CN104093739A - 针对tnf的免疫结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了结合肿瘤坏死因子-α(TNF-a)，例如人TNF-a的分离的结合蛋白，例如抗体或其抗原结合部分；以及相关的基于抗体的组合物和分子。本发明还公开了包含所述抗体的药物组合物以及使用所述抗体的治疗和诊断方法。

Description

针对TNF的免疫结合剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年10月24日申请的美国临时申请号61/550,587的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
发明领域
本发明提供TNF-α结合蛋白和它们在预防和/或治疗急性和慢性免疫疾病中的用途。
发明背景
本领域中需要能够结合TNF-α(也称为肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子-α、TNF和恶病质素)的改进的结合蛋白。提供能够以高亲和力结合TNF-α且中和TNF-α的新颖结合蛋白家族、CDR移植结合蛋白、人源化结合蛋白及其片段。
发明简述
提供结合TNF-α的TNF-α结合蛋白或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含选自以下任何一个的VH区：SEQID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077，或来自其的一个、两个或三个CDR。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含选自以下任何一个的VL区：SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076和1078，或来自其的一个、两个或三个CDR。在一个特定实施方案中，抗原结合结构域包含VH区和VL区，例如其中所述VH区包含SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077，或来自其的一个、两个或三个CDR，且所述VL区包含SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076和1078，或来自其的一个、两个或三个CDR。
在一个实施方案中，结合蛋白结合TNF-α。在另一个实施方案中，结合蛋白调节TNF-α的生物功能。在另一个实施方案中，结合蛋白中和TNF-α。在另一个实施方案中，结合蛋白减弱TNF-α结合它的受体的能力，例如结合蛋白减弱前人TNF-α、成熟人TNF-α或截短人TNF-α结合它的受体的能力。在另一个实施方案中，结合蛋白降低一种或多种选自以下的TNF-α生物活性：TNF依赖性细胞因子产生；TNF依赖性细胞杀伤；TNF依赖性发炎；TNF依赖性骨侵蚀；和TNF依赖性软骨损伤。
在一个实施方案中，结合蛋白具有选自以下的缔合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；和至少约106M-1s-1；如通过表面等离子体共振所测量。在另一个实施方案中，结合蛋白具有选自以下的解离速率常数(Koff)：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；和至多约10-6s-1，如通过表面等离子体共振所测量。在另一个实施方案中，结合蛋白具有选自以下的解离常数(KD)：至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M；和至多10-13M。
在另一方面，提供一种用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本文公开的药物组合物。在另一个实施方案中，提供一种用于降低人TNF-α活性的方法，所述方法包括：使人TNF-α与本文公开的结合蛋白接触以使人TNF-α活性降低。在另一个实施方案中，提供一种用于降低罹患TNF-α活性有害的病症的人受试者体内的人TNF-α活性的方法，所述方法包括向所述人受试者施用本文公开的结合蛋白以使所述人受试者体内的人TNF-α活性降低。在另一个实施方案中，提供一种用于治疗受试者的TNF-α活性有害的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的结合蛋白以使治疗得以达成。
在一个实施方案中，方法治疗涉及免疫和发炎要素的疾病，如自体免疫性疾病，特别是与发炎相关的那些自体免疫性疾病，包括克罗恩氏病(Crohn’s disease)、牛皮癣(包括斑块牛皮癣)、关节炎(包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎或青少年特发性关节炎)、多发性硬化症和僵直性脊椎炎。因此，本文的结合蛋白可用于治疗这些病症。
发明详述
本发明提供结合TNF-α的TNF-α结合蛋白或其抗原结合部分、其药物组合物、以及用于制备所述结合蛋白和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还提供使用本文公开的结合蛋白检测人TNF-α、在体外或体内抑制人TNF-α、以及调控基因表达或TNF-α相关功能的方法。
除非本文另外定义，否则关联本公开使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。术语的含义和范围应为清晰的，然而，如果存在任何隐含歧义，那么本文中所提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有需要，否则单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及所述术语的其它形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具有限制性。此外，除非另外明确陈述，否则如“要素”或“组分”的术语涵盖构成一个单元的要素和组分以及构成一个以上子单元的要素和组分。
一般而言，关联本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学和杂交使用的命名以及本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学和杂交的技术是本领域中众所周知且常用的那些命名和技术。除非另外指出，否则本公开的方法和技术一般根据本领域中所众所周知且如在整篇本说明书中所引用并论述的各种一般参考文献和更特定参考文献中所述的常规方法来进行。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989))。酶促反应和纯化技术是根据制造商说明书，如本领域中通常所实现或如本文所述来进行。关联本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名以及本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中众所周知且常用的那些命名、实验室程序和技术。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗。
术语“人TNF-α”(本文中缩写为hTNF-α)包括三聚体细胞因子蛋白。所述术语包括包含三个17.5kD TNF-α蛋白的均三聚体蛋白质。所述均三聚体蛋白质称为“TNF-α蛋白”。术语人“TNF-α”意图包括可通过标准重组表达方法制备的重组人TNF-α(rhTNF-α)。人TNF-α的序列展示于表1中。
表1：人TNF-α的序列
术语“抗体”泛指包含四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生物。所述突变、变异或衍生抗体形式是本领域中已知的。
在全长抗体中，各重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域：CL。VH和VL区可进一步细分成散置在较保守区域的称为框架区(FR)的高变区，称为互补决定区(CDR)。各VH和VL主要由三个CDR和四个FR组成，其自氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
术语结合蛋白的“抗原结合部分”或“抗原结合区”(或简称为“结合蛋白部分”)是指结合蛋白的保留与抗原(例如hTNF-α)特异性结合的能力的一个或多个片段。结合蛋白的抗原结合功能可由全长结合蛋白的片段执行。所述结合蛋白实施方案也可具有双特异性、双重特异性或多特异性形式；特异性结合于两种或更多种不同抗原。涵盖于术语结合蛋白的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为包含由在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)包含单一可变结构域的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546；Winter等，PCT公布WO90/05144A1)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由独立基因编码，但它们可使用重组方法由合成接头接合，所述接头能够使它们制成其中VL和VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。所述单链结合蛋白也意图涵盖于术语结合蛋白的“抗原结合部分”内。也涵盖其它形式的单链结合蛋白，如双功能抗体。双功能抗体是二价双特异性结合蛋白，其中VH和VL结构域表达于单一多肽链上，但使用过短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak等(1994)Structure2:1121-1123)。
术语“结合蛋白”是指包含一个或多个任选连接于接头多肽或恒定结构域的本文公开的抗原结合部分的多肽。接头多肽包含两个或两个以上由肽键接合的氨基酸残基且用于连接一个或多个抗原结合部分。所述接头多肽为本领域中所众所周知(参见例如Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等，(1994)Structure2:1121-1123)。恒定结构域是指重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列为本领域中已知且呈现于表2中。
表2：人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列
结合蛋白或其抗原结合部分可为通过结合蛋白或结合蛋白部分与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价缔合而形成的较大免疫粘附分子的一部分。所述免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白链菌素核心区来制备四聚scFv分子(Kipriyanov等，(1995)Hum.Antibod.Hybridomas6:93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C端聚组氨酸标签来制备二价且生物素化scFv分子(Kipriyanov等，(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。可使用常规技术自完整抗体制备如Fab和F(ab’)2片段的抗体部分，所述技术如对完整抗体分别进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，可使用如本文所述的标准重组DNA技术获得结合蛋白、结合蛋白部分和免疫粘附分子。
“分离的结合蛋白”是指实质上不含具有不同抗原特异性的其它结合蛋白的结合蛋白或其抗原结合部分(例如，特异性结合hTNF-α的分离的结合蛋白实质上不含特异性结合非hTNF-α的抗原的结合蛋白)。然而，特异性结合hTNF-α的分离的结合蛋白可对其他抗原(如来自其它物种的TNF-α分子)具有交叉反应性。此外，分离的结合蛋白可实质上不含其它细胞物质和/或化学物质。
术语“人结合蛋白”包括具有来源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的结合蛋白或其抗原结合部分。本文公开的人结合蛋白可包括不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机或位点特异性突变诱发或由体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中且特别是在CDR3中。然而，术语“人结合蛋白”不意图包括来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)的生殖系的CDR序列已移植至人框架序列上的结合蛋白。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域中公认的这些术语是指对于抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中相较于其它氨基酸残基更加可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat等，(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391；和Kabat等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices,NIH出版号91-3242)。也参见Martin,“Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains”,Kontermann和Dübel编,Antibody Engineering(Springer-Verlag,柏林,2001)，第31章,尤其是第432-433页。对于重链可变区，高变区的范围是CDR1的氨基酸位置31至35、CDR2的氨基酸位置50至65以及CDR3的氨基酸位置95至106。对于轻链可变区，高变区的范围是CDR1的氨基酸位置24至34、CDR2的氨基酸位置50至56以及CDR3的氨基酸位置89至97。
术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的各可变区中存在三个CDR，对于各可变区指定为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”是指存在于能够结合抗原的单一可变区中的一组三个CDR。已根据不同系统来不同定义这些CDR的精确边界。由Kabat所述的系统(Kabat等Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991))不仅提供可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且也提供界定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917以及Chothia等(1989)Nature 342:877-883)发现Kabat CDR内的某些子部分尽管在氨基酸序列层面上具有极大差异，但采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区域可称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。界定与Kabat CDR重叠的CDR的其它边界已由Padlan(1995)FASEB J.9:133-139和MacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732-745)描述。其它CDR边界定义可能不严格遵循以上系统之一，但将仍然与Kabat CDR重叠，但鉴于特定残基或残基群组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验研究结果而可将它们缩短或延长。本文所用的方法可利用根据任何这些系统定义的CDR，但特定实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。
本领域中已知人重链和轻链受体序列。在本公开的一个实施方案中，人重链和轻链受体序列选自由V-base(hvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或(国际ImMunoGeneTics信息系统)(himgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/)所列出的序列。在本公开的另一个实施方案中，人重链和轻链受体序列分别选自表3和表4中所述的序列。
表3：重链受体序列
表4：轻链受体序列
术语“多价结合蛋白”在本说明书中用于表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白可被工程化以具有三个或更多个抗原结合位点，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两种或更多种相关或无关靶标的结合蛋白。如本文所用的双重可变结构域(DVD)结合蛋白或免疫球蛋白(DVD-Ig)是包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白且是四价或多价结合蛋白。所述DVD结合蛋白可为单特异性，即能够结合一种抗原；或是多特异性，即能够结合两种或更多种抗原。包含两个重链DVD-Ig多肽和两个轻链DVD-Ig多肽的DVD结合蛋白称作DVD-Ig。DVD-Ig的各半部包含重链DVD-Ig多肽和轻链DVD-Ig多肽以及两个抗原结合位点。各结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合位点总共有6个CDR涉及于抗原结合中。DVD结合蛋白和制备DVD结合蛋白的方法公开于美国专利号7,612,181中。
本公开的一个方面涉及包括能够结合TNF-α的结合蛋白的DVD结合蛋白。在一个特定实施方案中，DVD结合蛋白能够结合TNF-α和第二靶标。
术语“中和性”是指当结合蛋白特异性结合细胞因子时中和所述细胞因子的生物活性。在一个特定实施方案中，中和性结合蛋白与hTNF-α的结合导致hTNF-α的生物活性受抑制，例如中和性结合蛋白结合hTNF-α且使hTNF-α的生物活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％或85％以上。中和性结合蛋白对hTNF-α生物活性的抑制可通过测量本领域中所众所周知的hTNF-α生物活性的一个或多个指标来评估。举例来说，中和L929细胞上TNF-α的细胞毒性。
在另一个实施方案中，术语“促效剂”或“促效性”是指当结合蛋白特异性结合TNF-α(例如hTNF-α)时，TNF-α的生物活性增加。在一个特定实施方案中，促效性结合蛋白与TNF-α的结合导致TNF-α的生物活性增加。在一个特定实施方案中，促效性结合蛋白结合TNF-α且使TNF-α的生物活性增加至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。促效性结合蛋白对TNF-α生物活性的抑制可通过测量本领域中所众所周知的TNF-α生物活性的一个或多个指标来评估。
术语“活性”包括结合蛋白对抗原，例如hTNF-α结合蛋白结合于TNF-α抗原的活性(如结合特异性/亲和力)和/或结合蛋白的中和效能(或促效效能)，例如hTNF-α结合蛋白与hTNF-α结合会抑制hTNF-α的生物活性，例如中和L929细胞上TNF-α的细胞毒性。
术语“表面等离子体共振”是指允许通过例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden和Piscataway,NJ)检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。
术语“Kon”是指结合蛋白(例如抗体)与抗原缔合以形成例如如在本领域中已知的抗体/抗原复合物的缔合速率常数。“Kon”也称为如在本文中可互换使用的术语“缔合速率常数”或“ka”。这个值指示抗体与它的靶标抗原的结合速率或抗体与抗原之间形成复合物的速率，也由以下方程式所示：
抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
术语“Koff”是指结合蛋白(例如抗体)自例如如在本领域中已知的抗体/抗原复合物解离的解离速率常数或“解离速率常数”。这个值指示抗体自它的靶标抗原解离或Ab-Ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原的解离速率，如由以下方程式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag
术语“KD”是指“平衡解离常数”，且是指在滴定测量中在平衡状态下获得的值，或通过将解离速率常数(Koff)除以缔合速率常数(Kon)而获得的值。缔合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体对抗原的结合亲和力。测定缔合和解离速率常数的方法为本领域中所众所周知。使用基于荧光的技术提供检查在生理缓冲液中处在平衡状态下的样本的高灵敏度和能力。可使用其它实验性方法和仪器，如(生物分子相互作用分析)测定法(例如可获自BIAcoreInternational AB(GEHealthcare公司),Uppsala,Sweden的仪器)。另外，也可使用(动态排除测定法(Kinetic Exclusion Assay))测定法，其可获自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)。
I.结合人TNF-α的结合蛋白
本公开的一个方面提供以高亲和力、缓慢解离速率和高中和能力结合TNF-α的分离的完全人抗人TNF结合蛋白，如单克隆抗体或其抗原结合部分。本公开的第二方面提供以高亲和力、缓慢解离速率和高中和能力结合TNF-α的亲和力成熟完全人抗TNF结合蛋白，如单克隆抗体或其抗原结合部分。
A.制备TNF-α结合蛋白的方法
本文公开的结合蛋白可通过本领域中已知的多种技术中的任何一个制备。
1.使用转基因动物产生抗TNF-α单克隆抗体
在本公开的另一个实施方案中，通过用TNF-α抗原使包含一些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物免疫来产生结合蛋白。在一个特定实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，其为包含人免疫球蛋白基因座的较大片段且缺乏小鼠抗体产生的工程化小鼠品系。参见例如Green等，(1994)NatureGenet.7:13-21；以及美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。也参见PCT公布WO 91/10741(1991年7月25日公布)；WO 94/02602(1994年2月3日公布)；WO 96/34096和WO 96/33735(均为1996年10月31日公布)；WO 98/16654(1998年4月23日公布)；WO 98/24893(1998年6月11日公布)；WO 98/50433(1998年11月12日公布)；WO 99/45031(1999年9月10日公布)；WO 99/53049(1999年10月21日公布)；WO 00/09560(2000年2月24日公布)；和WO 00/37504(2000年6月29日公布)。XENOMOUSE转基因小鼠产生完全人抗体的成人样人谱系，且产生抗原特异性人Mab。XENOMOUSE转基因小鼠通过引入人重链基因座和x轻链基因座的百万碱基(megabase)大小的生殖系构型YAC片段而含有约80％的人抗体谱系。参见Mendez等，(1997)Nature Genet.15:146-156；Green和Jakobovits(1998)J.Exp.Med.188:483-495。
2.使用重组抗体文库产生抗TNF-α单克隆抗体
体外方法也可用于制备本文公开的结合蛋白，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。重组抗体文库的所述筛选的方法在本领域中是众所周知的且包括例如以下文献中所述的方法：美国专利号5,223,409；PCT公布WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO97/29131；Fuchs等，(1991)Bio/Technology 9:1369-1372；Hay等，(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85；Huse等，(1989)Science246:1275-1281；McCafferty等，(1990)Nature348:552-554；Griffiths等，(1993)EMBO J.12:725-734；Hawkins等，(1992)J.Mol.Biol.226:889-896；Clackson等，(1991)Nature352:624-628；Gram等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576-3580；Garrard等，(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等，(1991)Nucl.AcidRes.19:4133-4137；和Barbas等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982；和美国专利公布号2003.0186374。
重组抗体文库可来自用TNF-α或TNF-α的一部分免疫的受试者。或者，重组抗体文库可来自未处理的受试者，即未用TNF-α免疫的受试者，如人抗体文库来自尚未用人TNF-α免疫的人受试者。通过用包括人TNF-α的肽筛选重组抗体文库以由此选择识别TNF-α的那些抗体来选择本文公开的抗体。用于进行所述筛选和选择的方法在本领域中是众所周知的，如先前段落中的参考文献中所述。为选择对hTNF-α具有特定结合亲和力的本文公开的抗体，如以特定koff速率常数自人TNF-α解离的抗体，可使用本领域中已知的表面等离子体共振方法来选择具有所需koff速率常数的抗体。为选择对hTNF-α具有特定中和活性的本文公开的抗体，如具有特定IC50的抗体，可使用本领域中已知用于评估对hTNF-α活性的抑制的标准方法。
在一个方面，提供一种结合TNF-α(例如人TNF-α)的分离的结合蛋白或其抗原结合部分。在一个特定实施方案中，结合蛋白是中和性结合蛋白。在各种实施方案中，结合蛋白是重组结合蛋白或单克隆抗体。
举例来说，也可使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法来产生本文公开的结合蛋白。在噬菌体展示方法中，使功能抗体结构域展示于带有编码它们的聚核苷酸序列的噬菌体粒子的表面上。具体来说，所述噬菌体可用于展示自谱系或组合抗体文库(例如人或鼠类)表达的抗原结合结构域。可用抗原，例如使用标记的抗原或结合于或捕捉于固体表面或珠粒的抗原来选择或鉴定表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括自Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合的噬菌体表达的fd和M13结合结构域。可用于制备本文公开的结合蛋白的噬菌体展示方法的实例可见于本领域中。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可自噬菌体分离结合蛋白编码区且将其用于产生包括人结合蛋白或任何其它所需抗原结合片段的完整结合蛋白，且在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达，例如如以下所详述。举例来说，也可使用本领域中已知的方法来利用用以重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术，如以下文献中所公开的技术：PCT公布WO92/22324；Mullinax等，(1992)BioTechniques12(6):864-869；和Sawai等，(1995)Am.J.Reprod.Immunol.34:26-34；和Better等，(1998)Science 240:1041-1043。可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等，(1991)MethodsEnzymol.203:46-88；Shu等，(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA 90:7995-7999；和Skerra等，(1998)Science240:1038-1041中所述的技术。
作为通过噬菌体展示来筛选重组抗体文库的替代方案，本领域中已知用于筛选大型组合文库的其它方法可应用于鉴定本文公开的双重特异性结合蛋白。如PCT公布号WO 98/31700以及Roberts和Szostak(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297-12302中所述，一类替代表达系统是重组抗体文库表达为RNA-蛋白质融合物的表达系统。在这个系统中，通过在体外翻译于3'末端处带有嘌呤霉素(一种肽基受体抗生素)的合成mRNA来在mRNA与它编码的肽或蛋白质之间产生共价融合物。因此，可基于所编码的肽或蛋白质(例如抗体或其部分)的性质(如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合)，自mRNA的复杂混合物(例如组合文库)增浓特异性mRNA。可由如上所述的重组方式(例如在哺乳动物宿主细胞中)表达由筛选所述文库所回收的编码抗体或其部分的核酸序列，且另外可通过对突变已引入最初选择的序列中的mRNA-肽融合物进行更多轮筛选或通过如上所述的用于重组抗体的体外亲和力成熟的其它方法来经受进一步亲和力成熟。
在另一方法中，本文公开的结合蛋白也可使用本领域中已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，遗传方法用于将抗体结构域系栓(tether)至酵母细胞壁且使它们展示于酵母表面上。具体来说，所述酵母可用于展示自谱系或组合抗体文库(例如人或鼠类)表达的抗原结合结构域。可用于制备本文公开的结合蛋白的酵母展示方法的实例包括Wittrup等,美国专利号6,699,658和Frenken等,美国专利号6,114,147中所公开的方法。
B.产生重组TNF-α结合蛋白
本文公开的结合蛋白可通过本领域中已知的许多技术中的任何一个产生。举例来说，自宿主细胞表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染至宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意图涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的广泛多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-聚葡萄糖转染等。尽管有可能在原核或真核宿主细胞中表达本文公开的结合蛋白，但因为真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装且分泌适当折叠且具有免疫活性的结合蛋白，所以设想在所述真核细胞中，例如在哺乳动物宿主细胞中表达结合蛋白。
用于表达本文公开的重组结合蛋白的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中所述的dhfr-CHO细胞，其与DHFR可选择标记物一起使用，例如如Kaufman和Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码结合蛋白基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞持续足以允许结合蛋白在宿主细胞中表达或具体来说允许抗体分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中的时段来产生结合蛋白。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。
宿主细胞也可用于产生功能结合蛋白片段，如Fab片段或scFv分子。应了解，以上程序的变化形式处于本公开的范围内。举例来说，可能合乎需要的是用编码本文公开的结合蛋白的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于移除一些或全部编码并非结合目标抗原所必需的轻链和重链中的任何一个或两者的DNA。本文公开的结合蛋白也涵盖自所述截短DNA分子表达的分子。另外，可通过用标准化学交联方法使本文公开的结合蛋白与第二结合蛋白交联来产生双功能结合蛋白，其中一个重链和一个轻链是本文公开的结合蛋白且另一重链和另一轻链对非目标抗原的抗原具特异性。
在用于重组表达本文公开的结合蛋白或其抗原结合部分的一示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染法将编码重链与轻链两者的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，使重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV强化子/AdMLP启动子调控元件以驱动基因高度转录。重组表达载体也带有DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤(methotrexate)选择/扩增法来选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达重链和轻链，且自培养基回收完整结合蛋白。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞且自培养基回收结合蛋白。另外，提供一种通过在适合培养基中培养本文公开的宿主细胞直至合成本文公开的重组结合蛋白来合成本文公开的重组结合蛋白的方法。所述方法可进一步包括自培养基分离重组结合蛋白。
II.hTNF-α结合蛋白
A.单个克隆序列
表5提供完全人抗人TNF结合蛋白的VH和VL序列，包括来自各VH和VL序列的CDR。
表5.单个的完全人抗TNF-α VH序列
B.IgG转化的克隆
表6提供如在实施例2中详细论述的转化成IgG克隆的人源化抗TNF MAK-195抗体的VH序列。
表6.IgG转化的克隆的人源化抗TNF MAK-195 Ab VH序列
表7提供如在实施例2中详细论述的人源化抗TNF MAK-195抗体的IgG转化的克隆的VL序列。
表7.IgG转化的克隆的人源化抗TNF MAK-195 Ab VL序列
C.来自转化的克隆的单个的hMAK-199序列
表8提供如在实施例3中详细论述的人源化抗TNF MAK-199转化的克隆的VH序列。
表8.IgG转化的克隆的人源化抗TNF MAK-199 Ab VH序列
表9提供如在实施例3中详细论述的人源化抗TNF MAK-199转化的克隆的VH序列。
表9.IgG转化的克隆的人源化抗TNF MAK-199 Ab VL序列
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含选自以下任何一个的VH区：SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077，或来自其的一个、两个或三个CDR。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含选自以下任何一个的VL区：SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076和1078，或来自其的一个、两个或三个CDR。在一个特定实施方案中，抗原结合结构域包含VH区和VL区，例如其中所述VH区包含SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077，或来自其的一个、两个或三个CDR，且所述VL区包含SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076和1078，或来自其的一个、两个或三个CDR。
在VH和/或VL CDR序列如上文提供的一个实施方案中，人受体框架包含至少一个选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-21。在一个特定实施方案中，人受体框架包含选自以下的氨基酸序列：SEQIN NO:9、10、11、12、15、16、17和21。在另一个实施方案中，人受体框架包含至少一个框架区氨基酸取代，其中所述框架的氨基酸序列与人受体框架的序列至少65％一致且包含至少70个与人受体框架一致的氨基酸残基。在另一个实施方案中，人受体框架在关键残基处包含至少一个框架区氨基酸取代。所述关键残基选自：邻接CDR的残基；糖基化位点残基；稀有残基；能够与人TNF-α相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；典型残基；重链可变区与轻链可变区之间的接触残基；维尼尔区(Vernier zone)内的残基；和Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链框架之间重叠的区域中的残基。在一个实施方案中，关键残基选自：H1、H12、H24、H27、H29、H37、H48、H49、H67、H71、H73、H76、H78、L13、L43、L58、L70和L80。在一个实施方案中，VH突变选自：Q1E、I12V、A24V、G27F、I29L、V29F、F29L、I37V、I48L、V48L、S49G、V67L、F67L、V71K、R71K、T73N、N76S、L78I和F78I。在另一个实施方案中，VL突变选自：V13L、A43S、I58V、E70D和S80P。在一个实施方案中，结合蛋白包含两个可变结构域，其中所述两个可变结构域具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:22与23；23与24；24与25；26与27；28与29；30与31；或32与33。
III.产生结合蛋白和结合蛋白产生细胞系
在一个实施方案中，本文公开的TNF-α结合蛋白展现降低或中和TNF-α活性的高能力，例如，如通过本领域中已知的若干体外和体内测定法中的任何一个所评估。或者，本文公开的TNF-α结合蛋白也展现增加或促效TNF-α活性的高能力。
在特定实施方案中，分离的结合蛋白或其抗原结合部分结合人TNF-α，其中所述结合蛋白或其抗原结合部分以约0.1s-1或0.1s-1以下、如1×10-2s-1或1×10-2s-1以下、1×10-3s-1或1×10-3s-1以下、1×10-4s-1或1×10-4s-1以下、1×10-5s-1或1×10-5s-1以下和1×10-6s-1或1×10-6s-1以下的koff速率常数(如通过表面等离子体共振所测定)自人TNF-α解离；或以约1×10-6M或1×10-6M以下、如1×10-7M或1×10-7M以下、1×10-8M或1×10-8M以下、1×10-9M或1×10-9M以下、1×10-10M或1×10-10M以下和1×10-11M或1×10-11M以下的IC50抑制人TNF-α活性。在某些实施方案中，结合蛋白包含重链恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一个实施方案中，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，结合蛋白可包含轻链恒定区(κ轻链恒定区或λ轻链恒定区)。在另一个实施方案中，结合蛋白包含κ轻链恒定区。或者，结合蛋白部分可为例如Fab片段或单链Fv片段。
置换Fc部分中的氨基酸残基以改变结合蛋白效应功能在本领域中是已知的(参见美国专利号5,648,260和5,624,821)。结合蛋白的Fc部分介导若干重要效应功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。视治疗目标而定，这些效应功能在一些情况下为治疗性抗体所需，但在其它情况下可能不必要或甚至有害。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，通过分别与FcγR和补体C1q结合来介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)是决定抗体的循环半衰期的关键组分。在另一个实施方案中，置换结合蛋白的恒定区(例如结合蛋白的Fc区)中的至少一个氨基酸残基，以使结合蛋白的效应功能得以改变。
一个实施方案提供一种标记的结合蛋白，其中本文公开的抗体或抗体部分被衍生或连接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白质)。举例来说，可通过使本文公开的抗体或抗体部分与一个或多个其它分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)来衍生本文公开的标记的结合蛋白，所述一个或多个分子实体如另一抗体(例如双特异性抗体或双功能抗体)、可检测剂、细胞毒性剂、医药剂和/或可介导抗体或抗体部分与另一分子(如抗生蛋白链菌素核心区或聚组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽。
本文公开的抗体或抗体部分可用其衍生的适用可检测剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红素(phycoerythrin)等。也可用可检测酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶等)衍生抗体。当用可检测酶衍生抗体时，所述抗体是通过添加所述酶用于产生可检测反应产物的其它试剂来检测。举例来说，当存在可检测剂辣根过氧化酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺会产生有色反应产物，其是可检测的。也可用生物素衍生抗体，且通过间接测量抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合加以检测。
本公开的另一个实施方案提供一种结晶化结合蛋白。在一个实施方案中，提供如本文所公开的完整TNF-α结合蛋白及其片段的晶体以及包含所述晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶化结合蛋白具有与所述结合蛋白的可溶性对应物相比较长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶后保留生物活性。
本文公开的结晶化结合蛋白可根据本领域中已知且如PCT公布WO 02/72636中所公开的方法来产生。
本公开的另一个实施方案提供一种糖基化结合蛋白，其中结合蛋白或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。初期体内蛋白质产生可经历称为翻译后修饰的进一步加工。具体来说，可以酶促方式添加糖(糖基)残基，即一种称为糖基化的过程。带有共价连接的寡糖侧链的所得蛋白质称为糖基化蛋白或糖蛋白。蛋白质糖基化取决于目标蛋白质的氨基酸序列以及表达蛋白质的宿主细胞。不同生物体可产生不同糖基化酶(例如糖基转移酶和糖苷酶)，且具有不同可用底物(核苷酸糖)。归因于所述因素，蛋白质糖基化样式和糖基残基的组成可视表达特定蛋白质的宿主系统而不同。适用于本公开中的糖基残基可包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。在一个实施方案中，糖基化结合蛋白包含糖基残基以使糖基化样式是人样式。
本领域技术人员已知不同蛋白质糖基化可产生不同蛋白质特征。举例来说，在微生物宿主(如酵母)中产生且利用酵母内源性路径进行糖基化的治疗性蛋白质的功效与在哺乳动物细胞(如CHO细胞系)中表达的相同蛋白质相比可降低。所述糖蛋白也可在人中具有免疫原性且在施用之后展示体内半衰期缩短。人和其它动物中的特异性受体可识别特异性糖基残基且促进蛋白质从血流快速清除。其它不良作用可包括蛋白质折叠、溶解度、对蛋白酶的敏感度、运输、转运、区室化、分泌、由其它蛋白质或因子识别、抗原性或过敏原性的变化。因此，从业者可能偏好具有特定糖基化组成和样式的治疗性蛋白质，例如与在人细胞中或在预定标的动物的物种特异性细胞中所产生者相同或至少类似的糖基化组成和样式。
表达与宿主细胞的糖基化蛋白不同的糖基化蛋白可通过对宿主细胞进行遗传修饰以表达异源糖基化酶来达成。使用本领域中已知的技术，从业者可产生展现人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。举例来说，已对酵母菌株进行遗传修饰来表达非天然存在的糖基化酶以使在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)展现的蛋白质糖基化与动物细胞，尤其是人细胞的蛋白质糖基化相同(美国专利号7,449,308和7,029,872)。
此外，本领域技术人员应了解，可使用被遗传工程化来表达各种糖基化酶的宿主细胞的文库来表达目标蛋白质，以使所述文库的成员宿主细胞产生具有变异糖基化样式的目标蛋白质。从业者可随后选择和分离具有特定新型糖基化样式的目标蛋白质。在一个实施方案中，具有经特定选择的新型糖基化样式的蛋白质展现改进或改变的生物性质。
IV.TNF-α结合蛋白的用途
考虑到例如本文公开的人TNF-α结合蛋白或其部分结合人TNF-α的能力，它们可用于使用常规免疫测定法(如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学)来检测TNF-α(例如在如血清或血浆的生物样本中)。提供一种用于检测生物样本中的TNF-α的方法，所述方法包括使生物样本与本文公开的结合蛋白或结合蛋白部分接触且检测与TNF-α结合的结合蛋白(或结合蛋白部分)或未结合的结合蛋白(或结合蛋白部分)，以由此检测所述生物样本中的TNF-α。结合蛋白直接或间接用可检测物质标记以有助于检测结合或未结合的抗体。适合可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。适合酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合荧光物质的实例包括伞酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；并且适合放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
替代标记结合蛋白，可通过利用用可检测物质标记的rhTNF-α标准物和未标记的人TNF-α结合蛋白进行的竞争免疫测定法来测定生物流体中的人TNF-α。在这个测定法中，将生物样本、标记的rhTNF-α标准物和人TNF-α结合蛋白组合且测定与未标记的结合蛋白结合的标记的rhTNF-α标准物的量。生物样本中人TNF-α的量与结合于TNF-α结合蛋白的标记的rhTNF-α标准物的量成反比。类似地，也可通过利用用可检测物质标记的rhTNF-α标准物和未标记的人TNF-α结合蛋白进行的竞争免疫测定法来测定生物流体中的人TNF-α。
在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白和结合蛋白部分能够在体外和在体内中和TNF-α活性(例如人TNF-α活性)。在另一个实施方案中，本文公开的结合蛋白和结合蛋白部分能够增加或促效人TNF-α活性(例如人TNF-α活性)。因此，本文公开的所述结合蛋白和结合蛋白部分可用于抑制或增加例如含有hTNF-α的细胞培养物中、人受试者中或具有本文公开的结合蛋白与之交叉反应的TNF-α的其它哺乳动物受试者中的hTNF-α活性。在一个实施方案中，提供一种用于抑制或增加hTNF-α活性的方法，所述方法包括使hTNF-α与本文公开的结合蛋白或结合蛋白部分接触以使hTNF-α活性得以抑制或增加。举例来说，在含有或疑似含有hTNF-α的细胞培养物中，可将本文公开的结合蛋白或结合蛋白部分添加至培养基中以抑制或增加培养物中的hTNF-α活性。
在另一个实施方案中，提供一种用于降低或增加受试者(宜来自罹患TNF-α活性有害或者有益的疾病或病症的受试者)中的hTNF-α活性的方法。提供用于降低或增加罹患所述疾病或病症的受试者中的TNF-α活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的结合蛋白或结合蛋白部分以使受试者中的TNF-α活性得以降低或增加。在一个特定实施方案中，TNF-α是人TNF-α且受试者是人受试者。或者，受试者可为表达所提供的结合蛋白能够结合的TNF-α的哺乳动物。此外，受试者可为其中已引入TNF-α(例如通过施用TNF-α或通过表达TNF-α转基因)的哺乳动物。本文公开的结合蛋白可施用至人受试者以用于治疗目的。此外，本文公开的结合蛋白可施用至表达所述结合蛋白能够与之结合的TNF-α的非人哺乳动物以用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，所述动物模型可适用于评估本文公开的结合蛋白的治疗功效(例如测试施药剂量和时程)。
术语“TNF-α活性有害的病症”包括TNF-α活性在罹患病症的受试者中的存在已展示或疑似造成病症的病理生理异常或是促成病症恶化的因素的疾病和其它病症。因此，TNF-α活性有害的病症是其中降低TNF-α活性预期会减轻病症的症状和/或进程的病症。所述病症可例如通过罹患病症的受试者的生物流体中的TNF-α浓度增加(例如受试者的血清、血浆、滑液等中的TNF-α浓度增加)来证实，所述TNF-α浓度可例如使用如上所述的抗TNF-α抗体来检测。可用本文公开的结合蛋白治疗的病症的非限制性实例包括下文关于本文公开的抗体的药物组合物的章节中所论述的那些病症。
或者，术语“TNF-α活性有益的病症”包括罹患病症的受试者中的TNF-α活性的存在已展示或疑似有益于治疗病症的病理生理异常或为促成病症治疗的因素的疾病和其它病症。因此，TNF-α活性有益的病症为其中增加TNF-α活性预期会减轻病症的症状和/或进程的病症。可用本文公开的抗体治疗的病症的非限制性实例包括下文关于本文公开的抗体的药物组合物的章节中所论述的那些病症。
V.药物组合物
也提供包含本文公开的结合蛋白或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物。包含本文公开的结合蛋白的药物组合物可用于但不限于诊断、检测或监测病症，用于预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状，和/或用于研究。在一个特定实施方案中，组合物包含一种或多种本文公开的结合蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种本文公开的结合蛋白和除本文公开的结合蛋白以外的用于治疗TNF-α活性有害的病症的一种或多种防治剂或治疗剂。在一个特定实施方案中，防治剂或治疗剂已知适用于或已用于或当前正用于预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状。根据这些实施方案，组合物可进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。
本文公开的结合蛋白和结合蛋白部分可并入适于施用至受试者的药物组合物中。通常，药物组合物包含本文公开的结合蛋白或结合蛋白部分和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括以下一个或多个：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及其组合。在许多情况下，组合物中可包括等张剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包括少量增强结合蛋白或结合蛋白部分的存放期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
各种递送系统是已知的且可用于施用一种或多种本文公开的结合蛋白或一种或多种本文公开的结合蛋白与适用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状的防治剂或治疗剂的组合，例如囊封于脂质体、微粒、微胶囊中；能够表达结合蛋白或结合蛋白片段的重组细胞；受体介导的内饮作用(参见例如Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)；构建作为反转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。本文公开的施用防治剂或治疗剂的方法包括但不限于胃肠外施用(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、肿瘤内施用和粘膜施用(例如鼻内和经口途径)。另外，可采用肺部施药，例如通过使用吸入器或喷雾器且与雾化剂一起配制。在一个实施方案中，使用Alkermes肺部药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)施用本文公开的结合蛋白、本文公开的组合疗法或组合物。在一个特定实施方案中，肌肉内、静脉内、肿瘤内、经口、鼻内、肺部或皮下施用本文公开的防治剂或治疗剂。防治剂或治疗剂可通过任何适宜途径施用，例如通过输注或快速注射，通过经上皮或粘膜皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可与其它生物活性剂一起施用。施药可为全身性或局部施药。
在一个特定实施方案中，可能需要将本文公开的防治剂或治疗剂局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如但不限于局部输注、注射或借助于植入物来达成，所述植入物是多孔或无孔材料，包括膜和基质，如硅橡胶膜(sialastic membrane)、聚合物、纤维基质(例如)或胶原蛋白基质。在一个实施方案中，将有效量的一种或多种本文公开的结合蛋白拮抗剂局部施用至受试者的受影响区域以预防、治疗、管理和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，将有效量的一种或多种本文公开的结合蛋白与有效量的除本文公开的抗体以外的一种或多种疗法(例如一种或多种防治剂或治疗剂)组合来局部施用至受试者的受影响区域以预防、治疗、管理和/或改善病症或其一种或多种症状。
在本文公开的组合物是编码防治剂或治疗剂的核酸的一个特定实施方案中，所述核酸可通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分且施用它以使得它变成细胞内核酸来体内施用以促进它所编码的防治剂或治疗剂的表达，此举的实现是例如通过使用反转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic,DuPont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包覆，或通过将它与已知会进入核的同源盒样肽(homeobox-likepeptide)连接来施用(参见例如Joliot等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)。或者，可将核酸以细胞内方式引入且并入宿主细胞DNA内以便通过同源重组表达。
本文公开的方法可包括通过注射(例如通过快速注射或连续输注)施用被配制来用于胃肠外施用的组合物。注射用制剂可以添加有防腐剂的单位剂型(例如在安瓿中或多剂量容器中)提供。组合物可采用如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂的形式，且可含有配制剂，如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可呈使用前用适合媒介物(例如无菌无热原质水)复原的粉末形式。
本文公开的方法可另外包括施用配制成储槽式制剂的组合物。所述长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。因此，举例来说，组合物可用适合聚合或疏水性材料(例如配制成在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂来配制，或配制成微溶性衍生物(例如配制成微溶性盐)。
本文公开的方法涵盖施用配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；和与阳离子形成的盐，如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
一般来说，组合物的成分是单独或混合在一起以单位剂型(例如以干燥冻干粉末或无水浓缩物形式)提供于指示活性剂的量的密闭容器(如安瓿或药囊)中。当施药模式是输注时，组合物可用含有无菌医药级水或盐水的输注瓶分配。当施药模式是注射时，可提供含注射用无菌水或盐水的安瓿以便在施药前混合各成分。
具体来说，也提供将一种或多种本文公开的防治剂或治疗剂或药物组合物封装于指示药剂的量的密闭容器(如安瓿或药囊)中。在一个实施方案中，一种或多种本文公开的防治剂或治疗剂或药物组合物是以干燥灭菌冻干粉末或无水浓缩物形式提供于密闭容器中且可复原(例如用水或盐水)成适于施用至受试者的浓度。在一个实施方案中，一种或多种本文公开的防治剂或治疗剂或药物组合物是以至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg的单位剂量，以干燥无菌冻干粉末形式提供于密闭容器中。本文公开的冻干防治剂或治疗剂或药物组合物应在2℃与8℃之间储存于它的原始容器中，且本文公开的防治剂或治疗剂或药物组合物应在复原后1周内、5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在一个替代实施方案中，一种或多种本文公开的防治剂或治疗剂或药物组合物是以液体形式提供于指示药剂的量和浓度的密闭容器中。在一个实施方案中，液体形式的所施用组合物是以至少0.25mg/ml、至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml提供于密闭容器中。液体形式应在2℃与8℃之间储存于它的原始容器中。
本文公开的结合蛋白和结合蛋白部分可并入适于胃肠外施用的药物组合物中。在一个实施方案中，结合蛋白或结合蛋白部分将制成含有0.1-250mg/ml结合蛋白的可注射溶液。可注射溶液可主要由在火石或琥珀小瓶、安瓿或预填充注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲剂可为L-组氨酸(1-50mM)，最优5-10mM，在pH5.0至7.0(最优pH6.0)下。其它适合缓冲剂包括但不限于丁二酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可使用浓度是0-300mM(对于液体剂型，最优150mM)的氯化钠来改变溶液的毒性。对于冻干剂型，可包括低温保护剂，主要是0-10％蔗糖(最优0.5-1.0％)。其它适合低温保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型，可包括增积剂，主要是1-10％甘露糖醇(最优2-4％)。液体剂型与冻干剂型两者中均可使用稳定剂，主要是1-50mML-甲硫氨酸(最优5-10mM)。其它适合增积剂包括甘氨酸、精胺酸，可以0-0.05％聚山梨醇酯-80(最优0.005-0.01％)形式包括在内。其它表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
典型组合物是呈可注射溶液或可输注溶液形式，如类似于用于用其它抗体使人被动免疫的那些组合物的组合物。在制造和储存条件下，治疗组合物通常必须无菌且稳定。可将组合物配制成溶液、微乳剂、分散液、脂质体或适于较高药物浓度的其它有序结构。无菌可注射溶液可通过将活性化合物(即结合蛋白或结合蛋白部分)以所需量与以上列举的成分之一或其组合一起并入适当溶剂中，视需要随后过滤灭菌来制备。分散液一般是通过将活性化合物并入含有基础分散介质和来自以上所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和喷雾干燥，所述干燥会产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可通过将延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)包括于组合物中来实现可注射组合物的延长吸收。
如本领域技术人员所了解，施药途径和/或模式将视所需结果而变化。在某些实施方案中，活性化合物可与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊封递送系统。可使用生物可降解生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述制剂的许多方法已取得专利或一般为本领域技术人员所知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
补充性活性化合物也可并入组合物中。在某些实施方案中，本文公开的结合蛋白或结合蛋白部分是与一种或多种适用于治疗TNF-α活性有害的病症的其它治疗剂共同配制和/或共同施用。举例来说，本文公开的抗hTNF-α抗体或抗体部分可与一种或多种结合其它靶标的其它抗体(例如结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)一起共同配制和/或共同施用。此外，一种或多种本文公开的结合蛋白可与两种或更多种前述治疗剂组合使用。所述组合疗法宜利用较低剂量的所施用治疗剂，由此避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在某些实施方案中，针对TNF-α或其片段的结合蛋白与本领域中已知的半衰期延长媒介物连接。所述媒介物包括但不限于Fc域、聚乙二醇和聚葡萄糖。所述媒介物描述于例如美国申请号6,660,843中。
在一个特定实施方案中，施用包含编码本文公开的结合蛋白或本文公开的另一防治剂或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列以通过基因疗法治疗、预防、管理或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法是指通过向受试者施用已表达或可表达的核酸所进行的疗法。在本公开的这个实施方案中，核酸产生它们所编码的介导防治或治疗作用的本文公开的结合蛋白或防治剂或治疗剂。
可根据本公开使用本领域中可用的任何基因疗法方法。
TNF-α在与多种涉及免疫和发炎要素的疾病相关的病理学中起关键作用，所述疾病如自体免疫性疾病，特别是与发炎相关的那些自体免疫性疾病，包括克罗恩氏病、牛皮癣(包括斑块牛皮癣)、关节炎(包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎或青少年特发性关节炎)、多发性硬化症、全身性红斑狼疮和僵直性脊椎炎。因此，本文的结合蛋白可用于治疗这些病症。在另一个实施方案中，病症是呼吸道病症；哮喘；过敏性和非过敏性哮喘；由于感染所致的哮喘；由于感染呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)所致的哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及气管发炎的病状；嗜酸性粒细胞增多症；纤维化和过量粘液产生；囊肿性纤维化；肺纤维化；特异反应性病症；特异反应性皮炎；荨麻疹；湿疹；过敏性鼻炎；过敏性肠胃炎；发炎性和/或自体免疫性皮肤病状；发炎性和/或自体免疫性胃肠器官病状；发炎性肠病(IBD)；溃疡性结肠炎；发炎性和/或自体免疫性肝脏病状；肝硬化；肝纤维化；由乙型和/或丙型肝炎病毒造成的肝纤维化；硬皮病；肿瘤或癌症；肝细胞癌；成胶质细胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染；细菌感染；寄生虫感染；HTLV-1感染；1型保护性免疫反应的表达的抑制、在疫苗接种期间1型保护性免疫反应的表达的抑制、神经退化性疾病、神经元再生和脊髓损伤。
本领域技术人员应易于了解，本文公开的方法的其它适合修改和改适可在不脱离本发明或本文公开的实施方案的范围下使用适合等效物来进行。现已详细描述本公开，通过参考以下实施例将对其有更明确理解，所述实施例仅出于说明目的包括在内而不意图限制本发明。
实施例
实施例1：通过体外展示系统鉴定针对TNF的完全人抗体
1.1：抗体选择
通过体外展示技术，利用结合重组人TNF蛋白的能力自人抗体文库分离完全人抗人TNF单克隆抗体。由DNA测序测定可变重(VH)链和可变轻(VL)链的氨基酸序列且列于表10中。
表10.单个克隆序列
1.2：完全人抗人TNF抗体AE11-5的亲和力成熟
通过体外展示技术使针对人TNF的AE11-5人抗体亲和力成熟。构建一个轻链文库以在以下残基处含有受限突变诱发：28、31、32、51、55、91、92、93、95a和96(Kabat编号)。这个文库也含有框架生殖系回复突变D1E、M4L、H11Q、R49K、H76N和Q103K以及在位置50(R/K)和94(S/L)处的切换残基(toggled residue)以允许在文库选择期间进行框架生殖系化。制备两个重链文库以在CDRH1和CDRH2中的残基30、31、33、50、52和55至58(Kabat编号)处或在CDRH3中的残基95至100b处含有受限突变诱发。含有CDRH1和CDRH2多样性的文库也具有框架生殖系回复突变A18V和L64Q以及在54(L/F)和78(V/A)处的切换残基。CDRH3文库具有在100c(A/F)处的另一切换残基。
在降低浓度的生物素化人或食蟹猕猴TNF抗原存在下针对结合人或食蟹猕猴TNF的能力独立选择所有三个文库。将由文库选择回收的所有突变CDR序列重组成额外文库且所述重组文库经受更严格选择条件，随后鉴定单个抗体。
表11提供来源于AE11-5的亲和力成熟完全人TNF抗体的VH区的氨基酸序列清单。各VH序列的单个CDR的氨基酸残基以粗体指示。
表11.亲和力成熟AE11-5 VH变体的氨基酸序列清单
表12提供来源于AE11-5的亲和力成熟完全人TNF抗体的VL区的氨基酸序列清单。各VH序列的单个CDR的氨基酸残基以粗体指示。
表12.亲和力成熟AE11-5 VL变体的氨基酸序列清单
表13.在亲和力成熟AE11-5抗体中观察到的氨基酸残基
表14.来自转化的克隆的单个VH序列
表15.单个克隆VL序列
表16.转化成全长IgG的AE11-5亲和力成熟scFv克隆
1.3TNF酶联免疫吸附测定法方案(ELISA)和测定法结果
以下方案用于通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来表征TNF抗体与生物素化人或食蟹猕猴TNF的结合。将ELISA板用每孔50μl 2μg/ml山羊抗人IgG-Fc涂布，在4℃下过夜。用PBS/Tween将板洗涤3次。将在PBS/0.1％BSA中稀释至1μg/ml的50μl Mab添加至适当孔中且在室温(RT)下孵育1小时。用PBS/Tween将板洗涤3次。将50μl连续稀释的生物素-人TNF添加至适当孔中且在室温下孵育1小时。用PBS/Tween将板洗涤3次。将在PBS/0.1％BSA中1:10,000稀释的50μl抗生蛋白链菌素-HRP添加至适当孔中且在室温下孵育1小时。用PBS/Tween将板洗涤3次。将50μl TMB添加至适当孔中且使反应进行1分钟。用每孔50μl 2 N H2SO4终止反应且在450nm下读取吸光度。结果展示于表17中。
表17
1.4通过L929生物测定法测定TNF抗体的TNF中和效能
人TNF是在Abbott生物研究中心(Worcester,Massachusetts,US)制备且自Biologics Pharmacy接收。小鼠TNF是在Abbott生物研究中心制备且自Biologics Pharmacy接收。大鼠TNF是在Abbott生物研究中心制备且自Biologics Pharmacy接收。兔TNF是自R&DSystems购得。恒河猴/猕猴TNF(rhTNF)是自R&D Systems购得。放线菌素(Actinomycin)是自Sigma Aldrich购得且在10mg/mL的储备浓度下再混悬于DMSO中。
测定培养基：10％FBS(Hyclone#SH30070.03)，Gibco试剂：RPMI1640(#21870)、2mML-谷氨酰胺(#25030)、50单位/毫升青霉素/50μg/mL链霉素(#15140)、0.1mM MEM非必需氨基酸(#11140)和5.5X10-5M2-巯基乙醇(#21985-023)。
使L929细胞生长至半汇合密度且使用0.05％胰蛋白酶(Gibco#25300)收集。细胞用PBS洗涤，计数且在1E6个细胞/毫升下再混悬于含有4μg/mL放线菌素D的测定培养基中。将细胞在50μL的体积和5E4个细胞/孔下接种于96孔板(Costar#3599)中。各孔接收50μL测定培养基，从而使体积达到100μL。
如下制备试样。在测定培养基中将测试和对照IgG蛋白稀释至4x浓度且进行连续1:3稀释。在测定培养基中将TNF物质稀释至以下浓度：400pg/mL人TNF、200pg/mL鼠类TNF、600pg/mL大鼠TNF和100pg/mL兔TNF。以1:2稀释方案将抗体样本(200μL)添加至TNF(200μL)中且使其在室温下孵育0.5小时。
为测量这个测定法中的人TNF中和效能，将抗体/TNF溶液在100μL下添加至涂布的细胞以使得最终浓度是375nM-0.019nM。TNF的最终浓度如下：100pg/mL人TNF、50pg/mL鼠类TNF、150pg/mL大鼠TNF和25pg/mL兔TNF。将板在37℃、5％CO2下孵育20小时。为定量活力，自孔中移除100μL且添加10μL WST-1试剂(Roche目录号11644807001)。将板在测定条件下孵育3.5小时，在500xg下离心，且将75μL上清液转移至ELISA板(Costar目录号3369)。在Spectromax 190 ELISA板读取器上在OD 420-600nm下读取板。所选TNF/IL-17 DVD-Ig结合蛋白的中和效能展示于表18中。
表18
实施例2：人源化抗人TNF抗体hMAK-195的亲和力成熟
使小鼠抗人TNF抗体MAK-195人源化且亲和力成熟以产生一组人源化MAK195变体，其对食蟹猕猴TNF具有交叉反应性且针对人TNF与食蟹猕猴TNF两者均具有改进的亲和力和结合动力学。
为改进hMAK195对TNF的亲和力，自IgBLAST数据库中的其它人抗体序列鉴定也与生殖系VH3-53和IGKV1-39共有高一致性的高突变CDR残基。随后通过用在这些位置处具有低简并性的引物进行PCR使相应hMAK195 CDR残基经受受限突变诱发以产生三个呈scFv形式的抗体文库。第一文库在VH CDR1和VH CDR2中的残基31、32、33、35、50、52、53、54、56和58(Kabat编号)处含有突变；第二文库在VH CDR3中的残基95至100、100a、101和102处含有突变；并且第三文库在三个VL CDR中的残基28、30、31、32、50、53、92、93、94和95处含有突变。为进一步增加hMAK195与人生殖系框架序列的一致性，将VH位置60(D/A)、61(S/D)、62(T/S)、63(L/V)和65(S/G)处的二元简并性引入第一文库中。此外，将VL位置24(K/R)、33(V/L)、54(R/L)、55(H/Q)、56(T/S)、91(H/S)和96(F/Y)处的二元简并性引入第三文库中。
针对低浓度的生物素化TNF对这些hMAK195变体进行选择以改进缔合速率、解离速率或两者，且回收亲和力被调节的hMAK195的抗体蛋白序列以再转化回IgG来进一步表征。在降低浓度的生物素化人或食蟹猕猴TNF抗原存在下针对结合人或食蟹猕猴TNF的能力独立选择所有三个文库。将由文库选择回收的所有突变CDR序列重组成额外文库且所述重组文库经受更严格选择条件，随后鉴定单个抗体。
表19提供经受亲和力成熟选择方案的人源化MAK-195的VH和VL的氨基酸序列清单。各VH和VL序列的单个CDR的氨基酸残基以粗体指示。
表19.亲和力成熟hMAK195 VH变体的氨基酸序列清单
表20提供来源于hMAK195的亲和力成熟完全人TNF抗体的VL区的氨基酸序列清单。各VH序列的单个CDR的氨基酸残基以粗体指示。
表20.亲和力成熟hMAK195 VL变体的氨基酸序列清单
表21.在亲和力成熟hMAK-195中观察到的氨基酸残基。
以下各表提供转化成用于表征的IgG蛋白的人源化MAK-195抗体的清单。
表22.IgG转化的克隆的VH序列
表23.IgG转化的克隆的VL序列
表24.hMAK195亲和力成熟克隆的重链与轻链对
克隆名称 HC LC 蛋白质名称
A8 hMAK195-A8 hMAK195VL.1 hMAK195-AM11
B5 hMAK195-B5 hMAK195VL.1 hMAK195-AM13
rHC3 hMAK195rHC3 hMAK195VL.1 hMAK195-AM14
rHC18 hMAK195rHC18 hMAK195VL.1 hMAK195-AM15
rHC19 hMAK195rHC19 hMAK195VL.1 hMAK195-AM16
rHC22 hMAK195rHC22 hMAK195VL.1 hMAK195-AM17
rHC34 hMAK195rHC34 hMAK195VL.1 hMAK195-AM18
rHC60 hMAK195rHC60 hMAK195VL.1 hMAK195-AM19
S4-6 hMAK195S4-6 hMAK195S4-6 hMAK195-AM20
S4-12 hMAK195S4-12 hMAK195S4-12 hMAK195-AM21
S4-17 hMAK195S4-17 hMAK195S4-17 hMAK195-AM22
S4-18 hMAK195S4-18 hMAK195S4-18 hMAK195-AM23
S4-19 hMAK195S4-19 hMAK195S4-19 hMAK195-AM24
S4-24 hMAK195S4-24 hMAK195S4-24 hMAK195-AM25
S4-34 hMAK195S4-34 hMAK195S4-34 hMAK195-AM26
2.1TNF酶联免疫吸附测定法结果
表25
2.2通过L929生物测定法测定TNF抗体的TNF中和效能
表26
实施例3：人源化抗人TNF抗体hMAK-199的亲和力成熟
使小鼠抗人TNF抗体MAK-199人源化且亲和力成熟以产生一组人源化MAK195变体，其对人TNF与食蟹猕猴TNF两者均具有改进的亲和力和结合动力学。根据以下说明制备若干文库：
在首先引入V2I回复突变之后制备三个HC文库且证实它不影响scFv对TNF的亲和力。
H1+H2(DDK)文库：
-在7个残基处的受限突变诱发(T30、N31、N35、T52a、T54、E56、T58)
-生殖系切换：M34I和F63L
H1+H2(QKQ)文库：
-在7个残基处的受限突变诱发(T30、N31、N35、T52a、T54、E56、T58)
-生殖系切换：M34I和F63L
-生殖系回复突变：D61Q、D62K、K64Q、F67V、F69M、L71T
H3文库：
-在12个残基95-100、100a-100f处的受限突变诱发
-生殖系切换：F91Y
LC文库：文库
-在11个残基28、30-32、50、53、91-94、96处的受限突变诱发
-生殖系切换：T51A、Y71F、F87Y和T43A/V44P(这两者共同进展)
重组文库：
在至少3轮选择后使文库多样性降低之后，将在存在和不存在VL文库下重组VH文库。
在降低浓度的生物素化人或食蟹猕猴TNF抗原存在下针对结合人或食蟹猕猴TNF的能力独立选择所有四个文库。将由文库选择回收的所有突变CDR序列重组成额外文库且所述重组文库经受更严格选择条件，随后鉴定单个抗体。
表27提供经受亲和力成熟选择方案的hMAK-199抗体的VH的氨基酸序列清单。各VH序列的单个CDR的氨基酸残基以粗体指示。
表27.亲和力成熟hMAK199 VH变体的氨基酸序列清单
表28提供来源于hMAK199的亲和力成熟完全人TNF抗体的VL区的氨基酸序列清单。各VL序列的单个CDR的氨基酸残基以粗体指示。
表28.亲和力成熟hMAK199 VL变体的氨基酸序列清单
表29.在亲和力成熟hMAK-199抗体中观察到的氨基酸残基
表30.来自转化的克隆的单个hMAK-199 VH序列
表31.单个hMAK-199克隆VL序列
表32.转化成全长IgG的hMAK199亲和力成熟scFv克隆
3.1TNF酶联免疫吸附测定法结果
表33.hMAK199亲和力成熟全长IgG
IgG名称 hTNFa ELISA中的EC50(nM)
hMAK199-AM1 0.016
hMAK199-AM2 0.016
hMAK199-AM3 0.019
hMAK199-AM4 0.050
hMAK199-AM5 0.078
hMAK199-AM6 0.035
hMAK199-AM7 0.100
hMAK199-AM8 0.219
hMAK199-AM9 0.032
hMAK199-AM10 0.014
3.2通过L929生物测定法测定TNF抗体的TNF中和效能
表34
实施例4
实施例4.4：使用BIACORE技术进行亲和力测定
表35：用于Biacore分析的试剂
抗原 供货商命名 供货商 目录号
TNFα 重组人TNF-α/TNFSF1A R&D systems 210-TA
BIACORE方法：
BIACORE测定法(Biacore,Inc.Piscataway,NJ)用缔合速率常数和解离速率常数的动力学测量结果来测定结合蛋白的亲和力。在25℃下通过用1000或3000仪器(AB,Uppsala,Sweden)，使用操作HBS-EP(10mMHEPES[pH7.4]、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)进行基于表面等离子体共振的测量来测定结合蛋白与靶标抗原(例如纯化重组靶标抗原)的结合。所有化学品都自AB(Uppsala,Sweden)或另外自如本文中所述的不同来源获得。举例来说，根据制造商说明书和程序使用标准胺偶联试剂盒将于10mM乙酸钠(pH4.5)中稀释的约5000RU山羊抗小鼠IgG(Fcγ)片段特异性多克隆抗体(PierceBiotechnology Inc,Rockford,Ill.,US)在25μg/ml下跨越CM5研究级生物传感器芯片直接固定。用乙醇胺阻断生物传感器表面上未反应的部分。流槽2和4中的修饰的羧甲基聚葡萄糖表面用作反应表面。流槽1和3中不含山羊抗小鼠IgG的未修饰羧甲基聚葡萄糖用作参考表面。关于动力学分析，在使用Biaevaluation4.0.1软件下将由1:1朗缪尔结合模型(Langmuirbinding model)获得的速率方程式与所有八次注射的缔合和解离阶段同时拟合(使用整体拟合分析)。在HEPES缓冲盐水中稀释纯化抗体以跨越山羊抗小鼠IgG特异性反应表面进行捕集。在5μl/min的流动速率下将欲作为配体捕集的抗体(25μg/ml)注射于反应基质上。测定25μl/min的连续流动速率下的缔合速率常数kon(M-1s-1)和解离速率常数koff(s-1)。通过在范围是10-200nM的不同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后根据以下公式，由动力学速率常数计算抗体与靶标抗原之间反应的平衡解离常数(M)：KD＝koff/kon。随时间变化记录结合且计算动力学速率常数。在这个测定法中，可测量快达106M-1s-1的缔合速率和慢达10-6s-1的解离速率。
就此而言，预期本文的结合蛋白具有有利性质，包括高亲和力、缓慢解离速率和高中和能力。
实施例4.5：中和人TNF-α
使L929细胞生长至半汇合密度且使用0.25％胰蛋白酶(Gibco#25300)收集。细胞用PBS洗涤，计数且在1E6个细胞/毫升下再混悬于含有4μg/mL放线菌素D的测定培养基中。将细胞在100μL的体积和5E4个细胞/孔下接种于96孔板(Costar#3599)中。在测定培养基中稀释结合蛋白和对照IgG稀释至4X浓度且进行连续1:4稀释。在测定培养基中稀释人TNF-α至400pg/mL。以1:2稀释方案将结合蛋白样本(200μL)添加至人TNF-α(200μL)中且使其在室温下孵育0.5小时。
将结合蛋白/人TNF-α溶液在100μL下添加至涂布的细胞，以使得最终浓度是100pg/mL人TNF-α和150nM-0.0001nM结合蛋白。将板在37℃、5％CO2下孵育20小时。为定量活力，自孔移除100μL且添加10μL WST-1试剂(Roche目录号11644807001)。将板在测定条件下孵育3.5小时。在Spectromax 190 ELISA板读取器上在OD420-600nm下读取各板。
就此而言，预期本文的结合蛋白具有有利性质，包括高亲和力、缓慢解离速率和高中和能力。
实施例4.6：治疗
需要用TNF-α结合蛋白治疗的患者可能患有具有免疫和发炎要素的疾病，如自体免疫性疾病，特别是与发炎相关的那些自体免疫性疾病，包括克罗恩氏病、牛皮癣(包括斑块牛皮癣)、关节炎(包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎或青少年特发性关节炎)、多发性硬化症和僵直性脊椎炎。因此，本文的结合蛋白可用于治疗这些病症。
可通过皮下注射来施用TNF-α结合蛋白。如果患者患有类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或僵直性脊椎炎，那么所述患者可接受每隔一周40mg作为起始剂量且为达成治疗目的必要时可接受每周40mg。如果患者患有青少年特发性关节炎且体重是15kg至<30kg，那么所述患者可接受每隔一周20mg，且如果≥30kg，那么每隔一周40mg。如果患者患有克罗恩氏病，那么所述患者可接受160mg的初始剂量(一天中4次40mg注射，或每天两次40mg注射持续连续两天)，接着两周后80mg，且又过两周后开始每隔一周40mg的维持剂量。如果患者患有斑块牛皮癣，那么所述患者可接受80mg初始剂量，接着在初始剂量的一周后开始每隔一周40mg。
结合蛋白可提供于单次使用预填充笔(40mg/0.8mL)、单次使用预填充玻璃注射器(40mg/0.8mL或20mg/0.4mL)中。
以引用的方式并入
在整篇本申请中引用的所有引用参考资料(包括参考文献、专利、专利申请和网站)的内容据此以引用的方式明确整体并入本文，所述参考资料中引用的参考资料也是如此。除非另外指示，否则本文公开的实践将采用本领域中所众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
等同方案
可在不脱离本公开的精神或基本特征下以其它特定形式来实施本发明。因此，上述实施方案在所有方面都应视为具有说明性而非限制本文所述的本发明。因此，本发明的范围是由随附权利要求而非由上述描述所指示，且因此属于权利要求的等效性含义和范围内的所有变化都意图包括在本文中。

Claims (29)

1.一种包含至少一个重链可变区(VH区)的结合蛋白，所述重链可变区包含：
(a)三个来自以下的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077中的任何一个；或
(b)SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077中的任何一个。
2.一种包含至少一个轻链可变区(VL区)的结合蛋白，所述轻链可变区包含：
(a)三个来自以下的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076和1078中的任何一个；或
(b)SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076、1078中的任何一个。
3.一种包含至少一个重链可变区(VH区)和至少一个轻链可变区(VL区)的结合蛋白，其中所述VH区包含：
(a)三个来自以下的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077中的任何一个；或
(b)SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077中的任何一个；并且
所述VL区包含：
(c)三个来自以下的CDR：SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076和1078中的任何一个；或
(d)SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076、1078中的任何一个。
4.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两个VH区和两个VL区。
5.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一个VH区和至少一个VL区，所述至少一个VH区和所述至少一个VL区包含选自由以下组成的组的一组氨基酸序列：SEQ ID NO:22与23；24与25；26与27；28与29；30与31；和32与33。
6.如权利要求4所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白：
(a)调节TNF-α的生物功能；
(b)中和TNF-α；
(c)减弱TNF-α结合它的受体的能力；
(d)减弱前人TNF-α、成熟人TNF-α或截短人TNF-α结合它的受体的能力；和/或
(e)降低以下一个或多个：TNF依赖性细胞因子产生、TNF依赖性细胞杀伤、TNF依赖性发炎、TNF依赖性骨侵蚀和TNF依赖性软骨损伤。
7.如权利要求4所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有的缔合速率常数(Kon)为至少约102M-1s-1、至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M-1s-1、或至少约106M-1s-1，如通过表面等离子体共振所测量。
8.如权利要求4所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有的解离速率常数(Koff)为至多约10-3s-1、至多约10-4s-1、至多约10-5s-1、或至多约10-6s-1，如通过表面等离子体共振所测量。
9.如权利要求4所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有的解离常数(KD)为至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M、至多约10-12M、或至多10-13M。
10.一种能够结合人TNF-α的结合蛋白，所述结合蛋白包含：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的重链恒定区；
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的轻链恒定区；
(c)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(VH区)：SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075和1077；和
(d)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(VL区)：SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076和1078。
11.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合结合蛋白、单结构域结合蛋白、CDR移植结合蛋白、双功能抗体、人源化结合蛋白、多特异性结合蛋白、Fab、双重特异性结合蛋白、Fab’片段、双特异性结合蛋白、F(ab’)2片段、DVD-IgTM、包含由在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段、由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段、由抗体的单个臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)或单链结合蛋白。
12.如权利要求4所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白缀合于选自由以下组成的组的显影剂：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
13.如权利要求4所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白进一步包含选自由以下组成的组的治疗剂或细胞毒性剂：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素(anthracycline)、毒素、细胞凋亡剂以及至少一种用于治疗TNF-α活性有害的病症的其它治疗剂。
14.一种分离的核酸，所述核酸编码包含如权利要求3所述的氨基酸序列的结合蛋白。
15.一种载体，所述载体包含如权利要求14所述的分离的核酸。
16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求15所述的载体。
17.一种用于产生结合TNF-α的蛋白质的方法，所述方法包括在足以产生结合TNF-α的结合蛋白的条件下在培养基中培养如权利要求16所述的宿主细胞的步骤。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求3所述的结合蛋白和药学上可接受的载体。
19.一种用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的如权利要求18所述的药物组合物。
20.一种用于降低人TNF-α活性的方法，所述方法包括使人TNF-α与如权利要求3所述的结合蛋白接触以使人TNF-α活性得以降低。
21.一种用于降低罹患TNF-α活性有害的病症的人受试者体内的人TNF-α活性的方法，所述方法包括向所述人受试者施用如权利要求3所述的结合蛋白以使所述人受试者体内的人TNF-α活性得以降低和/或治疗得以达成。
22.一种用于治疗罹患TNF-α有害的病症的患者的方法，所述方法包括在向所述患者施用第二药剂之前、同时或之后向所述患者施用如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述第二药剂选自由以下组成的组：能够结合人IL-12的抗体或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；组胺；组胺受体阻断剂；缓激肽；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲氨蝶呤；皮质类固醇、糖皮质激素受体调节剂；环孢灵(cyclosporin)、雷帕霉素(rapamycin)、FK506和非类固醇消炎剂。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述病症是自体免疫性和/或发炎性病症。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述病症选自由以下组成的组：克罗恩氏病、牛皮癣、斑块牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎或青少年特发性关节炎、多发性硬化症和僵直性脊椎炎。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述病症选自由以下组成的组：呼吸道病症；哮喘；过敏性和非过敏性哮喘；由于感染所致的哮喘；由于感染呼吸道合胞病毒(RSV)所致的哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及气管发炎的病状；嗜酸性粒细胞增多症；纤维化和过量粘液产生；囊肿性纤维化；肺纤维化；特异反应性病症；特异反应性皮炎；荨麻疹；湿疹；过敏性鼻炎；过敏性肠胃炎；发炎性和/或自体免疫性皮肤病状；发炎性和/或自体免疫性胃肠器官病状；发炎性肠病(IBD)；溃疡性结肠炎；克罗恩氏病；发炎性和/或自体免疫性肝脏病状；肝硬化；肝纤维化；由乙型和/或丙型肝炎病毒引起的肝纤维化；硬皮病；肿瘤或癌症；肝细胞癌；成胶质细胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；病毒感染；细菌感染；寄生虫感染；HTLV-1感染；1型保护性免疫反应的表达的抑制以及在疫苗接种期间1型保护性免疫反应的表达的抑制。
26.一种用于通过免疫测定法测定试样中TNF-α或其片段的存在的方法，其中所述免疫测定法包括使所述试样与至少一种如权利要求3所述的结合蛋白或其片段以及至少一种可检测标记接触。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(i)使所述试样与所述至少一种结合蛋白或其片段接触，其中所述结合蛋白结合于所述TNF-α或其片段上的表位以形成第一复合物；
(ii)使所述复合物与所述至少一种可检测标记接触，其中所述可检测标记结合于所述第一复合物上或所述TNF-α或其片段上未由所述结合蛋白或其片段结合的表位以形成第二复合物；以及
(iii)基于由所述第二复合物中的所述可检测标记产生的信号来检测所述试样中所述TNF-α或其片段的存在，其中所述TNF-α或其片段的存在与由所述可检测标记产生的所述信号成正相关(directlycorrelated)。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(i)使所述试样与所述至少一种结合蛋白或其片段接触，其中所述结合蛋白或其片段结合于所述TNF-α或其片段上的表位以形成第一复合物；
(ii)使所述复合物与所述至少一种可检测标记接触，其中所述可检测标记与所述TNF-α或其片段竞争结合于所述结合蛋白或其片段以形成第二复合物；以及
(iii)基于由所述第二复合物中的所述可检测标记产生的信号来检测所述试样中所述TNF-α或其片段的存在，其中所述TNF-α或其片段的存在与由所述可检测标记产生的所述信号成反相关(indirectlycorrelated)。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述方法任选地进一步包括诊断、预测或评估所述患者的治疗性/防治性治疗的效率。
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