BRPI0716249A2 - anticorpos antimiostatina - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTIMIOSTATINA. A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais antimiostatina que preferencialmente se ligam à miostatina sobre GDF-11, tendo forte afinidade de ligação à miostatina e sendo resistente à degradação química. Os anticorpos da invenção são úteis para aumentar a massa muscular, aumentar a densidade óssea, ou para tratamento ou prevenção de vários distúrbios em espécies mamíferas e de aves.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTIMIOSTATINA".

Este pedido de patente reivindica o benefício de pedido de pa- tente provisório US 60/824498, depositado em 5 de setembro de 2006.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de medicina, particu- larmente no campo de anticorpos monoclonais contra miostatina. Mais espe- cificamente a invenção refere-se a anticorpos monoclonais antimiostatina que preferencialmente se ligam à miostatina sobre GDF-11 e são resistentes à clivagem de proteína, e uso dos anticorpos para tratamento, profilaxia ou diagnóstico de vários distúrbios ou condições em espécies mamíferas e de aves.

Antecedentes da Invenção

Miostatina, também referida como fator de diferenciação de crescimento-8 (GDF-8), é um membro da superfamília TGF-β de proteínas, que compartilha similaridades estruturais com outros membros da família TGF-β. Miostatina é largamente expressa em músculo de esqueleto em de- senvolvimento e adulto e funciona como um regulador negativo de músculo de esqueleto. Miostatina também pode estar envolvida em outros processos fisiológicos incluindo diferenciação de pré-adipócito a adipócitos, e, indireta- mente, com homeostase de glicose e inibição de formação de osso.

Fator de diferenciação de crescimento-11, também referido co- mo GDF-11 ou BMP-11, é o membro da superfamília de TGF-β de proteínas que é mais homólogo à miostatina. A seqüência de aminoácidos das formas maduras de miostatina humana e GDF-11 são cerca de 90% idênticas; en- tretanto, GDF-11 é expressa em uma faixa mais ampla de tecidos que mios- tatina, incluindo polpa dentária, cérebro, coração, rim e pulmão assim como músculo e tecido adiposo. GDF-11 humano foi recentemente verificado go- vernar as janelas temporais durante as quais progenitores multipotentes re- têm competência para produção de distinta progênie neural.

Há uma necessidade terapêutica de inibição específica de uma atividade de miostatina enquanto inibindo minimamente uma atividade de outras proteínas de superfamília TGF-β, particularmente GDF-11. Além dis- so, há uma necessidade diagnostica de um anticorpo antimiostatina que rea- ja - transverso minimamente com uma outra proteína de superfamília TGF-β, particularmente GDF-11, de modo a monitorar ou determinar mais precisa- mente níveis de miostatina em uma amostra. Anticorpos anti - miostatina que preferencialmente se ligam à miostatina sobre GDF-11 são mostrados na publicação internacional número WO 2005/094446. Anticorpos monoclonais humanizados que se ligam preferencialmente à miostatina sobre GDF-11 são mostrados na publicação internacional WO 2007/044411. Anticorpos terapêuticos podem ser submetidos a uma variedade

de reações de degradação, por exemplo, desamidação ou clivagem, que podem ocorrer in vivo ou durante fabricação, formulação, estocagem e uso terapêutico. Por exemplo, resíduos asparagina (Asn) em anticorpos ou ou- tros polipeptídeos são particularmente suscetíveis à clivagem em solução aquosa. Assim, há uma necessidade de um anticorpo antimiostatina que pre- ferencialmente se liga à miostatina sobre GDF-11, tenha uma forte afinidade de ligação para miostatina (isto é, não maior que cerca de 3x10 8 M) e seja resistente à degradação química. Sumário da Invenção Anticorpos da invenção se ligam preferencialmente à miostatina

ao invés de GDF-11, isto é, eles são significantemente menos reativos com GDF-11 que com miostatina. Um anticorpo da invenção se liga à miostatina em pelo menos cerca de 2, 3, 5, 10, 20, 22, ou 25 vezes mais forte que ele se liga a GDF-11 como medido por uma técnica, por exemplo, por ELISA de competição, ou através de ensaio BIACORE ou Kinexa para demonstrar maior afinidade (isto é, menor KD) do anticorpo para GDF-8 que GDF-11. Mais preferivelmente, anticorpos da invenção não se ligam a GDF-11 acima de níveis de fundo no ensaio de ligação usado.

A presente invenção abrange um anticorpo monoclonal antimios- tatina que liga preferencialmente miostatina ao invés de fator de diferencia- ção de crescimento-11 (GDF-11), em que o dito anticorpo se liga à miostati- na com uma afinidade não maior que cerca de 3x10 8 M e em que pelo me- nos 95% do anticorpo monoclonal não é clivado quando presente por um ano a 4°C, seis meses a 25°C, dois meses a 37°C ou quatro semanas a 40°C em uma solução de anticorpo. Uma solução de anticorpo exemplar compreende 1 mg/mL de um anticorpo da invenção, fosfato a 10 mM, pH 7,4, e NaCI a 150 mM. Preferivelmente, anticorpos da invenção são ainda caracterizados por terem uma IC5o de menos que 25 nM, no ensaio de repór- ter SBE/miostatina in vitro descrito aqui no Exemplo 4.

Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é resistente à degradação química, isto é, 100%, 99%, 98%, 97%, 96% ou 95% dos anti- corpos não são clivados, quando presentes em uma solução de anticorpos por um tempo e temperatura selecionados do grupo consistindo em: um ano a 4°C, seis meses a 25°C, dois meses a 37°C, e quatro semanas a 40°C em uma solução de anticorpos. Um tempo e uma temperatura preferidos é de quatro semanas a 40°C. Em uma modalidade, anticorpos da invenção são ainda caracte-

rizados por ligação de miostatina dentro do domínio abrangendo aminoáci- dos 40-64 [ANYCSGECEFVFFLQKYPHTHLVHQA (SEQ ID NO: 29) para ser humano], 43-57[CSGECEFVFLQKYPH (SEQ ID NO: 30) para ser huma- no] ou 45-59 [GECEFVFLQKYPHTH (SEQ ID NO: 31) para ser humano] de miostatina madura. Em uma outra modalidade, anticorpos da invenção são ainda caracterizados por ligação de um polipeptídeo consistindo em aminoá- cidos 40-64, 43-57 ou 45-59 de miostatina madura.

Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) com uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, 5, 6, e 7. Em uma outra modalidade, um anticorpo monoclonal da invenção compreende uma HCVR com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 12 e uma LCVR com uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9 e 10.

Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma HCVR e uma LCVR, em que a dita HCVR compreende um peptídeo em CDRH1 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 23, um peptídeo em CDRH2 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 25, e um pep- tídeo em CDRH3 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 27, e em que a dita LCVR compreende um peptídeo em CDRL1 com a seqüência co- mo mostrada em SEQ ID NO: 13, um peptídeo em CDRL2 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 14, e um peptídeo em CDRL3 com a se- qüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 16, 17, 18 e 19.

Em uma outra modalidade, um anticorpo da invenção compre- ende uma HCVR e uma LCVR, em que a dita HCVR compreende um peptí- deo em CDRH1 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 24, um peptídeo em CDRH2 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 26, e um peptídeo em CDRH3 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 28, e em que a dita LCVR compreende um peptídeo em CDRL1 com a se- qüência como mostrada em SEQ ID NO: 13, um peptídeo em CDRL2 com a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 14, e um peptídeo em CDRL3 com a seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 21 e 22.

Em uma modalidade, um anticorpo da invenção ainda compre- ende uma região constante, em que a dita região constante origina-se do genoma humano ou o genoma de um animal selecionado do grupo consis- tindo em animais domésticos, animais de esporte e animais de fonte de ali- mento. Em uma modalidade mais preferida, um anticorpo da invenção com- preende uma cadeia leve com uma seqüência de aminoácidos como mos- trada em SEQ ID NO: 32 e uma cadeia pesada com uma seqüência de ami- noácidos como mostrada em SEQ ID NO: 33. Em uma outra modalidade, a invenção provê uma composição

(por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo um anticorpo da invenção. A composição da invenção ainda pode compreender um veícu- lo farmaceuticamente aceitável. Na dita composição, o anticorpo da inven- ção é o ingrediente ativo. Preferivelmente a composição compreende uma população homogênea ou substancialmente homogênea de um anticorpo antimiostatina da invenção. A composição para uso terapêutico ou profilático é estéril, pode ser liofilizada, e é preferivelmente suprida com um apropriado diluente.

A invenção provê um processo de inibição de pelo menos uma atividade biológica de miostatina em um animal, preferivelmente uma espé- cie mamífera ou ave, preferivelmente um ser humano, em sua necessidade, compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz de um anticorpo monoclonal an- timiostatina da invenção às ditas espécies mamíferas ou de aves. A inven- ção ainda provê um processo de aperfeiçoamento de massa muscular ou tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio ou condição melhora- da pela neutralização ou antagonização de uma bioatividade de miostatina que compreende administração a um paciente (por exemplo, um ser huma- no) em necessidade de tal tratamento ou prevenção de uma quantidade te- rapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo da invenção.

A invenção realiza um anticorpo da invenção para uso em tera- pia. A invenção realiza o uso de um anticorpo da invenção para a prepara- ção de um medicamento para o tratamento de perda muscular, fragilidade, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de desuso e caquexia.

A invenção realiza o uso de um anticorpo da invenção para a preparação de um medicamento para a prevenção de perda muscular, fragi- lidade, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de desuso e caquexia.

A invenção realiza o processo de tratamento de perda muscular, fragilidade, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de desuso e caquexia em um mamífero, preferivelmente um ser humano, em sua necessidade, através de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticor- po da invenção.

A invenção realiza o processo de prevenção de perda muscular, fragilidade, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de tecido e caquexia em um mamífero, preferivelmente um ser humano, em sua necessidade, através de administração de uma quantidade profilaticamente eficaz de um anticorpo da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1A mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da forma madura de miostatina humana e GDF-11 humano com o epitopo antigênico de Mabs 510C2 e C12 e suas variantes sublinhadas e os resí- duos dentro de epitopo antigênico que diferem entre miostatina e GDF-11 em impressão negrito.

A Figura 1B lista epitopos antigênicos que Mabs 510C2 e C12 e suas variantes ligam.

As Figuras 2A e B mostram as seqüências de aminoácidos das regiões variáveis dos Mabs parentes 510C2 e C12, respectivamente, assim como várias variantes, incluindo domínios CDR e estruturas. Os domínios CDR estão em impressão em negrito e as variações nos domínios CDR es- tão sublinhadas.

A Figura 3 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos dos domínios CDR de Mabs parentes 510C2 e C12 e anticorpos da presente invenção. As variações são impressas em negrito e sublinhadas.

A Figura 4 lista as seqüências de aminoácidos da cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo monoclonal da invenção, isto é, N93H-C12.

As Figuras 5A e B comparam afinidade de certos anticorpos mo- noclonais da invenção com aquela de seu anticorpo parente como determi- nado por ELISA.

Descrição Detalhada da Invenção Definições:

Quando aqui usado, o termo "miostatina madura" (vide SEQ ID NO: 1 para espécies humana, murina, rato, galinha, peru, canina, eqüina e suína) refere-se à forma monomérica ou homodimérica da proteína resultan- do após clivagem proteolítica, por exemplo, para seres humanos em Arg 266 da forma pró-proteína de 375 aminoácidos de miostatina. Quando aqui usa- do, o termo "miostatina" refere-se à miostatina madura a menos que de outro modo aqui estabelecido.

Um anticorpo de inteiro comprimento como ele existe natural- mente é uma molécula de imunoglobulina compreendida por quatro cadeias de peptídeo, duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50-70 kDa quando de intei- ro comprimento) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 kDa quando de intei- ro comprimento) interligadas por ligações dissulfeto. A porção terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100-110 ou mais ami- noácidos primariamente responsáveis por reconhecimento de antígeno. A porção terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante primari- amente responsável por função efetora.

Cadeias leves são classificadas como kappa ou Iambda e carac- terizadas por uma particular região constante como conhecido na técnica. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma particular região cons- tante conhecida na técnica. IgGi e IgG4 são isotipos preferidos para anticor- pos da invenção. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região vari- ável de cadeia pesada terminal-N (aqui "HCVR") e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios (CH1, CH2, e CH3) para IgG1 IgD1 e IgA; e 4 domínios (CH1, CH2, CH3, e CH4) para IgM e IgE. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (aqui "LCVR") e uma região constante de cadeia leve, CL. As regiões HCVR e LCVR ainda podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de com- plementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conserva- das, chamadas regiões de estrutura (FR). Cada HCVR e LCVR é composta por três CDRs e quatro FRs1 dispostas a partir de terminus amino para ter- minus carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Aqui as 3 CDRs da cadeia pesada são referidas como "CDRH1, CD- RH2 e CDRH3" e as 3 CDRs da cadeia leve são referidas como "CDRL1, CDRL2 e CDRL3". As CDRs contêm maioria dos resíduos que formam es- pecíficas interações com o antígeno. Designação de aminoácidos para cada domínio é de acordo com convenções bem conhecidas [Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethes- da, Md. (1991)]. A habilidade funcional de um anticorpo ligar-se a um particu- lar antígeno é grandemente influenciada pelas seis CDRs. O termo "anticorpo", em referência a um anticorpo monoclonal

antimiostatina da invenção (ou simplesmente, "anticorpo monoclonal da in- venção" ou "anticorpo da invenção"), como aqui usado, refere-se a um anti- corpo monoclonal. Um "anticorpo monoclonal" ou "Mab" como aqui usado refere-se a um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anti- corpo inteiramente humano, a menos que de outro modo indicado. Preferi- velmente um anticorpo monoclonal da invenção existe em uma população homogênea ou substancialmente homogênea. Anticorpos monoclonais da invenção podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma bem conheci- das, assim como tecnologias recombinantes, tecnologias de mostra de fago, tecnologias sintéticas ou combinações de tais tecnologias ou outras tecnolo- gias facilmente conhecidas na técnica. "Anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de uma cópia simples ou clone, incluindo, por exemplo, qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago, e não o processo pelo qual ele é produzido. Um "anticorpo monoclonal" pode ser um anticorpo intacto (compreendendo uma região Fc completa ou de inteiro comprimento), um anticorpo substancialmente intacto, ou uma porção ou um fragmento de um anticorpo compreendendo uma porção de ligação de antígeno, por e- xemplo, um fragmento Fab, fragmento Fab' ou fragmento F(ab')2 de um anti- corpo quimérico, humanizado ou humano.

As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam os sítios de ligação de antígeno do anticorpo. Assim, um anticorpo IgG intac- to tem dois sítios de ligação. Exceto em anticorpos bifuncionais ou biespecí- ficos, os dois sítios Iigantes são idênticos. Como aqui usado, a "porção de ligação de antígeno" ou "região de ligação de antígeno" ou "fragmento de ligação de antígeno" refere-se intercambiavelmente àquela porção de uma molécula de anticorpo, dentro de região variável, que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e conferem ao anticorpo sua especificidade e afinidade para o antígeno. A porção de ligação de antígeno do anticorpo inclui resíduos de aminoácidos de estrutura necessários para manutenção da própria conformação dos resíduos de ligação de antígeno. Preferivelmente, as regiões de estrutura de anticorpos da invenção são de origem humana ou substancialmente de origem humana (pelo menos 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de origem humana).

Além disso, um "anticorpo monoclonal" como aqui usado pode ser um fragmento Fv de cadeia simples que pode ser produzido pela ligação de DNA codificando a LCVR e HCVR com uma seqüência ligadora. (Vide, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosen- burg and Moore eds., Springer - Verlag1 New York, pp 269-315, 1994). É en- tendido que independente de se fragmentos ou porções são especificados, o termo "anticorpo" como aqui usado inclui tais fragmentos ou porções assim como formas de cadeia simples. Tanto quanto a proteína retenha a habilida- de para específica ou preferencialmente ligar seu alvo pretendido (isto é, epitopo ou antígeno), ela é incluída no termo "anticorpo".

Um anticorpo "parente", como aqui usado, é um que é codificado por uma seqüência de aminoácidos usada para a preparação do anticorpo modificado ou variante. O anticorpo parente pode ter uma estrutura murina, mas preferivelmente tem uma região de estrutura humana. O anticorpo pa- rente pode ser um anticorpo murino, quimérico, humanizado ou humano.

Um anticorpo antimiostatina "modificado" ou "variante" refere-se aqui a uma molécula que difere em seqüência de aminoácidos de uma se- qüência de aminoácidos de anticorpo antimiostatina "parente" em virtude de adição, supressão e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoáci- do(s) na seqüência de anticorpo parente. Em uma modalidade preferida, o anticorpo variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região variável comparada ao anticorpo parente. Um anticorpo da inven- ção (um anticorpo variante) retém a habilidade de seu anticorpo parente pa- ra ligar preferencialmente miostatina sobre GDF-11, tem afinidade de ligação de miostatina similar a ou melhor que aquela de seu anticorpo parente e tem propriedades de estabilidade (isto é, propriedades de estabilidade química) que são superiores àquelas do anticorpo parente.

"Estabilidade química" refere-se à habilidade para resistir à de- gradação química, por exemplo, clivagem em uma ligação peptídica ("cliva- gem"). Anticorpos da invenção que são "resistentes à degradação química" como aqui usado são resistentes à clivagem espontânea em uma ligação peptídica e têm aumentada estabilidade química como comparados ao anti- corpo parente. Preferivelmente, 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, ou 95% de um anticorpo da invenção são resistentes à degradação química, isto é, não são clivados, quando presentes por um ano a 4°C, seis meses a 25°C, dois me- ses a 37°C, ou quatro semanas a 40°C em uma solução de anticorpos. Uma solução de anticorpos é uma solução usada em uma composição farmacêu- tica de anticorpo. Uma solução de anticorpo preferida compreende 1 mg/ml_ do anticorpo, fosfato a 10 mM, pH 7,4 e NaCI a 150 mM.

Um anticorpo antimiostatina modificado de particular interesse aqui é um anticorpo monoclonal antimiostatina com aumentada estabilidade química sobre aquela do anticorpo parente, no qual um resíduo Asn instável de um dipeptídeo Asn-Pro dentro de anticorpo parente é eliminado, preferi- velmente através de substituição com um resíduo aminoácido natural, mes- mo mais preferivelmente através de substituição com um resíduo histidina (H), serina (S)1 treonina (T), alanina (A), ou arginina®. Ainda, tal anticorpo modificado é caracterizado por ligação preferencial de miostatina sobre GDF-11 e tendo uma K0 para miostatina de menos que cerca de 3x10"8 M, preferivelmente ainda caracterizado por ter uma IC50 de menos que 25 nM em um ensaio-repórter SBE/miostatina in vitro como aqui mostrado no E- xemplo 4.

O termo "resíduo Asn instável", como aqui usado, refere-se a um resíduo asparagina em um anticorpo, uma proteína, ou um polipeptídeo, no qual espontânea desamidação ou clivagem de ligação peptídica pode ocor- rer in vitro ou in vivo.

O termo "clivada ou clivagem", como aqui usado, refere-se à cli- vagem de uma ligação peptídica em um anticorpo. Um sítio de clivagem de particular interesse é em um resíduo Asn em um anticorpo, tanto na extremi- dade amino como carbóxi do resíduo Asn. Clivagem de um anticorpo pode conduzir a uma redução de estabilidade e/ou a redução ou perda de ativida- de de uma proteína, ou perda de afinidade de ligação de um anticorpo. A modificação espontânea conduzindo à clivagem pode ocorrer ex vivo duran- te a preparação do composto terapêutico formulado, impactando negativa- mente a fabricação e estocagem do agente farmacêutico. Clivagem também pode ocorrer ex vivo durante a fabricação ou estocagem do anticorpo. Além disso, a modificação espontânea pode ocorrer in vivo afetando a eficácia da proteína ou anticorpo e duração de ação. Entretanto, simplesmente substitu- ição de um aminoácido em um sítio de clivagem por qualquer outro aminoá- cido pode impactar negativamente uma desejável bioatividade de um anti- corpo, por exemplo, afinidade de ligação ou neutralização.

O termo "epitopo" refere-se àquela porção de uma molécula ca- paz de ser reconhecida por e ligada por um anticorpo em uma ou mais das regiões de ligação de antígeno do anticorpo. Epitopos freqüentemente con- sistem em um agrupamento de moléculas de superfície quimicamente ativas tais como cadeias laterais de aminoácidos ou açúcar e têm específicas ca- racterísticas estruturais tridimensionais assim como específicas característi- cas de carga.

O termo "epitopo", como aqui usado, ainda refere-se a uma por- ção de um polipeptídeo tendo atividade antigênica e/ou imunogênica em um animal, preferivelmente um mamífero, por exemplo, um camundongo ou ser humano. O termo "epitopo antigênico", como aqui usado, é definido como uma porção de um polipeptídeo ao qual um anticorpo pode ligar-se especifi- camente como determinado por qualquer processo bem conhecido na técni- ca, por exemplo, através de convencionais imunoensaios. Epitopos antigêni- cos não precisam ser necessariamente imunogênicos, mas podem ser imu- nogênicos. Um "epitopo imunogênico", como aqui usado, é definido como uma porção de um polipeptídeo que elícita uma resposta de anticorpo em um animal, como determinado através de qualquer processo conhecido na técnica. (Vide, por exemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3998-4002(1983)).

As frases "propriedade biológica" ou "bioatividade", "atividade" ou "atividade biológica", em referência a um anticorpo da presente invenção, são usadas intercambiavelmente e incluem, mas não são limitadas a, afini- dade e especificidade de epitopo/antígeno, habilidade para neutralizar ou antagonizar uma atividade de miostatina in vivo ou in vitro, IC50 em um en- saio-repórter SBE/miostatina como aqui mostrado no Exemplo 4, ou outro ensaio de atividade in vitro, a estabilidade in vitro ou in vivo do anticorpo. Outras propriedades biológicas identificáveis de um anticorpo incluem, por exemplo, reatividade cruzada (isto é, com homólogos não-humanos do pep- tídeo-alvo, ou com outras proteínas ou tecidos, genericamente), e habilidade para conservar altos níveis de expressão de proteína em células mamíferas.

As propriedades mencionadas anteriormente podem ser observadas ou me- didas ou avaliadas usando técnicas reconhecidas incluindo, mas não limita- das a, ELISA, ELISA competitivo, análise de ressonância de plasma de su- perfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivo sem-limite, ligação de re- ceptor, ensaios BIACORE ou KINEXA, produção e/ou secreção de fator de crescimento ou citocina, desenvolvimento de capa animal Xenopus, transdu- ção de sinal e imuno-histoquímica com seções de tecido de diferentes fontes incluindo ser humano, primata, ou qualquer outra fonte como pode ser ne- cessário.

O termo "atividade de miostatina" como aqui usado refere-se a uma ou mais de atividades morfogenéticas ou fisiologicamente reguladoras de crescimento associadas à proteína miostatina ativa. Por exemplo, miosta- tina ativa é um regulador negativo de massa de músculo de esqueleto. Mios- tatina ativa também pode modular a produção de enzimas específicas de músculo (por exemplo, creatina cinase), estimular proliferação de mioblasto, e modular diferenciação de pré-adipócitos a adipócitos.

O termo "inibir" ou "neutralizar" como aqui usado com relação a uma atividade de um anticorpo da invenção significa a habilidade para anta- gonizar substancialmente, proibir, prevenir, restringir, diminuir, interromper, eliminar, parar, reduzir ou reverter, por exemplo, progressão ou severidade daquilo que está sendo inibido incluindo, mas não limitado a, uma atividade biológica. A inibição ou a neutralização é preferivelmente pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou maior que a atividade na ausência do anticorpo.

Os termos "indivíduo", "sujeito", e "paciente", aqui usados inter- cambiavelmente, referem-se a um animal, preferivelmente um mamífero (in- cluindo um não-primata e um primata) ou espécies de aves, incluindo, mas não limitado a, animais murinos, símios, seres humanos, mamíferos de fa- zenda (por exemplo, bovino, suíno, ovino), animais de esporte mamíferos (por exemplo, eqüinos), e animais domésticos mamíferos (por exemplo, ca- nino e felino); preferivelmente o termo refere-se a seres humanos. O termo também refere-se a espécies de aves, incluindo, mas não limitado a, gali- nhas e perus. Em uma certa modalidade, o sujeito, preferivelmente um ma- mífero, mais preferivelmente um ser humano, é ainda caracterizado com uma doença ou um distúrbio ou uma condição que pode se beneficiar de um diminuído nível ou diminuída bioatividade de miostatina. Em uma outra mo- dalidade, o sujeito, preferivelmente um mamífero, preferivelmente um ser humano, é ainda caracterizado como estando em risco de desenvolvimento de um distúrbio, doença ou condição que possa beneficiar-se de um diminu- ído nível de miostatina ou uma diminuída bioatividade de miostatina. Caracterização de Anticorpo

A invenção apresenta um anticorpo que liga-se preferencialmen- te à miostatina ao invés de GDF-11 e é mais estável que o anticorpo parente (isto é, mais resistente à degradação química que o anticorpo parente) en- quanto mantendo, ou aperfeiçoando, a afinidade de ligação para miostatina como exibida pelo anticorpo parente. Em uma modalidade, um resíduo Asn instável em CDRL3 do anticorpo parente Mab C12 ou Mab 510C2 como mostrado na Figura 2, é substituído com um diferente aminoácido.

Preferidas substituições de aminoácidos em um anticorpo da invenção são aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade para degradação química espontânea, isto é, clivagem ou desamidação, e (2) mantêm a afini- dade de ligação de antígeno - anticorpo como exibida pelo anticorpo paren- te. Em uma modalidade preferida, o resíduo Asn na CDRL3 de Mab C12 é substituído com H ou R. Em uma outra modalidade preferida, o resíduo Asn na CDRL3 de Mab 510C2 é substituído com H, S, T, ou A.

Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é resistente à degradação química espontânea, isto é, 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, ou 95% dos anticorpos não são clivados quando presentes em uma solução de anticorpos por um tempo e temperatura selecionados do grupo consistindo em: um ano a 4°C, seis meses a 25°C, dois meses a 37°C, e quatro sema- nas a 40°C em uma solução de anticorpos. Uma solução de anticorpos é qualquer solução apropriada para uma composição farmacêutica compreen- dendo um anticorpo. Uma solução de anticorpo exemplar compreende 1 mg/mL do anticorpo, fosfato a 10 mM, pH 7,4 e NaCI a 150 mM.

Em uma modalidade, anticorpos da invenção são ainda caracte-

rizados por terem uma forte afinidade de ligação (K0) para miostatina, isto é, menos que cerca de 3x10 8 M, 1x10 8 M ou 1x10"9 M, preferivelmente menos que cerca de 9x10"10 M, 8,7x10 10 M ou mais preferivelmente, menos que cerca de 8x10"11 M. Alternativamente, os anticorpos da invenção são carac- terizados por uma K0 para miostatina de não maior que cerca de 3x10"8 M, 1x10"8 M ou 1x10 9 M, mais preferivelmente não maior que cerca de 8,7x10" M e mais preferivelmente não maior que cerca de 8 χ 10~11 Μ. A afinidade de ligação de um anticorpo da invenção é similar a ou melhor que aquela de seu anticorpo parente. Preferivelmente, anticorpos da invenção caracterizados por uma

forte afinidade de ligação como descritos acima também têm uma IC5o de menos que 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, ou 5,2 nM no ensaio-repórter SBE/miostatina in vitro como mostrado aqui no Exemplo 4. Preferivelmente a IC50 de um anticorpo da invenção é similar a ou melhor que aquela de seu anticorpo parente. Todos os anticorpos da invenção são significantemente menos reativos com GDF-11 que com miostatina, isto é, eles se ligam preferencialmente à miostatina antes que a GDF-11.

Anticorpos da invenção são preferivelmente anticorpos quiméri- cos, humanizados ou humanos ou suas porções de ligação de antígeno e preferivelmente se ligam à miostatina dentro de região da forma madura de miostatina abrangendo aminoácidos 40-64 ou mais preferivelmente dentro de região da forma madura de miostatina abrangendo aminoácidos 43-57 e/ou 45-59. Além disso, anticorpos da invenção neutralizam uma atividade biológica de miostatina in vivo ou in vitro. Ligação específica de anticorpos monoclonais antimiostatina da invenção permite que os anticorpos da inven- ção sejam usados como terapêuticos ou profiláticos para condições, doen- ças ou distúrbios associados à miostatina, isto é, condições, doenças ou dis- túrbios que beneficiam de diminuição de níveis de miostatina ou antagoniza- ção ou inibição de uma atividade biológica de miostatina. Ainda, anticorpos da invenção podem ser usados para diagnosticarem ou monitorarem condi- ções, doenças ou distúrbios que se beneficiam de um nível alterado ou bioa- tividade de miostatina ou para determinar o nível de miostatina em uma a- mostra.

Os anticorpos monoclonais antimiostatina da invenção ligam-se a um epitopo antigênico descoberto estar localizado dentro de aminoácidos 40-64 (SEQ ID NO: 1 para ser humano) de miostatina madura, preferivel- mente dentro de aminoácidos 43-57 e/ou 45-59 de miostatina madura. Além disso, um epitopo imunogênico de miostatina da invenção é localizado den- tro de aminoácidos 40-64 de miostatina madura (SEQ ID NO: 1 para ser hu- mano), preferivelmente dentro de aminoácidos 43-57 e/ou 45-59 de miostati- na madura de qualquer espécie mamífera ou de ave. Um epitopo imunogê- nico da invenção é também contemplado ser um epitopo antigênico. Adicio- nalmente, resíduos de miostatina fora dos aminoácidos 40-64 podem afetar a estrutura conformacional do domínio antigênico e pelo que alterar ligação de um anticorpo da invenção ao epitopo antigênico.

Anticorpos de cadeia simples, e anticorpos quiméricos, humani- zados, assim como anticorpos de cadeia simples enxertados com CDR ou quiméricos, e similares, compreendendo porções derivadas de diferentes espécies, também são abrangidos pela presente invenção e o termo "anti- corpo" ou "anticorpo modificado". As várias porções destes anticorpos po- dem ser quimicamente ligadas através de técnicas convencionais, sintetica- mente, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usando técni- cas de engenharia genética. Por exemplo, ácidos nucléicos codificando uma cadeia quimérica ou humanizada podem ser expressos para produzirem uma proteína contígua.

Em adição, porções funcionais de anticorpos, incluindo porções de ligação de antígeno de anticorpos de cadeia simples ou humana, huma- nizada, quimérica, também podem ser produzidas. Porções funcionais dos anticorpos anteriores retêm pelo menos uma função de ligação de antígeno e/ou função biológica ou bioatividade do anticorpo de inteiro comprimento do qual elas são derivadas. Preferidas porções funcionais retêm uma função de ligação de antígeno de um correspondente anticorpo de inteiro comprimento (por exemplo, a habilidade para ligar uma forma madura mamífera de mios- tatina). Porções ou fragmentos funcionais particularmente preferidos retêm a habilidade de inibir uma ou mais funções ou bioatividades características de uma miostatina madura mamífera, tal como uma atividade de ligação, uma atividade de sinalização, e/ou estimulação de uma resposta celular. Por e- xemplo, em uma modalidade, uma porção ou um fragmento funcional pode inibir a interação de miostatina madura com um ou mais de seus Iigantes e/ou pode inibir uma ou mais funções mediadas por receptor.

Porções ou fragmentos de anticorpos capazes de ligação à mi- ostatina madura ou a uma sua porção (preferivelmente dentro de aminoáci- dos 40-64, 43-57 e/ou 45-59 de miostatina madura), incluem, mas não são limitados a, fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2 e são abrangidos pela inven- ção. Tais fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática ou a- través de técnicas recombinantes. Por exemplo, clivagem com papaína ou pepsina pode gerar fragmentos Fab ou F(ab')2, respectivamente. O menor fragmento de ligação de antígeno é o Fv, que consiste nos domínios HCVR e LCVR. O fragmento Fab consiste nos domínios HCVR-CH1 e LCVR-CL ligados covalentemente por uma ligação dissulfeto entre as regiões constan- tes. Para superar a tendência de domínios HCVR e LCVR ligados não- covalentemente no Fv a dissociarem quando coexpressos em uma célula hospedeira, um assim chamado fragmento Fv de cadeia simples (Sc) (scFv) pode ser construído, no qual um polipeptídeo adequadamente longo e flexí- vel se liga tanto ao terminus-C da HCVR para o terminus-N da LCVR como o terminus-C da LCVR para o terminus-N da HCVR. Um Iigante comumente usado é um peptídeo (G^Ser)3 de 15 resíduos, mas outros Iigantes também são conhecidos na técnica. Anticorpos também podem ser produzidos em uma variedade de formas truncadas usando genes anticorpos nos quais um ou mais códons de interrupção foram introduzidos a montante do sítio de interrupção natural. Por exemplo, um gene quimérico codificando uma por- ção de cadeia pesada F(ab')2 pode ser desenhado para incluir seqüências de DNA codificando o domínio CH1 e região articulada da cadeia pesada. Identificação de Resíduo(s) Asn Instável

Muitos processos são disponíveis para detecção e quantificação de modificações espontâneas de resíduos Asn instáveis em uma proteína, por exemplo, anticorpo. Desamidação, uma modificação resultando na con- versão de um resíduo asparagina a uma mistura de isoaspartato e aspartato que pode prover um sinal para degradação de proteína, introduz carga nega- tiva e mudanças na massa de proteína (NH2 vs. OH, Δ = 1 Da) e hidrofobici- dade. Técnicas de separação incluindo processos cromatográficos e eletrô- nicos, tais como IEF, clEF, eletroforese de gel de uréia, HPLC de fase rever- sa, HPLC de troca de íons, e interação hidrofílica, podem ser usados para separar ou isolar formas desamidadas ou clivadas de um anticorpo, ou uma proteína ou um polipeptídeo. Cromatografia de troca de íons é amplamente usada para isolar proteínas desamidadas. A localização e a extensão das modificações espontâneas de um anticorpo, ou uma proteína, ou um poli- peptídeo ainda podem ser caracterizadas por espectrometria de mas- sa/cromatografia líquida (LC/MS) e sequenciamento de terminal-N. Substituição de Resíduo(s) Asn Instável ou Outra Modificação de Anticorpos Para eliminar, por exemplo, através de substituição de aminoá-

cido, um resíduo Asn instável em um anticorpo, ou outra proteína, o resíduo Asn instável pode ser substituído com um aminoácido simples. É desejável que a substituição de aminoácido não altere (isto é, negativamente), ou alte- re minimamente (por exemplo, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou menos) a afinidade de ligação de anticorpo : antígeno. É ainda desejável que a substituição de aminoácido não altere (isto é, negativamente), ou altere minimamente neu- tralização de anticorpo, especificidade de epitopo e a habilidade do anticorpo ligar-se preferencialmente à miostatina ao invés de GDF-11. Um ELISA pode ser usado para determinar os efeitos das substituições individuais de amino- ácidos sobre a afinidade de ligação de um anticorpo da invenção à miostati- na ou um seu epitopo antigênico e o valor de ELISA comparado àquele de seu anticorpo parente (por exemplo, anticorpo C12 ou 510C2) ligando ao mesmo antígeno. Alternativamente, um ensaio BIACORE® ou KINEXA® pode ser usado para medir afinidade de ligação de um anticorpo.

Anticorpos da invenção ainda podem ser mutageneizados (ou mutageneizados antes de eliminação do resíduo Asn cuja presença contribui para a instabilidade do anticorpo parente), por exemplo, dentro de domí- nio(s) CDR para criar um anticorpo variante com uma propriedade otimizada de interesse, por exemplo, afinidade de ligação, IC50, especificidade, etc. Um anticorpo da invenção gerado pela substituição de aminoácido é preferido e tem pelo menos um resíduo de aminoácido da molécula de anticorpo paren- te removido e um diferente resíduo inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para tal mutagênese de substituição incluem as regiões CDR, mas alterações FR também são contempladas.

Um meio conveniente para geração de variantes de substituição é maturação de afinidade usando mostra de fago. Em suma, vários sítios de região CDR sofrem mutação para geração de todas as substituições possí- veis de aminoácidos em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são mostradas em uma maneira monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões para o produto de gene Ill de M13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes mostradas em fago são então sele- cionadas por sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação, es- pecificidade, IC50) como aqui mostrado. De modo a identificar sítios de regi- ão CDR candidatos para modificação, mutágenos de exploração de alanina podem ser realizados para identificação de resíduos de região CDR contribu- indo significativamente para ligação de antígeno. Alternativamente, ou em adição, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo an- tígeno - anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e a miostatina. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas ou técnicas conhe- cidas. Alternativamente, ou em adição, mutagênese randômica pode ser rea- Iizada sobre uma ou mais seqüências CDR em uma ou mais posições de resíduos, tanto enquanto a CDR está operavelmente ligada à região variável como enquanto a CDR é independente de outra seqüência de região variá- vel e então a CDR alterada retornada para uma região variável usando tec- nologia de DNA recombinante. Uma vez que tais anticorpos variantes sejam gerados e expressos, o painel de variantes é submetido à seleção como descrito aqui e anticorpos com superiores propriedades em um ou mais en- saios relevantes podem ser selecionados para ainda desenvolvimento. Expressão de Anticorpos

A presente invenção também é direcionada a linhas de células que expressam um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção ou sua porção. Criação e isolamento de linhas de células produzindo um anticorpo monoclonal da invenção podem ser realizados usando-se técnicas-padrão conhecidas. Linhas de células preferidas incluem COS, CHO, SP2/0, NSO e levedura (disponível de repositórios públicos como ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA).

Uma ampla variedade de sistemas de expressão de hospedeiro podem ser usados para expressão de um anticorpo da presente invenção incluindo sistemas de expressão procariótico (bacteriano) e eucariótico (tais como levedura, baculovírus, planta, mamífero e outras células animais, ani- mais transgênicos, e células hibridomas), assim como sistemas de expres- são de mostra de fago. Um exemplo de um vetor de expressão bacteriana apropriado é pUC119 e um vetor de expressão eucariótico apropriado é um vetor pcDNA3.1 modificado com um sistema de seleção DHFR enfraquecido. Outros sistemas de expressão de anticorpos também são conhecidos na técnica e são aqui contemplados.

O anticorpo da invenção pode ser preparado através de expres- são recombinante de genes de cadeia leve e pesada de imunoglobulina em uma célula hospedeira. Para expressar recombinantemente um anticorpo, uma célula hospedeira é transformada, transduzida, infectada ou similar com um ou mais vetores de expressão recombinantes transportando fragmentos de DNA codificando as cadeias leve e/ou pesada de imunoglobulina do anti- corpo de modo que as cadeias leves e/ou pesadas sejam expressas na célu- la hospedeira. A cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas inde- pendentemente a partir de diferentes promotores aos quais elas são operati- vãmente ligadas em um vetor ou, alternativamente, a cadeia pesada e a ca- deia leve pode ser expressa independentemente a partir de diferentes pro- motores aos quais elas são operavelmente ligadas em dois vetores - um ex- pressando a cadeia pesada e um expressando a cadeia leve. Opcionalmente a cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas em diferentes células hospedeiras. Preferivelmente, os anticorpos recombinantes são secretados no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, do qual os anticorpos podem ser recuperados ou purificados. Metodologias-padrão de DNA re- combinante são usadas para obtenção de genes de cadeias pesada e leve de anticorpo, incorporar estes genes em vetores de expressão recombinan- tes, e introduzir os vetores em células hospedeiras.

Um DNA isolado codificando uma região HCVR pode ser conver- tido em um gene de cadeia pesada de inteiro comprimento através de liga- ção operável de DNA codificando HCVR a uma outra molécula de DNA codi- ficando regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2, e CH3). As se- qüências de genes de região constante de cadeia pesada são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immuno- Iogical lnterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Servi- ces, NIH Publication No. 91-3242 (1991). Fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos, por exemplo, através de amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgA, IgE, IgM ou IgD), classe (por exemplo, IgGi, IgG2, lgG3 e IgG4) ou região constante de subclasse e qualquer sua variante alotí- pica como descrito em Kabat (supra). Alternativamente, a porção de ligação de antígeno pode ser um fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2, Fd, ou um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificando HCVR pode ser operavelmen- te ligado a uma outra molécula de DNA codificando somente uma região constante CH1 de cadeia pesada. Um DNA isolado codificando uma região LCVR pode ser conver-

tido a um gene de cadeia leve de inteiro comprimento assim como um gene de cadeia leve de Fab) através de ligação operável de DNA codificando LC- VR a uma outra molécula de DNA codificando uma região constante de ca- deia leve, CL. As seqüências de genes de região constante de cadeia leve são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Kabat, supra. Fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos através de amplificação PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região cons- tante kappa ou lambda.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificando HCVR e LCVR são ligados operavelmente a um outro fragmento codificando um Iigador flexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácidos (GIy4-Ser)3, de modo que as seqüências HCVR e LCVR possam ser expres- sas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões LCVR e HCVR ligadas pelo Iigador flexível.

Para expressar um anticorpo da invenção, um DNA codificando uma cadeia leve e/ou pesada de comprimento inteiro ou parcial, obtida como descrito acima, é inserida em um vetor de expressão de modo que o gene é ligado operavelmente a seqüências controles transcricionais e traducionais. O vetor de expressão e seqüências controles de expressão são escolhidas para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos ge- nes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de processos padrões. Adicional- mente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita secreção da cadeia leve e/ou pesada de anticorpo monoclonal antimiostatina a partir de uma célula hospedeira. O gene de cadeia leve e/ou pesada de anticorpo monoclonal antimiostatina pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinal seja operavelmente ligado em estrutura ao termi- nus amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo. Em adição ao gene(s) de cadeia pesada e/ou leve de anticorpo,

um vetor de expressão recombinante da invenção transporta seqüências reguladoras que controlam a expressão do gene(s) de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. 0 termo "seqüência reguladora" é pretendido incluir promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação), quando necessário, que controla, a transcrição ou tradução do gene(s) de cadeia de anticorpo. O desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser trans- formada, o nível de expressão de proteína desejado. Seqüências regulado- ras preferidas para expressão em célula hospedeira mamífera incluem ele- mentos virais que dirigem altos níveis de expressão de proteína em células mamíferas, tais como promotores e/ou realçadores derivados de citomegalo- vírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor posterior principal adenovírus (AdMLP)) e o vírus polioma.

Em adição aos genes de cadeia pesada e/ou leve de anticorpo e seqüências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da inven- ção podem transportar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e um ou mais genes marcadores selecionáveis. O gene mar- cador selecionável facilita seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido. Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável con- fere resistência aos fármacos, tais como G418, higromicina, ou metotrexato, sobre uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcado- res selecionáveis preferidos incluem o gene dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras minus-DHFR com seleção/amplificação com metotrexato), o gene neo (para seleção G418), e glutamina sintetase (GS) em uma linha de células negativa-GS (como NSO) para seleção/ ampli- ficação.

Para expressão das cadeias leve e/ou pesada, o vetor(es) de expressão codificando as cadeias pesada e/ou leve é introduzido em uma célula hospedeira através de técnicas padrões, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano, trans- dução, infecção e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióti- cas, células eucarióticas são preferidas, e mais preferivelmente células hos- pedeiras mamíferas, porque tais células, são mais prováveis de montarem e secretarem um anticorpo imunologicamente ativo e propriamente dobrado. Células hospedeiras mamíferas preferidas para expressão de anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO), células de mieloma NSO1 células COS, e células SP2/0. Quando ve- tores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpo são intro- duzidos em células hospedeiras mamíferas, os anticorpos são produzidos através de cultura de células hospedeiras por um período de tempo suficien- te para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Anticorpos podem ser recuperados da célu- la hospedeira e/ou do meio de cultura usando processos padrões de purifi- cação.

Células hospedeiras também podem ser usadas para produzir

porções, ou fragmentos, de anticorpos intactos, por exemplo, fragmentos Fab ou moléculas scFv através de técnicas que são convencionais. Será entendido por aqueles versados na técnica que variações sobre o procedi- mento acima estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando uma cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo desta invenção. Tec- nologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover algum ou todo o DNA codificando uma ou ambas cadeias leve e pesada que não é necessário para ligação à miostatina. As moléculas expressar a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos da invenção.

Em um sistema preferido para expressão recombinante de um anticorpo da invenção, um vetor de expressão recombinante codificando ambas a cadeia pesada de anticorpo e a cadeia leve de anticorpo é introdu- zida em células CHO através de, por exemplo, transfecção mediada por fos- fato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes de ca- deia pesada e leve de anticorpo são, cada um, operavelmente ligados a e- Iementos reguladores promotores/realçadores para dirigirem altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também trans- porta um gene DHFR1 que permite seleção de células CHO que foram trans- fectadas com vetor usando seleção/amplificação com metotrexato. As célu- Ias hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitirem expressão das cadeias pesada e leve de anticorpo e anticorpo intacto é re- cuperado do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrões são usadas para preparação de vetor de expressão recombinante, transfecção de células hospedeiras, seleção de transformantes, cultura de células hos- pedeiras e recuperação de anticorpo do meio de cultura. Anticorpos, ou suas porções de ligação de antígeno, da invenção podem ser expressos em um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992). Usos

Anticorpos da presente invenção são úteis em aplicações tera- pêuticas, profiláticas, diagnosticas e de pesquisa como aqui descrito. Um anticorpo da invenção pode ser usado para diagnosticar um distúrbio ou do- ença associada com a expressão de miostatina humana. Em uma maneira similar, o anticorpo da invenção pode ser usado em um ensaio para monito- rar níveis de miostatina em um sujeito sendo tratado para uma condição as- sociada com miostatina. Usos Terapêuticos Para o Anticorpo

Miostatina desempenha um papel em desenvolvimento de mús- culo e um número de distúrbios ou doenças relacionadas. Em adultos, ARNm miostatina é primariamente detectado em músculo de esqueleto em- bora menores concentrações também sejam encontradas em tecido adiposo e tecido cardíaco (Sharma, M., et al., J. Cell Physiol. 180:1, 1999). Camun- dongos nocaute miostatina têm massa muscular duas a três vezes maior que suas ninhadas tipo selvagem. A massa muscular aumentada é o resul- tado de hipertrofia de fibra e hiperplasia (McPherron, A., et al. Nature 387:83-90, 1997 e Zhu, X. et al., FEBS Letters 474:71). Em adição, o ca- mundongo nocaute miostatina acumula menos gordura que suas ninhadas tipo selvagem mas de outra maneira parece normal e saudável. Miostatina também foi recentemente mostrada ser um importante regulador de adipo- gênese (Rebbapragada, A., et al., Mol. And Cell. Bio. 23:7230-7242, 2003).

Adicionalmente, estrutura e teor de osso foram recentemente estudados em camundongos deficientes de miostatina (Hamrick M. W., et al., J. Orthopae- dic Research 21:1025, 2003; Hamrick, M.W., et al., Calcif Tissue Int 71:63, 2002.

Por isso, uma composição compreendendo um anticorpo mono- clonal antimiostatina da invenção pode ser usado para aumentar massa muscular, aumentar densidade de osso, diminuir perda de muscular, ou po- de ser útil para o tratamento ou prevenção de condições em que a presença de miostatina causa ou contribui para indesejáveis efeitos patológicos ou diminuição de níveis de miostatina tem um benefício terapêutico em mamífe- ros, preferivelmente humanos. Preferivelmente uma composição compreen- dendo um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção pode ser usado para aumentar massa muscular.

Preferivelmente um anticorpo da invenção pode ser usado no tratamento ou prevenção de perda muscular, dano muscular, cirurgia, reparo de músculo danificado, fragilidade, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de desuso, osteoporose, osteoartrite, crescimento e reparo de ligamento, obesidade, supressão de acumulação de gordura no corpo, distrofia muscu- lar de qualquer tipo, miopatia de cuidado crítico, miopatia alcoólica, caquexia (por exemplo, relacionada com câncer ou induzida por HIV1 ou resultante de COPD, doença crônica de pulmão, recuperação de sepsia, insuficiência re- nal, insuficiência de fígado ou doença), síndrome metabólica, perda muscu- lar após queimadura, e diabetes Tipo II. Mais preferivelmente, um anticorpo da invenção pode ser usado no tratamento ou prevenção de perda muscular, fragilidade, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de desuso e caquexia. Mais preferivelmente, um anticorpo da invenção pode ser usado no trata- mento ou prevenção de atrofia de tecido ou caquexia.

Atrofia de desuso pode resultar de numerosas causas ou inci- dentes incluindo qualquer distúrbio ou doença ou estado que conduza a pro- longada imobilidade ou desuso ou repouso na cama incluindo, mas não limi- tado a, transplante de órgão sólido, substituição de junta, acidente vascular cerebral, dano de cordão espinhal, recuperação de queimadura severa, he- modiálise crônica sedentária, recuperação pós-sepsia e exposição a micro- gravidade. Uma vez que miostatina é altamente conservada em seqüência e função através de espécies, os anticorpos da invenção podem ser usados para aumentar massa muscular, aumentar densidade óssea, ou tratar ou prevenir condições em mamíferos não-humanos ou espécies de aves (por exemplo, animais domésticos (por exemplo, canino e felino), animais de es- portes (por exemplo, eqüinos), animais de fonte de alimento (por exemplo, bovinos, suínos e ovinos), espécies de aves ((por exemplo, galinha, peru, outros pássaros de jogos ou aves domésticas)] em que a presença de mios- tatina causa ou contribui para indesejáveis efeitos patológicos ou diminuição de níveis de miostatina tem um benefício terapêutico.

O uso de um anticorpo monoclonal antimiostatina da presente invenção para tratamento ou prevenção de pelo menos um dos distúrbios mencionados anteriormente em que atividade de miostatina é prejudicial ou que se beneficia de diminuídos níveis de miostatina bioativa é aqui contem- plado. Adicionalmente, o uso de um anticorpo monoclonal antimiostatina da presente invenção para uso na fabricação de um medicamento para o trata- mento de pelo menos um dos distúrbios mencionados anteriormente é con- templado.

Como aqui usados, os termos "tratamento", "tratando", e simila- res, referem-se a obtenção de um desejado efeito farmacológico e/ou fisioló- gico. O efeito pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", co- mo aqui usado, inclui administração de um composto da presente invenção para o tratamento de uma doença ou condição em um mamífero, particular- mente em um ser humano, e inclui: (a) inibição de doença, isto é, impedindo seu desenvolvimento; e (c) alívio de doença, isto é, causando regressão da doença ou distúrbio ou aliviando seus sintomas ou complicações das mes- mas. Regimes de dosagem podem ser ajustados para provimento de ótima resposta desejada.

Como aqui usado, o termo "prevenindo" refere-se a prevenção completa ou parcial de uma doença ou sintoma do mesmo. "Prevenção" co- mo aqui usado, inclui administração de um composto da presente invenção para prevenção de doença ocorrer em um sujeito que pode ser predisposto à doença mas ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma. Composição

Um anticorpo da invenção pode ser incorporado em composi- ções farmacêuticas apropriadas para administração a um sujeito. Os com- postos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em doses simples ou múltiplas. As composições para administração são preten- didas serem apropriadas para o modo de administração selecionado, e dilu- entes, veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes dispersantes, tampões, tensoativos, conservantes, agentes solubili- zantes, agentes de isotonicidade, agentes estabilizantes e similares são u- sados quando apropriado. As ditas composições são desenhadas de acordo com técnicas convencionais como, por exemplo, Remington, The Science and Practice od Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 que provê um compêndio de técnicas de formulação como são genericamente conhecidas pelos praticantes.

Uma composição da invenção preferivelmente é uma "quantida- de terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere- se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo neces- sários, para obtenção de desejado resultado terapêutico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo ou porção de anticorpo para elicitar uma desejada resposta no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo, é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refe- re-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo ne- cessários, para obtenção de desejado resultado profilático. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em sujeitos antes de ou em um estágio inicial de doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser me- nos que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz é pelo menos a dose mínima, mas menos que uma dose tóxica, de um agente ativo que é necessária para proporcionar benefício terapêutico a um sujeito. Estabelecido de outra maneira, uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um anticorpo da invenção é uma quantidade que em mamíferos, preferivelmente humanos, aumenta massa muscular, aumenta densidade óssea, ou trata condições em que a presença de miostatina causa ou contri- bui para indesejáveis efeitos patológicos ou diminuição em níveis de miosta- tina resulta em um efeito terapêutico benéfico em um mamífero, preferivel- mente um ser humano, incluindo, mas não limitado a, perda muscular, dano muscular, fragilidade de cirurgia, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de desuso, osteoporose, osteoartrite, crescimento e reparo de ligamento, obe- sidade, supressão de acumulação de gordura no corpo, distrofia muscular de qualquer tipo, miopatia de cuidado crítico, caquexia (por exemplo, relaciona- da com câncer ou induzida por HIV, ou resultante de COPD, insuficiência renal, insuficiência de fígado, insuficiência ou doença cardíaca), síndrome metabólica e diabetes Tipo II. Atrofia de desuso pode resultar de numerosas causas ou incidentes incluindo qualquer distúrbio ou doença ou estado que conduza a prolongada imobilidade ou desuso ou repouso na cama incluindo, mas não limitado a, transplante de órgão sólido, substituição de junta, aci- dente vascular cerebral, dano de cordão espinhal, recuperação de queima- dura severa, hemodiálise crônica sedentária, recuperação pós-sepsia e ex- posição a microgravidade.

A rota de administração de um anticorpo da presente invenção é parenteral. Preferivelmente, os anticorpos da invenção podem ser incorpora- dos em uma composição farmacêutica apropriada para administração paren- teral. O termo parenteral como aqui usado inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal, ou intraperitoneal. Liberação sis- têmica periférica através de injeção intravenosa ou interaperitoneal ou sub- cutânea é preferida. Apropriados veículos para tais injeções são conhecidos na técnica.

A composição tipicamente tem de ser estéril e estável sob as condições de fabricação e estocagem no recipiente provido, incluindo por exemplo, um frasco ou seringa selada. Por isso, composições podem ser filtradas estéreis após fabricação de formulação, ou de outro modo tornadas microbiologicamente aceitáveis. Uma típica composição para infusão intra- venosa pode ter um volume de 20-1000 mL de fluido, tal como solução esté- ril de Ringer, solução salina fisiológica, solução de dextrose e solução de Hank e uma dose terapeuticamente eficaz (por exemplo, 1 a 1000 mg) de concentração de anticorpo. Dose pode variar dependendo do tipo e severi- dade da doença. Como é bem conhecido nas técnicas medicinais, dosagens para qualquer um sujeito dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície de corpo, idade, o particular composto a ser administrado, sexo, tempo e rota de administração, saúde geral, e outros fármacos sendo administrados simultaneamente. Uma dose típica pode es- tar, por exemplo, na faixa de 1 a 1000 mg; entretanto, doses abaixo ou aci- ma desta faixa exemplar são imaginadas, especialmente considerando os fatores mencionados anteriormente. Um típico regime de dosagem pode o- correr diariamente, semanalmente bissemanalmente, ou mensalmente. Um típico regime de dosagem parenteral pode ser cerca de 10 pg/kg a cerca de 20 mg/kg de peso total de corpo, preferivelmente de cerca de 20 pg/kg a cerca de 10 mg/kg. Progresso pode ser monitorado através de avaliação periódica. Para repetidas administrações, dependendo da condição, o trata- mento pode ser repetido até uma desejada supressão de sintomas de doen- ça ocorrer ou desejada prevenção de sintomas de doença ocorra. Entretan- to, outros regimes de dosagem podem ser úteis e não são excluídos.

Estas quantidades sugeridas de anticorpo são sujeitas a um grande trato de discernimento terapêutico. O fator chave na seleção de uma dose e esquema apropriados é o resultado obtido. Fatores para considera- ção neste contexto incluem o particular distúrbio sendo tratado, o particular mamífero sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do anticorpo, o particular tipo de anticorpo, o processo de administração, a programação de administração, e outros fato- res conhecidos por praticantes médicos.

Agentes terapêuticos da invenção podem ser congelados ou Iio- filizados para estocagem e reconstituídos em um apropriado veículo estéril antes de uso. Liofilização e reconstituição podem conduzir a variados graus de perda de atividade de anticorpo. Dosagens podem ter para serem ajusta- das para compensar. Genericamente, pH entre 6 e 8 é preferido. Artigos de Fabricação

Em uma outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento ou prevenção dos distúrbios ou condições descritas acima é provido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo. Apropriados recipientes incluem, por exemplo, garra- fas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. O recipiente retém uma composição da invenção que é eficaz para prevenção ou tratamento de distúrbio ou condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ati- vo na composição é um anticorpo antimiostatina da invenção. O rótulo sobre, ou associado com, o recipiente indica que a composição é usada para o tra- tamento de condição de escolha. O artigo de fabricação ainda pode compre- ender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamen- te aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele ainda pode incluir outros materiais desejá- veis de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e inserções em embalagem com instru- ções para uso.

Os exemplos que se seguem são oferecidos para propósitos somente ilustrativos, e não são pretendidos, de qualquer modo para limitar o escopo da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Identificação de um sítio de clivagem em Mabs C12 e 510C2 Soluções de anticorpos em 1 mg/mL em várias condições tam-

pões (citrato 10 mM, pH 5, citrato 10 mM pH 6, citrato 10 mM pH 7, e citrato mM/NaCI 150 mM pH 7), são incubadas em múltiplas temperaturas (- 20°C, 4°C, 25°C, e 40°C) por 4 semanas. Seguindo incubação, amostras são caracterizadas por eletroforese de gel de dodecil sulfato de sódio - poliacri- lamida. Para anticorpos contendo o domínio variável de C12 ou 510C2 (em múltiplos isotipos Fc), bandas adicionais, além de bandas esperadas para as cadeias pesada e leve do anticorpo, são observadas. Estas bandas são ob- servadas somente para amostras incubadas em pH 7 (com ou sem NaCI); sob condições redutoras de amostra, duas bandas são observadas, com massas aparentes de -8-10 kDa, e -12-14 kDa sob condição não-redutoras, uma banda simples com massa aparente de -8-10 kDa é observada. A ex- tensão de clivagem, como determinada pelas intensidades relativas destas bandas parece ser dependente de pH (quando as bandas são menos inten- sas em amostras incubadas em pH 6, e não visíveis para amostras incuba- das em pH 5), e dependente de temperatura. De modo a determinar a locali- zação de clivagem, e para quantificar a extensão de clivagem, as mesmas soluções de anticorpos são ainda caracterizadas por espectrometria de massa/cromatografia líquida (LC/MS) e sequenciamento de terminal-N.

Análises de amostras por LC/MS é realizada como se segue. Para redução parcial dos anticorpos, 4 μΐ_ de cada amostra são misturados em 36 pL de água. Então, 15 pL de cada solução são misturados com 0,5 pL de tampão Tris-HCI 3 M, pH 8,0 e 0,5 pL de DTT 50 mg/mL e 45 pL de água. Ambas soluções de cada amostra são analisadas por LC/MS. Para desglico- silação de anticorpo, 3 pL de cada amostra são misturados com 60 pL de água, 1,0 pL de tampão tris-HCI 3 M, pH 8,0 e 1,0 pL de solução de PNGase F (PROZYME, 1 U/mL). As soluções são incubadas a 37°C por 6 horas e então analisadas por LC/MS. Para completa digestão de tripsina, 20 pL de cada amostra são Iiofilizados à secura sob sistema de vácuo - velocidade e então reconstituídos em 4,5 μΙ_ de guanidina - HCI 7 M, tampão tris-HCI 0,4 M, pH 8,0 e 0,5 μΙ_ de solução 50 mg/L de DTT. As soluções são incubadas a 37°C por 40 minutos e então diluídas com 95 μΙ_ de água. Cada solução é tratada com 2,0 μ!_ de tripsina suína 0,5 mg/L a 37°C por 3 horas. As solu- ções são aciduladas com ácido acético e então analisadas por LC/MS ou LC/MS/MS. As amostras intactas, parcialmente reduzidas, e desglicosiladas são analisadas usando um espectrômetro Waters HPLC/LCT premier ou Q- TOF micromassa. Fixação de parâmetro de espectrômetro de massa e H- PLC são ajustadas baseado em amostras e requisitos.

Os espectros de massa desconvolutados para o anticorpo C12, incubado em pH 7, e 40°C por quatro semanas, exibem dois picos, com massas em 134894 e 145116 Da. A diferença de massa é cerca de 10220 Da entre eles, que ajusta-se à massa de resíduo esperada do peptídeo ter- minal-N 1-93 (esperado: 10221 Da) da cadeia leve. Este resultado é confir- mado por análise LC/MS para as amostras de redução parcial. Neste amos- tra, três massas são detectadas: 23312,7, 13091,3 e 10239,4 Da, que são consistentes com a cadeia leve intacta 1-219 (esperado: 23313,1 Da), o pep- tídeo terminal-C 94-219 (esperado: 13091,6 Da) e peptídeo terminal-N 1-93 (esperado: 10239,4 Da) da cadeia leve. Resultados essencialmente idênti- cos são obtidos também com o anticorpo 510C2, embora a quantidade rela- tiva de produtos de clivagem seja menor para este anticorpo. A Tabela 1 re- sume a porcentagem de cadeia leve clivada determinada para a análise das amostras reduzidas parcialmente. Sequenciamento de terminal-N também é usado para caracteri-

zar as amostras incubadas. Análise de seqüência de aminoácido de degra- dação Edman automatizada é realizada sobre amostras aplicadas a um car- tucho de preparação de amostra PROSORB® utilizando o processo Applied Biosystem Inc. (ABI) gas phase (GP-PVDF). Cada resíduo é analisado sobre uma coluna ABI BROWNLEE 220x2,1 mm PTH 5 - esfera a 55°C com uma taxa de fluxo de 325 pL/minuto. Dados são analisados utilizando programa de análise de dados ABI's Model 61OA. Para amostras de anticorpos incu- badas a 40°C, duas seqüências são observadas: para C12, as duas seqüên- cias observadas são "DIQMTQ" (SEQ ID NO: 34) que correspondem ao es- perado terminus-N da cadeia leve C12, e "PLTFGG" (SEQ ID NO: 35) que corresponde aos resíduos 94-99 da cadeia leve C12. Idênticos resultados são obtidos para análises de soluções de anticorpo 510C2 incubadas. Usan- do as quantidades relativas de cada seqüência, a extensão de produto cliva- do é calculada, e é resumida na Tabela 1. Tabela 1. Sumário de extensão de clivagem na ligação peptídica Asn93-Pro94

% de Clivagem (pH 7, 4 semanas, 40°C) Mab LC/MS N-terminal Seq. C12-lgG4 22% 15-20% C12-lgG1 21% 20-22% C12-lgG2 14% 5-10% 510C2-lgG4 3% 5-8% 510C2-lgG1 5% 5-9%

Exemplo 2: Remoção do sítio de clivagem química nos anticorpos C12 e

510C2

Para remover o sítio de clivagem em C12 e 510C2, substituições de aminoácidos simples de cada aminoácido individual são usadas para substituir o resíduo asparagina em CDRL3 de ambos anticorpos monoclo- nais. ELISA é usado para determinar os efeitos das substituições individuais de aminoácidos sobre afinidade para miostatina comparada a Fabs C12 ou 510C2.

Placas de ELISA são revestidas com miostatina diluída para 4 pg/mL em tampão carbonato (NaHC03 50 mM pH 8,3) e 50 μί adicionados por cavidade. Placas são cobertas com fita de selagem e incubadas por toda noite a 4°C. A seguir, placas (placas de fundo-U Greiner Cat N0 650061) são lavadas três vezes com PBS-T (Tween-20 0,1%) usando um lavador auto- mático de placas. 200 μί de tampão de bloqueio (PBS + BSA 1% + Tween- 0,1%) são adicionados a cada cavidade e incubados em temperatura ambiente por uma hora. Placas são lavadas e 50 pL de amostra adicionados por cavidade. Amostras são compostas por Fabs periprep diluídos em PBST/BSA partindo em uma diluição 1:3 e então diluídas serialmente em etapas de meio-log. Placas são lavadas e 50 pL de solução de anticorpo se- cundário (1:2000 cabra anti-humano-kappa-AP Southern Biotech Cat N0 2060-04 em PBST/BSA) são adicionados a cada cavidade. Seguindo uma adicional etapa de lavagem, 100 pL de substrato AP são adicionados por cavidade e incubados em temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. A absorbância ou OD em 560 nm é lida. C12 ou 510C2 é incluído sobre cada placa ELISA como um padrão de referência de afinidade. A concentração de Fabs é determinada por um ELISA quantitativo usando um anticorpo anti-Fd (Sheep anti-Fd Biodesign) para captirar proteína e cabra anti-humano- kappa-AP (Southern Biotech) para detectar. Um padrão Fab purificado é cor- rido sobre cada placa para gerar uma curva padrão para as determinações de concentração.

Fabs modificados derivados de C12 e 510C2, em que o resíduo

Asn na CDRL3 é substituído com H ou R em C12, ou H, S, T, ou A em 510C2, mantêm afinidade para miostatina similar àquela do Fab parente co- mo determinado por ELISA. Cada uma desta substituições rende curvas de afinidade ELISA similares ao respectivo controle Fab parente como determi- nado por similares leituras de absorbância na mesma concentração de Fab (vide Figura 4). Entretanto, se o resíduo asparagina na CDRL3 é substituído com valina, prolina, glicina, glutamina, triptofano, tirosina, cisteína, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, treonina, serina, lisina, alanina, ácido aspártico, ou ácido glutâmico em C12, ou arginina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenil alanina, tirosina, valina, triptofano, ou prolina em 510C2, cada uma destas substituições reduz a afinidade de ligação dos Fabs modificados para mios- tatina como comparada àquela do Fab parente. Além disso, tentativas sobre a modificação do resíduo Pro do dipeptídeo Asn-Pro falharam porque todas as substituições reduzem a afinidade de ligação dos Fabs modificados para miostatina comparada àquela do Fab parente. Exemplo 3: Comparação de clivagem entre o anticorpo C12, e a variante LC-N93H

Soluções de anticorpos em 1 mg/mL em fosfato 10 mM, pH 7,4/NaCI 150 mM, são incubadas em múltiplas temperaturas (4°C, 25°C, e 40°C) por 4 semanas. Seguindo incubação, amostras são caracterizadas por eletroforese de gel de dodecil sulfato de sódio - poliacrilamida e sequencia- mento de terminal-N como descrito acima. Sob estas condições, adicionais bandas são observadas por SDS-PAGE para a amostra de anticorpo C12 incubada a 40°C além de bandas esperadas para as cadeias pesada e leve do anticorpo; as bandas observadas migram em ~8 kDa sob condições não- redutoras, e ~8 kDa e -14 kDa sob condições redutoras. Em contraste, ne- nhuma banda adicional é vista para a variante LC-N93H. Sequenciamento de terminal_N das amostras incubadas confirma que clivagem entre Asn93 e Pro94 na cadeia leve ocorre na amostra de anticorpo C12, com -10-20% da seqüência correspondendo ao novo terminus-N (PLTFGG (SEQ ID NO: 35)), enquanto não há adicional seqüência de cadeia leve que não o esperado terminus-N para a variante LC-N93H. Exemplo 4: Ensaio-repórter SBE/Miostatina

Neste ensaio-repórter, um plasmídeo codificando um gene Iuci- ferase a jusante de um elemento Iigante SMAD ("SBE-luciferase"), mais es- pecificamente (CAGA)12, expressa proteína Iuciferase quando uma molécula tal como miostatina, GDF-11, ou outro membro de superfamília TGF-β liga seu próprio receptor, pelo que disparando sinalização SMAD que resulta em um complexo SMAD fosforilado que é capaz de ligação de SBE. A sequên- cia CAGA é uma seqüência responsiva TGF-β dentro de promotor do gene induzido TGF-β PAI-1 (Denner et al„ EMBO J., 17:3091-3100, 1998). Para gerar o plasmídeo, a seqüência de repetição SBE: tcgagagccagacaaaaagcc agacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagcca gacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagac actcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacac (SEQ ID NO: 36) é clonada no sítio Nhel-Hindlll do vetor básico-pGL3 (Promega N0 E1751). Este plas- mídeo é usado para transfecções transientes em células EBNA HEK293. A quantidade de luz medida é proporcional à quantidade de Iuci- ferase produzida, que é proporcional à quantidade de miostatina à qual as células são expostas. A presença de um inibidor (por exemplo, um anticorpo que se liga à miostatina) reduz a quantidade de miostatina capaz de ativar SBE o que por último resulta em uma reduzida produção de luz.

Neste ensaio, células EBNA HEK293 (Edge Biosystems) em meios DMEM/F12 (3:1) (Gibco 93-0152DK), FBS 10%, Hepes 20 mM, L- glutamina 4 mM ("Meio Completo") são semeadas em cerca de 25000 célu- las por cavidade em cavidades de interior revestido com polilisina de uma placa de 96 cavidades (BD Biocoat 35-4461) e incubadas por toda noite a 37°C. No dia seguinte, as células são lavadas em PBS e 50 pL OptiMEM I (Gibco 31985-070) são adicionados por cavidade. As células são transfecta- das com 50 μΙ_ da seguinte mistura de SBE - DNA luciferase: 80 pL Lipofec- tamine (Gibco 11668-019 combinados com 1,5 mL de OptiMEM e deixada em repouso por 5 minutos então adicionada a um tubo em que 20 pg de SBE-DNA luciferase estão combinados com 1,5 mL de OptiMEM e 200 pL de reagente Plus (Invitrogen), misturados e deixados em repouso por 5 mi- nutos. Após as duas misturas serem adicionadas juntas, a solução é mistu- rada vigorosamente e deixada em repouso por 30 minutos antes de 50 pL desta solução ("meios de transfecção") serem adicionados a cada cavidade. As células são então incubadas por toda noite a 37°C em 5% CO2. Para ca- da placa de células, miostatina (R&D Systems 788-G8) é diluída para 20 ng/mL em meio completo. Cada anticorpo da invenção a ser testado é titula- do em Meio Completo, por exemplo, de cerca de 40 pg/mL a cerca de 50 ng/mL. Os meios de transfecção são removidos das cavidades e 50 pL de uma diluição de anticorpo são adicionados por cavidade e 50 pL de GDF-8 (miostatina) ou GDF-11 (R&D Systems) são adicionados por cavidade. A placa de células é então incubada por toda noite a 37°C em 5% CO2. No dia seguinte, os meios são aspirados, as células são lavadas em PBS e 75 pL de tampão de Iise (Promega E266A) são adicionados. A atividade luciferase no Iisado de células é medida usando Reagente Luciferase de acordo com instruções do fabricante (Promega E2620). Luminescência é feita gráfico contra Logi0 de concentração de Mab (pg/mL) e a IC50 para cada Mab para miostatina e GDF-11 é calculada.

Mab C12 e um anticorpo monoclonal modificado derivado de C12 (C12-N93H) quando testados nestas condições com miostatina rende- ram valores de IC50 de cerca de 9,59 nM e 7,03 nM respectivamente. Nem C12 nem C12-N93H demonstra atividade de neutralização neste ensaio quando testado com GDF-11 ao invés de miostatina, indicando que o anti- corpo modificado como seu anticorpo parente se liga preferencialmente à miostatina antes que GDF-11. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Eli Lilly and Company <120> ANTICORPOS ANTIMIOSTATINA <130> X17400 <150> 60/824498 <151> 2006-09-05 <160> 36

<170> Patentln verssão 3.4 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr vai Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile

25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 40 45

Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95

Lys Ile Pro Ala Met vai vai Asp Arg Cys Gly Cys ser 100 105

<210> 2 <211> 109 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 2 Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu 40 45

Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala

50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly

85 90 95

Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105

<210> 3 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser Val Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys ser Ala Ser ser ser Ile ser Tyr Met 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

40 45

Asp Thr ser Lys Leu Ala Arg Gly vai Pro Ser Arg Phe ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Arg Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 4 <211> 106 <212> PRT <21B> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 4

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Arg His Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> constructo sintético <400> 5

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Arg ser Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro ser ser Leu ser Ala ser vai Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 40 45

Asp Thr ser Lys Leu Ala Arg Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Arg Thr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 7 <211> 106 <212> PRT <21B> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ser ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile ser Tyr Met

25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr

40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Arg Ala Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15 Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser ser Ile Ser Tyr Met

25 BO

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly vai Pro ser Arg Phe ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Leu Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 9 <211> 106 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Leu His Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 10 <211> 106 <212> PRT <21Β> Arti f ■i cial <220>

<223> Constructo sintético <400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 11 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 11

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val 25 30

Gly Arg ser vai ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro ser 50 55 60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro vai Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr vai Ser ser

115 120

<210> 12 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 12

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro ser Glu 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr vai Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val 25 30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Arg Asn Arg vai Thr Ile Ser vai Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80

ser Leu Lys Leu ser Ser vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr vai Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr vai Ser Ser 115 120

<210> IB <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 13

Ser Ala Ser Ser ser Ile Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 14

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg 1 5

<210> 15 <211> 9 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 15 Gln Gln Trp Tyr Arg Asn Pro Leu Thr 1 5

<210> 16 <211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<22Β> constructo sintético

<400> 16

Gln Gln Trp Tyr Arg His Pro Leu Thr

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético

<400> 17

Gln Gln Trp Tyr Arg Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético

<400> 18

Gln Gln Trp Tyr Arg Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 19

Gln Gln Trp Tyr Arg Ala Pro Leu Thr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<22B> Constructo sintético

<400> 20

Gln Gln Trp Tyr Leu Asn Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<22B> Constructo sintético

<400> 21

Gln Gln Trp Tyr Leu His Pro Leu Thr

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético

<400> 22

Gln Gln Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Thr

1 5

<210> 23

<211> 12 10

20

25

30

<212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 23

Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Arg Ser Val Ser

1

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

10

24 12 PRT

Artifi ciai

Constructo sintético 24

Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Ser Ser vai Ser

1

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

10

25 16 PRT

Artificial

Constructo sintético 25

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn

1

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

10

15

26 16 PRT

Artificial

Constructo sintético 26 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser Leu Arg Asn 10 15

<210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 27

Arg Ala Ile Thr Thr vai Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 28

Arg Ala Ile Thr Thr vai Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 29

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Ala Asn Tyr Cys ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr 10 15

Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 25

<210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe vai Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His 10 15

<210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His 10 15

<210> 32 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Leu His Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr vai Ala Ala Pro 100 105 110 Ser vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140

Val Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn ser Gln Glu 145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr Ala 180 185 190

Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 33 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 33

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val 20 25 30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile ser Val Asp Thr ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu ser Ser vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala vai Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125

Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160

vai Thr vai Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205

vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Arg vai Glu Ser

210 215 220

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys vai Val Val Asp vai Ser Gln

260 265 270

Glu Asp Pro Glu vai Gln Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val vai Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Arg Leu Thr vai 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Leu Gly 450

<210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Synthetic Construct <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln 1 5

<210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 35 Pro Leu Thr Phe Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Constructo <400> 36

tcgagagcca gacaaaaagc cagacattta gccagacact cgagagccag acaaaaagcc 60

agacatttag ccagacactc gagagccaga caaaaagcca gacatttagc cagacactcg 120

agagccagac aaaaagccag acatttagcc agacactcga gagccagaca aaaagccaga 180

catttagcca gacac 195

Claims (18)

1. Anticorpo monoclonal antimiostatina que se liga preferencial- mente à miostatina antes que GDF-11, em que o dito anticorpo liga miostati- na com uma afinidade não maior que cerca de 3x10"8 M e em que pelo me- nos 95% do anticorpo monoclonal não são clivados quando presente em uma solução de anticorpos por um tempo e temperatura selecionados do grupo consistindo em: um ano a 4°C,seis meses a 25°C, dois meses a 37°C, e quatro semanas a 40°C, em uma solução de anticorpos quando presente por quatro semanas em um anticorpo.

2. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, em que o dito anticorpo monoclonal liga-se à miostatina com uma afinidade não maior que cerca de 9x10"10 M.

3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 ou rei- vindicação 2, em que o dito anticorpo monoclonal tem uma IC50 de menos que ou igual a cerca de 25 nM em um ensaio SBE/miostatina in vitro.

4. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, em que a dita solução de anticorpos compreende 1 mg/mL dos ditos anticorpos, fosfato 10 mM, pH 7,4 e NaCI 150 mM.

5. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 4, em que o dito anticorpo monoclonal se liga a um polipep- tídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos como mostrada no grupo consistindo em: ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (SERQ ID NO: 29) e CSGECEFVFLQKYPH (SEQ ID NO: 30).

6. Anticorpo monoclonal antimiostatina compreendendo uma re- gião variável de cadeia pesada (HCVR) com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) com uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5, 6 e 7.

7. Anticorpo monoclonal antimiostatina compreendendo uma HCVR com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 12 e uma LCVR com uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9 e 10.

8. Anticorpo monoclonal antimiostatina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o dito anticorpo compreende uma HCVR e uma HCVR, em que a dita LCVR compreende um peptídeo em CDRH1 com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 23, um peptí- deo em CDRH2 com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 25, e um peptídeo em CDRH3 com uma seqüência como mostrado em SEQ ID NO: 27, e em que a dita LCVR compreende um peptídeo em CDRL1 com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 13, um peptídeo em CDRL2 com uma seqüência como mostrado em SEQ ID NO: 14, e um peptídeo em CDRL3 com uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 17, 18 e 19.

9. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, em que o dito anticorpo compreende uma HCVR e uma LCVR, em que a dita HCVR compreende um peptídeo em CDRH1 com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 24, um peptídeo em CDRH2 com uma seqüência como em SEQ ID NO: 26, e um peptídeo em CDRH3 com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 28, e em que a dita LCVR compreende um peptídeo em CDRL1 com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 13, um peptídeo em CDRL2 com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 14, e um peptídeo em CDRL3 com uma sequên- cia selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 21 e 22.

10. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 8 ou 9, compreendendo uma região de estrutura humana.

11. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 6 a 10, compreendendo uma região constante, em que a dita região constante origina-se de genoma humano ou o genoma de um animal selecionado do grupo consistindo em animais domésticos, animais de espor- tes e animais de fonte de alimentação.

12. Anticorpo monoclonal antimiostatina compreendendo uma cadeia leve com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 32 e uma cadeia pesada com uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 33.

13. Composição compreendendo um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para uso em terapia.

15. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 na fabricação de um medicamento para aumento de massa muscular em um sujeito em sua necessidade da mesma.

16. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma ou mais condições selecionadas de perda muscular, fragilidade, sarcopenia relacionada à idade, atrofia de tecido, e caquexia.

17. Processo de tratamento de perda muscular, fragilidade, sar- copenia relacionada à idade, atrofia de desuso, e caquexia em um sujeito em sua necessidade através de administração de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um anticorpo monoclonal antimiostatina da presente in- venção.

18. Processo de prevenção de perda muscular, fragilidade, sar- copenia relacionada à idade, atrofia de desuso e caquexia em um sujeito em sua necessidade através de administração de uma quantidade profilatica- mente eficaz de um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção.