BRPI0809026A2 - Anticorpos antiesclerotina - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS ANTIESCLEROTINA".

A presente invenção refere-se ao campo da medicina, especialmente ao campo de anticorpos direcionados contra esclerostina. Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos de alta afinidade que se ligam especificamente à esclerostina humana, e ao uso terapêutico dos anticorpos para vários distúrbios ou condições em indivíduos humanos, que se beneficiariam de aumento em pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo ou resistência óssea.

Osteoporose é uma doença na qual ocorre redução da densidade mineral óssea (BMD) e desorganização da microarquitetura óssea, além do risco dos ossos osteoporóticos fraturarem ser alto. A osteoporose continua sendo uma causa importante de deficiência e mortalidade em longo prazo, especialmente entre pessoas idosas. Embora existam tratamentos eficazes para osteoporose na forma de modificação de estilo de vida e farmacoterapia, as terapias disponíveis atualmente são em número e eficácia limitados, frequentemente associadas a efeitos colaterais indesejados e não são universalmente aceitas pelos pacientes. Alguns agentes antireabsorção, incluindo calcitonina, bisfosfonatos, reposição de estrogênio e moduladores seletivos dos receptores de estrogênio (SERMs) previnem perda óssea adicional, porém não promovem a reconstrução óssea, uma vez perdida. Existe um agente anabólico na forma de PTH(1-34) humano que aumenta a massa e a densidade mineral óssea e recupera a arquitetura do osso. No entanto, este agente terapêutico requer injeção subcutânea diária, frequentemente por um ano ou mais, resultando em adesão parcial ao tratamento pelo paciente.

Esclerostina, o produto do gene SOST, é expressa intensamente em osteócitos no interior do osso. Por seu papel como potente regulador negativo da formação óssea, a esclerostina é um alvo desejável para intervenção terapêutica em distúrbios ou condições que se beneficiariam de aumento em pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo e resistência óssea, por exemplo, osteoporose. Portanto, anticorpos antiesclerostina podem provar ser úteis, como estratégia anabólica, para o tratamento destes distúrbios ou condições. A publicação do pedido de patente internacional PCT N0. WO 2006/119107 descreve seqüências de aminoácidos de certos anticorpos humanizados antiesclerostina, nas quais 5 todas as CDRs (regiões determinantes de complementaridade) são inteiramente murinos, isto é, não são diferentes das CDRs de um anticorpo gerado em camundongo.

Há necessidade por um anticorpo antiesclerostina alternativo que se ligue à esclerostina humana com forte afinidade de ligação e que exiba valor baixo de IC50 em ensaio de bioatividade da esclerostina. Este anticorpo seria supostamente mais terapeuticamente eficaz, especialmente para osteoporose, e requereria doses menos freqüentes do que o PTH(1-34) ou um anticorpo antiesclerostina com menor afinidade de ligação (isto é, Kd mais alta) ou valor mais alto de IC50. Há necessidade também por um anticorpo específico para esclerostina humana, em que haja risco menor de resposta imune ao anticorpo, produzida pelo indivíduo humano na sua administração, ou risco menor de instabilidade, ao mesmo tempo em que sendo mantidas as propriedades do anticorpo de alta afinidade de ligação pela esclerostina humana e valor baixo de IC5o em ensaio de bioatividade. Os anticorpos da presente invenção satisfazem estas necessidades e oferecem vantagens relacionadas.

Os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais quiméricos ou humanizados, compreendem uma seqüência polipeptídica em particular exposta neste pedido de patente, ligam-se especificamente à escleros25 tina humana com alta afinidade de ligação e podem ser utilizados para aumentar, pelo menos, um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo e resistência óssea de um mamífero, de preferência, ser humano.

Em uma concretização, pelo menos uma CDR em um anticorpo da invenção difere em seqüência de aminoácidos da CDR naquela posição presente em um anticorpo original, isto é, o anticorpo gerado em roedor (por exemplo, camundongo), da qual se derivou a variante do anticorpo, isto é, o anticorpo humanizado ou quimérico da invenção. De preferência, esta substituição ou substituições, em seqüência de CDR de um anticorpo da invenção, resultam em maior afinidade de ligação (isto é, K0 mais baixo) à esclerostina humana, IC50 rnais baixo em ensaio de bioatividade da esclerostina, 5 ou ambos, do que os existentes no anticorpo original. A substituição de um aminoácido em seqüência de CDR de um anticorpo da invenção, daquele presente na CDR do anticorpo original, pode resultar em menor resposta imunogênica ao anticorpo pelo ser humano administrado com o anticorpo. Ademais, a substituição de um aminoácido em seqüência de CDR de um 10 anticorpo da invenção, daquele presente na CDR do anticorpo original, pode reduzir 0 risco de instabilidade do anticorpo, por exemplo, pela substituição de um resíduo asparagina com aminoácido diferente, diminuindo, com isso, 0 risco de desamidação.

Em uma concretização, um anticorpo da invenção liga-se especi15 ficamente à esclerostina humana e compreende seis regiões CDR contendo seqüências de aminoácidos selecionadas do grupo constituído por (i) HCDR1 com SEQ ID NO: 20, HCDR2 com SEQ ID NO: 21, HCDR3 com SEQ ID NO: 22, LCDR1 com SEQ ID NO: 23, LCDR2 com SEQ ID NO: 24 e LCDR3 com SEQ ID NO: 25; (ii) HCDR1 com SEQ ID NO: 26, HCDR2 com 20 SEQ ID NO: 27, HCDR3 com SEQ ID NO: 28, LCDR1 com SEQ ID NO: 29, LCDR2 com SEQ ID NO: 30 e LCDR3 com SEQ ID NO: 31; e (iii) HCDR1 com SEQ ID NO: 32, HCDR2 com SEQ ID NO: 33, HCDR3 com SEQ ID NO: 34, LCDR1 com SEQ ID NO: 35, LCDR2 com SEQ ID NO: 36 e LCDR3 com SEQ ID NO: 37.

Em outra concretização, um anticorpo da invenção liga-se espe

cificamente à esclerostina humana e compreende um polipeptídeo de região variável da cadeia pesada ("HCVR") e um polipeptídeo de região variável da cadeia leve ("LCVR") em que (i) a HCVR possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14 e a LCVR possui a seqüência de aminoá30 cidos representada por SEQ ID NO: 17; (ii) a HCVR possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 e a LCVR possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18; ou (iii) a HCVR possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 16 e a LCVR possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 19.

Em outra concretização, um anticorpo da invenção liga-se especificamente à esclerostina humana e compreende uma cadeia polipeptídica 5 pesada e uma cadeia polipeptídica leve em que, (i) a cadeia polipeptídica pesada possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e a cadeia polipeptídica leve possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5; (ii) a cadeia polipeptídica pesada possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 e a cadeia polipeptídica 10 leve possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6; ou (iii) a cadeia polipeptídica pesada possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 e a cadeia polipeptídica leve possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7.

Em uma concretização, anticorpos da invenção conforme aqui 15 definidos, de preferência, com um número de SEQ ID, são ainda caracterizados por terem afinidade de ligação (Kd) à esclerostina humana de aproximadamente 10 pM ou menos a 25°C. Anticorpos preferidos da invenção possuem Kd à esclerostina do macaco cynomologous de aproximadamente 100 pM ou menos a 25°C. Anticorpos mais preferidos da invenção possuem 20 afinidade de ligação à esclerostina humana de aproximadamente 10 pM ou menos a 25°C, e afinidade de ligação à esclerostina do macaco cynomologous de aproximadamente 100 pM ou menos a 25°C.

Em outra concretização, anticorpos da invenção conforme aqui definidos, de preferência, definidos com um número de SEQ ID, são caracte25 rizados por exibirem IC50 de 50 nM ou menos em ensaio de fosfatase alcalina óssea específica utilizando esclerostina humana. De preferência, estes anticorpos exibem também K0 à esclerostina humana de aproximadamente 10 pM ou menos a 25°C. Mais preferivelmente, estes anticorpos exibem K0 à esclerostina humana de aproximadamente 10 pM ou menos a 25°C e K0 à 30 esclerostina do macaco cynomologous de aproximadamente 100 pM ou menos a 25°C. Em outra concretização, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. De preferência, a composição farmacêutica compreende uma população homogênea ou substancialmente homogênea de um anticorpo monoclonal da invenção e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

A invenção concretiza o uso de um anticorpo da invenção para o preparo de um medicamento. A invenção concretiza ainda o uso de um anticorpo da invenção em um método para o aumento de pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo ou resistência óssea, em um animal, de preferência, uma espécie mamífera, mais preferivelmente, um indivíduo humano.

A invenção provê ainda um método de aumento de pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo ou resistência óssea, que compreende a administração para um indivíduo humano, em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção.

Uma concretização da invenção provê um método para o tratamento de uma doença, condição ou distúrbio, em indivíduo humano, que se beneficie de aumento em pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo ou resistência óssea, incluindo, por exemplo, osteoporose, osteopenia, osteoartrite, dor associada à osteoartrite, doença periodontal e mieloma múltiplo.

A invenção concretiza ainda um método para detecção da proteína esclerostina em amostra biológica, compreendendo a incubação de um anticorpo da invenção com a amostra biológica sob condições e por tempo suficiente que permita a ligação à proteína esclerostina, e a detecção da referida ligação. Um anticorpo preferido para uso neste ensaio de detecção possui uma cadeia polipeptídica pesada representada por SEQ ID NO: 40 e uma cadeia polipeptídica leve representada por SEQ ID NO: 41; uma cadeia polipeptídica pesada representada por SEQ ID NO: 42 e uma cadeia polipeptídica leve representada por SEQ ID NO: 43; uma cadeia polipeptídica pesada representada por SEQ ID NO: 2 e uma cadeia polipeptídica leve representada por SEQ ID NO: 5; uma cadeia polipeptídica pesada representada por SEQ ID NO: 3 e uma cadeia polipeptídica leve representada por SEQ ID NO: 6; ou uma cadeia polipeptídica pesada representada por SEQ ID NO: 4 e uma cadeia polipeptídica leve representada por SEQ ID NO: 7.

A invenção provê ainda moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo da invenção; um vetor compreendendo aquele ácido nucleico, opcionalmente ligado operacionalmente a seqüências de controle, reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vetor; uma cé10 lula hospedeira compreendendo aquele vetor; um processo para produção de um anticorpo da invenção, compreendendo a cultura da célula hospedeira de modo que o ácido nucleico seja expresso, e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo do meio de cultura da célula hospedeira.

A invenção apresenta anticorpos que se ligam especificamente à esclerostina humana, neutralizam ou antagonizam pelo menos uma bioatividade da esclerostina humana in vitro ou in vivo e ainda exibem forte afinidade de ligação à esclerostina humana.

Quando utilizado nesta descrição, o termo "esclerostina" referese à proteína humana em toda sua extensão, contendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, ou a forma madura da proteína sem a seqüência de sinalização.

O termo "anticorpo", em referência a um anticorpo antiesclerostina da invenção (ou simplesmente, "anticorpo da invenção"), conforme utilizado nesta descrição, refere-se a um anticorpo monoclonal. "Anticorpo mo25 noclonal", conforme utilizado nesta descrição, refere-se a um anticorpo quimérico ou a um anticorpo humanizado, a não ser que indicado de outra forma. Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser produzidos, por exemplo, por tecnologias de recombinação, tecnologias de exibição em fagos, tecnologias de síntese, por exemplo, enxerto de CDR, ou por combinações 30 destas ou de outras tecnologias reconhecidas facilmente na técnica. "Anticorpo monoclonal" refere-se àquele derivado de uma única cópia ou clone, incluindo, por exemplo, qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não ao método pelo qual o mesmo é produzido.

Um "anticorpo monoclonal" ou "anticorpo da invenção" ou simplesmente "anticorpo" pode ser um anticorpo intacto (compreendendo uma região Fc completa ou em toda sua extensão), ou uma porção ou fragmento 5 de um anticorpo compreendendo uma porção de ligação a antígeno, por exemplo, um fragmento Fab, fragmento Fab’ ou fragmento F(ab’)2 de um anticorpo quimérico ou humanizado. Fragmentos especialmente preferidos de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção conservam a capacidade de inibirem ou neutralizarem uma ou mais bioatividades características de uma 10 esclerostina de mamíferos in vivo ou in vitro. Por exemplo, em uma concretização, uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção é capaz de inibir a interação da esclerostina humana madura com um ou mais de seus Iigantes e/ou é capaz de inibir uma ou mais funções mediadas pelo receptor da esclerostina humana.

Além disso, um "anticorpo monoclonal" ou "anticorpo da inven

ção" ou simplesmente "anticorpo", conforme utilizado nesta descrição, pode ser um fragmento Fv de cadeia única a ser produzido pela união do DNA codificador da LCVR e HCVR com uma seqüência de ligação. (Consultar, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies1 vol. 113, Rosen20 burg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994). Entende-se que independentemente de fragmentos ou porções de ligação a antígeno estarem especificados ou não, o termo "anticorpo", conforme utilizado nesta descrição, inclui estes fragmentos ou porções, bem como formas de cadeia única, a não ser que indicado de outra forma. Desde que conserve 25 a capacidade de ligar-se especificamente à esclerostina, a proteína está incluída no termo "anticorpo".

O termo "liga-se especificamente", conforme utilizado nesta descrição, refere-se à situação na qual um membro de um par específico de ligação não se liga significativamente a outras moléculas a não ser à(s) sua(s) 30 parceira(s) de ligação, conforme medido por uma técnica disponível na técnica, por exemplo, ensaio ELISA competitivo, ensaio BIACORE® ou ensaio KINEXA®. O tempo aplica-se também onde, por exemplo, um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção é específico para um epítopo em particular, presente em alguns antígenos, em cujo caso o anticorpo com o domínio de ligação a antígeno será capaz de ligar-se especificamente aos vários antígenos que portam o epítopo. O termo "epítopo" refere-se à5 quela porção da molécula de um anticorpo, capaz de ser reconhecida e de ligar-se, existente a uma ou mais regiões do anticorpo que se liga a antígeno.

A expressão "bioatividade" em referência a um anticorpo da invenção inclui, entre outras, afinidade de ligação a epítopo ou antígeno, capacidade de neutralizar ou antagonizar uma bioatividade da esclerostina in vivo ou in vitro, IC50 em ensaio de fosfatase alcalina óssea específica (por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2 desta descrição) ou outro ensaio de atividade in vitro, a estabilidade in vivo e/ou in vitro do anticorpo e as propriedades imunogênicas do anticorpo, por exemplo, quando administrado a um indivíduo humano. As propriedades ou características supramencionadas podem ser observadas ou medidas por técnicas reconhecidas na técnica, incluindo, entre outras, ensaio por ELISA, ELISA competitivo, análise da ressonância plasmônica de superfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivo sem limite de ligação a receptor, imuno-histoquímica em cortes de tecidos de diferentes origens, incluindo humana, primata ou de outra origem conforme necessário.

A expressão "bioatividade" em referência à esclerostina, inclui, entre outras, ligação específica da esclerostina a outra proteína (por exemplo, um receptor ou membro da família TGF-β), uma ou mais funções medi25 adas por receptor da esclerostina humana, transdução de sinal, propriedades imunogênicas, estabilidade in vivo ou in vitro, que afetem os níveis ou a atividade de outra proteína in vivo ou in vitro (consultar, por exemplo, o Exemplo 2), níveis de expressão e distribuição em tecidos da esclerostina.

O termo "inibir" ou "neutralizar", conforme utilizado nesta descrição, a respeito de uma bioatividade de um anticorpo da invenção significa a capacidade para antagonizar substancialmente, vedar, impedir, restringir, retardar, desorganizar, eliminar, interromper, reduzir ou reverter uma bioatividade da esclerostina (por exemplo, conforme medida no Exemplo 2 desta descrição).

O termo "numeração de Kabat", conforme utilizado nesta descrição, é reconhecido na técnica e se refere-se a um sistema de numeração de 5 resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (isto é, hipervariável) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões da cadeia pesada e da leve de um anticorpo (Kabat, et ai, Ann. NY Acad. Sei. 190:382-93 (1971); Kabat, et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 10 (1991)). O posicionamento de CDRs na região variável de um anticorpo segue a numeração de Kabat ou simplesmente, "Kabat".

Um polinucleotídeo está "operacionalmente ligado" quando posicionado em relação funcional a outro polinucleotídeo. Por exemplo, um promotor ou reforçador está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se afetar a transcrição da seqüência.

Os termos "indivíduo" e "paciente", utilizados alternadamente nesta descrição, referem-se a um mamífero, de preferência, um ser humano. Em certa concretização, o indivíduo é ainda caracterizado por uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da diminuição do nível ou da bioatividade da esclerostina.

O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado operacionalmente, incluindo, entre outros, plasmídios e vetores virais. Certos vetores são capazes de se replicarem de modo autônomo em uma célula hospedeira na qual 25 foram introduzidos, enquanto outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando nela introduzidos e, com isso, são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Ademais, certos vetores são capazes de direcionarem a expressão de genes aos quais foram ligados operacionalmente. Estes vetores são referidos nesta descrição como "vetores 30 de expressão recombinante" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Vetores exemplares são bem-conhecidos na técnica.

Nesta descrição, as expressões "célula", "célula hospedeira" e "cultura celular" são utilizadas alternadamente e incluem uma célula ou cultura celular individual receptora de qualquer polinucleotídeo isolado da invenção ou de quaisquer vetores recombinantes compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificadora de uma HCVR, LCVR ou um anticorpo 5 da invenção. Célula hospedeira inclui células transformadas, transduzidas ou infectadas por um ou mais vetores recombinantes ou por um polinucleotídeo que expresse um anticorpo monoclonal da invenção, ou uma cadeia leve ou cadeia pesada deste.

Cada cadeia pesada de um anticorpo em seqüência completa compreende uma região variável da cadeia pesada em N-terminal (nesta descrição, "HCVR") e uma região constante da cadeia pesada. Cada cadeia leve de um anticorpo em seqüência completa compreende uma região variável da cadeia leve em N-terminal (nesta descrição, "LCVR") e uma região constante da cadeia leve. As regiões HCVR e LCVR podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade ("CDRs"), intercaladas por regiões mais conservadas, denominadas regiões de estrutura principal ("FR", estrutura principal). A capacidade funcional de um anticorpo de ligar-se a um antígeno ou epítopo em particular é influenciada principalmente pelas seis CDRs presentes na região variável do anticorpo. Cada HCVR e LCVR é composta por três CDRs (HCDR1, HCDR2 e HCDR3, na HCVR, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 na LCVR) e por quatro FRs, em arranjo do grupo amino terminal ao grupo carbóxi terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As CDRs contêm a maior parte dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno. O posicionamento de CDRs na região variável segue a numeração de Kabat.

As cadeias leves são classificadas como kappa ou Iambda e caracterizadas por uma região constante própria, conforme conhecido na técnica. As cadeias pesadas são classificadas em gama, mu, alfa, delta, ou ép30 silon, e definem o isotipo do anticorpo em IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente, e várias destas podem ainda ser divididas em subclasses, por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma região constante própria com seqüência facilmente conhecida na técnica. As regiões constantes kappa, na cadeia leve, e IgGi, lgG2, IgG3, IgG4, na cadeia pesada, são regiões constantes preferidas nos anticorpos da invenção. Mais preferivelmente, a região constante da cadeia pesada com5 preende um polipeptídeo com seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, conforme codificada por um polinucleotídeo com a SEQ ID NO: 39. Anticorpos quiméricos podem apresentar regiões constantes de origem nãohumana, de preferência de rato ou murino.

Conforme utilizado nesta descrição, o termo "região de ligação a 10 antígeno" ou "porção de ligação a antígeno" refere-se àquela porção de uma molécula do anticorpo, dentro da região variável, que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e que conferem ao anticorpo a sua especificidade e afinidade pelo antígeno. Estâ porção do anticorpo inclui os resíduos de aminoácidos do estrutura principal, necessários para manter 15 os resíduos de ligação ao antígeno na conformação apropriada.

Um anticorpo preferido da invenção compreende seis CDRs com seqüências de aminoácidos são SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24 e 25. Outro anticorpo preferido da invenção compreende seis CDRs com seqüências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36 e 37. Um 20 anticorpo mais preferido da invenção compreende seis CDRs com seqüências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30 e 31. As CDRs destes anticorpos preferidos estão presentes na posição apresentada na Tabela 1 abaixo. As CDRs estão posicionadas na região variável de acordo com Kabat.

Um anticorpo preferido da invenção compreende uma LCVR

com a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17, 18 ou 19. Outros anticorpos monoclonais preferidos da invenção compreendem uma HCVR com a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14, 15 ou 16. Mais preferivelmente, um anticorpo da invenção compreende 30 uma LCVR representada por SEQ ID NO: 17 e uma HCVR representada por SEQ ID NO: 14. Um anticorpo alternativo da invenção compreende uma LCVR representada por SEQ ID NO: 19 e uma HCVR representada por SEQ ID NO: 16. Um anticorpo mais preferido da invenção compreende uma LCVR representada por SEQ ID NO: 18 e uma HCVR representada por SEQ ID NO: 15. Estas LCVRs estão, de preferência, ligadas à região constante de uma cadeia leve, de preferência de origem humana, preferivelmente, uma 5 cadeia kappa. Estas HCVRs estão ligadas, de preferência, operacionalmente à região constante de uma cadeia pesada, de preferência, de origem humana, preferivelmente IgGi ou IgG4, mais preferivelmente, a região constante de uma cadeia pesada compreendendo a seqüência representada por SEQ ID NO:38.

Um anticorpo preferido da invenção compreende uma cadeia

polipeptídica pesada com a SEQ ID NO: 2 e uma cadeia polipeptídica leve com a SEQ ID NO: 5. A cadeia polipeptídica pesada com a SEQ ID NO: 2 pode ser codificada, por exemplo, por uma seqüência de polinucleotídeo representada por SEQ ID NO: 8, a cadeia polipeptídica leve com a SEQ ID 15 NO: 5 pode ser codificada, por exemplo, por um polinucleotídeo representado por SEQ ID NO: 11.

Outro anticorpo preferido da invenção compreende uma cadeia polipeptídica pesada com a SEQ ID NO: 4 e uma cadeia polipeptídica leve com a SEQ ID NO: 7. A cadeia polipeptídica pesada com a SEQ ID NO:4 20 pode ser codificada, por exemplo, por uma seqüência de polinucleotídeo representado por SEQ ID NO: 10, a cadeia polipeptídica leve com a SEQ ID NO: 7 pode ser codificada, por exemplo, por um polinucleotídeo representado por SEQ ID NO: 13.

Outro anticorpo preferido da invenção compreende uma cadeia 25 polipeptídica pesada com a SEQ ID NO: 3 e uma cadeia polipeptídica leve com a SEQ ID NO: 6. A cadeia polipeptídica pesada com a SEQ ID NO:3 pode ser codificada por uma seqüência de polinucleotídeo representada por SEQ ID NO: 9, a cadeia polipeptídica leve com a SEQ ID NO: 6 pode ser codificada por um polinucleotídeo representado por SEQ ID NO: 12.

Os anticorpos humanizados preferidos da invenção são citados

nesta descrição como o 86, 88 e o 89. As SEQ ID NOs de suas seqüências são conforme listadas na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 - NosSEQ ID protéicas Anti¬ Cadeia Cadeia HCVR CDR1 de CDR2 de CDR3 corpo pesada leve pesada pesada pesada 86 2 5 14 20 21 22 88 3 6 15 26 27 28 89 4 7 16 32 33 34 LCVR CDR1 de leve CDR2 de leve CDR3 de

leve 17 23 24 25 18 29 30 31 19 35 36 37 CO De preferência, um anticorpo da invenção em que todas as seis CDRs, a HCVR, a LCVR, a HCVR e a LCVR, toda a cadeia pesada, toda a cadeia leve, ou toda a cadeia pesada e toda a cadeia leve são limitadas por uma seqüência em particular conforme mostrada por uma SEQ ID NO nesta 5 descrição (consultar, por exemplo, a Tabela 1) é caracterizado ainda por exibir Kd à esclerostina humana, a 25°C, inferior a aproximadamente 10 pM, 8 pM, 6 pM ou 4 pM, mais preferivelmente inferior a aproximadamente 2,2 pM. Adicionalmente, é preferido que este anticorpo seja limitado ainda por exibir Kd à esclerostina de macaco cynomologous a 25°C inferior a aproximada10 mente 100 pM, 90 pM ou 80 pM ou, mais preferivelmente, inferior a aproximadamente 75 pM.

De preferência, um anticorpo da invenção em que todas as seis CDRs, a HCVR, a LCVR, a HCVR e a LCVR, toda a cadeia pesada toda a cadeia leve, ou toda a cadeia pesada e toda a cadeia leve são limitadas por 15 uma seqüência em particular, conforme mostrada por uma SEQ ID NO nesta descrição, é caracterizado ainda por exibir IC5o em ensaio de fosfatase alcalina óssea específica utilizando esclerostina humana (consultar, por exemplo, o Exemplo 2 nesta descrição) de aproximadamente 50 nM ou menos, aproximadamente 40, 35 ou 30 nM ou menos, mais preferivelmente, de a20 proximadamente 25 nM e ainda mais preferivelmente de aproximadamente 20 nM (por exemplo, 20,2 nM) ou menos.

Mais preferivelmente, um anticorpo da-invenção em que todas as seis CDRs, a HCVR, a LCVR, a HCVR e a LCVR, toda a cadeia pesada toda a cadeia leve, ou toda a cadeia pesada e toda a cadeia leve são Iimita25 das por uma seqüência em particular, conforme mostrada por uma SEQ ID NO nesta descrição, é caracterizado ainda por exibir Kd à esclerostina humana, a 2°C, inferior a aproximadamente 10 pM, 8 pM, 6 pM ou 4 pM, mais preferivelmente, inferior a aproximadamente 2,2 pM, além de ser também caracterizado por exibir IC5o em ensaio de fosfatase alcalina óssea específi30 ca utilizando esclerostina humana de aproximadamente 50 nM ou menos, aproximadamente 40, 35, ou 30 nM ou menos, mais preferivelmente, de aproximadamente 25 nM ou menos e ainda mais preferivelmente de aproximadamente 20 nM (por exemplo, 20,2 nM) ou menos.

Ainda mais preferivelmente, um anticorpo da invenção em que todas as seis CDRs, a HCVR, a LCVR, a HCVR e a LCVR, toda a cadeia pesada toda a cadeia leve, ou toda a cadeia pesada e toda a cadeia leve são limitadas por uma seqüência em particular, conforme mostrada por uma SEQ ID NO nesta descrição, é caracterizado ainda por exibir K0 à esclerostina humana, a 25 5°C, inferior a aproximadamente 10 pM, 8 pM, 6 pM ou 4 pM, mais preferivelmente, inferior a aproximadamente 2.2 pM, é caracterizado também por exibir IC50 em ensaio de fosfatase alcalina óssea específica utilizando esclerostina humana de aproximadamente 50 nM ou menos, aproximadamente 40, 35 ou 30 nM ou menos, mais preferivelmente, de aproximadamente 25 nM ou menos e, ainda mais preferivelmente, de aproximadamente 20 nM (por exemplo, 20,2 nM) ou menos, e é caracterizado também por exibir IC50 em ensaio de fosfatase alcalina óssea específica utilizando esclerostina de macaco cynomologous de aproximadamente 75 nM ou menos.

Expressão do Anticorpo

A presente invenção é direcionada também a células hospedeiras que expressam um anticorpo antiesclerostina da invenção. A criação e isolamento de linhagens de células hospedeiras produtoras de anticorpos da invenção podem ser obtidos por técnicas-padrão conhecidas na técnica.

Uma ampla variedade de sistemas de expressão em hospedeiro, conhecidos na técnica, poderia ser utilizada para expressar anticorpos da presente invenção, incluindo, sistema de expressão procarióticos (bacteria25 nos) e eucarióticos (tais como levedura, baculovírus, células de plantas, mamíferos e de outros animais, animais transgênicos e células de hibridomas), bem como sistemas de expressão de exibição em fagos.

Um anticorpo da invenção pode ser preparado por expressão gênica recombinante da cadeia pesada e da cadeia leve de imunoglobulinas em célula hospedeira. Para expressar um anticorpo por recombinação, uma célula hospedeira é transformada, transduzida, infectada ou similares com um ou mais vetores de expressão recombinante portando fragmentos de DNA que codificam as cadeias leves e/ou pesadas de imunoglobulinas do anticorpo, de modo que as cadeias leves e/ou pesadas sejam expressas na célula hospedeira. A cadeia pesada e a leve podem ser expressas independentemente em um vetor, a partir de promotores diferentes daqueles dos 5 quais estão operacionalmente ligadas ou, de outra forma, a cadeia pesada e a leve podem ser expressas independentemente, a partir de promotores diferentes daqueles dos quais estão operacionalmente ligadas, em dois vetores - um expressando a cadeia pesada e o outro, a cadeia leve. Opcionalmente, a cadeia pesada e a leve podem ser expressas em células hospedeiras dife10 rentes.

Adicionalmente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinalização que facilite a secreção da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo antiesclerostina de uma célula hospedeira. O gene da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo antiesclerostina pode ser clonado no 15 vetor de modo que o peptídeo de sinalização seja ligado operacionalmente no estrutura principal ao amino terminal do gene da cadeia do anticorpo. Este peptídeo de sinalização pode ser o peptídeo de sinalização de uma imunoglobulina ou um peptídeo de sinalização heterólogo. De preferência, os anticorpos recombinantes são secretados no meio em que as células hospe20 deiras são cultivadas, do qual os anticorpos podem ser recuperados ou purificados.

Um DNA isolado, codificador de uma região HCVR, pode ser convertido em um gene da cadeia pesada em seqüência completa, ligandose operacionalmente o DNA codificador da HCVR a outra molécula de DNA 25 que codifica as regiões constantes da cadeia pesada. As seqüências de genes de regiões constantes da cadeia pesada de humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Fragmentos de DNA incluindo estas regiões podem ser obtidos, por exemplo, por amplificação convencional por PCR. A região constante da cadeia pesada pode ser de qualquer tipo 30 (por exemplo, IgG, IgA, IgE, IgM ou IgD), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) ou subclasse de região constante e qualquer variante alotípica desta, conforme descritas em Kabat (supra). Uma região constante preferida de cadeia pesada compreende o polipeptídeo representado pela SEQ ID NO:38.

Um DNA isolado, codificador de uma região LCVR, pode ser convertido em um gene de cadeia leve em seqüência completa (bem como 5 em um gene de Fab de cadeia leve), ligando-se operacionalmente o DNA codificador da LCVR a outra molécula de DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. As seqüências de genes de regiões constantes de cadeia leve são conhecidas na técnica. Fragmentos de DNA incluindo estas regiões podem ser obtidos por amplificação convencional por PCR. A região 10 constante da cadeia leve pode ser do tipo kappa ou lambda.

Células hospedeiras preferidas de mamíferos, a serem utilizadas na invenção, incluem células CHO (por exemplo, ATCC CRL-9096), células NSO, células SP2/0 e células COS (ATCC, por exemplo, CRL-1650, CRL1651), HeLa (ATCC CCL-2). Células hospedeiras adicionais para uso na 15 invenção incluem outras células de mamíferos, células de levedura e células procarióticas. Quando vetores de expressão recombinante que codificam os genes do anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos pelo cultivo das células hospedeiras por período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células 20 hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados da célula hospedeira e/ou o meio de cultura por métodos convencionais de purificação.

Uma vez expressados, os anticorpos intactos, cadeias individu25 ais leves e pesadas ou outras formas de imunoglobulinas da presente invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, cromatografia em coluna de troca iônica, afinidade, fase reversa e interação hidrofóbica, eletroforese em gel e procedimentos semelhantes. São preferidas imunoglobulinas substan30 cialmente puras com pelo menos aproximadamente 90%, 92%, 94% ou 96% de homogeneidade, sendo com 98 a 99% ou mais de homogeneidade as mais preferidas para uso farmacêutico. Uma vez purificados, parcialmente ou com a homogeneidade desejada, os anticorpos estéreis podem ser utilizados terapeuticamente, conforme indicado nesta descrição.

Anticorpo Humanizado

De preferência, um anticorpo da invenção a ser utilizado para fins terapêuticos, possui a seqüência do estrutura principal (estrutura principal) e da região constante (na medida em que exista no anticorpo) derivada do mamífero no qual seria utilizado como terapia, de modo a diminuir a possibilidade de que o mamífero produza uma resposta imune contra o anticorpo terapêutico. Anticorpos humanizados são de interesse especial uma vez que são de valor para aplicação terapêutica e que diminuem a probabilidade de uma resposta humoral contra o anticorpo de camundongo, frequentemente observada com anticorpos de origem murino quando administrados a um indivíduo humano. De preferência, anticorpos humanizados injetados podem apresentar uma meia-vida mais semelhante àquela que ocorre naturalmente com anticorpos humanos do que, por exemplo, anticorpos murinos, permitindo com isso doses menores e menos freqüentes a serem administrados a um indivíduo.

O termo "anticorpo humanizado", conforme utilizado nesta descrição, refere-se àquele em que pelo menos uma porção é de origem huma20 na. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compreender porções derivadas de um anticorpo de origem não-humana, tal como de um camundongo, e porções derivadas de um-anticorpo de origem humana, unidas, por exemplo, quimicamente por técnicas convencionais (por exemplo, sintéticas), ou ser preparado como um polipeptídeo contíguo utilizando técnicas de 25 engenharia genética.

De preferência, um "anticorpo humanizado" possui CDRs que se originam ou são derivadas de um anticorpo original, isto é, um anticorpo nãohumano (de preferência, um anticorpo monoclonal de camundongo), enquanto a estrutura principal e região constante, na medida em que presente 30 (ou uma parte significativa ou substancial desta, isto é, pelo menos, aproximadamente 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) são codificados por informação da seqüência de ácido nucleico contida na região germinal de imunoglobulinas humanas (consultar, por exemplo, o banco de dados International ImMunoGeneTics), ou em formas recombinadas ou que sofreram mutação destas, quer os referidos anticorpos tenham sido produzidos ou não em célula humana. De preferência, pelo menos, duas, três, quatro, 5 cinco ou seis CDRs de um anticorpo humanizado são otimizadas das CDRs de um anticorpo original não-humano do qual o anticorpo humanizado foi derivado, para gerar uma propriedade desejada, por exemplo, melhor especificidade, afinidade ou neutralização, a qual pode ser identificada por ensaio de varredura, por exemplo, um ensaio ELISA. De preferência, uma CDR oti10 mizada em um anticorpo da invenção compreende pelo menos um aminoácido substituído, quando comparada àquela no anticorpo original. Certas substituições de aminoácidos, nas CDRs dos anticorpos humanizados 88 e 89 da invenção, comparadas àquelas dos anticorpos originais 788 e 789 (consultar os Exemplos 5 e 6 nesta descrição), diminuem a probabilidade de 15 haver instabilidade do anticorpo (por exemplo, retirada dos resíduos Asn da CDR) ou diminuem a probabilidade de haver imunogenicidade do anticorpo quando administrado a um indivíduo humano (por exemplo, conforme predito pela tecnologia IMMUNOFILTER®).

Anticorpos humanizados contêm de preferência uma seqüência mínima derivada de um anticorpo não-humano. Anticorpos humanizados podem compreender resíduos não encontrados nem no anticorpo receptor, nem nas seqüências de CDR oü estrutura principal, importadas do anticorpo original. Anticorpos humanizados podem ser submetidos a mutagênese in vitro por métodos utilizados de rotina na técnica e, dessa forma, as sequências de aminoácidos da região de estrutura principal das regiões HCVR e LCVR dos anticorpos recombinantes humanizados são seqüências que, embora derivadas daquelas relacionadas a seqüências germinais humanas de HCVR e LCVR, podem não existir naturalmente no repertório germinal humano de anticorpos in vivo. É contemplado que tais seqüências de aminoácidos das regiões de estrutura principal de HCVR e LCVR dos anticorpos recombinantes humanizados sejam, pelo menos, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% ou, o mais preferível, 100% idênticas a uma seqüência germinal humana.

Em concretizações preferidas, um anticorpo humanizado da presente invenção compreende seqüências germinais humanas da estrutura principal de cadeia leve (consultar, por exemplo, PCT WO 2005/005604) e seqüências germinais humanas da estrutura principal de cadeia pesada (consultar, por exemplo, PCT WO 2005/005604). Regiões germinais humanas preferidas da estrutura principal de cadeia leve são derivadas do gene de cadeia leve kappa humana, selecionadas do grupo constituído por: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, 012, 02 e 08. Regiões germinais humanas preferidas da estrutura principal de cadeia pesada são derivadas de uma cadeia pesada humana, selecionada do grupo constituído por: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51 (consultar a Publicação Internacional N0 W02006/046935).

Há múltiplos métodos disponíveis na técnica para gerar anticorpos humanizados. Por exemplo, anticorpos humanizados podem ser produzidos a partir de seqüências de ácido nucleico codificadoras da HCVR e LCVR, obtidas de um anticorpo original (por exemplo, um anticorpo murino ou feito por hibridoma) que se ligue especificamente à esclerostina, de preferência, esclerostina humana, identificação das CDRs nas referidas HCVR e LCVR (não-humanas) e enxertia destas seqüências de ácido nucleico codificadoras de CDR em seqüências humanas selecionadas de ácido nucleico codificadoras de estrutura principal. Opcionalmente, uma região CDR pode ser otimizada por mutagênese aleatória ou em locais especificados, a fim de serem substituídos um ou mais aminoácidos na CDR com um aminoácido diferente, antes que a região CDR seja enxertada na região do estrutura principal. Alternativamente, uma região CDR pode ser otimizada após a inserção na região do estrutura principal humano, empregando métodos à disposição de especialistas na técnica.

Após as seqüências codificadores de CDR terem sido enxertadas nas seqüências codificadoras selecionadas do estrutura principal humano, as seqüências resultantes de DNA que codificam as seqüências humanizadas variáveis pesadas e leves são expressas, em seguida, produzindo um anticorpo humanizado que se liga à esclerostina. A HCVR e LCVR humanizadas podem ser expressas como parte de uma molécula completa de um anticorpo antiesclerostina, isto é, como proteína fusionada a seqüências humanas de domínio constante. No entanto, as seqüências de HCVR e LCVR podem ser expressas também na ausência de seqüências constantes para produzir um Fv humanizado antiesclerostina.

Referências adicionais em que são descritos métodos que podem ser utilizados na humanização de anticorpos de camundongo incluem, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869, 1991, e o método de Winter et al. [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)].

Usos diagnósticos

Um anticorpo da invenção pode ser utilizado para o diagnóstico de um distúrbio ou doença associado à expressão de esclerostina humana. De modo semelhante, o anticorpo da invenção pode ser utilizado em um ensaio para monitorar níveis de esclerostina em um indivíduo sendo tratado para uma condição associada à esclerostina. Estas aplicações incluem métodos que fazem uso de um anticorpo da invenção e de uma marcação para detectar esclerostina em uma amostra biológica, por exemplo, em líquido corporal ou célula ou extrato de tecido (consultar, por exemplo, o Exemplo 1 nesta descrição). Anticorpos da invenção podem ser utilizados com ou sem modificação, e podem ser marcados por ligação covalente ou não-covalente de um grupamento detectável.

Uma variedade de protocolos convencionais para medição de níveis de esclerostina em amostra biológica, incluindo, por exemplo, ELISAs, RIAs, e FACS, é conhecida na técnica e fornece base para o diagnóstico de níveis alterados ou anormais da expressão de esclerostina. Níveis normais ou padrão de esclerostina, presentes em uma amostra, são estabelecidos por qualquer técnica conhecida, por exemplo, pela combinação de uma amostra compreendendo um polipeptídeo da esclerostina com, por exemplo, um anticorpo da invenção sob condições adequadas para formação de um complexo antígeno:anticorpo. O anticorpo é marcado direta ou indiretamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado 5 ou não-ligado. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais Iuminescentes e materiais radioativos. A quantidade de um complexo formado de referência é quantificada por vários métodos tais como, por exemplo, meios fotométricos. Quantidades do polipeptídeo esclerostina, presentes na amostra, são com10 paradas em seguida aos valores de referência.

Usos Terapêuticos

Funções da esclerostina como regulador negativo da formação óssea, (consultar, por exemplo, Cytokine & Growth Factor Reviews, 16:319- 327, 2005). Em adultos, o mRNA da esclerostina é detectado primariamente em osteócitos, embora concentrações mais baixas tenham sido encontrada pelos Requerentes em cartilagem.

Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal antiesclerostina da invenção pode ser utilizada para aumentar pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral 20 ósseo ou resistência óssea, em osso vertebral ou não-vertebral, ou ambos, quando uma quantidade eficaz é administrada a um indivíduo humano em necessidade do mesmo. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal antiesclerostina da invenção pode ser utilizada para reduzir a incidência de fratura de osso vertebral e/ou não-vertebral, quando 25 uma quantidade eficaz é administrada a um indivíduo humano em necessidade do mesmo. Redução da incidência de fratura inclui redução de probabilidade ou incidência real de fratura para um indivíduo humano, comparado a uma população de controle não-tratada.

Além disso, um anticorpo da invenção pode ser útil para o tratamento de condições, doenças ou distúrbios em que a presença da esclerostina causa ou contribui para efeitos patológicos indesejados, ou uma diminuição dos níveis ou da bioatividade da esclerostina traz um benefício terapêutico para indivíduos humanos. Tais condições, doenças ou distúrbios incluem, entre outros, osteoporose, osteopenia, osteoartrite, dor associada à osteoartrite, doença periodontal ou mieloma múltiplo. Os indivíduos podem ser homens ou femininos. De preferência, um indivíduo humano está em risco 5 de fratura de osso vertebral e/ou não-vertebral, mais preferivelmente, um indivíduo humano está em risco para ou de sofrer de osteoporose. O indivíduo humano é de preferência do sexo feminino e, mais preferivelmente, do sexo feminino em risco para ou de apresentar osteoporose pós-menopausa. É contemplado que o método da invenção possa beneficiar um indivíduo 10 com osteoporose em qualquer estágio.

Adicionalmente, é contemplado o Uso de um anticorpo da invenção na produção de um medicamento para o tratamento de pelo menos um dos distúrbios supramencionados.

Os termos "tratamento" e "tratar" destinam-se a referir todos os processos em que possa haver atraso, interrupção, suspensão, controle ou extinção da evolução dos distúrbios aqui descritos, porém não indicam eliminação total de todos os sintomas do distúrbio. "Tratamento", conforme utilizado nesta descrição, inclui administração de um composto da presente invenção para tratar uma doença ou condição em um mamífero, especialmente, de um ser humano, e inclui: (a) inibir a progressão posterior da doença, isto é, suspender o seu desenvolvimento; e (b) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença ou distúrbio ou aliviar sintomas ou complicações destes. Os regimes de dose podem ser ajustados de modo a ser fornecida a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, conforme exigido pela situação terapêutica. Composição Farmacêutica

Um anticorpo da invenção pode ser incorporado em uma composição farmacêutica adequada para administração a um indivíduo humano. Um anticorpo da invenção pode ser administrado a um indivíduo humano isoladamente ou combinado a um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável em doses únicas ou múltiplas. Estas composições farmacêuticas são criadas para ser apropriadas ao modo escolhido de administração, sendo utilizados diluentes, veículo e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes dispersantes, tampões, surfactantes, conservantes, 5 agentes solubilizantes, agentes de isotonicidade, agentes estabilizantes e similares conforme apropriado. As referidas composições podem ser criadas de acordo com técnicas convencionais expostas em, por exemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, que oferece um compêndio de técnicas de 10 formulação, conforme geralmente conhecidas dos profissionais. Veículos adequados para composições farmacêuticas incluem qualquer material que, quando combinado a um anticorpo monoclonal da invenção, retenha a atividade da molécula e não provoque reação do sistema imune do indivíduo.

Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal antiesclerostina da presente invenção pode ser administrada para um indivíduo em risco para ou de exibir patologias conforme aqui descritas, por exemplo, osteoporose, osteoartrite ou outros distúrbios de degeneração óssea, utilizando técnicas normais de administração.

Uma composição farmacêutica da invenção contém, de prefe20 rência, uma "quantidade eficaz" de um anticorpo da invenção. Quantidade eficaz refere-se àquela necessária (em doses e para períodos de tempo e para os meios de administração) para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como estágio da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacida25 de do anticorpo ou de uma porção do anticorpo provocar uma resposta desejada no indivíduo. Quantidade eficaz é também aquela na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Quantidade eficaz é pelo menos a dose mínima, porém inferior a uma dose tóxica, de um agente ativo necessário para conferir benefício terapêutico a um indivíduo. Em outras palavras, quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção é aquela que, em mamíferos, de preferência, seres humanos, (i) aumenta pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo ou resistência óssea, ou (ii) trata uma condição, distúrbio ou doença em que a presença de esclerostina causa ou contribui para um efeito patológico indesejado, ou (iii) 5 uma diminuição em níveis ou bioatividade da esclerostina resulta em efeito terapêutico benéfico em um mamífero, de preferência, um ser humano, incluindo, entre outros, osteoporose, osteopenia, artrite reumatóide, doença periodontal ou mieloma múltiplo.

Conforme bem-conhecido na técnica médica, as doses para qualquer indivíduo dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho, a área de superfície corporal, idade e sexo do paciente, o composto em particular a ser administrado, horário e via de administração, saúde geral e outros fármacos administrados concomitantemente. A dosé pode variar ainda dependendo do tipo e gravidade da doença. Uma dose típica pode variar, por exemplo, de 0,001 a 1000 μg; de preferência, de 1 a 100 μg; no entanto, são cogitadas doses abaixo ou acima dessa variação exemplar, especialmente considerando os fatores supramencionados. Um regime de dose diária parenteral pode ser de aproximadamente 0,1 μg/kg a aproximadamente 20 mg/kg do peso corporal total, de preferência de aproximadamente 0,3 μg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica, e a dose ajustada de acordo.

Estas quantidades sugeridas de anticorpo estão sujeitas em grande parte ao critério terapêutico. O fator fundamental na seleção e programação de uma dose apropriada é o resultado obtido. Fatores a serem 25 considerados nesse contexto incluem o distúrbio em particular sendo tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do anticorpo, o tipo em particular de anticorpo, o método de administração, a programação da administração e outros fatores conhecidos na prática médica.

A via de administração de um anticorpo da presente invenção

pode ser oral, parenteral, por inalação ou tópica. De preferência, os anticorpos da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para administração parenteral. O termo parenteral, conforme utilizado nesta descrição, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal ou intraperitoneal. A liberação parenteral por injeção intravenosa ou intraperitoneal ou subcutânea é preferida. Injeção subcutâ5 nea é a mais preferida. Veículos adequados para estas injeções são bemconhecidos na técnica.

A composição farmacêutica deverá ser tipicamente estéril e estável sob as condições de fabricação e armazenamento no recipiente provido, incluindo, por exemplo, um frasco-ampola lacrado, seringa ou outro dis10 positivo para liberação, por exemplo, uma caneta. Por conseguinte, as composições farmacêuticas podem ser filtradas após ser feita a formulação ou, de outra forma, ter se tornado microbiologicamente aceitável.

Os exemplos seguintes são oferecidos somente para fins de ilustração e não se destinam a restringir o escopo da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Ensaio ELISA

Este ensaio é utilizado para detectar e quantificar a esclerostina em amostras de soro humano até o limite inferior de detecção de 0,4 ng/ml. O anticorpo 86 é o anticorpo de captura, enquanto o anticorpo 88 é o de detecção (consultar a Tabela 1 para as seqüências dos anticorpos).

O interior dos poços internas de uma placa de 96 poços é revestido com-100 μΙ do anticorpo monoclonal 86 antiesclerostina em seqüência completa, em concentração de 0,5 pg/ml em carbonato de sódio a 0,5 M e pH 9,6 ("tampão de revestimento"). A placa é lacrada e incubada durante a 25 noite a 4°C. Em seguida, é lavada três vezes com o "tampão de lavagem" (Tris-HCI a 0,4 M, NaCI a 3 M, Tween 20 a 0,1%). A seguir, 200 μΙ de tampão bloqueador de caseína em PBS (Pierce, n°37528) são adicionados por poço, e a placa é incubada por uma hora em temperatura ambiente. A placa é lavada, em seguida, duas vezes com tampão pra remover a solução blo30 queadora.

A fim de gerar uma curva-padrão, esclerostina humana em concentração de 0,35 mg/ml é preparada em tampão bloqueador de caseína, e diluída duas vezes em série (de 1,25 ng/ml a O ng/ml) em soro humano agrupado a 5% em tampão bloqueador de caseína em PBS. O soro humano é testado em uma coluna de partículas magnéticas revestidas com o anticorpo monoclonal 86 antiesclerostina para remover qualquer esclerostina que possa estar endogenamente presente no soro.

Cem microlitros de amostras (5% de soro em tampão bloqueador de caseína) ou de padrões são adicionados às poços, em duplicata, e a placa é incubada em temperatura ambiente por mais duas horas. Os poços são lavados em seguida 5 vezes com tampão de lavagem.

Cem microlitros do anticorpo de detecção (anticorpo monoclonal

88 antiesclerostina em seqüência completa), biotinilado utilizando o kit EZ Link NHS-LC da Pierce, são adicionados por poço. A placa é incubada em temperatura ambiente por uma hora e, em seguida, lavada quatro vezes com tampão de lavagem. O conjugado estreptovadina-peroxidase de rábano é 15 diluído, 1:2000, em tampão bloqueador de caseína em PBS até uma concentração final de 0,5 Mg/ml, em seguida, 100 μΙ são adicionados por poço, incubados em temperatura ambiente e lavados, em seguida, 7 vezes com tampão de lavagem. O substrato OPD (Sigma P8806) é adicionado em 100 μΙ/poço, e permitido que a reação prossiga em temperatura ambiente por 20 20 minutos. A reação é finalizada em seguida pela adição de 100 μΙ/poço de HCI a 1 N. É feita a leitura da placa por OD a 490 nm.

Exemplo 2 Neutralização - ensaio de fosfatase alcalina óssea específica

A fosfatase alcalina óssea específica é um indicador bioquímico da atividade de osteoblastos. O ensaio com fosfatase alcalina óssea especí25 fica tem como base a capacidade da esclerostina de diminuir os níveis da fosfatase alcalina estimulada por BMP-4 e Wnt3a, na linhagem de células multipotenciais de murinos, C2C12, enquanto um anticorpo que neutraliza a atividade da esclerostina resultaria em aumento dose-dependente da atividade da fosfatase alcalina nesse ensaio. Wnt3a e BMP-4 são fatores de 30 crescimento osteogênico.

Células C2C12 (ATCC, CRL 1772) são dispostas, 3000-5000 células por poço, em uma placa de cultura de tecido de 96 poços em meio MEM complementado com soro bovino fetal a 5%, em seguidas incubadas a 37°C em CO2 a 5% durante a noite. O anticorpo a ser testado é diluído em 0,5 X meio condicionado por Wnt3a até várias concentrações finais. O meio é retirado em seguida das células na placa de cultura de tecido, e 150 μΙ por 5 poço de uma solução pré-misturada de anticorpo-BMP4-esclerostina (humana ou de macaco cynomologous) são adicionados, na qual a concentração final do anticorpo é de 30 pg/ml a 0,5 pg/ml, a do BMP-4 é de 25 ng/ml e a da proteína esclerostina é de 1,0 pg/ml, e o meio condicionado está em 0,5X concentração. A placa é incubada em seguida a 37°C em CO2 a 5% por 72 10 horas. O meio é retirado das células na placa de cultura de tecido, as células são lavadas uma vez com PBS, em seguida, a placa das células é congelada e descongelada três vezes, alternando entre -80°C e 37°C.

lulas L-Wnt-3A e células L de controle (ATCC CRL-2647 e CRL-2648, respectivamente) por quatro dias, a partir de divisão em 1:20 de células confluentes, em DMEM com FBS a 10% e L-glutamina a 2 mM. O meio coletado é filtrado através de membranas de nylon de 0,2 mícron e armazenado a 20°C, para prazo prolongado, ou a 4°C para curto.

por poço de substrato de fosfatase alcalina (1-step PNPP, Pierce n°3t621). A placa de células é incubada, em seguida, por 60 minutos em temperatura ambiente, quando então, é feita a leitura da OD em 405 nm para determinar a atividade da fosfatase alcalina. Os valores de IC50 de neutralização pelos anticorpos, relatados na Tabela 2 abaixo, são médias obtidas de 2 experi25 mentos separados. Os cálculos de IC50 são realizados utilizando o SigmaPlot Regression Wizard com equação de ajuste sigmóide de quatro parâmetros.

O meio condicionado por Wnt3a é preparado pelo cultivo de cé

A atividade da fosfatase alcalina é medida pela adição de 150 μΙ

Tabela 2

Anticorpo

Com esclerostina humana

IC50 (nM)

IC50 (nM)

Com esclerostina Cyno

89

88

86

25.1

20.2 25,5

34,4

23,7

31,6 Exemplo 3 - Afinidade de ligação

Os estudos de equilíbrio de ligação entre um anticorpo antiesclerostina e esclerostina humana, de macaco cynomologous ("cyno") ou de rato foram realizados em um instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments 5 Inc.), sob condições controladas por KD. Com essa técnica, uma concentração fixa de anticorpo abaixo de sua K0 é misturada com várias concentrações da proteína esclerostina e deixada em repouso para atingir equilíbrio. A fração de anticorpos livres, não-ligados, restante na solução, é sondada pela exposição breve desta mistura equilibrada a partículas revestidas por escle10 rostina, sendo seguida por detecção com anticorpo secundário marcado por fluorescência. Tipicamente 2 pM de um anticorpo antiesclerostina a ser testado são misturados a concentrações variadas de esclerostina humana, cyno ou de rato, partindo de 2-50 nM e diluições três vezes seriadas em tampão de ligação (1X solução salina em tampão fosfato, pH 7,4, azida sódica a 15 0,02% e 1 mg/ml de albumina bovina sérica), contendo 2 pM do anticorpo a ser testado. Estas soluções são deixadas em repouso para atingirem o equilíbrio por dois dias a 25°C. A quantidade de anticorpo não-ligado é sondada com partículas de azlactona revestidas com esclerostina humana (Sapidyne Instruments Inc.). Estas partículas são preparadas reagindo 50 mg de partí20 cuias secas de azlactona com 50 mcg/ml de esclerostina humana em tampão carbonato de sódio a 50 mM e pH 9,0 - 9,6, sob rotação durante a noite. Em seguida, é permitido que as partículas precipitem, e o sobrenadante é substituído por uma solução bloqueadora (Tris a 1 M, pH 8,0, mais 10 mg/ml de albumina bovina sérica), sendo submetida rotação por uma hora. Esse 25 estoque de partículas é diluído 20 vezes em tampão de ligação e utilizado no período de três dias. Um instrumento KinExA 3000, equilibrado em temperatura ambiente (ca 25°C) é utilizado para os estudos de ligação. Tipicamente, 6,25 ml da solução equilibrada contendo anticorpo/esclerostina são coletados de uma coluna de partículas de azlactona carregadas com esclerostina 30 humana, em vazão de 0,25 ml/minuto, lavados, em seguida, com tampão do teste (1X solução salina em tampão fosfato, pH 7,4 com azida sódica a 0,02%). A fração de anticorpo antiesclerostina livre, ligada a estas partículas, é quantificada, medindo-se a fluorescência resultante da injeção de um anticorpo secundário marcado (anticorpo anti-Fab’2 humano marcado caprino). Duas amostras em réplica para cada condição são analisadas, e a Kd é determinada ajustando-se os dados a um modelo de ligação de 1:1, utilizando 5 o programa de computador KinExA Pro. A média dos valores de K0 a 25°C são relatadas na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3 - Afinidade Anticorpo Esclerostina humana Esclerostina de rato Esclerostina Cyno

Kd (pM) K0 (pM) K0 (pM) 89 0,3 0,4 1,4 88 2,2 2,2 75 86 0,6 0,1 1,0 Exemplo 4 - Ensaio de calceína in vivo:

O ensaio de calceína de rato permite uma avaliação direta da 10 formação óssea sobre um período curto de tempo (10 dias), e do efeito de um anticorpo da invenção sobre a formação óssea. Calceína é uma marcação do tipo flúor-cromo, incorporada na matriz óssea durante nova formação óssea. A medição de quantitativa da calceína reflete o grau de formação óssea induzida por agentes farmacológicos. Seis fêmeas de ratos Sprague15 Dawley de seis meses são utilizadas (n = 6/grupo de dose). As ratas recebem as doses a cada 3 dias por injeção subcutânea (dias 0, 3 e 6), contendo

1 mg/kg ou 6 mg/kg de anticorpo em veículo PBS, ou contendo 10 pg/kg de PTH diariamente ou 6 mg/kg de IgG humana como controle negativo. A calceína é injetada por via subcutânea no dia 7, e as ratas são sacrificadas no dia 10. As tíbias são coletadas e cortadas para avaliar a formação óssea (diáfise tibial), e submetidas à desmineralização e quantificação do flúorcromo da calceína total. Os valores apresentados na Tabela 4 abaixo são medias, com o controle de IgG humana definido para 1,0. Os dados demonstram que a administração de anticorpos da invenção leva tanto à formação óssea trabecular como cortical. Tabela 4

Anticorpo Dose Calceína trabecular relativa Calceína cortical relativa

mg/kg

HuIgG 6 1,00 1,00

PTH 0,01 1,45 1,89

89 6 1,97 1,88

88 6 1,90 2,18

86 6 1,77 2,78

Exemplo 5 Osteoartrite

A expressão de SOST está restrita principalmente ao tecido ósseo. No entanto, os requerentes determinam, nesta descrição, que outro te5 cido com expressão significativa de SOST é a cartilagem, conforme medida por PCR em tempo real. A expressão em cartilagem do SOST é observada também utilizando um arranjo de RNA isolado da cartilagem de pessoas normais ou pacientes com osteoartrite. Além disso, no arranjo, a expressão de SOST aumenta em relação à gravidade da osteoartrite, de modo que a 10 expressão em cartilagem da osteoartrite leve é maior do que a de controle, da grave é maior do que a da leve e a da cirúrgica grave (remoção para cirurgia de substituição de joelho) é maior do que todas as outras, demonstrando uma correlação de osteoartrite e expressão de SOST. Um anticorpo específico para esclerostina pode ser utilizado para tratar osteoartrite.

Um anticorpo quimérico antiesclerostina, com região variável de

murino sobre uma região Fc de rato, o anticorpo 789 com a SEQ ID NO:42 para cadeia pesada, e a SEQ ID NO:43 para cadeia leve, é testado quanto à capacidade de bloquear a dor articular no modelo MIA de osteoartrite. A região variável deste anticorpo foi a seqüência original para a geração do anti20 corpo humanizado 89 (HCVR com a SEQ ID NO: 16 e LCVR com a SEQ ID NO: 19). Ambos, o anticorpo humanizado 89 e o anticorpo quimérico 789 ligam-se ao mesmo epítopo. O modelo de osteoartrite utiliza injeções de monoiodoacetato (MIA) diretamente na articulação do joelho para induzir um processo semelhante ao da osteoartrite que envolve dor inflamatória media25 da por citocinas e um processo de destruição de cartilagem. O joelho contraIateral de um rato é injetado somente solução salina, e a dor é medida como a diferença em suportar o peso das duas patas traseiras.

O experimento n° 1 com MIA faz uso de ratos machos Lewis jovens (7-8 semanas de vida) em "modo de prevenção", onde o anticorpo antiesclerostina é administrado antes que as injeções de MIA. O dia anterior ao 5 das injeções de MIA, os ratos são injetados com 10 mg/kg de anticorpo antiesclerostina i.p. ou com 10 mg/kg de IgG de controle ou PBS (n = 6 por grupo). No dia seguinte, os ratos são anestesiados, e os joelhos direitos são injetados com 0,3 mg de iodoacetato monossódico, dissolvido em 50 ul de solução salina estéril a 0,9%. Os joelhos esquerdos são injetados apenas 10 com solução salina. As injeções são através do ligamento patelar, utilizando uma seringa de insulina com agulha 28G coberta por uma bainha de tubo plástico para permitir a penetração somente de 5 mm na articulação do joelho.

As medições de dor são efetuadas 2 e 7 após a injeção de MIA (3 e 8 dias após a injeção do anticorpo). Após a dor ser medida no dia 7, uma segunda dose da injeção com o anticorpo ou controle é administrada. São efetuadas medições adicionais da dor, em seguida, 10 e 14 dias após a injeção com MIA (3 e 7 dias após a segunda injeção do anticorpo).

A dor é medida por diferença em suportar o peso das patas inje20 tadas, por meio de um dispositivo que testa a incapacitância. Os ratos são colocados em uma caixa de Perspex com suas patas traseiras sobre sensores de pressão. Quando os ratos estão confiavelmente parados, é efetuada uma segunda leitura, seguida por 2 leituras adicionais, e a média é calculada. O peso colocado sobre a pata injetada com MIA é subtraído do colocado 25 sobre a pata injetada com solução salina para fornecer a diferença em suportar o peso.

Uma diminuição estatisticamente significativa em dor é observada com o anticorpo antiesclerostina, comparado ao controle com IgG (e PBS) nos dias 7, 10 e 14 após a administração de MIA (Tabela 5 abaixo). Os valores estão em diferenças em suportar o peso entre a pata injetada com MIA e a injetada com solução salina, em gramas (erro padrão da média).

Um segundo experimento com MIA é conduzido com ratos mais velhos (27 semanas de vida) e em "modo de tratamento", onde o anticorpo é administrado após MIA ser injetado. Os ratos recebem injeções com MIA ou solução salina de controle, como antes, e, em seguida, 6 dias mais tarde, 10 mg/kg de anticorpo antiesclerostina, IgG de controle ou PBS PBS (n = 6 por 5 grupo) são injetados i.p. Nos dias 8 e 15 após a injeção com MIA (2 e 9 dias após a do anticorpo), são efetuadas medições de dor como antes. No dia 16 após a injeção com MIA, uma segunda dose do anticorpo antiesclerostina e dos controles é administrada, e no dia 21 (5 dias após a segunda dose do anticorpo), as medições da dor são novamente coletadas.

No instante inicial após a administração do anticorpo antiescle

rostina (dia 8 pós-MIA), não há efeito do anticorpo sobre a dor, porém, 7 dias mais tarde, há uma tendência para diminuição da dor, conforme medida por diferenças em suportar o peso, entre a pata injetada com MIA e a injetada com solução salina, em gramas. A tendência para dor reduzida com o anti15 corpo antiesclerostina é observada também 5 dias após a segunda dose do anticorpo. O anticorpo quimérico 789 diferiu da IgG de controle com valor-p de 0,06 e 0,08 no dia 15 e 21, respectivamente. Em conjunto, esses resultados demonstram que a dor articular resultante do processo da doença estabelecido pelo MIA é interrompido pela administração do anticorpo neutrali20 zante antiesclerostina.

Exemplo 6 - Estudos de ratos OVX

A rata ovariectomizada (OVX) constitui um modelo bem reconhecido para osteoporose pós-menopausa. Neste estudo, os efeitos de anticorpos antiesclerostina da invenção, compreendendo uma região variável murino e Fc de rato, são examinados na rata OVX.

Fêmeas de ratos Sprague-Dawley de seis meses de vida são ovariectomizadas, sendo permitida perda óssea por 1 mês antes que a dose seja administrada. Um grupo de ratas (n = 8) não são ovariectomizadas, porém é simulado que são operadas para comparação óssea a ratas ovariec30 tomizadas. Todas as ratas OVX são distribuídas aleatoriamente para os grupos de tratamento (n = 7, cada) e tratadas com PTH (1-38), IgG de controle (10 mg/kg) ou 10 mg/kg do anticorpo quimérico antiesclerostina (Anticorpo 788 com a cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 40 e a cadeia leve representada pela SEQ ID NO:41 [a região variável deste anticorpo era a seqüência original para geração do anticorpo humanizado 88]; o anticorpo

789 com a cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 42 e a cadeia leve 5 representada pela SEQ ID NO: 43) por, no total, 58 dias. As doses dos anticorpos são todas por via subcutânea, uma vez a cada 3 dias, enquanto a do PTH (1-38) é administrada diariamente por via subcutânea em 10 mg/kg. Quando do sacrifício, o fêmur e as vértebras são removidos para análise quantitativa por tomografia computadorizada (CT)1 utilizando um aparelho de

CT para medir o fêmur distai (osso trabecular) e a região mediai (osso cortical), bem como a 5a vértebra lombar. Os ossos são posicionados em moldes de gesso para permitir que as medições e imagens do fêmur possam ser repetidas e obtidas a 2 mm do final da epífise (fêmur distai) ou a 10 mm da epífise (fêmur mediai).

As medições das vértebras são efetuadas com varredura da L-5

desde a estrutura característica em "V" na vértebra. Os dados são calculados pelo pacote comercial de software SYS-C320-V 1.5. As propriedades biomecânicas da diáfise femoral, da vértebra L-5 e do colo femoral são medidas após a necropsia, de acordo com: Turner CH1 Burr DB, Basic biome20 chanical measurements of bone: a tutorial. Bone 14(4):595-608, 1993. As propriedades mecânicas da região mediai são medidas, quanto à integridade do fêmur esquerdo, por meio do ensaio de flexão de 3 pontos com carga aplicada a meio caminho entre dois suportes com 15 mm de distância. O fêmur é posicionado de forma que o ponto de carregamento esteja em torno 25 de 7,5 mm proximal do espaço poplíteo distai, e a flexão ocorra perto do eixo medial-lateral. As amostras são testadas em banho de solução salina a 37 °C. As curvas de deslocamento de carga são registradas à velocidade de 10 mm/min, utilizando uma máquina de teste de materiais (modelo: 1/S, MTS Corp, Minneapolis, MN) e analisados com o software TestWorks 4 (MTS 30 Corp.) para calcular o pico da carga. As propriedades mecânicas da vértebra L-5 foram analisadas após os processos posteriores terem sido retirados e as extremidades do centro posicionadas em paralelo, utilizando uma serra com disco de diamante (Buehler Isomet1 Evanston1 IL). As amostras de vértebras carregadas em compressão, utilizando o dispositivo para testes de materiais, e analisadas com o software TestWorks 4 (MTS Corp.). Para medições do colo femoral, o fêmur é posicionado verticalmente em mandril de 5 suporte com o lado proximal voltado para cima, e a carga aplicada para baixo no ponto médio da cabeça do fêmur. A análise foi efetuada com o software TestWorks 4 (MTS Corp.). Os valores médios e erro padrão dos valores médios são apresentados na Tabela 5 e 6 abaixo. Os dados demonstram que os anticorpos 788 e 789 aumentam a densidade mineral óssea ("BMD"), 10 o teor mineral ósseo ("BMC") e a resistência óssea (pico da carga) em ratas OVX.

Tabela 5

Tratamento Fêmur Fêmur Fêmur Fêmur Vértebra Vértebra dist. dist. med. med. BMD BMC BMD BMC BMD BMC (mg/cm3) (mg) (mg/cm3) (mg) (mg/cm3) (mg) Simulação *602 74,1 898 61,2 *587 165 IgG 528 68,6 852 60,5 526 149 PTH *744 *95,3 *925 63,2 *642 *180 788 *675 *91,4 *946 *68,6 *703 *209 789 *710 *94,9 *951 *68,4 *721 *209' * Aumento estatisticamente significativo de IgG de controle, p <0,05, Método

de Dunnett.

Tabela 6

Colo femoral Fêmur med. Vértebra

Tratamento Picodacarga Pico da carga (New- Pico da carga

(Newtons) tons) (Newtons)

Simulação 96,5 134 236

IgG 100,4 126 188

PTH 117,6 128 *328

2492788 *131,6 *147 *431

2492789 *147,5 *153 *432

* Aumento estatisticamente significativo de IgG de controle, p <0,05, Método de Dunnett.

Claims (12)

1. Anticorpo que se liga especificamente à esclerostina humana, o qual compreende seis CDRs com seqüências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (i) HCDR1 com SEQ ID NO: 20, HCDR2 com SEQ ID NO: 21, HCDR3 com SEQ ID NO: 22, LCDR1 com SEQ ID NO: 23, LCDR2 com SEQ ID NO: 24 e LCDR3 com SEQ ID NO: 25, e (ii) HCDR1 com SEQ ID NO: 26, HCDR2 com SEQ ID NO: 27, HCDR3 com SEQ ID NO: 28, LCDR1 com SEQ ID NO: 29, LCDR2 com SEQ ID NO: 30 e LCDR3 com SEQ ID NO: 31.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que, (i) a região variável da cadeia leve possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14 e a região variável da cadeia leve, a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17, ou (ii) a região variável da cadeia leve possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 e a região variável da cadeia leve, a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, o qual compreende uma cadeia polipeptídica pesada e uma cadeia polipeptídica leve em que, (i) a cadeia polipeptídica pesada possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e a cadeia polipeptídica leve, a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, ou (ii) a cadeia polipeptídica pesada possui a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 e a cadeia polipeptídica leve, a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

4. Anticorpo que se liga especificamente à esclerostina humana e que compreende uma cadeia polipeptídica pesada com a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 e a cadeia polipeptídica leve com a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

5. Composição farmacêutica, compreendendo o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-4 e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso em terapia.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso em aumentar pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo ou resistência óssea em um indivíduo humano.

8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio, selecionado do grupo consistindo em osteoporose, osteopenia, osteoartrite, dor associada à osteoartrite, artrite reumatóide, doença periodontal ou mieloma múltiplo em um indivíduo humano.

9. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso no tratamento de osteoporose.

10. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-4 para o preparo de um medicamento para aumentar pelo menos um entre massa óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo ou resistência óssea em um indivíduo humano.

11. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4 para o preparo de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio selecionado do grupo consistindo em osteoporose, osteopenia, osteoartrite, dor associada à osteoartrite, artrite reumatóide, doença periodontal ou mieloma múltiplo em um indivíduo humano.

12. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-4, para o prepare de um medicamento para o tratamento de osteoporose.