MX2014004981A - Inmunoaglutinantes dirigidos contra tnf. - Google Patents

Inmunoaglutinantes dirigidos contra tnf.

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MX2014004981A
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Suju Zhong
Anca Clabbers
Chung-Ming Hsieh
Lorenzo Benatuil
Yuliya Kutskova
John Memmott
Carrie Goodreau
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Abstract

Se describen proteínas de unión aisladas, por ejemplo anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, los cuales se unen al factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), por ejemplo, TNF-a de humano, y composiciones y moléculas basadas en anticuerpo relacionadas. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, así como métodos terapéuticos y de diagnóstico para utilizar los anticuerpos.

Description

INMUNO AGLUTINANTES DI RIGIDOS CONTRA EL TNF Referencia cruzada a solicitud relacionada Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud de los Estados Unidos provisional No. de Serie 61 /550,587, presentada el 24 de octubre del 201 1 , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Campo de la invención Se proporcionan las proteínas de enlace a TNF-a y sus usos en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inmunológicas agudas y crónicas.
Antecedentes de la invención Existe una necesidad en la técnica en cuanto a proteínas de enlace capaces de enlazarse al TNF-a (conocido también como factor de necrosis de tumores, factor de necrosis de tumores alfa, factor de necrosis de tumores-a, TNF, y caquectina. Se proporciona una nueva familia de proteínas de enlace, proteínas de enlace injertadas con CDR, proteínas de enlace humanizadas, y fragmentos de las mismas, capaces de enlazarse al TNF-a con alta afinidad y neutralizar el TNF-a.
Breve descripción de la invención Se proporcionan proteínas de enlace a TNF-a, o las porciones de enlace al antígeno de las mismas, que se enlazan al TNF- a. En una modalidad, el dominio de enlace al antígeno comprende la región VH elegida de entre cualquiera de las SEC ID NOs: : 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077 o una, dos o tres CDRs de las mismas. En otra modalidad, el dominio de enlace al antígeno comprende la región VL elegida de entre cualquiera de las SEC ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1072, 1074, 1076 y 1078 o una, dos o tres CDRs de las mismas. En una modalidad particular, el dominio de enlace al antígeno comprende una región VH y una región VL, por ejemplo, en donde la región VH comprende las SEC ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077, o una, dos o tres CDRs de las mismas, y la región VL comprende las SEC ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1072, 1074, 1076, 1078 o una, dos o tres CDRs de las mismas.
En una modalidad, las proteínas de enlace se enlazan al TNF-a. En otra modalidad las proteínas de enlace modulan las funciones biológicas del TNF-a. En otra modalidad, las proteínas de enlace neutralizan en TNF-a. En aún otra modalidad, las proteínas de enlace disminuyen la habilidad del TNF-a para enlazarse con sus receptores, por ejemplo, las proteínas de enlace disminuyen la habilidad del TNF-a pro-humano, el TNF-a humano maduro, o el TNF-a truncado para enlazarse con sus receptores. En aún otra modalidad, las proteínas de enlace reducen una o más de las actividades biológicas del TNF-a, seleccionadas de: producción de citosina dependiente de TNF; eliminación de células dependiente de TNF; inflamación dependiente del TNF; erosión del hueso dependiente del TNF; y daño al cartílago dependiente del TNF.
En una modalidad, las proteínas tienen una constante de velocidad de asociación (KaSoc¡ac¡ón) seleccionada de: al menos aproximadamente 102M 1s 1: al menos aproximadamente 103 M V1; al menos aproximadamente 104 M 1s 1; al menos aproximadamente 105 M- 1s'1; y al menos aproximadamente 106 M 1s"1; cuando se mide por resonancia de plasmón superficial. En otra modalidad, las proteínas de enlace tienen una constante de velocidad de disociación (Kd¡Soc¡ac¡ón) seleccionada de: a lo máximo aproximadamente 10"3s 1; a lo máximo aproximadamente 104s 1; a lo máximo aproximadamente 105s 1; y a lo máximo aproximadamente 106s , cuando se mide por resonancia de plasmón superficial. En aún otra modalidad, las proteínas de enlace tienen una constante de disociación (KD) seleccionada de entre: a lo máximo aproximadamente 10"7 ; a lo máximo aproximadamente 108 M; a lo máximo aproximadamente 199 M; a lo máximo aproximadamente 10" 10 M; a lo máximo 10" 1M; y a lo máximo 1013 M.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar mamíferos, que comprende administrar a los mamíferos una cantidad efectiva de las composiciones farmacéuticas descritas en este documento. En otra modalidad, se proporciona un método para reducir la actividad del TNF-a humano, el método que comprende: poner el contacto el TNF-a humano con las proteínas de enlace descritas aquí, de modo tal que la actividad del TNF-a humano se reduce. En otra modalidad, se proporciona un método para reducir la actividad del TNF-a humano en sujetos humanos que sufren de un trastorno en el cual la actividad del TNF-a es perjudicial, el método que comprende, administrar al sujeto humano las proteínas de enlace descritas aquí, de modo tal que la actividad del TNF-a humano en los sujetos humanos se reduce. En otra modalidad, se proporciona un método para tratar a sujetos por enfermedades o trastornos en los cuales la actividad del TNF-a es perjudicial, el método que comprende, administrar a los sujetos las proteínas de enlace descritas aquí, de modo tal que se logre el tratamiento.
En una modalidad, el método trata enfermedades que involucran elementos inmunológicos e inflamatorios, tales como enfermedades autoinmunes, en particular aquellas asociadas con la inflamación, incluyendo la enfermedad de Crohn, psoriasis en placas), artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis psoriásica, osteoartritis, o artritis idiopática juvenil), esclerosis múltiple, y espondilitis anquilosante. Por lo tanto, las proteínas de enlace de este documento pueden ser usadas para tratar estos trastornos.
Descripción detal lada de la invención Se proporciona proteínas de enlace a TNF-a, o las porciones de enlace al antígeno de las mismas, que se enlazan con el TNF-a, composiciones farmacéuticas de las mismas, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospederas para fabricar tales proteínas de enlace y fragmentos. También se proporcionan métodos para usar las proteínas de enlace descritas aquí, para detectar el TNF-a humano, para inhibir el TNF-a humano ya sea in vitro o in vivo y para regular la expresión genética o las funciones relacionadas con el TNF-ct.
A menos que se defina de otra manera en este documento, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente descripción tendrán los significados que son conocidos comúnmente por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica. El significado y el ámbito de los términos debe estar claro, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas aquí prevalecen sobre cualquier definición del diccionario o extrínseca. Además, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o", a menos que se establezca de otra manera. Además, el uso del término "que incluye" así como otras formas del término, tales como "incluye" e "incluido", no son limitantes. También, los términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto los elementos y componentes que comprenden una unidad y los elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se establezca específicamente de otra manera.
Por lo general, las nomenclaturas usadas en conexión con, y las técnicas de, el cultivo, celular y de tejidos, patología, oncología, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas aquí, son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente descripción se llevan a cabo por lo general de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y se describen a través de la presente especificación a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N . Y. ( 1989)). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realizan comúnmente en la técnica o como se describen aquí. Las nomenclaturas usadas en conexión con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, la química analítica, la química orgánica sintética, y la química médica y farmacéutica, descritos aquí, son aquellos bien conocidos y sados comúnmente en la técnica. Las técnicas estándares se usan para las síntesis orgánicas, los análisis clínicos, las preparaciones farmacéuticas, la formulación y la administración, y el tratamiento de los pacientes.
El término "TNF-a humano" (abreviado aquí como hTNF-a) incluye una proteína de citosina trimérica. El término incluye una proteína homotrimérica que comprende tres proteínas TNF-a de 17.5 kD. La proteína homotrimérica se conoce como "proteína de TNF-a". El término "TNF-a" humano tiene la intención de incluir el TNF-a humano recombinante (rhTNF-a), el cual puede ser preparado mediante los métodos de expresión recombinante estándar. La secuencia del TNF-a humano se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Secuencia del TNF-a Humano El término "anticuerpo", se refiere en general a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig), o la porción de enlace al antígeno de las mismas, compuesta de cuatro cadenas dé polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) o cualquier fragmento funcional, mutante, variante, o derivado de las mismas, los cuales retienen las características de enlace al epítopo esenciales de una molécula de Ig. Tales formatos de anticuerpos mutantes, variantes, o derivados son conocidos en la técnica.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena se compone de la región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviado aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera se compone de un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde la amino-terminal a la carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR2, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), clase (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.
El término "porción de enlace al antígeno" o "región de enlace al antígeno" de una proteína de enlace (o simplemente "porción de enlace de la proteína", se refiere a uno o más fragmentos de una proteína de enlace que retienen la habilidad para enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hTNF-a). La función de enlace al antígeno de una proteína de enlace puede ser llevada a cabo por los fragmentos de una proteína de enlace de longitud completa. Tales modalidades de la proteína de enlace también pueden tener formatos biespecíficos, con especificidad doble, o multi-específicos; que se enlazan específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de los fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace al antígeno" de una proteína de enlace incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. , (1 989) Nature 341 :544-546, Winter et al. , Publicación PCT: WO 90/05144 A1 ), el cual comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, estos pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite ser formados como una cadena de proteína única en la cual las el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocida como Fv de cadena simple (scFv); véase, por ejemplo, Bird, et al. , (1 989) Science 242:423-426; y Huston et al. , (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales proteínas de enlace de cadena simple también deben estar abarcadas dentro del término "porción de enlace al antígeno" de una proteína de enlace. Otras formas de proteínas de enlace de cadena simple, tales como diacuerpos, también están abarcados. Los diacuerpos son proteínas de enlace bivalentes, biespecíficas en las cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena de polipéptidos única, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando por ello a que los dominios se apareen con dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de enlace al antígeno (véase, por ejemplo, Hollinger et al. , (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak et al. , ( 1994) Structure 2: 1 121 -1 123).
El término "proteína de enlace" se refiere a un polipéptido que comprende una o más porciones de enlace al antígeno descritas aquí, enlazadas opcionalmente a un polipéptido enlazador o un dominio constante. Los polipéptidos enlazadores comprenden dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y se usan para enlazar una o más porciones de enlace al antígeno. Tales polipéptidos enlazadores son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Holliger et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448; Poljak, et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Un dominio constante se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoácidos del dominio constante de cadena pesada y de cadena ligera son conocidas en la técnica y se representan en la Tabla 2.
Tabla 2: Secuencia del Dominio Constante de Cadena Pesada y el Dominio Constante de Cadena ligera de IgG Humana Proteina Identifica- Secuencia dor de la secuencia 12345678901234567890123456789012 Región SEC ID ASTKGPSVFFLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP constante NO. : 2 EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV de Ig VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS gama-1 CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Mutante SEC ID NO. : ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP de la 3 EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV región VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS constante CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI de Ig SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA gama-1 KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Región SEC ID TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR constante NO. : 4 EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS de Ig STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN Kappa RGEC Región SEC ID QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP constante NO. : 5 GAVTVA KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAAS de Ig SYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPT Lambda ECS Una proteina de enlace, o la porción de enlace al antígeno la misma, puede ser parte de una molécula de inmunoadhesion más grande, formada por la asociación covalente o no covalente de la proteína de enlace o la porción de la proteína de enlace con una o más proteínas o péptidos distintos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesion incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para formar una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, et al., (1995) Hum. Antibod. Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para formar moléculas de ScFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpos, tales como Fab y F(ab')2, pueden ser preparados a partir de anticuerpos completos, usando las técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, las proteínas de enlace, las porciones de proteínas de enlace y las moléculas de inmunoadhesion pueden ser obtenidas usando técnicas estándares de DNA recombinante, como se describen aquí.
Una "proteína de enlace aislada" se refiere a una proteína de enlace, o la porción de enlace al antígeno de la misma, que está sustancialmente libre de otras proteínas de enlace que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, una proteína de enlace aislada que se enlace específicamente con el hTNF-a, está sustancialmente libre de las proteínas de enlace que se enlazan específicamente con antígenos distintos al hTNF-a). Una proteína de enlace aislada que se enlaza específicamente con el hTNF-a puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las moléculas de TNF-a de otras especies. Además, una proteína de enlace aislada puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o sustancias químicas.
El término "proteína de enlace humana" incluye las proteínas de enlace, o la porción de enlace al antígeno de las mismas, que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Las proteínas de enlace humanas descritas aquí pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana (por ejemplo, las mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sirio, in vitro, o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDRs y en particular la CDR3. Sin embargo, el término "proteína de enlace humana", no debe incluir las proteínas de enlace en las cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tales como ratones, han sido injertadas en las secuencias de marco humanas.
Los términos "numeración Kabat", "definiciones de Kabat" y "etiquetado de Kabat" se usan de forma intercambiable en este documento. Esto términos, los cuales son reconocidos en la técnica, se refieren a un sistema para numerar los residuos de aminoácidos los cuales son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de enlace al antígeno del mismo (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 y Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91- 3242). Véase también, Martin, "Protein Sequence and Structure Analyis of Antibody Variable Domains", En Kotermann y Dübel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlín, 2001), Capítulo 31, en especial las páginas 432-433. Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable abarca desde las posiciones de aminoácidos 31 a 35 para la CDR1, las posiciones de aminoácidos 50 a 65 para la CDR2, y las posiciones de aminoácidos 95 a 106 para la CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable abarca desde las posiciones de aminoácidos 24 a 34 para la CDR1, las posiciones de aminoácidos 50 a 56 para la CDR2, y las posiciones de aminoácidos 89 a 97 para la CDR3.
El término "CDR" se refiere a la región determinante de complementariedad dentro de las secuencias variables de anticuerpos. Hay tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, las cuales se designan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto de CDFR" se refiere a un grupo de tres CDRs que aparecen en una sola región variable capaz de enlazarse al antígeno. Los límites precisos de estas CDRs han sido definidos de forma diferentes de acuerdo con los diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de residuos ambiguo aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino también proporciona los límites de los residuos precisos que definen las tres CDRs. Estas CDRs pueden ser conocidas como CDRs de Kabat. Chothia y Colaboradores (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 1 96:901 -91 7) y Chothia et al. , (1989) Nature 342:877-883) han descubierto que ciertas subporciones dentro de las CDRs de Kabat adoptan conformaciones idénticas del esqueleto peptídico, a pesar de que tienen gran diversidad a nivel de la secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se designaron L1 , L2, y L3 o H 1 , H2 y H3 donde la "L" y la "H" designan las regiones de la cadena ligera y la cadena pesada respectivamente. Estas regiones pueden ser conocidas como CDRs de Chothia, las cuales tienen límites que se traslapan con las CDRs de Kabat. Otros límites que definen CDRs que se traslapan con las CDRs de Kabat han sido descritos por Padlan (1995) FASEB J . 9: 133-1 39 y MacCallum (1 996) J . Mol. Biol. 262(5):732-745. Todavía, otras definiciones de CDRs pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas anteriores, pero no obstante se traslaparan con las CDRs de Kabat, aunque estas pueden estar acortadas o alargadas a la luz de la predicción o los descubrimientos experimentales de que los residuos o grupos de residuos particulares o aún las CDRs completas no afectan significativamente el enlace con el antígeno. Los métodos usados aquí pueden utilizar las CDRs definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque las modalidades particulares usan las CDRs definidas por Kabat o Chothia.
Las secuencias aceptoras de la cadena pesada o la cadena ligera humanas son conocidas en la técnica. En una modalidad de la descripción, las secuencias aceptoras de la cadena pesada y la cadena ligera humanas se seleccionan de entre las secuencias listadas por V- base (hvbase. mrc-cpe. cam .ac.uk/) o por I MGT®, the international Im MunoGeneTics information system® (himgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/) . En otra modalidad de la descri pción , las secuencias aceptoras de la cadena pesada y la cadena ligera humanas se seleccionan de las secuencias descritas en la Tabla 3 y la Tabla 4 , respectivamente.
Tabla 3: Secuencias Aceptoras de la Cadena Pesada Tabla 4: Secuencias Aceptoras de la Cadena Ligera El término "proteína de enlace m ultivalente" se usa en esta especificación para denotar una proteína de enlace que comprende dos o más sitios de enlace al antígeno . La proteína de enlace multivalente puede ser modificada por ingeniería para tener los tres o más sitios de enlace al antígeno, y por lo general no es un anticuerpo de formación natural. El término "proteína de enlace multiespecífica" se refiere a una proteína de enlace capaz de enlazarse a dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Las proteínas (DVD) o inmunoglobulinas (DVD-lg) de enlace de dominio variable doble, son proteínas de enlace que comprenden dos o más sitios de enlace al antígeno y son proteínas de enlace, tetravalentes o multivalentes. Tales proteínas de enlace DVD pueden ser monoespecíficas, es decir, capacees de enlazarse a un antígeno o multiespecíficas, es decir, capaces de enlazarse a dos o más antígenos. Las proteínas de enlace DVD que comprenden dos polipéptidos de DVD-lg de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD-lg de cadena ligera se conocen como DVD-lg. Cada mitad de una DVD-lg comprende un polipéptido de DVD-lg de cadena pesada, y un polipéptido de DVD-lg de cadena ligera, y dos sitios de enlace al antígeno. Cada sitio de enlace al antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDRs involucradas en el enlace al antígeno por sitio de enlace del antígeno. Las proteínas de enlace DVD y los métodos para preparar proteínas de enlace DVD se describen en la Patente Norteamericana No. 7,612, 181 .
Un aspecto de la descripción se refiere a una proteína de enlace DVD que comprende proteínas de enlace capaces de enlazarse al TNF-a. En una modalidad particular, la proteína de enlace DVD es capaz de enlazarse al TNF-a y a un segundo objetivo.
El término "neutralización" se refiere a la neutralización de una actividad biológica de una citocina cuando una proteína de enlace se enlaza específicamente a la citosina. En una modalidad particular, el enlace de una proteína de enlace de neutralización a hTN F-a resulta en la inhibición de una actividad biológica del hTNF-a, por ejemplo, la proteína de enlace de neutralización se enlaza al hTNF-a y reduce una actividad biológica del hTNF-a en al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85% o más. La inhibición de una actividad biológica del hTNF-a por una proteína de enlace de neutralización puede ser evaluada midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hTNF-a bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la neutralización de ia citotoxicidad del TNF-a sobre las células L929.
En otra modalidad, los términos "agonista" o "agonizante" se refieren a un aumento de una actividad biológica del TNF-a cuando una proteína se enlaza específicamente al TNF-a, por ejemplo, el hTNF-a. En una modalidad particular, en enlace de una proteína de enlace agonizante al TNF-a resulta en el aumento de una actividad biológica del TNF-a. En una modalidad particular, la proteína de enlace agonizante se enlaza al TNF-a y aumenta una actividad biológica del TNF-a en al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80% , 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y 100%. Un inhibidor de una actividad biológica del TNF-a por una proteína de enlace agonizante puede ser evaluada midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica del TNF-a, bien conocidos en la técnica.
El término "actividad" incluye las actividades tales como la especificidad /afinidad de enlace de una proteína de enlace por un antígeno, por ejemplo, una proteína de enlace a hTNF-a que se enlaza a un antígeno de TNF-.a y/o la potencia de neutralización (o la potencia agonizante) de una proteína de enlace, por ejemplo, una proteína de enlace a hTNF-a cuyo enlace al hTNF-a inhibe la actividad biológica del hTNF-a, por ejemplo, la neutralización de la citotoxicidad del TNF-a sobre la células L929.
El término "resonancia de plasmón superficial" se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones biespecíficas en tiempo real , mediante la detección de las alteraciones en las concentraciones de las proteínas dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ).
El término " Kasoc¡ac¡ón" se refiere a constante de velocidad de asociación para la asociación de una proteína de enlace (por ejemplo, un anticuerpo) al antígeno, para formar, por ejemplo, el complejo anticuerpo/antígeno, como se conoce en la técnica. La "Kasoc¡ac¡ón" también es conocida por los términos "constante de velocidad de asociación", o "ka", como se usa de forma intercambiable aquí. Este valor que indica la velocidad de enlace de un anticuerpo con su antígeno objetivo o la velocidad de formación del complejo entre un anticuerpo y el antígeno, también se demuestra por la siguiente ecuación: Anticuerpo ("Ab")+ Antígeno ("Ag")?Ab-Ag El término " Kdisociación" se refiere a la constante de velocidad de disociación para la disociación, o "constante de velocidad de disociación" de una proteína de enlace (por ejemplo un anticuerpo), de, por ejemplo, el complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica. Este valor indica la velocidad de disociación de un anticuerpo de su antígeno objetivo o la separación del complejo Ab-Ag a través del tiempo, en el anticuerpo y el antígeno libres como se muestra por la ecuación siguiente: Ab+Ag<-Ab-Ag El término "KD" se refiere a la constante de equilibrio de disociación" y se refiere al valor obtenido en una medición de titulación en equilibrio, o al dividir la constante de velocidad de disociación (Kd¡sociaciór) entre la constante de velocidad de asociación (KaSoc¡ación). La constante de velocidad de asociación, la constante de velocidad de disociación y la constante de equilibrio de disociación se usan para representar la afinidad de enlace de un anticuerpo a un antígeno. Los métodos para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica. Usar técnicas basadas en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la habilidad de examinar muestras en amortiguadores fisiológicos en equilibrio. Otras técnicas e instrumentos experimentales tales como en ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) pueden ser usados (por ejemplo, los instrumentos tales como BIAcore International AB, una Compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia), adicionalmente también se puede usar un ensayo KinExA® (Ensayo cinético de Exclusión), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
I. Proteínas de enlace que se Enlazan al TNF-a Humano Un aspecto de la presente descripción proporciona proteínas de enlace a TNF anti-humanas, completamente humanas, aisladas, tales como anticuerpos monoclonales, o las porciones de enlace al antígeno de los mismos, que se enlazan al TNF-a con alta afinidad, una velocidad de disociación baja y una capacidad de neutralización alta. Un segundo aspecto de la descripción proporciona proteínas de enlace anti-TNF, completamente humanas, maduradas por afinidad, tales como anticuerpos monoclonales, o las porciones de enlace al antígeno de los mismos, que se enlazan al TNF-a con alta afinidad, una velocidad de disociación baja y alta capacidad de neutralización.
A. Método para Preparar Proteínas de Enlace a TNF-a Las proteínas de enlace descritas en este documento pueden ser preparadas mediante cualquiera de un número de técnicas conocidas en la técnica. 1. Anticuerpos Monoclonales Anti-TNF-a usando Animales Transgénicos En otra modalidad de la descripción, las proteínas de enlace se producen inmunizando animales no humanos que comprenden algunos o todos los locus de inmunoglobulina humana con un antígeno de TNF-a. En una modalidad particular, los animales no humanos son ratones transgénicos XENOMOUSE, una cepa de ratones transgénicos que comprende fragmentos grandes de los locus de inmunoglobulina humana y tienen producción deficiente del anticuerpo de ratón. Véase, por ejemplo, Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13-21 y las Patentes Norteamericanas 5,916,771 ; 5,939,598; 5,985,61 5; 5,998,209; 6,075, 1 81 ; 6,091 ,001 ; 6, 1 14,598 y 6, 130,364. Véanse también las Publicaciones PCT WO 91 /1 0741 , publicada el 25 de julio de 1 991 ; WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1 994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambas publicadas el 31 de octubre de 1996; WO 98/16654, publicada el 23 de abril de 1 998; WO 98/24803, publicada el 1 1 , de junio de 1998; WO 98/50422, publicada el 12 de noviembre de 1998; WO 99/45031 , publicada el 1 0 de septiembre de 1 999; WO 99/53049, publicada el 21 de octubre de 1999; WO 00/09560, publicada el 24 de febrero de 2000; y WO 00/37504, publicada el 29 de junio del 2000. Los ratones transgénicos XENOMOUSE producen un repertorio humano similar al de adultos de anticuerpos complemente humanos, y generan Mabs humanos específicos del antígeno. Los ratones transgénicos XENOMOUSE contienen aproximadamente 80% del repertorio human o de anticuerpos a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal, con tamaño de megabases, de los locus de la cadena pesada y x locus de la cadena ligera. Véase, Méndez et al. , ( 1997) Naure Genet. 1 5: 146-156; Green y Jakobovits ( 1 998) J . Exp. Med. 1 88:483-495. 2. Anticuerpos Monoclonales Anti-TNF-a Usando Genotecas de anticuerpos Recombinantes También se pueden usar métodos in vitro para preparar la proteína de enlace descrita aquí, en donde una genoteca de anticuerpos se evalúa y se selecciona para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de enlace deseada. Los métodos para tal evaluación y selecciona de genotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidas en la técnica e incluyen los métodos descritos en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,223,409; las publicaciones PCT WO 92/18619, WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; y WO 97/29131; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1369-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nucí. Acid Res. 19:4133-4137; y Barbas et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; y la Publicación de la Patente Norteamericana No. 2003.0186374.
Las genotecas de anticuerpos recombinantes pueden ser de un sujeto humanizado con TNF-a, o una porción del TNF-a. Alternativamente, la genoteca de anticuerpos recombinantes puede ser de sujetos no tratados, es decir, aquellos que no han sido inmunizados con TNF-a, tal como una genoteca de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con la TNF-a humana. Los anticuerpos descritos aquí se seleccionan muestreando y seleccionando la genoteca de anticuerpos recombinantes, con el péptido que comprende el TNF-a humano, para seleccionar por ello aquellos anticuerpos que reconocen el TN F-a humano. Los métodos para llevar a cabo tal muestreo y selección son bien conocidos en la técnica, como por ejemplo como se describe en las referencias en el párrafo anterior. Para seleccionar los anticuerpos descritos aquí, que tienen afinidades de enlace particulares por el hTNF-a, tales como aquellos que se disocian del TNF-a humanos con una constante de velocidad kdisociación particular, el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón superficial puede ser usado para seleccionar los anticuerpos que tienen la constante de velocidad kd ¡sociacíón particular. Para seleccionar los anticuerpos descritos aquí, que tienen una actividad de neutralización particular para el hTNF-a, tales como aquellos con un I C50 particular, se pueden usar los métodos estándares conocidos en la técnica, para evaluar la inhibición de la actividad del hTNF-a.
En un aspecto, se proporciona una proteína de enlace aislada, por una porción de enlace al antígeno de la misma, que se enlaza al TNF-a, por ejemplo TNF-a humano. En una modalidad particular, la proteína de enlace es una proteína de neutralización. En varias modalidades, la proteína de enlace es una proteína recombinante o un anticuerpo monoclonal.
Por ejemplo, las proteínas de enlace descritas aquí también pueden ser generadas usando varios métodos de expresión en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de expresión en fagos, los dominios funcionales de los anticuerpos se expresan sobre la superficie de partículas de fagos las cuales contienen las secuencias de polinucleótidos que las codifican . En un método particular, tales fagos pueden ser uti lizados para expresar los dom inios de enlace al antígeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpos combinatorios (por ejemplo huma nos o m urinos) . Los fagos que expresan un dominio de enlace al antígeno que se en laza al antígeno de interés pueden ser seleccionados o identificados con el antígeno, por ejemplo usando un antígeno etiquetado o un antígeno enlazado o capturado por una superficie sólida o perlas. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen los dominios de en lace fd y M 1 3 expresados por lo fagos con los dominios de anticuerpos Fv estabilizados por Fab, Fv o disu lfuro, fusionados ya sea a la proteína del gene I I I o el gene VI I I de los fagos. Los ejemplos de métodos de expresión en fagos q ue pueden ser usadas para preparar las proteínas de enlace descritas aquí, se pueden encontrar en la técnica .
Como se describe en las referencias anteriores , después de la selección de los fagos, las reg iones que codifican la proteína de enlace de los fagos pueden ser aisladas y usadas para generar proteínas de enlace completas que incl uyen la proteína de enlace humana o cualqu ier otro fragmento de enlace al antígeno deseado, y se expresan en cualquier tipo deseado de organismos hospederos, incluyendo células de mam íferos, células de i nsectos, células de plantas, levaduras, y bacterias, por ejem plo como se describe en detalle a continuación. Por ejem plo, las técnicas para producir de forma recom binante los fragmentos Fab, Fab' y F(ab' )2 tam bién pueden ser em pleados usando los métodos conocidos en la técnica , tales como aquellos descritos en la publ icación PCT WO 92/22324; M ullinax et al. , (1992) BioTechniques 12(6):864-869; y Sawai et al. (1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34; y Better et al., (1998) Science 240:1041-1043: los Ejemplos de las Técnicas las cuales pueden ser usadas para producir Fvs y anticuerpos de cadena sencilla incluyen aquellos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 4.946,778 y 5,258,498; Huston et al., (1991) Methods Emzymol. 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; y Skerra et al., (1998) Science 240:1038-1041.
Además del muestreo y selección de genotecas de anticuerpos recombinantes por expresión en fagos, se pueden aplicar otras metodologías conocidas en la técnica para muestrear y seleccionar genotecas combinatorias grandes, para la identificación de las proteínas de enlace con especificidad doble descritas aquí. Un tipo de sistema de expresión alternativo es aquel en el cual la genoteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de RNA-proteína, como se describe en la Publicación PCT No. WO 98/31700 y en Roberts y Szostak (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. En este sistema, se crea un fusión covalente entre un mRNA sintético que contiene puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en su extremo 3'. Por lo tanto el mRNA específico puede ser enriquecido de una mezcla compleja de mRNAs (por ejemplo, una genoteca combinatoria) con base en las propiedades del péptido o la proteína codificados, por ejemplo, el anticuerpo o las porciones del mismo, tales como el enlace del anticuerpo, o una porción del mismo, al antígeno con especificidad doble. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos o porciones de los mismos, recuperados por selección de tales genotecas pueden ser expresados por los medios recom binantes descritos anteriormente (por ejemplo, en células hospederas de mam íferos) , además, pueden ser sometidas a maduración por afinidad posterior ya sea por rondas adicionales de fusiones de m RNA-péptido en las cuales han sido introducidas m utaciones en las secuencias seleccionadas originalmente, o por otros métodos para maduración de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describe anteriormente.
En una técn ica las proteínas de enlace descritas aquí también pueden ser generadas usando métodos de expresión en levaduras conocidos en la técnica . En los métodos de expresión en levaduras, se usan los métodos genéticos usados para enlazar dominios de anticuerpos a la pared de las cél ulas de levadura y expresarlos sobre la superficie de las levaduras . En particular, tales levaduras pueden ser utilizadas para expresar dom inios de enlace al antigeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpos com binatorios (por ejemplo de humano o de muri no). Los ejemplos de métodos de expresión en levaduras q ue pueden ser usados para preparar las proteínas de enlace descrita aq uí , incluyen aquellos descritos en Wittrup et al. , Patente Norteamericana No. 6, 699, 658 y Frenken et al . , Patente Norteamericana N o 6, 1 1 4, 147.
B. Producción de Proteínas Recombinantes de En lace a TNF-a Las proteínas de enlace descritas aqu í pueden ser producidas mediante cualquier número de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la expresión por células hospederas, en donde el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en las células hospederas mediante las técnicas estándares. Las varias formas del término "transfección" tienen la intención de abarcar una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de DNA exógeno en células hospederas procarióticas y eucarióticas, por ejemplo, electroporación, precipitación en fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y lo similares. Aunque también es posible expresar las proteínas de enlace descritas aquí ya sea en células hospederas procarióticas y eucarióticas, la expresión de las proteínas de enlace en células eucarióticas se contempla, por ejemplo, en células hospederas de mamíferos, puesto que tales células eucarióticas (y en particular las células de mamíferos) son más viables que las células procarióticas para ensamblar y segregar las proteínas de enlace plegadas apropiadamente e inmunológicamente activas.
Las células hospederas de mamífero para expresar las proteínas de enlace recombinantes descritas aquí incluyen células de Ovarios de Hámsteres chinos (células CHO) (incluyendo las células dhfr~CHO, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo como se describen en Kaufman y Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células de mielo NS0, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes de la proteína de enlace, se introducen en células hospederas de mamíferos, las proteínas se enlace se producen cultivando las células hospederas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas de enlace en las células hospederas o, en particular, la secreción de los anticuerpos en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospederas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo usando los métodos estándares de purificación de proteínas.
Las células hospederas también pueden ser usadas para producir fragmentos de proteínas de enlace funcionales, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entenderá que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del ámbito de la presente descripción. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar células hospederas con el DNA que codifica los fragmentos funcionales ya sea de la cadena ligera y/o la cadena pesada de las proteínas de enlace descritas aquí. La tecnología de DNA recombinante también puede ser usada para eliminar algo de, o todo el DNA que codifica ya alguna de las cadenas ligera y pesada o ambas, que no son necesarias para el enlace a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de DNA también están abarcadas por las proteínas de enlace descritas aquí . Además, se pueden producir proteínas de enlace bifuncionales en las cuales una cadena pesada y una cadena ligera son las proteínas de enlace descritas aquí y la otra cadena pesada y la otra cadena ligera son específicas para un antígeno distinto a los antígenos de interés, al enlazar de forma cruzada una proteína de enlace descrita aquí con una segunda proteína de enlace mediante los métodos estándares de enlazamiento cruzado.
En un sistema ejemplificante para la expresión recombinante de las proteínas de enlace, o las porciones de enlace al antígeno de las mismas, descritas aquí, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada y la cadena ligera se introduce en células dhfr-CHO mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera se enlazan operativamente a elementos reguladores del mejorador de CMV/promotor de AdMLP para controlar los niveles altos de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también contiene un gene de DHFR, el cual permite la selección de las células CHO que han sido transfectadas con el vector, usando selección con metotrexato/amplificación. Las células hospederas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera y las proteínas de enlace intactas se recuperan del medio de cultivo. Las técnicas estándares de la biología molecular se usan para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospederas, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar las proteínas de enlace del medio de cultivo, aún más, un método para sintetizar las proteínas de enlace recombinantes descritas aquí se proporciona al cultivar las células hospederas descritas aquí en un medio de cultivo adecuado, hasta que se sintetizan las proteínas de enlace recombinantes descritas aquí. El método pude comprender además, aislar las proteínas de enlace recombinantes del medio de cultivo.
II. Proteínas de Enlace a hTNF-a A. Secuencias de los Clones Individuales La tabla 5 proporciona las secuencias de VH y VL de las proteínas de enlace anti-TNF humano completamente humanas, incluyendo las CDRs de cada secuencia de VH y VL.
Tabla 5. Secuencias de VH anti-TNF-a completamente humanas individuales B. Clones Convertidos con IgG La tabla 6 proporciona la secuencia de VH de los anticuerpos MAK-1 95 anti-TN F humanizados que fueron convertidos en clones IgG como se discute en detalle en el Ejemplo 2.
Tabla 6. Secuencias de VH de anticuerpos MAK-195 anti-TNF humanizados de los clones convertidos con IgG La tabla 7 proporciona las secuencias de VL de los clones convertidos para anticuerpos MAK-1 95 anti-TNF humanizados con IgG como se discute en detalle en el Ejemplo 2.
Tabla 7. Secuencias de VL de los anticuerpos MAK-195 anti-TNF humanizados de los clones convertidos con IgG C. Secuencias individuales de hMAK-1 99 a partir de Clones Convertidos La tabla 8 proporciona secuencias de clones convertidos MAK-199 anti-TNF humanizados como se discute en detalle en el Ejemplo 3.
Tabla 8. Secuencias de VH de anticuerpos MAK-199 anti-TNF humanizados de los clones convertidos con IgG La Tabla 9 proporciona las secuencias de VL de los clones convertidos MAK-199 anti-TNF humanizados como se discute en detalle en el Ejemplo 3.
Tabla 9. Secuencias de VL de los anticuerpos MAK-199 anti-TNF humanizados de los clones convertidos con IgG En una modalidad, el dominio de enlace al antígeno comprende la región VH seccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077 o una, dos o tres CDRs de las mismas. En otra modalidad, el dominio de enlace al antígeno comprende la región VL seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 35, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1072, 1074, 1076 y 1078 o una, dos, o tres CDRs de las mismas. En una modalidad particular, el dominio de enlace al antígeno comprende una región VH y una región VL, por ejemplo, en donde la región VH comprende las SEC I D NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24,-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1 077 o una, dos, o tres CDRs de las mismas, y la región VL comprende las SEC I D NOs: 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1 072, 1 074, 1076 y 1078 o una, dos o tres CDRs de las mismas.
En una modalidad, donde las secuencias de CDR de VH y/o VL se proporcionan anteriormente, el marco aceptor humano comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID NOs: 6-21 . En una modalidad particular, el marco aceptor humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: las SEC ID NOs: 9, 1 0, 1 1 , 1 2, 1 5, 16, 17, y 21 . En otra modalidad, el marco aceptor humano comprende al menos una región de sustitución de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos del marco es al menos 65% idéntica con la secuencia del marco aceptor humano y comprende al menos 70 residuos de aminoácidos idénticos al marco aceptor humano. En otra modalidad, el marco aceptor humano comprende al menos una región de marco de sustitución de aminoácidos en un residuo clave. El residuo clave se selecciona de: un residuo adyacente a la CDR; un residuo del sitio de glicosilación; un residuo raro; un residuo capaz de interactuar con el TNF-a humano; un residuo capaz de interactuar con una CDR; un residuo canónico; un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera; un residuo dentro de una zona de Vernier; y un residuo en un región que se traslapa entre la CDR1 de cadena pesada variable definida por Chothia y un primer marco de cadena pesada definido por Kabat. En una modalidad, el residuo clave se selecciona de: H1, H12, H24, H27, H29, H37, H48, H49, H67, H71, H73, H76, H78, L13, L43, L58, L70 y L80. En una modalidad, la mutación de la VH se selecciona de: Q1E, I12V, A24V, G27F, I29L, V29F F29L I37V, I48L, S49G, V67L, V71K, R71K, T37N, N76S, L78I, y F78I. En otra modalidad, la mutación de la VL se selecciona de: V13L, A43S, I58V, E70D, y S80P. En una modalidad, las proteínas de enlace comprenden dos dominios variables en donde los dos dominios variables tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas de: las SEC ID NOs: 22 y 23; 23 y 24; 24 y 25; 26 y 27; 28 y 29; 30 y 31; o 32 y 33.
III. Producción de Proteínas de Enlace y Líneas de Células que Producen las Proteínas de Enlace En una modalidad, las proteínas de enlace a TNF-a descritas aquí exhiben una alta capacidad para reducir o neutralizar la actividad del TNF-a, por ejemplo, cuando se evalúa por medio de cualquiera de los varios ensayos in vitro e in vivo conocidos en la técnica. Alternativamente, las proteínas de enlace a TNF-a descritas aquí, también exhiben una alta capacidad para aumentar agonizar la actividad del TNF-a.
En modalidades particulares, las proteínas de enlace aisladas, o las porciones de enlace al antígeno de las mismas, se enlazan al TNF-a humano, en donde las proteínas de enlace, o la porción de enlace al antígeno de las mismas, se disocian del TNF-a humano con una constante de velocidad kd ¡sociación de aproximadamente 0.1 s" 1 o menos, cuando se determina por resonancia de plasmón superficial, como por ejemplo 1 x 1 0 2s"1 o menos, 1 x10 3s" 1 o menos, 1 x10" s 1 o menos, 1 x1 0 5s 1 o menos y 1 x10~6s 1 o menos; o las cuales inhiben la actividad del TNF-a humano con una I C50 de aproximadamente 1 x10 6 M o menos, como por ejemplo 1 x10 7 M o menos, 1 x1 0"8 M o menos, 1 x10~9 o menos, 1 x10"10 M o menos y 1 x1 0" 1 1 M o menos. En ciertas modalidades, las proteínas de enlace comprenden una región constante de cadena pesada, tal como una región constante de lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. En una modalidad, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG 1 o una región constante de cadena pesada de lgG4. Además, las proteínas de enlace pueden comprender una región constante de cadena ligera, ya sea una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda. En otra modalidad, las proteínas de enlace comprenden una región constante de cadena ligera kappa. Alternativamente, la porción de las proteínas de enlace puede ser por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv sencillo.
Los remplazos de residuos de aminoácidos en la porción Fe para alterar la unción efectora de las proteínas de enlace son conocidos en la técnica (Véanse las Patentes Norteamericanas Nos. 5,648,260 y 5,624,821 ). La porción Fe de las proteínas de enlace interviene en varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, inducción de citosinas, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y vida media/velocidad de depuración de los anticuerpos y los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para anticuerpos terapéuticas pero en otros casos podrían ser innecesarias o aún perjudiciales, dependiendo de los objeticos terapéuticos. Ciertos isotipos de IgG humana, en particular lgG1 e lgG3, intervienen en la ADCC y la CDC vía en enlazamiento con FcyRs y C1 q del complemento, respectivamente. Los receptores neonatales de Fe (FcRn) son los componentes críticos que determinan la vida media circulante de los anticuerpos. En aún otra modalidad, al menos un residuo de aminoácido se remplaza en la región constante de las proteínas de enlace, por ejemplo, la región Fe de las proteínas de enlace, de modo tal que las funciones efectoras de las proteínas de enlace se alteran.
Una modalidad proporciona proteínas de enlace etiquetadas en donde un anticuerpo o una porción de anticuerpo descritos aquí se derivan o se enlazan con otras moléculas funcionales (por ejemplo, otros péptidos o proteínas). Por ejemplo, una proteína de enlace etiquetadas descrita aquí, puede ser derivada enlazando funcionalmente un anticuerpo o una porción de anticuerpo descritos aquí (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, y de otras formas) con una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o la porción del anticuerpo con otras moléculas (tales como una región de núcleo de estreptavidina o una etiq ueta de polihistidina).
Los agentes detectables útiles con los cuales un anticuerpo o una región del anticuerpo descritos aqu í se pueden derivar incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes fluorescentes detectables ejemplificante incluyen fluoresceína , isotiocinato de fluorescenina , rodam ina , 5-cloruro de di metilamina- 1 -naftalenosulfonilo, ficoeritrina y los similares. U n anticuerpo también puede ser derivado con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa y las simi lares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, está se detecta agregando reactivos ad icionales que la enzima usa para prod ucir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando se presenta el agente detectable, peroxidasa de rábano, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción coloreado, el cual es detectable. Un anticuerpo también puede ser derivado con biotina . Y se detecta a través de la medición indirecta del enlace a avid ina o estreptavid ina .
Otra modal idad de la descripción proporciona proteínas de enlace cristal izadas. En una modalidad , se proporcionan cristales de las proteínas de enlace a TN F-a completas y de fragmentos de las mismas como se describen aquí , y las formulaciones y las com posiciones que comprenden tales cristales. En u na modalidad , las proteínas de enlace cristalizadas tienen una mayor vida med ia in vivo que las contrapartes sol ubles de las proteínas de enlace. En otra modalidad, las proteínas de enlace retinen su actividad biológ ica después de la cristalización .
Las proteínas de enlace cristalizadas descritas aq u í pueden ser producidas de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y como se describe en la Publicación PCT WO 02/72636.
Otra modalidad de la descripción proporciona proteínas de enlace glicosiladas en donde las proteínas de enlace o la porción de enlace al antígeno de las mismas, comprende uno o más residuos de carbohidratos. La producción incipiente de proteínas in vivo puede experimentar mayor procesamiento, conocido como modificación post-traslacional. En particular, los residuos de azúcares (glicosilo) pueden ser agregados enzimáticamente, un proceso conocido como glicosilación . Las proteínas resultantes que contienen cadenas laterales de oligosacárido enlazadas covalentemente son conocidas como proteínas glicosiladas o glicoproteínas. La glicosilación de las proteínas depende de la secuencia de más de la proteína de interés, así como de las células hospederas en las cuales se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glicosilación (por ejemplo, glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen diferentes sustratos (azúcares de nucleótido) disponibles. Debido a tales factores, el patrón de glicosilación, y la composición de los residuos de glicosilo, pueden diferir dependiendo del sistema hospedero en el cual se expresan las proteínas. Los residuos de glicosilo útiles en la descripción pueden incluir, pero no se limitan a, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. En una modalidad, las proteínas de enlace glicosiladas comprenden residuos de glicosilo de modo tal que el patrón de glicosilación es humano.
Es conocido por aquellas personas experimentadas en la técnica que una glicosilación diferente de las proteínas puede resultar en diferentes características de las proteínas. Por ejemplo, la eficacia de las proteínas terapéuticas producidas en micoorganismos hospederos, tales como levaduras, y glicosiladas utilizando la vía endógena de las levaduras puede ser reducida en comparación con la de las mismas proteínas expresadas en cél ulas de mam íferos , tales como la línea de cél ulas CHO. Tales glicoproteínas pueden ser i nm unogén icas en los humanos y muestran vida media reducida in vivo después de la adm inistración . Los receptores específicos en los humanos y otros animales pueden reconocer residuos de glicosi lo específicos y promueven la depuración rápida de las proteínas del flujo sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambio en el plegamiento de las proteínas, su solubilidad , susceptibilidad a las proteasas, trafico, transporte, compartimentación, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores , antigenicidad , o alergen icidad . Por consiguiente, los médicos pueden preferir una proteína terapéutica con una composición y u n patrón de glicosilación específicos, por ejemplo, la com posición y el patrón de glicosilación idénticos, o al menos similares a aquellos producidos en las células humanas en las células específicas de la especie de los animales objetivo deseados.
Expresar proteínas glicosi ladas disti ntas a aquellas de las células hospederas se puede lograr modificando genéticamente las células hospederas para que expresen enzimas de glicosilación heterólogas. Usando las técn icas conocidas en la técnica , los médicos pueden generar anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos que exhiben glicosilacion de proteínas humanas. Por ejemplo, las cepas de levadura han sido modificadas genéticamente para expresar enzimas de glicosilacion de formación no natural, de modo tal que las proteínas glicosiladas (glicoproteínas) producidas en estas cepas de levaduras exhiben glicosilacion de proteínas idéntica a aquella de las células animales, en especial de las células humanas (Patentes norteamericanas Nos. 7,449,308 y 7,029,872).
Además, se apreciará por aquellas personas experimentadas en la técnica que una proteína de interés puede ser expresada usando una genoteca de células hospederas modificadas por ingeniería genética para expresar varias enzimas de glicosilación, de modo tal que las células hospederas miembros de la genoteca producen la proteína de interés con patrones de glicosilación variantes. Los médicos pueden seleccionar y aislar la proteína de interés con patrones de glicosilación particularmente novedosos. En una modalidad, las proteínas que tienen un patrón de glicosilación novedoso seleccionado particularmente exhiben propiedades biológicas mejoradas o alteradas.
IV. Usos de las Proteínas de enlace a TNF-a Dada su habilidad para enlazarse al TNF-a humano, por ejemplo, las proteínas de enlace al TNF-a, o las porciones de las mismas, descritas aquí, pueden ser usadas para detectar el TNF-a (por ejemplo en una muestra biológica, como por ejemplo en un ensayo inmunosorbente enlazado a una enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejidos. Se proporciona un método para detectar el TNF-a en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con una proteína de enlace o enlazar una porción de la proteína, descrita aquí y detectar, ya sea la proteína de enlace (o la porción de la proteína de enlace) enlazada al TNF-a o la proteína de enlace (o la porción de la proteína de enlace) no enlazada, para detectar por ello el TNF-a en la muestra biológica. Las proteínas de enlace se etiquetan directamente o indirectamente con una sustancia deseada, para facilitar la detección de los anticuerpos enlazados o no enlazadas. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotinas; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescenina, isobiotiocianato de fluoresceína, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 3H , 14C, 35S, 90Y, "Te, 1 1 1 ln, 125l , 1 31 l , 1 77Lu, 166Ho, o 153Sm.
Alternativamente al etiquetado de las proteínas de enlace, el TNF-a humano puede ser analizado en fluidos biológicos mediante inmunoensayo de competición utilizando estándares de rhTNF-a etiquetados con una sustancia detectabie y una proteína de enlace a TNF-a humano, no etiquetada. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares de rhTNF-a etiquetados y la proteína de enlace a TNF-a humano se combinan y se determina la cantidad del estándar de rhTNF-a etiquetado enlazado a la proteína de enlace no etiquetada. La cantidad de TNF-a humano en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad del estándar de rhTNF-a etiquetado enlazado a la proteína de enlace de TNF-a. De forma similar, el TNF-a humano también puede ser ensayado en fluidos biológicos mediante inmunoensayos de competición utilizando estándares de rhTNF-a etiquetados con una sustancia detectable y una proteína de enlace a TNF-a humano, no etiquetada.
En una modalidad las proteínas de enlace y las porciones de las proteínas de enlace descritas aquí son capaces de neutralizar la actividad del TNF-a, por ejemplo la actividad el TNF-a humano, tanto in vitro e in vivo. En otra modalidad, las proteínas de enlace y las porciones de proteínas de enlace descritas aquí son capaces de aumentar o agonizar la actividad el TNF humano, por ejemplo, la actividad el TNF-a humano. Por consiguiente, tales proteínas de enlace y las porciones de las proteínas de enlace descritas aquí pueden ser usadas para la inhibir o aumentar la actividad del TNF-a, por ejemplo, en un cultivo de células que contiene hTNF-a, en sujetos humanos o en otros sujetos mamiferitos que tienen TNF-a con el cual las proteínas de enlace descritas aquí reaccionan de forma cruzada. De una modalidad , se proporciona un método para inhibir o aumentar la actividad del TNF-a que comprende poner en contacto el hTNF-a con una proteína de enlace o porciones de la proteína de enlace descritas aquí de modo tal que la actividad del hTN F-a se inhibe o se incrementa. Por ejemplo, en un cultivo de células que contiene, o que se sospecha que tiene hTNF-a, una proteína de enlace o porciones de las proteínas de enlace descritas aquí pueden ser agregadas al medio de cultivo para inhibir o aumentar la actividad del hTNF-a en el cultivo.
En otra modalidad , se proporciona un método para reducir o aumentar la actividad del hTNF-a en un sujeto, ventajosamente de un sujeto que sufre de una enfermedad o trastorno en el cual la actividad del TNF-a es perjudicial o, alternativamente, benéfica. Se proporcionan métodos para reducir o aumentar la actividad del TNF-a en un sujeto que sufre de tal enfermedad o trastorno, los cuales métodos comprenden administrar al sujeto una proteína de enlace o una porción de la proteína de enlace descrita aquí de modo tal que la actividad del TNF-a en el sujeto se reduce o se incrementa. En modalidades particulares, el TNF-a es TNF-a humano y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa un TNF-a al cual se pueden enlazar las proteínas de enlace, aún más, el sujeto puede ser un mamífero en el cual ha sido introducido el TNF-a (por ejemplo, mediante la administración de un TNF-a o mediante expresión de un transgen de TNF-a). Una proteína de enlace descrita aquí puede ser administrada a un sujeto humano con propósitos terapéuticos. Además, una proteína de enlace descrita aquí puede ser administrada a un mamífero o humano que expresa un TNF-a con el cual se pueden enlazar las proteínas de enlace, con propósitos veterinarios, o como un modelo animal de enfermedades humanas. Con relación a lo anterior, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de las proteínas de en lace descritas aquí (por ejemplo, eval uar las dosis y la evolución temporal de la administración).
El término "trastorno en el cual la actividad del TN F-a es perjudicial" incluye las enfermedades y otros trastornos en los cuales se ha demostrado que o se sospecha que, la presencia de la actividad del TN F-a en un sujeto que sufre del trastorno, es ya sea responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye al em peoram iento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad del TN F-a es perjud icial es un trastorno en el cual se espera q ue la reducción en la activas del TNF-a alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Tales trastornos pueden ser evidenciados, por ejemplo, por un aumento en la concentración del TNF-a en un fluido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración del TN F-a en el suero, el plasma , el fluido sinovial , etc. , del sujeto) , el cual puede ser detectado , por ejem plo, usando un anticuerpo anti-TN F-a como se describe anteriormente . Los ejem plos no lim itantes de trastornos que pueden ser tratados con las proteínas de enlace descritas aquí incl uyen aquellos trastornos d iscutidos en la sección sig uiente, que se relaciona con las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos descritos aqu í .
Alternativamente, el término "un trastorno en el cual la actividad del TN F-a es benéfica" incluye las enfermedades y otros trastornos en los cuales se ha demostrado o se sospecha que, la presencia del TN F-a es benéfica para tratar la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye al tratamiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad del TNF-a es benéfica es un trastorno en el cual se espera que un aumento en la actividad del TNF-a alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Los ejemplos no limitantes de trastornos que pueden ser tratados con los anticuerpos descritos aquí incluyen aquellos trastornos discutidos en la sección siguiente relacionada con las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos descritos aquí.
V. Composiciones Farmacéuticas También se proporcionan las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de enlace, o las porciones de enlace al antígeno de las mismas, descritas aquí, y un portador aceptable farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de enlace descritas aquí son para usarse en, pero sin limitarse a, el diagnóstico, detección, o monitoreo de un trastorno, para evitar, tratar, manejar, o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, y/o en la investigación. En una modalidad específica una composición comprende una o más proteínas de enlace descritas aquí. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una o más proteínas de enlace escritas aquí y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos a las proteínas de enlace descritas aquí, para tratar un trastorno en el cual la actividad del TNF-a es perjudicial. En una modalidad particular, los agentes profilácticos o terapéuticos conocidos por ser útiles para o que han sido o actualmente se usan en la prevención, tratamiento, manejo, o alivio de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estas modalidades, la composición puede comprender además un portador, diluyente o excipiente.
Las proteínas de enlace y las porciones de enlace de las proteínas descritas aquí pueden ser incorporadas en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Típicamente, las composiciones farmacéuticas comprenden proteínas de enlace o porciones de enlace de las proteínas de enlace descritas aquí y un portador aceptable farmacéuticamente. El término "portador aceptable farmacéuticamente" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y los similares que sean compatibles fisiológicamente. Los ejemplos de los portadores aceptables farmacéuticamente incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y los similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en las composiciones, pueden ser incluidos. Los portadores aceptables farmacéuticamente pueden comprender además, cantidades pequeñas de sustancias auxiliares, tales como agentes de humectación o emulsión, conservadores o amortiguadores, los cuales aumentan la vida media de almacenamiento o la efectividad de las proteínas de enlace o de las porciones de las proteínas de enlace.
Varios sistemas de administración se conocen y pueden ser usados para administrar una o más de las proteínas de enlace descritas aquí, o la combinación de una o más proteínas de enlace descritas aquí, y agentes profiláctico o agentes terapéuticos útiles para prevenir, manejar, tratar, o aliviar los trastornos o uno o más síntomas de los mismos, por ejemplo, encapsulación en liposomas, macropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar las proteínas de enlace o los fragmentos de las proteínas de enlace, endocitosis mediada por receptores (véase, por ejemplo, Wu y Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral y otros vectores, etc. los métodos para administrar los agentes profilácticos o terapéuticos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, la administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral, y administración por las mucosas (por ejemplo, intranasal u otras rutas). Además, la administración pulmonar puede ser empleada, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de formación de aerosol. En una modalidad, una proteína de enlace descrita aquí, la terapia de combinación, o una composición descrita aquí, se administran usando la tecnología de administración pulmonar de fármacos AIR® de Alkermes (Alkermes, Inc. Cambridge. Mass). En una modalidad especifica, los agentes profilácticos o terapéuticos descritos aquí se administran de forma intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar, y subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden ser administrados mediante una ruta conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal de intestinal, etc.) y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos descritos aquí, localmente en el área en necesidad de tratamiento; esto puede ser logrado por ejemplo, no a modo de limitación, mediante infusión local, mediante inyección, o por medio de un implante, dichos implantes que son de un material poroso o no poroso, que incluye membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®), o matrices de colágeno. En una modalidad , una cantidad efectiva de uno o más antagonistas de las proteínas de enlace descritas aquí, se administra localmente en el área afectada a un sujeto, para prevenir, tratar manejar, y/o aliviar un trastorno o los síntomas del mismo. En otra modalidad , una cantidad efectiva de una o más proteínas de enlace descritas aquí, se administra localmente en el área afectada de un sujeto, en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos a los anticuerpos descritos aquí, para prevenir, tratar, manejar, y/o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.
En una modalidad específica, donde la composición descrita aquí es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para promover la expresión de un agente profiláctico o terapéutico, al construirlo como parte de un vector de expresión de ácidos nucleicos apropiado, y administrarlo, de modo tal que este se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase la Patente Norteamericana No. 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo con macropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, DuPont), o revestimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección , o administrándolo en un enlace con un péptido similar a homeobox el cual se conoce por entrar en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al. , (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1 864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro del DNA de las células hospederas para la expresión por recombinación homologa.
El método descrito aquí puede comprender la administración de una composición formulada para administración parenteral por inyección (por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en formas de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampolletas o en recipientes dosis múltiples) con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, los ingredientes activos pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de piógenos) antes del uso.
Los métodos descritos aquí pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden ser administradas mediante implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Asi, por ejemplo, las composiciones pueden ser formuladas con materiales polímeros o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados bastante solubles (por ejemplo, como una sal bastante soluble).
Los métodos descritos aquí abarcan la administración de composiciones formuladas con formas neutras o salinas. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etcétera y aquellos formados con cationes tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
Por lo general, los ingredientes de las composiciones se suministran ya sea por separado o mezclados en formas de dosificación unitarias, por ejemplo, como polvo seco liofilizado o concentrados anhidros en un recipiente sellado herméticamente, tales como ampolletas o sobres que indican la cantidad los agentes activos. Cuando el modo de administración es por infusión, la composición puede ser distribuida con una botella de infusión que contiene agua o solución salina grado farmacéutico, estéril. Cuando el modo de administración es mediante inyección, se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina puede de modo tal que los ingredientes puedan ser mezclados antes de la administración.
En particular, también se proporcionan uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas descritas aquí se empacan en recipientes sellados herméticamente, tales como ampolletas o bolsitas que indican la cantidad del agente. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas descritas aquí se suministran como polvo seco estéril , liofilizado, o concentrado anhidro, en recipientes sellados herméticamente y pueden ser reconstituidas (por ejemplo, con agua o solución salina) , a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas descritas aquí se suministran como un polvo seco estéril, liofilizado, en recipientes sellados herméticamente, en una unidad de dosificación de al menos 5 mg, al menos 10 mg, al menos 1 5 mg, al menos 25 mg, al mapos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg, o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas liofilizados descritos aquí, deben ser almacenados a temperaturas de entre 2°C y 8°C en su recipiente original, y los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas descritas aquí, deben ser administrados en un periodo de 1 semana, un periodo de 5 días, un periodo de 72 horas, un periodo de 48 horas, un periodo de 24 horas, un periodo de 12 horas, un periodo de 6 horas, un periodo de 5 horas, un periodo de 3 horas, o un periodo de 1 hora después de ser reconstituidos. En una modalidad alternativa, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas, descritos aquí, se suministran en forma líquidas en recipientes sellados herméticamente que indican la cantidad y la concentración de los agentes. En una modalidad, la forma líquidas de las composiciones administradas se suministra en recipientes sellados herméticamente con una concentración de al menos 0.25 mg/ml, al menos 0.5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2.5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, o al menos 100 mg/ml. Las formas líquidas deben ser almacenadas a una temperatura de entre 2°C y 8°C en su recipiente original.
Las proteínas de enlace y las porciones de las proteínas de enlace descritas aquí pueden ser incorporadas en una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral. En una modalidad, las proteínas de enlace o las porciones de las proteínas de enlace se prepararán como una solución inyectable que contiene 0.1-250 mg/ml de las proteínas de enlace. La solución inyectable puede ser compuesta ya sea de una forma de dosificación líquidas o liofilizada en frascos de vidrio óptico o ámbar, ampolletas o jeringas pre llenadas. El amortiguador puede ser L-histidína (1-50 mM), óptimamente 5-10 mM, a pH 5.0 a 7.0 (óptimamente pH 6.0). Otros amortiguadores adecuados incluyen , pero no se lim itan a succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro de sodio puede ser usado para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 m M (óptimamente 1 50 m M para una forma de dosificación líquida) . Los crioprotectores pueden ser incl uidos para una forma de dosificación liofilizada, principal mente sacarosa al 0- 10% (óptimamente 0.5-1 .0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Los agentes de carga pueden ser inclu idos para las formas de dosificación liofilizadas, principalmente 1 - 1 0% de manitol (óptimamente 2-4%) . Los estabilizadores pueden ser usados tanto en formas de dosificación , líquidas y l iofilizadas, principalmente L-Metionina 1 -50 m M (óptimamente 5- 1 0 m M). Otros agentes de carga adecuados incluyen glicina , arginina , y pueden ser incluidos como 0-0.05% de polysorbate-80 (óptimamente 0.005-0.01 %). Los surfactantes adicionales incluyen, pero no se limitan a los surfactantes polysorbate 20 y BRIJ .
Las com posiciones típicas están en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como com posiciones sim ilares a aquellas usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. Las com posiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución , microemulsión , dispersión , liposomas, u otras estructuras adecuadas para concentraciones de fármacos altas. Las soluciones estériles inyectables pueden ser preparadas incorporando el com puesto activo (es decir, las proteínas de enlace o las porciones de las proteínas de enlace) en la cantidad requerida, en un solvente apropiado con uno o u na combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requ iera , seguido por esteri lización por filtración . Por lo general , las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de d ispersión básico y los otros ingredientes requeridos de entre aq uellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles , liofilizados, para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y secado por atom ización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquiera de los ingredientes deseados, a partir de una solución estéril filtrada previamente de los mismos. La fluidez apropiada de una solución puede ser mantenida , por ejemplo, mediante el uso de un revestim iento, como por ejemplo lecitina , mediante el mantenimiento del tamaño de partícu la requerido, en el caso de las dispersiones y mediante el uso de surfactantes. La absorción prolongada de composiciones i nyectables puede ser lograda incluyendo, en las composiciones, un agente que retarda la absorción , por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Como se apreciará por los expertos en la técnica, la ruta y/o el modo de adm inistración variaran depend iendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede ser preparado con un portador que protegerá el com puesto contra la liberación rápida, tales formulaciones de l iberación controlada que incluyen im plantes, parches transdérmicos, y sistemas de ad ministración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables , biocompatibles tales como vin il acetato de etileno, polianhídridos, ácido poligl icól ico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poli láctico muchos métodos para la preparación de ta les formulaciones están patentados o se conocen en general por aquel las personas experimentadas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J . R. Robinson , ed . , Marcel Dekker, Inc. , Nueva York, 1 978.
Los com puestos activos suplementarios también pueden ser incorporados en las composiciones. En ciertas moda lidades, una proteína de en lace o porciones de las proteínas de enlace descritas aquí se coformulan con y/o se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son úti les para tratar trastornos en los cuales la actividad del TN F-a es perjudicial . Por ejemplo, un anticuerpo anti-TNF-a o las porciones del anticuerpo descritas aqu í pueden ser coformulados y/o coadm inistrados con uno o más anticuerpos adicionales que se enlazan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se enlazan a otras citosinas o que se enlazan a moléculas de la superficie de las célu las) . Además, u na o más de las proteínas de enlace descritas aqu í pueden ser usadas en com binación con dos o más de los sigu ientes agentes terapéuticos. Tales terapias de combi nación pueden utilizar ventajosamente dosis menores de los agentes terapéuticos administrados, evitándose así las posi bles toxicidades o complicaciones asociadas con las varias monoterapias.
En ciertas modalidades, una proteína de enlace a un TN F-a o un fragmento del m ismo se enlaza con un vehículo q ue extiende la vida madia conocido en la técnica. Tales veh ículos incl uyen , pero no se limitan a , el domin io Fe, polietilenglicol , y dextrano. Tales vehículos se describen, por ejemplo, en la Patente Norteamericana no. 6,660, 843.
En u na modal idad específica, las secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de enlace descrita aqu í u otros agentes profilácticos o terapéuticos descritos aquí , se admi nistran para tratar, prevenir, manejar, o al iviar u n trastorno o u no o más síntomas de los mismos a manera de terapia genética. Terapia genética se refiere a las terapias llevadas a cabo mediante la adm inistración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta modalidad de la descripción , los ácidos nucleicos producen su proteína codificada o los agentes profilácticos o terapéuticos descritos aquí , que intervienen en un efecto profiláctico o terapéutico.
Cualquiera de los métodos para la terapia genética , disponibles en la técnica puede ser usado de acuerdo con la presente descripción .
El TN F-a desempeña una función critica en la patología asociada con una variedad de enfermedades que i nvolucran elementos inmunológ icos e inflamatorios, tales como enfermedades autoinmunes, en particu lar aquellas asociadas con la inflamación , incluyendo la enfermedad de Croh n , psoriasis (incluyendo psoriasis en placas) , artritis (incluyendo artritis reumatoide , artritis psoriásica , osteoartritis, o artritis idiopática juvenil) , esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistém ico, y espondilitis anquilosante. Por lo tanto, las proteínas de enlace de este documento pueden ser usadas para tratar estos trastornos. En otra modalidad, es trastorno es un trastorno respiratorio; asma, asma alérgica y no alérgica; asma debida a infecciones; asma debida a infecciones con virus respiratorio sincitial (RSV); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una condición que involucra inflamación de las vías aéreas; eosinofilia; fibrosis y producción excesiva de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición inflamatoria y/o autoinmune de la piel; una condición inflamatoria y/o autoinmune de los órganos gastrointestinales; enfermedades inflamatorias intestinales (IBD); colitis ulcerosa; una condición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática; fibrosis hepática provocada por el virus de hepatitis B y/o C, tumores o cánceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma de Hodgkin; una infección viral; una infección bacteriana; una infección parasitaria; infección por HTLV-1; supresión de la expresión de respuestas inmunes protectoras de tipo 1; supresión de la expresión de una respuesta inmune protectora de tipo 1 durante la vacunación, enfermedades neurodegenerativas, regeneración neuronal; y lesiones de la medula espinal.
Será fácilmente aparente para aquellas personas experimentadas en la técnica que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de los métodos descritos aquí pueden ser hechas usando los equivalentes adecuados sin apartarse del ámbito de la invención o las modalidades descritas aquí. Habiéndose descrito en detalle la presente invención, la misma será entendida más claramente haciendo referencia a los siguientes ejem plos , los cuales se incluyen con propósitos de ilustración solamente y no tienen la i nvención de ser lim itantes de la invención.
Ejem plos Ejemplo 1 : Identificación de los anticuerpos completamente humanos para TN F mediante sistemas de expresión in vitro 1 .1 Selección de anticuerpos Los anticuerpos monoclonales de TN F anti-humano, completamente humanos, se aislaron mediante tecnolog ías de expresión in vitro, a partir de genotecas de anticuerpos humanos, por su habilidad para enlazarse a proteínas de TN F humanas recom binantes. Las secuencias de am inoácidos de las cadenas pesada variable (VH) y l igera variable (VL) se determinaron por secuenciación de DNA y se listan en la Tabla 10.
Tabla 10. Secuencias de los clones individuales 1.2 Maduración por afinidad del anticuerpo de TNF anti-humano, completamente humano, AE11-5 El anticuerpo humano AE11-5 para el TNF humano se sometió a maduración por afinidad mediante tecnologías de expresión in vitro. Se construyó una genoteca de cadena ligera para contener mutagénesis limitadas en los siguientes residuos: 28, 31, 32, 51, 55, 91, 91, 93, 95a, y 96 (numeración de Kabat). Esta genoteca también contenía las retro-mutaciones de línea germinal del marco D1E, M4L, H11Q, R49K, H76N y Q103K así como residuos conmutados en la posición 50(R/K) y 94 (S/L) para permitir la transformación a la línea germinal del marco durante las selecciones de la genoteca. Se construyeron dos genotecas de la cadena pesada para contener mutagénesis limitada en la CDRH1 y la CDRH2 en los residuos 30, 31, 33, 50, 52, y 55 a 58 (numeración de Kabat) o en CDRH3 en los residuos 95 a 100b. Las genotecas que contenía las diversidades de CDRH1 y CDRH2 también tenían retro-mutaciones de línea germinal del marco A18V y L64Q y residuos conmutados en 54(L/F) y 78(V/A). La genoteca de CDRH3 tenía un residuo conmutado adicional en 100c(A/F).
Las tres genotecas se seleccionaron por separado por su habilidad para enlazarse antígenos de TNF humano o de monos cynomolgus. Todas las secuencias de CDR mutadas recuperadas de las selecciones de las genotecas se recombinaron en genotecas adicionales y las genotecas recombinadas se sometieron a condiciones de selección más severas antes que se identificaran los anticuerpos individuales.
La Tabla 11 proporciona una lista de las secuencias de aminoácidos de las regiones VH de anticuerpos de TNF completamente madurados por afinidad, derivados de AE 1 1 -5. Los residuos de aminoácidos de las CDRs individuales de cada secuencia de VH se indican en negritas.
Tabla 11. Lista de las secuencias de aminoácidos de las variantes de AE11-5 VH maduradas por afinidad La Tabla 12 proporciona una lista de las secuencias de aminoácidos de las regiones VL de anticuerpos de TNF completamente humanos, madurados por afinidad, derivados de AE1 1 -5. Los residuos de aminoácidos de las CDRs individuales de cada secuencia VH están indicadas en negritas.
Tabla 12. Lista de las secuencias de aminoácidos de las variantes de AE11-5 VL maduradas por afinidad Tabla 13. Residuos de aminoácidos observados en los anticuerpos AE1 1 -5 madurados por afinidad Región variable de la cadena pesada de AE11-5 (SEC ID NO: 1073) AE11-5VH 1234567890123456789012345678901234567890123456789012a3 5678901 EVQLVQSGAEVKKPGSSAKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTANYAQ V NW TTT WT FRSPI TY SV M DAST GI P L I NGS AN G V P V F N I H R V A L K R F M L 234567890123456789012abc345678901234567890abcl2345675 390123 KFLGRVTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYDPTRADYWGQGTLVTVSS Q A SVFFNTS F WIVVEFASM TFP TRKP ARH IGRA Q ADI Y V P N G Región variable de la cadena ligera de AE11-5 (SEC ID NO: 1074) AE11-5VL 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901 DIVMTQSPDFHSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLH YQQ PDQSPKLLIRHASQSISGVPSR E L Q R RR KYV L T TT P V N GN T T I NC G S C KG S M G CI E N K HK D K Y VM F W PL R LY P V Tabla 14. Secuencias VH individuales de clones convertidos Tabla 15. Secuencias VL de clones individuales Tabla 16. Clones de scFv madurados por afinidad con AE11-5 convertidos para IgG de longitud completa 1.3 Protocolo del ensayo inmunosorbente enlazado a una enzima (ELISA) y resultados del ensayo El siguiente protocolo se usa para caracterizar el enlazamiento de los anticuerpos de TNF a TNF humano o de cyno biotinilados, por medio del ensayo inmunosorbente enlazado a una enzima (ELISA). Se recubrió una placa de ELISA con 50 µ? por pocilio de IgG-Fc anti humano de cabra a 2pg/ml, durante la noche a 4°C. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50µ? de Mab diluido a *\[¡g/m\ en PBS/ BSA al 0.1% se agregó a los pocilios adecuados y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de biotina-TNF humano diluido serialmente se agregó a los pocilios adecuados y se incubó durante 1 hora a RT. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de estreptavidina-HRP diluida 1:10,000 en PBS/BSA al 0.1% se agregó a los pocilios adecuados y se incubaron durante 1 hora a RT. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de T B se agregaron a los pocilios adecuados y la reacción se dejó continuar durante 1 minuto. La reacción se detuvo con 50 µ?/ pocilio de H2S04 2N y se leyó la absorbancia a 450 nm. Los resultados se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17 1.4 Potencia de neutralización de TNF de los anticuerpos de TNF, por el bioensayo L929 El TNF humano se preparó en Abbott Bioresearch Center (Worcester, Massachussetss, EU) y se recibió de la Farmacia de Productos Biológicos. El TNF de ratón se preparó en Abbott Bioresearch Center y se recibió de la Farmacia de Productos Biológicos. El TNF de rata se preparó en Abbott Bioresearch Center y se recibió de la Farmacia de Productos Biológicos. El TNF se conejo se compró en R&D Systems. El TNF de Rhesus/Macaco (rhTNF) se compró en R&D Systems. La actinomicina se compró en Sigma Aldrich y se resuspendió a puna concentración base de 10 mg/m! en DMSO .
Medio de Ensayo: 10% FBS(Hyclone#SH30070.03), reactivos Gibco: RPMI 1640 (#21870), L-glutamina 2 mM (#25030), 50 unidades/mL de penicilina /50 Mg/mL de estreptomicina (#15140), aminoácidos no esenciales de MEM 0.1 mM (#11140) y 2-mercaptoetanol 5.5 x 10 5 M (#21985-023).
Células L929 se cultivaron a densidad semi-confluente y se recolectaron usando tripsina al 0.05% (Gibco#25300). Las células se lavaron con PBS, se contabilizaron, y se resuspendieron a 1E6 células/mL en medio de ensayo conteniendo 4 pg/ML de actinomicina D. Las células se sembraron en una placva de 96 pozos (Costar#3599) a un volumen de 50 µ? y 5E4 células/pozo. Las células recibieron 50 µ? de medio de ensayo, llevando el volumen a 100 pL.
Una muestra de prueba se preparó como sigue. Las proteínas de IgG de prueba y de control se diluyeron a una concentración 4x en medio de ensayo y se realizaron diluciones seriales 1:3. Las especies de TNF se diluyeron a las siguientes concentraciones en medio de ensayo: 400 pg/mL de huTNF, 200 pg/mL de muTHF, 600 pg/mL de TNF de rata y 100 pg/mL de rabTNF. La muestra de anticuerpos (200 µ?) se agregó al TNF (200 pL) en un esquema de dilución 1:2 y se le permitió incubarse por 0.5 horas a la temperatura ambiente.
Para medir la potencia de neutralización del huTNF en este ensayo, la solución de anticuerpo/TNF se agregó a las células sobre las placas a 100 µ? para una concentración final de 375 nM-0.019 nM. La concentración final del TNF fue la siguiente, 100 pg/mL de huTNF, 50 pg/mL de muTNF, 150pg/ML de rataTNF, y 25 pg/mL de rabTNF. Las placas se incubaron por 20 horas a 37°C, 5% de CO2. Para cuantificar la viabilidad, 100 µ? se removieron de los pozos y se agregaron 10 µ? de reactivo WST-1 (Roche, # de cat.: 11644807001). Las placas se incubaron bajo las condiciones de ensayo por 3.5 horas, se sometieron a centrifugación a 500 x g, y 75 µ? del sobrenadante se transfirió a placas ELISA (Costar, # de cat.: 3369). Las placas se leyeron a un OD de 420-600 nm en un lector de placas ELISA Spectromax 190. La potencia de neutralización de las proteínas de enlace TNF/IL-17 DVD-lg se muestra en la Tabla 18.
Tabla 18 Ejemplo 2: Maduración por afinidad de un anticuerpo de TNF antihumano, humanizado, hMAK-195.
El anticuerpo de TNF anti-humano de ratón, MAK-195, fue humanizado y madurado por afinidad para generar un panel de variantes de MAK195 humanizadas que tenían reactividad cruzada con cyno-TNF y cinética de afinidad y enlace mejorada tanto contra el TNF humano y cyno.
Para mejorar la afinidad del hMAK 195 con el TNF, residuos de CDR hipermadurados se identificaron de entre otras secuencias de anticuerpos humanos en la base de datos IgBLAST que también comparten alta identidad con las líneas germinales VH3-53 e IGKV1-39. Los residuos de hMAK195 CDR correspondientes se sometieron entonces a mutagénesis limitada mediante PCR con cebadores que tienen baja degeneración en estas posiciones, para crear tres genotecas de anticuerpos en el formato scFv. La primera genoteca contenía mutaciones en los residuos 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 56, y 58 en la VH CDR1 y 2 (numeración de Kabat); la segunda genoteca en los residuos 95 a 100, 100a, 101, y 102 en VH CDR3, y la tercera genoteca en los residuos 28, 30, 31, 32, 50, 53, 92, 93, 94, y 95 en las tres VL CDRs. Para aumentar adicionalmente la identidad de hMAK195 con las secuencias de marco de línea germinal humana, se introdujo degeneración binaria en las posiciones de la VH 60 (D/A), 61 (S/D), 62 (T/S), 63 (L/V), y 65 (S/G). En la primera genoteca También se introdujo degeneración binaria en las posiciones de VL 24 (K/R), 33 (V/L), 54 (R/L), 55 (H/Q), 56 (T/S), 91 (H/S), y 96 (F/Y), en la tercera genoteca.
Estas variantes de hMAK195 se seleccionaron contra una concentración baja de TNF biotiniladas por la velocidad de asociación, velocidad de disociación, mejoradas, o ambas se llevaron a cabo y las secuencias de proteína del anticuerpo de hMAK195 modulado por afinidad se recuperaron para convertirlas de nuevo a IgG para su caracterización posterior. Las tres genotecas se seleccionaron por separado en cuanto a su habilidad para enlazarse al TNF humano o de monos cynomolgus, en presencia de concentraciones decrecientes de antígenos de TNF humano o de mono cynomolgus biotinilados. Todas las secuencias de CDR mutadas recuperadas por las selecciones de las genotecas se recombinaron en genotecas adicionales y las genotecas recombinadas se sometieron a condiciones de selección más severas antes de la identificación de los anticuerpos individuales.
La Tabla 19 proporciona una lista de las secuencias de aminoácidos de VH y VL del MAK-195 humanizado, las cuales se sometieron al protocolo de selección por maduración de afinidad. Los residuos de aminoácidos de las CDRs individuales de cada secuencia de VH y VL se ind ican en negritas.
Tabla 1 9. Lista de las secuencias de aminoácidos de las variantes de hMAK1 95 VH maduradas por afinidad La Tabla 20 proporciona una lista de las secuencias de aminoácidos de las regiones de VL de anticuerpos de TNF com pletamente hu manos, mad urados por afinidad , derivados de h AK195. Los residuos de aminoácidos de las CDRs individuales de cada secuencia de VH se i ndican en negritas.
Tabla 20. Lista de las secuencias de aminoácidos de las variantes de hMAK1 95 VL maduradas por afinidad Tabla 21. Residuos de aminoácidos observados en el hMAK-195 madurado por afinidad Las ta blas siguientes proporcionan una lista de los anticuerpos MAK-1 95 hu manizados los cuales se convirtieron proteínas de IgG para su caracterización.
Tabla 22. Secuencias de VH de los clones convertidos en IgG Tabla 23. Secuencias de VL de los clones convertidos en IgG Tabla 24. Pares de cadena pesada y ligera de los clones madurados por afinidad hMAK195 2.1 Resultados del ensayo Inmunosorbente enlazado a una enzima Tabla 25 2.2 Potencia de neutralización de los anticuerpos de TNF por el bioensayo L929 Tabla 26 Ejemplo 3: Maduración por afinidad de un anticuerpo de TNF antihumano, humanizado, hMAK-199 El anticuerpo de TN F anti-humano de ratón, MAK-199, fue humanizado y madurado por afinidad para generar un panel de MA195 humanizado que tenía afinidad y cintica de enlace mejorada contra el TNF-a tanto de humano y de cyno. Se construyeron varias genotecas de acuerdo con las siguientes especificaciones: Se construyeron tres genotecas de HC después que se introdujo primero la retro-mutación V2I y se confirmó que esta no tenía afectaba la afinidad del scFv para el TNF.
Genoteca H 1 +H2(DDK): - Mutagénesis limitada en 7 residuos (T30, N31 , N35, T52a, T54, E56, T58) - Conmutaciones de la línea germinal: M34I y F63L Genoteca H 1 +H2 (QKQ) : - Mutagénesis limitada en 7 residuos (T30, N31 , N35, T52a, T54, E56, T58) - Conmutaciones de la línea germinal: M34I y F63L - retro-mutaciones de la línea germinal: D61 Q, D62K, K64Q, F67V, F569M , L71 T Genoteca H3: - Mutagénesis limitada en 12 residuos 95-1 00, 1 00a-100f - Conmutación de la línea germinal: F91 Y Genoteca LC: genoteca - Mutagénesis limitada en 1 1 residuos, 28, 30-32, 50, 53, - Conmutaciones de la Línea germinal : T51 A, Y71 F, F87Y, y T43A/V44P (estos dos co-evolucionan) Genotecas Recom binantes: Las genotecas de VH se recombinaron con y sin la genoteca de VL después q ue la diversidad de las genoteca se redujo después de al menos 3 rondas de selección .
Las cuatro genotecas se seleccionaron por separado en cuanto a su habilidad para enlazar el TN F humano o de monos cynomolgus en presencia de concentraciones decrecientes de antígenos biotinilados de TN F, humanos o de monos cynomolgus. Todas las secuencias de CDR mutadas recuperadas de las selecciones en las genotecas se recom binaron en genotecas adicionales y las genotecas recombi nadas se sometieron a condiciones de selección más severas antes que se identificaran los anticuerpos ind ividuales.
La Tabla 27 proporciona una lista de las secuencias de aminoácidos de VH del anticuerpo h MAK- 199, las cuales se sometieron al protocolo de selección por maduración de afinidad . Los residuos de aminoácidos de las CDRs individuales de cada secuencia de VH se indican en negritas.
Tabla 27. Lista de secuencias de aminoácidos de variantes de hMAK-199 VH maduradas por afinidad La Tabla 28 proporciona una lista de secuencias de aminoácidos de las regiones VL de anticuerpos de TN F completamente humanos, madurados por afinidad , derivados de hMAK- 1 99. Los residuos de am inoácidos de las CDRs individuales de cada una de las secuencias VL se indican en negritas.
Tabla 28. Lista de secuencias de aminoácidos de variantes de hMAK-199 VL maduradas por afinidad Tabla 29. Residuos de aminoácidos observados en los anticuerpos hMAK-199 madurados por afinidad Región variable de la cadena pesada de MAK199 (SEC ID NO: 1077) MAK199VH. 123 567890123456789012345678901234567890123 56789012a345678901 2a EIQLVQ3GAEVKKPGASVKVSC ASGYTFTNYGMN VRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYAD V ND II N K S Q AH T S V H ST Q Q N RS S R M DQ G L K KK A S A P V N R Q I Q M D D G A E 234567890123456789012abc345678901234567890abcdefgl234567890123 DFKGRFTFTLDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFLTT WTDYAMDYWGQGTTVTVSS GLT V M T Y RLFNPMDASENT K Q NYMKVEAEM SR VSRARSD H CWL IMG D QP QII I VF GPQ F ND D P V GM N L CA L A H Región variable de la cadena ligera de MA 199 (SEC ID NO: 1078) Makl99Vk.la 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYmWYQQKPGKTVKLLIYYTSRLQSGVPSR N YQV AP FA L E ESF V N K H AKT G G TT V H R GD A NR F C 234567890123456789012345678901234567890123456a FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPPTFGQGTKLEI P Y ISW T Q S IP A AM RR F G V Y A Tabla 30. Secuencias individuales de hMAK-199 VH de clones convertidos Tabla 31. Secuencias de VL de clones hMAK-199 individuales Tabla 32. Clones de scFv madurados por afinidad, hMAK-199, convertidos a IgG de longitud completa 3.1 Resultados del ensayo inmunosorbente enlazado a una enzima Tabla 33. IgG de longitud completa, madurada por afinidad a hMAK199 3.2 Potencia de neutralización del TN F por los anticuerpos de TNF por bioensayo L929 Tabla 34.
Ejem plo 4 Ejemplo 4.4: Determinación de la Afinidad Usando la Tecnología Biacore Tabla 35: Reactivo para el Análisis Biacore Métodos de BIACORE: El ensayo BIACORE (Biacore, Inc. Piscataway, NJ) determina la afinidad de las proteínas de en lace con mediciones cinéticas de las constantes de velocidad de asociación y de velocidad de disociación . El enlazam iento de las proteínas de enlace a un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno recombinante purificado, objetivo) de determina por mediciones basadas en resonancia de plasmón superficial con un instrumento Biacore® 1000 o 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia) usando HBS-EP circulante HEPES 10 mM [pH 7.4], NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, y 0.005% de surfactante P20) a 25 °C. Todas las sustancias químicas se obtienen de Biacore® AB (Uppsala, Suecia) o de lo contrario de una fuente diferente como se describe en el texto. Por ejemplo, aproximadamente 5000 RU de IgG anti-ratón de cabra (Fcy), anticuerpo policlonal específico del fragmento (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, III, EU) diluido en acetato de sodio 10 mm (pH 4.5) se inmoviliza directamente sobre un circuito integrado biodetector usando un equipo de acoplamiento de amina estándar, de acuerdo con las instrucciones y los procedimientos del fabricante, a 25 g/ml. Las porciones que no reaccionan sobre la superficie del biodetector se bloquean con etanolamina. La superficie de carboximetil dextrano modificado en flowcell 2 y 4, se usa como una superficie de reacción. El carboximetil dextrano no modificado sin IgG anti-ratón, de cabra en Flow cell 1 y 3 se usa como la superficie de referencia. Para el análisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de enlace de Langmuir 1:1 se resuelven simultáneamente para las fases de asociación y disociación de las ocho inyecciones (usando análisis de resolución global) con el uso del programa Bioevaluation 4.0.1. Los anticuerpos purificados se diluyen en solución salina amortiguada con HEPES para su captura sobre las superficies de reacción específicas de la IgG anti-ratón, de cabra. Los anticuerpos a ser capturados como un ligando (25 pg/ml) se inyectan a través de matrices de inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto. Las constantes de velocidad de asociación y disociación, ka Soc¡ac¡ón (M 1 s 1 ) y kd¡sociac¡ón (s 1 ) se determinan bajo una velocidad de flujo constante de 25 µ?/minuto. Las constantes de velocidad se derivan realizando mediciones cinéticas de enlace a diferentes concentraciones del antígeno desde 10-200 nM . La constante de disociación de equilibrio (M) de la reacción entre los anticuerpos y el antígeno objetivo se calcula entonces a partir de las constantes cinéticas de velocidad mediante la siguiente formula D= kdf sociac¡6n kasociación- El enlazamiento se registra como una función del tiempo y se calculas las constantes cinéticas de velocidad. En este ensayo, se pueden medir velocidades de asociación tan rápidas como 106 M 1 s" 1 y velocidades de disociación tan lentas como 1 0"6s 1.
Se espera que las proteínas de enlace de este documento tengan propiedades benéficas a este respecto, incluyendo alta afinidad, velocidad de disociación lenta, y alta capacidad de neutralización.
Ejemplo 4.5: Neutralización de TNF-a Humano Células L929 de cultivan a una densidad semi-confluente y se recolectan usando tripsina al 0.25% (Gibco#25300). Las células se lavan con PBS, se contabilizan y se vuelven a suspender a 1 E6 células/mL en medio de ensayo que contiene 4 pg/mL de actinomicina D. Las células se siembran en placas de 96 pozos (costar#3599) a un volumen de 100 pL y 5E4 células/pozo. Las proteínas de enlace y la IgG de control se diluyen a una concentración 4x en medio de ensayo y se llevan a cabo diluciones seriales 1 :4. El huTNF-a se diluye a 400 pg/mL en medio de ensayo. La muestra de proteína de enlace (200 µ?_) se agrega al huTNF-a (200 µ?_) en un esquema de dilución 1 :2 y se le permite incubarse por 0.5 horas a la temperatura ambiente.
La solución de proteína de enlace/TNF-a humano se agrega a las células colocadas en las placas, a 100 pL para una concentración final de 100 pg/mL de huTNF-a y proteína de enlace 1 50 nM-0.0001 nM. Las placas se incuban por 20 horas a 37°C, 5% de CO2. Para cuantificar la viabilidad, 100 µ? se extrae de los pozos y se agregan 10 pL del reactivo WST-1 (# de Cat de Roche 1 1644807001 ). Las placas se incuban bajo las condiciones del ensayo por 3.5 horas. Las placas se leen a OD 420-600 nm en un lector de placas ELISA Spectromax 1 90.
Se espera que las proteínas de enlace de este documento tengan propiedades benéficas a este respecto, incluyendo alta afinidad, velocidad de disociación lenta, y alta capacidad de neutralización.
Ejemplo 4.6: Tratamiento Un paciente que requiere tratamiento con una proteína de enlace a TNF-a puede tener una enfermedad con elementos inmunológicos e inflamatorios, tales enfermedades autoinmunes, en particular aquellas asociadas con la inflamación , incluyendo la enfermedad de Crohn, psoriasis (incluyendo psoriasis en placas), artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis psoriásica, osteoartritis, o artritis idiopática juvenil), esclerosis múltiple, y espondilitis anquilosante. Por lo tanto, las proteínas de enlace de este documento pueden ser usadas para tratar estos trastornos.
La adm inistración de las proteínas de enlace a TN F-a puede ocurrir por inyección subcutánea. Si el paciente tiene artritis reumatoide, artritis psoriásica, o espondilitis anqu ilosante, el paciente puede recibir 40 mg cada dos semanas como una dosis inicial y 40 mg cada semana , si es necesario para lograr los objetivos del tratamiento. Si el paciente tiene artritis idiopática juvenil y pesa desde 1 5 kg a < 30 kg , el paciente puede recibir 20 mg cada dos semanas, y si pesa = 30 kg , 40 mg cada dos semanas . Si el paciente tiene la enfermedad de Crohn , el paciente puede recibir una dosis inicial de 1 60 mg (cuatro inyecciones de 40 mg en un d ía o dos inyecciones de 40 mg por día dos d ías consecutivos) seguido por 80 mg dos semanas después, y otras dos semanas después comenzar una dosis de mantenim iento de 40 mg cada dos semanas. Si el paciente tiene psoriasis en placas , el paciente puede recibir una dosis inicial de 80 mg, seg uido por 40 mg cada los semanas comenzando una semana después de la dosis in icial .
Las proteínas de enlace pueden ser proporcionadas en una pluma pre-llenada de uso i ndividual (40 mg/0.8 m L) , una jeringa de vidrio pre-llenada de uso individual (40 mg/0.8 m i o 20 mg/0.4 m L) .
Incorporación como referencia Los conten idos de todas las referencias citadas (incluyendo las referencias de la literatura , patentes, solicitudes de patente, y sitios de red) que se citan a través de esta sol icitud , se incorporan expresamente como referencia en su totalidad , como son las referencias citadas aquí. La práctica descrita aquí empelará a menos que se indique de otra manera, las técnicas convencionales de la inmunología, la biología molecular, y la biología celular, las cuales son bien conocidas en la técnica.
Equivalentes La invención puede ser implementada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o las características esenciales de la misma. Las modalidades anteriores deben ser consideradas por lo tanto en todo aspecto como ilustrativas más bien que como limitantes de la invención descrita aquí. El alcance de la invención se indica por lo tanto por las reivindicaciones anexas, más bien que por la descripción anterior, y todos los cambios que estén dentro del significado y el rango de equivalencia de las reivindicaciones deben estar abarcados por lo tanto en la misma.

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de enlace que comprende al menos una región variable de la cadena pesada (región VH), caracterizada porque comprende: (a) las tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de las SEC ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077; o (b) cualquiera de las SEC ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077.
2. Una proteína de enlace que comprende al menos una región variable de cadena ligera (región VL), caracterizada porque comprende: (a) las tres regiones determinantes de complementariedad de cualquiera de las SEC ID NOs: 23, 35, 27, 29, 31, 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1072, 1074, 1076 y 1078; o (b) cualquiera de las SEC ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1072, 1074, 1076 y 1078.
3. Una proteína de enlace que comprende al menos una región variable de cadena pesada (región VH) y al menos una región variable de cadena ligera (región VL), caracterizada porque, la región VH comprende: (a) tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de las SEC ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 92-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077; y (b) cualquiera de las SEC ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077; y la región VL comprende: (c) tres CDRs de cualquiera de las SEC ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1963-1072, 1074, 1076 y 1078; o (d) cualquiera de las SEC ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1072, 1074, 1076 y 1078.
4. La proteína de enlace de la reivindicación 3, caracterizada porque, la proteína de enlace comprende dos regiones VH y dos regiones VL.
5. La proteína de enlace de las reivindicación 3, caracterizado porque, la proteína de enlace comprende al menos una región VH y al menos una región VL que comprende un conjunto de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 22 y 23; 24 y 25; 26 y 27; 28 y 29; 30 y 21; y 32 y 33.
6. La proteína de enlace de la reivindicación 4, caracterizada porque, la proteína de enlace; (a) modula una función biológica del TNF-a; (b) neutraliza el TNF-a; (c) disminuye la habilidad el TNF-a para enlazarse a su receptor; (d) disminuye la habilidad del TNF-a pro-humano, el TNF-a humano maduro; o el TNF-a trucado para enlazarse a su receptor; y/o (e) reduce uno más de: la producción de citosinas dependientes de TNF, la muerte celular dependiente de TNF, la inflamación dependiente de TNF, la erosión del hueso dependiente del TNF, y el daño al cartílago dependiente del TN F.
7. La proteína de enlace de la reivindicación 4, caracterizada porque, la proteína de enlace tiene una constante de velocidad de asociación (Kasociación) de al menos aproximadamente 102 M"1s"\ al menos aproximadamente 1 03 1s 1 ; al menos aproximadamente 104 M 1s"1 ; al menos aproximadamente 1 05 M"V1 ; o al menos aproximadamente 1 06 M"1s"1 ; cuando se mide por resonancia de plasmón superficial.
8. La proteína de enlace de la reivindicación 4, caracterizada porque, la proteína de enlace tiene unas constante de velocidad de disociación (Kdisociación) de a lo máximo aproximadamente 1 0 3s" 1 ; a lo máximo aproximadamente 10"4s 1 ; a lo máximo aproximadamente 1 0 5s 1 ; y a lo máximo aproximadamente 1 0 6s" \ cuando se mide por resonancia de plasmón superficial.
9. La proteína de enlace de las reivindicación 4, caracterizada porque, la proteína de enlace tiene una constante de disociación (KD) de a lo máximo aproximadamente 107 M; a lo máximo aproximadamente 108 M; a lo máximo aproximadamente 10"9 M; a lo máximo aproximadamente 1010 M; a lo máximo 1011M; y a lo máximo 10-13 M.
10. Una proteína de enlace capaz de enlazarse al TNF-a humano, la proteína de enlace, caracterizada porque, comprende: (a) una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3; (b) una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4 o la SEC ID NO: 5; (c) una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NO: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34-58, 74-83, 94-266, 478-486, 496-675, 738-762, 778-956, 1053-1062, 1073, 1075 y 1077, y (d) una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 59-73, 84-93, 267-477, 487-495, 676-737, 763-777, 957-1052, 1063-1072, 1074, 1076 y 1078.
11. La proteína de enlace de la reivindicación 3, caracterizada porque, comprende una molécula de inmunoglobulina un Fv, un Fv enlazado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un scFv, una proteína de enlace quimérica, una proteína de enlace de dominio único, una proteína de enlace injertada con CDR, un diacuerpo, una proteína de enlace humanizada, una proteína de enlace multiespecífica, un Fab', una proteína de enlace específica doble, un fragmento Fab', una proteína de enlace biespecífica, un fragmento F(ab')2, un DVD-lg™, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra, un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 , un fragmento que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, o una proteína de enlace de cadena sencilla.
12. La proteína de enlace de la reivindicación 4, caracterizada porque, la proteína de enlace se conjuga con un agente de formación de imágenes seleccionado del grupo que consiste de una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bioluminiscente, una etiqueta magnética, y biotina.
13. La proteína de enlace de la reivindicación 4, caracterizada porque, la proteína de enlace comprende además un agente terapéutico o citotóxico, seleccionado del grupo que consiste de un anti-metabolitos, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxinas, un agente apoptótico, y al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el cual el TNF-a es perjudicial.
14. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque, codifica una proteína de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 3.
15. Un vector, caracterizado porque, comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 14.
16. Células hospederas, caracterizadas porque, comprenden el vector de la reivindicación 15.
17. un método para producir una proteína que se enlaza al TNF-a, el método, caracterizado porque, comprende las etapas de cultivar las células hospederas de la reivindicación 16, en un medio de cultivo, bajo las condiciones suficientes para producir una proteína de enlace que se enlaza al TNF-a.
18. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de enlace de la reivindicación 3, y un portador aceptable farmacéuticamente.
19. Un método para tratar a un mamífero, caracterizado porque, comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 18.
20. Un método para reducir la actividad del TNF-a humano, el método, caracterizado porque, comprende poner en contacto el TNF-a humano con la proteína de enlace de la reivindicación 3, de modo tal que la actividad del TNF-a humano se reduce.
21. Un método para reducir la actividad del TNF-a humano en un sujeto humano que sufre de un trastorno en el cual la actividad del TNF-a es perjudicial, el método, caracterizado porque, comprende administrar al sujeto humano la proteína de enlace de la reivindicación 3, de modo tal que la actividad del TNF-a humano, en el sujeto humano, se reduce y/o se logra el tratamiento.
22. un método para tratar a un paciente que sufre de un trastorno en el cual el TNF-a es perjudicial, que comprende administrar al paciente la proteína de enlace de las reivindicación 3, ya sea antes, concurrentemente, o después de la administración al paciente de un segundo agente, caracterizado porque, el segundo agente se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo, o fragmentos del mismo, capaces de enlazarse a IL-12 humano; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RAGE; histamina; un bloqueador del receptor de histamina; bradiquinina; I L-1 alfa; IL-1beta; VEGF; PLGF; metotrexato; un corticosteroide; un modulador del receptor de glucocorticoides; ciclosporina, rapamicina, FK506; y un agente antiinflamatorio no esferoidal.
23. El método de la reivindicación 21 o 22, caracterizado porque, el trastorno es un trastorno autoinmune y/o inflamatorio.
24. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque, el trastorno se selecciona del grupo que consiste de, enfermedad de Crohn, psoriasis, psoriasis en placas, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, osteoartritis, o artritis idiopática juvenil, esclerosis múltiple, y espondilitis anquilosante.
25. El método de al reivindicación 23, caracterizado porque, el trastorno se selecciona del grupo que consiste de un trastorno respiratorio; asma; asma alérgica y no alérgica; asma debida a infecciones; asma debida a infecciones con el virus sincitial respiratorio (RSV); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una condición que involucra la inflamación de las vías áreas; eosinofilia; fibrosis y producción excesiva de modo; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición inflamatoria y/o autoin mune de la piel; una condición inflamatoria y/o autoin mune de los órganos gastrointestinales; enfermedades inflamatorias intestina les (I BD); colitis ulcerosa ; enfermedad de Crohn ; u na cond ición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática; fibrosis hepática provocada por el virus de hepatitis B y/o C; escleroderm ia ; tumores o cánceres; carcinoma hepatocelu lar; g l ioblastoma; l infoma; linfoma de Hodgkin; una infección viral; una infección bacteriana; una infección parasitaria ; infección por HTLV-1 ; supresión de la expresión de respuestas inmunes protectoras de tipo 1 , y su presión de la expresión de respuestas inmunes protectoras de tipo 1 durante la vacunación .
26. Un método para determ inar la presencia de TN F-a o un fragmento del mismo en una muestra de prueba mediante un inmunoensayo, caracterizado porque, el inmunoensayo comprende poner en contacto a m uestra de prueba con al menos una proteína de enlace o fragmentos de las mismas, de acuerdo con la reivindicación 3, y al menos una etiqueta detectable.
27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque, el método comprende además: (i) poner en contacto la muestra de prueba con la al menos una proteína de enlace o los fragmentos de la misma , en donde la proteína de enlace se en laza a un epítopo en el TN F-a o un fragmento del mismo, para formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con la al menos una etiqueta detectable, en donde la etiq ueta detecta ble se enlaza a un epítopo en el primer complejo, o en el TNF-a o un fragmento del mismo, que no está enlazado por la proteína de enlace o los fragmentos de la misma, para formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia del TNF-a o un fragmento del mismo en la muestra de prueba, con base en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, en donde la presencia del TNF-a o un fragmento del mismo se correlaciona directamente con la señal generada por la etiqueta detectable.
28. El método de la reivindicación 26, caracterizado purque, el método comprende además: (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de enlace o fragmentos de la misma, en donde la proteína de enlace o los fragmentos de la misma se enlazan a un epítopo en el TNF-a o un fragmento del mismo, para formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con la al menos una etiqueta detectable, en donde la etiqueta detectable compite con el TNF-a o un fragmento del mismo para enlazarse con la proteína de enlace o los fragmentos de la misma, para formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia del TNF-a o un fragmento del mismo en la muestra de prueba con base en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, en donde la presencia del TNF-a o un fragmento del mismo se correlaciona indirectamente con la señal generada por la etiqueta detectable.
29. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque, el método comprende además, opcionalmente, diagnosticar, pronosticar, o evaluar la eficiencia del tratamiento terapéutico/profiláctico paciente.
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