TW201326207A - 抗ｔｎｆ免疫結合物 - Google Patents

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Tariq Ghayur
Lorenzo Benatuil
Yuliya Kutskova
John Memmott
Jennifer Perez
Suju Zhong
Carrie Goodreau
Anca Clabbers
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Abstract

本發明揭示結合於腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，例如人類TNF-α之經分離結合蛋白(例如抗體或其抗原結合部分)，及基於相關抗體之組合物及分子。亦揭示包含該等抗體之醫藥組合物，以及關於使用該等抗體之治療及診斷方法。

Description

抗TNF免疫結合物
本發明提供TNF-α結合蛋白及其在預防及/或治療急性及慢性免疫疾病中的用途。
[相關申請案之交互參照]
本申請案主張2011年10月24日申請之美國臨時申請案第61/550,587號的優先權，該臨時申請案係以全文引用的方式併入本文中。
此項技術中需要能夠結合TNF-α(亦稱作腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子-α、TNF及惡病質素)之改良結合蛋白。提供能夠以高親和力結合TNF-α且中和TNF-α之新穎結合蛋白家族、CDR移植結合蛋白、人類化結合蛋白及其片段。
提供結合TNF-α之TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分。在一實施例中，抗原結合域包含選自以下任一者的VH區：SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075及1077，或來自其之一個、兩個或三個CDR。在另一實施例中，抗原結合域包含選自以下任一者的VL區：SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076及1078，或來自其之一個、兩個或三個CDR。在一特定實施例中，抗原結合域包 含VH區及VL區，例如其中該VH區包含SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075及1077，或來自其之一個、兩個或三個CDR，且該VL區包含SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076及1078，或來自其之一個、兩個或三個CDR。
在一實施例中，結合蛋白結合TNF-α。在另一實施例中，結合蛋白調節TNF-α之生物功能。在另一實施例中，結合蛋白中和TNF-α。在另一實施例中，結合蛋白降低TNF-α結合其受體之能力，例如結合蛋白降低原人類TNF-α、成熟人類TNF-α或截短人類TNF-α結合其受體之能力。在另一實施例中，結合蛋白降低一或多種TNF-α生物活性，其選自：TNF依賴性細胞激素產生；TNF依賴性細胞殺死；TNF依賴性發炎；TNF依賴性骨侵蝕；及TNF依賴性軟骨損傷。
在一實施例中，結合蛋白具有選自以下之結合速率常數(Kon)：至少約102 M-1s-1；至少約103 M-1s-1；至少約104 M-1s-1；至少約105 M-1s-1；及至少約106 M-1s-1；如藉由表面電漿子共振所量測。在另一實施例中，結合蛋白具有選自以下之脫離速率常數(Koff)：至多約10-3 s-1；至多約10-4 s-1；至多約10-5 s-1；及至多約10-6 s-1，如藉由表面電漿子共振所量測。在另一實施例中，結合蛋白具有選自以下之解離常數(KD)：至多約10-7 M；至多約10-8 M；至多約10-9 M；至 多約10-10 M；至多約10-11 M；至多約10-12 M；及至多10-13 M。
在另一態樣中，提供一種治療哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之本文揭示之醫藥組合物。在另一實施例中，提供一種降低人類TNF-α活性之方法，該方法包含：使人類TNF-α與本文揭示之結合蛋白接觸以便降低人類TNF-α活性。在另一實施例中，提供一種在罹患TNF-α活性有害之病症的人類個體中降低人類TNF-α活性的方法，該方法包含向該人類個體投與本文揭示之結合蛋白以便降低該人類個體中之人類TNF-α活性。在另一實施例中，提供一種用於治療個體之TNF-α活性有害之疾病或病症的方法，該方法包含向該個體投與本文揭示之結合蛋白以便達成治療。
在一個實施例中，該方法治療涉及免疫及發炎要素之疾病，諸如自體免疫疾病，尤其彼等與發炎相關之自體免疫疾病，包括克羅恩氏病(Crohn's disease)、牛皮癬(包括斑塊牛皮癬)、關節炎(包括類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨關節炎或青少年特發性關節炎)、多發性硬化症及僵直性脊椎炎。因此，本文之結合蛋白可用於治療此等病症。
提供結合TNF-α之TNF-α結合蛋白或其抗原結合部分、其醫藥組合物、以及用於製備該等結合蛋白及片段之核酸、重組表現載體及宿主細胞。亦提供使用本文揭示之結合 蛋白偵測人類TNF-α、在活體外或活體內抑制人類TNF-α、及調控基因表現或TNF-α相關功能的方法。
除非本文另外定義，否則關於本發明所用之科技術語具有一般技術者通常所瞭解之含義。術語之含義及範疇應為清晰的，然而，若存在任何隱含歧義，則本文中所提供之定義優先於任何字典或外來定義。此外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」的使用意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及其他形式之術語(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)的使用不具限制性。此外，除非另外明確陳述，否則諸如「要素」或「組分」之術語涵蓋構成一個單元之要素及組分以及構成一個以上次單元之要素及組分。
一般而言，關於本文所述之細胞及組織培養、病理學、腫瘤學、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交所用之命名以及本文所述之細胞及組織培養、病理學、腫瘤學、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交之技術為此項技術中熟知且常用之彼等命名及技術。除非另外指出，否則本發明之方法及技術一般根據此項技術中所熟知且如在本說明書中所引用並論述之各個一般參考文獻及更特定之參考文獻中所述的習知方法來進行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y. (1989))。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書，如此項技術中通常所實現或如本文所述來進行。關於本文所述之分析化學、合成有機化學及醫藥化學所用之命名以及本文所述之分析化學、合成有機化學及醫藥化學之實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等命名、實驗室程序及技術。對化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞、以及患者治療使用標準技術。
術語「人類TNF-α」(本文中縮寫為hTNF-α)包括三聚體細胞激素蛋白。該術語包括包含三個17.5 kD TNF-α蛋白之均三聚體蛋白質。該均三聚體蛋白質稱作「TNF-α蛋白」。術語人類「TNF-α」意欲包括重組人類TNF-α(rhTNF-α)，其可藉由標準重組表現方法製備。人類TNF-α之序列展示於表1中。
術語「抗體」泛指包含四條多肽鏈(兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)之任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原結合部分，或其保留Ig分子之必需抗原決定基結合特徵的任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。該等突變體、變異體或衍生物抗體形式為此項技術中已知的。
在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域：CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域：CL。VH及VL區可進一步細分成散置有稱為構架區(FR)之較保守區域的高變區，稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL由三個CDR及四個FR組成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
術語結合蛋白之「抗原結合部分」或「抗原結合區」(或簡稱為「結合蛋白部分」)係指保留與抗原(例如hTNF-α)特異性結合之能力之結合蛋白的一或多個片段。結合蛋白之抗原結合功能可由全長結合蛋白之片段執行。該等結合蛋白實施例亦可具有雙特異性、雙重特異性或多特異性形式；特異性結合於兩種或兩種以上不同抗原。涵蓋於術語結合蛋白之「抗原結合部分」內之結合片段的實例包括：(i)Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，其為包含由在鉸鏈區之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)包含單一可變域之dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546；Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 A1)； 及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)由獨立基因編碼，但其可使用重組方法由合成連接子接合，該連接子能夠使其製成其中VL及VH區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。該等單鏈結合蛋白亦意欲涵蓋於術語結合蛋白之「抗原結合部分」內。亦涵蓋其他形式之單鏈結合蛋白，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價、雙特異性結合蛋白，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上，但使用過短而不允許同一鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，藉此迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。
術語「結合蛋白」係指包含一或多個視情況連接於連接子多肽或恆定域之本文揭示之抗原結合部分的多肽。連接子多肽包含兩個或兩個以上由肽鍵接合之胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分。該等連接子多肽為此項技術中所熟知(參見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。恆定域係指重鏈或輕鏈恆定域。人類IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列為此項技術中已知且呈現於表2中。
結合蛋白或其抗原結合部分可為藉由結合蛋白或結合蛋白部分與一或多種其他蛋白質或肽共價或非共價締合而形成之較大免疫黏著分子的一部分。該等免疫黏著分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區來產生四聚scFv分子(Kipriyanov等人，(1995)Hum.Antibod.Hybridomas 6：93- 101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C端聚組胺酸標籤來產生二價且經生物素標記之scFv分子(Kipriyanov等人，(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。可使用習知技術自完整抗體製備諸如Fab及F(ab')2片段之抗體部分，諸如分別對完整抗體進行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，可使用如本文所述之標準重組DNA技術獲得結合蛋白、結合蛋白部分及免疫黏著分子。
「經分離結合蛋白」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他結合蛋白的結合蛋白或其抗原結合部分(例如，特異性結合hTNF-α之經分離結合蛋白實質上不含特異性結合非hTNF-α之抗原的結合蛋白)。然而，特異性結合hTNF-α之經分離結合蛋白可對其他抗原(諸如來自其他物種之TNF-α分子)具有交叉反應性。此外，經分離結合蛋白可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「人類結合蛋白」包括具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的結合蛋白或其抗原結合部分。本文揭示之人類結合蛋白可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或位點特異性突變誘發或由活體內體細胞突變引入之突變)，例如在CDR中且詳言之在CDR3中。然而，術語「人類結合蛋白」不欲包括來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上之結合蛋白。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。此項技術中公認之此等術語係指對於 抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中相較於其他胺基酸殘基更加可變(亦即高變)之胺基酸殘基進行編號的系統(Kabat等人，(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-391；及Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242)。亦參見Martin,「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」,Kontermann及Dübel編，Antibody Engineering(Springer-Verlag,Berlin,2001)，第31章，尤其第432-433頁。對於重鏈可變區，高變區之範圍為CDR1之胺基酸位置31至35、CDR2之胺基酸位置50至65，及CDR3之胺基酸位置95至106。對於輕鏈可變區，高變區之範圍為CDR1之胺基酸位置24至34、CDR2之胺基酸位置50至56，及CDR3之胺基酸位置89至97。
術語「CDR」係指抗體可變序列內之互補決定區。在重鏈及輕鏈之各可變區中存在三個CDR，對於各可變區指定為CDR1、CDR2及CDR3。術語「CDR組」係指出現於能夠結合抗原之單一可變區中之三個CDR之群組。已根據不同系統來不同地定義此等CDR之精確邊界。Kabat所述之系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及(1991))不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確殘基編號系統，而且提供界定三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia及 Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；及Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883)發現，Kabat CDR內之某些子部分儘管在胺基酸序列層面上具有極大差異，但採用幾乎相同之肽骨架構形。此等子部分指定為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區域可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由Padlan(1995)FASEB J.9：133-139及MacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5)：732-745)描述。其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述系統之一，但仍然與Kabat CDR重疊，惟鑒於特定殘基或殘基群組或甚至整個CDR不會顯著影響抗原結合之預測或實驗發現而可將其縮短或延長。儘管特定實施例使用Kabat或Chothia定義之CDR，但本文所用之方法可利用根據任何此等系統定義之CDR。
此項技術中已知人類重鏈及輕鏈接受體序列。在本發明之一個實施例中，人類重鏈及輕鏈接受體序列係選自由V-base(hvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或IMGT®(國際ImMunoGeneTics資訊系統®)(himgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/)所列出之序列。在本發明之另一實施例中，人類重鏈及輕鏈接受體序列係分別選自表3及表4中所述之序列。
術語「多價結合蛋白」在本說明書中用於表示包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。多價結合蛋白可經工程改造以具有三個或三個以上抗原結合位點，且一般不為天然產生之抗體。術語「多特異性結合蛋白」係指能夠結合兩種或兩種以上相關或無關標靶之結合蛋白。如本文所用之雙重可變域(DVD)結合蛋白或免疫球蛋白(DVD-Ig) 為包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白且為四價或多價結合蛋白。該等DVD結合蛋白可為單特異性，亦即能夠結合一種抗原；或為多特異性，亦即能夠結合兩種或兩種以上抗原。包含兩個重鏈DVD-Ig多肽及兩個輕鏈DVD-Ig多肽之DVD結合蛋白稱作DVD-Ig。DVD-Ig之每一半包含一個重鏈DVD-Ig多肽及一個輕鏈DVD-Ig多肽，以及兩個抗原結合位點。各結合位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域，每個抗原結合位點總共有6個CDR涉及於抗原結合中。DVD結合蛋白及製備DVD結合蛋白之方法揭示於美國專利第7,612,181號中。
本發明之一個態樣係關於包含能夠結合TNF-α之結合蛋白的DVD結合蛋白。在一特定實施例中，DVD結合蛋白能夠結合TNF-α及第二標靶。
術語「中和性」係指當結合蛋白特異性結合細胞激素時抵消該細胞激素之生物活性。在一特定實施例中，中和性結合蛋白與hTNF-α之結合導致hTNF-α之生物活性得到抑制，例如，中和性結合蛋白結合hTNF-α且使hTNF-α之生物活性降低至少約20%、40%、60%、80%、85%或85%以上。中和性結合蛋白對hTNF-α生物活性之抑制可藉由量測此項技術中所熟知的hTNF-α生物活性之一或多個指標來評估。舉例而言，中和L929細胞上TNF-α之細胞毒性。
在另一實施例中，術語「促效劑」或「促效性」係指當結合蛋白特異性結合TNF-α(例如hTNF-α)時，TNF-α之生物活性增加。在一特定實施例中，促效性結合蛋白與TNF-α 之結合導致TNF-α之生物活性增加。在一特定實施例中，促效性結合蛋白結合TNF-α且使TNF-α之生物活性增加至少約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%及100%。促效性結合蛋白對TNF-α生物活性之抑制可藉由量測此項技術中所熟知的TNF-α生物活性之一或多個指標來評估。
術語「活性」包括結合蛋白對抗原之諸如結合特異性/親和力之活性，例如，結合於TNF-α抗原之hTNF-α結合蛋白及/或結合蛋白之中和效能(或促效效能)，例如，hTNF-α結合蛋白與hTNF-α之結合抑制hTNF-α之生物活性，例如中和L929細胞上TNF-α之細胞毒性。
術語「表面電漿子共振」係指藉由使用例如BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden及Piscataway,NJ)偵測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化來分析即時生物特異性相互作用的光學現象。
術語「Kon」係指如在此項技術中已知之結合蛋白(例如抗體)與抗原締合以形成例如抗體/抗原複合物之結合速率常數。「Kon」亦稱為術語「締合速率常數」或「ka」，其在本文中可互換使用。此值指示抗體與其標靶抗原之結合速率或抗體與抗原之間之複合物形成速率，亦由以下方程式所示：抗體(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab-Ag。
術語「Koff」係指如在此項技術中已知之結合蛋白(例如抗體)自例如抗體/抗原複合物解離之脫離速率常數或「解 離速率常數」。此值指示抗體自其標靶抗原解離或Ab-Ag複合物隨時間分離為游離抗體及抗原之解離速率，如由以下方程式所示：Ab+Ag ← Ab-Ag。
術語「KD」係指「平衡解離常數」且係指在滴定量測中在平衡狀態下獲得之值，或藉由將解離速率常數(Koff)除以締合速率常數(Kon)而獲得之值。締合速率常數、解離速率常數及平衡解離常數用於表示抗體對抗原之結合親和力。測定締合及解離速率常數之方法為此項技術中所熟知。使用基於螢光之技術提供高靈敏度及檢查在生理緩衝液中處在平衡狀態下之樣本的能力。可使用其他實驗性方法及儀器，諸如BIAcore®(生物分子相互作用分析)分析法(例如可獲自BIAcore International AB,GE Healthcare公司(Uppsala,Sweden)之儀器)。另外，亦可使用KinExA®分析法(動態排除分析法(Kinetic Exclusion Assay))，其可獲自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)。
I.結合人類TNF-α之結合蛋白
本發明之一個態樣提供以高親和力、緩慢脫離速率及高中和能力結合TNF-α之經分離完全人類抗人類TNF結合蛋白，諸如單株抗體或其抗原結合部分。本發明之第二態樣提供以高親和力、緩慢脫離速率及高中和能力結合TNF-α之親和力成熟完全人類抗TNF結合蛋白，諸如單株抗體或其抗原結合部分。
A.製備TNF-α結合蛋白之方法
本文揭示之結合蛋白可由此項技術中已知之多種技術中的任一者製備。
1.使用轉殖基因動物產生抗TNF-α單株抗體
在本發明之另一實施例中，藉由用TNF-α抗原使包含一些或全部人類免疫球蛋白基因座之非人類動物免疫而產生結合蛋白。在一特定實施例中，非人類動物為XENOMOUSE轉殖基因小鼠，其為包含人類免疫球蛋白基因座之較大片段且小鼠抗體產生缺乏之經工程改造小鼠品系。參見例如Green等人，(1994)Nature Genet.7：13-21；及美國專利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598及6,130,364。亦參見PCT公開案WO 91/10741(1991年7月25日公開)；WO 94/02602(1994年2月3日公開)；WO 96/34096及WO 96/33735(均為1996年10月31日公開)；WO 98/16654(1998年4月23日公開)；WO 98/24893(1998年6月11日公開)；WO 98/50433(1998年11月12日公開)；WO 99/45031(1999年9月10日公開)；WO 99/53049(1999年10月21日公開)；WO 00/09560(2000年2月24日公開)；及WO 00/37504(2000年6月29日公開)。XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類抗體之擬似成人人類譜系，且生成抗原特異性人類單株抗體。XENOMOUSE轉殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及x輕鏈基因座之百萬鹼基(megabase)大小的生殖系組態YAC片段而含有約80%之人類抗體譜系。參見Mendez等人，(1997)Nature Genet.15：146-156； Green及Jakobovits(1998)J.Exp.Med.188：483-495。
2.使用重組抗體文庫產生抗TNF-α單株抗體
活體外方法亦可用於製備本文揭示之結合蛋白，其中抗體文庫經篩選以鑑別具有所要結合特異性之抗體。該重組抗體文庫之篩選方法在此項技術中為熟知的且包括例如以下文獻中所述之方法：美國專利第5,223,409號；PCT公開案WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；及WO 97/29131；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9：1369-1372；Hay等人，(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等人，(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554；Griffiths等人，(1993)EMBO J.12：725-734；Hawkins等人，(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Clackson等人，(1991)Nature 352：624-628；Gram等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580；Garrard等人，(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)Nucl.Acid Res.19：4133-4137；及Barbas等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982；及美國專利公開案第2003.0186374號。
重組抗體文庫可來自經TNF-α或TNF-α之一部分免疫之個體。或者，重組抗體文庫可來自未經處理之個體，亦即未經TNF-α免疫之個體，諸如來自未經人類TNF-α免疫之人類個體的人類抗體文庫。藉由用包含人類TNF-α之肽篩 選重組抗體文庫以藉此選擇識別TNF-α之彼等抗體來選擇本文揭示之抗體。進行該篩選及選擇之方法在此項技術中為熟知的，諸如前一段落之參考文獻中所述。為選擇對hTNF-α具有特定結合親和力之本文揭示之抗體，諸如以特定Koff速率常數自人類TNF-α解離之抗體，可使用此項技術中已知之表面電漿子共振方法來選擇具有所要Koff速率常數之抗體。為選擇對hTNF-α具有特定中和活性之本文揭示之抗體，諸如具有特定IC50之抗體，可使用此項技術中已知用於評估對hTNF-α活性之抑制的標準方法。
在一個態樣中，提供結合TNF-α(例如人類TNF-α)之經分離結合蛋白或其抗原結合部分。在一特定實施例中，結合蛋白為中和性結合蛋白。在多個實施例中，結合蛋白為重組結合蛋白或單株抗體。
舉例而言，亦可使用此項技術中已知之各種噬菌體呈現方法來生成本文揭示之結合蛋白。在噬菌體呈現方法中，使功能抗體域呈現於帶有編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上。詳言之，可利用該噬菌體呈現自譜系或組合抗體文庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合域。可利用抗原，例如使用經標記抗原或者結合或捕捉於固體表面或珠粒之抗原來選擇或鑑別表現結合相關抗原之抗原結合域的噬菌體。此等方法中所用之噬菌體典型地為絲狀噬菌體，其包括自Fab、Fv或二硫鍵穩定之Fv抗體域與噬菌體基因III或基因VIII蛋白質重組融合之噬菌體表現的fd及M13結合域。可用於製備本文揭示之結合蛋白之噬菌體呈 現方法的實例可見於此項技術中。
如以上參考文獻中所述，在噬菌體選擇之後，可自噬菌體分離結合蛋白編碼區且將其用於生成包括人類結合蛋白或任何其他所要抗原結合片段之完整結合蛋白，且於任何所要宿主(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌)中表現，例如如以下所詳述。舉例而言，亦可使用此項技術中已知之方法來利用以重組方式產生Fab、Fab'及F(ab')2片段之技術，諸如以下文獻中所揭示者：PCT公開案WO 92/22324；Mullinax等人，(1992)BioTechniques 12(6)：864-869；及Sawai等人，(1995)Am.J.Reprod.Immunol.34：26-34；及Better等人，(1998)Science 240：1041-1043。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術的實例包括美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Huston等人，(1991)Methods Enzymol.203：46-88；Shu等人，(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：7995-7999；及Skerra等人，(1998)Science 240：1038-1041中所述之技術。
作為藉由噬菌體呈現來篩選重組抗體文庫之替代方法，此項技術中已知用於篩選較大組合文庫之其他方法可應用於鑑別本文揭示之雙重特異性結合蛋白。如PCT公開案第WO 98/31700號以及Roberts及Szostak(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中所述，一類替代表現系統為重組抗體文庫表現為RNA-蛋白質融合體之表現系統。在此系統中，藉由在活體外轉譯於3'末端處帶有嘌呤 黴素、肽基接受體抗生素之合成mRNA而在mRNA與其編碼之肽或蛋白質之間形成共價融合體。因此，可基於所編碼之肽或蛋白質(例如抗體或其部分)之特性(諸如抗體或其部分與雙重特異性抗原之結合)，自mRNA之複雜混合物(例如組合文庫)增濃特異性mRNA。可由如上所述之重組方式(例如在哺乳動物宿主細胞中)表現自篩選該等文庫所回收之編碼抗體或其部分之核酸序列，且另外可藉由對向最初選擇之序列中引入突變之mRNA-肽融合體進行更多輪篩選或藉由如上所述之用於重組抗體之活體外親和力成熟之其他方法來進行進一步親和力成熟。
在另一方法中，本文揭示之結合蛋白亦可使用此項技術中已知之酵母呈現方法生成。在酵母呈現方法中，使用遺傳方法將抗體域繫栓(tether)至酵母細胞壁且使其呈現於酵母表面上。詳言之，可利用該酵母呈現自譜系或組合抗體文庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合域。可用於製備本文揭示之結合蛋白之酵母呈現方法的實例包括Wittrup等人，美國專利第6,699,658號及Frenken等人，美國專利第6,114,147號中所揭示之方法。
B.重組TNF-α結合蛋白的產生
本文揭示之結合蛋白可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者而產生。舉例而言，自宿主細胞表現，其中藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。各種形式之術語「轉染」意欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿 孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。儘管有可能在原核或真核宿主細胞中表現本文揭示之結合蛋白，但因為真核細胞(且詳言之哺乳動物細胞)比原核細胞更可能組裝且分泌經適當摺疊且具免疫活性之結合蛋白，所以計畫於該等真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中表現該等結合蛋白。
用於表現本文揭示之重組結合蛋白之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中所述之dhfr-CHO細胞，其與DHFR可選擇標記物一起使用，如例如Kaufman及Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所述)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼結合蛋白基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞持續足以允許結合蛋白在宿主細胞中表現或詳言之允許抗體分泌至宿主細胞藉以生長之培養基中之時段來產生結合蛋白。可使用標準蛋白質純化方法自培養基中回收抗體。
宿主細胞亦可用於產生功能結合蛋白片段，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解，上述程序之變更處於本發明之範疇內。舉例而言，可能需要用編碼本文揭示之結合蛋白之輕鏈及/或重鏈之功能片段的DNA轉染宿主細胞。亦可使用重組DNA技術移除一些或全部編碼並非結合相關抗原所必需之輕鏈及重鏈中之一或兩者的DNA。本文揭示之結合蛋白亦涵蓋自該等截短DNA分子表現之分子。另外，可藉 由利用標準化學交聯方法使本文揭示之結合蛋白與第二結合蛋白交聯而產生雙功能結合蛋白，其中一個重鏈及一個輕鏈為本文揭示之結合蛋白且另一重鏈及另一輕鏈對非相關抗原之抗原具特異性。
在重組表現本文揭示之結合蛋白或其抗原結合部分之例示性系統中，藉由磷酸鈣介導之轉染法將編碼重鏈與輕鏈之重組表現載體引入dhfr- CHO細胞中。在重組表現載體內，使重鏈及輕鏈基因各自可操作地連接至CMV強化子/AdMLP啟動子調控元件，以驅動基因高度轉錄。重組表現載體亦帶有DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤(methotrexate)選擇/擴增法來選擇已經過載體轉染之CHO細胞。培養所選轉型體宿主細胞，以允許表現重鏈及輕鏈，且自培養基中回收完整結合蛋白。使用標準分子生物學技術製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉型體，培養宿主細胞且自培養基中回收結合蛋白。另外，提供藉由在適合之培養基中培養本文揭示之宿主細胞直至合成本文揭示之重組結合蛋白來合成本文揭示之重組結合蛋白的方法。該方法可進一步包含自培養基中分離重組結合蛋白。
II. hTNF-α結合蛋白
A.個別純系序列
表5提供抗TNF結合蛋白之VH及VL序列，包括來自各VH及VL序列之CDR。
B. IgG轉化純系
表6提供如在實例2中詳細論述之IgG轉化純系之VH序列。
表7提供如在實例2中詳細論述之IgG轉化純系的VL序列。
C.來自轉化純系之個別hMAK-199序列
表8提供如在實例3中詳細論述之hMAK-199轉化純系之VH序列。
表9提供如在實例3中詳細論述之hMAK-199轉化純系之VH序列。
在一實施例中，抗原結合域包含選自以下任一者的VH 區：SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075及1077，或來自其之一個、兩個或三個CDR。在另一實施例中，抗原結合域包含選自以下任一者的VL區：SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076及1078，或來自其之一個、兩個或三個CDR。在一特定實施例中，抗原結合域包含VH區及VL區，例如其中該VH區包含SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075及1077，或來自其之一個、兩個或三個CDR，且該VL區包含SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076及1078，或來自其之一個、兩個或三個CDR。
在VH及/或VL CDR序列係如上文提供之一實施例中，人類接受體構架包含至少一個選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：6-21。在一特定實施例中，人類接受體構架包含選自以下之胺基酸序列：SEQ IN NO：9、10、11、12、15、16、17及21。在另一實施例中，人類接受體構架包含至少一個構架區胺基酸取代，其中該構架之胺基酸序列與人類接受體構架之序列具至少65%一致性且包含至少70個與人類接受體構架一致的胺基酸殘基。在另一實施例中，人類 接受體構架在關鍵殘基處包含至少一個構架區胺基酸取代。該關鍵殘基選自：鄰接CDR之殘基；糖基化位點殘基；稀有殘基；能夠與人類TNF-α相互作用之殘基；能夠與CDR相互作用之殘基；典型殘基；重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基；維尼爾區(Vernier zone)內之殘基；及Chothia定義之可變重鏈CDR1與Kabat定義之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基。在一實施例中，關鍵殘基係選自：H1、H12、H24、H27、H29、H37、H48、H49、H67、H71、H73、H76、H78、L13、L43、L58、L70及L80。在一實施例中，VH突變係選自：Q1E、I12V、A24V、G27F、I29L、V29F、F29L、I37V、I48L、V48L、S49G、V67L、F67L、V71K、R71K、T73N、N76S、L78I及F78I。在另一實施例中，VL突變係選自：V13L、A43S、I58V、E70D及S80P。在一實施例中，結合蛋白包含兩個可變域，其中該兩個可變域具有選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：22與23；23與24；24與25；26與27；28與29；30與31；或32與33。
III.結合蛋白及產生結合蛋白之細胞株的產生
在一實施例中，本文揭示之TNF-α結合蛋白展現降低或中和TNF-α活性之高能力，例如，如由此項技術中已知之若干活體外及活體內分析法中之任一者所評估。或者，本文揭示之TNF-α結合蛋白亦展現增加或促效TNF-α活性之高能力。
在特定實施例中，經分離之結合蛋白或其抗原結合部分 結合人類TNF-α，其中該結合蛋白或其抗原結合部分以約0.1 s-1或0.1 s-1以下、諸如1×10-2 s-1或1×10-2 s-1以下、1×10-3 s-1或1×10-3 s-1以下、1×10-4 s-1或1×10-4 s-1以下、1×10-5 s-1或1×10-5 s-1以下及1×10-6 s-1或1×10-6 s-1以下之koff速率常數(如藉由表面電漿子共振所測定)自人類TNF-α解離；或以約1×10-6 M或1×10-6 M以下、諸如1×10-7 M或1×10-7 M以下、1×10-8 M或1×10-8 M以下、1×10-9 M或1×10-9 M以下、1×10-10 M或1×10-10 M以下及1×10-11 M或1×10-11 M以下之IC50抑制人類TNF-α活性。在某些實施例中，結合蛋白包含重鏈恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一實施例中，重鏈恆定區為IgG1重鏈恆定區或IgG4重鏈恆定區。此外，結合蛋白可包含輕鏈恆定區(κ輕鏈恆定區或λ輕鏈恆定區)。在另一實施例中，結合蛋白包含κ輕鏈恆定區。或者，結合蛋白部分可為例如Fab片段或單鏈Fv片段。
置換Fc部分中之胺基酸殘基以改變結合蛋白效應功能在此項技術中為已知的(參見美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。結合蛋白之Fc部分介導若干重要的效應功能，例如細胞激素誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。視治療目標而定，此等效應功能在一些情況下為治療性抗體所需，但在其他情況下可能不必要或甚至有害。某些人類IgG同型、尤其IgG1及IgG3經由分別與FcγR及補體C1q結合而介導ADCC及CDC。新生兒Fc受體(FcRn)為決 定抗體之循環半衰期之關鍵組分。在另一實施例中，置換結合蛋白之恆定區(例如結合蛋白之Fc區)中之至少一個胺基酸殘基，以使結合蛋白之效應功能改變。
一個實施例提供一種經標記之結合蛋白，其中本文揭示之抗體或抗體部分經衍生處理或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白質)。舉例而言，本文揭示之經標記之結合蛋白可藉由使本文揭示之抗體或抗體部分(藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式)與一或多個其他分子實體功能性連接來進行衍生處理，該一或多個分子實體為諸如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可介導抗體或抗體部分與另一分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)締合之蛋白質或肽。
可適用於對本文揭示之抗體或抗體部分進行衍生處理之可偵測劑包括螢光化合物。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素(phycoerythrin)及其類似物。亦可用可偵測酶(諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶及其類似物)對抗體進行衍生處理。當用可偵測酶對抗體進行衍生處理時，其係藉由添加該酶用來產生可偵測反應產物之其他試劑來偵測。舉例而言，當存在可偵測劑辣根過氧化酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺產生有色反應產物，其為可偵測的。亦可用生物素對抗體進行衍生處理，且經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合來偵測。
本發明之另一實施例提供一種結晶化結合蛋白。在一實施例中，提供如本文所揭示之完整TNF-α結合蛋白及其片段之晶體，以及包含該等晶體之調配物及組合物。在一個實施例中，結晶化結合蛋白具有與該結合蛋白之可溶性對應物相比較長之活體內半衰期。在另一實施例中，結合蛋白在結晶後保留生物活性。
本文揭示之結晶化結合蛋白可根據此項技術中已知且如PCT公開案第WO 02/72636號中所揭示之方法製備。
本發明之另一實施例提供一種糖基化結合蛋白，其中結合蛋白或其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。初期活體內蛋白質產生可經歷稱為轉譯後修飾之進一步處理。詳言之，可以酶促方式添加糖(糖基)殘基，一種稱為糖基化之方法。帶有共價連接之寡醣側鏈之所得蛋白質稱為糖基化蛋白或醣蛋白。蛋白質糖基化視相關蛋白質之胺基酸序列以及表現蛋白質之宿主細胞而定。不同有機體可產生不同糖基化酶(例如糖基轉移酶及糖苷酶)，且具有不同可用受質(核苷酸糖)。歸因於該等因素，蛋白質糖基化模式及糖基殘基之組成可視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用於本發明中之糖基殘基可包括(但不限於)葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙醯葡糖胺及唾液酸。在一實施例中，糖基化結合蛋白包含使糖基化模式為人類模式之糖基殘基。
熟習此項技術者已知不同蛋白質糖基化可產生不同蛋白質特徵。舉例而言，在微生物宿主(諸如酵母)中產生且利 用酵母內源性路徑進行糖基化之治療性蛋白質的功效與在哺乳動物細胞(諸如CHO細胞株)中表現之相同蛋白質相比可降低。該等醣蛋白亦可在人類中具有免疫原性且在投與之後展示縮短之活體內半衰期。人類及其他動物中之特異性受體可識別特異性糖基殘基且促進蛋白質自血流快速清除。其他不良作用可包括蛋白質摺疊、溶解度、對蛋白酶之敏感度、運輸、轉運、區室化、分泌、由其他蛋白質或因子識別、抗原性或過敏原性之變化。因此，從業者可能偏好具有特定糖基化組成及模式之治療性蛋白質，例如與在人類細胞中或在預定個體動物之物種特異性細胞中所產生者相同或至少類似的糖基化組成及模式。
表現與宿主細胞之糖基化蛋白不同之糖基化蛋白可藉由對宿主細胞進行遺傳修飾以表現異源糖基化酶來達成。使用此項技術中已知之技術，從業者可生成展現人類蛋白質糖基化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，已對酵母菌株進行遺傳修飾以表現非天然產生之糖基化酶，使得在此等酵母菌株中產生之糖基化蛋白(醣蛋白)展現與動物細胞、尤其人類細胞相同之蛋白質糖基化(美國專利第7,449,308號及第7,029,872號)。
此外，熟習此項技術者應瞭解，可使用經遺傳工程改造以表現各種糖基化酶之宿主細胞文庫來表現相關蛋白質，使得該文庫之成員宿主細胞產生具有變異型糖基化模式之相關蛋白質。從業者可隨後選擇及分離具有特定新穎糖基化模式之相關蛋白質。在一實施例中，具有經特定選擇之 新穎糖基化模式之蛋白質展現改良或改變之生物特性。
IV. TNF-α結合蛋白之用途
考慮到例如本文揭示之人類TNF-α結合蛋白或其部分結合人類TNF-α之能力，其可用於使用習知免疫分析法(諸如酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)或組織免疫組織化學)來偵測TNF-α(例如在諸如血清或血漿之生物樣本中)。提供偵測生物樣本中之TNF-α的方法，其包含使生物樣本與本文揭示之結合蛋白或結合蛋白部分接觸且偵測與TNF-α結合之結合蛋白(或結合蛋白部分)或未經結合之結合蛋白(或結合蛋白部分)，藉此偵測該生物樣本中之TNF-α。結合蛋白直接或間接經可偵測物質標記以有助於偵測經結合或未經結合之抗體。適合之可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質及放射性物質。適合之酶的實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合之輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合之螢光物質之實例包括傘酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括魯米諾(luminol)；且適合之放射性物質之實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
替代標記結合蛋白，可藉由利用經可偵測物質標記之rhTNF-α標準物及未經標記之人類TNF-α結合蛋白的競爭免疫分析法來分析生物流體中之人類TNF-α。在此分析法 中，將生物樣本、經標記之rhTNF-α標準物及人類TNF-α結合蛋白組合且測定與未經標記之結合蛋白結合的經標記rhTNF-α標準物的量。生物樣本中人類TNF-α之量與結合於TNF-α結合蛋白之經標記rhTNF-α標準物的量成反比。類似地，亦可藉由利用經可偵測物質標記之rhTNF-α標準物及未經標記之人類TNF-α結合蛋白的競爭免疫分析法來分析生物流體中之人類TNF-α。
在一實施例中，本文揭示之結合蛋白及結合蛋白部分能夠在活體外及在活體內中和TNF-α活性(例如人類TNF-α活性)。在另一實施例中，本文揭示之結合蛋白及結合蛋白部分能夠增加或促效人類TNF-α活性(例如人類TNF-α活性)。因此，本文揭示之該等結合蛋白及結合蛋白部分可用於例如在含有hTNF-α之細胞培養物中、在人類個體中或在具有TNF-α與本文揭示之結合蛋白交叉反應之其他哺乳動物個體中抑制或增加hTNF-α活性。在一個實施例中，提供抑制或增加hTNF-α活性之方法，其包含使hTNF-α與本文揭示之結合蛋白或結合蛋白部分接觸以使hTNF-α活性得以抑制或增加。舉例而言，在含有或疑似含有hTNF-α之細胞培養物中，可將本文揭示之結合蛋白或結合蛋白部分添加至培養基中以抑制或增加培養物中之hTNF-α活性。
在另一實施例中，提供降低或增加個體(宜來自罹患TNF-α活性有害或者有益之疾病或病症之個體)中hTNF-α活性的方法。提供降低或增加罹患該疾病或病症之個體中之TNF-α活性的方法，該方法包含向該個體投與本文揭示 之結合蛋白或結合蛋白部分以使個體中之TNF-α活性得以降低或增加。在一特定實施例中，TNF-α為人類TNF-α且個體為人類個體。或者，個體可為表現所提供結合蛋白能夠結合之TNF-α的哺乳動物。此外，個體可為已引入TNF-α之哺乳動物(例如，藉由投與TNF-α或藉由表現TNF-α轉殖基因)。本文揭示之結合蛋白可投與至人類個體以用於治療目的。此外，本文揭示之結合蛋白可投與至表現該結合蛋白所能夠結合之TNF-α的非人類哺乳動物以用於獸醫目的或用作人類疾病之動物模型。關於後者，該等動物模型可用於評估本文揭示之結合蛋白之治療功效(例如，測試投藥劑量及時程)。
術語「TNF-α活性有害的病症」包括罹患病症之個體中之TNF-α活性的存在已展示或疑似造成病症之病理生理異常或為促成病症惡化之因素的疾病及其他病症。因此，TNF-α活性有害的病症為其中降低TNF-α活性預期會減輕病症之症狀及/或進程的病症。該等病症可例如藉由罹患病症之個體之生物流體中的TNF-α濃度增加(例如個體之血清、血漿、滑液等中之TNF-α濃度增加)證實，其可例如使用如上所述之抗TNF-α抗體來偵測。可用本文揭示之結合蛋白治療之病症的非限制性實例包括下文關於本文揭示之抗體之醫藥組合物的章節中所論述的彼等病症。
或者，術語「TNF-α活性有益的病症」包括罹患病症之個體中之TNF-α活性的存在已展示或疑似有益於治療病症之病理生理異常或為促成病症治療之因素的疾病及其他病 症。因此，TNF-α活性有益的病症為其中增加TNF-α活性預期會減輕病症之症狀及/或進程的病症。可用本文揭示之抗體治療之病症的非限制性實例包括下文關於本文揭示之抗體之醫藥組合物的章節中所論述的彼等病症。
V.醫藥組合物
亦提供包含本文揭示之結合蛋白或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。包含本文揭示之結合蛋白的醫藥組合物係用於(但不限於)診斷、偵測或監測病症，用於預防、治療、管理或改善病症或其一或多種症狀，及/或用於研究。在一特定實施例中，組合物包含一或多種本文揭示之結合蛋白。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種本文揭示之結合蛋白及除本文揭示之結合蛋白以外用於治療TNF-α活性有害之病症的一或多種預防劑或治療劑。在一特定實施例中，預防劑或治療劑已知適用於或已用於或當前正用於預防、治療、管理或改善病症或其一或多種症狀。根據此等實施例，組合物可進一步包含載劑、稀釋劑或賦形劑。
本文揭示之結合蛋白及結合蛋白部分可併入適於投與至個體之醫藥組合物中。典型地，醫藥組合物包含本文揭示之結合蛋白或結合蛋白部分及醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。醫藥學上可接受之載劑的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇 及其類似物中之一或多者，以及其組合。在許多情況下，組合物中可包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含微量的增強結合蛋白或結合蛋白部分之存放期或有效性之輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑。
各種傳遞系統為已知的且可用於投與一或多種本文揭示之結合蛋白或一或多種本文揭示之結合蛋白與適用於預防、管理、治療或改善病症或其一或多種症狀之預防劑或治療劑的組合，例如囊封於脂質體、微粒、微膠囊中；能夠表現結合蛋白或結合蛋白片段之重組細胞；受體介導之內飲作用(參見例如Wu及Wu(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)；作為反轉錄病毒或其他載體之一部分來構築核酸等。投與本文揭示之預防劑或治療劑之方法包括(但不限於)非經腸投與(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投與、瘤內投與及黏膜投與(例如鼻內及經口途徑)。另外，可採用肺部投藥，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及用霧化劑調配。在一個實施例中，使用Alkermes AIR®肺部藥物傳遞技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)投與本文揭示之結合蛋白、本文揭示之組合療法或組合物。在一特定實施例中，經肌肉內、靜脈內、瘤內、經口、鼻內、肺部或皮下投與本文揭示之預防劑或治療劑。預防劑或治療劑可由任何適宜途徑投與，例如藉由輸注或快速注射，藉由經上皮或黏膜皮膚襯層(例 如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部投藥。
在一特定實施例中，可能需要將本文揭示之預防劑或治療劑局部投與至有治療需要之區域；此可藉由例如(但不限於)局部輸注、注射或藉助於植入物來達成，該植入物為多孔或無孔材料，包括膜及基質，諸如賽萊膜(sialastic membrane)、聚合物、纖維基質(例如Tissuel®)或膠原蛋白基質。在一個實施例中，將有效量之一或多種本文揭示之結合蛋白拮抗劑局部投與至個體之受侵襲區域以預防、治療、管理及/或改善病症或其症狀。在另一實施例中，將有效量之一或多種本文揭示之結合蛋白以及有效量之除本文揭示之抗體以外的一或多種療法(例如一或多種預防劑或治療劑)局部投與至個體之受侵襲區域以預防、治療、管理及/或改善病症或其一或多種症狀。
在一特定實施例中，其中本文揭示之組合物為編碼預防劑或治療劑之核酸，該核酸可藉由將其構築為適當核酸表現載體之一部分且投與其以使得其變成細胞內核酸而活體內投與以促進其所編碼之預防劑或治療劑的表現，此舉之實現係例如藉由使用反轉錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)，或藉由直接注射，或藉由使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic,DuPont)，或以脂質或細胞表面受體或轉染劑包覆，或藉由將其與已知進入細胞核之同源盒樣肽(homeobox-like peptide)連接而投與(參見例如Joliot等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)。或 者，可將核酸以細胞內方式引入且併入宿主細胞DNA內以便藉由同源重組表現。
本文揭示之方法可包含藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)投與經調配用於非經腸投與之組合物。注射用調配物可呈添加有防腐劑之單位劑型(例如於安瓿中或多劑量容器中)。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性成分可呈使用前用適合之媒劑(例如無菌無熱原質水)復原之粉末形式。
本文揭示之方法可另外包含投與調配成儲槽式製劑之組合物。該等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射而投與。因此，舉例而言，可用適合之聚合材料或疏水性材料(例如以於可接受之油中之乳液形式)或離子交換樹脂、或以微溶性衍生物形式(例如以微溶性鹽形式)來調配組合物。
本文揭示之方法涵蓋投與調配成中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等之鹽。
一般而言，組合物之成分各別或混合在一起以單位劑型(例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式)於指示活性劑之量的密閉容器(諸如安瓿或藥囊)中提供。當投藥模式為輸 注時，組合物可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶分配。當投藥模式為注射時，可提供注射用無菌水或鹽水之安瓿以便可在投藥前混合各成分。
詳言之，亦提供將一或多種本文揭示之預防劑或治療劑或醫藥組合物封裝於指示藥劑之量的密閉容器(諸如安瓿或藥囊)中。在一個實施例中，一或多種本文揭示之預防劑或治療劑或醫藥組合物係以乾燥滅菌凍乾粉末或無水濃縮物形式提供於密閉容器中且可復原(例如用水或鹽水)至適於投與至個體之濃度。在一實施例中，一或多種本文揭示之預防劑或治療劑或醫藥組合物以至少5 mg、至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg或至少100 mg之單位劑量，以乾燥無菌凍乾粉末形式提供於密閉容器中。本文揭示之凍乾預防劑或治療劑或醫藥組合物應在2℃與8℃之間儲存於其原始容器中，且本文揭示之預防劑或治療劑或醫藥組合物應在復原後1週內、5天內、72小時內、48小時內、24小時內、12小時內、6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一替代實施例中，一或多種本文揭示之預防劑或治療劑或醫藥組合物係以液體形式提供於指示藥劑之量及濃度的密閉容器中。在一實施例中，液體形式之所投與組合物係以至少0.25 mg/ml、至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml提供於密閉容器中。液體形 式應在2℃與8℃之間儲存於其原始容器中。
本文揭示之結合蛋白及結合蛋白部分可併入適於非經腸投與之醫藥組合物中。在一實施例中，將結合蛋白或結合蛋白部分製成含有0.1-250 mg/ml結合蛋白之可注射溶液。該可注射溶液可由於硬質或琥珀小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型組成。緩衝劑可為L-組胺酸(1-50 mM)，最佳5-10 mM，pH值為5.0至7.0(最佳pH值為6.0)。其他適合之緩衝劑包括(但不限於)丁二酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可使用濃度為0-300 mM(對於液體劑型，最佳為150 mM)之氯化鈉來改變溶液之毒性。對於凍乾劑型，可包括低溫保護劑，主要為0-10%蔗糖(最佳0.5-1.0%)。其他適合之低溫保護劑包括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型，可包括增積劑，主要為1-10%甘露糖醇(最佳2-4%)。液體劑型與凍乾劑型中均可使用穩定劑，主要為1-50 mM L-甲硫胺酸(最佳5-10 mM)。其他適合之增積劑包括甘胺酸、精胺酸，可以0-0.05%聚山梨醇酯-80(最佳0.005-0.01%)形式包括在內。其他界面活性劑包括(但不限於)聚山梨醇酯20及BRIJ界面活性劑。
典型的組合物呈可注射溶液或可輸注溶液形式，諸如類似於用於以其他抗體使人類被動免疫者之組合物。治療組合物典型地必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。可將組合物調配成溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於較高藥物濃度之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將活性化合物(亦即結合蛋白或結合蛋白部分)以所需量與上文列舉 之成分之一或其組合一起併入適當溶劑中，視需要繼之以過濾滅菌來製備。分散液一般係藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及上文所列舉之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌凍乾粉末的情況下，製備方法包括真空乾燥及噴霧乾燥，其得到活性成分加上來自先前經無菌過濾溶液之任何其他所要成分的粉末。可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由將延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)包括於可注射組合物中來實現組合物之延長吸收。
如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或模式視所要結果而變化。在某些實施例中，活性化合物可與保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。許多製備該等調配物之方法已取得專利或一般為熟習此項技術者所知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
補充活性化合物亦可併入組合物中。在某些實施例中，本文揭示之結合蛋白或結合蛋白部分係與一或多種適用於治療TNF-α活性有害之病症的其他治療劑共同調配及/或共同投與。舉例而言，本文揭示之抗hTNF-α抗體或抗體部分 可與一或多種結合其他標靶之其他抗體(例如結合其他細胞激素或結合細胞表面分子之抗體)一起共同調配及/或共同投與。此外，一或多種本文揭示之結合蛋白可與兩種或兩種以上前述治療劑組合使用。該等組合療法宜利用較低劑量之所投與治療劑，由此避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。
在某些實施例中，TNF-α之結合蛋白或其片段係與此項技術中已知之延長半衰期媒劑連接。該等媒劑包括(但不限於)Fc域、聚乙二醇及聚葡萄糖。該等媒劑描述於例如美國專利第6,660,843號中。
在一特定實施例中，係投與包含編碼本文揭示之結合蛋白或本文揭示之另一預防劑或治療劑之核苷酸序列的核酸序列，以藉由基因療法治療、預防、管理或改善病症或其一或多種症狀。基因療法係指藉由向個體投與已表現或可表現之核酸而進行之療法。在本發明之此實施例中，核酸產生其所編碼之介導預防或治療作用的本文揭示之結合蛋白或預防劑或治療劑。
根據本發明可使用此項技術中可利用之任何基因療法方法。
TNF-α在與多種涉及免疫及發炎要素之疾病相關之病理學方面扮演關鍵作用，該等疾病為諸如自體免疫疾病，尤其彼等與發炎相關之自體免疫疾病，包括克羅恩氏病、牛皮癬(包括斑塊牛皮癬)、關節炎(包括類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨關節炎或青少年特發性關節炎)、多發 性硬化症、全身性紅斑狼瘡及僵直性脊椎炎。因此，本文之結合蛋白可用於治療此等病症。在另一實施例中，病症為呼吸道病症；哮喘；過敏性及非過敏性哮喘；由於感染所致之哮喘；由於感染呼吸道融合性病毒(respiratory syncytial virus，RSV)所致之哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣管發炎之病狀；嗜伊紅血球增多症；纖維化及過量黏液產生；囊腫性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；發炎性及/或自體免疫皮膚病狀；發炎性及/或自體免疫胃腸器官病狀；發炎性腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；發炎性及/或自體免疫肝臟病狀；肝硬化；肝纖維化；由B型及/或C型肝炎病毒造成之肝纖維化；硬皮病；腫瘤或癌症；肝細胞癌；神經膠母細胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染；細菌感染；寄生蟲感染；HTLV-1感染；1型保護性免疫反應之表現的抑止、在疫苗接種期間1型保護性免疫反應之表現的抑止、神經退化性疾病、神經元再生及脊髓損傷。
熟習此項技術者應易於瞭解，可在不悖離本發明或本文揭示之實施例之範疇的情況下使用適合之等效形式來進行本文揭示之方法的其他適合修改及調適。現已詳細描述本發明，藉由參考以下實例將對其有更清楚的理解，該等實例僅出於說明之目的包括在內而不欲限制本發明。
實例 實例1：藉由活體外呈現系統鑑別TNF之完全人類抗體 1.1：抗體選擇
藉由活體外呈現技術利用結合重組人類TNF蛋白之能力自人類抗體文庫分離完全人類抗人類TNF單株抗體。根據DNA定序測定可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之胺基酸序列且列於表10中。
1.2：完全人類抗人類TNF抗體AE11-5之親和力成熟
藉由活體外呈現技術使人類TNF之AE11-5人類抗體親和力成熟。一個輕鏈文庫經構築以在以下殘基28、31、32、51、55、91、92、93、95a及96(Kabat編號)處含有受限突 變誘發。此文庫亦含有構架生殖系回復突變D1E、M4L、H11Q、R49K、H76N及Q103K以及在位置50(R/K)及94(S/L)處之轉態殘基(toggled residue)以允許在文庫選擇期間進行構架生殖系化。製得兩個重鏈文庫以在CDRH1及CDRH2中之殘基30、31、33、50、52及55至58(Kabat編號)處或在CDRH3中之殘基95至100b處含有受限突變誘發。含有CDRH1及CDRH2多樣性之文庫亦具有構架生殖系回復突變A18V及L64Q以及在54(L/F)及78(V/A)處之轉態殘基。CDRH3文庫具有在100c(A/F)處之另一轉態殘基。
在降低濃度的經生物素標記之人類或食蟹獼猴TNF抗原之存在下針對結合人類或食蟹獼猴TNF之能力獨立地選擇所有三個文庫。將所有自文庫選擇回收之突變CDR序列重組成額外文庫且該等重組文庫經受更嚴格選擇條件，隨後鑑別個別抗體。
表11提供來源於AE11-5之親和力成熟完全人類TNF抗體之VH區的胺基酸序列清單。各VH序列之個別CDR之胺基酸殘基以粗體指示。
表12提供來源於AE11-5之親和力成熟完全人類TNF抗體之VL區的胺基酸序列清單。各VH序列之個別CDR之胺基酸殘基以粗體指示。
1.3 TNF酶聯免疫吸附分析法方案(ELISA)及分析法結果
使用以下方案藉由酶聯免疫吸附分析法(ELISA)來表徵TNF抗體與經生物素標記之人類或食蟹獼猴TNF之結合。將ELISA盤每孔塗以50 μl的2 μg/ml山羊抗人類IgG-Fc，在4℃下隔夜。用PBS/Tween將盤洗滌3次。將用PBS/0.1% BSA稀釋至1 μg/ml之50 μl Mab添加至適當孔中且在室溫(RT)下培育1小時。用PBS/Tween將盤洗滌3次。將50 μl經連續稀釋的生物素-人類TNF添加至適當孔中且在室溫下培育1小時。用PBS/Tween將盤洗滌3次。將用PBS/0.1% BSA以1：10,000稀釋的50 μl抗生蛋白鏈菌素-HRP添加至適當孔中且在室溫下培育1小時。用PBS/Tween將盤洗滌3次。將50 μl TMB添加至適當孔中且使反應進行1分鐘。用每孔50 μl 2 N H2SO4終止反應且讀取450 nm下之吸光度。結果展示於表17中。
1.4藉由L929生物分析法測定TNF抗體之TNF中和效能
人類TNF係在Abbott生物研究中心(Worcester,Massachusetts,US)製備且自Biologics Pharmacy得到。小鼠TNF係在Abbott生物研究中心製備且自Biologics Pharmacy得到。大鼠TNF係在Abbott生物研究中心製備且自Biologics Pharmacy得到。兔TNF係自R&D Systems購得。恆河猴/獼猴TNF(rhTNF)係自R&D Systems購得。放線菌素(Actinomycin)係自Sigma Aldrich購得且以10 mg/mL之儲備濃度再懸浮於DMSO中。
分析培養基：10% FBS(Hyclone#SH30070.03)，Gibco試劑：RPMI 1640(#21870)、2 mM L-麩醯胺酸(#25030)、50單位/毫升青黴素/50 μg/mL鏈黴素(#15140)、0.1 mM MEM非必需胺基酸(#11140)及5.5×10-5 M 2-巰基乙醇(#21985-023)。
使L929細胞生長至半匯合密度且使用0.05%胰蛋白酶(Gibco#25300)收集。細胞以PBS洗滌，計數且以1E6個細胞/毫升再懸浮於含有4 μg/mL放線菌素D之分析培養基中。將細胞以50 μL之體積及5E4個細胞/孔接種於96孔盤(Costar#3599)中。各孔接收50 μL分析培養基，使體積達到100 μL。
如下製備試樣。用分析培養基將測試及對照IgG蛋白稀釋至4x濃度且進行連續1：3稀釋。用分析培養基將TNF物質稀釋至以下濃度：400 pg/mL人類TNF、200 pg/mL鼠類TNF、600 pg/mL大鼠TNF及100 pg/mL兔TNF。以1：2稀釋 方案將抗體樣本(200 μL)添加至TNF(200 μL)中且使其在室溫下培育0.5小時。
為量測此分析法中之人類TNF中和效能，將抗體/TNF溶液以100 μL添加至經塗之細胞以使得最終濃度為375 nM-0.019 nM。TNF之最終濃度如下：100 pg/mL人類TNF、50 pg/mL鼠類TNF、150 pg/mL大鼠TNF及25 pg/mL兔TNF。盤在37℃、5% CO2下培育20小時。為定量存活率，自孔中移出100 μL且添加10 μL WST-1試劑(Roche目錄號11644807001)。盤在分析條件下培育3.5小時，以500×g離心，且將75 μL上清液轉移至ELISA盤(Costar目錄號3369)。利用Spectromax 190 ELISA盤讀取器在OD 420-600 nm下讀取盤。所選TNF/IL-17 DVD-Ig結合蛋白之中和效能展示於表18中。
實例2：人類化抗人類TNF抗體hMAK-195之親和力成熟
使小鼠抗人類TNF抗體MAK-195人類化且親和力成熟以 生成一組人類化MAK195變異體，其對食蟹獼猴TNF具有交叉反應性且針對人類TNF與食蟹獼猴TNF具有改良之親和力及結合動力學。
為改良hMAK 195對TNF之親和力，自IgBLAST資料庫中之其他人類抗體序列鑑別亦與生殖系VH3-53及IGKV1-39共有高一致性的超突變CDR殘基。隨後藉由PCR利用在此等位置處具有低簡併性之引子使相應hMAK195 CDR殘基進行受限突變誘發以產生三種呈scFv形式之抗體文庫。第一文庫在VH CDR1及VH CDR2中之殘基31、32、33、35、50、52、53、54、56及58(Kabat編號)處含有突變；第二文庫在VH CDR3中之殘基95至100、100a、101及102處含有突變；且第三文庫在三個VL CDR中之殘基28、30、31、32、50、53、92、93、94及95處含有突變。為進一步增加hMAK195與人類生殖系構架序列之一致性，將VH位置60(D/A)、61(S/D)、62(T/S)、63(L/V)及65(S/G)處之二元簡併引入第一文庫中。此外，將VL位置24(K/R)、33(V/L)、54(R/L)、55(H/Q)、56(T/S)、91(H/S)及96(F/Y)處之二元簡併引入第三文庫中。
針對低濃度的經生物素標記之TNF對此等hMAK195變異體進行選擇以改良結合速率、脫離速率或兩者，且回收親和力經調節之hMAK195的抗體蛋白序列以再轉化成IgG以用於進一步表徵。在降低濃度的經生物素標記之人類或食蟹獼猴TNF抗原之存在下針對結合人類或食蟹獼猴TNF之能力獨立地選擇所有三個文庫。將所有自文庫選擇回收之 突變CDR序列重組成額外文庫且該等重組文庫經受更嚴格選擇條件，隨後鑑別個別抗體。
表19提供經受親和力成熟選擇方案之人類化MAK-195的VH及VL之胺基酸序列清單。各VH及VL序列之個別CDR之胺基酸殘基以粗體指示。
表20提供來源於hMAK195之親和力成熟完全人類TNF抗體之VL區的胺基酸序列清單。各VH序列之個別CDR之胺基酸殘基以粗體指示。
以下各表提供經轉化成用於表徵之IgG蛋白之人類化MAK-195抗體的清單。
2.1 TNF酶聯免疫吸附分析法結果
2.2 藉由L929生物分析法測定TNF抗體之TNF中和效能
實例3：人類化抗人類TNF抗體hMAK-199之親和力成熟
使小鼠抗人類TNF抗體MAK-199人類化且親和力成熟以生成一組人類化MAK195變異體，其對人類TNF與食蟹獼猴TNF具有改良之親和力及結合動力學。根據以下說明製 備若干文庫：在首先引入V2I回復突變之後製備三個HC文庫且證實其不影響scFv對TNF之親和力。
H1+H2(DDK)文庫：
- 在7個殘基處之受限突變誘發(T30、N31、N35、T52a、T54、E56、T58)
- 生殖系雙態觸發：M34I及F63L
H1+H2(QKQ)文庫：
- 在7個殘基處之受限突變誘發(T30、N31、N35、T52a、T54、E56、T58)
- 生殖系雙態觸發：M34I及F63L
- 生殖系回復突變：D61Q、D62K、K64Q、F67V、F69M、L71T
H3文庫：
- 在12個殘基95-100、100a-100f處之受限突變誘發
- 生殖系雙態觸發：F91Y
LC文庫：文庫
- 在11個殘基28、30-32、50、53、91-94、96處之受限突變誘發
- 生殖系雙態觸發：T51A、Y71F、F87Y及T43A/V44P(此兩者共同發展)
重組文庫： 在經過至少3輪選擇後使文庫多樣性降低之後，將在存在及不存在VL文庫之情況下重組VH文庫。
在降低濃度的經生物素標記之人類或食蟹獼猴TNF抗原之存在下針對結合人類或食蟹獼猴TNF之能力獨立地選擇所有四個文庫。將所有自文庫選擇回收之突變CDR序列重組成額外文庫且該等重組文庫經受更嚴格選擇條件，隨後鑑別個別抗體。
表27提供經受親和力成熟選擇方案之hMAK-199抗體之VH的胺基酸序列清單。各VH序列之個別CDR之胺基酸殘基以粗體指示。
表28提供來源於hMAK199之親和力成熟完全人類TNF抗體之VL區的胺基酸序列清單。各VL序列之個別CDR之胺基酸殘基以粗體指示。
3.1 TNF酶聯免疫吸附分析法結果
3.2藉由L929生物分析法測定TNF抗體之TNF中和效能
實例4 實例4.4：使用BIACORE技術進行親和力測定
BIACORE方法：
BIACORE分析法(Biacore,Inc.Piscataway,NJ)藉由結合速率常數及脫離速率常數之動力學量測來測定結合蛋白之親和力。在25℃下藉由利用Biacore® 1000或3000儀器(Biacore® AB,Uppsala,Sweden)使用操作性(running)HBS-EP(10 mM HEPES[pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)進行基於表面電漿子共振的量測來測定結合蛋白與標靶抗原(例如經純化重組標靶抗原)之結合。所有化學品均獲自Biacore® AB(Uppsala, Sweden)或如本文中所述之其他不同來源。舉例而言，使用標準胺偶合套組根據製造商之說明書及程序將用10 mM乙酸鈉(pH 4.5)稀釋的約5000 RU山羊抗小鼠IgG(Fcγ)片段特異性多株抗體(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,Il1.,US)以25 μg/ml直接固定於CM5研究級生物感測器晶片上。用乙醇胺阻斷生物感測器表面上未反應之部分。流槽2及4中之經修飾的羧甲基聚葡萄糖表面用作反應表面。流槽1及3中不含山羊抗小鼠IgG的未經修飾的羧甲基聚葡萄糖用作參考表面。關於動力學分析，藉由使用Biaevaluation 4.0.1軟體將由1：1朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)獲得之速率方程式與所有八次注射之締合及解離階段同時擬合(使用整體擬合分析)。用HEPES緩衝鹽水稀釋經純化之抗體，以便於山羊抗小鼠IgG特異性反應表面上捕捉。將欲以配體形式捕捉之抗體(25 μg/ml)以5 μl/min之流動速率注射於反應基質上。在25 μl/min之連續流動速率下測定締合速率常數kon(M-1s-1)及解離速率常數koff(s-1)。藉由在範圍為10-200 nM之不同抗原濃度下進行動力學結合性量測法來獲得速率常數。隨後藉由以下公式，從動力學速率常數來計算抗體與標靶抗原之間反應的平衡解離常數(M)：KD=koff/kon。記錄結合性隨時間變化之函數，且計算動力學速率常數。在此分析法中，可量測到快達106 M-1s-1之結合速率及慢達10-6 s-1之脫離速率。
就此而言，本文之結合蛋白預期具有有利特性，包括高親和力、緩慢脫離速率及高中和能力。
實例4.5：人類TNF-α之中和作用
使L929細胞生長至半匯合密度且使用0.25%胰蛋白酶(Gibco#25300)收集。細胞以PBS洗滌，計數且依1E6個細胞/毫升再懸浮於含有4 μg/mL放線菌素D之分析培養基中。將細胞以100 μL之體積及5E4個細胞/孔接種於96孔盤(Costar#3599)中。用分析培養基將結合蛋白及對照IgG稀釋至4X濃度且進行連續1：4稀釋。用分析培養基將人類TNF-α稀釋至400 pg/mL。以1：2稀釋方案將結合蛋白樣本(200 μL)添加至人類TNF-α(200 μL)中且使其在室溫下培育0.5小時。
將結合蛋白/人類TNF-α溶液以100 μL添加至經塗佈之細胞以使得最終濃度為100 pg/mL人類TNF-α及150 nM-0.0001 nM結合蛋白。盤在37℃、5% CO2下培育20小時。為定量存活率，自孔中移出100 μL且添加10 μL WST-1試劑(Roche目錄號11644807001)。盤在分析條件下培育3.5小時。利用Spectromax 190 ELISA盤讀取器在OD 420-600 nm下讀取盤。
就此而言，本文之結合蛋白預期具有有利特性，包括高親和力、緩慢脫離速率及高中和能力。
實例4.6：治療
需要用TNF-α結合蛋白治療之患者可能患有具免疫及發炎要素之疾病，諸如自體免疫疾病，尤其彼等與發炎相關之自體免疫疾病，包括克羅恩氏病、牛皮癬(包括斑塊牛皮癬)、關節炎(包括類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、 骨關節炎或青少年特發性關節炎)、多發性硬化症及僵直性脊椎炎。因此，本文之結合蛋白可用於治療此等病症。
可藉由皮下注射來投與TNF-α結合蛋白。若患者患有類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎或僵直性脊椎炎，則該患者可接受每隔一週40 mg作為起始劑量且為達成治療目的必要時可接受每週40 mg。若患者患有青少年特發性關節炎且體重為15 kg至<30 kg，則該患者可接受每隔一週20 mg，且若30 kg，則每隔一週40 mg。若患者患有克羅恩氏病，則該患者可接受160 mg之初始劑量(一天中4次40 mg注射，或每天兩次40 mg注射持續連續兩天)，接著兩週後80 mg，且又兩週後開始每隔一週40 mg之維持劑量。若患者患有斑塊牛皮癬，則該患者可接受80 mg初始劑量，接著在初始劑量的一週後開始每隔一週40 mg。
結合蛋白可以單次使用預填充筆形物(40 mg/0.8 mL)、單次使用預填充玻璃針筒(40 mg/0.8 mL或20 mg/0.4 mL)形式提供。
以引用的形式併入
在本申請案中引用之所有引用參考資料(包括參考文獻、專利、專利申請案及網站)的內容據此以全文引用的方式明確地併入，其中引用之參考資料亦如此。除非另外指出，否則本文揭示之實務將採用此項技術中所熟知的免疫學、分子生物學及細胞生物學之習知技術。
等效物
在不悖離本發明之精神或基本特徵的情況下可以其他特 定形式來實施本發明。因此，就各方面而言上述實施例應視作說明性而非限制本文所述之發明。因此，本發明之範疇係由隨附申請專利範圍而非由上述描述所指示，且因此屬於申請專利範圍之等效性含義及範圍內的所有變化均意欲包涵於本文中。

Claims (29)

  1. 一種結合蛋白，其包含至少一個重鏈可變區(VH區)，該重鏈可變區包含：(a)三個來自以下任一者的互補決定區(CDR)：SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075及1077；或(b)SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075及1077中之任一者。
  2. 一種結合蛋白，其包含至少一個輕鏈可變區(VL區)，該輕鏈可變區包含：(a)三個來自以下任一者的互補決定區(CDR)：SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076及1078；或(b)SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076、1078中之任一者。
  3. 一種結合蛋白，其包含至少一個重鏈可變區(VH區)及至少一個輕鏈可變區(VL區)，其中該VH區包含：(a)三個來自以下任一者的互補決定區(CDR)：SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、 1053-1062、1073、1075及1077；或(b)SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、778-956、1053-1062、1073、1075及1077中之任一者；且該VL區包含：(c)三個來自以下任一者的CDR：SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076及1078；或(d)SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076、1078中之任一者。
  4. 如請求項3之結合蛋白，其中該結合蛋白包含兩個VH區及兩個VL區。
  5. 如請求項3之結合蛋白，其中該結合蛋白包含至少一個VH區及至少一個VL區，其包含選自由以下組成之群的一組胺基酸序列：SEQ ID NO：22與23；24與25；26與27；28與29；30與31；及32與33。
  6. 如請求項4之結合蛋白，其中該結合蛋白：(a)調節TNF-α之生物功能；(b)中和TNF-α；(c)降低TNF-α結合其受體之能力；(d)降低原人類TNF-α、成熟人類TNF-α或截短人類 TNF-α結合其受體之能力；及/或(e)降低TNF依賴性細胞激素產生、TNF依賴性細胞殺死、TNF依賴性發炎、TNF依賴性骨侵蝕及TNF依賴性軟骨損傷中之一或多者。
  7. 如請求項4之結合蛋白，其中該結合蛋白具有至少約102 M-1s-1、至少約103 M-1s-1、至少約104 M-1s-1、至少約105 M-1s-1、或至少約106 M-1s-1之結合速率常數(Kon)，如藉由表面電漿子共振所量測。
  8. 如請求項4之結合蛋白，其中該結合蛋白具有至多約10-3 s-1、至多約10-4 s-1、至多約10-5 s-1、或至多約10-6 s-1之脫離速率常數(Koff)，如藉由表面電漿子共振所量測。
  9. 如請求項4之結合蛋白，其中該結合蛋白具有至多約10-7 M、至多約10-8 M、至多約10-9 M、至多約10-10 M、至多約10-11 M、至多約10-12 M、或至多10-13 M之解離常數(KD)。
  10. 一種能夠結合人類TNF-α之結合蛋白，該結合蛋白包含：(a)重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(b)輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(c)重鏈可變區(VH區)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34-58、74-83、94-266、478-486、496-675、738-762、 778-956、1053-1062、1073、1075及1077；及(d)輕鏈可變區(VL區)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、59-73、84-93、267-477、487-495、676-737、763-777、957-1052、1063-1072、1074、1076及1078。
  11. 如請求項3之結合蛋白，其中該結合蛋白包含免疫球蛋白分子、Fv、二硫鍵連接之Fv、單株抗體、scFv、嵌合結合蛋白、單域結合蛋白、CDR移植結合蛋白、雙功能抗體、人類化結合蛋白、多特異性結合蛋白、Fab、雙重特異性結合蛋白、Fab'片段、雙特異性結合蛋白、F(ab')2片段、DVD-IgTM、包含由在鉸鏈區之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段、由VH域及CH1域組成之Fd片段、由抗體之單臂之VL域及VH域組成的Fv片段、dAb片段、孤立之互補決定區(CDR)或單鏈結合蛋白。
  12. 如請求項4之結合蛋白，其中該結合蛋白係結合於選自由以下組成之群的顯影劑：放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。
  13. 如請求項4之結合蛋白，其中該結合蛋白進一步包含選自由以下組成之群的治療劑或細胞毒性劑：抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素(anthracycline)、毒素、細胞凋亡劑、及至少一種用於治療TNF-α活性有害之病症的其他治療劑。
  14. 一種經分離核酸，其編碼包含如請求項3之胺基酸序列 的結合蛋白。
  15. 一種載體，其包含如請求項14之經分離核酸。
  16. 一種宿主細胞，其包含如請求項15之載體。
  17. 一種產生結合TNF-α之蛋白質的方法，該方法包含在足以產生結合TNF-α之結合蛋白之條件下在培養基中培養如請求項16之宿主細胞的步驟。
  18. 一種醫藥組合物，其包含如請求項3之結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  19. 一種如請求項18之醫藥組合物的用途，其係用於製造用以治療TNF-α病症之藥物。
  20. 一種降低人類TNF-α活性之方法，該方法包含使人類TNF-α與如請求項3之結合蛋白接觸，以便降低人類TNF-α活性。
  21. 一種如請求項3之結合蛋白之用途，其係用於製造用以降低罹患TNF-α活性有害之病症之人類個體中的人類TNF-α活性的藥物。
  22. 一種如請求項3之結合蛋白之用途，其係用於製造用以治療罹患TNF-α有害之病症之患者的藥物，其係在向該患者投與第二藥劑之前、同時或之後向該患者投與該結合蛋白，其中該第二藥劑係選自由以下組成之群：能夠結合人類IL-12之抗體或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；組織胺；組織胺受體阻斷劑；緩激肽；IL-1α；IL-Iβ；VEGF；PLGF；甲胺喋呤；皮質類固醇、糖皮質激素受體調節劑；環孢靈 (cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506及非類固醇消炎劑。
  23. 如請求項21或22之用途，其中該病症為自體免疫及/或發炎病症。
  24. 如請求項23之用途，其中該病症係選自由以下組成之群：克羅恩氏病(Crohn's disease)、牛皮癬、斑塊牛皮癬、關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨關節炎或青少年特發性關節炎、多發性硬化症及僵直性脊椎炎。
  25. 如請求項23之用途，其中該病症係選自由以下組成之群：呼吸道病症；哮喘；過敏性及非過敏性哮喘；由於感染所致之哮喘；由於感染呼吸道融合性病毒(RSV)所致之哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣管發炎之病狀；嗜伊紅血球增多症；纖維化及過量黏液產生；囊腫性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；發炎性及/或自體免疫皮膚病狀；發炎性及/或自體免疫胃腸器官病狀；發炎性腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；克羅恩氏病；發炎性及/或自體免疫肝臟病狀；肝硬化；肝纖維化；由B型及/或C型肝炎病毒造成之肝纖維化；硬皮病；腫瘤或癌症；肝細胞癌；神經膠母細胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染；細菌感染；寄生蟲感染；HTLV-1感染；1型保護性免疫反應之表現的抑止及在疫苗接種期間1型保護性免疫反應之表現的抑 止。
  26. 一種藉由免疫分析法測定試樣中TNF-α或其片段之存在的方法，其中該免疫分析法包含使該試樣與至少一種如請求項3之結合蛋白或其片段及至少一種可偵測標記接觸。
  27. 如請求項26之方法，其中該方法進一步包含：(i)使該試樣與該至少一種結合蛋白或其片段接觸，其中該結合蛋白結合於該TNF-α或其片段上之抗原決定基，以形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一種可偵測標記接觸，其中該可偵測標記結合於該第一複合物上或該TNF-α或其片段上未與該結合蛋白或其片段結合之抗原決定基，以形成第二複合物；及(iii)基於該第二複合物中由該可偵測標記生成之信號來偵測該試樣中該TNF-α或其片段之存在，其中該TNF-α或其片段之存在與由該可偵測標記生成之該信號直接相關。
  28. 如請求項26之方法，其中該方法進一步包含：(i)使該試樣與該至少一種結合蛋白或其片段接觸，其中該結合蛋白或其片段結合於該TNF-α或其片段上之抗原決定基，以形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一種可偵測標記接觸，其中該可偵測標記與該TNF-α或其片段競爭結合於該結合蛋白或其片段，以形成第二複合物；及 (iii)基於該第二複合物中由該可偵測標記生成之信號來偵測該試樣中該TNF-α或其片段之存在，其中該TNF-α或其片段之存在與由該可偵測標記生成之該信號間接相關。
  29. 如請求項26之方法，其中該方法視情況進一步包含診斷、預測或評估該患者之治療性/預防性治療的功效。
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