[0130]
本発明は、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号、及び同第4,179,337号に記載されるように、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコール等の1つ以上の水溶性ポリマー付着物を含むように共有結合的に修飾された誘導体結合剤をさらに含む。本技術分野で知られているさらに他の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ−(N−ビニルピロリドン)−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)及びポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物が含まれる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール(PEG)サブユニットで共有結合的に修飾されたペプチボディである。水溶性ポリマーを、特定位置、例えばペプチボディのアミノ末端で結合され得るか、またはポリペプチドの1つ以上の側鎖にランダムに付着され得る。結合剤、例えばペプチボディ、及び特にヒト化抗体の治療能力を改善するためのPEGの使用が、2000年10月17日に発行されたGonzalesらの米国特許第6,133,426号に記載されている。
[0131]
本発明はまた、ミオスタチン結合剤のペプチド及び/またはビヒクル部分を誘導体化することも企図する。そのような誘導体は、化合物の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改善し得る。部分は、別の方式で、化合物等のいかなる望ましくない副作用等も除去するかまたは減弱し得る。典型的な誘導体には、以下のような化合物が含まれる:
1.誘導体またはそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分を修飾して2つ以上のCys残基(例えば、リンカー中に)を含有させてもよく、これをジスルフィド結合形成によって環状化することが可能である。
2.誘導体は、分子間で架橋されるかまたは分子間の架橋が可能であるようにされている。例えば、ペプチド部分を修飾して1つのCys残基を含有し、それによって、同様の分子との分子間ジスルフィド結合を形成可能にすることが可能である。誘導体を、C末端を通じて架橋することもまた可能である。
3.1つ以上のペプチジル[−C(O)NR−]連結(結合)が、非ペプチジル連結により置き換えられる。典型的な非ペプチジル連結は、−CH2−カルバメート[−CH2−OC(O)NR−]、ホスホン酸塩、−CH2−スルホンアミド[−CH2−S(O)2NR−]、尿素[−NHC(O)NH−]、−CH2−二次アミン、及びアルキル化ペプチド[−C(O)NR6−、式中、R6低級アルキルである]である。
4.N末端が誘導体化されている。典型的には、N末端は、アシル化されているかまたは置換アミンへと修飾され得る。典型的なN末端誘導体基には、−NRR1(−NH2以外)、−NRC(O)R1、−NRC(O)OR1、−NRS(O)2R1、−NHC(O)NHR1、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル−NH−(CBZ−NH−)が含まれ、式中、R及びR1は、各々独立して、水素または低級アルキルであり、フェニル環は、C1−C4アルキル、C1−C4アルコキシ、クロロ、及びブロモからなる群から選択される1〜3個の置換基で置換され得る。
5.遊離C末端が誘導体化されている。典型的には、C末端は、エステル化されているかまたはアミド化されている。例えば、当該技術分野で記載される方法を用いて、本発明の化合物のC末端に(NH−CH2−CH2−NH2)2を付加してもよい。同様に、当該技術分野で記載される方法を用いて、本発明の化合物のC末端に−NH2を付加する(または−NH2基で「キャッピング」する)ことも可能である。典型的なC末端誘導体基には、例えば、−C(O)R2が含まれ、式中、R2は、低級アルコキシである、または−NR3R4が含まれ、式中、R3及びR4は、各々独立して、水素またはC1〜C8アルキル(好ましくはC1〜C4アルキル)である。
6.ジスルフィド結合を、別の、好ましくはより安定な架橋部分(例えば、アルキレン)と置き換える。例えば、Bhatnagar et al.,J Med Chem39:3814−9(1996)、Alberts et al.,Thirteenth Am Pep Symp,357−9(1993)を参照のこと。
7.1つ以上の個々のアミノ酸残基が修飾されている。以下に詳細に記載されるように、多様な誘導体化剤が、選択した側鎖または末端残基と特異的に反応することが知られている。
[0132]
リジニル残基及びアミノ末端残基を、リジニル残基の電荷を逆転させるコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させてもよい。αアミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデート等のイミドエステル;ピリドキサールリン酸;ピリドキサール;クロロボロヒドリド;トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;2,4ペンタンジオン;及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
[0133]
フェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンを含む、いくつかの従来の試薬のうちのいずれか1つまたは組み合わせとの反応によって、アルギニル残基を修飾してもよい。アルギニル残基の誘導体化には、グアニジン官能基のpKaが高いため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジン基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
[0134]
チロシル残基の特異的修飾は、広く研究されてきており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基にスペクトル標識を導入することに関心が持たれている。最も一般的には、N−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、O−アセチルチロシル種及び3−ニトロ誘導体を形成する。
[0135]
カルボジイミド(R’−N=C=N−R’)、例えば1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応によって、カルボキシル側鎖基(アスパルチルまたはグルタミル)を選択的に修飾してもよい。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル及びグルタミル残基をアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換してもよい。
[0136]
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基を脱アミド化して、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基にしてもよい。あるいは、穏やかな酸性条件下で、これらの残基を脱アミド化する。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内に入る。
[0137]
システイニル残基をアミノ酸残基または他の部分と置き換えて、ジスルフィド結合を除去するか、または逆に架橋を安定化してもよい。例えば、Bhatnagar et al.,(上記)を参照のこと。
[0138]
二官能性剤での誘導体化は、ペプチドまたはその機能する誘導体を、水不溶性支持体マトリックスに、または他の巨大分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般的に用いられる架橋剤には、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−N−マレイミド−1,8−オクタン等の二官能性マレイミドが含まれる。メチル−3−[(p−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化可能な中間体を生じる。あるいは、米国特許第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号、及び第4,330,440号に記載される、臭化シアン活性化炭水化物等の反応性水不溶性マトリックス及び反応性基質が、タンパク質固定化に使用される。
[0139]
炭水化物(オリゴ糖)基を、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に、好適に結合させてもよい。一般的に、O結合型オリゴ糖は、セリン(Ser)残基またはスレオニン(Thr)残基に結合され、一方、N結合型オリゴ糖は、配列Asn−X−Ser/Thr(式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る)の一部であるとき、アスパラギン(Asn)残基に結合される。Xは、好ましくは、プロリン以外の19の天然存在アミノ酸の1つである。N結合型及びO結合型オリゴ糖の構造及び各種類に見られる糖残基は、異なる。両方に一般的に見られる糖の1種は、N−アセチルノイラミン酸(シアル酸と称される)である。シアル酸は、通常、N結合型及びO結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を与え得る。そのような部位(複数を含む)は、本発明の化合物のリンカー内に取り込まれてもよく、好ましくは、(例えば、CHO、BHK、COS等の哺乳動物細胞において)ポリペプチド化合物の組換え産生中に、細胞によってグリコシル化される。しかしながら、当該技術分野で知られている合成法または半合成法によって、そのような部位をさらにグリコシル化してもよい。
[0140]
他のあり得る修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Cys中の硫黄原子の酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が含まれる[例えば、Creighton,Proteins:Structure and Molecule Properties(W.H.Freeman&Co.,San Francisco),pp.79−86(1983)を参照のこと]。
[0141]
また、本発明の化合物をDNAレベルで変化させてもよい。化合物の任意の部分のDNA配列を、選択した宿主細胞とより適合するコドンに変化させてもよい。好ましい宿主細胞である大腸菌に関して、最適化コドンが当該技術分野で公知である。コドンを置換して、制限酵素部位を除去するか、またはサイレント制限酵素部位を含ませてもよく、これは選択した宿主細胞におけるDNAのプロセシングを補助し得る。ビヒクル、リンカー、及びペプチドDNA配列を修飾して、前述の配列変化のいずれかを含ませてもよい。
[0142]
構造の安定化または生体分解の減少を提供する非ペプチド類似体を含むさらなる誘導体もまた、企図される。非ペプチド部分によって1つ以上の残基を置き換えることによって、選択した阻害ペプチドに基づいて、ペプチド模倣類似体を調製することができる。好ましくは、非ペプチド部分は、ペプチドがその天然コンフォメーションを保持するか、またはミオスタチンを認識し、ミオスタチンに結合する能力を保持する、好ましい、例えば生物活性のコンフォメーションを安定化するのを可能にする。一態様において、得られた類似体/模倣体は、ミオスタチンに対する結合親和性の増加を示す。ペプチドから非ペプチド模倣類似体を調製する方法の一例が、Nachman et al.,Regul Pept57:359−370(1995)に記載される。望ましい場合、本発明のペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、またはリン酸化によって、あるいは本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特にC末端エステル、及びN−アシル誘導体の生成によって修飾され得る。ペプチボディはまた、ペプチド誘導体を生成するように他の部分との共有結合または非共有結合複合体を形成することによっても修飾され得る。共有結合複合体は、ペプチボディを含むアミノ酸の側鎖上、またはNもしくはC末端の官能基に化学物質部分を連結させることによって調製され得る。
[0143]
特に、放射標識、蛍光標識、酵素(例えば比色反応または蛍光分析反応を触媒する)、基質、固体マトリックス、または担体(例えばビオチンまたはアビジン)を含むが、これらに限定されない、レポーター基に、ペプチドを複合することが可能であることが予期される。したがって、本発明は、放射標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス、及び担体からなる群から選択されるレポーター基をさらに含むことが好ましいペプチボディ分子を含む分子を提供する。そのような標識は、当業者に周知であり、例えば、ビオチン標識が特に企図される。そのような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,996,345号、及び同第4,277,437号に記載される。有用であろう他の標識には、放射能標識、蛍光標識、及び化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。そのような標識の使用に関する米国特許には、例えば、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、及び同第3,996,345号が含まれる。本発明のペプチボディはいずれも、これらの標識のいずれかを1つ、2つ、またはそれより多く含んでもよい。
[0132]
リジニル残基及びアミノ末端残基を、リジニル残基の電荷を逆転させるコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させてもよい。αアミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデート等のイミドエステル;ピリドキサールリン酸;ピリドキサール;クロロボロヒドリド;トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;2,4ペンタンジオン;及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
[0133]
フェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンを含む、いくつかの従来の試薬のうちのいずれか1つまたは組み合わせとの反応によって、アルギニル残基を修飾してもよい。アルギニル残基の誘導体化には、グアニジン官能基のpKaが高いため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジン基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
[0134]
チロシル残基の特異的修飾は、広く研究されてきており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基にスペクトル標識を導入することに関心が持たれている。最も一般的には、N−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、O−アセチルチロシル種及び3−ニトロ誘導体を形成する。
[0135]
カルボジイミド(R’−N=C=N−R’)、例えば1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応によって、カルボキシル側鎖基(アスパルチルまたはグルタミル)を選択的に修飾してもよい。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル及びグルタミル残基をアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換してもよい。
[0136]
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基を脱アミド化して、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基にしてもよい。あるいは、穏やかな酸性条件下で、これらの残基を脱アミド化する。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内に入る。
[0137]
システイニル残基をアミノ酸残基または他の部分と置き換えて、ジスルフィド結合を除去するか、または逆に架橋を安定化してもよい。例えば、Bhatnagar et al.,(上記)を参照のこと。
[0138]
二官能性剤での誘導体化は、ペプチドまたはその機能する誘導体を、水不溶性支持体マトリックスに、または他の巨大分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般的に用いられる架橋剤には、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−N−マレイミド−1,8−オクタン等の二官能性マレイミドが含まれる。メチル−3−[(p−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化可能な中間体を生じる。あるいは、米国特許第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号、及び第4,330,440号に記載される、臭化シアン活性化炭水化物等の反応性水不溶性マトリックス及び反応性基質が、タンパク質固定化に使用される。
[0139]
炭水化物(オリゴ糖)基を、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に、好適に結合させてもよい。一般的に、O結合型オリゴ糖は、セリン(Ser)残基またはスレオニン(Thr)残基に結合され、一方、N結合型オリゴ糖は、配列Asn−X−Ser/Thr(式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る)の一部であるとき、アスパラギン(Asn)残基に結合される。Xは、好ましくは、プロリン以外の19の天然存在アミノ酸の1つである。N結合型及びO結合型オリゴ糖の構造及び各種類に見られる糖残基は、異なる。両方に一般的に見られる糖の1種は、N−アセチルノイラミン酸(シアル酸と称される)である。シアル酸は、通常、N結合型及びO結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を与え得る。そのような部位(複数を含む)は、本発明の化合物のリンカー内に取り込まれてもよく、好ましくは、(例えば、CHO、BHK、COS等の哺乳動物細胞において)ポリペプチド化合物の組換え産生中に、細胞によってグリコシル化される。しかしながら、当該技術分野で知られている合成法または半合成法によって、そのような部位をさらにグリコシル化してもよい。
[0140]
他のあり得る修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Cys中の硫黄原子の酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が含まれる[例えば、Creighton,Proteins:Structure and Molecule Properties(W.H.Freeman&Co.,San Francisco),pp.79−86(1983)を参照のこと]。
[0141]
また、本発明の化合物をDNAレベルで変化させてもよい。化合物の任意の部分のDNA配列を、選択した宿主細胞とより適合するコドンに変化させてもよい。好ましい宿主細胞である大腸菌に関して、最適化コドンが当該技術分野で公知である。コドンを置換して、制限酵素部位を除去するか、またはサイレント制限酵素部位を含ませてもよく、これは選択した宿主細胞におけるDNAのプロセシングを補助し得る。ビヒクル、リンカー、及びペプチドDNA配列を修飾して、前述の配列変化のいずれかを含ませてもよい。
[0142]
構造の安定化または生体分解の減少を提供する非ペプチド類似体を含むさらなる誘導体もまた、企図される。非ペプチド部分によって1つ以上の残基を置き換えることによって、選択した阻害ペプチドに基づいて、ペプチド模倣類似体を調製することができる。好ましくは、非ペプチド部分は、ペプチドがその天然コンフォメーションを保持するか、またはミオスタチンを認識し、ミオスタチンに結合する能力を保持する、好ましい、例えば生物活性のコンフォメーションを安定化するのを可能にする。一態様において、得られた類似体/模倣体は、ミオスタチンに対する結合親和性の増加を示す。ペプチドから非ペプチド模倣類似体を調製する方法の一例が、Nachman et al.,Regul Pept57:359−370(1995)に記載される。望ましい場合、本発明のペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、またはリン酸化によって、あるいは本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特にC末端エステル、及びN−アシル誘導体の生成によって修飾され得る。ペプチボディはまた、ペプチド誘導体を生成するように他の部分との共有結合または非共有結合複合体を形成することによっても修飾され得る。共有結合複合体は、ペプチボディを含むアミノ酸の側鎖上、またはNもしくはC末端の官能基に化学物質部分を連結させることによって調製され得る。
[0143]
特に、放射標識、蛍光標識、酵素(例えば比色反応または蛍光分析反応を触媒する)、基質、固体マトリックス、または担体(例えばビオチンまたはアビジン)を含むが、これらに限定されない、レポーター基に、ペプチドを複合することが可能であることが予期される。したがって、本発明は、放射標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス、及び担体からなる群から選択されるレポーター基をさらに含むことが好ましいペプチボディ分子を含む分子を提供する。そのような標識は、当業者に周知であり、例えば、ビオチン標識が特に企図される。そのような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,996,345号、及び同第4,277,437号に記載される。有用であろう他の標識には、放射能標識、蛍光標識、及び化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。そのような標識の使用に関する米国特許には、例えば、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、及び同第3,996,345号が含まれる。本発明のペプチボディはいずれも、これらの標識のいずれかを1つ、2つ、またはそれより多く含んでもよい。
ペプチド及びペプチボディを作製する方法
[0144]
本明細書に記載されるミオスタチン作動薬及びペプチドは、当該技術分野で公知の多様な技術を用いて生成され得る。一実施形態において、ミオスタチン作動薬は、以下の実施例17に記載される方法を用いて生成される。
[0145]
ペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。様々な自動化合成装置が商業的に入手可能であり、既知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、Stewart and Young(上記)、Tam et al.,J Am Chem Soc,105:6442(1983)、Merrifield,Science232:341−347(1986)、Barany and Merrifield,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York,1−284、Barany et al.,Int J Pep Protein Res,30:705−739(1987)、及び米国特許第5,424,398号を参照されたく、各々、参照により本明細書に組み込まれる。
[0146]
固相ペプチド合成法は、0.1〜1.0mMアミン/gのポリマーを含有するコポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)を用いる。ペプチド合成のこれらの方法は、アルファ−アミノ基のブチルオキシカルボニル(t−BOC)または9−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル(FMOC)保護を用いる。どちらの方法も、ペプチドのC末端から始める各ステップで単一のアミノ酸を付加する段階的合成を含む(Coligan et al.,Curr Prot Immunol,Wiley Interscience,1991,Unit9を参照のこと)。化学合成が完了したら、t−BOCまたはFMOCアミノ酸ブロッキング基を除去するために合成ペプチドを脱保護し、低下した温度で酸処理することによって(例えば、液体HF−10%アニソールを用いて0℃で約0.25〜約1時間)、ポリマーから切断させ得る。試薬を蒸発させた後、1%酢酸溶液を用いて、ポリマーからペプチドを抽出し、次いでこれを凍結乾燥して粗物質を生じる。これは、通常、溶媒として5%酢酸を用いて、Sephadex G−15上でのゲル濾過等のような手法によって精製され得る。カラムの適切な画分を凍結乾燥すると、均質なペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、これを次いで、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸光分光法、モル旋光度、可溶性等のような標準的手法によって特徴付けられ、固相エドマン分解によって定量化され得る。
[0147]
ファージディスプレイ技術は、上述のような本発明のペプチドを同定するのに特に有効であり得る。簡潔には、ファージライブラリーを調製し(例えば、ml13、fd、またはラムダファージを用いる)、4〜約80アミノ酸残基の挿入物をディスプレイする。挿入物は、例えば、完全縮重アレイまたは偏向アレイを示し得る。所望の抗原に結合する挿入物を有するファージを選択し、所望の抗原に結合するファージの再選択を数周期行って、このプロセスを反復する。DNA配列決定を行って、発現されたペプチドの配列を特定する。このような方式で、所望の抗原に結合する配列の最小直鎖部分を決定し得る。最小直鎖部分の一部または全部を含有する挿入物に加えて、その上流または下流に1つ以上のさらなる縮重残基を含有する挿入物を含有する偏向ライブラリーを用いて、この手順は反復され得る。これらの技術は、本明細書に既に特定されている薬剤よりもミオスタチンに対してさらに高い結合親和性を持つ、本発明のペプチドを特定し得る。
[0148]
ペプチドを調製する方式にかかわらず、標準的組換えDNA法を用いて、そのようなペプチドの各々をコードする核酸分子を生成することも可能である。核酸コードの縮重を考慮するため、ならびに特定の宿主細胞におけるコドン選択を考慮するため、これらがコードするアミノ酸配列を変化させることなく、このような分子のヌクレオチド配列を適切に操作することも可能である。
[0149]
本発明はまた、本発明のペプチド及びペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。これらの核酸分子には、本発明のペプチド及びペプチボディ、ならびにペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター及び構築物が含まれる。典型的な核酸分子を以下の実施例に提供する。
[0150]
組換えDNA技術はまた、本発明の全長ペプチボディ及び他の巨大ポリペプチド結合剤、またはその断片を調製するための好適な方法も提供する。ペプチボディまたは断片をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、このベクターを次いで、本発明の結合剤を産生するために宿主細胞に挿入してもよい。本発明の典型的なペプチボディの調製が以下の実施例2に記載される。
[0151]
種々の発現ベクター/宿主系を使用して、本発明のペプチド及びペプチボディを発現し得る。これらの系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物;酵母発現ベクターで形質転換された酵母;ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)でトランスフェクションされたか、または細菌発現ベクター(例えば、TiもしくはpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞系;あるいは動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。1つの好ましい宿主細胞株は、以下の実施例2に記載されるようなペプチボディの発現に用いられる、大腸菌株2596(ATCC番号202174)である。組換えタンパク質産生に有用な哺乳動物細胞には、VERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、COS細胞(COS−7等)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、及び293細胞が含まれるが、これらに限定されない。
[0152]
「発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現するためのプラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。発現ベクターは、(1)遺伝子発現を制御する役割を有する、単数または複数の遺伝子要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される結合剤をコードする構造または配列、ならびに(3)適切な転写開始及び終結配列の集合体を含む、転写単位を含み得る。酵母または真核発現系で使用するために意図される構造単位には、好ましくは、翻訳されたタンパク質が宿主細胞によって細胞外分泌されるのを可能にするリーダー配列が含まれる。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合には、アミノ末端メチオニル残基を含み得る。その後、この残基は、最終ペプチド産物を得るために発現された組換えタンパク質から切断されても、切断されなくてもよい。
[0153]
例えば、市販の発現系、例えば、ピキア発現系(Invitrogen,San Diego,CA)を用いて、製造業者の指示に従って、ペプチド及びペプチボディを酵母中で組換えにより発現させてもよい。この系はまた、分泌させるためにプレ−プロ−α配列にも頼っているが、挿入物の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ(AOX1)プロモーターによって駆動される。分泌されたペプチドは、酵母増殖培地から、細菌及び哺乳動物細胞上清からペプチドを精製するために用いられる方法を用いて精製される。
[0154]
あるいは、ペプチド及びペプチボディをコードするcDNAをバキュロウイルス発現ベクターpVL1393(PharMingen,San Diego,CA)内にクローニングしてもよい。このベクターは、sF9タンパク質不含培地中でSpodoptera frugiperda細胞を感染させ、組換えタンパク質を産生するために製造業者の指示(PharMingen)に従って使用され得る。組換えタンパク質は、培地からヘパリン−セファロースカラム(Pharmacia)を用いて精製、濃縮され得る。
[0155]
あるいは、ペプチドまたはペプチボディは、昆虫系において発現され得る。タンパク質発現用の昆虫系は当業者に公知である。1つのそのような系では、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウイルス(AcNPV)は、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeにおいて外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。ペプチドコード配列は、ウイルスの非必須領域、例えば多面体遺伝子にクローン化し、多面体プロモーターの制御下に置かれ得る。ペプチドをうまく挿入すれば、多面体遺伝子は不活性となり、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが生じる。組換えウイルスは、ペプチドが発現されているS.frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeを感染させるために使用され得る(Smith et al.,J Virol46:584(1983)、Engelhard et al.,Proc Nat Acad Sci(USA)91:3224−7(1994))。
[0156]
別の例では、ペプチドをコードするDNA配列は、PCRにより増幅され、適当なベクター、例えば、pGEX−3X(Pharmacia)にクローン化され得る。pGEXベクターは、ベクターによりコードされるグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)及びベクターのクローニング部位に挿入されるDNA断片によりコードされるタンパク質を含む融合タンパク質を生ずるように設計されている。PCR用プライマーは、例えば適当な切断部位を含むように作成され得る。融合部分を単に発現を容易とするために使用する場合、または対象となるペプチドへの結合として望ましくない場合には、組換え融合タンパク質を、その後融合タンパク質のGST部分から切断してもよい。pGEX−3X/特異的結合剤ペプチド構築物を大腸菌XL−1Blue細胞(Stratagene,La Jolla CA)に形質転換し、個々の形質転換体を単離し、増殖させる。個々の形質転換体からのプラスミドDNAを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的に配列決定して適正な配向で、核酸挿入物をコードする所望の特異的結合剤の存在を確認することができる。
[0157]
融合タンパク質は、細菌中で不溶性封入体として産生され得、以下のように精製され得る。宿主細胞を遠心分離により収集し、0.15M NaCl、10mMトリス、pH8、1mM EDTAで洗浄し、0.1mg/mlのリゾチーム(Sigma,St.Louis,MO)で、室温で15分間処理する。溶解物を超音波処理によって清澄化し、細胞破片を12,000×gで10分間遠心分離することによりペレット化し得る。融合タンパク質を含有するペレットを、50mMトリス、pH8、及び10mM EDTA中に再懸濁し、50%グリセロール上に重層し、6000×gで30分間遠心分離し得る。ペレットは、Mg++もCa++も含まない一般的なリン酸緩衝食塩液(PBS)中に再懸濁され得る。再懸濁したペレットを、変性SDS−PAGE中で画分することによって、融合タンパク質をさらに精製することができる(Sambrook et al.,上記)。タンパク質を可視化するためにゲルを0.4M KCl中に浸してもよく、これは切除されて、SDSを欠くゲル泳動緩衝液中で電気溶出され得る。GST/融合タンパク質を細菌中で可溶性タンパク質として産生される場合、タンパク質はGST精製モジュール(Pharmacia)を用いて精製され得る。
[0158]
融合タンパク質を消化に供して、本発明のペプチドからGSTを切断してもよい。消化反応物(0.5ml PBS中の20〜40mgの融合タンパク質、20〜30単位のヒトトロンビン(4000U/mg,Sigma)を室温で16〜48時間インキュベートし、変性SDS−PAGEゲル上に装填して、反応生成物を画分し得る。タンパク質バンドを可視化するためにゲルを0.4M KCl中に浸してもよい。自動化配列決定装置(Applied Biosystems Model473A,Foster City,CA)を用いたアミノ酸配列分析によって、ペプチドの期待される分子量に対応するタンパク質バンドが何かを確認することも可能である。あるいは、ペプチドのHPLC及び/または質量分析を行うことによって、それが何であるかを確認することも可能である。
[0159]
あるいは、ペプチドをコードするDNA配列を、所望のプロモーター、及び任意にリーダー配列を含有するプラスミド内にクローニングすることも可能である(Better et al.,Science240:1041−43(1988))。自動化配列決定によって、この構築物の配列を確認することも可能である。次いで、細菌のCaCl2インキュベーション及び熱ショック処理を使用する標準法を用いて、プラスミドを大腸菌株MC1061に形質転換することができる(Sambrook et al.,上記)。カルベニシリンを補充したLB培地中で、形質転換細菌を増殖させることができ、適切な培地中の増殖によって、発現タンパク質の産生を誘導することができる。存在する場合、リーダー配列は、ペプチドの分泌をもたらし、分泌中に切断されることも可能である。
[0160]
組換えペプチド及びペプチボディの発現のための哺乳動物宿主系は当業者に周知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングするか、またはタンパク質活性を与えるのに有用であろう特定の翻訳後修飾を生ずるような特定能力について選択され得る。タンパク質のそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピド化、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されない。CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等の異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機序を有し、導入した外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングが確実になるように選択可能である。
[0161]
形質転換細胞が長期高収率タンパク質産生に用いられることが好ましい。そのような細胞が、所望の発現カセットとともに、選択可能マーカーを含有するベクターで形質転換されると、選択培地に切り替える前に、細胞を強化培地で1〜2日間増殖させてもよい。導入された配列を発現するのに成功した細胞の増殖及び回収を可能にするように、選択可能マーカーを設計する。使用する細胞株に適した組織培養技術を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊を増殖させることも可能である。
[0162]
多くの選択系が、組換えタンパク質産生のために形質転換された細胞を回収するために使用され得る。そのような選択系には、それぞれtk−細胞、hpgrt−細胞、またはaprt−細胞中の、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗薬耐性が、メトトレキサートへの耐性を与えるdhfr;ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt;アミノ配糖体G418に対する耐性を与え、クロルスルフロンに対する耐性を与えるneo;及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygroに関する選択の基礎として使用され得る。有用であり得るさらなる選択可能遺伝子には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするhisDが含まれる。形質転換体同定のための視覚的指標を与えるマーカーには、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質GUS、ならびにルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンが含まれる。
[0144]
本明細書に記載されるミオスタチン作動薬及びペプチドは、当該技術分野で公知の多様な技術を用いて生成され得る。一実施形態において、ミオスタチン作動薬は、以下の実施例17に記載される方法を用いて生成される。
[0145]
ペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。様々な自動化合成装置が商業的に入手可能であり、既知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、Stewart and Young(上記)、Tam et al.,J Am Chem Soc,105:6442(1983)、Merrifield,Science232:341−347(1986)、Barany and Merrifield,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York,1−284、Barany et al.,Int J Pep Protein Res,30:705−739(1987)、及び米国特許第5,424,398号を参照されたく、各々、参照により本明細書に組み込まれる。
[0146]
固相ペプチド合成法は、0.1〜1.0mMアミン/gのポリマーを含有するコポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)を用いる。ペプチド合成のこれらの方法は、アルファ−アミノ基のブチルオキシカルボニル(t−BOC)または9−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル(FMOC)保護を用いる。どちらの方法も、ペプチドのC末端から始める各ステップで単一のアミノ酸を付加する段階的合成を含む(Coligan et al.,Curr Prot Immunol,Wiley Interscience,1991,Unit9を参照のこと)。化学合成が完了したら、t−BOCまたはFMOCアミノ酸ブロッキング基を除去するために合成ペプチドを脱保護し、低下した温度で酸処理することによって(例えば、液体HF−10%アニソールを用いて0℃で約0.25〜約1時間)、ポリマーから切断させ得る。試薬を蒸発させた後、1%酢酸溶液を用いて、ポリマーからペプチドを抽出し、次いでこれを凍結乾燥して粗物質を生じる。これは、通常、溶媒として5%酢酸を用いて、Sephadex G−15上でのゲル濾過等のような手法によって精製され得る。カラムの適切な画分を凍結乾燥すると、均質なペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、これを次いで、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸光分光法、モル旋光度、可溶性等のような標準的手法によって特徴付けられ、固相エドマン分解によって定量化され得る。
[0147]
ファージディスプレイ技術は、上述のような本発明のペプチドを同定するのに特に有効であり得る。簡潔には、ファージライブラリーを調製し(例えば、ml13、fd、またはラムダファージを用いる)、4〜約80アミノ酸残基の挿入物をディスプレイする。挿入物は、例えば、完全縮重アレイまたは偏向アレイを示し得る。所望の抗原に結合する挿入物を有するファージを選択し、所望の抗原に結合するファージの再選択を数周期行って、このプロセスを反復する。DNA配列決定を行って、発現されたペプチドの配列を特定する。このような方式で、所望の抗原に結合する配列の最小直鎖部分を決定し得る。最小直鎖部分の一部または全部を含有する挿入物に加えて、その上流または下流に1つ以上のさらなる縮重残基を含有する挿入物を含有する偏向ライブラリーを用いて、この手順は反復され得る。これらの技術は、本明細書に既に特定されている薬剤よりもミオスタチンに対してさらに高い結合親和性を持つ、本発明のペプチドを特定し得る。
[0148]
ペプチドを調製する方式にかかわらず、標準的組換えDNA法を用いて、そのようなペプチドの各々をコードする核酸分子を生成することも可能である。核酸コードの縮重を考慮するため、ならびに特定の宿主細胞におけるコドン選択を考慮するため、これらがコードするアミノ酸配列を変化させることなく、このような分子のヌクレオチド配列を適切に操作することも可能である。
[0149]
本発明はまた、本発明のペプチド及びペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。これらの核酸分子には、本発明のペプチド及びペプチボディ、ならびにペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター及び構築物が含まれる。典型的な核酸分子を以下の実施例に提供する。
[0150]
組換えDNA技術はまた、本発明の全長ペプチボディ及び他の巨大ポリペプチド結合剤、またはその断片を調製するための好適な方法も提供する。ペプチボディまたは断片をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、このベクターを次いで、本発明の結合剤を産生するために宿主細胞に挿入してもよい。本発明の典型的なペプチボディの調製が以下の実施例2に記載される。
[0151]
種々の発現ベクター/宿主系を使用して、本発明のペプチド及びペプチボディを発現し得る。これらの系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物;酵母発現ベクターで形質転換された酵母;ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)でトランスフェクションされたか、または細菌発現ベクター(例えば、TiもしくはpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞系;あるいは動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。1つの好ましい宿主細胞株は、以下の実施例2に記載されるようなペプチボディの発現に用いられる、大腸菌株2596(ATCC番号202174)である。組換えタンパク質産生に有用な哺乳動物細胞には、VERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、COS細胞(COS−7等)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、及び293細胞が含まれるが、これらに限定されない。
[0152]
「発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現するためのプラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。発現ベクターは、(1)遺伝子発現を制御する役割を有する、単数または複数の遺伝子要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される結合剤をコードする構造または配列、ならびに(3)適切な転写開始及び終結配列の集合体を含む、転写単位を含み得る。酵母または真核発現系で使用するために意図される構造単位には、好ましくは、翻訳されたタンパク質が宿主細胞によって細胞外分泌されるのを可能にするリーダー配列が含まれる。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合には、アミノ末端メチオニル残基を含み得る。その後、この残基は、最終ペプチド産物を得るために発現された組換えタンパク質から切断されても、切断されなくてもよい。
[0153]
例えば、市販の発現系、例えば、ピキア発現系(Invitrogen,San Diego,CA)を用いて、製造業者の指示に従って、ペプチド及びペプチボディを酵母中で組換えにより発現させてもよい。この系はまた、分泌させるためにプレ−プロ−α配列にも頼っているが、挿入物の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ(AOX1)プロモーターによって駆動される。分泌されたペプチドは、酵母増殖培地から、細菌及び哺乳動物細胞上清からペプチドを精製するために用いられる方法を用いて精製される。
[0154]
あるいは、ペプチド及びペプチボディをコードするcDNAをバキュロウイルス発現ベクターpVL1393(PharMingen,San Diego,CA)内にクローニングしてもよい。このベクターは、sF9タンパク質不含培地中でSpodoptera frugiperda細胞を感染させ、組換えタンパク質を産生するために製造業者の指示(PharMingen)に従って使用され得る。組換えタンパク質は、培地からヘパリン−セファロースカラム(Pharmacia)を用いて精製、濃縮され得る。
[0155]
あるいは、ペプチドまたはペプチボディは、昆虫系において発現され得る。タンパク質発現用の昆虫系は当業者に公知である。1つのそのような系では、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウイルス(AcNPV)は、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeにおいて外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。ペプチドコード配列は、ウイルスの非必須領域、例えば多面体遺伝子にクローン化し、多面体プロモーターの制御下に置かれ得る。ペプチドをうまく挿入すれば、多面体遺伝子は不活性となり、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが生じる。組換えウイルスは、ペプチドが発現されているS.frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeを感染させるために使用され得る(Smith et al.,J Virol46:584(1983)、Engelhard et al.,Proc Nat Acad Sci(USA)91:3224−7(1994))。
[0156]
別の例では、ペプチドをコードするDNA配列は、PCRにより増幅され、適当なベクター、例えば、pGEX−3X(Pharmacia)にクローン化され得る。pGEXベクターは、ベクターによりコードされるグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)及びベクターのクローニング部位に挿入されるDNA断片によりコードされるタンパク質を含む融合タンパク質を生ずるように設計されている。PCR用プライマーは、例えば適当な切断部位を含むように作成され得る。融合部分を単に発現を容易とするために使用する場合、または対象となるペプチドへの結合として望ましくない場合には、組換え融合タンパク質を、その後融合タンパク質のGST部分から切断してもよい。pGEX−3X/特異的結合剤ペプチド構築物を大腸菌XL−1Blue細胞(Stratagene,La Jolla CA)に形質転換し、個々の形質転換体を単離し、増殖させる。個々の形質転換体からのプラスミドDNAを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的に配列決定して適正な配向で、核酸挿入物をコードする所望の特異的結合剤の存在を確認することができる。
[0157]
融合タンパク質は、細菌中で不溶性封入体として産生され得、以下のように精製され得る。宿主細胞を遠心分離により収集し、0.15M NaCl、10mMトリス、pH8、1mM EDTAで洗浄し、0.1mg/mlのリゾチーム(Sigma,St.Louis,MO)で、室温で15分間処理する。溶解物を超音波処理によって清澄化し、細胞破片を12,000×gで10分間遠心分離することによりペレット化し得る。融合タンパク質を含有するペレットを、50mMトリス、pH8、及び10mM EDTA中に再懸濁し、50%グリセロール上に重層し、6000×gで30分間遠心分離し得る。ペレットは、Mg++もCa++も含まない一般的なリン酸緩衝食塩液(PBS)中に再懸濁され得る。再懸濁したペレットを、変性SDS−PAGE中で画分することによって、融合タンパク質をさらに精製することができる(Sambrook et al.,上記)。タンパク質を可視化するためにゲルを0.4M KCl中に浸してもよく、これは切除されて、SDSを欠くゲル泳動緩衝液中で電気溶出され得る。GST/融合タンパク質を細菌中で可溶性タンパク質として産生される場合、タンパク質はGST精製モジュール(Pharmacia)を用いて精製され得る。
[0158]
融合タンパク質を消化に供して、本発明のペプチドからGSTを切断してもよい。消化反応物(0.5ml PBS中の20〜40mgの融合タンパク質、20〜30単位のヒトトロンビン(4000U/mg,Sigma)を室温で16〜48時間インキュベートし、変性SDS−PAGEゲル上に装填して、反応生成物を画分し得る。タンパク質バンドを可視化するためにゲルを0.4M KCl中に浸してもよい。自動化配列決定装置(Applied Biosystems Model473A,Foster City,CA)を用いたアミノ酸配列分析によって、ペプチドの期待される分子量に対応するタンパク質バンドが何かを確認することも可能である。あるいは、ペプチドのHPLC及び/または質量分析を行うことによって、それが何であるかを確認することも可能である。
[0159]
あるいは、ペプチドをコードするDNA配列を、所望のプロモーター、及び任意にリーダー配列を含有するプラスミド内にクローニングすることも可能である(Better et al.,Science240:1041−43(1988))。自動化配列決定によって、この構築物の配列を確認することも可能である。次いで、細菌のCaCl2インキュベーション及び熱ショック処理を使用する標準法を用いて、プラスミドを大腸菌株MC1061に形質転換することができる(Sambrook et al.,上記)。カルベニシリンを補充したLB培地中で、形質転換細菌を増殖させることができ、適切な培地中の増殖によって、発現タンパク質の産生を誘導することができる。存在する場合、リーダー配列は、ペプチドの分泌をもたらし、分泌中に切断されることも可能である。
[0160]
組換えペプチド及びペプチボディの発現のための哺乳動物宿主系は当業者に周知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングするか、またはタンパク質活性を与えるのに有用であろう特定の翻訳後修飾を生ずるような特定能力について選択され得る。タンパク質のそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピド化、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されない。CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等の異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機序を有し、導入した外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングが確実になるように選択可能である。
[0161]
形質転換細胞が長期高収率タンパク質産生に用いられることが好ましい。そのような細胞が、所望の発現カセットとともに、選択可能マーカーを含有するベクターで形質転換されると、選択培地に切り替える前に、細胞を強化培地で1〜2日間増殖させてもよい。導入された配列を発現するのに成功した細胞の増殖及び回収を可能にするように、選択可能マーカーを設計する。使用する細胞株に適した組織培養技術を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊を増殖させることも可能である。
[0162]
多くの選択系が、組換えタンパク質産生のために形質転換された細胞を回収するために使用され得る。そのような選択系には、それぞれtk−細胞、hpgrt−細胞、またはaprt−細胞中の、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗薬耐性が、メトトレキサートへの耐性を与えるdhfr;ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt;アミノ配糖体G418に対する耐性を与え、クロルスルフロンに対する耐性を与えるneo;及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygroに関する選択の基礎として使用され得る。有用であり得るさらなる選択可能遺伝子には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするhisDが含まれる。形質転換体同定のための視覚的指標を与えるマーカーには、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質GUS、ならびにルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンが含まれる。
結合剤の精製及び再フォールディング
[0163]
いくつかの場合、ミオスタチン作動薬、例えば、本発明のペプチド及び/またはペプチボディ等の結合剤は、生物学的に活性になるために、「再フォールディング」され、酸化されて適切な三次構造になり、ジスルフィド連結が生成される必要があり得る。一実施形態において、ミオスタチン作動薬は、以下の実施例17に記載される方法を用いて精製及び再フォールディングされる。
[0164]
再フォールディングは、当該技術分野で周知の多くの手順を用いて達成され得る。そのような方法には、例えば、カオトロピック剤の存在下で、通常7より高いpHに、可溶化したポリペプチド剤を曝露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いる選択と類似であるが、典型的には、カオトロープは、より低い濃度で用いられる。典型的なカオトロピック剤は、グアニジン及び尿素である。ほとんどの場合、再フォールディング/酸化溶液はまた、還元剤に加えて特定の比でその酸化型を含有して特定の酸化還元電位を生じ、ジスルフィドシャフリングを可能にして、システイン架橋の形成を生じる。いくつかの通常用いられるレドックス対には、システイン/シスタミン、グルタチオン/ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオスレイトールDTT/ジチアンDTT、及び2−メルカプトエタノール(bME)/ジチオ−bMEが含まれる。多くの場合、共溶媒が再フォールディングの効率を増加させるために使用され得る。一般に使用される共溶媒には、様々な分子量のグリセロール、ポリエチレングリコール、及びアルギニンが含まれる。
[0165]
本発明のペプチド及びペプチボディを精製することが望ましい場合がある。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、1つのレベルで、タンパク質性画分及び非タンパク質性画分の粗分画を伴う。他のタンパク質からペプチド及び/またはペプチボディを分離するように、部分的精製または完全精製(または均質になるまでの精製)を達成するために、クロマトグラフィー技術及び電気泳動技術を用いて、対象となるペプチドまたはポリペプチドは、さらに精製され得る。本発明のペプチボディ及びペプチドの調製物に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー;ポリアクリルアミドゲル電気泳動;等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは同等のHPLCである。
[0166]
本発明の特定の態様は、本発明のペプチボディまたはペプチドの精製に関し、特定の実施形態において、実質的な精製に関する。本明細書で使用される「精製されたペプチボディまたはペプチド」という用語は、他の構成要素から単離可能な組成物を指すよう意図され、ここでペプチボディまたはペプチドは、天然に得られ得る状態と比較して、いずれかの度合いに精製されている。したがって、精製されたペプチドまたはペプチボディはまた、天然に生じ得る環境にないペプチボディまたはペプチドも指す。
[0167]
一般的に、「精製された」は、多様な他の構成要素を除去する分画に供され、その発現される生物学的活性を実質的に保持する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この意味は、ペプチボディまたはペプチドが組成物の主要な構成要素を形成し、例えば、組成物中で約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%またはそれ以上のタンパク質を構成する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。
[0168]
本開示に照らして、ペプチドまたはペプチボディの精製の度合いを定量化する多様な方法が当業者に知られるであろう。これらには、例えば、活性画分の特異的結合活性を測定するか、またはSDS/PAGE分析によって、画分内のペプチドまたはペプチボディの量を評価することが含まれる。ペプチドまたはペプチボディ画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の結合活性を計算し、これを最初の抽出物の結合活性と比較して、こうして本明細書において「倍精製数」によって評価される、精製の度合いを計算することである。結合活性の量を表すのに用いられる実際の単位は、もちろん、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技術に依存するであろうし、ペプチボディまたはペプチドが検出可能な結合活性を示すかどうかに依存するであろう。
[0169]
精製に使用するのに適した多様な技術が、当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体(免疫沈降)等を用いた沈殿、または熱変性、その後の遠心分離;親和性クロマトグラフィー(例えばプロテイン−A−Sepharose)、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、及び親和性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーステップ;等電点電気泳動;ゲル電気泳動;ならびにこうした技術及び他の技術の組み合わせが含まれる。当該技術分野に一般的に知られるように、多様な精製ステップを行う順序を変化させることも可能であるし、または特定のステップを省略し、そしてなお、実質的に精製された結合剤の適切な調製法を生じることも可能であると考えられる。
[0170]
本発明の結合剤を常に最も精製された状態で提供しなければならないという一般的な必要条件はない。実際、実質的により精製されていない結合剤産物は、ある特定の実施形態において有用性を有するであろうことが企図される。より少ない精製ステップを組み合わせて用いることによって、または同じ一般的精製スキームの異なる型を利用することによって、部分的精製が達成され得る。例えば、HPLC装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも高い「−倍」精製を生じるであろう。相対的により低い度合いの精製を示す方法は、ペプチドまたはペプチボディの総回収に、あるいはペプチドまたはペプチボディの結合活性を維持するのに有利であり得る。
[0171]
ペプチドまたはポリペプチドの移動が、SDS/PAGEの異なる条件で多様であり得、時によって著しく多様であり得ることが知られている(Capaldi et al.,Biochem Biophys Res Comm,76:425(1977))。したがって、異なる電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された結合剤発現産物の見かけの分子量が多様であり得ることが理解されるであろう。
[0163]
いくつかの場合、ミオスタチン作動薬、例えば、本発明のペプチド及び/またはペプチボディ等の結合剤は、生物学的に活性になるために、「再フォールディング」され、酸化されて適切な三次構造になり、ジスルフィド連結が生成される必要があり得る。一実施形態において、ミオスタチン作動薬は、以下の実施例17に記載される方法を用いて精製及び再フォールディングされる。
[0164]
再フォールディングは、当該技術分野で周知の多くの手順を用いて達成され得る。そのような方法には、例えば、カオトロピック剤の存在下で、通常7より高いpHに、可溶化したポリペプチド剤を曝露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いる選択と類似であるが、典型的には、カオトロープは、より低い濃度で用いられる。典型的なカオトロピック剤は、グアニジン及び尿素である。ほとんどの場合、再フォールディング/酸化溶液はまた、還元剤に加えて特定の比でその酸化型を含有して特定の酸化還元電位を生じ、ジスルフィドシャフリングを可能にして、システイン架橋の形成を生じる。いくつかの通常用いられるレドックス対には、システイン/シスタミン、グルタチオン/ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオスレイトールDTT/ジチアンDTT、及び2−メルカプトエタノール(bME)/ジチオ−bMEが含まれる。多くの場合、共溶媒が再フォールディングの効率を増加させるために使用され得る。一般に使用される共溶媒には、様々な分子量のグリセロール、ポリエチレングリコール、及びアルギニンが含まれる。
[0165]
本発明のペプチド及びペプチボディを精製することが望ましい場合がある。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、1つのレベルで、タンパク質性画分及び非タンパク質性画分の粗分画を伴う。他のタンパク質からペプチド及び/またはペプチボディを分離するように、部分的精製または完全精製(または均質になるまでの精製)を達成するために、クロマトグラフィー技術及び電気泳動技術を用いて、対象となるペプチドまたはポリペプチドは、さらに精製され得る。本発明のペプチボディ及びペプチドの調製物に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー;ポリアクリルアミドゲル電気泳動;等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは同等のHPLCである。
[0166]
本発明の特定の態様は、本発明のペプチボディまたはペプチドの精製に関し、特定の実施形態において、実質的な精製に関する。本明細書で使用される「精製されたペプチボディまたはペプチド」という用語は、他の構成要素から単離可能な組成物を指すよう意図され、ここでペプチボディまたはペプチドは、天然に得られ得る状態と比較して、いずれかの度合いに精製されている。したがって、精製されたペプチドまたはペプチボディはまた、天然に生じ得る環境にないペプチボディまたはペプチドも指す。
[0167]
一般的に、「精製された」は、多様な他の構成要素を除去する分画に供され、その発現される生物学的活性を実質的に保持する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この意味は、ペプチボディまたはペプチドが組成物の主要な構成要素を形成し、例えば、組成物中で約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%またはそれ以上のタンパク質を構成する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。
[0168]
本開示に照らして、ペプチドまたはペプチボディの精製の度合いを定量化する多様な方法が当業者に知られるであろう。これらには、例えば、活性画分の特異的結合活性を測定するか、またはSDS/PAGE分析によって、画分内のペプチドまたはペプチボディの量を評価することが含まれる。ペプチドまたはペプチボディ画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の結合活性を計算し、これを最初の抽出物の結合活性と比較して、こうして本明細書において「倍精製数」によって評価される、精製の度合いを計算することである。結合活性の量を表すのに用いられる実際の単位は、もちろん、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技術に依存するであろうし、ペプチボディまたはペプチドが検出可能な結合活性を示すかどうかに依存するであろう。
[0169]
精製に使用するのに適した多様な技術が、当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体(免疫沈降)等を用いた沈殿、または熱変性、その後の遠心分離;親和性クロマトグラフィー(例えばプロテイン−A−Sepharose)、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、及び親和性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーステップ;等電点電気泳動;ゲル電気泳動;ならびにこうした技術及び他の技術の組み合わせが含まれる。当該技術分野に一般的に知られるように、多様な精製ステップを行う順序を変化させることも可能であるし、または特定のステップを省略し、そしてなお、実質的に精製された結合剤の適切な調製法を生じることも可能であると考えられる。
[0170]
本発明の結合剤を常に最も精製された状態で提供しなければならないという一般的な必要条件はない。実際、実質的により精製されていない結合剤産物は、ある特定の実施形態において有用性を有するであろうことが企図される。より少ない精製ステップを組み合わせて用いることによって、または同じ一般的精製スキームの異なる型を利用することによって、部分的精製が達成され得る。例えば、HPLC装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも高い「−倍」精製を生じるであろう。相対的により低い度合いの精製を示す方法は、ペプチドまたはペプチボディの総回収に、あるいはペプチドまたはペプチボディの結合活性を維持するのに有利であり得る。
[0171]
ペプチドまたはポリペプチドの移動が、SDS/PAGEの異なる条件で多様であり得、時によって著しく多様であり得ることが知られている(Capaldi et al.,Biochem Biophys Res Comm,76:425(1977))。したがって、異なる電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された結合剤発現産物の見かけの分子量が多様であり得ることが理解されるであろう。
ミオスタチン結合剤及び他の拮抗薬の活性
[0172]
本明細書に記載される結合剤を含む拮抗薬は、ミオスタチンに結合し、ミオスタチン活性を阻害または遮断する能力に関して試験され得る。結合剤がミオスタチン活性を阻害するまたは遮断する能力を決定するために、いかなる数のアッセイまたは動物試験も用いられ得る。本発明のペプチド及びペプチボディを特徴付けるために使用されるいくつかのアッセイが、以下の実施例に記載される。1つのアッセイは、C2C12pMARE−lucアッセイであり、アッセイは、ミオスタチン/アクチビン応答要素(MARE)を含有するルシフェラーゼレポーターベクターでトランスフェクションした、ミオスタチン応答性細胞株(C2C12筋芽細胞)を利用する。一連のペプチボディ希釈物をミオスタチンとプレインキュベーションし、次いで細胞をインキュベーション混合物に曝露することによって、典型的なペプチボディをアッセイする。得られたルシフェラーゼ活性を決定し、一連のペプチボディ希釈物から滴定曲線を生成する。次いで、IC50(ルシフェラーゼ活性によって測定されるようなミオスタチン活性の50%阻害を達成するペプチボディの濃度)を決定した。以下に記載される第2のアッセイは、ミオスタチン結合剤及びミオスタチンとその受容体に結合可能な抗体等の他の拮抗薬の動力学パラメータka(会合速度定数)、kd(解離速度定数)、及びKD(解離平衡定数)を決定するためのBIAcore(登録商標)アッセイである。解離平衡定数(KD、nMで表される)が低いほど、ミオスタチンに対するペプチボディの親和性が高いことを示した。さらなるアッセイには、ペプチボディ等の結合剤が中和性である(ミオスタチンのその受容体への結合を妨げる)か、または非中和性である(ミオスタチンのその受容体への結合を妨げない)かどうかを決定する、遮断アッセイ;本発明の結合剤が、ミオスタチンに選択的に結合して、ある特定の他のTGF−βファミリーメンバーに結合しないかどうかを決定する、選択性アッセイ;及びKDをも決定し、いくつかの状況では、より感受性であると見なされる、KinEx A(商標)アッセイまたは溶液に基づく平衡アッセイが含まれる。これらのアッセイは実施例3に記載される。
[0173]
図1は、ペプチドのペプチボディ型のIC50と比較した、ペプチドのIC50を示す。これは、ミオスタチン活性を阻害する際に、ペプチボディがペプチドのみよりも、有意に有効であることを示す。さらに、親和性成熟ペプチボディは、一般的に、親ペプチド及びペプチボディと比較して、改善されたIC50及びKD値を示す。いくつかの典型的な親和性成熟ペプチボディのIC50値を以下の実施例7の表VIIに示す。さらに、いくつかの場合、2つのペプチドがタンデムに結合された2×型のペプチボディを作製すると、インビトロ及びインビボの両方で、ペプチボディの活性が増加する。
[0174]
インビボ活性を以下の実施例に示す。結合剤の活性には、処置した動物モデルの総体重に対する増加した除脂肪筋肉量、増加した筋力、および減少した脂肪量が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるインビボ活性には、性腺機能低下症、リウマチ性悪液質、癌悪液質、及び不活動のモデルを含む動物モデルにおける、除脂肪筋肉量及び筋力の消耗の減弱がさらに含まれる。
[0172]
本明細書に記載される結合剤を含む拮抗薬は、ミオスタチンに結合し、ミオスタチン活性を阻害または遮断する能力に関して試験され得る。結合剤がミオスタチン活性を阻害するまたは遮断する能力を決定するために、いかなる数のアッセイまたは動物試験も用いられ得る。本発明のペプチド及びペプチボディを特徴付けるために使用されるいくつかのアッセイが、以下の実施例に記載される。1つのアッセイは、C2C12pMARE−lucアッセイであり、アッセイは、ミオスタチン/アクチビン応答要素(MARE)を含有するルシフェラーゼレポーターベクターでトランスフェクションした、ミオスタチン応答性細胞株(C2C12筋芽細胞)を利用する。一連のペプチボディ希釈物をミオスタチンとプレインキュベーションし、次いで細胞をインキュベーション混合物に曝露することによって、典型的なペプチボディをアッセイする。得られたルシフェラーゼ活性を決定し、一連のペプチボディ希釈物から滴定曲線を生成する。次いで、IC50(ルシフェラーゼ活性によって測定されるようなミオスタチン活性の50%阻害を達成するペプチボディの濃度)を決定した。以下に記載される第2のアッセイは、ミオスタチン結合剤及びミオスタチンとその受容体に結合可能な抗体等の他の拮抗薬の動力学パラメータka(会合速度定数)、kd(解離速度定数)、及びKD(解離平衡定数)を決定するためのBIAcore(登録商標)アッセイである。解離平衡定数(KD、nMで表される)が低いほど、ミオスタチンに対するペプチボディの親和性が高いことを示した。さらなるアッセイには、ペプチボディ等の結合剤が中和性である(ミオスタチンのその受容体への結合を妨げる)か、または非中和性である(ミオスタチンのその受容体への結合を妨げない)かどうかを決定する、遮断アッセイ;本発明の結合剤が、ミオスタチンに選択的に結合して、ある特定の他のTGF−βファミリーメンバーに結合しないかどうかを決定する、選択性アッセイ;及びKDをも決定し、いくつかの状況では、より感受性であると見なされる、KinEx A(商標)アッセイまたは溶液に基づく平衡アッセイが含まれる。これらのアッセイは実施例3に記載される。
[0173]
図1は、ペプチドのペプチボディ型のIC50と比較した、ペプチドのIC50を示す。これは、ミオスタチン活性を阻害する際に、ペプチボディがペプチドのみよりも、有意に有効であることを示す。さらに、親和性成熟ペプチボディは、一般的に、親ペプチド及びペプチボディと比較して、改善されたIC50及びKD値を示す。いくつかの典型的な親和性成熟ペプチボディのIC50値を以下の実施例7の表VIIに示す。さらに、いくつかの場合、2つのペプチドがタンデムに結合された2×型のペプチボディを作製すると、インビトロ及びインビボの両方で、ペプチボディの活性が増加する。
[0174]
インビボ活性を以下の実施例に示す。結合剤の活性には、処置した動物モデルの総体重に対する増加した除脂肪筋肉量、増加した筋力、および減少した脂肪量が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるインビボ活性には、性腺機能低下症、リウマチ性悪液質、癌悪液質、及び不活動のモデルを含む動物モデルにおける、除脂肪筋肉量及び筋力の消耗の減弱がさらに含まれる。
治療方法
[0175]
本発明は、アンドロゲン治療法を受けている前立腺癌患者において、治療量の、ミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号311のミオスタチン結合ペプチド、例えば、配列番号635からなる少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディを含む結合剤を投与することによって悪液質を治療する方法を提供する。
[0176]
本明細書で使用される「悪液質」という用語は、前立腺癌等のいくつかの疾患から生じる筋萎縮加速及び除脂肪体重の損失の状態を指す。以下の実施例に示されるように、本明細書に記載される典型的なペプチボディのようなミオスタチン拮抗薬が、除脂肪筋肉量を劇的に増加させ、体脂肪を減少させ、脂肪に対する筋肉の比を改変し、筋力を増加させる。
[0177]
また、ミオスタチン拮抗薬は、将来の筋力の消耗及び関連疾患から保護するために、治療等を必要とする対象において、予防的に投与することもできる。
[0178]
本発明のミオスタチン拮抗薬は、治療効果を増強するまたは潜在的副作用を減少させるために、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用され得る。
[0175]
本発明は、アンドロゲン治療法を受けている前立腺癌患者において、治療量の、ミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号311のミオスタチン結合ペプチド、例えば、配列番号635からなる少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディを含む結合剤を投与することによって悪液質を治療する方法を提供する。
[0176]
本明細書で使用される「悪液質」という用語は、前立腺癌等のいくつかの疾患から生じる筋萎縮加速及び除脂肪体重の損失の状態を指す。以下の実施例に示されるように、本明細書に記載される典型的なペプチボディのようなミオスタチン拮抗薬が、除脂肪筋肉量を劇的に増加させ、体脂肪を減少させ、脂肪に対する筋肉の比を改変し、筋力を増加させる。
[0177]
また、ミオスタチン拮抗薬は、将来の筋力の消耗及び関連疾患から保護するために、治療等を必要とする対象において、予防的に投与することもできる。
[0178]
本発明のミオスタチン拮抗薬は、治療効果を増強するまたは潜在的副作用を減少させるために、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用され得る。
薬学的組成物
[0179]
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、薬学的組成物において製剤化されるミオスタチン拮抗薬を使用する。薬学的組成物には、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤が含まれ得る。一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75において製剤化される。
[0180]
そのような組成物は、治療的または予防的有効量の、薬学的に許容される薬剤と混和して1つ以上のミオスタチン拮抗薬を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容される薬剤と混和して、ミオスタチンを部分的または完全に阻害する拮抗薬を含む。典型的には、拮抗薬は、対象への投与のために、十分に精製されているであろう。
[0181]
薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変するか、維持するか、または保持するための製剤化物質を含有してもよい。適切な製剤材料には、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等);抗菌剤;酸化防止剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等);緩衝剤(ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−HCl、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸等);増量剤(bulking agent)(マンニトールまたはグリシン等)、キレート剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等);錯化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等);充填剤(filler);単糖;二糖及び他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリン類等);タンパク質(血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等);着色剤;香味剤及び希釈剤;乳化剤;親水性ポリマー(ポリビニルピロリドン等);低分子量ポリペプチド;塩形成対イオン(ナトリウム等);保存剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素);溶媒(グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等);糖アルコール(マンニトールまたはソルビトール等);懸濁剤;界面活性剤または湿潤剤(プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20、ポリソルベート80等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール(tyloxapal));安定性増進剤(スクロースまたはソルビトール);等張化増進剤(アルカリ金属ハロゲン化物(好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール);送達ビヒクル;希釈剤;賦形剤、及び/または薬学的補助剤が含まれるが、これらに限定されない。(Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990)。
[0182]
最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投薬量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,上記を参照のこと。そのような組成物は、結合剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
[0183]
薬学的組成物中の主なビヒクルまたは担体は、実際には、水性または非水性のいずれであり得る。例えば、非経口投与用の組成物中で一般的な他の材料が補充される可能性のある、適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理的食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得る。中性の緩衝化された生理的食塩水または血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な薬学的組成物は、約pH7.0〜8.5のトリス緩衝液または約pH4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたは適切なその代替物をさらに含み得る。本発明の一実施形態において、凍結乾燥されたケーキまたは水性溶液の形態で、場合によって使用される製剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記)と、望ましい度合いの純度を有する選択された組成物を混合することによって、保存用の結合剤組成物を調製してもよい。さらに、スクロース等の適切な賦形剤を用いて、結合剤産物を凍結乾燥物として製剤化してもよい。
[0184]
薬学的組成物は、非経口送達、例えば、皮下のために選択することができる。あるいは、本組成物は、吸入または腸内送達のため、例えば経口、耳、眼、直腸、または膣送達のために選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の技術範囲内である。
[0185]
製剤成分は、投与の部位に許容され得る濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用いて、生理学的pHまたはわずかにより低いpH、典型的には約5〜約8のpH範囲内に、組成物を維持する。
[0186]
非経口投与が企図される場合、本発明で使用する治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中の所望の結合剤を含む、発熱物質不含の、非経口的に許容される水性溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、結合剤が適切に保存された無菌等張溶液として製剤化される、無菌蒸留水である。さらに別の調製物は、産物の制御放出または持続放出を提供し、次いで産物がデポ注射を介して送達され得る、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物(ポリ乳酸、ポリグリコール酸)、ビーズ、またはリポソーム等の薬剤とともに所望の分子の製剤を含むことができる。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、これは循環中での持続的な期間を促進するという効果を有し得る。所望の分子を導入する他の適切な手段には、移植可能な薬物送達デバイスが含まれる。
[0187]
別の態様において、非経口投与に適した薬学的配合物を、水性溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理学的緩衝生理食塩水において製剤化され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁物を、適切な油性注射懸濁物として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノ酸ポリマーもまた、送達に使用可能である。任意に、懸濁物はまた、化合物の可溶性を増加させ、非常に濃縮された溶液の調製を可能にするのに適した安定化剤または薬剤を含有することも可能である。別の実施形態において、薬学的組成物は、吸入用に製剤化され得る。例えば、結合剤を、吸入用の乾燥粉末として配合してもよい。ポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液を、エアロゾル送達のため、噴霧剤とともに製剤化してもよい。なお別の実施形態において、溶液を噴霧してもよい。肺投与は、PCT出願第PCT/US94/001875号にさらに記載され、出願は、化学的修飾タンパク質の肺送達を記載する。
[0188]
ある特定の製剤が経口で投与可能であることもまた、企図される。本発明の一実施形態において、この様式で投与される結合剤分子を、錠剤及びカプセル等の固体剤形の調合に通例用いられる担体を含み、または含まずに、製剤化することができる。例えば、生物学的利用能が最大になり、前全身分解が最小になる胃腸管の地点で、製剤の活性部分が放出されるように、カプセルを設計してもよい。結合剤分子の吸収を促進するために、さらなる薬剤を含むことができる。また、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用し得る。
[0189]
経口投与に適した投薬量で、当該技術分野に周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与のための薬学的組成物を製剤化することもできる。そのような担体は、薬学的組成物が、患者により摂取される錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤として製剤化されることを可能にする。
[0190]
活性化合物を固体賦形剤と合わせて、得られた顆粒混合物を(場合によって粉砕した後)加工して、錠剤または糖剤コアを得ることによって、経口使用のための薬学的調製物を得ることも可能である。望ましい場合、適切な補助剤を添加することも可能である。適切な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、及びソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース;アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム;ならびにゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質が含まれる。所望の場合、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、及びアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウム等のその塩等の、崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
[0191]
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、及び/または二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒または溶媒混合物もまた含有可能である濃縮糖溶液等の、適切なコーティングと組み合わせて、糖剤コアを用いることも可能である。染料または色素を錠剤または糖剤コーティングに添加して、製品を識別するか、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴付けることも可能である。
[0192]
経口で使用可能な薬学的調製物には、ゼラチンで作製された押し込み型カプセル、ならびにゼラチン及びコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールで作製されたソフト密封カプセルも含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースまたはデンプン等の充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び場合により安定化剤と混合された活性成分を含み得る。ソフトカプセル中、活性化合物は、安定化剤を含む、または含まずに、適切な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。
[0193]
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合された、有効量の結合剤を含み得る。錠剤を、無菌水、または他の適切なビヒクルに溶解することによって、単位用量型で溶液を調製することも可能である。適切な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤;あるいはデンプン、ゼラチン、またはアカシア等の結合剤;あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の滑沢剤が含まれるが、これらに限定されない。
[0194]
さらなる薬学的組成物が当業者に明らかであり、こうした組成物には、持続送達または制御送達製剤中の結合剤分子を伴う製剤が含まれる。多様な他の持続送達または制御送達、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子、または多孔ビーズ及び蓄積注射を製剤化する技術もまた、当業者に知られている。例えば、薬学的組成物の送達のための多孔ポリマー微小粒子の制御放出を記載する、PCT/US第93/00829号を参照のこと。持続調製物のさらなる例には、成型物品、例えば、フィルムまたは微小カプセルの形の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(US第3,773,919号、EP第58,481号)、L−グルタミン酸及びガンマエチル−L−グルタメートのコピリマー(Sidman et al.,Biopolymers,22:547−556(1983))、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.,15:167−277,(1981)、Langer et al.,Chem.Tech.,12:98−105(1982))、エチレン酢酸ビニル(Langer et al.,上記)、またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP第133,988号)が含まれ得る。持続放出組成物にはまた、当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれによっても調製可能なリポソームも含まれる。例えば、Eppstein et al.,PNAS(USA),82:3688(1985)、EP第36,676号、EP第88,046号、EP第143,949号を参照のこと。
[0195]
インビボ投与に用いられるべき薬学的組成物は、典型的には、滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成前にまたはその後に行われ得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥型で、または溶液中で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
[0196]
一旦、薬学的組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁物、ゲル、乳剤、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中で保存され得る。そのような製剤は、すぐに使える型または投与前に再構築を要する(例えば、凍結乾燥した)型のいずれかで保存され得る。
[0197]
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を生じるキットに関する。キットは、各々、乾燥タンパク質を有する第1の容器及び水性製剤を有する第2の容器の両方を含有し得る。本発明の範囲内にも含まれるのは、単一チャンバー及び多チャンバーの予め充填されたシリンジ(例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ(lyosyringes))を含有するキットである。
[0179]
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、薬学的組成物において製剤化されるミオスタチン拮抗薬を使用する。薬学的組成物には、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤が含まれ得る。一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75において製剤化される。
[0180]
そのような組成物は、治療的または予防的有効量の、薬学的に許容される薬剤と混和して1つ以上のミオスタチン拮抗薬を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容される薬剤と混和して、ミオスタチンを部分的または完全に阻害する拮抗薬を含む。典型的には、拮抗薬は、対象への投与のために、十分に精製されているであろう。
[0181]
薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変するか、維持するか、または保持するための製剤化物質を含有してもよい。適切な製剤材料には、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等);抗菌剤;酸化防止剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等);緩衝剤(ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−HCl、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸等);増量剤(bulking agent)(マンニトールまたはグリシン等)、キレート剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等);錯化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等);充填剤(filler);単糖;二糖及び他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリン類等);タンパク質(血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等);着色剤;香味剤及び希釈剤;乳化剤;親水性ポリマー(ポリビニルピロリドン等);低分子量ポリペプチド;塩形成対イオン(ナトリウム等);保存剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素);溶媒(グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等);糖アルコール(マンニトールまたはソルビトール等);懸濁剤;界面活性剤または湿潤剤(プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20、ポリソルベート80等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール(tyloxapal));安定性増進剤(スクロースまたはソルビトール);等張化増進剤(アルカリ金属ハロゲン化物(好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール);送達ビヒクル;希釈剤;賦形剤、及び/または薬学的補助剤が含まれるが、これらに限定されない。(Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990)。
[0182]
最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投薬量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,上記を参照のこと。そのような組成物は、結合剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
[0183]
薬学的組成物中の主なビヒクルまたは担体は、実際には、水性または非水性のいずれであり得る。例えば、非経口投与用の組成物中で一般的な他の材料が補充される可能性のある、適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理的食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得る。中性の緩衝化された生理的食塩水または血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な薬学的組成物は、約pH7.0〜8.5のトリス緩衝液または約pH4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたは適切なその代替物をさらに含み得る。本発明の一実施形態において、凍結乾燥されたケーキまたは水性溶液の形態で、場合によって使用される製剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記)と、望ましい度合いの純度を有する選択された組成物を混合することによって、保存用の結合剤組成物を調製してもよい。さらに、スクロース等の適切な賦形剤を用いて、結合剤産物を凍結乾燥物として製剤化してもよい。
[0184]
薬学的組成物は、非経口送達、例えば、皮下のために選択することができる。あるいは、本組成物は、吸入または腸内送達のため、例えば経口、耳、眼、直腸、または膣送達のために選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の技術範囲内である。
[0185]
製剤成分は、投与の部位に許容され得る濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用いて、生理学的pHまたはわずかにより低いpH、典型的には約5〜約8のpH範囲内に、組成物を維持する。
[0186]
非経口投与が企図される場合、本発明で使用する治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中の所望の結合剤を含む、発熱物質不含の、非経口的に許容される水性溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、結合剤が適切に保存された無菌等張溶液として製剤化される、無菌蒸留水である。さらに別の調製物は、産物の制御放出または持続放出を提供し、次いで産物がデポ注射を介して送達され得る、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物(ポリ乳酸、ポリグリコール酸)、ビーズ、またはリポソーム等の薬剤とともに所望の分子の製剤を含むことができる。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、これは循環中での持続的な期間を促進するという効果を有し得る。所望の分子を導入する他の適切な手段には、移植可能な薬物送達デバイスが含まれる。
[0187]
別の態様において、非経口投与に適した薬学的配合物を、水性溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理学的緩衝生理食塩水において製剤化され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁物を、適切な油性注射懸濁物として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノ酸ポリマーもまた、送達に使用可能である。任意に、懸濁物はまた、化合物の可溶性を増加させ、非常に濃縮された溶液の調製を可能にするのに適した安定化剤または薬剤を含有することも可能である。別の実施形態において、薬学的組成物は、吸入用に製剤化され得る。例えば、結合剤を、吸入用の乾燥粉末として配合してもよい。ポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液を、エアロゾル送達のため、噴霧剤とともに製剤化してもよい。なお別の実施形態において、溶液を噴霧してもよい。肺投与は、PCT出願第PCT/US94/001875号にさらに記載され、出願は、化学的修飾タンパク質の肺送達を記載する。
[0188]
ある特定の製剤が経口で投与可能であることもまた、企図される。本発明の一実施形態において、この様式で投与される結合剤分子を、錠剤及びカプセル等の固体剤形の調合に通例用いられる担体を含み、または含まずに、製剤化することができる。例えば、生物学的利用能が最大になり、前全身分解が最小になる胃腸管の地点で、製剤の活性部分が放出されるように、カプセルを設計してもよい。結合剤分子の吸収を促進するために、さらなる薬剤を含むことができる。また、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用し得る。
[0189]
経口投与に適した投薬量で、当該技術分野に周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与のための薬学的組成物を製剤化することもできる。そのような担体は、薬学的組成物が、患者により摂取される錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤として製剤化されることを可能にする。
[0190]
活性化合物を固体賦形剤と合わせて、得られた顆粒混合物を(場合によって粉砕した後)加工して、錠剤または糖剤コアを得ることによって、経口使用のための薬学的調製物を得ることも可能である。望ましい場合、適切な補助剤を添加することも可能である。適切な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、及びソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース;アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム;ならびにゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質が含まれる。所望の場合、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、及びアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウム等のその塩等の、崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
[0191]
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、及び/または二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒または溶媒混合物もまた含有可能である濃縮糖溶液等の、適切なコーティングと組み合わせて、糖剤コアを用いることも可能である。染料または色素を錠剤または糖剤コーティングに添加して、製品を識別するか、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴付けることも可能である。
[0192]
経口で使用可能な薬学的調製物には、ゼラチンで作製された押し込み型カプセル、ならびにゼラチン及びコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールで作製されたソフト密封カプセルも含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースまたはデンプン等の充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び場合により安定化剤と混合された活性成分を含み得る。ソフトカプセル中、活性化合物は、安定化剤を含む、または含まずに、適切な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。
[0193]
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合された、有効量の結合剤を含み得る。錠剤を、無菌水、または他の適切なビヒクルに溶解することによって、単位用量型で溶液を調製することも可能である。適切な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤;あるいはデンプン、ゼラチン、またはアカシア等の結合剤;あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の滑沢剤が含まれるが、これらに限定されない。
[0194]
さらなる薬学的組成物が当業者に明らかであり、こうした組成物には、持続送達または制御送達製剤中の結合剤分子を伴う製剤が含まれる。多様な他の持続送達または制御送達、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子、または多孔ビーズ及び蓄積注射を製剤化する技術もまた、当業者に知られている。例えば、薬学的組成物の送達のための多孔ポリマー微小粒子の制御放出を記載する、PCT/US第93/00829号を参照のこと。持続調製物のさらなる例には、成型物品、例えば、フィルムまたは微小カプセルの形の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(US第3,773,919号、EP第58,481号)、L−グルタミン酸及びガンマエチル−L−グルタメートのコピリマー(Sidman et al.,Biopolymers,22:547−556(1983))、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.,15:167−277,(1981)、Langer et al.,Chem.Tech.,12:98−105(1982))、エチレン酢酸ビニル(Langer et al.,上記)、またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP第133,988号)が含まれ得る。持続放出組成物にはまた、当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれによっても調製可能なリポソームも含まれる。例えば、Eppstein et al.,PNAS(USA),82:3688(1985)、EP第36,676号、EP第88,046号、EP第143,949号を参照のこと。
[0195]
インビボ投与に用いられるべき薬学的組成物は、典型的には、滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成前にまたはその後に行われ得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥型で、または溶液中で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
[0196]
一旦、薬学的組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁物、ゲル、乳剤、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中で保存され得る。そのような製剤は、すぐに使える型または投与前に再構築を要する(例えば、凍結乾燥した)型のいずれかで保存され得る。
[0197]
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を生じるキットに関する。キットは、各々、乾燥タンパク質を有する第1の容器及び水性製剤を有する第2の容器の両方を含有し得る。本発明の範囲内にも含まれるのは、単一チャンバー及び多チャンバーの予め充填されたシリンジ(例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ(lyosyringes))を含有するキットである。
投薬量
[0198]
治療的に使用されるべき薬学的組成物の有効量は、例えば、治療背景及び目的に応じて異なるであろう。したがって、当業者は、治療に適した投薬レベルが、部分的に、送達される分子、結合剤分子を用いようとする適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ(体重、体表面積、または臓器の大きさ)及び状態(年齢及び全身の健康状態)に応じて異なることを認識するであろう。したがって、臨床医は、投薬量を滴定し、投与経路を調節して、最適治療効果を得ることも可能である。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約0.1mg/kg〜約100mg/kgまたはそれ以上の範囲に及び得る。他の実施形態において、投薬量は、0.1mg/kg〜約100mg/kgまたは1mg/kg〜約100mg/kgまたは5mg/kg〜約100mg/kgの範囲に及び得る。
[0199]
本明細書に記載される治療方法の一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、0.01〜10.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3〜3.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3、1.0、もしくは3.0mg/kgの用量で投与される。
[0200]
いかなる化合物に関しても、まず、細胞培養アッセイにおいて、あるいはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、またはサル等の動物モデルにおいて、治療有効用量を推定することも可能である。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用してもよい。次いで、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために使用され得る。
[0201]
正確な投薬量は、治療を要する対象に関する要因を考慮して決定されるであろう。投薬量及び投与を調整して、十分なレベルの活性化合物を提供するか、または所望の効果を維持する。考慮に入れられ得る要因には、疾患状態の重症度、対象の全般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ(複数を含む)、反応感度、ならびに療法への応答が含まれる。長時間作用性薬学的組成物を、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、3〜4日ごとに、毎週、または2週間に1回、投与することができる。
[0202]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、1日2回、1日1回、週2回、週1回、月2回、または月1回、投与される。例えば、ミオスタチン拮抗薬は、週1回、4週間投与される。
[0203]
投薬頻度は、用いる製剤中の結合剤分子の薬物動態学パラメータに依存するであろう。典型的には、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。したがって、単回投与として、または長期にわたる複数回投与として(同じまたは異なる濃度/投薬量で)、または連続注入として、組成物を投与してもよい。適切な投薬量のさらなる改良が、日常的になされる。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
[0204]
薬学的組成物の投与経路は、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内(実質内)、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、尿道、膣、または結腸手段、持続放出系によるもの、あるいは埋め込みデバイスによるもの、等の公知の方法と一致する。望ましい場合、ボーラス注射によって、または注入によって連続して、または埋め込みデバイスによって組成物を投与してもよい。
[0205]
あるいは、またはさらに、所望の分子が吸収されているか、または被包されている、膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みを介して、組成物を局所に投与してもよい。埋め込みデバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または臓器内に埋め込まれ得、所望の分子の送達は、分散、持続放出ボーラス投与、または連続投与を介してであり得る。
[0206]
いくつかの場合、エクスビボ方式で薬学的組成物を用いることが望ましい場合がある。そのような場合、患者から取り出された細胞、組織、または臓器を薬学的組成物は曝露され、その後に、これらの細胞、組織、及び/または臓器が引き続いて患者に移植して戻される。
[0207]
他の場合において、ペプチボディ等のミオスタチン拮抗薬は、本明細書に記載されるような方法を用いて、ポリペプチドを発現及び分泌するように遺伝的に操作された特定の細胞を移植することによって送達され得る。そのような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、自己、異種、または外因性の細胞であり得る。場合によって、これらの細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少させるために、これらの細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物(複数を含む)の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
[0208]
本発明が記載されてきているが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定のためではない。
[0198]
治療的に使用されるべき薬学的組成物の有効量は、例えば、治療背景及び目的に応じて異なるであろう。したがって、当業者は、治療に適した投薬レベルが、部分的に、送達される分子、結合剤分子を用いようとする適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ(体重、体表面積、または臓器の大きさ)及び状態(年齢及び全身の健康状態)に応じて異なることを認識するであろう。したがって、臨床医は、投薬量を滴定し、投与経路を調節して、最適治療効果を得ることも可能である。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約0.1mg/kg〜約100mg/kgまたはそれ以上の範囲に及び得る。他の実施形態において、投薬量は、0.1mg/kg〜約100mg/kgまたは1mg/kg〜約100mg/kgまたは5mg/kg〜約100mg/kgの範囲に及び得る。
[0199]
本明細書に記載される治療方法の一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、0.01〜10.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3〜3.0mg/kg(境界値を含む)の用量で、または0.3、1.0、もしくは3.0mg/kgの用量で投与される。
[0200]
いかなる化合物に関しても、まず、細胞培養アッセイにおいて、あるいはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、またはサル等の動物モデルにおいて、治療有効用量を推定することも可能である。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用してもよい。次いで、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために使用され得る。
[0201]
正確な投薬量は、治療を要する対象に関する要因を考慮して決定されるであろう。投薬量及び投与を調整して、十分なレベルの活性化合物を提供するか、または所望の効果を維持する。考慮に入れられ得る要因には、疾患状態の重症度、対象の全般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ(複数を含む)、反応感度、ならびに療法への応答が含まれる。長時間作用性薬学的組成物を、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、3〜4日ごとに、毎週、または2週間に1回、投与することができる。
[0202]
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、1日2回、1日1回、週2回、週1回、月2回、または月1回、投与される。例えば、ミオスタチン拮抗薬は、週1回、4週間投与される。
[0203]
投薬頻度は、用いる製剤中の結合剤分子の薬物動態学パラメータに依存するであろう。典型的には、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。したがって、単回投与として、または長期にわたる複数回投与として(同じまたは異なる濃度/投薬量で)、または連続注入として、組成物を投与してもよい。適切な投薬量のさらなる改良が、日常的になされる。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
[0204]
薬学的組成物の投与経路は、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内(実質内)、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、尿道、膣、または結腸手段、持続放出系によるもの、あるいは埋め込みデバイスによるもの、等の公知の方法と一致する。望ましい場合、ボーラス注射によって、または注入によって連続して、または埋め込みデバイスによって組成物を投与してもよい。
[0205]
あるいは、またはさらに、所望の分子が吸収されているか、または被包されている、膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みを介して、組成物を局所に投与してもよい。埋め込みデバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または臓器内に埋め込まれ得、所望の分子の送達は、分散、持続放出ボーラス投与、または連続投与を介してであり得る。
[0206]
いくつかの場合、エクスビボ方式で薬学的組成物を用いることが望ましい場合がある。そのような場合、患者から取り出された細胞、組織、または臓器を薬学的組成物は曝露され、その後に、これらの細胞、組織、及び/または臓器が引き続いて患者に移植して戻される。
[0207]
他の場合において、ペプチボディ等のミオスタチン拮抗薬は、本明細書に記載されるような方法を用いて、ポリペプチドを発現及び分泌するように遺伝的に操作された特定の細胞を移植することによって送達され得る。そのような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、自己、異種、または外因性の細胞であり得る。場合によって、これらの細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少させるために、これらの細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物(複数を含む)の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
[0208]
本発明が記載されてきているが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定のためではない。
実施例1:ミオスタチン結合ペプチドの特定
[0209]
3つの繊維状ファージライブラリー、TN8−IX(5×109独立形質転換体)、TN12−I(1.4×109独立形質転換体)、及び直鎖(2.3×109独立形質転換体)(Dyax Corp.)を用いて、ミオスタチン結合ファージに関して選択した。ミオスタチンでコーティングした表面上で各ライブラリーをインキュベートし、異なるパニング条件:非特異的溶出、及び組換えヒトアクチビン受容体IIB/Fcキメラ(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,Minnesota)を用いた特異的溶出、または以下に記載されるミオスタチンプロペプチド溶出に供した。3つのライブラリーすべてに関して、第一の選択周期では、非特異的方式でファージを溶出させ、一方、第二及び第三の選択周期では、受容体及びプロミオスタチンを用いた。以下に記載されるように選択手順を行った。
[0209]
3つの繊維状ファージライブラリー、TN8−IX(5×109独立形質転換体)、TN12−I(1.4×109独立形質転換体)、及び直鎖(2.3×109独立形質転換体)(Dyax Corp.)を用いて、ミオスタチン結合ファージに関して選択した。ミオスタチンでコーティングした表面上で各ライブラリーをインキュベートし、異なるパニング条件:非特異的溶出、及び組換えヒトアクチビン受容体IIB/Fcキメラ(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,Minnesota)を用いた特異的溶出、または以下に記載されるミオスタチンプロペプチド溶出に供した。3つのライブラリーすべてに関して、第一の選択周期では、非特異的方式でファージを溶出させ、一方、第二及び第三の選択周期では、受容体及びプロミオスタチンを用いた。以下に記載されるように選択手順を行った。
ミオスタチンの調製
[0210]
以下のように、大腸菌K−12株2596(ATCC番号202174)において、ミオスタチンタンパク質を組換え的に産生した。公開された国際特許出願WO00/24782号に記載される手順に従って、発現ベクターpCFM1656(ATCC番号69576)及び米国特許第4,710,473号に記載される発現ベクター系に由来するpAMG21発現ベクター(ATCC番号98113)に、ヒトプロミオスタチン分子をコードするポリヌクレオチドをクローニングした。プロミオスタチンをコードするポリヌクレオチドを哺乳動物発現ベクターから得た。標準的PCR法ならびにNdeI及びBamHIの制限酵素部位を導入する以下のPCRプライマーを用いて、コード領域を増幅した。
[0210]
以下のように、大腸菌K−12株2596(ATCC番号202174)において、ミオスタチンタンパク質を組換え的に産生した。公開された国際特許出願WO00/24782号に記載される手順に従って、発現ベクターpCFM1656(ATCC番号69576)及び米国特許第4,710,473号に記載される発現ベクター系に由来するpAMG21発現ベクター(ATCC番号98113)に、ヒトプロミオスタチン分子をコードするポリヌクレオチドをクローニングした。プロミオスタチンをコードするポリヌクレオチドを哺乳動物発現ベクターから得た。標準的PCR法ならびにNdeI及びBamHIの制限酵素部位を導入する以下のPCRプライマーを用いて、コード領域を増幅した。
5’プライマー:5’−GAGAGAGAGCATATGAATGAGAACAGTGAGCAAAAAG−3’(配列番号292)
3’プライマー:5’−AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC−3’(配列番号293)
[0211]
PCR産物及びベクターを両酵素で消化し、混合し、連結した。連結産物を大腸菌株#2596に形質転換した。封入体の形で組換えタンパク質が発現されているかどうか、顕微鏡で単一コロニーを確認した。プラスミドを単離し、組換え遺伝子のコード領域を通じて配列決定して、遺伝的忠実度を確認した。
[0212]
バッチ法を用いて、37℃で、10Lの発酵物から細菌ペーストを生成した。9.6OD600の細胞密度で培養物をHSLで誘導し、104OD600の濃度で、6時間後に採取した。ペーストを−80℃で保存した。プロミオスタチンを発現する大腸菌ペーストを微小流動装置(microfluidizer)中で16,000psiで溶解し、遠心分離して不溶性封入体画分を単離した。ジチオスレイトールを含有する塩酸グアニジン中に封入体を再懸濁し、室温で可溶化した。次いで、これを水性緩衝液中で30倍に希釈した。次いで、再フォールディングされたプロミオスタチンを濃縮し、20mMトリスpH8.0に緩衝液交換し、アニオン交換カラムに適用した。増加する塩化ナトリウム勾配でアニオン交換カラムから溶出させた。プロミオスタチンを含有する画分をプールした。大腸菌で産生されるプロミオスタチンは、最初の23アミノ酸を欠き、残基24のアスパラギンの前のメチオニンで始まる。成熟ミオスタチンを産生するために、プールしたプロミオスタチンを、プロペプチドと成熟ミオスタチンC末端の間で酵素的に切断した。次いで、0.1%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの増加勾配を用いて、得られた混合物をC4−rpHPLCカラムに適用した。成熟ミオスタチンを含有する画分をプールし、speed−vac中で乾燥させた。
[0213]
以下に記載される筋芽細胞C2C12に基づくアッセイにおいて、大腸菌から産生される組換え成熟ミオスタチンを試験し、哺乳動物細胞系で商業的に産生された組換えネズミミオスタチン(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,Minnesota)に比較したときに、完全に活性であることを見出した。大腸菌で産生される成熟ミオスタチンを、以下に記載されるファージディスプレイ及びスクリーニングアッセイに用いた。
3’プライマー:5’−AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC−3’(配列番号293)
[0211]
PCR産物及びベクターを両酵素で消化し、混合し、連結した。連結産物を大腸菌株#2596に形質転換した。封入体の形で組換えタンパク質が発現されているかどうか、顕微鏡で単一コロニーを確認した。プラスミドを単離し、組換え遺伝子のコード領域を通じて配列決定して、遺伝的忠実度を確認した。
[0212]
バッチ法を用いて、37℃で、10Lの発酵物から細菌ペーストを生成した。9.6OD600の細胞密度で培養物をHSLで誘導し、104OD600の濃度で、6時間後に採取した。ペーストを−80℃で保存した。プロミオスタチンを発現する大腸菌ペーストを微小流動装置(microfluidizer)中で16,000psiで溶解し、遠心分離して不溶性封入体画分を単離した。ジチオスレイトールを含有する塩酸グアニジン中に封入体を再懸濁し、室温で可溶化した。次いで、これを水性緩衝液中で30倍に希釈した。次いで、再フォールディングされたプロミオスタチンを濃縮し、20mMトリスpH8.0に緩衝液交換し、アニオン交換カラムに適用した。増加する塩化ナトリウム勾配でアニオン交換カラムから溶出させた。プロミオスタチンを含有する画分をプールした。大腸菌で産生されるプロミオスタチンは、最初の23アミノ酸を欠き、残基24のアスパラギンの前のメチオニンで始まる。成熟ミオスタチンを産生するために、プールしたプロミオスタチンを、プロペプチドと成熟ミオスタチンC末端の間で酵素的に切断した。次いで、0.1%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの増加勾配を用いて、得られた混合物をC4−rpHPLCカラムに適用した。成熟ミオスタチンを含有する画分をプールし、speed−vac中で乾燥させた。
[0213]
以下に記載される筋芽細胞C2C12に基づくアッセイにおいて、大腸菌から産生される組換え成熟ミオスタチンを試験し、哺乳動物細胞系で商業的に産生された組換えネズミミオスタチン(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,Minnesota)に比較したときに、完全に活性であることを見出した。大腸菌で産生される成熟ミオスタチンを、以下に記載されるファージディスプレイ及びスクリーニングアッセイに用いた。
ミオスタチンでコーティングした試験管の調製
[0214]
1mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中、8μgのミオスタチンタンパク質の濃度で、5mlのImmuno(商標)試験管(NUNC)上にミオスタチンを固定した。ミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管を、軌道振盪(orbital shaking)を伴って、室温で1時間インキュベートした。次いで、5mlの2%ミルク−PBSを添加し、回転させながら室温で1時間インキュベートすることによって、ミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管を遮断した。得られたミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管を、PBSで3回洗浄した後、選択手順に供した。陰性選択のため、さらなるImmuno(商標)試験管もまた、調製した(ミオスタチンなし)。ミオスタチンタンパク質の代わりに、1mlの2%BSA−PBSでImmuno(商標)試験管をコーティングしたことを除いて、各パニング条件について、5〜10のImmuno(商標)試験管を上記手順に供した。
[0214]
1mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中、8μgのミオスタチンタンパク質の濃度で、5mlのImmuno(商標)試験管(NUNC)上にミオスタチンを固定した。ミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管を、軌道振盪(orbital shaking)を伴って、室温で1時間インキュベートした。次いで、5mlの2%ミルク−PBSを添加し、回転させながら室温で1時間インキュベートすることによって、ミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管を遮断した。得られたミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管を、PBSで3回洗浄した後、選択手順に供した。陰性選択のため、さらなるImmuno(商標)試験管もまた、調製した(ミオスタチンなし)。ミオスタチンタンパク質の代わりに、1mlの2%BSA−PBSでImmuno(商標)試験管をコーティングしたことを除いて、各パニング条件について、5〜10のImmuno(商標)試験管を上記手順に供した。
陰性選択
[0215]
各パニング条件について、TN8−IX及びTN12−Iライブラリー(TN8−IXについては5×1011pfu、及びTN12−Iについては1.4×1011pfu)では、約100のランダムライブラリー同等物、直鎖ライブラリー(2.3×1010pfu)では約10のランダムライブラリー同等物を、ライブラリーストックから一定量を分取し、PBST(0.05%Tween−20を含むPBS)で1mlに希釈した。陰性選択用に調製したImmuno(商標)試験管に、1mlの希釈したライブラリーストックを添加し、軌道振盪を伴い、室温で10分間インキュベートした。ファージ上清を抜き取って、別の陰性選択ステップのため、第2のImmuno(商標)試験管に添加した。この方式で、5〜10の陰性選択ステップを行った。
[0215]
各パニング条件について、TN8−IX及びTN12−Iライブラリー(TN8−IXについては5×1011pfu、及びTN12−Iについては1.4×1011pfu)では、約100のランダムライブラリー同等物、直鎖ライブラリー(2.3×1010pfu)では約10のランダムライブラリー同等物を、ライブラリーストックから一定量を分取し、PBST(0.05%Tween−20を含むPBS)で1mlに希釈した。陰性選択用に調製したImmuno(商標)試験管に、1mlの希釈したライブラリーストックを添加し、軌道振盪を伴い、室温で10分間インキュベートした。ファージ上清を抜き取って、別の陰性選択ステップのため、第2のImmuno(商標)試験管に添加した。この方式で、5〜10の陰性選択ステップを行った。
ミオスタチン結合に関する選択
[0216]
上記の最後の陰性選択ステップ後、調製したミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管に、ファージ上清を添加した。軌道振盪を伴い、Immuno(商標)試験管を室温で1時間インキュベートし、特異的ファージがミオスタチンに結合するのを可能にした。3つのライブラリー(TN8−IX、TN12−I、及び直鎖ライブラリー)すべてを用いた、3周期の選択に関して、上清を廃棄した後、2%ミルク−PBSで約15回、PBSTで10回、PBSで2回、Immuno(商標)試験管を洗浄したが、TN8−IX及びTN12−Iのライブラリーの2回目の選択周期に関しては、2%ミルク−PBSで約14回、2%BSA−PBSで2回、PBSTで10回、PBSで1回、Immuno(商標)試験管を洗浄したことが例外であった。
[0216]
上記の最後の陰性選択ステップ後、調製したミオスタチンでコーティングしたImmuno(商標)試験管に、ファージ上清を添加した。軌道振盪を伴い、Immuno(商標)試験管を室温で1時間インキュベートし、特異的ファージがミオスタチンに結合するのを可能にした。3つのライブラリー(TN8−IX、TN12−I、及び直鎖ライブラリー)すべてを用いた、3周期の選択に関して、上清を廃棄した後、2%ミルク−PBSで約15回、PBSTで10回、PBSで2回、Immuno(商標)試験管を洗浄したが、TN8−IX及びTN12−Iのライブラリーの2回目の選択周期に関しては、2%ミルク−PBSで約14回、2%BSA−PBSで2回、PBSTで10回、PBSで1回、Immuno(商標)試験管を洗浄したことが例外であった。
非特異的溶出
[0217]
最後の洗浄ステップ後、1mlの100mMトリエチルアミン溶液(Sigma,St.Louis,Missouri)を添加して、軌道振盪を伴い、10分間インキュベートすることによって、結合したファージをImmuno(商標)試験管から溶出させた。次いで、0.5mlの1Mトリス−HCl(pH7.5)を用いて、ファージ含有溶液のpHを中和した。
[0217]
最後の洗浄ステップ後、1mlの100mMトリエチルアミン溶液(Sigma,St.Louis,Missouri)を添加して、軌道振盪を伴い、10分間インキュベートすることによって、結合したファージをImmuno(商標)試験管から溶出させた。次いで、0.5mlの1Mトリス−HCl(pH7.5)を用いて、ファージ含有溶液のpHを中和した。
結合したファージの受容体(ヒトアクチビン受容体)溶出
[0218]
第2周期及び第3周期で、最後の洗浄ステップ後、1mlの1μMの受容体タンパク質(組換えヒトアクチビン受容体IIB/Fcキメラ、R&D Systems,Inc.、Minneapolis,Minnesota)を添加し、各条件に関して1時間インキュベートすることによって、結合したファージをImmuno(商標)試験管から溶出させた。
[0218]
第2周期及び第3周期で、最後の洗浄ステップ後、1mlの1μMの受容体タンパク質(組換えヒトアクチビン受容体IIB/Fcキメラ、R&D Systems,Inc.、Minneapolis,Minnesota)を添加し、各条件に関して1時間インキュベートすることによって、結合したファージをImmuno(商標)試験管から溶出させた。
結合したファージのプロペプチド溶出
[0219]
第2周期及び第3周期で、最後の洗浄ステップ後、1mlの1μMプロペプチドタンパク質(上述のように作製)を添加し、各条件に関して1時間インキュベートすることによって、結合したファージをImmuno(商標)試験管から溶出させた。
[0219]
第2周期及び第3周期で、最後の洗浄ステップ後、1mlの1μMプロペプチドタンパク質(上述のように作製)を添加し、各条件に関して1時間インキュベートすることによって、結合したファージをImmuno(商標)試験管から溶出させた。
ファージ増幅
[0220]
12.5μg/mlのテトラサイクリンを含有するLB培地中で、新鮮な大腸菌(XL−1Blue MRF’)培養物をOD600=0.5まで増殖させた。各パニング条件について、20mlのこの培養物を氷上で冷却し、遠心分離した。細菌ペレットを、1mlのminA塩溶液に再懸濁した。
[0221]
異なる溶出法由来の各混合物を濃縮細菌試料に添加し、37℃で15分間インキュベートした。2mlのNZCYM培地(2×NZCYM、50μg/mlのアンピシリン)を、各混合物に添加し、37℃で15分間インキュベートした。50μg/mlのアンピシリンを含有する巨大NZCYM寒天プレート上に、得られた4mlの溶液を播種し、37℃で一晩インキュベートした。
[0222]
大型NZCYM寒天プレート上で一晩増殖させた各細菌/ファージ混合物を、35mlのLB培地中に掻き取り、さらなる35mlのLB培地で、寒天プレートをさらにすすいだ。LB培地中の得られた細菌/ファージ混合物を遠心分離して、細菌をペレットにして除いた。50μlのファージ上清を新しい試験管に移し、12.5mlのPEG溶液(20%PEG8000、3.5M酢酸アンモニウム)を添加し、氷上で2時間インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを遠心分離して落とし、6mlのファージ再懸濁緩衝液(250mM NaCl、100mMトリスpH8、1mM EDTA)中に再懸濁した。残りの細菌を遠心分離して除き、1.5mlのPEG溶液を添加することにより、ファージを2回沈殿させることによって、このファージ溶液をさらに精製した。遠心分離ステップ後、ファージペレットを400μlのPBSに再懸濁した。この溶液を最後の遠心分離に供して、残りの細菌破片を取り除いた。標準的プラーク形成アッセイ(Molecular Cloning,Maniatis et al.,3rd Edition)によって、得られたファージ調製物の力価を決定した。
[0220]
12.5μg/mlのテトラサイクリンを含有するLB培地中で、新鮮な大腸菌(XL−1Blue MRF’)培養物をOD600=0.5まで増殖させた。各パニング条件について、20mlのこの培養物を氷上で冷却し、遠心分離した。細菌ペレットを、1mlのminA塩溶液に再懸濁した。
[0221]
異なる溶出法由来の各混合物を濃縮細菌試料に添加し、37℃で15分間インキュベートした。2mlのNZCYM培地(2×NZCYM、50μg/mlのアンピシリン)を、各混合物に添加し、37℃で15分間インキュベートした。50μg/mlのアンピシリンを含有する巨大NZCYM寒天プレート上に、得られた4mlの溶液を播種し、37℃で一晩インキュベートした。
[0222]
大型NZCYM寒天プレート上で一晩増殖させた各細菌/ファージ混合物を、35mlのLB培地中に掻き取り、さらなる35mlのLB培地で、寒天プレートをさらにすすいだ。LB培地中の得られた細菌/ファージ混合物を遠心分離して、細菌をペレットにして除いた。50μlのファージ上清を新しい試験管に移し、12.5mlのPEG溶液(20%PEG8000、3.5M酢酸アンモニウム)を添加し、氷上で2時間インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを遠心分離して落とし、6mlのファージ再懸濁緩衝液(250mM NaCl、100mMトリスpH8、1mM EDTA)中に再懸濁した。残りの細菌を遠心分離して除き、1.5mlのPEG溶液を添加することにより、ファージを2回沈殿させることによって、このファージ溶液をさらに精製した。遠心分離ステップ後、ファージペレットを400μlのPBSに再懸濁した。この溶液を最後の遠心分離に供して、残りの細菌破片を取り除いた。標準的プラーク形成アッセイ(Molecular Cloning,Maniatis et al.,3rd Edition)によって、得られたファージ調製物の力価を決定した。
選択及び増幅のさらなる周期
[0223]
第2の周期において、第1の周期由来の増幅したファージ(1011pfu)を投入ファージとして用いて、選択ステップ及び増幅ステップを行った。次に、第2の周期由来の増幅したファージ(1011pfu)を投入ファージとして用いて、第3の周期の選択及び増幅を行った。第3の周期の溶出ステップ後、溶出したファージの小さな割合を上述のプラーク形成アッセイにおけるように播種した。個々のプラークを摘み取り、各ウェルに100μlのTE緩衝液を含有する96ウェルマイクロタイタープレートに播種した。これらのマスタープレートを4℃で一晩インキュベートして、ファージがTE緩衝液に溶出するのを可能にした。
[0223]
第2の周期において、第1の周期由来の増幅したファージ(1011pfu)を投入ファージとして用いて、選択ステップ及び増幅ステップを行った。次に、第2の周期由来の増幅したファージ(1011pfu)を投入ファージとして用いて、第3の周期の選択及び増幅を行った。第3の周期の溶出ステップ後、溶出したファージの小さな割合を上述のプラーク形成アッセイにおけるように播種した。個々のプラークを摘み取り、各ウェルに100μlのTE緩衝液を含有する96ウェルマイクロタイタープレートに播種した。これらのマスタープレートを4℃で一晩インキュベートして、ファージがTE緩衝液に溶出するのを可能にした。
クローン分析
ファージELISA
[0224]
ファージクローンをファージELISAに供して、次いで配列決定した。以下に論じるように配列をランク付けした。
[0225]
ファージELISAを以下のように行った。OD600が0.5に達するまで、大腸菌XL−1Blue MRF’培養物を増殖させた。30μlのこの培養物を96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分注した。10μlの溶出したファージを各ウェルに添加し、室温で15分間細菌を感染させた。12.5μg/mlのテトラサイクリン及び50μg/mlのアンピシリンを含有する約120μlのLB培地を各ウェルに添加した。次いで、マイクロタイタープレートを振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。ミオスタチンタンパク質(0.1M炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中2μg/ml)で、96ウェルMaxisorp(商標)プレート(NUNC)を、4℃で一晩コーティングした。対照として、別個のMaxisorp(商標)プレートを、PBS中で調製した2%BSAでコーティングした。
[0226]
翌日、タンパク質でコーティングしたMaxisorp(商標)プレート中の液体を廃棄し、PBSで3回洗浄し、各ウェルを、300μlの2%ミルク溶液で、室温で1時間遮断した。ミルク溶液を破棄し、ウェルをPBS溶液で3回洗浄した。最後の洗浄ステップ後、約50μlのPBST−4%のミルクを、タンパク質でコーティングしたMaxisorp(商標)プレートの各ウェルに添加した。96ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルから約50μlの一晩培養物を、ミオスタチンコーティングプレートの対応するウェル及び対照2%BSAコーティングプレートの対応するウェルに移した。2種のプレート中、100μlの混合物を、室温で1時間インキュベートした。Maxisorp(商標)プレートから液体を廃棄し、PBSTで約3回、続いてPBSで2回、ウェルを洗浄した。HRP複合した抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)を約1:7,500に希釈し、100μlの希釈溶液をMaxisorp(商標)プレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。液体を再び廃棄し、PBSTで約3回、続いてPBSで2回、ウェルを洗浄した。100μlのLumiGlo(商標)化学発光基質(KPL)を、Maxisorp(商標)プレートの各ウェルに添加し、反応が起こるように約5分間インキュベートした。Maxisorp(商標)プレートの化学発光単位を、プレート読取装置(Lab System)上で読み取った。
ファージELISA
[0224]
ファージクローンをファージELISAに供して、次いで配列決定した。以下に論じるように配列をランク付けした。
[0225]
ファージELISAを以下のように行った。OD600が0.5に達するまで、大腸菌XL−1Blue MRF’培養物を増殖させた。30μlのこの培養物を96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分注した。10μlの溶出したファージを各ウェルに添加し、室温で15分間細菌を感染させた。12.5μg/mlのテトラサイクリン及び50μg/mlのアンピシリンを含有する約120μlのLB培地を各ウェルに添加した。次いで、マイクロタイタープレートを振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。ミオスタチンタンパク質(0.1M炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中2μg/ml)で、96ウェルMaxisorp(商標)プレート(NUNC)を、4℃で一晩コーティングした。対照として、別個のMaxisorp(商標)プレートを、PBS中で調製した2%BSAでコーティングした。
[0226]
翌日、タンパク質でコーティングしたMaxisorp(商標)プレート中の液体を廃棄し、PBSで3回洗浄し、各ウェルを、300μlの2%ミルク溶液で、室温で1時間遮断した。ミルク溶液を破棄し、ウェルをPBS溶液で3回洗浄した。最後の洗浄ステップ後、約50μlのPBST−4%のミルクを、タンパク質でコーティングしたMaxisorp(商標)プレートの各ウェルに添加した。96ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルから約50μlの一晩培養物を、ミオスタチンコーティングプレートの対応するウェル及び対照2%BSAコーティングプレートの対応するウェルに移した。2種のプレート中、100μlの混合物を、室温で1時間インキュベートした。Maxisorp(商標)プレートから液体を廃棄し、PBSTで約3回、続いてPBSで2回、ウェルを洗浄した。HRP複合した抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)を約1:7,500に希釈し、100μlの希釈溶液をMaxisorp(商標)プレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。液体を再び廃棄し、PBSTで約3回、続いてPBSで2回、ウェルを洗浄した。100μlのLumiGlo(商標)化学発光基質(KPL)を、Maxisorp(商標)プレートの各ウェルに添加し、反応が起こるように約5分間インキュベートした。Maxisorp(商標)プレートの化学発光単位を、プレート読取装置(Lab System)上で読み取った。
ファージクローンの配列決定
[0227]
各ファージクローンに関して、PCR法によって配列決定テンプレートを調製した。以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、500ヌクレオチド断片を増幅した:プライマー#1:5’−CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG−3’(配列番号294)及びプライマー#2:5’−CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC−3’(配列番号295)。各クローンに関して、以下の混合物を調製した。
[0227]
各ファージクローンに関して、PCR法によって配列決定テンプレートを調製した。以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、500ヌクレオチド断片を増幅した:プライマー#1:5’−CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG−3’(配列番号294)及びプライマー#2:5’−CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC−3’(配列番号295)。各クローンに関して、以下の混合物を調製した。
[0228]
サーモサイクラー(GeneAmp PCR系9700、Applied Biosystem)を用いて、以下のプログラムを実行した:[94℃5分、94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒]×30サイクル;72℃7分;4℃に冷却。製造者のプロトコルに従って、QIAquickマルチウェルPCR精製キット(Qiagen)を用いて、各反応由来のPCR産物を清浄にした。10μlの各PCR反応物を、1μlの染料(10×BBXSアガロースゲル装填色素)と混合して、1%アガロースゲル上で泳動することによって、PCRの清浄化産物を確認した。次いで、製造者が推奨するプロトコルに従って、ABI377配列決定装置(Perkin Elmer)を用いて、残りの産物を配列決定した。
サーモサイクラー(GeneAmp PCR系9700、Applied Biosystem)を用いて、以下のプログラムを実行した:[94℃5分、94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒]×30サイクル;72℃7分;4℃に冷却。製造者のプロトコルに従って、QIAquickマルチウェルPCR精製キット(Qiagen)を用いて、各反応由来のPCR産物を清浄にした。10μlの各PCR反応物を、1μlの染料(10×BBXSアガロースゲル装填色素)と混合して、1%アガロースゲル上で泳動することによって、PCRの清浄化産物を確認した。次いで、製造者が推奨するプロトコルに従って、ABI377配列決定装置(Perkin Elmer)を用いて、残りの産物を配列決定した。
配列ランク付け及び分析
[0229]
ヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列をELISAデータと相関させた。ミオスタチンでコーティングしたウェル中で高い化学発光単位を、2%BSAでコーティングしたウェル中で低い化学発光単位を示したクローンを特定した。複数回生じた配列を特定した。これらの基準に基づいて選択した候補配列を、ペプチボディとしてさらなる分析に供した。およそ1200の個々のクローンを分析した。本発明のペプチボディを生成するために、これらのうち、132のペプチドを選択した。これらを以下の表Iに示す。配列番号1〜129を有するペプチドを用いて、同一名のペプチボディを生成した。表Iに示される配列番号130〜141を有するペプチドは、リンカー配列によって付着された、配列番号1〜132からの2つ以上のペプチドを含む。配列番号130〜141を、同一名のペプチボディを生成するのにも用いた。
[0230]
ペプチドのTN−8由来群に関してコンセンサス配列を決定した。これらは以下の通りである:
KDXCXXWHWMCKPX(配列番号142)
WXXCXXXGFWCXNX(配列番号143)
IXGCXWWDXXCYXX(配列番号144)
XXWCVSPXWFCXXX(配列番号145)
XXXCPWFAXXCVDW(配列番号146)
[0231]
上記コンセンサス配列のすべてに関して、各コンセンサス配列の下線の「コア配列」は、常にその位置で生じるアミノ酸である。「X」は、任意の天然存在または修飾アミノ酸を指す。コア配列とともに含有される2つのシステインは、TN8−IXライブラリーにおける固定アミノ酸である。
[0229]
ヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列をELISAデータと相関させた。ミオスタチンでコーティングしたウェル中で高い化学発光単位を、2%BSAでコーティングしたウェル中で低い化学発光単位を示したクローンを特定した。複数回生じた配列を特定した。これらの基準に基づいて選択した候補配列を、ペプチボディとしてさらなる分析に供した。およそ1200の個々のクローンを分析した。本発明のペプチボディを生成するために、これらのうち、132のペプチドを選択した。これらを以下の表Iに示す。配列番号1〜129を有するペプチドを用いて、同一名のペプチボディを生成した。表Iに示される配列番号130〜141を有するペプチドは、リンカー配列によって付着された、配列番号1〜132からの2つ以上のペプチドを含む。配列番号130〜141を、同一名のペプチボディを生成するのにも用いた。
[0230]
ペプチドのTN−8由来群に関してコンセンサス配列を決定した。これらは以下の通りである:
KDXCXXWHWMCKPX(配列番号142)
WXXCXXXGFWCXNX(配列番号143)
IXGCXWWDXXCYXX(配列番号144)
XXWCVSPXWFCXXX(配列番号145)
XXXCPWFAXXCVDW(配列番号146)
[0231]
上記コンセンサス配列のすべてに関して、各コンセンサス配列の下線の「コア配列」は、常にその位置で生じるアミノ酸である。「X」は、任意の天然存在または修飾アミノ酸を指す。コア配列とともに含有される2つのシステインは、TN8−IXライブラリーにおける固定アミノ酸である。
実施例2:ペプチボディの生成
ペプチド−Fc融合タンパク質をコードするDNAの構築
[0232]
ミオスタチンに結合可能なペプチドを、単独でまたは互いに組み合わせて用いて、ペプチドがヒトIgG1のFcドメインに融合した、融合タンパク質を構築した。各ペプチボディのFc部分のアミノ酸配列は以下の通りである(アミノ末端からカルボキシル末端):
ペプチド−Fc融合タンパク質をコードするDNAの構築
[0232]
ミオスタチンに結合可能なペプチドを、単独でまたは互いに組み合わせて用いて、ペプチドがヒトIgG1のFcドメインに融合した、融合タンパク質を構築した。各ペプチボディのFc部分のアミノ酸配列は以下の通りである(アミノ末端からカルボキシル末端):
[0233]
ペプチドをN配置で融合させた(ペプチドをFc領域のN末端に結合させた)か、C配置で融合させた(ペプチドをFc領域のC末端に結合させた)か、またはN、C配置で融合させた(ペプチドをFc領域のN末端及びC末端の両方に結合させた)。別個のベクターを用いて、N末端融合体及びC末端融合体を発現させた。選択したファージ核酸に、オリゴヌクレオチド対(「オリゴ」)をアニーリングさせ、ペプチドをコードする二本鎖ヌクレオチド配列を生成することによって、各ペプチボディを構築した。これらのポリヌクレオチド分子をApaLからXhoIの断片として構築した。この断片を、あらかじめApaLI及びXhoIで消化した、N末端配向用のpAMG21−Fc N末端ベクターに、またはC末端配向用のpAMG21−Fc−C末端ベクターに連結した。標準手順を用い、エレクトロポレーションによって、得られた連結混合物で、大腸菌株2596細胞または4167細胞(株2596細胞のhsdR−変異体)を形質転換した。組換えタンパク質産物を産生し、正しいヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を所持する能力に関して、クローンをスクリーニングした。修飾ペプチド各々に関して、単一のそのようなクローンを選択した。
[0234]
pAMG21−2×Bs−N(ZeoR)Fcと称される別のベクターを用いて、構築物の多くを生成した。このベクターは、ベクター消化をBsmBIで行ったことを除いて、上記ベクターと類似である。いくつかの構築物では、ペプチド配列をFcの両端で融合させた。これらの場合、ベクターは、pAMG21−2×Bs−N(ZeoR)Fc及びpAMG21−2×Bs−C−Fcの複合体であった。
[0235]
pAMG21の構築
公開された国際特許出願第WO00/24782号に記載される手順に従って、発現ベクターpCFM1656(ATCC番号69576)及び米国特許第4,710,473号に記載される発現ベクター系から、発現プラスミドpAMG21(ATCC番号98113)を得、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
ペプチドをN配置で融合させた(ペプチドをFc領域のN末端に結合させた)か、C配置で融合させた(ペプチドをFc領域のC末端に結合させた)か、またはN、C配置で融合させた(ペプチドをFc領域のN末端及びC末端の両方に結合させた)。別個のベクターを用いて、N末端融合体及びC末端融合体を発現させた。選択したファージ核酸に、オリゴヌクレオチド対(「オリゴ」)をアニーリングさせ、ペプチドをコードする二本鎖ヌクレオチド配列を生成することによって、各ペプチボディを構築した。これらのポリヌクレオチド分子をApaLからXhoIの断片として構築した。この断片を、あらかじめApaLI及びXhoIで消化した、N末端配向用のpAMG21−Fc N末端ベクターに、またはC末端配向用のpAMG21−Fc−C末端ベクターに連結した。標準手順を用い、エレクトロポレーションによって、得られた連結混合物で、大腸菌株2596細胞または4167細胞(株2596細胞のhsdR−変異体)を形質転換した。組換えタンパク質産物を産生し、正しいヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を所持する能力に関して、クローンをスクリーニングした。修飾ペプチド各々に関して、単一のそのようなクローンを選択した。
[0234]
pAMG21−2×Bs−N(ZeoR)Fcと称される別のベクターを用いて、構築物の多くを生成した。このベクターは、ベクター消化をBsmBIで行ったことを除いて、上記ベクターと類似である。いくつかの構築物では、ペプチド配列をFcの両端で融合させた。これらの場合、ベクターは、pAMG21−2×Bs−N(ZeoR)Fc及びpAMG21−2×Bs−C−Fcの複合体であった。
[0235]
pAMG21の構築
公開された国際特許出願第WO00/24782号に記載される手順に従って、発現ベクターpCFM1656(ATCC番号69576)及び米国特許第4,710,473号に記載される発現ベクター系から、発現プラスミドpAMG21(ATCC番号98113)を得、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
Fc N末端ベクター
[0236]
テンプレートとしてpAMG21Fc_Gly5_Tpoベクターを用いて、Fc N末端ベクターを構築した。5’PCRプライマー(以下)を設計して、pAMG Tpo Gly5のTpoペプチド配列を除去し、ApaLI及びXhoI部位を含有するポリリンカーと交換した。このベクターをテンプレートとして用い、以下の5’プライマー及び普遍的3’プライマーを用いて、Expand LongポリメラーゼでPCRを行った。
[0236]
テンプレートとしてpAMG21Fc_Gly5_Tpoベクターを用いて、Fc N末端ベクターを構築した。5’PCRプライマー(以下)を設計して、pAMG Tpo Gly5のTpoペプチド配列を除去し、ApaLI及びXhoI部位を含有するポリリンカーと交換した。このベクターをテンプレートとして用い、以下の5’プライマー及び普遍的3’プライマーを用いて、Expand LongポリメラーゼでPCRを行った。
[0237]
得られたPCR産物をゲル精製し、制限酵素NdeI及びBsrGIで消化した。Qiagen(Chatsworth,CA)ゲル精製スピンカラムを介して、プラスミド、及びそのリンカーとともに対象となるペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方をゲル精製した。次いで、標準的な連結手順を用いて、プラスミド及び挿入物を連結し、得られた連結混合物を大腸菌(株2596)細胞に形質転換した。単一クローンを選択し、DNA配列決定を行った。正しいクローンを特定し、本明細書に記載される修飾されたペプチドのベクター供給源としてこれを用いた。
得られたPCR産物をゲル精製し、制限酵素NdeI及びBsrGIで消化した。Qiagen(Chatsworth,CA)ゲル精製スピンカラムを介して、プラスミド、及びそのリンカーとともに対象となるペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方をゲル精製した。次いで、標準的な連結手順を用いて、プラスミド及び挿入物を連結し、得られた連結混合物を大腸菌(株2596)細胞に形質転換した。単一クローンを選択し、DNA配列決定を行った。正しいクローンを特定し、本明細書に記載される修飾されたペプチドのベクター供給源としてこれを用いた。
Fc C末端ベクターの構築
[0238]
テンプレートとしてpAMG21Fc_Gly5_Tpoベクターを用いて、Fc C末端ベクターを構築した。3’PCRプライマーを設計して、Tpoペプチド配列を除去し、ApaLI及びXhoI部位を含有するポリリンカーと交換した。普遍的5’プライマー及び3’プライマーを用いて、Expand LongポリメラーゼでPCRを行った。
5’プライマー:5’−CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG−3’(配列番号299)
3’プライマー:5’−TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCT
TTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC−3’(配列番号300)
[0239]
得られたPCR産物をゲル精製し、制限酵素BsrGI及びBamHIで消化した。Qiagenゲル精製スピンカラムを介して、プラスミド、及びそのリンカーとともに対象となる各々のペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方をゲル精製した。次いで、標準的な連結手順を用いて、プラスミド及び挿入物を連結し、得られた連結混合物を大腸菌(株2596)細胞に形質転換した。株2596(ATCC#202174)は、luxプロモーター、ならびに2つのラムダ温度感受性リプレッサー、cI857s7及びlac IQリプレッサーを含有するように修飾された大腸菌K−12株である。単一クローンを選択し、DNA配列決定を行った。正しいクローンを特定し、本明細書に記載される各ペプチボディの供給源として用いた。
[0238]
テンプレートとしてpAMG21Fc_Gly5_Tpoベクターを用いて、Fc C末端ベクターを構築した。3’PCRプライマーを設計して、Tpoペプチド配列を除去し、ApaLI及びXhoI部位を含有するポリリンカーと交換した。普遍的5’プライマー及び3’プライマーを用いて、Expand LongポリメラーゼでPCRを行った。
5’プライマー:5’−CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG−3’(配列番号299)
3’プライマー:5’−TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCT
TTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC−3’(配列番号300)
[0239]
得られたPCR産物をゲル精製し、制限酵素BsrGI及びBamHIで消化した。Qiagenゲル精製スピンカラムを介して、プラスミド、及びそのリンカーとともに対象となる各々のペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方をゲル精製した。次いで、標準的な連結手順を用いて、プラスミド及び挿入物を連結し、得られた連結混合物を大腸菌(株2596)細胞に形質転換した。株2596(ATCC#202174)は、luxプロモーター、ならびに2つのラムダ温度感受性リプレッサー、cI857s7及びlac IQリプレッサーを含有するように修飾された大腸菌K−12株である。単一クローンを選択し、DNA配列決定を行った。正しいクローンを特定し、本明細書に記載される各ペプチボディの供給源として用いた。
大腸菌における発現
[0240]
Terrificブロス培地(前述のSambrookらの参考文献に引用される、Tartof and Hobbs,“Improved media for growing plasmid and cosmid clones”,Bethesda Research Labs Focus,Volume9,page12,1987を参照のこと)中、37℃で、大腸菌株2596中の各々のpAMG21−Fc融合構築物の培養物を増殖させた。合成自己誘導剤(autoinducer)、N−(3−オキソヘキサノイル)−DL−ホモセリンラクトンを、1ミリリットルあたり20ナノグラム(ng/ml)の最終濃度になるように、培養培地に添加した後、luxPRプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導が達成された。培養物を37℃でさらに6時間インキュベートした。次いで、封入体の存在に関して、細菌培養物を顕微鏡によって検査し、遠心分離によって収集した。誘導した培養物中に、屈折(refractile)封入体が観察されたことから、大腸菌の不溶性画分でFc融合体が産生された可能性が最も高いことが示された。10%β−メルカプトエタノールを含有するLaemmli試料緩衝液に直接再懸濁することによって細胞ペレットを溶解し、SDS−PAGEによって分析した。大部分の場合、SDS−PAGEゲル上に、適切な分子量の強いクマシー染色されたバンドが観察された。
[0240]
Terrificブロス培地(前述のSambrookらの参考文献に引用される、Tartof and Hobbs,“Improved media for growing plasmid and cosmid clones”,Bethesda Research Labs Focus,Volume9,page12,1987を参照のこと)中、37℃で、大腸菌株2596中の各々のpAMG21−Fc融合構築物の培養物を増殖させた。合成自己誘導剤(autoinducer)、N−(3−オキソヘキサノイル)−DL−ホモセリンラクトンを、1ミリリットルあたり20ナノグラム(ng/ml)の最終濃度になるように、培養培地に添加した後、luxPRプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導が達成された。培養物を37℃でさらに6時間インキュベートした。次いで、封入体の存在に関して、細菌培養物を顕微鏡によって検査し、遠心分離によって収集した。誘導した培養物中に、屈折(refractile)封入体が観察されたことから、大腸菌の不溶性画分でFc融合体が産生された可能性が最も高いことが示された。10%β−メルカプトエタノールを含有するLaemmli試料緩衝液に直接再懸濁することによって細胞ペレットを溶解し、SDS−PAGEによって分析した。大部分の場合、SDS−PAGEゲル上に、適切な分子量の強いクマシー染色されたバンドが観察された。
ペプチボディのフォールディング及び精製
[0241]
高圧ホモジナイズ(15,000PSIで3パス)によって、水中(体積当たり1/10体積)で細胞を破壊し、遠心分離(J−6B中4000RPMで30分間)によって封入体を採取した。6Mグアニジン、50mMトリス、8mM DTT、pH8.0中、1/10の比で、周囲温度で1時間、封入体を可溶化した。可溶化した混合物を、4M尿素、20%グリセロール、50mMトリス、160mMアルギニン、3mMシステイン、1mMシスタミン、pH8.5に25倍に希釈した。混合物を低温中で一晩インキュベートした。次いで、10mMトリスpH8.5、50mM NaCl、1.5M尿素に対して、混合物を透析した。一晩透析した後、透析物のpHを酢酸でpH5に調整した。遠心分離によって沈殿物を除去し、10mM NaAc、50mM NaCl、pH5で平衡化したSP−Sepharose Fast Flowカラムに、上清を4℃)で装填した。装填後、カラムを、10mM NaAc、50mM NaCl、pH5.2で洗浄してベースラインにした。20カラム体積の、酢酸緩衝液中の50mM〜500mMのNaCl勾配で、カラムを展開した。あるいは、ベースラインまで洗浄した後、5カラム体積の10mMリン酸ナトリウムpH7.0でカラムを洗浄し、15カラム体積の、リン酸塩緩衝液中の0〜400mMのNaCl勾配で、カラムを展開した。カラム画分をSDS−PAGEによって分析した。二量体ペプチボディを含有する画分をプールした。ゲル濾過によっても画分を分析し、凝集物が存在するかどうかを決定した。
[0242]
表Iのペプチドから多くのペプチボディを調製した。ペプチドをヒトIgG1Fc分子に結合させて、表IIのペプチボディを形成した。表IIのペプチボディに関して、C配置は、指定のペプチドが、FcのC末端に結合したことを示す。N配置は、指定のペプチドが、FcのN末端に結合したことを示す。N,C配置は、1つのペプチドが各Fc分子のN末端に、1つがC末端に結合したことを示す。2×の表示は、指定の2つのペプチドが、示したリンカーによって分離されて、互いにタンデムに結合し、そしてまた、FcのN末端またはC末端に、あるいはN、C両末端に結合したことを示す。リンカーによって分離されてタンデムに結合した2つのペプチドは、例えば、ミオスタチン−TN8−29−19−8gと示され、これは、TN8−29ペプチドが(gly)8リンカーを介して、TN8−19ペプチドに結合したことを示す。特に明記しない限り、ペプチド(複数を含む)は、(gly)5リンカー配列を介して、Fcに結合した。いくつかの場合、ペプチド(複数を含む)は、kリンカーを介して結合した。kまたは1kと示されるリンカーは、gsgsatggsgstassgsgsatg(配列番号301)リンカー配列を指し、kcは、FcのC末端に結合したリンカーを指し、knは、FcのN末端に結合したリンカーを指す。以下の表IIにおいて、第4列は、Fcを第1のペプチドに結合するリンカー配列を指し、第5列は、配置NもしくはCまたは両方を指す。
[0243]
Fc分子は溶液中で二量体化するため、1つのペプチドを有するように構築されたペプチボディは、実際には、2コピーのペプチド及び2つのFc分子を持つ二量体であり、タンデムに2つのペプチドを有する2×型は、実際には、4コピーのペプチド及び2つのFc分子を持つ二量体であろう。
[0244]
表IIに示すペプチボディは、大腸菌で発現されるため、最初のアミノ酸残基はMet(M)である。したがって、N配置のペプチボディは、例えば、Met−ペプチド−リンカー−FcまたはMet−ペプチド−リンカー−ペプチド−リンカー−Fcである。C配置のペプチボディは、例えば、Met−Fc−リンカー−ペプチドまたはMet−Fc−リンカー−ペプチド−リンカー−ペプチドである。C,N配置のペプチボディは、両方の組み合わせ、例えば、Met−ペプチド−リンカー−Fc−リンカー−ペプチドである。
[0245]
典型的なペプチボディをコードするヌクレオチド配列を以下の表IIに提供する。本発明の典型的なペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列には、以下のようなFcポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる:
[0241]
高圧ホモジナイズ(15,000PSIで3パス)によって、水中(体積当たり1/10体積)で細胞を破壊し、遠心分離(J−6B中4000RPMで30分間)によって封入体を採取した。6Mグアニジン、50mMトリス、8mM DTT、pH8.0中、1/10の比で、周囲温度で1時間、封入体を可溶化した。可溶化した混合物を、4M尿素、20%グリセロール、50mMトリス、160mMアルギニン、3mMシステイン、1mMシスタミン、pH8.5に25倍に希釈した。混合物を低温中で一晩インキュベートした。次いで、10mMトリスpH8.5、50mM NaCl、1.5M尿素に対して、混合物を透析した。一晩透析した後、透析物のpHを酢酸でpH5に調整した。遠心分離によって沈殿物を除去し、10mM NaAc、50mM NaCl、pH5で平衡化したSP−Sepharose Fast Flowカラムに、上清を4℃)で装填した。装填後、カラムを、10mM NaAc、50mM NaCl、pH5.2で洗浄してベースラインにした。20カラム体積の、酢酸緩衝液中の50mM〜500mMのNaCl勾配で、カラムを展開した。あるいは、ベースラインまで洗浄した後、5カラム体積の10mMリン酸ナトリウムpH7.0でカラムを洗浄し、15カラム体積の、リン酸塩緩衝液中の0〜400mMのNaCl勾配で、カラムを展開した。カラム画分をSDS−PAGEによって分析した。二量体ペプチボディを含有する画分をプールした。ゲル濾過によっても画分を分析し、凝集物が存在するかどうかを決定した。
[0242]
表Iのペプチドから多くのペプチボディを調製した。ペプチドをヒトIgG1Fc分子に結合させて、表IIのペプチボディを形成した。表IIのペプチボディに関して、C配置は、指定のペプチドが、FcのC末端に結合したことを示す。N配置は、指定のペプチドが、FcのN末端に結合したことを示す。N,C配置は、1つのペプチドが各Fc分子のN末端に、1つがC末端に結合したことを示す。2×の表示は、指定の2つのペプチドが、示したリンカーによって分離されて、互いにタンデムに結合し、そしてまた、FcのN末端またはC末端に、あるいはN、C両末端に結合したことを示す。リンカーによって分離されてタンデムに結合した2つのペプチドは、例えば、ミオスタチン−TN8−29−19−8gと示され、これは、TN8−29ペプチドが(gly)8リンカーを介して、TN8−19ペプチドに結合したことを示す。特に明記しない限り、ペプチド(複数を含む)は、(gly)5リンカー配列を介して、Fcに結合した。いくつかの場合、ペプチド(複数を含む)は、kリンカーを介して結合した。kまたは1kと示されるリンカーは、gsgsatggsgstassgsgsatg(配列番号301)リンカー配列を指し、kcは、FcのC末端に結合したリンカーを指し、knは、FcのN末端に結合したリンカーを指す。以下の表IIにおいて、第4列は、Fcを第1のペプチドに結合するリンカー配列を指し、第5列は、配置NもしくはCまたは両方を指す。
[0243]
Fc分子は溶液中で二量体化するため、1つのペプチドを有するように構築されたペプチボディは、実際には、2コピーのペプチド及び2つのFc分子を持つ二量体であり、タンデムに2つのペプチドを有する2×型は、実際には、4コピーのペプチド及び2つのFc分子を持つ二量体であろう。
[0244]
表IIに示すペプチボディは、大腸菌で発現されるため、最初のアミノ酸残基はMet(M)である。したがって、N配置のペプチボディは、例えば、Met−ペプチド−リンカー−FcまたはMet−ペプチド−リンカー−ペプチド−リンカー−Fcである。C配置のペプチボディは、例えば、Met−Fc−リンカー−ペプチドまたはMet−Fc−リンカー−ペプチド−リンカー−ペプチドである。C,N配置のペプチボディは、両方の組み合わせ、例えば、Met−ペプチド−リンカー−Fc−リンカー−ペプチドである。
[0245]
典型的なペプチボディをコードするヌクレオチド配列を以下の表IIに提供する。本発明の典型的なペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列には、以下のようなFcポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる:
[0246]
さらに、以下のような5つのグリシンgggggリンカーをコードするポリヌクレオチドが含まれる:
5’−GGTGGAGGTGGTGGT−3’(配列番号302)
[0247]
ペプチボディをコードするポリヌクレオチドにはまた、メチオニンをコードするコドンATG及びTAA等の停止コドンも含まれる。
[0248]
したがって、表IIの第1のペプチボディの構造は、以下のような、C配置及び(gly)5リンカーを持つTN8−Con1である:M−Fc−GGGGG−KDKCKMWHWMCKPP(配列番号303)。このペプチボディをコードする典型的なポリヌクレオチドは:
5’−ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTAAGACAAATGCAAAATGTGGCACTGGATGTGCAAACCGCCG−3’(配列番号304)であろう。
さらに、以下のような5つのグリシンgggggリンカーをコードするポリヌクレオチドが含まれる:
5’−GGTGGAGGTGGTGGT−3’(配列番号302)
[0247]
ペプチボディをコードするポリヌクレオチドにはまた、メチオニンをコードするコドンATG及びTAA等の停止コドンも含まれる。
[0248]
したがって、表IIの第1のペプチボディの構造は、以下のような、C配置及び(gly)5リンカーを持つTN8−Con1である:M−Fc−GGGGG−KDKCKMWHWMCKPP(配列番号303)。このペプチボディをコードする典型的なポリヌクレオチドは:
5’−ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTAAGACAAATGCAAAATGTGGCACTGGATGTGCAAACCGCCG−3’(配列番号304)であろう。
実施例3:インビトロアッセイ
C2C12細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ
[0249]
本アッセイは、ミオスタチンの受容体への結合を阻害する度合いを測定することによって試験される、阻害剤のミオスタチン中和能を示す。
[0250]
C2C12筋芽細胞(ATCC番号:CRL−1772)をpMARE−luc構築物でトランスフェクションすることによってミオスタチン応答性受容体細胞株を生成した。ミオスタチン/アクチビン応答要素(Dennler et al.EMBO17:3091−3100(1998))を表すCAGA配列の12の反復を、TATAボックスの上流で、pLuc−MCSレポーターベクター(Stratageneカタログ番号219087)内にクローニングすることによって、pMARE−luc構築物を作製した。筋芽細胞C2C12細胞は、天然に、その細胞表面上に、ミオスタチン/アクチビン受容体を発現する。ミオスタチンが細胞受容体に結合すると、Smad経路が活性化され、リン酸化されたSmadが応答要素に結合し(Macias−Silva et al.Cell87:1215(1996))、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を生じる。次いで、製造業者のプロトコルに従って、市販のルシフェラーゼレポーターアッセイキット(カタログ番号E4550、Promega,Madison,WI)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定する。pMARE−lucでトランスフェクションされた安定株のC2C12細胞(C2C12/pMAREクローン#44)を用い、以下の方法に従って、ミオスタチン活性を測定した。
[0251]
同数のレポーター細胞(C2C12/pMAREクローン#44)を96ウェル培地に播種した。4nMで固定したミオスタチン濃度で、ペプチボディの2つの希釈を用いて、最初の周期のスクリーニングを行った。組換え成熟ミオスタチンを、それぞれ、40nM及び400nMのペプチボディと、室温で2時間、プレインキュベートした。レポーター細胞培養物を、ペプチボディを含み、または含まず、ミオスタチンで6時間処理した。処理した培養物において、ルシフェラーゼ活性を決定することによって、ミオスタチン活性を測定した。初めに、このアッセイを用いて、レポーターアッセイにおいて、ミオスタチンシグナル伝達活性を阻害したペプチボディヒットを特定した。続いて、4nMに固定したミオスタチン濃度で、9点の滴定曲線を生成した。レポーター細胞培養物に混合物を添加する前に、ミオスタチンを、9つの濃度:0.04mM、0.4nM、4nM、20nM、40nM、200nM、400nM、2μM、及び4μMのペプチボディの各々と2時間、プレインキュベートした。いくつかの典型的なペプチボディのIC50値を表IIIに提供し、親和性成熟ペプチボディに関しては、表VIIIに提供する。
C2C12細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ
[0249]
本アッセイは、ミオスタチンの受容体への結合を阻害する度合いを測定することによって試験される、阻害剤のミオスタチン中和能を示す。
[0250]
C2C12筋芽細胞(ATCC番号:CRL−1772)をpMARE−luc構築物でトランスフェクションすることによってミオスタチン応答性受容体細胞株を生成した。ミオスタチン/アクチビン応答要素(Dennler et al.EMBO17:3091−3100(1998))を表すCAGA配列の12の反復を、TATAボックスの上流で、pLuc−MCSレポーターベクター(Stratageneカタログ番号219087)内にクローニングすることによって、pMARE−luc構築物を作製した。筋芽細胞C2C12細胞は、天然に、その細胞表面上に、ミオスタチン/アクチビン受容体を発現する。ミオスタチンが細胞受容体に結合すると、Smad経路が活性化され、リン酸化されたSmadが応答要素に結合し(Macias−Silva et al.Cell87:1215(1996))、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を生じる。次いで、製造業者のプロトコルに従って、市販のルシフェラーゼレポーターアッセイキット(カタログ番号E4550、Promega,Madison,WI)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定する。pMARE−lucでトランスフェクションされた安定株のC2C12細胞(C2C12/pMAREクローン#44)を用い、以下の方法に従って、ミオスタチン活性を測定した。
[0251]
同数のレポーター細胞(C2C12/pMAREクローン#44)を96ウェル培地に播種した。4nMで固定したミオスタチン濃度で、ペプチボディの2つの希釈を用いて、最初の周期のスクリーニングを行った。組換え成熟ミオスタチンを、それぞれ、40nM及び400nMのペプチボディと、室温で2時間、プレインキュベートした。レポーター細胞培養物を、ペプチボディを含み、または含まず、ミオスタチンで6時間処理した。処理した培養物において、ルシフェラーゼ活性を決定することによって、ミオスタチン活性を測定した。初めに、このアッセイを用いて、レポーターアッセイにおいて、ミオスタチンシグナル伝達活性を阻害したペプチボディヒットを特定した。続いて、4nMに固定したミオスタチン濃度で、9点の滴定曲線を生成した。レポーター細胞培養物に混合物を添加する前に、ミオスタチンを、9つの濃度:0.04mM、0.4nM、4nM、20nM、40nM、200nM、400nM、2μM、及び4μMのペプチボディの各々と2時間、プレインキュベートした。いくつかの典型的なペプチボディのIC50値を表IIIに提供し、親和性成熟ペプチボディに関しては、表VIIIに提供する。
BIAcore(登録商標)アッセイ
[0252]
センサーチップCM5、及びランニング緩衝液として、0.005パーセントのP20界面活性剤(Biacore,Inc.)を用いて、BIAcore(登録商標)3000(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)装置上で、各候補ミオスタチンペプチボディの親和性分析を行った。製造業者の示唆するプロトコルに従って、アミンカップリングキット(Biacore,Inc.)を用い、一級アミン基を介して、研究用品質のCM5センサーチップ(Biacore,Inc.)に、組換え成熟ミオスタチンタンパク質を固定化した。
[0253]
直接結合アッセイを用いて、ペプチボディをスクリーニングし、固定化ミオスタチンに結合する能力の順にランク付けした。2つの濃度(40及び400nM)の各候補ミオスタチン結合ペプチボディを、流速50μl/分で3分間、固定化ミオスタチン表面に注入することによって、結合アッセイを行った。3分間解離させた後、表面を再生成した。結合シグナル強度に関して、ならびに解離速度に関して、結合曲線を定性的に比較した。BIA evaluation3.1コンピュータプログラム(Biacore,Inc.)を用いて、ka(会合速度定数)、kd(解離速度定数)、及びKD(解離平衡定数)を含むペプチボディ結合動力学パラメータを決定した。解離平衡定数(nMで表す)が低いほど、ミオスタチンに対するペプチボディの親和性が高くなる。ペプチボディKD値の例を表IIIに示し、以下の親和性成熟ペプチボディに関しては、表VIに示す。
[0252]
センサーチップCM5、及びランニング緩衝液として、0.005パーセントのP20界面活性剤(Biacore,Inc.)を用いて、BIAcore(登録商標)3000(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)装置上で、各候補ミオスタチンペプチボディの親和性分析を行った。製造業者の示唆するプロトコルに従って、アミンカップリングキット(Biacore,Inc.)を用い、一級アミン基を介して、研究用品質のCM5センサーチップ(Biacore,Inc.)に、組換え成熟ミオスタチンタンパク質を固定化した。
[0253]
直接結合アッセイを用いて、ペプチボディをスクリーニングし、固定化ミオスタチンに結合する能力の順にランク付けした。2つの濃度(40及び400nM)の各候補ミオスタチン結合ペプチボディを、流速50μl/分で3分間、固定化ミオスタチン表面に注入することによって、結合アッセイを行った。3分間解離させた後、表面を再生成した。結合シグナル強度に関して、ならびに解離速度に関して、結合曲線を定性的に比較した。BIA evaluation3.1コンピュータプログラム(Biacore,Inc.)を用いて、ka(会合速度定数)、kd(解離速度定数)、及びKD(解離平衡定数)を含むペプチボディ結合動力学パラメータを決定した。解離平衡定数(nMで表す)が低いほど、ミオスタチンに対するペプチボディの親和性が高くなる。ペプチボディKD値の例を表IIIに示し、以下の親和性成熟ペプチボディに関しては、表VIに示す。
ActRIIB/Fc表面上の遮断アッセイ
[0254]
固定化ActRIIB/Fc(R&D Systems、Minneapolis,MN)及びミオスタチンを用いて、ペプチボディの存在下及び非存在下、BIAcore(登録商標)アッセイ系で、遮断アッセイを行った。アッセイを用いて、非中和(ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を妨げないもの)または中和(ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を妨げるもの)として、ペプチボディを分類した。初めに、いかなるペプチボディも存在しない、ベースラインのミオスタチン−ActRIIB/Fc結合を決定した。
[0255]
初期スクリーニング研究には、ペプチボディを、試料緩衝液中、4nM、40nM、及び400nMに希釈し、4nMミオスタチン(同様に、試料緩衝液中で希釈する)とインキュベートした。ペプチボディ:リガンド混合物が、室温で平衡に達するようにし(少なくとも5時間)、次いで、流速10μl/分で、20〜30分間、固定化ActRIIB/Fc表面上に注入した。結合反応の増加(ペプチボディを含まない対照の結合を越える)は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が非中和性であることを示した。結合反応の減少(対照と比較)は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が、ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を遮断することを示した。IC50値(中和ペプチボディ)またはEC50(非中和ペプチボディ)を得るために、全濃度系列の遮断アッセイを用いて、選択したペプチボディをさらに特徴付けた。ペプチボディ試料を、200nMから0.05mMまで試料緩衝液中で連続希釈して、4mMミオスタチンと、室温で平衡に達するまで(最小5時間)インキュベートした後、流速10μl/分で20〜30分間、固定化ActRIIB/Fc表面上に注入した。試料注入後、結合したリガンドを3分間、受容体から解離させた。ペプチボディ濃度に対して結合シグナルをプロットし、4nMミオスタチンの存在下で、各ペプチボディのIC50値を計算した。例えば、ペプチボディTN8−19、L2、及びL17は、細胞に基づくアッセイにおいて、ミオスタチン活性を阻害するが、TN−8−19の結合は、ミオスタチン/ActRIIB/Fc相互作用を遮断しないことから、TN−8−19が、他の2つのペプチボディで観察されるものとは異なるエピトープに結合することが示された。
[0254]
固定化ActRIIB/Fc(R&D Systems、Minneapolis,MN)及びミオスタチンを用いて、ペプチボディの存在下及び非存在下、BIAcore(登録商標)アッセイ系で、遮断アッセイを行った。アッセイを用いて、非中和(ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を妨げないもの)または中和(ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を妨げるもの)として、ペプチボディを分類した。初めに、いかなるペプチボディも存在しない、ベースラインのミオスタチン−ActRIIB/Fc結合を決定した。
[0255]
初期スクリーニング研究には、ペプチボディを、試料緩衝液中、4nM、40nM、及び400nMに希釈し、4nMミオスタチン(同様に、試料緩衝液中で希釈する)とインキュベートした。ペプチボディ:リガンド混合物が、室温で平衡に達するようにし(少なくとも5時間)、次いで、流速10μl/分で、20〜30分間、固定化ActRIIB/Fc表面上に注入した。結合反応の増加(ペプチボディを含まない対照の結合を越える)は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が非中和性であることを示した。結合反応の減少(対照と比較)は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が、ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を遮断することを示した。IC50値(中和ペプチボディ)またはEC50(非中和ペプチボディ)を得るために、全濃度系列の遮断アッセイを用いて、選択したペプチボディをさらに特徴付けた。ペプチボディ試料を、200nMから0.05mMまで試料緩衝液中で連続希釈して、4mMミオスタチンと、室温で平衡に達するまで(最小5時間)インキュベートした後、流速10μl/分で20〜30分間、固定化ActRIIB/Fc表面上に注入した。試料注入後、結合したリガンドを3分間、受容体から解離させた。ペプチボディ濃度に対して結合シグナルをプロットし、4nMミオスタチンの存在下で、各ペプチボディのIC50値を計算した。例えば、ペプチボディTN8−19、L2、及びL17は、細胞に基づくアッセイにおいて、ミオスタチン活性を阻害するが、TN−8−19の結合は、ミオスタチン/ActRIIB/Fc相互作用を遮断しないことから、TN−8−19が、他の2つのペプチボディで観察されるものとは異なるエピトープに結合することが示された。
ペプチボディに対するエピトープビンニング
[0256]
精製ペプチボディをBIAcoreチップ上に固定化して、第2のペプチボディを注入する前に、ミオスタチンを捕捉し、捕捉されたミオスタチンに結合した二次ペプチボディの量を決定した。別個のエピトープを持つペプチボディのみが、捕捉されたミオスタチンに結合し、したがって類似のまたは別個のエピトープ結合特性を持つペプチボディのビンニングが可能になる。例えば、ペプチボディTN8−19及びL23が、ミオスタチン上の異なるエピトープに結合することが示された。
[0256]
精製ペプチボディをBIAcoreチップ上に固定化して、第2のペプチボディを注入する前に、ミオスタチンを捕捉し、捕捉されたミオスタチンに結合した二次ペプチボディの量を決定した。別個のエピトープを持つペプチボディのみが、捕捉されたミオスタチンに結合し、したがって類似のまたは別個のエピトープ結合特性を持つペプチボディのビンニングが可能になる。例えば、ペプチボディTN8−19及びL23が、ミオスタチン上の異なるエピトープに結合することが示された。
選択性アッセイ
[0257]
BIAcore(登録商標)技術を用いて、これらのアッセイを行って、他のTGFβファミリーメンバーへのペプチボディの結合の選択性を決定した。製造業者が示唆するプロトコルに従って、ActRIIB/Fc、TGFβRII/Fc、及びBMPR−1A/Fc(すべてR&D Systems,Minneapolis,MNから得られた)を研究用品質のセンサーチップに共有結合的にカップリングした。BIAcoreアッセイは屈折率の変化を検出するので、いかなるペプチボディも存在しない対照表面上の注入で検出された反応と比較した、固定化受容体表面上での注入で検出された反応の間の相違は、それぞれ、受容体へのアクチビンA、TGFβ1、TGFβ3、及びBMP4の実際の結合を表す。ペプチボディ及びTGFβ分子をプレインキュベートすると、結合反応の変化(増加または減少)は、TGFβファミリーの分子へのペプチボディ結合を示す。本発明のペプチボディはすべて、ミオスタチンに結合するが、アクチビンA、TGFβ1、TGFβ3、またはBMP4に結合しない。
[0257]
BIAcore(登録商標)技術を用いて、これらのアッセイを行って、他のTGFβファミリーメンバーへのペプチボディの結合の選択性を決定した。製造業者が示唆するプロトコルに従って、ActRIIB/Fc、TGFβRII/Fc、及びBMPR−1A/Fc(すべてR&D Systems,Minneapolis,MNから得られた)を研究用品質のセンサーチップに共有結合的にカップリングした。BIAcoreアッセイは屈折率の変化を検出するので、いかなるペプチボディも存在しない対照表面上の注入で検出された反応と比較した、固定化受容体表面上での注入で検出された反応の間の相違は、それぞれ、受容体へのアクチビンA、TGFβ1、TGFβ3、及びBMP4の実際の結合を表す。ペプチボディ及びTGFβ分子をプレインキュベートすると、結合反応の変化(増加または減少)は、TGFβファミリーの分子へのペプチボディ結合を示す。本発明のペプチボディはすべて、ミオスタチンに結合するが、アクチビンA、TGFβ1、TGFβ3、またはBMP4に結合しない。
KinEx A(商標)平衡アッセイ
[0258]
KinExA(商標)技術(Sapidyne Instruments,Inc.)を用いた、溶液に基づく平衡結合アッセイを用いて、ペプチボディ分子へのミオスタチン結合の解離平衡(KD)を測定した。この溶液に基づくアッセイは、いくつかの場合、BIAcoreアッセイよりもより感受性であると見なされる。Reacti−Gel(商標)6Xを約50μg/mlのミオスタチンで一晩プレコーティングし、次いで、BSAで遮断した。30pM及び100pMのペプチボディ試料を、試料緩衝液中、様々な濃度(0.5pM〜5nM)のミオスタチンと室温で8時間インキュベートした後、ミオスタチンでコーティングしたビーズの間を流動させた。スーパーブロック中の1mg/mlの蛍光(Cy5)標識したヤギ抗ヒトFc抗体によって、ビーズに結合したペプチボディの量を定量化した。結合シグナルは、所定のミオスタチン濃度で平衡状態の未結合ペプチボディの濃度に比例する。KinEx A(商標)ソフトウェア(Sapidyne Instruments,Inc.)において提供される、二重曲線一部位均質結合モデルを用いた競合曲線の非線形回帰から、KDを得た。
[0258]
KinExA(商標)技術(Sapidyne Instruments,Inc.)を用いた、溶液に基づく平衡結合アッセイを用いて、ペプチボディ分子へのミオスタチン結合の解離平衡(KD)を測定した。この溶液に基づくアッセイは、いくつかの場合、BIAcoreアッセイよりもより感受性であると見なされる。Reacti−Gel(商標)6Xを約50μg/mlのミオスタチンで一晩プレコーティングし、次いで、BSAで遮断した。30pM及び100pMのペプチボディ試料を、試料緩衝液中、様々な濃度(0.5pM〜5nM)のミオスタチンと室温で8時間インキュベートした後、ミオスタチンでコーティングしたビーズの間を流動させた。スーパーブロック中の1mg/mlの蛍光(Cy5)標識したヤギ抗ヒトFc抗体によって、ビーズに結合したペプチボディの量を定量化した。結合シグナルは、所定のミオスタチン濃度で平衡状態の未結合ペプチボディの濃度に比例する。KinEx A(商標)ソフトウェア(Sapidyne Instruments,Inc.)において提供される、二重曲線一部位均質結合モデルを用いた競合曲線の非線形回帰から、KDを得た。
実施例4:ミオスタチン阻害剤の比較
[0259]
3つの典型的な第一周期ペプチボディが結合し(KD)、阻害する(IC50)能力を、可溶性受容体融合タンパク質actRIIB/Fc(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,Minn.)で得たKD及びIC50値と比較した。実施例3に記載されるpMARE luc細胞に基づくアッセイを用いて、IC50値を決定し、実施例3に記載されるBiacore(登録商標)アッセイを用いて、KD値を決定した。
[0259]
3つの典型的な第一周期ペプチボディが結合し(KD)、阻害する(IC50)能力を、可溶性受容体融合タンパク質actRIIB/Fc(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,Minn.)で得たKD及びIC50値と比較した。実施例3に記載されるpMARE luc細胞に基づくアッセイを用いて、IC50値を決定し、実施例3に記載されるBiacore(登録商標)アッセイを用いて、KD値を決定した。
[0260]
ペプチボディは、受容体/Fc阻害剤よりも改善されたIC50を有し、2つのペプチボディにおいては、受容体/Fcと匹敵する結合親和性を有する。
ペプチボディは、受容体/Fc阻害剤よりも改善されたIC50を有し、2つのペプチボディにおいては、受容体/Fcと匹敵する結合親和性を有する。
実施例5:ペプチド及びペプチボディがミオスタチンを阻害する能力の比較
[0261]
ペプチド配列:QGHCTRWPWMCPPY(TN8−19)(配列番号33)を用い、上の実施例2に記載される手順に従って、対応するペプチボディTN8−19(pb)を構築した。上の実施例3に記載されるC2C12に基づくアッセイを用いて、ミオスタチン阻害活性に関して、ペプチドのみ及びペプチボディの両方をスクリーングした。図1から、ペプチボディのIC50(ミオスタチンを50%阻害するのに有効な濃度)が、ペプチドのものより有意に低く、したがって、ペプチボディの配置を取ることによって、ペプチドがミオスタチン活性を阻害する能力が、実質的に改善されたことがわかる。
[0261]
ペプチド配列:QGHCTRWPWMCPPY(TN8−19)(配列番号33)を用い、上の実施例2に記載される手順に従って、対応するペプチボディTN8−19(pb)を構築した。上の実施例3に記載されるC2C12に基づくアッセイを用いて、ミオスタチン阻害活性に関して、ペプチドのみ及びペプチボディの両方をスクリーングした。図1から、ペプチボディのIC50(ミオスタチンを50%阻害するのに有効な濃度)が、ペプチドのものより有意に低く、したがって、ペプチボディの配置を取ることによって、ペプチドがミオスタチン活性を阻害する能力が、実質的に改善されたことがわかる。
実施例6:親和性成熟ペプチド及びペプチボディの生成
[0262]
ペプチボディ生成に用いた第一周期ペプチドのいくつかを、親和性成熟のために選択した。選択されたペプチドには、次のものが含まれた:システイン拘束TN8−19、QGHCTRWPWMCPPY(配列番号33)、及び直鎖ペプチド、直鎖−2
MEMLDSLFELLKDMVPISKA(配列番号104)、直鎖−15
HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV(配列番号117)、直鎖−17
RATLLKDFWQLVEGYGDN(配列番号119)、直鎖−20
YREMSMLEGLLDVLERLQHY(配列番号122)、直鎖−21
HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ(配列番号123)、直鎖−24
EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN(配列番号126)。コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸(コンセンサス配列から決定する)を一定に維持するかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイライブラリーを生成した。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイライブラリーを生成することも可能である。よりストリンジェントな条件下での、そのようなライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの所望の特性を持つ、ペプチドを生じることが可能である。
[0262]
ペプチボディ生成に用いた第一周期ペプチドのいくつかを、親和性成熟のために選択した。選択されたペプチドには、次のものが含まれた:システイン拘束TN8−19、QGHCTRWPWMCPPY(配列番号33)、及び直鎖ペプチド、直鎖−2
MEMLDSLFELLKDMVPISKA(配列番号104)、直鎖−15
HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV(配列番号117)、直鎖−17
RATLLKDFWQLVEGYGDN(配列番号119)、直鎖−20
YREMSMLEGLLDVLERLQHY(配列番号122)、直鎖−21
HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ(配列番号123)、直鎖−24
EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN(配列番号126)。コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸(コンセンサス配列から決定する)を一定に維持するかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイライブラリーを生成した。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイライブラリーを生成することも可能である。よりストリンジェントな条件下での、そのようなライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの所望の特性を持つ、ペプチドを生じることが可能である。
ライブラリーのためのドープしたオリゴの産生
[0263]
コア配列が91%「ドープ」された、すなわち各溶液が、表される塩基(A、G、C、またはT)の91%、及び他の3ヌクレオチドの各々3%である、DNA合成装置中、オリゴヌクレオチドを合成した。TN8−19ファミリーでは、例えば、二次ファージライブラリーの構築に用いた91%ドープしたオリゴは、以下の通りであった:
5’−CAC AGT GCA CAG GGT NNK NNK NNK caK ggK caK tgK acK cgK tgK ccK tgK atK tgK ccK ccK taK NNK NNK NNK CAT TCT CTC GAG ATC A−3’(配列番号634)
ここで、「N」は、4つのヌクレオチドA、T、C、及びGの各々が、等しく表されたことを示し、Kは、G及びTが等しく表されたことを示し、小文字は、91%の表記の塩基と他の塩基の各々3%の混合物を表す。この様式で調製されたオリゴヌクレオチドファミリーを上記のようにPCR増幅し、上記のプロトコルに従って、ファージミドベクター、例えば、修飾pCES1プラスミド(Dyax)、または入手可能なファージミドベクターのいずれかに連結した。生成された二次ファージライブラリーは、すべて91%ドープされ、1〜6.5×109の独立形質転換体を有した。上記のように、ライブラリーをパニングしたが、以下の条件を用いた:
[0263]
コア配列が91%「ドープ」された、すなわち各溶液が、表される塩基(A、G、C、またはT)の91%、及び他の3ヌクレオチドの各々3%である、DNA合成装置中、オリゴヌクレオチドを合成した。TN8−19ファミリーでは、例えば、二次ファージライブラリーの構築に用いた91%ドープしたオリゴは、以下の通りであった:
5’−CAC AGT GCA CAG GGT NNK NNK NNK caK ggK caK tgK acK cgK tgK ccK tgK atK tgK ccK ccK taK NNK NNK NNK CAT TCT CTC GAG ATC A−3’(配列番号634)
ここで、「N」は、4つのヌクレオチドA、T、C、及びGの各々が、等しく表されたことを示し、Kは、G及びTが等しく表されたことを示し、小文字は、91%の表記の塩基と他の塩基の各々3%の混合物を表す。この様式で調製されたオリゴヌクレオチドファミリーを上記のようにPCR増幅し、上記のプロトコルに従って、ファージミドベクター、例えば、修飾pCES1プラスミド(Dyax)、または入手可能なファージミドベクターのいずれかに連結した。生成された二次ファージライブラリーは、すべて91%ドープされ、1〜6.5×109の独立形質転換体を有した。上記のように、ライブラリーをパニングしたが、以下の条件を用いた:
[0264]
二次ライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進したペプチドを得た。個々の選択クローンを上記のようにファージELISAに供し、配列決定した。
[0265]
ペプチドの以下の親和性成熟TN8−19ファミリーを以下の表IVに示す。
二次ライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進したペプチドを得た。個々の選択クローンを上記のようにファージELISAに供し、配列決定した。
[0265]
ペプチドの以下の親和性成熟TN8−19ファミリーを以下の表IVに示す。
[0266]
上に示す親和性成熟TN−8−19−1からCon2(mTN8con6配列を除く)由来のコンセンサス配列は:Ca1a2 Wa3 WMCPP(配列番号352)である。これらのペプチドはすべて、配列WMCPP(配列番号633)を含む。下線のアミノ酸は、すべての実施形態に存在するコアアミノ酸を表し、a1、a2、及びa3は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸から選択される。このコンセンサス配列の一実施形態Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)において、b1は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、b2は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、b3は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択される。これらのペプチドはすべて、配列WMCPP(配列番号633)を含む。配列番号352を含む親和性成熟TN8配列のより詳細な分析は、以下の式:
c1c2c3c4c5c6 Cc7c8 Wc9 WMCPPc10c11c12c13(配列番号354)を提供し、式中
c1は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
c7は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c8は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c9は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、式中
c10〜c13は、任意のアミノ酸である。
[0267]
上記式の一実施形態において、b7は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、b8は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、b9は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択される。これは、以下の配列:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8 Wd9 WMCPPd10d11d12d13(配列番号355)を提供する。
上に示す親和性成熟TN−8−19−1からCon2(mTN8con6配列を除く)由来のコンセンサス配列は:Ca1a2 Wa3 WMCPP(配列番号352)である。これらのペプチドはすべて、配列WMCPP(配列番号633)を含む。下線のアミノ酸は、すべての実施形態に存在するコアアミノ酸を表し、a1、a2、及びa3は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸から選択される。このコンセンサス配列の一実施形態Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)において、b1は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、b2は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、b3は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択される。これらのペプチドはすべて、配列WMCPP(配列番号633)を含む。配列番号352を含む親和性成熟TN8配列のより詳細な分析は、以下の式:
c1c2c3c4c5c6 Cc7c8 Wc9 WMCPPc10c11c12c13(配列番号354)を提供し、式中
c1は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
c5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
c6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
c7は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c8は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
c9は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、式中
c10〜c13は、任意のアミノ酸である。
[0267]
上記式の一実施形態において、b7は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、b8は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、b9は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択される。これは、以下の配列:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8 Wd9 WMCPPd10d11d12d13(配列番号355)を提供する。
d1は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
d2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
d5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
d7は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、
d8は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、
d9は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択され、
d10〜d13は、任意のアミノ酸から選択される。
[0268]
mTN8con6シリーズのコンセンサス配列は、WYe1e2 Ye3G(配列番号356)であり、式中e1は、P、S、またはYであり、e2は、CまたはQであり、e3は、GまたはHである。
[0269]
TN−19親和性成熟ファミリーに加えて、直鎖L−2、L−15、L−17、L−20、L−21、及びL−24の第1周期のペプチドから、さらなる親和性成熟ペプチドを産生した。これらのファミリーを以下の表Vに示す。
d2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d4は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
d5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
d6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
d7は、アミノ酸T、I、またはRのうちのいずれか1つから選択され、
d8は、R、S、Qのうちのいずれか1つから選択され、
d9は、P、R、及びQのうちのいずれか1つから選択され、
d10〜d13は、任意のアミノ酸から選択される。
[0268]
mTN8con6シリーズのコンセンサス配列は、WYe1e2 Ye3G(配列番号356)であり、式中e1は、P、S、またはYであり、e2は、CまたはQであり、e3は、GまたはHである。
[0269]
TN−19親和性成熟ファミリーに加えて、直鎖L−2、L−15、L−17、L−20、L−21、及びL−24の第1周期のペプチドから、さらなる親和性成熟ペプチドを産生した。これらのファミリーを以下の表Vに示す。
[0270]
次いで、表IV及びVに提供される親和性成熟ペプチドを上記のペプチボディに組み立て、インビボアッセイを用いてアッセイした。
[0271]
親和性成熟L2ペプチドは、f1 EMLf 2 SLf3f4 LL(配列番号455)のコンセンサス配列を含み、式中、f1は、MまたはIであり、f2は、任意のアミノ酸であり、f3は、LまたはFであり、f4は、E、Q、またはDである。
[0272]
親和性成熟L15ペプチドファミリーは、配列Lg1g2 LLg3g4 L(配列番号456)を含み、式中、g1は、Q、D、またはEであり、g2は、S、Q、D、またはEであり、g3は、任意のアミノ酸であり、g4は、L、W、F、またはYである。親和性成熟L17ファミリーは、配列:h1h2h3h4h5h6h7h8h9(配列番号457)を含み、式中、h1は、RまたはDであり、h2は、任意のアミノ酸であり、h3は、A、T S、またはQであり、h4は、LまたはMであり、h5は、LまたはSであり、h6は、任意のアミノ酸であり、h7は、FまたはEであり、h8は、W、F、またはCであり、h9は、L、F、M、またはKである。コンセンサス配列はまた、上に示されるペプチドのmL20、mL21、及びmL24ファミリーに関しても決定され得る。
[0273]
上記の実施例2に記載されるように、FcのN末端(N配置)、C末端(C配置)、またはN末端及びC末端の両方(N、C配置)で、配列番号296を有するヒトIgG1のFcドメインに結合するリンカーを用いて、上記のこれらの親和性成熟ペプチドからペプチボディを構築した。指定されたペプチドを、5グリシン(5G)、8グリシン、またはkリンカー配列を介して、C末端またはN末端に結合させた。2×ペプチボディ型では、5gly、8gly、またはk等のリンカーでペプチドを結合した。親和性成熟ペプチド及びペプチボディは、例えば、mTN8−19−22等の小文字「m」で示される。本発明のペプチボディは、ペプチドがファージミドベクターにスプライシングされる2つのスプライス部位をさらに含有する。これらのスプライス部位の位置は、AQ−ペプチド−LEである。ペプチボディは、一般的に、これらのさらなるアミノ酸を含む(しかし、これらは表に列挙されるペプチド配列には含まれない)。いくつかのペプチボディでは、LEアミノ酸をペプチド配列から除去した。これらのペプチボディは、−LEと示される。
[0274]
典型的なペプチボディ、及びそれらをコードする典型的なポリヌクレオチド配列を、以下の表VIに提供する。この表には、2×mTN8−19−7(配列番号615)等のペプチボディ配列(ペプチドのみと対照的に)及びLE配列が欠失したペプチボディ(配列番号617)の例が含まれる。説明として、2×型のリンカー配列は、タンデムペプチド間のリンカーを指す。これらのペプチボディ配列は、Fc、リンカー、AQ、及びLE配列を含有する。付随するヌクレオチド配列は、存在する場合AQ/LEリンカー配列に加えてペプチド配列をコードするが、示されるリンカーはコードしない。
次いで、表IV及びVに提供される親和性成熟ペプチドを上記のペプチボディに組み立て、インビボアッセイを用いてアッセイした。
[0271]
親和性成熟L2ペプチドは、f1 EMLf 2 SLf3f4 LL(配列番号455)のコンセンサス配列を含み、式中、f1は、MまたはIであり、f2は、任意のアミノ酸であり、f3は、LまたはFであり、f4は、E、Q、またはDである。
[0272]
親和性成熟L15ペプチドファミリーは、配列Lg1g2 LLg3g4 L(配列番号456)を含み、式中、g1は、Q、D、またはEであり、g2は、S、Q、D、またはEであり、g3は、任意のアミノ酸であり、g4は、L、W、F、またはYである。親和性成熟L17ファミリーは、配列:h1h2h3h4h5h6h7h8h9(配列番号457)を含み、式中、h1は、RまたはDであり、h2は、任意のアミノ酸であり、h3は、A、T S、またはQであり、h4は、LまたはMであり、h5は、LまたはSであり、h6は、任意のアミノ酸であり、h7は、FまたはEであり、h8は、W、F、またはCであり、h9は、L、F、M、またはKである。コンセンサス配列はまた、上に示されるペプチドのmL20、mL21、及びmL24ファミリーに関しても決定され得る。
[0273]
上記の実施例2に記載されるように、FcのN末端(N配置)、C末端(C配置)、またはN末端及びC末端の両方(N、C配置)で、配列番号296を有するヒトIgG1のFcドメインに結合するリンカーを用いて、上記のこれらの親和性成熟ペプチドからペプチボディを構築した。指定されたペプチドを、5グリシン(5G)、8グリシン、またはkリンカー配列を介して、C末端またはN末端に結合させた。2×ペプチボディ型では、5gly、8gly、またはk等のリンカーでペプチドを結合した。親和性成熟ペプチド及びペプチボディは、例えば、mTN8−19−22等の小文字「m」で示される。本発明のペプチボディは、ペプチドがファージミドベクターにスプライシングされる2つのスプライス部位をさらに含有する。これらのスプライス部位の位置は、AQ−ペプチド−LEである。ペプチボディは、一般的に、これらのさらなるアミノ酸を含む(しかし、これらは表に列挙されるペプチド配列には含まれない)。いくつかのペプチボディでは、LEアミノ酸をペプチド配列から除去した。これらのペプチボディは、−LEと示される。
[0274]
典型的なペプチボディ、及びそれらをコードする典型的なポリヌクレオチド配列を、以下の表VIに提供する。この表には、2×mTN8−19−7(配列番号615)等のペプチボディ配列(ペプチドのみと対照的に)及びLE配列が欠失したペプチボディ(配列番号617)の例が含まれる。説明として、2×型のリンカー配列は、タンデムペプチド間のリンカーを指す。これらのペプチボディ配列は、Fc、リンカー、AQ、及びLE配列を含有する。付随するヌクレオチド配列は、存在する場合AQ/LEリンカー配列に加えてペプチド配列をコードするが、示されるリンカーはコードしない。
実施例7:親和性成熟ペプチボディのインビトロスクリーニング
[0275]
上述のプロトコルに従って、以下の典型的なペプチボディをスクリーニングして、以下のKD値及びIC50値を得た。表VIIは、KinExA(商標)溶液に基づくアッセイまたはBIAcore(登録商標)アッセイによって決定されるように、親ペプチボディと比較した、選択された親和性成熟ペプチボディのKD値の範囲を示す。これらの値は、親ペプチボディと比較して、ミオスタチンに対する親和性成熟ペプチボディの増加した結合親和性を示す。表VIIIは、いくつかの親和性成熟ペプチボディのIC50値を示す。値の範囲をこの表に示す。
[0275]
上述のプロトコルに従って、以下の典型的なペプチボディをスクリーニングして、以下のKD値及びIC50値を得た。表VIIは、KinExA(商標)溶液に基づくアッセイまたはBIAcore(登録商標)アッセイによって決定されるように、親ペプチボディと比較した、選択された親和性成熟ペプチボディのKD値の範囲を示す。これらの値は、親ペプチボディと比較して、ミオスタチンに対する親和性成熟ペプチボディの増加した結合親和性を示す。表VIIIは、いくつかの親和性成熟ペプチボディのIC50値を示す。値の範囲をこの表に示す。
実施例8:典型的なペプチボディのインビボ同化活性
[0276]
CD1nu/nuマウスモデル(Charles River Laboratories,Massachusetts)を用いて、ヒトFc領域(huFc)を含む本発明のペプチボディのインビボ有効性を決定した。このモデルは、迅速な同化反応で本発明の阻害剤に反応し、これは、乾燥筋量の増加及び筋線維タンパク質の増加を伴ったが、体内の水含量の集積は伴わなかった。
[0277]
一例において、1×ペプチボディmTN8−19−21のインビボでの有効性を以下の実験によって示した。10匹の8週齢CD1nu/nuマウスの群を、週2回または週1回、1mg/kg、3mg/kg、及び10mg/kgの投与量(皮下注射)で処置した。10匹の8週齢CD1nu/nuマウスの対照群は、週2回、10mg/kgでhuFc(ビヒクル)の(皮下)注射を投与した。1日おきに動物の体重を測定し、0日目及び13日目に、NMRによって除脂肪体重を決定した。次いで、14日目に動物を殺処分し、腓腹筋のサイズを決定した。結果を図2及び3に示す。図2は、多様な投薬量でペプチボディを14日間にわたって投与した際の、対照と比較した、マウスの総体重の増加を示す。図2からわかるように、すべての投薬量は、対照と比較して体重の増加を示し、投薬量のすべてが、14日目までに、対照を超える、統計的に有意な増加を示した。図3は、核磁気共鳴(NMR)画像法(EchoMRI2003、Echo Medical Systems,Houston,Tx)によって決定される、0日目及び13日目の除脂肪体重の変化、ならびに14日目に動物から切開された腓腹筋の重量変化を示す。
[0278]
別の例において、1×mTN8−19−32ペプチボディを、CD1nu/nuマウスに、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、及び30mg/kgで、週2回注射して投与し、huFc対照(ビヒクル)と比較した。ペプチボディ処置動物は、総体重の増加(図示せず)、ならびにNMR測定によって決定されるように、0日目と比較して13日目に除脂肪体重の増加を示す。除脂肪体重の増加を図4に示す。
[0279]
別の例において、インビボ同化有効性に関して、1×親和性成熟ペプチボディを2×親和性成熟ペプチボディと比較した。CD1nu/nu雄マウス(群あたり10匹の動物)を、1mg/kg及び3mg/kgの1×mTN8−19−7及び2×mTN8−19−7の週2回の注射で35日間処置し、一方、対照群(10匹の動物)には、huFc(3mg/kg)を週2回注射して投与した。図5に示されるように、2×ペプチボディでの処置は、1×ペプチボディまたは対照と比較して、剖検時、より多い体重増加及び除脂肪屍体量を生じた。
[0276]
CD1nu/nuマウスモデル(Charles River Laboratories,Massachusetts)を用いて、ヒトFc領域(huFc)を含む本発明のペプチボディのインビボ有効性を決定した。このモデルは、迅速な同化反応で本発明の阻害剤に反応し、これは、乾燥筋量の増加及び筋線維タンパク質の増加を伴ったが、体内の水含量の集積は伴わなかった。
[0277]
一例において、1×ペプチボディmTN8−19−21のインビボでの有効性を以下の実験によって示した。10匹の8週齢CD1nu/nuマウスの群を、週2回または週1回、1mg/kg、3mg/kg、及び10mg/kgの投与量(皮下注射)で処置した。10匹の8週齢CD1nu/nuマウスの対照群は、週2回、10mg/kgでhuFc(ビヒクル)の(皮下)注射を投与した。1日おきに動物の体重を測定し、0日目及び13日目に、NMRによって除脂肪体重を決定した。次いで、14日目に動物を殺処分し、腓腹筋のサイズを決定した。結果を図2及び3に示す。図2は、多様な投薬量でペプチボディを14日間にわたって投与した際の、対照と比較した、マウスの総体重の増加を示す。図2からわかるように、すべての投薬量は、対照と比較して体重の増加を示し、投薬量のすべてが、14日目までに、対照を超える、統計的に有意な増加を示した。図3は、核磁気共鳴(NMR)画像法(EchoMRI2003、Echo Medical Systems,Houston,Tx)によって決定される、0日目及び13日目の除脂肪体重の変化、ならびに14日目に動物から切開された腓腹筋の重量変化を示す。
[0278]
別の例において、1×mTN8−19−32ペプチボディを、CD1nu/nuマウスに、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、及び30mg/kgで、週2回注射して投与し、huFc対照(ビヒクル)と比較した。ペプチボディ処置動物は、総体重の増加(図示せず)、ならびにNMR測定によって決定されるように、0日目と比較して13日目に除脂肪体重の増加を示す。除脂肪体重の増加を図4に示す。
[0279]
別の例において、インビボ同化有効性に関して、1×親和性成熟ペプチボディを2×親和性成熟ペプチボディと比較した。CD1nu/nu雄マウス(群あたり10匹の動物)を、1mg/kg及び3mg/kgの1×mTN8−19−7及び2×mTN8−19−7の週2回の注射で35日間処置し、一方、対照群(10匹の動物)には、huFc(3mg/kg)を週2回注射して投与した。図5に示されるように、2×ペプチボディでの処置は、1×ペプチボディまたは対照と比較して、剖検時、より多い体重増加及び除脂肪屍体量を生じた。
実施例9:筋力増加
[0280]
年齢が一致した正常な雄4カ月齢雄C57Bl/6マウスを、週あたり5mg/kgの2×mTN8−19−33、2×mTN8−19−7、及びhuFcビヒクル対照群(10匹の動物/群)の週2回の皮下注射で、30日間処置した。さらなる注射を行わずに動物を回復させた。回復期18日目に、握力を測定した。Columbia Instruments測定装置、モデル1027dsm(Columbus,Ohio)を用いて、握力を測定した。ペプチボディ処置は、握力の有意な増加を生じ、2×mTN8−19−33で前処置した動物は、対照処置動物と比較して、握力の14%の増加を示し、一方、2×mTN8−19−7は、対照処置マウスと比較して、握力の15%の増加を示した。
[0280]
年齢が一致した正常な雄4カ月齢雄C57Bl/6マウスを、週あたり5mg/kgの2×mTN8−19−33、2×mTN8−19−7、及びhuFcビヒクル対照群(10匹の動物/群)の週2回の皮下注射で、30日間処置した。さらなる注射を行わずに動物を回復させた。回復期18日目に、握力を測定した。Columbia Instruments測定装置、モデル1027dsm(Columbus,Ohio)を用いて、握力を測定した。ペプチボディ処置は、握力の有意な増加を生じ、2×mTN8−19−33で前処置した動物は、対照処置動物と比較して、握力の14%の増加を示し、一方、2×mTN8−19−7は、対照処置マウスと比較して、握力の15%の増加を示した。
実施例10:薬物動態学
[0281]
LE配列を含まない代表的なペプチボディを用いて、インビボ薬物動態学実験を行った。10mg/kg及び5mg/kgの投薬量を、CD1nu/nuマウスに投与し、以下のパラメータを決定した:Cmax(μg/mL)、曲線下面積(AUC)(μg−時間/mL)、及び半減期(時間)。親和性成熟ペプチボディの2×型が1×型よりも有意に長い半減期を有することが見出された。例えば、1×親和性成熟mTN8−19−22は、動物において約50.2時間の半減期を有し、一方、2×mTN8−19−22は、約85.2時間の半減期を有する。親和性成熟1×mTN8−7は、約65時間の半減期を有し、一方、2×mTN8−19−7は、約106時間の半減期を有する。
[0281]
LE配列を含まない代表的なペプチボディを用いて、インビボ薬物動態学実験を行った。10mg/kg及び5mg/kgの投薬量を、CD1nu/nuマウスに投与し、以下のパラメータを決定した:Cmax(μg/mL)、曲線下面積(AUC)(μg−時間/mL)、及び半減期(時間)。親和性成熟ペプチボディの2×型が1×型よりも有意に長い半減期を有することが見出された。例えば、1×親和性成熟mTN8−19−22は、動物において約50.2時間の半減期を有し、一方、2×mTN8−19−22は、約85.2時間の半減期を有する。親和性成熟1×mTN8−7は、約65時間の半減期を有し、一方、2×mTN8−19−7は、約106時間の半減期を有する。
実施例11:mdxマウスの処置
[0282]
本発明のペプチボディは、動物において、除脂肪筋肉量を増加させることが示され、筋肉の消耗を伴う多様な障害の治療に有用である。筋ジストロフィーは、これらの障害の1つである。デュシェンヌ筋ジストロフィーのマウスモデルは、Duchennemdxマウス(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)である。老齢(10カ月齢)mdxマウスに、ペプチボディ1×mTN8−19−33(n=8/群)またはビヒクルhuFcタンパク質(N=6/群)のいずれかを3カ月間注射した。投薬スケジュールは、1日おき、10mg/kg、皮下注射によるものであった。ペプチボディ処置は、老齢mdxマウスの体重を増加させ、維持するのに正の影響を有した。図6Aに示されるように、hu−Fc−処置対照群と比較して、ペプチボディ処置群では、体重の有意な増加が観察された。さらに、図6Bに示されるように、脂肪量に対する除脂肪体重の比もまた、対照群と比較して、ペプチボディ処置の結果として、老齢mdxマウスで有意に増加し、体重のうちの脂肪の割合が、対照群と比較して、ペプチボディ処置マウスで減少することが、NMR分析により明らかになった。
[0282]
本発明のペプチボディは、動物において、除脂肪筋肉量を増加させることが示され、筋肉の消耗を伴う多様な障害の治療に有用である。筋ジストロフィーは、これらの障害の1つである。デュシェンヌ筋ジストロフィーのマウスモデルは、Duchennemdxマウス(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)である。老齢(10カ月齢)mdxマウスに、ペプチボディ1×mTN8−19−33(n=8/群)またはビヒクルhuFcタンパク質(N=6/群)のいずれかを3カ月間注射した。投薬スケジュールは、1日おき、10mg/kg、皮下注射によるものであった。ペプチボディ処置は、老齢mdxマウスの体重を増加させ、維持するのに正の影響を有した。図6Aに示されるように、hu−Fc−処置対照群と比較して、ペプチボディ処置群では、体重の有意な増加が観察された。さらに、図6Bに示されるように、脂肪量に対する除脂肪体重の比もまた、対照群と比較して、ペプチボディ処置の結果として、老齢mdxマウスで有意に増加し、体重のうちの脂肪の割合が、対照群と比較して、ペプチボディ処置マウスで減少することが、NMR分析により明らかになった。
実施例12:CIA関節炎マウスモデルの処置
[0283]
コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルは、リウマチ性関節炎のモデルとして広く用いられている。実験の1日目及び21日目に、8週齢DBA/1Jマウス(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)の尾の付け根に100μgのウシコラーゲンII(Chrondex,Redmond,WA)を投与して免疫を与え、関節炎を誘導した。関節及び足の発赤及び/または腫脹によってマウスの関節炎状態をスコア付けし、これに基づいて動物を選択した。動物の3群を確立した:コラーゲンを投与されない正常動物(正常、12匹の動物)、コラーゲンに加えてネズミFcビヒクルを投与した動物(CIA/ビヒクル、6匹の動物)、及びコラーゲンに加えて、ネズミFcに結合したペプチボディ2×mTN8−19−21を投与した動物(2×mTN8−19−21/muFc、2×−21とも称する)(CIA/ペプチボディ、8匹の動物)。これらの実験及び以下の実施例に用いたネズミFcは、ネズミIgG由来のFcである。CIA/ビヒクル動物及びCIA/ペプチボディ動物には、1日目及び21日目のコラーゲンの投与に加えて、8日目から始め、50日目まで連続して、週2回、5mg/kgのミオスタチンペプチボディ2×mTN8−19−21/muFcまたはネズミFcビヒクルのみを皮下(s.c.)注射した。動物の体重を4日ごとに測定した。結果を図7に示す。図7は、体重が減少したCIA/ビヒクル動物と比較して、CIA/ペプチボディ(2×21)動物の体重増加を示し、本本明細書に記載されるペプチボディを含むミオスタチン拮抗薬が、対照動物に示されるリウマチ性悪液質に対抗可能であることを示す。
[0283]
コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルは、リウマチ性関節炎のモデルとして広く用いられている。実験の1日目及び21日目に、8週齢DBA/1Jマウス(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)の尾の付け根に100μgのウシコラーゲンII(Chrondex,Redmond,WA)を投与して免疫を与え、関節炎を誘導した。関節及び足の発赤及び/または腫脹によってマウスの関節炎状態をスコア付けし、これに基づいて動物を選択した。動物の3群を確立した:コラーゲンを投与されない正常動物(正常、12匹の動物)、コラーゲンに加えてネズミFcビヒクルを投与した動物(CIA/ビヒクル、6匹の動物)、及びコラーゲンに加えて、ネズミFcに結合したペプチボディ2×mTN8−19−21を投与した動物(2×mTN8−19−21/muFc、2×−21とも称する)(CIA/ペプチボディ、8匹の動物)。これらの実験及び以下の実施例に用いたネズミFcは、ネズミIgG由来のFcである。CIA/ビヒクル動物及びCIA/ペプチボディ動物には、1日目及び21日目のコラーゲンの投与に加えて、8日目から始め、50日目まで連続して、週2回、5mg/kgのミオスタチンペプチボディ2×mTN8−19−21/muFcまたはネズミFcビヒクルのみを皮下(s.c.)注射した。動物の体重を4日ごとに測定した。結果を図7に示す。図7は、体重が減少したCIA/ビヒクル動物と比較して、CIA/ペプチボディ(2×21)動物の体重増加を示し、本本明細書に記載されるペプチボディを含むミオスタチン拮抗薬が、対照動物に示されるリウマチ性悪液質に対抗可能であることを示す。
実施例13:精巣摘出マウスの処置
[0284]
以下の実施例は、典型的なペプチボディでの精巣摘出C57Bl/6マウスの処置を記載する。年齢及び体重が一致した6月齢の外科的に精巣摘出したC57Bl/6マウス(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)の2群を、ネズミFcまたはペプチボディ2×mTN8−19−21/muFc(群あたり11匹の動物)のいずれかで処置した。マウスの2群に、3mg/kgのペプチボディまたはネズミFcを、週2回、IP注射した。処置は、手術の3週間後に開始し、10週間継続した。各生存動物に核磁気共鳴(NMR)画像法を行って、研究開始時、7週目、及び10週目の非脂肪量を評価した。以下の表でわかるように、ネズミFcで処置した精巣摘出マウスは、10週目までに非脂肪量を喪失し始めた。Fcビヒクルに対してペプチボディを投与された精巣摘出群の比較は、ネズミFcで処置した動物と比較して、ペプチボディが、精巣摘出動物において、除脂肪体重の増加を改善したことを示した。この結果を以下の表に示す。
[0284]
以下の実施例は、典型的なペプチボディでの精巣摘出C57Bl/6マウスの処置を記載する。年齢及び体重が一致した6月齢の外科的に精巣摘出したC57Bl/6マウス(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)の2群を、ネズミFcまたはペプチボディ2×mTN8−19−21/muFc(群あたり11匹の動物)のいずれかで処置した。マウスの2群に、3mg/kgのペプチボディまたはネズミFcを、週2回、IP注射した。処置は、手術の3週間後に開始し、10週間継続した。各生存動物に核磁気共鳴(NMR)画像法を行って、研究開始時、7週目、及び10週目の非脂肪量を評価した。以下の表でわかるように、ネズミFcで処置した精巣摘出マウスは、10週目までに非脂肪量を喪失し始めた。Fcビヒクルに対してペプチボディを投与された精巣摘出群の比較は、ネズミFcで処置した動物と比較して、ペプチボディが、精巣摘出動物において、除脂肪体重の増加を改善したことを示した。この結果を以下の表に示す。
[0285]
さらに、抗ミオスタチンペプチボディによる精巣摘出マウスの処置は、テストステロンレベルの増加を生じなかった。これらの結果は、アンドロゲン枯渇状態を治療するために、本明細書に記載されるペプチボディ等のミオスタチン拮抗薬を用いることができることを示す。
さらに、抗ミオスタチンペプチボディによる精巣摘出マウスの処置は、テストステロンレベルの増加を生じなかった。これらの結果は、アンドロゲン枯渇状態を治療するために、本明細書に記載されるペプチボディ等のミオスタチン拮抗薬を用いることができることを示す。
実施例14:TNF−αレベルの減少
[0286]
雌BALB/cマウス、8〜10週齢(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)を、LPS負荷の1日前に、PBS対照または10mg/kgのペプチボディ2×TN8−19−21/muFcで前処置した。各群は、5匹の動物であった。1日目、0.5mg/kg(10ug/マウス)のLPS(大腸菌055、B5由来のリポ多糖(Sigma)を静脈投与した。LPS投与の30分後に、血清試料を収集した。mTNF−α(腫瘍壊死因子α)レベルを測定した。結果は、ペプチボディで前処置した動物が、減少したレベルの血中mTNF−αを有することを示した。PBS処置動物では、血中のmTNF−αが、平均およそ380pg/mlであった。ペプチボディ処置動物では、血中のmTNF−αが、平均およそ120pg/mlしかなかった。これは、ミオスタチン拮抗薬が、炎症に寄与する少なくとも1つのサイトカインを減少させて、リウマチ性関節炎及び他の免疫障害を治療する際の拮抗薬の有効性に寄与し得ることを示す。
[0286]
雌BALB/cマウス、8〜10週齢(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)を、LPS負荷の1日前に、PBS対照または10mg/kgのペプチボディ2×TN8−19−21/muFcで前処置した。各群は、5匹の動物であった。1日目、0.5mg/kg(10ug/マウス)のLPS(大腸菌055、B5由来のリポ多糖(Sigma)を静脈投与した。LPS投与の30分後に、血清試料を収集した。mTNF−α(腫瘍壊死因子α)レベルを測定した。結果は、ペプチボディで前処置した動物が、減少したレベルの血中mTNF−αを有することを示した。PBS処置動物では、血中のmTNF−αが、平均およそ380pg/mlであった。ペプチボディ処置動物では、血中のmTNF−αが、平均およそ120pg/mlしかなかった。これは、ミオスタチン拮抗薬が、炎症に寄与する少なくとも1つのサイトカインを減少させて、リウマチ性関節炎及び他の免疫障害を治療する際の拮抗薬の有効性に寄与し得ることを示す。
実施例15:糖尿病のSTZ誘導モデル
[0287]
以下の実験の目的は、ストレプトゾトシン誘導性(STZ)誘導性糖尿病動物モデルにおけるミオスタチン拮抗薬の効果を決定することであった。さらに、これらの実験は、ミオスタチン拮抗薬が、糖尿病腎症の進行または発展を遅延させるかまたは防止するかどうかを決定するために設計された。用いたペプチボディは、ネズミFcに結合した2×mTN8−19−21(2×mTN8−19−21/muFcまたは2×−21)であった。対照ビヒクルは、ネズミFcのみであった。
[0287]
以下の実験の目的は、ストレプトゾトシン誘導性(STZ)誘導性糖尿病動物モデルにおけるミオスタチン拮抗薬の効果を決定することであった。さらに、これらの実験は、ミオスタチン拮抗薬が、糖尿病腎症の進行または発展を遅延させるかまたは防止するかどうかを決定するために設計された。用いたペプチボディは、ネズミFcに結合した2×mTN8−19−21(2×mTN8−19−21/muFcまたは2×−21)であった。対照ビヒクルは、ネズミFcのみであった。
ストレプトゾトシン誘導性糖尿病:
[0288]
複数回の低用量ストレプトゾトシン注射によって、糖尿病動物モデルを生成した。8週齢C57Bl/6マウスをCharles River Laboratoryから購入した。すべての動物を個々のケージで1週間飼育した。動物体重を測定し、次いで無作為に2群(n=20/群)に分けた。20匹のマウスに、40mg/kg(0.1mlのクエン酸緩衝液に溶解)の低用量のストレプトゾトシン(STZ,Sigma Co.)を連続5日間注射した。別の群の20匹のマウスに、ビヒクル(0.1mlのクエン酸緩衝液)を連続5日間注射した。グルコースオキシダーゼ法を用いて、血中グルコースレベルを測定した(Glucometer Elite,Bayer Corp.,Elkhart,IN)。血中グルコースレベルの測定によって、糖尿病の誘導を定義した。11mmol/Lまたは200mg/dlを超える血中グルコースレベルを、高血糖と見なした。次いで、糖尿病及び年齢が一致した正常マウスをさらに4ヶ月間維持した。体重、食物摂取、及び血中グルコースレベルを毎月測定した。STZ注射の4ヵ月後、20匹のマウスのうち16匹が糖尿病を発症し、これらを後の研究に用いた。体重に従って、糖尿病マウスを2つの処置群に分けた。年齢が一致した正常マウスもまた、2つの処置群に分けた。
[0288]
複数回の低用量ストレプトゾトシン注射によって、糖尿病動物モデルを生成した。8週齢C57Bl/6マウスをCharles River Laboratoryから購入した。すべての動物を個々のケージで1週間飼育した。動物体重を測定し、次いで無作為に2群(n=20/群)に分けた。20匹のマウスに、40mg/kg(0.1mlのクエン酸緩衝液に溶解)の低用量のストレプトゾトシン(STZ,Sigma Co.)を連続5日間注射した。別の群の20匹のマウスに、ビヒクル(0.1mlのクエン酸緩衝液)を連続5日間注射した。グルコースオキシダーゼ法を用いて、血中グルコースレベルを測定した(Glucometer Elite,Bayer Corp.,Elkhart,IN)。血中グルコースレベルの測定によって、糖尿病の誘導を定義した。11mmol/Lまたは200mg/dlを超える血中グルコースレベルを、高血糖と見なした。次いで、糖尿病及び年齢が一致した正常マウスをさらに4ヶ月間維持した。体重、食物摂取、及び血中グルコースレベルを毎月測定した。STZ注射の4ヵ月後、20匹のマウスのうち16匹が糖尿病を発症し、これらを後の研究に用いた。体重に従って、糖尿病マウスを2つの処置群に分けた。年齢が一致した正常マウスもまた、2つの処置群に分けた。
実験設計:
[0289]
0日目に開始して、両方の糖尿病群に、5mg/kgのビヒクル(mu−Fc)または2×mTN8−19−21を、週3回、6週間皮下注射した。体重及び食物摂取を週3回、測定した。STZを注射しなかった非糖尿病マウスを、ビヒクル(muFc)で、同じ用量及び同じスケジュールで6週間処置した。0日目、15日目、30日目、及び研究終了時に、グルコースオキシダーゼ法を用いて、血中グルコースレベルを測定した。研究設計を以下の表に提示する。
[0289]
0日目に開始して、両方の糖尿病群に、5mg/kgのビヒクル(mu−Fc)または2×mTN8−19−21を、週3回、6週間皮下注射した。体重及び食物摂取を週3回、測定した。STZを注射しなかった非糖尿病マウスを、ビヒクル(muFc)で、同じ用量及び同じスケジュールで6週間処置した。0日目、15日目、30日目、及び研究終了時に、グルコースオキシダーゼ法を用いて、血中グルコースレベルを測定した。研究設計を以下の表に提示する。
[0290]
2×mTN8−19−21/muFcで処置した糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける除脂肪及び脂肪量の変化を評価するために、Bruker Minispec NMR(Echo Medical Systems,Houston,TX)を用いて、開始時(0日目)、2週目(15日目)、4週目(30日目)、及び研究終了時(45日目)に、体組成を測定した。
[0291]
研究終了時(45日目)に、尿収集のために、マウスを個別代謝ケージに24時間拘束した。24時間尿体積を重量測定法で測定し、ネズミ微量アルブミン尿アッセイキット(Alpha Diagnostic,San Antonio,TX)を用い、酵素結合免疫吸着アッセイで、尿アルブミン濃度を決定した。
[0292]
クレアチニンクリアランス速度を計算することによって、腎機能を評価した。自動分析装置Hitachi717Clinical Chemistry Auto Analyzer(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を用いて、酵素的方法(CRE,Mizuho medy,Saga,Japan)によって、血漿クレアチニンレベル及び尿クレアチニンレベルを測定した。自動分析装置を用いることによって、血中尿素窒素レベルを測定した。
[0293]
研究完了に際して、すべての動物を殺処分した(46日目)。CO2チャンバー中でマウスを安楽死させ、心臓血液試料を収集し、全体組織解剖を行った。生化学分析のために、血清試料を−80℃で保存した。血中グルコースの血清レベル、血中尿素窒素(BUN)、クレアチニンレベルを測定した。殺処分直後、腓腹筋及び除脂肪屍体量を取り出し、計量した。右側の腎臓の中央半分をイソペンタンN2溶液で固定し、パラフィン中に包埋した。糸球体構造を分析するために、片をH&E及びPSA(過ヨウ素酸シッフ)で染色した。
[0294]
結果を平均±平均の標準誤差(SEM)として表した。非対合T検定を行って、統計的な群間差を決定した。p値が0.05未満であるとき、統計的に有意であると見なした。
2×mTN8−19−21/muFcで処置した糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける除脂肪及び脂肪量の変化を評価するために、Bruker Minispec NMR(Echo Medical Systems,Houston,TX)を用いて、開始時(0日目)、2週目(15日目)、4週目(30日目)、及び研究終了時(45日目)に、体組成を測定した。
[0291]
研究終了時(45日目)に、尿収集のために、マウスを個別代謝ケージに24時間拘束した。24時間尿体積を重量測定法で測定し、ネズミ微量アルブミン尿アッセイキット(Alpha Diagnostic,San Antonio,TX)を用い、酵素結合免疫吸着アッセイで、尿アルブミン濃度を決定した。
[0292]
クレアチニンクリアランス速度を計算することによって、腎機能を評価した。自動分析装置Hitachi717Clinical Chemistry Auto Analyzer(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を用いて、酵素的方法(CRE,Mizuho medy,Saga,Japan)によって、血漿クレアチニンレベル及び尿クレアチニンレベルを測定した。自動分析装置を用いることによって、血中尿素窒素レベルを測定した。
[0293]
研究完了に際して、すべての動物を殺処分した(46日目)。CO2チャンバー中でマウスを安楽死させ、心臓血液試料を収集し、全体組織解剖を行った。生化学分析のために、血清試料を−80℃で保存した。血中グルコースの血清レベル、血中尿素窒素(BUN)、クレアチニンレベルを測定した。殺処分直後、腓腹筋及び除脂肪屍体量を取り出し、計量した。右側の腎臓の中央半分をイソペンタンN2溶液で固定し、パラフィン中に包埋した。糸球体構造を分析するために、片をH&E及びPSA(過ヨウ素酸シッフ)で染色した。
[0294]
結果を平均±平均の標準誤差(SEM)として表した。非対合T検定を行って、統計的な群間差を決定した。p値が0.05未満であるとき、統計的に有意であると見なした。
結果:STZ誘導性糖尿病マウスにおける体重及び血中グルコースの変化
[0295]
C57Bl/6マウスの体重及び血中グルコースに対する、複数回の低用量STZ注射により、年齢が一致した正常マウス群よりも有意により高い血中グルコースレベルを有するSTZ処置マウスが生じ、最初は、20匹の動物に関して、平均約120mg/dlの平均血糖の正常レベルであったものが、STZ注射後の2週目には、平均約250〜280mg/dlに増加し、注射後の8〜18週目には、最大350mg/dlになった。抗ミオスタチンペプチボディ処置を開始するまでの4ヶ月の期間全体で、STZ処置群及び対照群の間で、体重変化に関する統計的に有意な相違が見られた。対照群は、着実に体重を増加し、平均すると、20週間にわたって、最大40%の体重増加であり(平均25gが、20週間後、34または35グラムにまで増加した)、一方、STZ群は、20週間の期間にわたって少ししか体重を増加せず、20週間にわたって、約12〜14%しか増加しなかった(20週間後、25g〜約28または29g)。
[0296]
STZ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスを2×mTN8−19−21/muFc及びビヒクルで6週間処置により、ビヒクル処置糖尿病群と比較して、2×−21処置STZ糖尿病マウスにおいて、体重増加の有意な増加が生じた。総体重は、ビヒクルが投与されたマウスと比較して、2×−21が投与されたSTZ処置マウスに関しては、最大約1.5グラムさらに増加した。それぞれの0日目のベースライン値と比較して、2×mTN8−19−21/muFcまたはビヒクルで処置した6週間後の体重純変化として、体重増分量を示す。これを図8に示す。2×−21での6週間の処置は、糖尿病動物において、体重喪失を有意に減弱した。
[0295]
C57Bl/6マウスの体重及び血中グルコースに対する、複数回の低用量STZ注射により、年齢が一致した正常マウス群よりも有意により高い血中グルコースレベルを有するSTZ処置マウスが生じ、最初は、20匹の動物に関して、平均約120mg/dlの平均血糖の正常レベルであったものが、STZ注射後の2週目には、平均約250〜280mg/dlに増加し、注射後の8〜18週目には、最大350mg/dlになった。抗ミオスタチンペプチボディ処置を開始するまでの4ヶ月の期間全体で、STZ処置群及び対照群の間で、体重変化に関する統計的に有意な相違が見られた。対照群は、着実に体重を増加し、平均すると、20週間にわたって、最大40%の体重増加であり(平均25gが、20週間後、34または35グラムにまで増加した)、一方、STZ群は、20週間の期間にわたって少ししか体重を増加せず、20週間にわたって、約12〜14%しか増加しなかった(20週間後、25g〜約28または29g)。
[0296]
STZ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスを2×mTN8−19−21/muFc及びビヒクルで6週間処置により、ビヒクル処置糖尿病群と比較して、2×−21処置STZ糖尿病マウスにおいて、体重増加の有意な増加が生じた。総体重は、ビヒクルが投与されたマウスと比較して、2×−21が投与されたSTZ処置マウスに関しては、最大約1.5グラムさらに増加した。それぞれの0日目のベースライン値と比較して、2×mTN8−19−21/muFcまたはビヒクルで処置した6週間後の体重純変化として、体重増分量を示す。これを図8に示す。2×−21での6週間の処置は、糖尿病動物において、体重喪失を有意に減弱した。
2×−21で処置したSTZ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける体組成変化
[0297]
それぞれの0日目のベースライン値と比較して、2×−21またはビヒクルで処置した6週間後の除脂肪体重純変化として、除脂肪体重を示す。これらの値を以下の表に示す。2×−21での処置は、ビヒクル処置対照マウス(0.94±1.94g及び1.60±1.28g)と比較して、STZ糖尿病マウス及び年齢が一致した正常マウスの両方(6.16±0.81g及び8.56±0.75g)の除脂肪体重の純増加を有意に増加させた(p<0.05)。脂肪量の%変化は、各群におけるベースライン0日目の値と比較した、2×−21またはビヒクルでの6週間の処置後の純変化を表す(以下の第2の表を参照のこと)。STZ糖尿病マウスにおける脂肪量増加の割合%は、2×−21(−15.60±7.01)及びビヒクル処置群(−21.59±6.84)の間で有意に異ならなかった。2×−21処置は、年齢が一致した正常マウスにおいて、純脂肪量増加を減少させた(−1.53±3.42対7.13±3.38)が、統計的に有意な量には達しなかった。
[0297]
それぞれの0日目のベースライン値と比較して、2×−21またはビヒクルで処置した6週間後の除脂肪体重純変化として、除脂肪体重を示す。これらの値を以下の表に示す。2×−21での処置は、ビヒクル処置対照マウス(0.94±1.94g及び1.60±1.28g)と比較して、STZ糖尿病マウス及び年齢が一致した正常マウスの両方(6.16±0.81g及び8.56±0.75g)の除脂肪体重の純増加を有意に増加させた(p<0.05)。脂肪量の%変化は、各群におけるベースライン0日目の値と比較した、2×−21またはビヒクルでの6週間の処置後の純変化を表す(以下の第2の表を参照のこと)。STZ糖尿病マウスにおける脂肪量増加の割合%は、2×−21(−15.60±7.01)及びビヒクル処置群(−21.59±6.84)の間で有意に異ならなかった。2×−21処置は、年齢が一致した正常マウスにおいて、純脂肪量増加を減少させた(−1.53±3.42対7.13±3.38)が、統計的に有意な量には達しなかった。
2×−21で処置したSTZ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける血中グルコース変化
[0298]
以下の表は、STZ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける血中グルコース変化に対する2×mTN8−19−21/muFcの効果を示す。血中グルコースレベルは、STZ糖尿病マウスまたは年齢が一致した正常マウスのいずれにおいても、2×−21処置群及びビヒクル処置群の間で有意には異ならなかった。
[0298]
以下の表は、STZ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける血中グルコース変化に対する2×mTN8−19−21/muFcの効果を示す。血中グルコースレベルは、STZ糖尿病マウスまたは年齢が一致した正常マウスのいずれにおいても、2×−21処置群及びビヒクル処置群の間で有意には異ならなかった。
腎臓重量/体重:
[0299]
STZ糖尿病マウスの高血糖は、腎臓肥大を伴うようである。STZ糖尿病マウスの体重に対する腎臓重量比は、年齢が一致した正常マウスのものより高かった(0.98±0.04対0.67±0.02)。6週間の2×−21処置は、腎臓重量/体重比を、ビヒクル処置糖尿病マウスにおける0.98±0.04から0.84±0.04の値まで有意に減少させた(p<0.05)。
[0299]
STZ糖尿病マウスの高血糖は、腎臓肥大を伴うようである。STZ糖尿病マウスの体重に対する腎臓重量比は、年齢が一致した正常マウスのものより高かった(0.98±0.04対0.67±0.02)。6週間の2×−21処置は、腎臓重量/体重比を、ビヒクル処置糖尿病マウスにおける0.98±0.04から0.84±0.04の値まで有意に減少させた(p<0.05)。
クレアチニンクリアランス速度
[0300]
糖尿病マウスに関しては、非糖尿病正常対照マウスと比較して、クレアチニンクリアランス速度の増加傾向があった(図9)。糖尿病マウスの平均クレアチニンクリアランス速度は、年齢が一致した正常マウスよりも2倍以上高かった。図9に示されるように、2×−21での処置は、ビヒクル措置糖尿病マウスと比較して、糖尿病マウスにおけるクレアチニンクリアランス速度を減少させ、腎機能を示した。
[0300]
糖尿病マウスに関しては、非糖尿病正常対照マウスと比較して、クレアチニンクリアランス速度の増加傾向があった(図9)。糖尿病マウスの平均クレアチニンクリアランス速度は、年齢が一致した正常マウスよりも2倍以上高かった。図9に示されるように、2×−21での処置は、ビヒクル措置糖尿病マウスと比較して、糖尿病マウスにおけるクレアチニンクリアランス速度を減少させ、腎機能を示した。
24時間尿体積及び尿アルブミン排出:
[0301]
尿アルブミン排出及び24時間尿体積は、糖尿病腎症の初期段階中の腎傷害を決定する際に非常に重要なバイオマーカーである。結果は、尿アルブミン排出(図10A)及び24時間尿体積の両方が、年齢が一致した正常マウスと比較した場合、STZ糖尿病マウスで増加することを示した。2×−21処置は、糖尿病マウスにおいて、尿アルブミンレベルを減少させ、24時間尿体積も減少させた(図10B)。これは、腎機能の正常化を示した。
[0302]
ミオスタチンペプチボディ2×mTNF8−19−21/muFcの投与は、STZ誘導性糖尿病マウスにおいて、体重損失を有意に減弱させ、骨格筋量及び除脂肪体重を保持した。骨格筋及び非脂肪量の増加に加えて、2×mTN8−19−21/muFcは、STZ誘導性糖尿病マウスにおいて、腎臓肥大、クレアチニンクリアランス速度の増加を減弱させ、24時間尿体積及び尿アルブミン排出を減少させた。これは、糖尿病腎症の発症の初期段階における、腎機能の改善を示す。
[0301]
尿アルブミン排出及び24時間尿体積は、糖尿病腎症の初期段階中の腎傷害を決定する際に非常に重要なバイオマーカーである。結果は、尿アルブミン排出(図10A)及び24時間尿体積の両方が、年齢が一致した正常マウスと比較した場合、STZ糖尿病マウスで増加することを示した。2×−21処置は、糖尿病マウスにおいて、尿アルブミンレベルを減少させ、24時間尿体積も減少させた(図10B)。これは、腎機能の正常化を示した。
[0302]
ミオスタチンペプチボディ2×mTNF8−19−21/muFcの投与は、STZ誘導性糖尿病マウスにおいて、体重損失を有意に減弱させ、骨格筋量及び除脂肪体重を保持した。骨格筋及び非脂肪量の増加に加えて、2×mTN8−19−21/muFcは、STZ誘導性糖尿病マウスにおいて、腎臓肥大、クレアチニンクリアランス速度の増加を減弱させ、24時間尿体積及び尿アルブミン排出を減少させた。これは、糖尿病腎症の発症の初期段階における、腎機能の改善を示す。
実施例16:5−フルオロウラシル化学療法誘導性悪液質のネズミモデルにおけるミオスタチン拮抗薬の効果
[0303]
化合物5−フルオロウラシル(5−Fu)は、一般的に、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、または膵臓癌を有する患者において、療法剤として用いられる。5−Fu療法の副作用は、体重損失及び筋萎縮である。5−Fu−誘導性悪液質の治療における抗ミオスタチン拮抗薬療法の潜在的な療法的利点を調べた。用いたペプチボディは、2×mTN8−19−21/muFc(2×−21とも称される)またはネズミFcに結合した2×mTN8−19−21であった。対照ビヒクルは、ネズミFcのみであった。
[0304]
この研究において、正常雄C57Bl/6マウスを4群に分け(n=24)、5−Fu(45〜50mg/kg)またはビヒクルリン酸緩衝溶液(PBS)の連続5日間(0日目〜4日目)の腹腔内(IP)投与に供した。2群は、5−Fu処置を始めた日(0日目)の2週間前(−13日目)または1週間前(−6日目)から開始し、週2回、10mg/kgの2×21で前処置し、5−Fu処置後、24日目の研究終了時まで継続した。体重、除脂肪体重、及び食物摂取を、5−Fu療法前及びその後に、週2回またはより頻繁にモニタリングした。最終研究のために、最後の投薬の0、2、24、96、168、336時間後に、血清を収集した。
[0305]
0日目及び5−FU療法前、2×21で1週間または2週間、前処置した群の平均体重増加は、5−Fu対照群の6.4%と比較して、それぞれ12.6%及び13.9%であった(両方ともp<0.0001)。これは、5−Fuのみの群の7.4%の増加と比較して、ペプチボディで1週間または2週間、前処置した群における除脂肪体重の14.7%及び16.2%の増加と匹敵した(p=0.001及びp<0.0001)。5−Fu投薬後の6日目、1週間または2週間の2×21前処置群の体重変化は、5−Fuのみの群の−8.6%と比較して、−1.9%及び−1.4%であり(両方ともp値は、0.0001未満であった)、除脂肪体重は、5−FUのみの群の−8.8%と比較して、−1.3%及び−0.9%に変化した(両方ともp値は、0.0001未満であった)。回復中の8日目、1週間または2週間の2×21前処置群の体重変化は、5−Fuのみの群の0.6%の増加と比較して、それぞれ、6.8%及び8.5%に有意に増加した(p=0.0006及びp<0.0001)。同様に、除脂肪体重は、1週間または2週間で、4.9%及び6.0%に変化した。2×21前処置群を、5−Fuのみの群の−3.3%と比較した(それぞれ、p=0.001及びp<0.0001)。結果は図11に要約される。
[0306]
8日目〜24日目に、ほぼすべてのマウスが重度の好中球減少症を示し、重度の副作用のため、死亡したマウスもいた。5−Fu投与の前に2×21で、1週間または2週間、前処置した群の生存率は、5−Fuのみの群の13%の生存率と比較して、46%であった(それぞれ、p=0.001及びp=0.009)。生存結果は図12に要約される。
[0307]
ANOVA反復測定法を用いた統計分析は、5−Fuのみで処置した群と比較して、5−Fu処置前に2×21ペプチボディで1週間または2週間、前処置した群が、−13日目〜8日目の研究経過全体を通じて、有意により高い体重及び除脂肪体重を有したことを示した(両方とも0.0001未満のp値)。
[0308]
この研究からの結果は、1週間または2週間の10mg/kg、週2回の抗ミオスタチンペプチボディ、2×21での前処置は、C57Bl/6マウスにおいて、5−Fuが誘導する体重損失及び筋萎縮を有意に改善するのに有効であることを示した。さらに、ペプチボディでの前処置は、生存率及び5−Fu化学療法に反応する期間を増加させた。したがって、本発明のミオスタチン結合剤等のミオスタチン拮抗薬を、化学療法剤または他の化学剤での治療の前及び治療中に用いて、化学薬品悪液質を防止するかまたは改善することも可能である。
[0303]
化合物5−フルオロウラシル(5−Fu)は、一般的に、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、または膵臓癌を有する患者において、療法剤として用いられる。5−Fu療法の副作用は、体重損失及び筋萎縮である。5−Fu−誘導性悪液質の治療における抗ミオスタチン拮抗薬療法の潜在的な療法的利点を調べた。用いたペプチボディは、2×mTN8−19−21/muFc(2×−21とも称される)またはネズミFcに結合した2×mTN8−19−21であった。対照ビヒクルは、ネズミFcのみであった。
[0304]
この研究において、正常雄C57Bl/6マウスを4群に分け(n=24)、5−Fu(45〜50mg/kg)またはビヒクルリン酸緩衝溶液(PBS)の連続5日間(0日目〜4日目)の腹腔内(IP)投与に供した。2群は、5−Fu処置を始めた日(0日目)の2週間前(−13日目)または1週間前(−6日目)から開始し、週2回、10mg/kgの2×21で前処置し、5−Fu処置後、24日目の研究終了時まで継続した。体重、除脂肪体重、及び食物摂取を、5−Fu療法前及びその後に、週2回またはより頻繁にモニタリングした。最終研究のために、最後の投薬の0、2、24、96、168、336時間後に、血清を収集した。
[0305]
0日目及び5−FU療法前、2×21で1週間または2週間、前処置した群の平均体重増加は、5−Fu対照群の6.4%と比較して、それぞれ12.6%及び13.9%であった(両方ともp<0.0001)。これは、5−Fuのみの群の7.4%の増加と比較して、ペプチボディで1週間または2週間、前処置した群における除脂肪体重の14.7%及び16.2%の増加と匹敵した(p=0.001及びp<0.0001)。5−Fu投薬後の6日目、1週間または2週間の2×21前処置群の体重変化は、5−Fuのみの群の−8.6%と比較して、−1.9%及び−1.4%であり(両方ともp値は、0.0001未満であった)、除脂肪体重は、5−FUのみの群の−8.8%と比較して、−1.3%及び−0.9%に変化した(両方ともp値は、0.0001未満であった)。回復中の8日目、1週間または2週間の2×21前処置群の体重変化は、5−Fuのみの群の0.6%の増加と比較して、それぞれ、6.8%及び8.5%に有意に増加した(p=0.0006及びp<0.0001)。同様に、除脂肪体重は、1週間または2週間で、4.9%及び6.0%に変化した。2×21前処置群を、5−Fuのみの群の−3.3%と比較した(それぞれ、p=0.001及びp<0.0001)。結果は図11に要約される。
[0306]
8日目〜24日目に、ほぼすべてのマウスが重度の好中球減少症を示し、重度の副作用のため、死亡したマウスもいた。5−Fu投与の前に2×21で、1週間または2週間、前処置した群の生存率は、5−Fuのみの群の13%の生存率と比較して、46%であった(それぞれ、p=0.001及びp=0.009)。生存結果は図12に要約される。
[0307]
ANOVA反復測定法を用いた統計分析は、5−Fuのみで処置した群と比較して、5−Fu処置前に2×21ペプチボディで1週間または2週間、前処置した群が、−13日目〜8日目の研究経過全体を通じて、有意により高い体重及び除脂肪体重を有したことを示した(両方とも0.0001未満のp値)。
[0308]
この研究からの結果は、1週間または2週間の10mg/kg、週2回の抗ミオスタチンペプチボディ、2×21での前処置は、C57Bl/6マウスにおいて、5−Fuが誘導する体重損失及び筋萎縮を有意に改善するのに有効であることを示した。さらに、ペプチボディでの前処置は、生存率及び5−Fu化学療法に反応する期間を増加させた。したがって、本発明のミオスタチン結合剤等のミオスタチン拮抗薬を、化学療法剤または他の化学剤での治療の前及び治療中に用いて、化学薬品悪液質を防止するかまたは改善することも可能である。
実施例17:除脂肪体重及び下肢筋肉量は、アンドロゲン枯渇療法を受けている前立腺癌を有するヒト患者におけるミオスタチンの薬理学的阻害後増加する。
[0309]
ヒトにおけるミオスタチン阻害の可能性を調べるために、ADTを受けている前立腺癌患者において、AMG745を用いた研究が行われた。研究の目的には、AMG745の安全性、忍容性、薬物動態学(PK)、及び薬理学(PD)の評価が含まれた。
[0309]
ヒトにおけるミオスタチン阻害の可能性を調べるために、ADTを受けている前立腺癌患者において、AMG745を用いた研究が行われた。研究の目的には、AMG745の安全性、忍容性、薬物動態学(PK)、及び薬理学(PD)の評価が含まれた。
材料及び方法
一般研究設計
[0310]
これは、ADTを受けている前立腺癌に罹患している男性における多施設のランダム化二重盲検プラセボ対照並行群研究であった。この試験は、AMG745の安全性、耐容性、PK、及び薬力学を評価するために設計された。
一般研究設計
[0310]
これは、ADTを受けている前立腺癌に罹患している男性における多施設のランダム化二重盲検プラセボ対照並行群研究であった。この試験は、AMG745の安全性、耐容性、PK、及び薬力学を評価するために設計された。
AMG745
[0311]
AMG745は、新規の抗ミオスタチンペプチボディである。ペプチボディは、成分のペプチド(「ペプチ−」)と、抗体(「−ボディ」)に類似する全体構造における免疫グロブリンのFc部分とを表す。この形式において、ペプチドの「弾頭」は、ミオスタチンと相互作用し、その受容体を通したシグナル伝達を阻害する。第2のドメインであるFc成分は、体内で複合体を安定させ、内皮細胞のトランスサイトーシス及びFcRn1を通した再生利用を可能にし、治療に有用な範囲への滞留時間を延長する。この研究からのデータは、ミオスタチンの阻害が標的組織において関連のある生理的効果を誘導することができることを示す。
[0312]
AMG745は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結される2つの同一のポリペプチド鎖からなる。各鎖のN末端部分は、抗ミオスタチンペプチドとグリシン(AQに加えて5つのグリシン)リンカーを介してC末端で融合されるヒトIgG1Fc配列からなる。各ポリペプチド鎖は、アミノ酸メチオニンから始まってグルタミン酸で終わる255アミノ酸からなる。各ポリペプチド鎖上には、残基Cys42−Cys102、Cys148−Cys206、及びCys242−Cys249の間に3つの鎖間ジスルフィド結合があり、Cys7 鎖1−Cys7 鎖2及びCys10 鎖1−Cys10 鎖2の間に2つの鎖間ジスルフィド結合がある。AMG745分子を構成する510アミノ酸により、57,099ダルトンの理論的な分子量を得る。微生物で発現したタンパク質として、AMG745は、グリコシル化されない。
[0313]
AMG745の各ポリペプチド鎖(配列番号635)の255残基アミノ酸配列を以下に示す。配列の単純フォント部分は、IgG1Fc配列(配列番号296)を示す。太字フォント部分は、5つのグリシン+AQリンカー配列(配列番号636)を示す。配列の太字及び斜字部分は、抗ミオスタチンペプチド(配列番号311)を示す。
[0311]
AMG745は、新規の抗ミオスタチンペプチボディである。ペプチボディは、成分のペプチド(「ペプチ−」)と、抗体(「−ボディ」)に類似する全体構造における免疫グロブリンのFc部分とを表す。この形式において、ペプチドの「弾頭」は、ミオスタチンと相互作用し、その受容体を通したシグナル伝達を阻害する。第2のドメインであるFc成分は、体内で複合体を安定させ、内皮細胞のトランスサイトーシス及びFcRn1を通した再生利用を可能にし、治療に有用な範囲への滞留時間を延長する。この研究からのデータは、ミオスタチンの阻害が標的組織において関連のある生理的効果を誘導することができることを示す。
[0312]
AMG745は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結される2つの同一のポリペプチド鎖からなる。各鎖のN末端部分は、抗ミオスタチンペプチドとグリシン(AQに加えて5つのグリシン)リンカーを介してC末端で融合されるヒトIgG1Fc配列からなる。各ポリペプチド鎖は、アミノ酸メチオニンから始まってグルタミン酸で終わる255アミノ酸からなる。各ポリペプチド鎖上には、残基Cys42−Cys102、Cys148−Cys206、及びCys242−Cys249の間に3つの鎖間ジスルフィド結合があり、Cys7 鎖1−Cys7 鎖2及びCys10 鎖1−Cys10 鎖2の間に2つの鎖間ジスルフィド結合がある。AMG745分子を構成する510アミノ酸により、57,099ダルトンの理論的な分子量を得る。微生物で発現したタンパク質として、AMG745は、グリコシル化されない。
[0313]
AMG745の各ポリペプチド鎖(配列番号635)の255残基アミノ酸配列を以下に示す。配列の単純フォント部分は、IgG1Fc配列(配列番号296)を示す。太字フォント部分は、5つのグリシン+AQリンカー配列(配列番号636)を示す。配列の太字及び斜字部分は、抗ミオスタチンペプチド(配列番号311)を示す。
発現及び調製
[0314]
AMG745は、本明細書に記載される大腸菌の発酵による不溶性封入体として発現された。一般的な発酵は、誘導から12〜16時間後に開始し、続いて、ディスクスタック遠心分離機を用いて細胞採取する。高圧均質化を用いた細胞の溶解により、封入体を単離した。洗浄及び遠心分離後、得られた二重洗浄した封入体スラリー(DWIB)を精製まで−30o±10oCで保存した。
[0315]
DWIBの可溶化後、AMG745は、尿素、グリセロール、アルギニン、及び酸化還元対システイン/シスタミンを含有する溶液中でリフォールディングした。リフォールディング後、産物を濃縮し、リフォールディング試薬を限外濾過及び透析(UF/DF)プロセス手段によって取り除いた。透析産物を酸性化し、続いて、清澄化した。その後、産物を3つの異なるクロマトグラフィーステップを通して精製した:2つのアニオン交換(Q Sepharose Fast Flow)カラム(1つはフロースルーモードにおいて行われたもの、もう1つは、結合及び溶出モードで行われたもの)、及びHIC(Butyl Sepharose Fast Flow)カラム。次いで、産物をさらに濃縮し、UF/DFプロセスを用いて製剤緩衝液に透析した。次いで、製剤産物を、0.2μmのフィルターを通してバルク容器に濾過し、−30℃±10℃で冷凍した。
[0316]
さらなるクロマトグラフィーステップを、臨床薬物プロセスのための精製プロセスに加えて、宿主細胞に関連する不純物を取り除いた。
[0314]
AMG745は、本明細書に記載される大腸菌の発酵による不溶性封入体として発現された。一般的な発酵は、誘導から12〜16時間後に開始し、続いて、ディスクスタック遠心分離機を用いて細胞採取する。高圧均質化を用いた細胞の溶解により、封入体を単離した。洗浄及び遠心分離後、得られた二重洗浄した封入体スラリー(DWIB)を精製まで−30o±10oCで保存した。
[0315]
DWIBの可溶化後、AMG745は、尿素、グリセロール、アルギニン、及び酸化還元対システイン/シスタミンを含有する溶液中でリフォールディングした。リフォールディング後、産物を濃縮し、リフォールディング試薬を限外濾過及び透析(UF/DF)プロセス手段によって取り除いた。透析産物を酸性化し、続いて、清澄化した。その後、産物を3つの異なるクロマトグラフィーステップを通して精製した:2つのアニオン交換(Q Sepharose Fast Flow)カラム(1つはフロースルーモードにおいて行われたもの、もう1つは、結合及び溶出モードで行われたもの)、及びHIC(Butyl Sepharose Fast Flow)カラム。次いで、産物をさらに濃縮し、UF/DFプロセスを用いて製剤緩衝液に透析した。次いで、製剤産物を、0.2μmのフィルターを通してバルク容器に濾過し、−30℃±10℃で冷凍した。
[0316]
さらなるクロマトグラフィーステップを、臨床薬物プロセスのための精製プロセスに加えて、宿主細胞に関連する不純物を取り除いた。
製剤
[0317]
30mg/mLのAMG745に対する最終投薬製剤は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75であった。
[0317]
30mg/mLのAMG745に対する最終投薬製剤は、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75であった。
投薬量及び対象
[0318]
0.3mg/kg、1.0mg/kg、及び3.0mg/kgの皮下投与は、それぞれ、週1回、4週間行なわれ、逐次的コホートにおいて評価された。AMG745またはプラセボに対して3:1の割り当て比でランダムに選ばれた8人の対象を、0.3mg/kgの用量コホート及び1.0mg/kgの用量コホートに登録した。除脂肪体重における4週間の用量の安全性、耐容性、PK、及び効果を評価するために、AMG745またはプラセボに対して1:1の割り当て比でランダムに選ばれた38人の対象すべてを、3.0mg/kgの用量コホートに登録した。
[0319]
前回のコホートに登録された最後の対象が、治験薬の第3の用量を与えられた後、少なくとも14日間追跡された後に、用量漸増決定が行われ、これらは、すべての利用可能な有害事象、バイタルサイン、及び検査値の盲目検査に基づいた。
[0320]
この研究は、地方の施設内治験審査委員会によって承認され、FDA及びICHの良好な臨床実践ガイドラインに従って行われた。すべての対象は、研究の開始前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。
[0318]
0.3mg/kg、1.0mg/kg、及び3.0mg/kgの皮下投与は、それぞれ、週1回、4週間行なわれ、逐次的コホートにおいて評価された。AMG745またはプラセボに対して3:1の割り当て比でランダムに選ばれた8人の対象を、0.3mg/kgの用量コホート及び1.0mg/kgの用量コホートに登録した。除脂肪体重における4週間の用量の安全性、耐容性、PK、及び効果を評価するために、AMG745またはプラセボに対して1:1の割り当て比でランダムに選ばれた38人の対象すべてを、3.0mg/kgの用量コホートに登録した。
[0319]
前回のコホートに登録された最後の対象が、治験薬の第3の用量を与えられた後、少なくとも14日間追跡された後に、用量漸増決定が行われ、これらは、すべての利用可能な有害事象、バイタルサイン、及び検査値の盲目検査に基づいた。
[0320]
この研究は、地方の施設内治験審査委員会によって承認され、FDA及びICHの良好な臨床実践ガイドラインに従って行われた。すべての対象は、研究の開始前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。
研究対象
[0321]
適格対象は、前立腺癌の文書化された病歴を有する;登録時、文書化された遠隔転移がない;登録前に前立腺癌に対する一次、アジュバント、またはサルベージ治療として少なくとも6カ月間ADT(アンドロゲン枯渇療法)を受けている;ADTが断続的に投与されていた場合、スクリーニング時、血清総テストステロン濃度が50ng/dL未満である;治験責任医師によって決定される、安定した前立腺特異抗原(PSA);一次筋肉疾患、ミオパシー、またはニューロパシーの病歴がない;体重が137kg(300lb)以下であり、身長が78インチ(約1.98m)以下である;スクリーニング時、米国東海岸癌臨床試験グループ(ECOG)の一般状態が0である;臨床的に有意なクレアチンホスホキナーゼ(CPK)の上昇がない;糸球体濾過率(GFR)が40mL/分を超える;アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)またはアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)が正常値上限の2.5倍を超えない、男性であった。
[0321]
適格対象は、前立腺癌の文書化された病歴を有する;登録時、文書化された遠隔転移がない;登録前に前立腺癌に対する一次、アジュバント、またはサルベージ治療として少なくとも6カ月間ADT(アンドロゲン枯渇療法)を受けている;ADTが断続的に投与されていた場合、スクリーニング時、血清総テストステロン濃度が50ng/dL未満である;治験責任医師によって決定される、安定した前立腺特異抗原(PSA);一次筋肉疾患、ミオパシー、またはニューロパシーの病歴がない;体重が137kg(300lb)以下であり、身長が78インチ(約1.98m)以下である;スクリーニング時、米国東海岸癌臨床試験グループ(ECOG)の一般状態が0である;臨床的に有意なクレアチンホスホキナーゼ(CPK)の上昇がない;糸球体濾過率(GFR)が40mL/分を超える;アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)またはアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)が正常値上限の2.5倍を超えない、男性であった。
研究手順
[0322]
すべてのコホートに対して前研究及び研究中周期的に、以下の処置、すなわち身体検査、バイタルサイン、心電図、血液学的、化学的、尿検査、抗−AMG745抗体スクリーニング、及びPKのための血液試料の採取を行った。3mg/kgのコホートに関して、DXA及び下肢CTスキャンを、投与前、研究29日目(研究の終了)、及び1カ月の追跡訪問時に行った。HologicまたはGE Lunarスキャナーにおいて、すべてのDXAスキャンを行った。個々の対象におけるすべての訪問で、同じスキャナーを使用した。検査及び分析におけるすべてのDXAスキャンを中心となる読み取り施設に送信した。
[0322]
膝伸展機を用いて、1回の反復(1−RM)に対して引き上げられた最大重量に基づいて下肢の強度を評価した。2日目より前の2週間以内及び/または2日目まで、29日目、及び1カ月の追跡訪問時に、評価を行った。
[0323]
1日目より前の2週間以内及び/または1日目まで、29日目、及び1カ月の追跡訪問時に、簡易身体能力バッテリー(SPPB)を行った。SPPBには、立位平衡、時限歩行テスト、5回椅子座りの評価が含まれた。
[0324]
すべての研究訪問時に、有害事象及び併用薬を記録した。
[0325]
統計的分析
[0326]
AMG745またはプラセボに対して3:1の割り当て比でランダムに選ばれた8人の対象を、0.3mg/kgの用量コホート及び1.0mg/kgの用量コホートに登録して、複数回用量の投与後の安全性及びPKを特徴付けた。安全性/PKを特徴付け、さらに全身組成におけるAMG745の効果を調べるために、AMG745またはプラセボに対して1:1の割り当て比でランダムに選ばれた38人の対象を、3mg/kgの用量コホートに登録することを計画した。この計画された登録は、二次エンドポイントに対して処置群間差が1.5%であり、ベースラインから5週目までの除脂肪体重のパーセント変化(2.1の標準偏差;Smith et al.2001)であると仮定され、10%の有意水準の1つの片側検定に対して80%の検出力を得た。分散分析(ANOVA)を用いて、処置群間(3mg/kgのAMG745対プラセボ)のベースラインからのパーセント変化を比較した。
[0327]
薬物動態解析には、薬物動態パラメータが推定され得たすべての処置された対象が含まれた。非コンパートメント法を用いて、薬物動態パラメータを推定した。各薬物動態パラメータに対して用量コホートによる要約統計量を生成した。個々の対象における血清AMG745の濃度−時間プロファイル及び各用量の平均値のグラフを作成した。
[0328]
安全性分析に関して、AMG745またはプラセボを受けたすべての対象が含まれ、すべてのコホートからプラセボで処置した対象を合わせて、複合プラセボ群を形成した。
[0322]
すべてのコホートに対して前研究及び研究中周期的に、以下の処置、すなわち身体検査、バイタルサイン、心電図、血液学的、化学的、尿検査、抗−AMG745抗体スクリーニング、及びPKのための血液試料の採取を行った。3mg/kgのコホートに関して、DXA及び下肢CTスキャンを、投与前、研究29日目(研究の終了)、及び1カ月の追跡訪問時に行った。HologicまたはGE Lunarスキャナーにおいて、すべてのDXAスキャンを行った。個々の対象におけるすべての訪問で、同じスキャナーを使用した。検査及び分析におけるすべてのDXAスキャンを中心となる読み取り施設に送信した。
[0322]
膝伸展機を用いて、1回の反復(1−RM)に対して引き上げられた最大重量に基づいて下肢の強度を評価した。2日目より前の2週間以内及び/または2日目まで、29日目、及び1カ月の追跡訪問時に、評価を行った。
[0323]
1日目より前の2週間以内及び/または1日目まで、29日目、及び1カ月の追跡訪問時に、簡易身体能力バッテリー(SPPB)を行った。SPPBには、立位平衡、時限歩行テスト、5回椅子座りの評価が含まれた。
[0324]
すべての研究訪問時に、有害事象及び併用薬を記録した。
[0325]
統計的分析
[0326]
AMG745またはプラセボに対して3:1の割り当て比でランダムに選ばれた8人の対象を、0.3mg/kgの用量コホート及び1.0mg/kgの用量コホートに登録して、複数回用量の投与後の安全性及びPKを特徴付けた。安全性/PKを特徴付け、さらに全身組成におけるAMG745の効果を調べるために、AMG745またはプラセボに対して1:1の割り当て比でランダムに選ばれた38人の対象を、3mg/kgの用量コホートに登録することを計画した。この計画された登録は、二次エンドポイントに対して処置群間差が1.5%であり、ベースラインから5週目までの除脂肪体重のパーセント変化(2.1の標準偏差;Smith et al.2001)であると仮定され、10%の有意水準の1つの片側検定に対して80%の検出力を得た。分散分析(ANOVA)を用いて、処置群間(3mg/kgのAMG745対プラセボ)のベースラインからのパーセント変化を比較した。
[0327]
薬物動態解析には、薬物動態パラメータが推定され得たすべての処置された対象が含まれた。非コンパートメント法を用いて、薬物動態パラメータを推定した。各薬物動態パラメータに対して用量コホートによる要約統計量を生成した。個々の対象における血清AMG745の濃度−時間プロファイル及び各用量の平均値のグラフを作成した。
[0328]
安全性分析に関して、AMG745またはプラセボを受けたすべての対象が含まれ、すべてのコホートからプラセボで処置した対象を合わせて、複合プラセボ群を形成した。
結果
[0329]
計54人の対象が、治験薬を受け(31人がAMG745、23人がプラセボ)、これらの対象すべてが研究を完了した。治験薬を受けた54人のうちの53人の対象が4つの計画されたすべての用量を受けた。1人の対象(AMG745 3mg/kg)は、腹部の紅斑の有害事象により、第2の投与後、治験責任医師により中断され、この対象は、研究に残り、研究の追跡評価を完了した。研究集団の人口動態及びベースライン特性を表1に要約する。
[0330]
大部分の対象(87%)は、白人/白色人種であった。平均(標準偏差)年齢は、AMG745を受けた対象において73.1(6.8)歳であり、プラセボを受けた対象において73.5(6.7)歳であった。ベースラインの身長、体重、ボディマス指数(BMI)、ならびに腫瘍量及び処置に関するベースライン特性が表2に要約される。これらのベースライン特性のすべては、概して、AMG745を受けた対象とプラセボを受けた対象の間で均衡が取れていた。
[0329]
計54人の対象が、治験薬を受け(31人がAMG745、23人がプラセボ)、これらの対象すべてが研究を完了した。治験薬を受けた54人のうちの53人の対象が4つの計画されたすべての用量を受けた。1人の対象(AMG745 3mg/kg)は、腹部の紅斑の有害事象により、第2の投与後、治験責任医師により中断され、この対象は、研究に残り、研究の追跡評価を完了した。研究集団の人口動態及びベースライン特性を表1に要約する。
[0330]
大部分の対象(87%)は、白人/白色人種であった。平均(標準偏差)年齢は、AMG745を受けた対象において73.1(6.8)歳であり、プラセボを受けた対象において73.5(6.7)歳であった。ベースラインの身長、体重、ボディマス指数(BMI)、ならびに腫瘍量及び処置に関するベースライン特性が表2に要約される。これらのベースライン特性のすべては、概して、AMG745を受けた対象とプラセボを受けた対象の間で均衡が取れていた。
薬物動態学の結果
[0331]
AMG745は、0.3〜3mg/kgの用量範囲にわたる毎週のSC用量投与4回の後に、用量−線形薬物動態を示した。中央値tmaxは、第1の投与から約24〜72時間後、及び第4の投与から約24〜48時間後の範囲に及び、第4の投与後の見かけの平均血清クリアランス(CL/F)は、1.89〜2.29mL/時/kgの範囲に及ぶと推定された(表2)。
[0331]
AMG745は、0.3〜3mg/kgの用量範囲にわたる毎週のSC用量投与4回の後に、用量−線形薬物動態を示した。中央値tmaxは、第1の投与から約24〜72時間後、及び第4の投与から約24〜48時間後の範囲に及び、第4の投与後の見かけの平均血清クリアランス(CL/F)は、1.89〜2.29mL/時/kgの範囲に及ぶと推定された(表2)。
抗AMG745抗体の結果
[0332]
研究を完了した54人の対象に関して、抗AMG745(全分子)結合抗体のための表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサー免疫学的検定によって、血清試料が分析された。2人の対象からの試料は、免疫学的検定のうちの1つ以上において陽性結果を得た:
[0333]
AMG745を受けた対象のうちで抗AMG745(全分子)結合抗体の発生率は、1/31(3%)であった。抗AMG745抗体の陽性結果は、これらの対象において、AMG745の曝露に影響を及ぼすように思われなかった。
[0334]
中和抗体は、バイオアッセイによる技術的な問題により評価され得なかった。
[0332]
研究を完了した54人の対象に関して、抗AMG745(全分子)結合抗体のための表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサー免疫学的検定によって、血清試料が分析された。2人の対象からの試料は、免疫学的検定のうちの1つ以上において陽性結果を得た:
[0333]
AMG745を受けた対象のうちで抗AMG745(全分子)結合抗体の発生率は、1/31(3%)であった。抗AMG745抗体の陽性結果は、これらの対象において、AMG745の曝露に影響を及ぼすように思われなかった。
[0334]
中和抗体は、バイオアッセイによる技術的な問題により評価され得なかった。
薬力学的結果
[0335]
薬力学的効果の分析は、3mg/kgの用量コホートに限定され、本研究は、除脂肪体重のパーセント変化における治療群間の統計的に有意な差を検出するために、80%検出力を有するように設計された。
[0335]
薬力学的効果の分析は、3mg/kgの用量コホートに限定され、本研究は、除脂肪体重のパーセント変化における治療群間の統計的に有意な差を検出するために、80%検出力を有するように設計された。
除脂肪体重
[0336]
ベースラインからEOS(29日目)までの除脂肪体重のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において1.5%(0.5%)であり、プラセボ対象において−0.7%(0.5%)であり、群間差は2.2%(0.8%)であり、統計的に有意であった(p=0.008)。この効果は、29日目から1カ月後の追加訪問時まで維持された:除脂肪体重のパーセント変化は、AMG745対象において1.9%(0.5%)であり、プラセボ対象において0.2%(0.5%)であり、1.7%(0.7%)の群間差は、統計的に有意であった(p=0.023)(表3、図13)。
[0337]
ベースラインからEOS(29日目)までの右脚+左脚の非脂肪量のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において正(1.3%[0.9%])であり、プラセボ対象において負(−1.0%[0.9%])であり、この差(最小二乗平均[SE])は2.3%[1.3%])であった(p=0.084)。追跡訪問時(29日目から1カ月後)、ベースラインから追跡訪問までの右脚+左脚の非脂肪量のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において正(1.6%[0.8%])であり、ラセボ対象において負(−0.6%[0.8%])であり、この差(最小二乗平均[SE])は2.1%[1.1%])であった(p=0.065)(表3)。
[0336]
ベースラインからEOS(29日目)までの除脂肪体重のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において1.5%(0.5%)であり、プラセボ対象において−0.7%(0.5%)であり、群間差は2.2%(0.8%)であり、統計的に有意であった(p=0.008)。この効果は、29日目から1カ月後の追加訪問時まで維持された:除脂肪体重のパーセント変化は、AMG745対象において1.9%(0.5%)であり、プラセボ対象において0.2%(0.5%)であり、1.7%(0.7%)の群間差は、統計的に有意であった(p=0.023)(表3、図13)。
[0337]
ベースラインからEOS(29日目)までの右脚+左脚の非脂肪量のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において正(1.3%[0.9%])であり、プラセボ対象において負(−1.0%[0.9%])であり、この差(最小二乗平均[SE])は2.3%[1.3%])であった(p=0.084)。追跡訪問時(29日目から1カ月後)、ベースラインから追跡訪問までの右脚+左脚の非脂肪量のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において正(1.6%[0.8%])であり、ラセボ対象において負(−0.6%[0.8%])であり、この差(最小二乗平均[SE])は2.1%[1.1%])であった(p=0.065)(表3)。
体脂肪量のパーセント変化
[0338]
ベースラインからEOS(29日目)までの体脂肪量のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において−0.7%(0.2%)であり、プラセボ対象において0.3%(0.2%)であり、−1.0%(0.3%)の群間差は、統計的に有意であった(p=0.005)。ベースラインから追跡訪問(29日目から1カ月後)までのパーセント変化は、AMG745対象において−0.8%(0.3%)であり、プラセボ対象において0.0%(0.3%)であり、群間差は、−0.7%[0.4%])であった(p=0.068)(表3)。
[0338]
ベースラインからEOS(29日目)までの体脂肪量のパーセント変化(最小二乗平均[SE])は、AMG745対象において−0.7%(0.2%)であり、プラセボ対象において0.3%(0.2%)であり、−1.0%(0.3%)の群間差は、統計的に有意であった(p=0.005)。ベースラインから追跡訪問(29日目から1カ月後)までのパーセント変化は、AMG745対象において−0.8%(0.3%)であり、プラセボ対象において0.0%(0.3%)であり、群間差は、−0.7%[0.4%])であった(p=0.068)(表3)。
下肢筋肉サイズ
[0339]
ベースラインからEOS(29日目)までの下肢筋肉サイズのパーセント変化は、AMG745対象において1.2%(0.7%)であり、プラセボ対象において−0.7%(0.7%)であり、群間差は、1.8%(1.0%)であった(p=0.065)。ベースラインから追跡訪問(29日目から1カ月後)までの下肢筋肉サイズのパーセント変化は、AMG745対象において2.7%(0.7%)であり、プラセボ対象において−0.1%(0.7%)であり、2.8%(1.0%)の群間差は、統計的に有意であった(p=0.007)(表3)。
[0339]
ベースラインからEOS(29日目)までの下肢筋肉サイズのパーセント変化は、AMG745対象において1.2%(0.7%)であり、プラセボ対象において−0.7%(0.7%)であり、群間差は、1.8%(1.0%)であった(p=0.065)。ベースラインから追跡訪問(29日目から1カ月後)までの下肢筋肉サイズのパーセント変化は、AMG745対象において2.7%(0.7%)であり、プラセボ対象において−0.1%(0.7%)であり、2.8%(1.0%)の群間差は、統計的に有意であった(p=0.007)(表3)。
体重及びボディマス指数
[0340]
除脂肪体重の観察された増加及び体脂肪の同時に起こる減少と一致して、体重またはBMIのいずれにおける全体的効果もなかった。
[0340]
除脂肪体重の観察された増加及び体脂肪の同時に起こる減少と一致して、体重またはBMIのいずれにおける全体的効果もなかった。
身体機能(SPPB)及び下肢強度(1−RMの膝伸展)
[0341]
ベースラインからの変化の統計的分析は、SPPBまたは1−RM膝伸展に関して行われなかったが、一般に、AMG745に関連する効果は、4回の投与のこの短期間の研究においては見られなかった。
[0341]
ベースラインからの変化の統計的分析は、SPPBまたは1−RM膝伸展に関して行われなかったが、一般に、AMG745に関連する効果は、4回の投与のこの短期間の研究においては見られなかった。
生化学パラメータ
[0342]
空腹時血漿グルコース、インスリン、コレステロール、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、またはトリグリセリド(trigylercides)に関して、治療群間(AMG745対プラセボ)の見かけ上の差はなかった。
[0342]
空腹時血漿グルコース、インスリン、コレステロール、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、またはトリグリセリド(trigylercides)に関して、治療群間(AMG745対プラセボ)の見かけ上の差はなかった。
安全性
[0343]
有害事象は、任意の用量のAMG745を与えられた31人のうちの25人の対象(81%)に対して、プラセボを与えられた23人のうちの12人の対象(52%)に対して報告された(表4)。対象の有害事象の発生率とAMG745の投与との間での関係は明らかではなかった。
[0344]
下痢(AMG745、4/31=13%;プラセボ、2/23=9%)、疲労(AMG745、4/31=13%;プラセボ、1/23=4%);打撲傷(すべてAMG745[3/31=10%]);及び注射部位の変色(AMG745、2/31=6%;プラセボ、1/23=4%)の4つの有害事象が、2人より多い対象において報告された。
[0345]
治験責任医師により治療とは無関係であると見なされた失神の1つの重篤な有害事象を除いて(3mg/kgの用量コホートにおいてAMG745を与えられ、失神症状の前歴のあった対象において)、すべての有害事象は、重症度が軽度または中等度であり、深刻ではないと報告された。この事象は、最終の投与から2週間にわたって生じた。
[0346]
処置に関連する有害事象は、任意の用量のAMG745を与えられた31人のうちの7人の対象(23%)で、及びプラセボを与えられた23人のうちの1人の対象(4%)で報告された。処置に関連する有害事象は、1人の対象を超えては報告されなかった。
[0347]
3mg/kgの用量コホートにおいてAMG745を与えられていた1人の対象に関して、治験薬の投与は、腹部の紅斑の有害事象により、第2の投与後、治験責任医師により中断され、中等度の重症度(CTCAE v3.0グレード2)から軽度に減少する(CTCAE v3.0グレード1)と報告され、治験薬に関連した。
[0348]
一般に、実験変数、ECG、バイタルサイン、テストステロンレベル、または前立腺特異抗原レベルにおけるAMG745の臨床的に重要な効果は、明らかではなかった。わずかに上昇した肝機能検査値が、AMG745(0.3mg/kg)を与えられた1人の対象における有害事象として報告され(最大アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ[AST]、アラニンアミノトランスフェラーゼ[ALT]、及びアルカリ性ホスファターゼ[AP]は、それぞれ、正常上限(ULN)の2.2倍、1.7倍、及び1.5倍であった)、上述の失神の重篤な有害事象に関連して、心電図の変化の有害事象(中等度の重症度[CTCAE v3.0グレード2])が報告された。有害事象の要約を表5に示す。
[0349]
ADTを受けている前立腺癌に罹患している男性におけるこのランダム化二重盲検プラセボ制御複数回投与研究は、最大3.0mg/kgで毎週のSC用量を4回投与されたAMG 745の忍容性が一般に良好であることを実証した。これらの結果はまた、除脂肪体重の増加、体脂肪の減少、及び下肢筋肉サイズの増加のような、ミオスタチンを薬理学的に阻害する薬力学的効果の第1の臨床的証拠をもたらした。
[0350]
この研究において得られたデータは、ADTにより治療されている前立腺癌に罹患している男性において、AMG745によりミオスタチンの薬理学的な阻害が、29日間の短期治療期間後でさえ、除脂肪体重を増加させ、体脂肪を減少させることを示す。
[0343]
有害事象は、任意の用量のAMG745を与えられた31人のうちの25人の対象(81%)に対して、プラセボを与えられた23人のうちの12人の対象(52%)に対して報告された(表4)。対象の有害事象の発生率とAMG745の投与との間での関係は明らかではなかった。
[0344]
下痢(AMG745、4/31=13%;プラセボ、2/23=9%)、疲労(AMG745、4/31=13%;プラセボ、1/23=4%);打撲傷(すべてAMG745[3/31=10%]);及び注射部位の変色(AMG745、2/31=6%;プラセボ、1/23=4%)の4つの有害事象が、2人より多い対象において報告された。
[0345]
治験責任医師により治療とは無関係であると見なされた失神の1つの重篤な有害事象を除いて(3mg/kgの用量コホートにおいてAMG745を与えられ、失神症状の前歴のあった対象において)、すべての有害事象は、重症度が軽度または中等度であり、深刻ではないと報告された。この事象は、最終の投与から2週間にわたって生じた。
[0346]
処置に関連する有害事象は、任意の用量のAMG745を与えられた31人のうちの7人の対象(23%)で、及びプラセボを与えられた23人のうちの1人の対象(4%)で報告された。処置に関連する有害事象は、1人の対象を超えては報告されなかった。
[0347]
3mg/kgの用量コホートにおいてAMG745を与えられていた1人の対象に関して、治験薬の投与は、腹部の紅斑の有害事象により、第2の投与後、治験責任医師により中断され、中等度の重症度(CTCAE v3.0グレード2)から軽度に減少する(CTCAE v3.0グレード1)と報告され、治験薬に関連した。
[0348]
一般に、実験変数、ECG、バイタルサイン、テストステロンレベル、または前立腺特異抗原レベルにおけるAMG745の臨床的に重要な効果は、明らかではなかった。わずかに上昇した肝機能検査値が、AMG745(0.3mg/kg)を与えられた1人の対象における有害事象として報告され(最大アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ[AST]、アラニンアミノトランスフェラーゼ[ALT]、及びアルカリ性ホスファターゼ[AP]は、それぞれ、正常上限(ULN)の2.2倍、1.7倍、及び1.5倍であった)、上述の失神の重篤な有害事象に関連して、心電図の変化の有害事象(中等度の重症度[CTCAE v3.0グレード2])が報告された。有害事象の要約を表5に示す。
[0349]
ADTを受けている前立腺癌に罹患している男性におけるこのランダム化二重盲検プラセボ制御複数回投与研究は、最大3.0mg/kgで毎週のSC用量を4回投与されたAMG 745の忍容性が一般に良好であることを実証した。これらの結果はまた、除脂肪体重の増加、体脂肪の減少、及び下肢筋肉サイズの増加のような、ミオスタチンを薬理学的に阻害する薬力学的効果の第1の臨床的証拠をもたらした。
[0350]
この研究において得られたデータは、ADTにより治療されている前立腺癌に罹患している男性において、AMG745によりミオスタチンの薬理学的な阻害が、29日間の短期治療期間後でさえ、除脂肪体重を増加させ、体脂肪を減少させることを示す。
[0351]
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によってその範囲が限定されるものではなく、特定の実施形態は、本発明の個々の態様の単なる説明として意図され、機能的に同等である方法及び構成要素が発明である。実際に、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によってその範囲が限定されるものではなく、特定の実施形態は、本発明の個々の態様の単なる説明として意図され、機能的に同等である方法及び構成要素が発明である。実際に、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
Claims (20)
- 悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または体脂肪を減少させる及び/または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に、薬学的に許容される担体と混和して治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、
前記ヒト対象が、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、
前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号635のアミノ酸配列(MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE)からなる少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディからなり、
前記ミオスタチン拮抗薬が、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75において製剤化され、
前記ミオスタチン拮抗薬が、0.3mg/kg、1.0mg/kg、または3.0mg/kgの用量で、週1回、4週間皮下投与される、前記方法。 - 悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または体脂肪を減少させる及び/または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、前記ヒト対象が、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号311に記載のアミノ酸配列(LADHGQCIRWPWMCPPEGWE)からなるポリペプチドを含む、前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号635に記載のアミノ酸配列(MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE)からなる少なくとも1つのポリペプチドを含むからペプチボディからなる、請求項2に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号635に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列からなる少なくとも1つのポリペプチドを含むペプチボディからなる、請求項2に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、大腸菌において不溶性封入体で発現され、細胞採取、細胞溶解、封入体の可溶化、リフォールディング、濃縮、及びクロマトグラフィー精製を介して単離される、ペプチボディである、請求項2に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、さらなる化合物に複合される、請求項2〜5に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、薬学的組成物において製剤化される、請求項2〜6に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む薬学的組成物において製剤化される、請求項2〜6に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、10mM酢酸ナトリウム、9%(w/v)スクロース、0.004%(w/v)ポリソルベート20、pH4.75において製剤化される、請求項2〜6に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、非経口でまたは経口で投与される、請求項2〜9に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、皮下投与される、請求項2〜9に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、0.01〜10.0mg/kg(境界値を含む)の用量で投与される、請求項2〜10に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、0.3〜3.0mg/kg(境界値を含む)の用量で投与される、請求項2〜10に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、0.3、1.0、または3.0mg/kgの用量で投与される、請求項2〜10に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、1日2回、1日1回、週2回、週1回、月2回、または月1回投与される、請求項2〜14に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、週1回、4週間投与される、請求項2〜14に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、さらなる薬剤と共投与される、請求項2〜16に記載の前記方法。
- 前記ミオスタチン拮抗薬が、抗前立腺癌剤を含むさらなる薬剤と共投与される、請求項2〜16に記載の前記方法。
- 前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けているヒト対象において悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または下肢筋肉量を増加させるための、あるいは医薬の製造における、ミオスタチン拮抗薬の使用であって、前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号311に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、前記使用。
- 前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けているヒト対象において悪液質を治療するもしくは調節する及び/または除脂肪体重を増加させる及び/または下肢筋肉量を増加させるための、あるいは医薬の製造における、ミオスタチン拮抗薬の使用であって、前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号635に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むペプチボディからなる、前記使用。
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