TW202346340A - 抗原結合域及其使用方法 - Google Patents

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布萊恩 史考特 蓋里森
米雪兒 伊莉莎白 洪
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美商聖堤生物科技股份有限公司
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Abstract

本發明提供對內皮黏蛋白（EMCN）具有特異性之抗體及其抗原結合片段。本發明亦提供與對EMCN具有特異性之抗體或其抗原結合域有關的細胞、核酸、載體、組合物及方法。

Description

抗原結合域及其使用方法
基於嵌合抗原受體（CAR）之過繼細胞療法用於重新導向免疫反應性細胞（諸如T細胞）之特異性及功能，已展現對淋巴惡性腫瘤患者之功效（Pule等人, Nat. Med. (14):1264-1270 (2008)；Maude等人, N Engl J Med. (371):1507-17 (2014)；Brentjens等人, Sci Transl Med. (5):177ra38 (2013)）。CAR T細胞已被證明在化療已導致抗藥性及腫瘤進展的表現CD19之惡性腫瘤患者中誘導完全緩解。CD19 CAR療法的成功為治療其他血液惡性腫瘤（諸如急性骨髓性白血病（AML））提供樂觀情緒。急性骨髓性白血病係成人中最常見的急性白血病。AML係一種骨髓系血細胞之癌症，其特徵為在骨髓及血液中累積且干擾正常血細胞的異常細胞之快速生長。有時，AML會擴散至腦、皮膚或牙齦。過去40年來，AML之標準化學療法治療並未有重大改變（Pulte等人, 2008），且整體存活期仍然非常差。
開發用於AML之CAR療法的一個挑戰係缺乏適當的目標。鑑別適當的CAR目標之能力對於有效地靶向及治療腫瘤而不損害表現相同目標抗原之正常細胞而言係重要的。因此，仍需要靶向AML細胞而不靶向正常細胞或組織的基於CAR-T細胞之AML療法。
本文提供一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（endomucin，EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： 可變重鏈（VH）區，其含有具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）；以及 可變輕鏈（VL）區，其含有具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區L（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3），其中該抗體或其抗原結合片段係人源化的。
本文亦提供一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：可變重鏈（VH）區，其含有具有選自由SEQ ID NO: 2-5組成之群之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）；以及可變輕鏈（VL）區，其含有具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區L（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3），其中該抗體或其抗原結合片段係人源化的。
本文亦提供一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：可變重鏈（VH）區，其含有具有選自由SEQ ID NO: 2-4組成之群之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）；以及可變輕鏈（VL）區，其含有具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區L（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3）。
在一些態樣中，CDRH1如SEQ ID NO: 2中所闡述。
在一些態樣中，VH區具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 15。
在一些態樣中，VH區具有如SEQ ID NO: 12中所闡述之胺基酸序列。
在一些態樣中，VH區具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。
在一些態樣中，VH區具有如SEQ ID NO: 16中所闡述之胺基酸序列。
在一些態樣中，VL具有如SEQ ID NO: 20中所闡述之胺基酸序列。
本文亦提供一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中VH包含：重鏈互補決定區1（CDR-H1）、重鏈互補決定區2（CDR-H2）及重鏈互補決定區3（CDR-H3），其含於選自由SEQ ID NO: 12-19組成之群的VH區胺基酸序列內；且VL包含：輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及輕鏈互補決定區3（CDR-L3），其含於SEQ ID NO: 20之VL區胺基酸序列內。
本文亦提供一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈（VH）區及可變輕鏈（VL）區，其中VL具有如SEQ ID NO: 20中所闡述之胺基酸序列。
本文亦提供一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈（VH）區及可變輕鏈（VL）區，其中VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。
在一些態樣中，VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 15。在一些態樣中，VH區具有如SEQ ID NO: 12中所闡述之胺基酸序列。
在一些態樣中，VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。在一些態樣中，VH區具有如SEQ ID NO: 16中所闡述之胺基酸序列。
在一些態樣中，VL具有如SEQ ID NO: 20中所闡述之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為抗原結合片段。在一些態樣中，抗原結合片段包含F(ab)片段、F(ab')片段或單鏈可變片段（scFV）。在一些實施例中，抗原結合片段包含單鏈可變片段（scFv）。
在一些態樣中，scFv之VH及VL由肽連接子分開。在一些態樣中，抗原結合域包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。在一些實施例中，肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 21-37。
在一些實施例中，scFv包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID No: 68、70、72及74。
本文亦提供一種嵌合蛋白，其包含如本文所提供之抗體或其抗原結合片段及異源分子或部分。
在一些態樣中，嵌合蛋白為抗體-藥物結合物，且異源分子或部分包含治療劑。
在一些態樣中，嵌合蛋白為嵌合抗原受體（CAR），且異源分子或部分包含選自由以下組成之群的多肽：跨膜域、一或多個細胞內傳訊域、鉸鏈域、間隔區、一或多個肽連接子及其組合。在一些態樣中，CAR包含跨膜域。在一些態樣中，CAR包含一或多個細胞內傳訊域。
在一些態樣中，CAR為包含一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊域的活化CAR。
在一些態樣中，CAR為包含一或多個抑制免疫反應之細胞內抑制性域的抑制性CAR。在一些態樣中，細胞內抑制性域包含酶抑制性域。在一些態樣中，細胞內抑制性域包含細胞內抑制性共傳訊域。
在一些態樣中，CAR在抗原結合域與跨膜域之間包含間隔區。在一些態樣中，間隔區具有選自由SEQ ID NO:41-52組成之群的胺基酸序列。
本文亦提供一種組合物，其包含如本文所提供之抗體或其抗原結合片段或如本文所提供之嵌合蛋白及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。
本文亦提供一種經工程改造之核酸，其編碼如本文所提供之抗體或抗原結合片段或如本文所提供之嵌合蛋白。
本文亦提供一種表現載體，其包含編碼本文所提供之抗體或抗原結合片段中之任一者的經工程改造之核酸。
本文亦提供一種組合物，其包含如本文所提供之經工程改造之核酸或如本文所提供之表現載體及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。
本文亦提供一種製造經工程改造之細胞之方法，其包含用如本文所提供之經工程改造之核酸或如本文所提供之表現載體轉導經分離之細胞。
本文亦提供一種經分離之細胞，其包含如本文所提供之經工程改造之核酸、如本文所提供之表現載體或如本文所提供之組合物。
本文亦提供一種經工程改造之細胞群，其表現如本文所提供之經工程改造之核酸或如本文所提供之表現載體。
本文亦提供一種經分離之細胞，其包含如本文所提供之抗原結合片段或如本文所提供之嵌合蛋白。
本文亦提供一種經工程改造之細胞群，其表現如本文所提供之抗原結合片段或如本文所提供之嵌合蛋白。
在一些態樣中，嵌合蛋白由細胞或細胞群重組表現。在一些態樣中，嵌合蛋白自載體或細胞基因體之選定基因座表現。
在一些態樣中，細胞或細胞群進一步包含在細胞表面上表現之一或多種靶向腫瘤之嵌合受體。在一些態樣中，一或多種靶向腫瘤之嵌合受體中之各者為嵌合抗原受體（CAR）或經工程改造之T細胞受體。
在一些態樣中，細胞或細胞群選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ T細胞、細胞毒性T淋巴球（CTL）、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T（NKT）細胞、自然殺手（NK）細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球（TIL）、先天性淋巴細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、骨髓細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、紅血球、血小板細胞、人類胚胎幹細胞（ESC）、ESC衍生細胞、富潛能幹細胞、間葉基質細胞（MSC）、誘導性富潛能幹細胞（iPSC）及iPSC衍生細胞。
在一些態樣中，細胞係自體的。在一些態樣中，細胞係同種異體的。
本文亦提供一種醫藥組合物，其包含有效量之如本文所提供之細胞或經工程改造之細胞群及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。
本文亦提供一種醫藥組合物，其包含有效量之表現如本文所提供之抗原結合片段或如本文所提供之嵌合蛋白的經基因修飾之細胞及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。
在一些態樣中，醫藥組合物用於治療及/或預防腫瘤。
本文亦提供一種治療有需要個體之方法，該方法包含投與治療有效劑量之如本文所提供之組合物或如本文所提供之細胞中之任一者。
本文亦提供一種刺激個體之針對腫瘤細胞的細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量之如本文所提供之組合物或如本文所提供之細胞中之任一者。
在一些態樣中，該方法包含向個體投與如本文所提供之細胞或細胞群，其中細胞或細胞群表現包含如本文所提供之活化CAR之嵌合蛋白。
本文亦提供一種抑制個體之針對腫瘤細胞的細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量之如本文所提供之組合物或如本文所提供之細胞中之任一者。在一些態樣中，該方法包含向個體投與如本文所提供之細胞或細胞群，其中細胞或細胞群表現包含如本文所提供之抑制性之嵌合蛋白。
本文亦提供一種治療患有腫瘤之個體的方法，該方法包含投與治療有效劑量之如本文所提供之組合物或如本文所提供之細胞中之任一者。
本文亦提供一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如本文所提供之嵌合蛋白。
在一些態樣中，該套組進一步包含關於使用嵌合蛋白來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。
本文亦提供一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如本文所提供之細胞或細胞群。在一些態樣中，該套組進一步包含關於使用細胞來治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。
本文亦提供一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如本文所提供之經工程改造之核酸。在一些態樣中，該套組進一步包含關於使用核酸來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。
本文亦提供一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如本文所提供之載體。在一些態樣中，該套組進一步包含關於使用載體來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。
本文亦提供一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如本文所提供之組合物。在一些態樣中，該套組進一步包含關於使用組合物來治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。
相關申請案的交叉參考
本申請案主張於2022年4月20日提交之美國臨時申請案第63/333,064號之權益，該申請案以全文引用的方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，其已經由EFS-Web提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於20XX年XX月，名稱為XXXXXUS_sequencelisting.txt且大小為X,XXX,XXX位元組。
除非另外指示，否則本發明之實踐將利用此項技術內之分子生物學、化學、生物化學、病毒學及免疫學之習知方法。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如Hepatitis C Viruses: Genomes and Molecular Biology (S.L. Tan編, Taylor & Francis, 2006)；Fundamental Virology, 第3版, 第I及II卷(B.N. Fields及D.M. Knipe編)；Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV卷(D.M. Weir及C.C. Blackwell編, Blackwell Scientific Publications)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 當前新增)；Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版, 2001)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)。 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術、符號及其他科學術語之術語意欲具有熟習此項技術者通常理解之含義。在一些情況下，為了清楚起見及/或為便於參考，本文中定義具有通常所理解之含義的術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中一般理解之差異。熟習此項技術者一般良好理解本文中所描述或提及之技術及程序且通常使用習知方法採用，諸如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual第4版 (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY中所描述之廣泛利用的分子選殖方法。視需要，除非另外指出，否則涉及使用市售套組及試劑之程序一般根據製造商所定義之方案及條件進行。
如本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一（a/an）」及「該」包括複數個參考物。除非另外特別指示，否則術語「包括」、「諸如」及其類似術語意欲表述包括但不限於。
如本文所用，除非另外特別指示，否則術語「包含」亦特定地包括「由所述要素組成」及「基本上由所述要素組成」的實施例。
術語「約」指示且涵蓋指示值以及高於及低於該值之範圍。在某些實施例中，術語「約」指示指定值±10%、±5%或±1%。在某些實施例中，在適用情況下，術語「約」指示指定值±該值之一個標準差。
如本文所用，術語「刺激細胞介導之免疫反應」或「刺激免疫反應」係指產生引起一或多種細胞類型或細胞群之免疫反應的信號。免疫刺激活性可包括促炎性活性。在各種實施例中，免疫反應發生在免疫細胞（例如，T細胞或NK細胞）活化之後或同時經由受體，包括但不限於CD28、CD137（4-1BB）、OX40、CD40及ICOS及其對應配位體，包括B7-1、B7-2、OX-40L及4-1BBL介導。此類多肽可存在於腫瘤微環境中且可活化對贅瘤細胞之免疫反應。在各種實施例中，促進、刺激或以其他方式促效促炎性多肽及/或其配位體可增強免疫反應性細胞之免疫反應。不受特定理論束縛，接受多種刺激信號（例如，共刺激）對於產生穩健且長期的細胞介導之免疫反應，諸如T細胞介導之免疫反應而言很重要，其中T細胞在不存在共刺激信號之情況下可受抑制且對抗原無反應性（亦稱為「T細胞無反應性」）。雖然各種共刺激信號（尤其彼此組合）之影響可能不同且仍僅被部分理解，但共刺激一般引起基因表現增加，以便產生長期存活、增殖且抗凋亡細胞，諸如T細胞或NK細胞，其對抗原穩健反應，例如在介導對表現同源抗原之目標細胞的完全及/或持續根除時。
如本文所用，術語「嵌合抗原受體」或替代地「CAR」係指重組多肽構築體，其包含至少細胞外抗原結合域、跨膜域及包含功能性傳訊域之細胞質傳訊域（在本文中亦稱為「細胞內傳訊域」）。
如本文所用，術語「活化CAR」或「aCAR」係指能夠在表現活化CAR之細胞中誘導信號轉導或蛋白質表現變化之CAR構築體/架構，其在結合至同源aCAR配位體後起始、活化、刺激或增加免疫反應。
如本文所用，術語「抑制性CAR」或「iCAR」係指能夠在表現抑制性CAR之細胞中誘導信號轉導或蛋白質表現變化之CAR構築體/架構，其在結合至同源iCAR配位體後防止、減弱、抑制、降低、減少、抑制或壓制免疫反應，諸如接受或已接受一或多種刺激信號（包括共刺激信號）之免疫反應性細胞的活化降低。
如本文所用，術語「細胞內傳訊域」係指蛋白質之功能部分，其藉由在細胞內傳輸資訊以藉由產生第二傳訊者或藉由回應於此類傳訊者而充當效應子經由所定義之傳訊路徑調控細胞活性而起作用。
如本文所用，術語「細胞外抗原結合域」或「抗原結合域」（ABD）係指特異性識別或結合至給定抗原或表位之多肽序列或多肽複合物，諸如本文所描述之提供EMCN特異性結合之嵌合蛋白的多肽序列或多肽複合物部分。ABD（或抗體、抗原結合片段及/或包括其之嵌合蛋白）被稱為「識別」ABD特異性結合之表位（或更一般地，抗原），且表位被稱為ABD之「識別特異性」或「結合特異性」。ABD據稱以特定親和力與其特異性抗原或表位結合。如本文所描述，「親和力」係指一個分子與另一分子之間非共價分子間力之相互作用之強度。親和力，亦即相互作用之強度，可表示為解離平衡常數（KD），其中較低KD值係指分子之間較強的相互作用。抗體構築體之KD值藉由此項技術中熟知之方法量測，包括但不限於生物層干涉術（例如，Octet/FORTEBIO®）、表面電漿子共振（SPR）技術（例如，Biacore®）及細胞結合分析（例如，流動式細胞測量術）。藉由親和力評估之特異性結合可指在ABD及其同源抗原或表位之間具有親和力之結合分子，其中KD值低於10 − 6M、10 − 7M、10 − 8M、10 − 9M或10 − 10M。特異性結合亦可包括識別及結合所關注之生物分子（例如多肽）同時不特異性識別及結合天然包括本發明之多肽的樣品，例如生物樣品中之其他分子。在某些實施例中，特異性結合係指ABD、抗體或抗原結合片段與表位或抗原或抗原決定子之間的結合，其方式使得結合可經一致或類似表位、抗原或抗原決定子之第二製備物置換或與其競爭。
ABD可為抗體。如本文所用，術語「抗體」係指衍生自與抗原特異性結合之免疫球蛋白分子的蛋白質或多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白，且可衍生自天然來源或重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子之四聚體。
ABD可為抗體之抗原結合片段。如本文所用，術語「抗原結合片段」係指完整抗體或其重組變異體之至少一部分，其足以賦予抗原結合片段對目標（諸如抗原或表位）之識別及特異性結合。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、線性抗體、單域抗體諸如sdAb（VL或VH）、駱駝VHH域及由抗原結合片段形成之多特異性抗體，諸如包含在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段及抗體之經分離之CDR或其他表位結合片段。抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv中（參見例如Hollinger及Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1 136, 2005）。抗原結合片段亦可移植至基於諸如III型纖維連接蛋白（Fn3）之多肽之支架中（參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維連接蛋白多肽微型抗體）。
結合分子（諸如本文所描述之嵌合蛋白）中ABD之數目界定結合分子之「價數」。具有單一ABD之結合分子為「單價」。具有複數個ABD之結合分子稱為「多價」。具有兩個ABD之多價結合分子為「二價」。具有三個ABD之多價結合分子為「三價」。具有四個ABD之多價結合分子為「四價」。在各種多價實施例中，複數個ABD中之全部具有相同的識別特異性且可稱為「單特異性多價」結合分子。在其他多價實施例中，複數個ABD中之至少兩者具有不同的識別特異性。此類結合分子為多價且「多特異性」。在ABD共同具有兩種識別特異性之多價實施例中，結合分子為「雙特異性」。在ABD共同具有三種識別特異性之多價實施例中，結合分子為「三特異性」。在ABD共同具有對相同抗原上存在之不同表位的複數個識別特異性之多價實施例中，結合分子為「多互補位」。ABD共同識別相同抗原上之兩個表位之多價實施例為「雙互補位」。
在各種多價實施例中，結合分子之多價提高結合分子對特定目標之親合力。如本文所描述，「親合力」係指兩個或更多個分子（例如，針對特定目標之多價結合分子）之間的相互作用之總強度，其中親合力為由多個ABD之親和力提供的相互作用之累積強度。親合力可藉由與如上文所描述之用於測定親和力之方法相同的方法量測。在某些實施例中，結合分子對特定目標之親合力使得相互作用為特異性結合相互作用，其中兩個分子之間的親合力具有低於10 − 6M、10 − 7M、10 − 8M、10 − 9M或10 − 10M之KD值。在某些實施例中，結合分子對特定目標之親合力具有使得相互作用為特異性結合相互作用之KD值，其中個別ABD之一或多種親和力獨自不具有符合特異性結合其各別抗原或表位的KD值。在某些實施例中，親合力為由多個ABD對共用特定目標或複合物上之獨立抗原（諸如在單個細胞上發現之獨立抗原）之親和力提供的相互作用之累積強度。在某些實施例中，親合力為由多個ABD對共用單個抗原上之獨立表位之親和力提供的相互作用之累積強度。
如本文所用，術語「單鏈可變片段」或「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗原結合片段及至少一個包含重鏈可變區之抗原結合片段的融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區經由短的可撓性多肽連接子連續連接，能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留其所來源之完整抗體的特異性。除非指明，否則如本文所用，scFv可具有任一次序之VL及VH可變區，例如相對於多肽之N端及C端，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
如本文所用，「可變區」係指來自重組事件，例如在B細胞中之免疫球蛋白基因中或T細胞中之T細胞受體（TCR）基因中之V、J及/或D區段重組之後的可變序列。在免疫球蛋白基因中，可變區通常由其所來源之抗體鏈定義，例如VH係指抗體重鏈之可變區且VL係指抗體輕鏈之可變區。所選VH及所選VL可締合在一起以形成賦予抗原特異性及結合親和力之抗原結合域。
如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」係指抗體可變區VH及VL內賦予抗原特異性及結合親和力之序列。例如，一般而言，各重鏈可變區中存在三個CDR（例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3），且各輕鏈可變區中存在三個CDR（LCDR1、LCDR2及LCDR3）。給定CDR之胺基酸序列邊界可使用許多熟知之方案中之任一者確定，包括由Kabat等人 (1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD描述之方案（「Kabat」編號方案）、Al-Lazikani等人, (1997) JMB 273,927-948描述之方案（「Chothia」編號方案）或其組合。在Kabat編號方案下，在一些實施例中，重鏈可變域（VH）中之CDR胺基酸殘基編號為31-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）及95-102（HCDR3）；且輕鏈可變域（VL）中之CDR胺基酸殘基編號為24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）及89-97（LCDR3）。在Chothia編號方案下，在一些實施例中，VH中之CDR胺基酸編號為26-32（HCDR1）、52-56（HCDR2）及95-102（HCDR3）；且VL中之CDR胺基酸殘基編號為26-32（LCDRl）、50-52（LCDR2）及91-96（LCDR3）。在組合之Kabat與Chothia編號方案中，在一些實施例中，CDR對應於作為Kabat CDR、Chothia CDR或兩者之部分的胺基酸殘基。舉例而言，在一些實施例中，CDR對應於VH，例如哺乳動物VH，例如人類VH中之胺基酸殘基26-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）及95-102（HCDR3）；及VL，例如哺乳動物VL，例如人類VL中之胺基酸殘基24-34（LCDRl）、50-56（LCDR2）及89-97（LCDR3）。在各種實施例中，CDR為哺乳動物序列，包括但不限於小鼠、大鼠、倉鼠、兔、駱駝、驢、山羊及人類序列。在一較佳實施例中，CDR為人類序列。在各種實施例中，CDR為天然存在之序列。
如本文所用，術語「構架區」或「FR」係指抗體可變區VH及VL內一般保守的序列，其通常在FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4配置（自N端至C端）中充當穿插CDR之支架。在各種實施例中，FR為哺乳動物序列，包括但不限於小鼠、大鼠、倉鼠、兔、駱駝、驢、山羊及人類序列。在特定實施例中，FR為人類序列。在各種實施例中，FR為天然存在之序列。在各種實施例中，FR為合成序列，包括但不限於合理設計之序列。
如本文所用，術語「抗體重鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較大者，且其通常決定抗體所屬類別。
如本文所用，術語「抗體輕鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。κ（Kappa）及λ（lambda）輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。
如本文所用，術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如由噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該術語亦應理解為意謂已藉由合成編碼抗體之DNA分子（且該DNA分子表現抗體蛋白）或指定抗體之胺基酸序列產生之抗體，其中該DNA或胺基酸序列已使用此項技術中可獲得且熟知之重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
如本文所用，術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特定免疫勝任細胞活化，或兩者。熟習此項技術者應理解包括幾乎所有蛋白質或肽之任何大分子可充當抗原。
如本文所用，術語「抗腫瘤作用」或「抗腫瘤活性」係指可藉由各種方式體現之生物作用，其包括但不限於例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、轉移數目減少、預期壽命增加、腫瘤細胞增殖減少、腫瘤細胞存活率降低或與癌性病狀相關之各種生理症狀改善。「抗腫瘤作用」亦可首先體現為本發明之肽、聚核苷酸、細胞及抗體預防腫瘤出現之能力，諸如在預防療法或治療中。
如本文所用，術語「自體」係指衍生自稍後將再引入個體中之相同個體的任何材料。
如本文所用，術語「同種異體」係指衍生自與引入材料之個體相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座處之基因不一致時，兩個或更多個個體稱為彼此同種異體。在一些實施例中，來自相同物種之個體的同種異體材料可例如在特定基因（諸如MHC對偶基因）處在基因上足夠不同，以進行抗原性相互作用。在一些實施例中，來自相同物種之個體的同種異體材料可例如在特定基因（諸如MHC對偶基因）處在基因上足夠類似，而不進行抗原性相互作用。
本發明之經分離之核酸分子包括編碼本發明之多肽或其片段的任何核酸分子。此類核酸分子不需要與內源核酸序列100%同源或一致，但通常將展現實質一致性。與外源性序列具有「實質一致性」或「實質同源性」之核酸一般能夠與雙股核酸分子之至少一股雜交。如本文所用，「雜交」係指在各種嚴格度條件下在互補聚核苷酸序列（例如，本文所描述之基因）或其部分之間配對形成雙股分子。例如，嚴格鹽濃度可小於約750 mM NaCl及75 mM檸檬酸三鈉，小於約500 mM NaCl及50 mM檸檬酸三鈉，或小於約250 mM NaCl及25 mM檸檬酸三鈉。低嚴格度雜交可在不存在有機溶劑，例如甲醯胺之情況下獲得，而高嚴格度雜交可在至少約35%甲醯胺或至少約50%甲醯胺存在下獲得。嚴格的溫度條件通常將包括至少約30℃、至少約37℃或至少約42℃之溫度。改變另外的參數，諸如雜交時間、清潔劑（例如，十二烷基硫酸鈉（SDS））之濃度及包括或不包括載體DNA，係熟習此項技術者熟知的。可藉由視需要組合此等各種條件來實現各種嚴格度。
「實質上一致」或「實質上同源」意謂與參考胺基酸序列（例如，本文所描述之胺基酸序列中之任一者）或核酸序列（例如，本文所描述之核酸序列中之任一者）展現至少約50%同源或一致的多肽或核酸分子。較佳地，此類序列與用於比較之序列在胺基酸層級或核酸上至少約60%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或約100%同源或一致。序列一致性通常使用序列分析軟體（例如，Genetics Computer Group之序列分析套裝軟體, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705；BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式）量測。此類軟體藉由向各種取代、缺失及/或其他修飾分配同源度而匹配一致或類似序列。保守取代通常包括以下群組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。在測定一致性程度的例示性方法中，可使用BLAST程式，其中在e-3與e-100之間的機率分數指示緊密相關之序列。
如本文所用，術語「編碼」係指諸如基因、cDNA或mRNA之聚核苷酸中之核苷酸之特定序列在生物過程中充當合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性，該等聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列（例如，rRNA、tRNA及mRNA）或已確定之胺基酸序列及由其獲得之生物特性。因此，若與基因相對應之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼股與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股均可稱為編碼該基因或cDNA之蛋白質或其他產物。除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此互為簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其達到編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些型式中含有內含子之程度。
如本文所用，術語「配位體」係指結合至受體之分子。特定言之，配位體結合另一細胞上之受體，允許細胞間識別及/或相互作用。
術語「有效量」及「治療有效量」在本文中可互換使用，且係指有效達成特定生物結果的如本文所描述之化合物、調配物、材料或組合物之量。在一些實施例中，「有效量」或「治療有效量」為足以阻止、改善或抑制所關注疾病或病症（例如，骨髓病症）之持續增殖、生長或轉移的量。
如本文所用，術語「免疫反應性細胞」係指在免疫反應（例如，免疫效應反應）中起作用之細胞或其前驅細胞或後代。免疫效應細胞之實例包括但不限於α/β T細胞、γ/δ T細胞、B細胞、自然殺手（NK）細胞、自然殺手T（NKT）細胞、肥胖細胞及骨髓衍生吞噬細胞。
如本文所用，術語「免疫效應反應」或「免疫效應功能」係指增強或促進對目標細胞之免疫攻擊的例如免疫反應性細胞之功能或反應。舉例而言，免疫效應功能或反應可指T細胞或NK細胞促進目標細胞之殺傷或生長或增殖抑制的特性。在T細胞之情況下，初始刺激及共刺激為免疫效應功能或反應之實例。
如本文所用，術語「可撓性多肽連接子」或「連接子」係指由單獨或組合使用之胺基酸（諸如甘胺酸及/或絲胺酸殘基）組成之肽連接子，其將可變重鏈及可變輕鏈區連接在一起。在一個實施例中，可撓性多肽連接子為Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數。例如，n=l、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9或n=10。在一些實施例中，可撓性多肽連接子包括但不限於Gly4Ser或(Gly4Ser)3。在其他實施例中，連接子包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)之多個重複。在一些實施例中，可撓性多肽連接子包括惠特洛連接子（Whitlow linker）（例如，GSTSGSGKPGSGEGSTKG [SEQ ID NO:36])。本發明之範疇內亦包括例如WO2012/138475中描述之連接子。
如本文所用，術語「治療（treat）」、「治療（treatment）」及「治療（treating）」係指由投與一或多種療法（例如，一或多種治療劑，諸如本發明之CAR）引起減少或改善增生性病症（例如，癌症）之進展、嚴重程度及/或持續時間，或改善增生性病症之一或多種症狀（較佳一或多種可辨別症狀）。在一些實施例中，減少或改善係指改善患者不一定可辨別之增生性病症之至少一個可量測物理參數，諸如腫瘤生長。在其他實施例中，術語「治療（treat）」、「治療（treatment）」及「治療（treating）」係指以物理方式藉由例如穩定可辨別症狀、以生理學方式藉由例如穩定物理參數或此兩者來抑制增生性病症之進展。在一些實施例中，減少或改善包括腫瘤大小或癌細胞計數之減少或穩定。
如本文所用，術語「個體」意欲包括可引發免疫反應之活體生物體（例如，哺乳動物、人類）。
本發明之其他態樣描述於以下章節中且在所主張發明之範圍內。 其他解釋慣例
本文所列舉之範圍應理解為範圍內所有值之簡寫，包括所述端點。例如，1至50之範圍應理解為包括來自以下之任何數字、數字組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50。
除非另外指示，否則提及具有一或多個立體中心之化合物意指其各立體異構物，以及立體異構物之所有組合。 內皮黏蛋白特異性抗原結合域
本發明提供結合至內皮黏蛋白（EMCN）之抗原結合域（例如，單鏈可變片段）、包括結合至EMCN之抗原結合域之嵌合蛋白及編碼此類抗原結合域及嵌合蛋白之核酸。不希望受理論束縛，EMCN為干擾黏著斑複合物之組裝且抑制細胞與細胞外基質間之相互作用的唾液酸醣蛋白。EMCN特異性抗原結合域結合至人類EMCN（例如，Uniprot Q9ULC0，出於所有目的以引用的方式併入本文中）或其表位片段。EMCN可在造血幹細胞及前驅細胞（HSPC）上表現。EMCN可在一般視為健康的細胞，諸如健康的HSPC上表現。先前已描述EMCN特異性抗體，包括CBFYE-0213、V.7.C7.1、L4B1、L5F12、L10B5、L3F12、L6H3、L6H10（在本文中亦稱為Ab1）、L9H8及L10F12，如Samulowitz U.等人, Am. J. Path., 2002年5月, 160(5):1669-1681中所描述，出於所有目的以引用的方式併入本文中。
本發明提供一種EMCN特異性抗原結合域，其包括 表 1中所列之胺基酸序列中之一或多者。 表 1. EMCN 特異性抗原結合域
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
RYDMH 1 Kabat註釋之CDR的CDR-H1
GFTFSRY 2 Chothia註釋之CDR的CDR-H1型式1
GFTLSRY 3 Chothia註釋之CDR的CDR-H1型式2
GFSFSRY 4 Chothia註釋之CDR的CDR-H1型式3
GFSLSRY 5 Chothia註釋之CDR的CDR-H1型式4
VIWGNGNTHYHSALKS 6 Kabat註釋之CDR的CDR-H2
WGNGN 7 Chothia註釋之CDR的CDR-H2
RIKD 8 CDR-H3（Kabat及Chothia註釋之CDR）
KSSQSLVASDENTYLN 9 CDR-L1（Kabat及Chothia註釋之CDR）
QVSKLDS 10 CDR-L2（Kabat及Chothia註釋之CDR）
LQGIHLPWT 11 CDR-L3（Kabat及Chothia註釋之CDR）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 12 VH 3-23型式1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 13 VH 3-23型式2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSFSRY DMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 14 VH 3-23型式3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 15 VH 3-23型式4
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 16 VH 3-33型式1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 17 VH 3-33型式2
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFSFSRY DMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 18 VH 3-33型式3
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFSLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 19 VH 3-33型式4
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK 20 VL 2-30
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中VH包括具有RIKD（SEQ ID NO:8）之胺基酸序列是重鏈互補決定區3（CDR-H3）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中VH包括重鏈互補決定區1（CDR-H1）、重鏈互補決定區2（CDR-H2）及重鏈互補決定區3（CDR-H3），其具有含於選自由SEQ ID NO: 12-20組成之群的VH區胺基酸序列內的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之胺基酸序列。在一些實施例中，VH區具有選自由SEQ ID NO:12-15組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，VH區具有SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一些實施例中，VH區具有選自由SEQ ID NO:16-19組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，VH區具有SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中VH包括具有選自以下之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5，具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2），及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）。在一些實施例中，具有以上VH序列之EMCN特異性抗原結合域可具有輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、輕鏈互補決定區域2（CDR-L2）及輕鏈互補決定區3（CDR-L3），其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列含於SEQ ID NO: 20之VL區胺基酸序列內。在一些實施例中，具有以上VH序列的EMCN特異性抗原結合域可具有具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-L3）。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中VL包括輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及輕鏈互補決定區3（CDR-L3），其具有含於SEQ ID NO: 20之VL區胺基酸序列內的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中VL包括具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。在一些實施例中，具有以上VL序列之EMCN特異性抗原結合域可具有重鏈互補決定區1（CDR-H1）、重鏈互補決定區2（CDR-H2）及重鏈互補決定區3（CDR-H3），其具有含於選自由以下組成之群之VH區胺基酸序列內的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之胺基酸序列：SEQ ID NO: 12-20。在一些實施例中，具有以上VL序列之EMCN特異性抗原結合域可具有具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有WGNGN SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）。在一些實施例中，具有以上VL序列之EMCN特異性抗原結合域可具有具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有WGNGN SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）。在一些實施例中，具有以上VL序列之EMCN特異性抗原結合域可具有具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）。在一些實施例中，具有以上VL序列之EMCN特異性抗原結合域可具有具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有WGNGN SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中；（1）VH包括具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）；及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中；（1）VH包括具有SEQ ID NO:3之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）；及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中；（1）VH包括具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）；及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中；（1）VH包括具有SEQ ID NO:5之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）、具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3）；及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有可變重鏈（VH）區，其含有具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）；及可變輕鏈（VL）區，其含有具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區L（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3），且抗原結合域係人源化的。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH區。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括與SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH區。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括與SEQ ID NO:16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL區。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VL區。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有（1）包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH區，及（2）包括與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VL區，或包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL區。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有（1）包括與SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區，及（2）包括與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VL區，或包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL區。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有（1）包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH區，及（2）包括與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VL區，或包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL區。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有（1）包括與SEQ ID NO:16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區，及（2）包括與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VL區，或包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL區。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有（1）包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL區，及（2）包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH區，或包括與SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VL區，及（2）包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH區，或包括與SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有（1）包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL區，及（2）包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH區，或包括與SEQ ID NO:16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有包括與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VL區，及（2）包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VH區，或包括與SEQ ID NO:16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列的VH區。
EMCN特異性抗原結合域可呈本文所描述之任一格式，諸如Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv、線性抗體、單域抗體諸如sdAb（VL或VH）、駱駝VHH及多特異性格式。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域呈F(ab)格式。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域呈F(ab')格式。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域呈單鏈可變片段（scFv）格式，包括具有本文所描述之肽連接子中之任一者的scFv格式（例如，參見 表 2）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域具有結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中L為肽連接子。
在一些實施例中，scFV具有選自SEQ ID NO: 68、70、72及74之胺基酸序列。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域係人源化的。
本發明亦提供與具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區之參考抗體或其抗原結合片段競爭的EMCN特異性抗原結合域，其中；（1）VH包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）：SEQ ID NO: 2-5、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3），及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。
本發明亦提供與具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區之參考抗體或其抗原結合片段競爭的EMCN特異性抗原結合域，其中；（1）VH包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）：SEQ ID NO: 2-5、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3），及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。
在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域與具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區之參考抗體或其抗原結合片段結合相同或基本上相同的表位（例如，不同的人類EMCN表位），其中；（1）VH包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）：SEQ ID NO: 2-5、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3），及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域與具有重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區之參考抗體或其抗原結合片段結合相同或基本上相同的表位（例如，不同的人類EMCN表位），其中；（1）VH包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈互補決定區1（CDR-H1）：SEQ ID NO: 2-5、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈互補決定區2（CDR-H2）及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的重鏈互補決定區3（CDR-H3），及（2）VL包括具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3（CDR-L3）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域與具有包括選自由SEQ ID NO:12-19組成之群之胺基酸序列的VH之參考抗體或其抗原結合片段結合相同或基本上相同的表位（例如，不同的人類EMCN表位）。在一些實施例中，EMCN特異性抗原結合域與具有包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL之參考抗體或其抗原結合片段結合相同或基本上相同的表位（例如，不同的人類EMCN表位）。
本發明亦提供包括具有 表 1中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域的嵌合蛋白及編碼此類嵌合蛋白之核酸。嵌合蛋白可包括如前述之EMCN特異性抗原結合域中之任一者。 嵌合抗原受體（ CAR ）
本發明之某些態樣係關於具有本文所描述之EMCN特異性抗原結合域中之任一者且能夠特異性結合至EMCN蛋白、EMCN衍生抗原或EMCN衍生表位的嵌合受體。在一些實施例中，嵌合受體為嵌合抗原受體（CAR）。一般而言，CAR為嵌合蛋白，其包括抗原結合域及與抗原結合域異源之多肽分子，諸如與抗原結合域可能來源之抗體異源的肽。與抗原結合域異源之多肽分子可包括但不限於跨膜域、一或多個細胞內傳訊域、鉸鏈域、間隔區、一或多個肽連接子或其組合。
在一些實施例中，CAR為經工程改造之受體，其將所關注之特異性（例如，EMCN）移植或賦予免疫效應細胞。在某些實施例中，CAR可用於將抗體之特異性移植至免疫反應性細胞，諸如T細胞。在一些實施例中，本發明之CAR包含與跨膜域融合、與一或多個細胞內傳訊域融合之細胞外抗原結合域（例如，scFv）。
在一些實施例中，嵌合抗原受體為活化嵌合抗原受體（aCAR，且除非另外說明，否則一般稱為CAR）。在一些實施例中，嵌合抗原受體與其同源配位體之結合足以誘導免疫反應性細胞之活化。在一些實施例中，嵌合抗原受體與其同源配位體之結合足以誘導免疫反應性細胞之刺激。在一些實施例中，免疫反應性細胞之活化引起目標細胞之殺傷。在一些實施例中，免疫反應性細胞之活化引起由免疫反應性細胞表現及/或分泌細胞介素或趨化介素。在一些實施例中，免疫反應性細胞之刺激引起由免疫反應性細胞表現及/或分泌細胞介素或趨化介素。在一些實施例中，免疫反應性細胞之刺激誘導免疫反應性細胞之分化。在一些實施例中，免疫反應性細胞之刺激誘導免疫反應性細胞之增殖。在一些實施例中，免疫反應性細胞之活化及/或刺激可為上述反應之組合。
本發明之CAR可為第一、第二或第三代CAR。「第一代」CAR包含單一細胞內傳訊域，一般衍生自T細胞受體鏈。「第一代」CAR一般具有來自CD3-ζ（CD3ζ）鏈之細胞內傳訊域，其為來自內源TCR之信號的主要傳遞物質。「第一代」CAR可提供從頭抗原識別且經由其在單一融合分子中之CD3-ζ鏈傳訊域引起CD4 ＋及CD8 ＋T細胞之活化，與HLA介導之抗原呈現無關。「第二代」CAR將來自各種共刺激分子（例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40）中之一者的第二細胞內傳訊域添加至CAR之細胞質尾區中以向T細胞提供額外信號。「第二代」CAR提供共刺激（例如，CD28或4-1BB）及活化（CD3-ζ）。臨床前研究已指示「第二代」CAR可改善免疫反應性細胞（諸如T細胞）之抗腫瘤活性。「第三代」CAR具有多個細胞內共刺激傳訊域（例如，CD28及4-1BB）及細胞內活化傳訊域（CD3-ζ）。
在一些實施例中，嵌合抗原受體為嵌合抑制性受體（iCAR）。在一些實施例中，一或多種嵌合抑制性受體結合在衍生自選自由以下組成之群的組織之非腫瘤細胞上表現的抗原：腦、神經元組織、內分泌、骨、骨髓、免疫系統、內皮組織、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些實施例中，嵌合抑制性受體（例如，EMCN特異性嵌合抑制性受體）可例如與本發明細胞（例如，免疫反應性細胞）上表現之一或多種活化嵌合受體（例如，活化嵌合TCR或CAR）一起用作非邏輯閘以控制、調節或以其他方式抑制一或多種活化嵌合受體之一或多種活性。舉例而言，若健康細胞表現由靶向腫瘤之嵌合受體識別之抗原及由嵌合抑制性受體識別之抗原，則表現腫瘤抗原之免疫反應性細胞可結合至健康細胞。在此情況下，抑制性嵌合抗原亦將結合健康細胞上之其同源配位體且嵌合抑制性受體之抑制功能將經由靶向腫瘤之嵌合受體降低、減少、防止或抑制免疫反應性細胞之活化（「非邏輯閘控」）。在一些實施例中，本發明之嵌合抑制性受體可抑制本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）的一或多種活性。在一些實施例中，免疫反應性細胞可包含一或多種靶向腫瘤之嵌合受體及一或多種靶向在腫瘤（例如，EMCN）上不表現或一般認為表現之抗原的嵌合抑制性受體。同一免疫反應性細胞中之靶向腫瘤之嵌合受體及嵌合抑制性受體之組合可用於降低靶上脫瘤毒性。
在一些實施例中，本發明之CAR之細胞外抗原結合域以約2×10 -7M或更小、約1×10 -7M或更小、約9×10 -8M或更小、約1×10 -8M或更小、約9×10 -9M或更小、約5×10 -9M或更小、約4×10 -9M或更小、約3×10 -9M或更小、約2×10 -9M或更小或約1×10 -9M或更小之解離常數（K d）結合至一或多種抗原（例如，EMCN）。在一些實施例中，K d在約2×10 -7M至約1×10 -9M範圍內。
本發明之CAR之細胞外抗原結合域的結合可藉由例如酶聯免疫吸附分析（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、FACS分析、生物分析（例如，生長抑制）、生物層干涉術（例如，Octet/FORTEBIO®）、表面電漿子共振（SPR）技術（例如，Biacore®）或分析西方墨點分析來確定。此等分析中之各者一般藉由利用對所關注複合物具有特異性之經標記試劑（例如，抗體或scFv）來偵測特定所關注蛋白質-抗體複合物的存在。例如，scFv可經放射性標記且用於RIA分析。放射性同位素可藉由諸如使用γ計數器或閃爍計數器之方式或藉由自動放射照像術偵測。在某些實施例中，CAR之細胞外抗原結合域用螢光標記進行標記。螢光標記之非限制性實例包括綠色螢光蛋白（GFP）、藍色螢光蛋白（例如，EBFP、EBFP2、Azurite及mKalamal）、青色螢光蛋白（例如，ECFP、Cerulean及CyPet）及黃色螢光蛋白（例如，YFP、Citrine、Venus及YPet）。在某些實施例中，CAR之細胞外抗原結合域用對細胞外抗原結合域具有特異性之二級抗體標記，且其中該二級抗體經標記（例如，放射性標記或用螢光標記進行標記）。
在一些實施例中，本發明之CAR包含結合至EMCN（例如，EMCN蛋白、EMCN衍生抗原或EMCN衍生表位）之細胞外抗原結合域、跨膜域及一或多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含scFv。在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含可交聯之Fab片段。在某些實施例中，細胞外結合域為F(ab) 2片段 。 細胞外抗原結合域
本發明之CAR的細胞外抗原結合域特異性結合至EMCN（例如，EMCN蛋白、EMCN衍生抗原或EMCN衍生表位）。在某些實施例中，細胞外抗原結合域結合至在造血幹細胞上表現之EMCN。在某些實施例中，細胞外抗原結合域結合至一般視為健康之細胞，諸如健康HSCP上表現之EMCN。在一些實施例中，EMCN為人類EMCN。
本發明之抗原結合域可包括結合至抗原之任何域，包括但不限於單株抗體、多株抗體、重組抗體、雙特異性抗體、結合抗體、人類抗體、人源化抗體及其功能片段，包括但不限於單域抗體（sdAb）諸如重鏈可變域（VH）、輕鏈可變域（VL）及駱駝衍生奈米體之可變域（VHH），以及此項技術中已知的作為抗原結合域起作用的替代支架，諸如纖維連接蛋白域、T細胞受體（TCR）、具有增強之親和力的重組TCR或其片段，例如單鏈TCR及其類似物。在某些實例中，抗原結合域衍生自最終將使用CAR之相同物種係有益的。
在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含抗體。在某些實施例中，抗體為人類抗體。在某些實施例中，抗體為嵌合抗體。在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含抗體之抗原結合片段。
在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含F(ab)片段。在某些實施例中，細胞外抗原結合域包含F(ab')片段。
在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含scFv。在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含兩個單鏈可變片段（scFv）。在一些實施例中，兩個scFv中之各者結合至相同抗原上之不同表位。在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含第一scFv及第二scFv。在一些實施例中，第一scFv及第二scFv結合相同抗原上之不同表位。在某些實施例中，scFv為哺乳動物scFv。在某些實施例中，scFv為嵌合scFv。在一些實施例中，scFv包含重鏈可變域（VH）及輕鏈可變域（VL）。
在一些實施例中，VH及VL由肽連接子分開。在某些實施例中，肽連接子包含表2中所示之胺基酸序列中之任一者。在一些實施例中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。在一些實施例中，一或多個scFv中之各者包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。當有兩個或更多個scFv連接在一起時，各scFv可用肽連接與下一scFv連接。在一些實施例中，一或多個scFv中之各者由肽連接子分開。 表 2. 肽連接子
連接子 胺基酸序列 SEQ ID NO:
(G 2S) 1scFv連接子 GGS 21
(G 2S) 2scFv連接子 GGSGGS 22
(G 2S) 3scFv連接子 GGSGGSGGS 23
(G 2S) 4scFv連接子 GGSGGSGGSGGS 24
(G 2S) 5scFv連接子 GGSGGSGGSGGSGGS 25
(G 3S) 1scFv連接子 GGGS 26
(G 3S) 2scFv連接子 GGGSGGGS 27
(G 3S) 3scFv連接子 GGGSGGGSGGGS 28
(G 3S) 4scFv連接子 GGGSGGGSGGGSGGGS 29
(G 3S) 5scFv連接子 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS 30
(G 4S) 1連接子 GGGGS 31
(G 4S) 2連接子 GGGGSGGGGS 32
(G 4S) 3連接子 GGGGSGGGGSGGGGS 33
(G 4S) 4連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 34
(G 4S) 5連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 35
惠特洛連接子 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 36
scFv連接子2 EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK 37
在一些實施例中，免疫效應細胞包含第一嵌合受體及第二嵌合受體。第一嵌合受體之抗原結合域及第二嵌合受體之抗原結合域可為本文所描述或此項技術中已知的適當抗原結合域。舉例而言，第一或第二抗原結合域可為一或多種抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段（scFv）或單域抗體（sdAb）。在一些實施例中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體之抗原結合域包含兩個單鏈可變片段（scFv）。在一些實施例中，兩個scFv中之各者結合至相同抗原上之不同表位。在一些實施例中，第一嵌合受體之抗原結合域可對EMCN具有特異性，且嵌合受體可對第二不同抗原，諸如癌症抗原（例如，在骨髓細胞，諸如AML細胞上表現之抗原）具有特異性。
在一些實施例中，細胞外抗原結合域包含單域抗體（sdAb）。在某些實施例中，sdAb為人源化sdAb。在某些實施例中，sdAb為嵌合sdAb。
在一些實施例中，本發明之CAR可包含兩個或更多個抗原結合域、三個或更多個抗原結合域、四個或更多個抗原結合域、五個或更多個抗原結合域、六個或更多個抗原結合域、七個或更多個抗原結合域、八個或更多個抗原結合域、九個或更多個抗原結合域或十個或更多個抗原結合域。在一些實施例中，兩個或更多個抗原結合域中之各者結合相同抗原。在一些實施例中，兩個或更多個抗原結合域中之各者結合相同抗原之不同表位。在一些實施例中，兩個或更多個抗原結合域中之各者結合不同抗原。
在一些實施例中，CAR包含兩個抗原結合域。在一些實施例中，兩個抗原結合域經由可撓性連接子彼此連接。在一些實施例中，兩個抗原結合域中之各者可獨立地選自抗體、抗體之抗原結合片段、scFv、sdAb、重組纖維連接蛋白域、T細胞受體（TCR）、具有增強之親和力之重組TCR及單鏈TCR。在一些實施例中，包含兩個抗原結合域之CAR為雙特異CAR或串聯CAR（tanCAR）。
在某些實施例中，雙特異性CAR或tanCAR包含包括雙特異性抗體或抗體片段（例如，scFv）之抗原結合域。在一些實施例中，在雙特異性抗體分子之各抗體或抗體片段（例如，scFv）中，VH可在VL上游或下游。在一些實施例中，上游抗體或抗體片段（例如，scFv）經配置使得其VH（VH 1）在其VL（VL 1）上游，且下游抗體或抗體片段（例如，scFv）經配置使得其VL（VL 2）在其VH（VH 2）上游，使得整個雙特異性抗體分子具有配置VH 1-VL 1-VL 2-VH 2。在其他實施例中，上游抗體或抗體片段（例如，scFv）經配置使得其VL（VL 1）在其VH（VH 1）上游，且下游抗體或抗體片段（例如，scFv）經配置使得其VH（VH 2）在其VL（VL 2）上游，使得整個雙特異性抗體分子具有配置VL 1VH 1-VH 2-VL 2。在一些實施例中，若構築體配置為VH 1-VL 1-VL 2-VH 2，則連接子安置在兩個抗體或抗體片段（例如，scFv）之間，例如VL 1與VL 2之間，或若構築體配置為VL 1-VH 1-VH 2-VL 2，則安置在VH 1與VH 2之間。連接子可為如本文所描述之連接子，例如(Gly 4-Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6。一般而言，兩個scFv之間的連接子應足夠長以避免兩個scFv之域之間錯配。在一些實施例中，連接子安置在第一scFv之VL與VH之間。在一些實施例中，連接子安置在第二scFv之VL與VH之間。在具有多個連接子之構築體中，任何兩個或更多個連接子可相同或不同。因此，在一些實施例中，雙特異性CAR或tanCAR以本文所描述之配置包含VL、VH，且可進一步包含一或多個連接子。
在一些實施例中，嵌合受體包含二價CAR。在一些實施例中，二價CAR為EMCN二價CAR。在一些實施例中，二價EMCN CAR包含表1中所示之抗EMCN序列中之一或多者。在一些實施例中，二價EMCN CAR之ABD各自包含相同的ABD。
在一些實施例中，嵌合受體包含雙順反子嵌合抗原受體。在一些實施例中，雙順反子嵌合抗原受體包含EMCN CAR。在一些實施例中，雙順反子EMCN CAR包含表1中所示之抗EMCN序列中之一或多者。 跨膜域
在一些實施例中，本發明之CAR（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）的跨膜域包含跨越細胞膜之至少一部分的疏水性α螺旋。已證明不同的跨膜域可引起不同的受體穩定性。在抗原識別之後，受體群集且信號傳輸至細胞。在一些實施例中，本發明之CAR之跨膜域可包含CD8多肽、CD28多肽、CD3-ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、LIR-1（LILRB1）多肽之跨膜域，或可為合成肽或其任何組合。
在一些實施例中，跨膜域衍生自CD8多肽。可使用任何適合的CD8多肽。例示性CD8多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_001139345及AAA92533.1。在一些實施例中，跨膜域衍生自CD28多肽。可使用任何適合的CD28多肽。例示性CD28多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_006130.1及NP_031668.3。在一些實施例中，跨膜域衍生自CD3-ζ多肽。可使用任何適合的CD3-ζ多肽。例示性CD3-ζ多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_932170.1及NP_001106862.1。在一些實施例中，跨膜域衍生自CD4多肽。可使用任何適合的CD4多肽。例示性CD4多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_000607.1及NP_038516.1。在一些實施例中，跨膜域衍生自4-1BB多肽。可使用任何適合的4-1BB多肽。例示性4-1BB多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_001552.2及NP_001070977.1。在一些實施例中，跨膜域衍生自OX40多肽。可使用任何適合的OX40多肽。例示性OX40多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_003318.1及NP_035789.1。在一些實施例中，跨膜域衍生自ICOS多肽。可使用任何適合的ICOS多肽。例示性ICOS多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_036224及NP_059508。在一些實施例中，跨膜域衍生自CTLA-4多肽。可使用任何適合的CTLA-4多肽。例示性CTLA-4多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_005205.2及NP_033973.2。在一些實施例中，跨膜域衍生自PD-1多肽。可使用任何適合的PD-1多肽。例示性PD-1多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_005009及NP_032824。在一些實施例中，跨膜域衍生自LAG-3多肽。可使用任何適合的LAG-3多肽。例示性LAG-3多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_002277.4及NP_032505.1。在一些實施例中，跨膜域衍生自2B4多肽。可使用任何適合的2B4多肽。例示性2B4多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_057466.1及NP_061199.2。在一些實施例中，跨膜域衍生自BTLA多肽。可使用任何適合的BTLA多肽。例示性BTLA多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_861445.4及NP_001032808.2。可使用任何適合的LIR-1（LILRB1）多肽。例示性LIR-1（LILRB1）多肽包括但不限於NCBI參考編號NP_001075106.2及NP_001075107.2。
在一些實施例中，跨膜域包含多肽，其包含與NCBI參考編號NP_001139345、AAA92533.1、NP_006130.1、NP_031668.3、NP_932170.1、NP_001106862.1、NP_000607.1、NP_038516.1、NP_001552.2、NP_001070977.1、NP_003318.1、NP_035789.1、NP_036224、NP_059508、NP_005205.2、NP_033973.2、NP_005009、NP_032824、NP_002277.4、NP_032505.1、NP_057466.1、NP_061199.2、NP_861445.4或NP_001032808.2之序列或其片段至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，可使用諸如BLAST或FASTA之標準軟體來確定同源性。在一些實施例中，多肽可包含一個保守胺基酸取代、至多兩個保守胺基酸取代或至多三個保守胺基酸取代。在一些實施例中，多肽可具有作為NCBI參考編號NP_001139345、AAA92533.1、NP_006130.1、NP_031668.3、NP_932170.1、NP_001106862.1、NP_000607.1、NP_038516.1、NP_001552.2、NP_001070977.1、NP_003318.1、NP_035789.1、NP_036224、NP_059508、NP_005205.2、NP_033973.2、NP_005009、NP_032824、NP_002277.4、NP_032505.1、NP_057466.1、NP_061199.2、NP_861445.4或NP_001032808.2之連續部分胺基酸序列，其長度至少為至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230或至少240個胺基酸。
可衍生跨膜域之適合多肽的另外實例包括但不限於以下之跨膜區：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD27、CD3 ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、CD2、CD27、LFA-1（CD11a、CD18）、GITR、CD40、BAFFR、HVEM（LIGHTR）、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRTAM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D及NG2C。
在一些實施例中，跨膜域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（SEQ ID NO:38）。在一些實施例中，跨膜域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR（SEQ ID NO:39）。在一些實施例中，跨膜域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN（SEQ ID NO:40）。 間隔區
在一些實施例中，本發明之CAR（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）亦可包含將細胞外抗原結合域連接至跨膜域之間隔區。間隔區可具有足夠可撓性以允許抗原結合域在不同方向上定向以促進抗原識別。在一些實施例中，間隔區可為來自人類蛋白質之鉸鏈。舉例而言，鉸鏈可為人類Ig（免疫球蛋白）鉸鏈，包括但不限於IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈。在一些實施例中，間隔區可包含IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、IgD鉸鏈、CD28鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈或PDGFR-β細胞外連接子。在一些實施例中，間隔區在抗原結合域與跨膜域之間定位。在一些實施例中，間隔區可包含表3中所列之胺基酸序列中之任一者，或與表3中所列之胺基酸序列中之任一者至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼本發明之間隔區中之任一者的核酸可包含表4中所列之核酸序列中之任一者，或與表4中所列之核酸序列中之任一者至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之核酸序列。 表 3. 間隔胺基酸序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP 41 CD28鉸鏈
ESKYGPPCPSCP 42 IgG4最小鉸鏈
ESKYGPPAPSAP 43 IgG4最小鉸鏈，無雙硫鍵
ESKYGPPCPPCP 44 IgG4 S228P最小鉸鏈，雙硫鍵形成增強
EPKSCDKTHTCP 45 IgG1最小鉸鏈
AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 46 延伸之CD8a鉸鏈
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC 47 LNGFR鉸鏈
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC 48 截短之LNGFR鉸鏈（TNFR-Cys1）
AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV 49 PDGFR-β細胞外連接子
TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 50 示例間隔子
ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 51 示例間隔子
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 52 示例間隔子
表 4. 間隔核酸序列
核酸序列 SEQ ID NO: 描述
GCAGCAGCTATCGAGGTGATGTATCCTCCGCCCTACCTGGATAATGAAAAGAGTAATGGGACTATCATTCATGTAAAAGGGAAGCATCTTTGTCCTTCTCCCCTTTTCCCCGGTCCGTCTAAACCT 53 CD28鉸鏈
GAAAGCAAGTACGGTCCACCTTGCCCTAGCTGTCCG 54 IgG4最小鉸鏈
GAATCCAAGTACGGCCCCCCAGCGCCTAGTGCCCCA 55 IgG4最小鉸鏈，無雙硫鍵
GAATCTAAATATGGCCCGCCATGCCCGCCTTGCCCA 56 IgG4 S228P最小鉸鏈，雙硫鍵形成增強
GAACCGAAGTCTTGTGATAAAACTCATACGTGCCCG 57 IgG1最小鉸鏈
GCTGCTGCTTTCGTACCCGTGTTCCTCCCTGCTAAGCCTACGACTACCCCCGCACCGAGACCACCCACGCCAGCACCCACGATTGCTAGCCAGCCCCTTAGTTTGCGACCAGAAGCTTGTCGGCCTGCTGCTGGTGGCGCGGTACATACCCGCGGCCTTGATTTTGCTTGCGATATATATATCTGGGCGCCTCTGGCCGGAACATGCGGGGTCCTCCTCCTTTCTCTGGTTATTACTCTCTACTGTAATCACAGGAAT 58 延伸之CD8a鉸鏈
GCCTGCCCGACCGGGCTCTACACTCATAGCGGGGAATGTTGTAAGGCATGTAACTTGGGTGAGGGCGTCGCACAGCCCTGCGGAGCTAACCAAACAGTGTGCGAACCCTGCCTCGATAGTGTGACGTTCTCTGATGTTGTATCAGCTACAGAGCCTTGCAAACCATGTACTGAGTGCGTTGGACTTCAGTCAATGAGCGCTCCATGTGTGGAGGCAGATGATGCGGTCTGTCGATGTGCTTACGGATACTACCAAGACGAGACAACAGGGCGGTGCGAGGCCTGTAGAGTTTGTGAGGCGGGCTCCGGGCTGGTGTTTTCATGTCAAGACAAGCAAAATACGGTCTGTGAAGAGTGCCCTGATGGCACCTACTCAGACGAAGCAGATGCAGAATGC 59 LNGFR鉸鏈
GCCTGCCCTACAGGACTCTACACGCATAGCGGTGAGTGTTGTAAAGCATGCAACCTCGGGGAAGGTGTAGCCCAGCCATGCGGGGCTAACCAAACCGTTTGC 60 截短之LNGFR鉸鏈（TNFR-Cys1）
GCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTG 61 PDGFR-β細胞外連接子
在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:41中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:42中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:43中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:44中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:45中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:46中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:47中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:48中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:49中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:50中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:51中所示之序列。在一些實施例中，間隔區包含SEQ ID NO:52中所示之序列。
在一些實施例中，本發明之CAR可進一步包括長度介於2個胺基酸殘基與10個胺基酸殘基之間且可在CAR之跨膜域與細胞質區之間形成連接的短寡肽或多肽連接子。適合的連接子之非限制性實例為甘胺酸-絲胺酸二聯體。在一些實施例中，連接子包含GGCKJSGGCKJS（SEQ ID NO:62）之胺基酸序列。
在一些態樣中，跨膜域進一步包含相同蛋白之細胞外域之至少一部分。 細胞內傳訊域
在一些實施例中，本發明之CAR（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）包含一或多個細胞質域或區。CAR之細胞質域或區可包括細胞內傳訊域。
可用於本發明之CAR的適合細胞內傳訊域之實例包括但不限於共同作用以在抗原受體接合後調節信號轉導之T細胞受體（TCR）及共受體的細胞質序列，以及此等序列及具有相同功能性能力之任何重組序列的任何衍生物或變異體。
不希望受理論束縛，咸信僅經由TCR產生之信號不足以完全活化T細胞，且因此通常亦需要二級及/或共刺激信號來完全活化。因此，T細胞活化可由兩種不同類別之細胞質傳訊序列介導，亦即經由TCR起始抗原依賴性初級活化者（初級細胞內傳訊域）及以抗原獨立方式起作用以提供二級或共刺激信號者（二級細胞質域，例如共刺激域）。此外，T細胞傳訊及功能（例如，活化傳訊級聯）可藉由T細胞中存在之抑制性受體經由細胞內抑制性共傳訊域而負調控。
在一些實施例中，本發明之CAR之細胞內傳訊域可包括抑制性細胞內傳訊域。可使用之抑制性細胞內域的實例包括PD-1、CTLA4、TIGIT、BTLA及LIR-1（LILRB1）、TIM3、KIR3DL1、NKG2A、LAG3、SLAP1、SLAP2、Dok-1、Dok-2、LAIR1、GRB-2、CD200R、SIRPα、HAVR、GITR、PD-L1、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、CD94、KLRG-1、CEACAM1、LIR2、LIR3、LIR5、SIGLEC-2及SIGLEC-10。在一些實施例中，抑制性細胞內傳訊域包括一或多個細胞內抑制性共傳訊域。在一些實施例中，一或多個細胞內抑制性共傳訊域經肽連接子（例如，參見表2）或間隔子或鉸鏈序列（例如，參見表3）連接至其他域（例如，跨膜域）。在一些實施例中，當存在兩個或更多個細胞內抑制性共傳訊域時，兩個或更多個細胞內抑制性共傳訊域可經由肽連接子（例如，參見表2）或間隔子或鉸鏈序列（例如，參見表3）連接。在一些實施例中，細胞內抑制性共傳訊域為抑制性域。在一些實施例中，嵌合蛋白之一或多個細胞內抑制性共傳訊域包含一或多種含ITIM之蛋白質或其片段。ITIM為在許多抑制性免疫受體之細胞質尾區中發現的保守胺基酸序列。含ITIM之蛋白質的實例包括PD-1、TIGIT、BTLA及LIR-1（LILRB1）、TIM3、KIR3DL1、NKG2A、LAG3、LAIR1、SIRPα、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、CD94、KLRG-1、CEACAM1、LIR2、LIR3、LIR5、SIGLEC-2及SIGLEC-10。在一些實施例中，一或多種細胞內抑制性共傳訊域包含一或多種非ITIM支架蛋白或其片段。在一些實施例中，一或多種非ITIM支架蛋白或其片段選自GRB-2、Dok-1、Dok-2、SLAP、LAG3、HAVR、GITR及PD-L1。抑制性細胞內傳訊域可進一步包括酶抑制性域。在一些實施例中，酶抑制性域包含酶催化域。在一些實施例中，酶催化域衍生自選自由以下組成之群的酶：CSK、SHP-1、PTEN、CD45、CD148、PTP-MEG1、PTP-PEST、c-CBL、CBL-b、PTPN22、LAR、PTPH1、SHIP-1及RasGAP。傳訊之酶調控之實例更詳細描述於Pavel Otáhal等人 (Biochim Biophys Acta. 2011年2月;1813(2):367-76)、Kosugi A.等人 (Involvement of SHP-1 tyrosine phosphatase in TCR-mediated signaling pathways in lipid rafts, Immunity, 2001年6月; 14(6): 669-80)及Stanford等人 (Regulation of TCR signaling by tyrosine phosphatases: from immune homeostasis to autoimmunity, Immunology, 2012年9月; 137(1): 1-19)，各自出於所有目的以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之CAR的細胞內傳訊域可包含初級傳訊域，其以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之初級活化。以刺激方式作用之初級細胞內傳訊域可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體（ITAM）之傳訊模體。可用於本發明之CAR的適合含ITAM初級細胞內傳訊域之實例包括但不限於CD3-ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278（亦稱為「ICOS」）FcεRI、DAP10、DAP12及CD66d之彼等ITAM。
在一些實施例中，本發明之CAR（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）包含細胞內傳訊域，例如CD3-ζ多肽之初級傳訊域。本發明之CD3-ζ多肽可具有與NCBI參考編號NP_932170或NP_001106864.2之序列或其片段至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3-ζ多肽可包含一個保守胺基酸取代、至多兩個保守胺基酸取代或至多三個保守胺基酸取代。在一些實施例中，多肽可具有作為NCBI參考編號NP_932170或NP_001106864.2之連續部分的胺基酸序列，其長度為至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少160、至少170或至少180個胺基酸。
在其他實施例中，初級傳訊域包含經修飾之ITAM域，例如原生ITAM域相比具有改變（例如，增加或減少）活性的突變ITAM域。在一個實施例中，初級傳訊域包含經修飾之含ITAM之初級細胞內傳訊域，例如經最佳化及/或截短之含ITAM之初級細胞內傳訊域。在一個實施例中，初級傳訊域包含一個、兩個、三個、四個或更多個ITAM模體。
在一些實施例中，本發明之CAR的細胞內傳訊域可本身包含CD3-ζ傳訊域，或其可與適用於本發明之CAR情形的任何其他所需細胞內傳訊域組合。例如，CAR之細胞內傳訊域可包含CD3-ζ鏈部分及共刺激傳訊域。共刺激傳訊域可指包含共刺激分子之細胞內域之CAR的一部分。本發明之共刺激分子為淋巴球對抗原之有效反應可能所需的除抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子。適合的共刺激分子之實例包括但不限於CD97、CD2、ICOS、CD27、CD154、CD8、OX40、4-1BB、CD28、ZAP40、CD30、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、MyD88、2B4、CD40、PD-1、淋巴球功能相關抗原1（LFA-1）、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體、I類MHC分子、TNF受體蛋白、類免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、傳訊淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、CDS、ICAM-1、(CD11a/CD18)、BAFFR、KIRDS2、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRTAM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及其類似物。
在一些實施例中，本發明之CAR之細胞質部分內的細胞內傳訊序列可以隨機或指定順序彼此連接。在一些實施例中，例如長度在2個胺基酸與10個胺基酸之間（例如，2個胺基酸、3個胺基酸、4個胺基酸、5個胺基酸、6個胺基酸、7個胺基酸、8個胺基酸、9個胺基酸或10個胺基酸）的短寡肽或多肽連接子可形成細胞內傳訊序列之間的連接。在一個實施例中，可使用甘胺酸-絲胺酸二聯體作為適合的連接子。在一個實施例中，可使用單一胺基酸，例如丙胺酸或甘胺酸作為適合的連接子。
在一些實施例中，細胞內傳訊域包含兩個或更多個共刺激傳訊域，例如，兩個共刺激傳訊域、三個共刺激傳訊域、四個共刺激傳訊域、五個共刺激傳訊域、六個共刺激傳訊域、七個共刺激傳訊域、八個共刺激傳訊域、九個共刺激傳訊域、10個共刺激傳訊域或更多個共刺激傳訊域。在一個實施例中，細胞內傳訊域包含兩個共刺激傳訊域。在一些實施例中，兩個或更多個共刺激傳訊域由本發明之連接子（例如，表2中所描述之連接子中之任一者）分開。在一個實施例中，連接子為甘胺酸殘基。在另一實施例中，連接子為丙胺酸殘基。
在一些實施例中，本發明之細胞表現包括結合EMCN之抗原結合域、本發明之跨膜域、初級傳訊域及一或多個共刺激傳訊域的CAR。
在一些實施例中，本發明之細胞表現包括結合EMCN之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域）、本發明之跨膜域及一或多個細胞內抑制性共傳訊域的iCAR。在一些實施例中，本發明之細胞表現包括結合EMCN之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域）、本發明之跨膜域、初級傳訊域及一或多個共刺激傳訊域的CAR。在一些實施例中，本發明之細胞表現包括結合EMCN之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域）、本發明之跨膜域、位於抗原結合域與跨膜域之間的鉸鏈、初級傳訊域及一或多個共刺激傳訊域的CAR。
在一些實施例中，跨膜域衍生自與該一或多個細胞內傳訊域中之一者相同的蛋白。在一些實施例中，CAR為抑制性CAR且包括跨膜域及至少一個細胞內抑制性共傳訊域，各自衍生自選自以下之蛋白質：PD-1、CTLA4、TIGIT、BTLA及LIR1（LILRB1）、TIM3、KIR3DL1、NKG2A、LAG3、SLAP1、SLAP2、Dok-1、Dok-2、LAIR1、GRB-2、CD200R、SIRPα、HAVR、GITR、PD-L1、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、CD94、KLRG-1、CEACAM1、LIR2、LIR3、LIR5、SIGLEC-2及SIGLEC-10。
在一些實施例中，跨膜域衍生自第一蛋白，且該一或多個細胞內傳訊域衍生自與第一蛋白不同的第二蛋白。 自然殺手細胞受體（ NKR ） CAR
在一些實施例中，本發明之CAR（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）包含自然殺手細胞受體（NKR）之一或多種組分，藉此形成NKR-CAR。NKR組分可為來自任何適合自然殺手細胞受體之跨膜域、鉸鏈域或細胞質域，包括但不限於殺手細胞類免疫球蛋白受體（KIR）諸如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1及KIRS DPI；天然細胞毒性受體（NCR），諸如NKp30、NKp44、NKp46；傳訊淋巴球活化分子（SLAM）家族免疫細胞受體，諸如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME及CD2F-10；Fc受體（FcR），諸如CD16及CD64；以及Ly49受體，諸如LY49A及LY49C。在一些實施例中，NKR-CAR可與轉接分子或細胞內傳訊域，諸如DAP12相互作用。包含NKR組分之CAR的例示性組態及序列描述於2014年9月18日公開之國際專利公開案WO2014/145252中。 額外嵌合受體目標
本發明之某些態樣係關於結合至除EMCN以外之所關注抗原的嵌合受體及編碼此類嵌合受體之核酸。本發明之某些態樣係關於結合至除EMCN以外之所關注抗原的嵌合受體及經基因修飾以表現此類嵌合受體中之一或多者的細胞，諸如免疫反應性細胞，以及使用此類受體及細胞治療及/或預防骨髓惡性腫瘤（諸如AML）及需要抗原特異性免疫反應之其他病變的方法。惡性細胞已發展出一系列保護自身不受免疫識別及清除的機制。本發明提供在腫瘤微環境中用於治療此類惡性細胞之免疫原性。
在一些實施例中，第一嵌合受體包括結合EMCN之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域）且第二嵌合受體包括結合第二抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）之額外抗原結合域。在一些實施例中，細胞可表現對EMCN具有特異性之第一嵌合受體（例如，包括具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者之EMCN特異性抗原結合域的CAR）及對第二抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）具有特異性之第二嵌合受體。在一些實施例中，細胞可表現對EMCN具有特異性之第一嵌合抑制性受體（例如，包括具有表A中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域之抑制性CAR）及對第二抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）具有特異性之第二嵌合受體。舉例而言，細胞（例如，免疫反應性細胞）可經工程改造以共表現或能夠共表現包括結合EMCN之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域）的iCAR及靶向腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）之aCAR。除EMCN以外，結合至抗原之適合抗體包括足夠強有力且特異性地結合至第二抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）之任何抗體，無論天然或合成、全長或其片段、單株或多株。AML相關抗原之實例包括FLT3、CD33、CD123、CLEC12A、CXCR4及EphA3。在一些實施例中，市售抗體可用於結合至第二抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）。市售抗體之CDR容易由熟習此項技術者使用習知定序技術獲得。此外，熟習此項技術者能夠基於此類市售抗體之CDR構築編碼scFv及嵌合受體（例如，CAR及TCR）之核酸。 T 細胞受體（ TCR ）
本發明之某些態樣係關於特異性結合至第二抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）之嵌合受體，且第二抗原之嵌合受體為經工程改造之T細胞受體（TCR）。本發明之TCR為含有兩個可變鏈之雙硫鍵連接的異二聚蛋白質，可變鏈表現為與不變CD3鏈分子之複合物的一部分。TCR在T細胞之表面上發現，且負責識別呈與主要組織相容複合物（MHC）分子結合之肽形式的抗原。在某些實施例中，本發明之TCR包含由TRA編碼之α鏈及由TRB編碼之β鏈。在某些實施例中，TCR包含γ鏈及δ鏈（分別由TRG及TRD編碼）。
TCR之各鏈由兩個細胞外域構成：可變（V）區及恆定（C）區。固定區接近細胞膜，其後為跨膜區及短細胞質尾區。可變區結合至肽/MHC複合物。各可變區具有三個互補決定區（CDR）。
在某些實施例中，TCR可與三個二聚傳訊模組CD3δ/ε、CD3γ/ε及CD247ζ/ζ或CD247ζ/η形成受體複合物。當TCR複合物與其抗原及MHC（肽/MHC）結合時，表現TCR複合物之T細胞經活化。
在一些實施例中，本發明之TCR為重組TCR。在某些實施例中，TCR為非天然存在之TCR。在某些實施例中，TCR與天然存在之TCR的差異在於至少一個胺基酸殘基。在一些實施例中，TCR與天然存在之TCR的差異在於至少2個胺基酸殘基、至少3個胺基酸殘基、至少4個胺基酸殘基、至少5個胺基酸殘基、至少6個胺基酸殘基、至少7個胺基酸殘基、至少8個胺基酸殘基、至少9個胺基酸殘基、至少10個胺基酸殘基、至少11個胺基酸殘基、至少12個胺基酸殘基、至少13個胺基酸殘基、至少14個胺基酸殘基、至少15個胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、至少30個胺基酸殘基、至少40個胺基酸殘基、至少50個胺基酸殘基、至少60個胺基酸殘基、至少70個胺基酸殘基、至少80個胺基酸殘基、至少90個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基或更多胺基酸殘基。在某些實施例中，TCR自天然存在之TCR經至少一個胺基酸殘基修飾。在一些實施例中，TCR自天然存在之TCR經至少2個胺基酸殘基、至少3個胺基酸殘基、至少4個胺基酸殘基、至少5個胺基酸殘基、至少6個胺基酸殘基、至少7個胺基酸殘基、至少8個胺基酸殘基、至少9個胺基酸殘基、至少10個胺基酸殘基、至少11個胺基酸殘基、至少12個胺基酸殘基、至少13個胺基酸殘基、至少14個胺基酸殘基、至少15個胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、至少30個胺基酸殘基、至少40個胺基酸殘基、至少50個胺基酸殘基、至少60個胺基酸殘基、至少70個胺基酸殘基、至少80個胺基酸殘基、至少90個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基或更多胺基酸殘基修飾。 嵌合 TCR
在一些實施例中，本發明之TCR包含一或多個抗原結合域，其可移植至TCR鏈之一或多個恆定域，例如TCR α鏈或TCR β鏈，以產生特異性結合至第二所關注抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）之嵌合TCR。不希望受理論束縛，咸信嵌合TCR可在抗原結合時經由TCR複合物傳訊。舉例而言，抗體或抗體片段（例如，scFv）可移植至TCR鏈（諸如TCR α鏈及/或TCR β鏈）之恆定域（例如，細胞外恆定域之至少一部分）、跨膜域及細胞質域。作為另一實例，抗體或抗體片段之CDR可移植至TCR α鏈及/或β鏈中，以產生特異性結合至第二抗原，諸如腫瘤相關抗原（例如，AML相關抗原）之嵌合TCR。此類嵌合TCR可藉由此項技術中已知之方法（例如Willemsen RA等人, Gene Therapy 2000; 7:1369-1377；Zhang T等人, Cancer Gene Ther 2004 11: 487-496；及Aggen等人, Gene Ther. 2012年4月; 19(4): 365-74）產生。 免疫反應性細胞
本發明之某些態樣係關於細胞，諸如免疫反應性細胞，其經基因工程改造以包含一或多種本發明之嵌合受體或一或多種編碼此類嵌合受體之核酸，及使用此類細胞治療骨髓惡性腫瘤（例如，AML）之方法。
在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞為初代細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞為細胞株。在一些實施例中，哺乳動物細胞為骨髓細胞、血細胞、皮膚細胞、骨胳細胞、肌肉細胞、神經元細胞、脂肪細胞、肝細胞或心臟細胞。在一些實施例中，細胞為幹細胞。例示性幹細胞包括但不限於胚胎幹細胞（ESC）、誘導性富潛能幹細胞（iPSC）、成體幹細胞及組織特異性幹細胞，諸如造血幹細胞（血液幹細胞）、間葉幹細胞（MSC）、神經幹細胞、上皮幹細胞或皮膚幹細胞。在一些實施例中，細胞為自本發明之幹細胞衍生或分化之細胞。在一些實施例中，細胞為免疫細胞。本發明之免疫細胞可自本發明之幹細胞（例如，自ESC或iPSC）分離或分化。例示性免疫細胞包括但不限於T細胞（例如，輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、自然殺手T細胞、αβ T細胞及γδ T細胞）、B細胞、自然殺手（NK）細胞、樹突狀細胞、骨髓細胞、巨噬細胞及單核球。在一些實施例中，細胞為神經元細胞。本發明之神經元細胞可自本發明之幹細胞（例如，自ESC或iPSC）分離或分化。例示性神經元細胞包括但不限於神經前驅細胞、神經元（例如，感覺神經元、運動神經元、膽鹼激導性神經元、GABA激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、多巴胺激導性神經元或血清素激導性神經元）、星形細胞、寡樹突神經膠質細胞及小神經膠質細胞。
在一些實施例中，細胞為免疫反應性細胞。本發明之免疫反應性細胞可自本發明之幹細胞（例如，自ESC或iPSC）分離或分化。本發明之例示性免疫反應性細胞包括但不限於淋巴譜系細胞。包含B細胞、T細胞及自然殺手（NK）細胞之淋巴譜系提供抗體之產生、細胞免疫系統之調控、血液中外來物之偵測、宿主外來細胞之偵測及其類似者。淋巴譜系之免疫反應性細胞之實例包括但不限於T細胞、自然殺手（NK）細胞、胚胎幹細胞、富潛能幹細胞及誘導性富潛能幹細胞（例如，可衍生或分化淋巴細胞之細胞）。T細胞可為在胸腺中成熟且主要負責細胞介導之免疫之淋巴球。T細胞涉及適應性免疫系統。在一些實施例中，本發明之T細胞可為任何類型之T細胞，包括但不限於T輔助細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞（包括中樞記憶T細胞、類幹細胞記憶T細胞（stem-cell-like memory T cell/stem-like memory T cell）及兩種類型之效應記憶T細胞：例如T EM細胞及T EMRA細胞、調節性細胞（亦稱為抑制T細胞）、自然殺手T細胞、黏膜相關恆定T細胞及γδ T細胞。細胞毒性T細胞（CTL或殺手T細胞）為能夠誘導受感染之體細胞或腫瘤細胞死亡的T淋巴球亞群。患者之自身T細胞可經由引入一或多種嵌合受體（諸如嵌合TCR或CAR）經基因修飾以靶向特定抗原。
自然殺手（NK）細胞可為作為細胞介導之免疫之一部分且在先天性免疫反應期間起作用的淋巴球。NK細胞不需要先前活化以對執行其對目標細胞之細胞毒性作用。
在一些實施例中，本發明之免疫反應性細胞為T細胞。本發明之T細胞可為自體、同種異體或活體外衍生自經工程改造之前驅細胞或幹細胞。
在一些實施例中，本發明之免疫反應性細胞為具有缺陷型TCR-αβ之通用T細胞。開發通用T細胞之方法描述於此項技術中，例如Valton等人, Molecular Therapy (2015); 23 9, 1507-1518及Torikai等人, Blood 2012 119:5697-5705中。
在一些實施例中，本發明之免疫反應性細胞為包含一或多種本發明之嵌合受體的經分離之免疫反應性細胞。在一些實施例中，免疫反應性細胞包含一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種或十種或更多種本發明之嵌合受體。
在一些實施例中，免疫反應性細胞為T細胞。在一些實施例中，免疫反應性細胞為自然殺手（NK）細胞。
在一些實施例中，免疫反應性細胞表現或能夠表現免疫受體。免疫受體一般能夠在表現免疫受體之細胞中誘導信號轉導或蛋白質表現之變化，在結合至同源配位體之後引起免疫反應之調節（例如，調控、活化、起始、刺激、增加、防止、減弱、抑制、降低、減少、抑制或壓制免疫反應）。舉例而言，當回應於配位體結合CD3鏈存在於TCR/CAR簇中時，產生基於免疫受體酪胺酸之活化模體（ITAM）介導之信號轉導級聯。特定言之，在某些實施例中，當內源TCR、外源TCR、嵌合TCR或CAR（特定言之，活化CAR）結合其各別抗原時，發生免疫突觸形成，其包括靠近結合受體之許多分子（例如，CD4或CD8、CD3γ/δ/ε/ζ等）之群集。膜結合傳訊分子之此群集允許含於CD3鏈內之ITAM模體變為磷酸化，繼而可起始T細胞活化路徑且最終活化轉錄因子，諸如NF-κB及AP-1。此等轉錄因子能夠誘導T細胞之全域基因表現，以增加IL-2產生用於增殖及主調節T細胞蛋白之表現，以便起始T細胞介導之免疫反應，諸如細胞介素產生及/或T細胞介導之殺傷。 表現多種嵌合受體之細胞
在一些實施例中，本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）包含兩種或更多種本發明之嵌合受體。在一些實施例中，細胞包含兩種或更多種嵌合受體，其中兩種或更多種嵌合受體中之一者為嵌合抑制性受體。在一些實施例中，細胞包含三種或更多種嵌合受體，其中三種或更多種嵌合受體中之至少一者為嵌合抑制性受體。在一些實施例中，細胞包含四種或更多種嵌合受體，其中四種或更多種嵌合受體中之至少一者為嵌合抑制性受體。在一些實施例中，細胞包含五種或更多種嵌合受體，其中五種或更多種嵌合受體中之至少一者為嵌合抑制性受體。
在一些實施例中，兩種或更多種嵌合受體中之各者包含不同抗原結合域，例如結合至相同抗原或不同抗原之抗原結合域。在一些實施例中，由兩種或更多種嵌合受體結合之各抗原在相同細胞，諸如骨髓細胞類型（例如，相同AML細胞類型）上表現。在一些實施例中，由兩種或更多種嵌合受體結合之各抗原為AML相關抗原（例如，FLT3、CD33、CD123、CLEC12A、CXCR4、EphA3等）。
在本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）表現兩種或更多種不同嵌合受體之實施例中，不同嵌合受體中之各者的抗原結合域可經設計以使得抗原結合域不彼此相互作用。舉例而言，表現第一嵌合受體（例如，EMCN特異性嵌合受體）及第二嵌合受體之本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）可包含第一嵌合受體，其包含不與第二嵌合受體之抗原結合域形成締合的抗原結合域。舉例而言，第一嵌合受體之抗原結合域可包含抗體片段，諸如scFv，而第二嵌合受體之抗原結合域可包含VHH。
不希望受理論束縛，咸信在具有複數個各自包含抗原結合域之嵌合膜嵌入受體的細胞中，受體中之各者的抗原結合域之間的相互作用可為不合需要的，因為此類相互作用可抑制抗原結合域中之一或多者與其同源抗原結合之能力。因此，在本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）表現兩種或更多種嵌合受體之實施例中，嵌合受體包含使此類抑制性相互作用最小化之抗原結合域。在一個實施例中，一個嵌合受體之抗原結合域包含scFv且第二嵌合受體之抗原結合域包含單VH域，例如駱駝、鯊魚或七鰓鰻單VH域，或衍生自人類或小鼠序列之單VH域。 在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，第一嵌合受體之抗原結合域與其同源抗原之結合（例如，EMCN特異性嵌合受體與EMCN之結合）不實質上由第二嵌合受體之存在減少。在一些實施例中，在第二嵌合受體存在下第一嵌合受體之抗原結合域與其同源抗原之結合為在第二嵌合受體不存在之情況下第一嵌合受體之抗原結合域與其同源抗原之結合的85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，第一嵌合受體及第二嵌合受體之抗原結合域彼此締合之程度小於兩者均為scFv抗原結合域時締合之程度。在一些實施例中，第一嵌合受體及第二嵌合受體之抗原結合域之彼此締合比兩者均為scFv抗原結合域時低85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。 嵌合抑制性受體
在一些實施例中，本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）包含一或多種本發明之嵌合抑制性受體。在一些實施例中，一或多種嵌合抑制性受體中之各者包含結合一般在正常細胞（例如，通常視為健康之細胞）上但不在腫瘤細胞（諸如AML細胞）上表現之抗原的抗原結合域。在一些實施例中，嵌合抑制性受體包括結合EMCN之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的EMCN特異性抗原結合域）。
在一些實施例中，一或多種嵌合抑制性受體結合在衍生自選自由以下組成之群的組織之非腫瘤細胞上表現的抗原：腦、神經元組織、內分泌、骨、骨髓、免疫系統、內皮組織、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些實施例中，嵌合抑制性受體（例如，EMCN特異性嵌合抑制性受體）可例如與本發明細胞（例如，免疫反應性細胞）上表現之一或多種活化嵌合受體（例如，活化嵌合TCR或CAR）一起用作非邏輯閘以控制、調節或以其他方式抑制一或多種活化嵌合受體之一或多種活性。在一些實施例中，本發明之嵌合抑制性受體可抑制本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）的一或多種活性。
在一些實施例中，本發明之細胞包含一或多種本發明之嵌合抑制性受體，且進一步包含結合至一或多種腫瘤相關抗原之靶向腫瘤之嵌合受體。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括AML相關抗原。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括CD33。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括FLT3。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括CD33及FLT3。 共刺激配位體
在一些實施例中，本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）可進一步包括一或多種重組或外源共刺激配位體。舉例而言，細胞可進一步用一或多種共刺激配位體轉導，使得細胞共表現或經誘導以共表現一或多種本發明之嵌合受體（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）及一或多種共刺激配位體。不希望受理論束縛，咸信一或多種嵌合受體與一或多種共刺激配位體之間的相互作用可提供對細胞完全活化很重要的非抗原特異性信號。適合的共刺激配位體之實例包括但不限於腫瘤壞死因子（TNF）超家族之成員及免疫球蛋白（Ig）超家族配位體。TNF係一種涉及全身性發炎且刺激急性期反應之細胞介素。其主要作用為調控免疫細胞。TNF超家族之成員具有許多共同特徵。大多數TNF超家族成員合成為含有短細胞質段及相對長的細胞外區之第II型跨膜蛋白（細胞外C端）。適合的TNF超家族成員之實例包括但不限於神經生長因子（NGF）、CD40L（CD40L）/CD 154、CD137L/4-1BBL、TNF-a、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配位體（FasL）、CD30L/CD153、腫瘤壞死因子β（TNFP）/淋巴毒素α（LTa）、淋巴毒素β（LTP）、CD257/B細胞活化因子（B AFF）/Bly s/THANK/Tall-1、糖皮質激素誘導之TNF受體配位體（GITRL）及TNF相關細胞凋亡誘導配位體（TRAIL）、LIGHT（TNFSF 14）。免疫球蛋白（Ig）超家族為參與細胞識別、結合或黏著過程之一大群細胞表面及可溶性蛋白質。此等蛋白質與免疫球蛋白共有結構特徵且具有免疫球蛋白域（摺疊）。適合的免疫球蛋白超家族配位體之實例包括但不限於CD80及CD86，兩者均為CD28之配位體；PD-L1/（B7-H1），其為PD-1之配位體。在某些實施例中，一或多種共刺激配位體選自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14、PD-L1及其組合。 趨化介素受體
在一些實施例中，本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）包含一或多種嵌合受體（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）且可進一步包括一或多種趨化介素受體。舉例而言，細胞（諸如T細胞）中之趨化介素受體CCR2b或CXCR2之基因轉殖表現增強對分泌CCL2或分泌CXCL1之實體腫瘤的運輸（Craddock等人, J Immunother. 2010年10月; 33(8):780-8及Kershaw等人Hum Gene Ther. 2002年11月1日; 13(16): 1971 -80）。不希望受理論束縛，咸信在本發明之表現嵌合受體之細胞上表現的趨化介素受體可識別由腫瘤分泌之趨化介素且改良細胞對腫瘤之靶向，其可促進細胞向腫瘤浸潤且增強細胞之抗腫瘤功效。本發明之趨化介素受體可包括天然存在之趨化介素受體、重組趨化介素受體或其趨化介素結合片段。可在本發明之細胞上表現的適合趨化介素受體之實例包括但不限於CXC趨化介素受體，諸如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7；CC趨化介素受體，諸如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11；CX3C趨化介素受體，諸如CX3CR1；XC趨化介素受體，諸如XCR1；及其趨化介素結合片段。在一些實施例中，待在細胞上表現之趨化介素受體係基於由腫瘤分泌之趨化介素來選擇。 嵌合受體調控
本發明之一些實施例係關於調控本發明之表現嵌合受體之細胞（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）的一或多種嵌合受體活性。有數種可調控嵌合受體活性之方式。在一些實施例中，可調控嵌合受體，其中一或多種嵌合受體活性可控制，可為最佳化嵌合受體療法之安全性及/或功效所需的。舉例而言，使用與二聚化域融合之凋亡蛋白酶誘導細胞凋亡（參見例如Di等人, N Engl. J. Med. 2011年11月3日; 365(18): 1673-1683）可用作嵌合受體療法中之安全開關。在一些實施例中，本發明之表現嵌合受體之細胞亦可表現誘導型凋亡蛋白酶-9（iCaspase-9），其在投與二聚化劑藥物，諸如雷米杜西（rimiducid）（IUPAC名稱：(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁醯基]哌啶-2-甲酸[(1R)-3-(3,4-二甲氧苯基)-1-[3-[2-[2-[[2-[3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁醯基]哌啶-2-羰基]氧基丙基]苯氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙氧基]苯基]丙基]酯）後，誘導凋亡蛋白酶-9之活化且引起細胞凋亡。在一些實施例中，iCaspase-9含有結合域，該結合域包含二聚化之化學誘導劑（CID），其在CID之存在下介導二聚化，此引起表現嵌合受體之細胞的誘導型及選擇性耗乏。
替代地，在一些實施例中，本發明之嵌合受體可藉由使用去活化或以其他方式抑制嵌合受體活性之小分子或抗體來調控。舉例而言，抗體可藉由誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（AACC）使表現嵌合受體之細胞缺失。在一些實施例中，本發明之表現嵌合受體之細胞可進一步表現由能夠藉由ADCC或補體誘導之細胞死亡誘導細胞死亡之分子識別的抗原。舉例而言，本發明之表現嵌合受體之細胞可進一步表現能夠由抗體或抗體片段靶向之受體。可由抗體或抗體片段靶向之適合受體的實例包括但不限於EpCAM、VEGFR、整合素（例如，ανβ3、α4、αI¾β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族成員（例如，TRAIL-R1及TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白（basigin）、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及EGFR，及其截短型式。
在一些實施例中，本發明之表現嵌合受體之細胞亦可表現缺乏傳訊能力但保持由能夠誘導ADCC之分子識別之表位的截短表皮生長因子受體（EGFR）（例如，WO2011/056894）。
在一些實施例中，本發明之表現嵌合受體之細胞進一步包括高度表現之緊密標記/自殺基因，其在表現嵌合受體之細胞中組合來自CD32及CD20抗原兩者之目標表位，其結合抗CD20抗體（例如，利妥昔單抗（rituximab）），從而引起藉由ADCC選擇性耗乏表現嵌合受體之細胞。耗乏本發明之表現嵌合受體之細胞的其他方法可包括但不限於投與單株抗CD52抗體，其選擇性結合且靶向表現嵌合受體之細胞以藉由誘導ADCC進行破壞。在一些實施例中，表現嵌合受體之細胞可使用嵌合受體配位體，諸如抗個體基因型抗體選擇性地靶向。在一些實施例中，抗個體基因型抗體可引起效應細胞活性，諸如ADCC或ADC活性。在一些實施例中，嵌合受體配位體可進一步偶合至誘導細胞殺傷之藥劑，諸如毒素。在一些實施例中，本發明之表現嵌合受體之細胞可進一步表現由本發明之細胞耗乏劑識別的目標蛋白。在一些實施例中，目標蛋白為CD20且細胞耗乏劑為抗CD20抗體。在此類實施例中，一旦期望減少或消除表現嵌合受體之細胞，則投與細胞耗乏劑。在一些實施例中，細胞耗乏劑為抗CD52抗體。
在一些實施例中，經調控嵌合受體包含一組多肽，其中本發明之嵌合受體之組分分配於獨立多肽或成員上。舉例而言，該組多肽可包括二聚化開關，在二聚化分子存在時，其可將多肽彼此偶合以形成功能性嵌合受體。 編碼 EMCN 特異性蛋白質之核酸構築體
本發明之某些態樣係關於編碼一或多種本發明之EMCN特異性蛋白質（例如，本文所描述之EMCN特異性CAR）的核酸（例如，經分離之核酸）。在一些實施例中，核酸為RNA構築體，諸如信使RNA（mRNA）轉錄本或經修飾RNA。在一些實施例中，核酸為DNA構築體。
在一些實施例中，本發明之核酸編碼嵌合受體，其包含一或多個抗原結合域，其中各域結合至目標抗原（例如，EMCN）；跨膜域；及一或多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，核酸編碼包含抗原結合域、跨膜域、初級傳訊域（例如，CD3-ζ域）及一或多個共刺激傳訊域之嵌合受體。在一些實施例中，核酸進一步包含編碼間隔區之核苷酸序列。在一些實施例中，抗原結合域藉由間隔區連接至跨膜域。在一些實施例中，間隔區包含選自表3中所列之核酸序列中之任一者的核酸序列。在一些實施例中，核酸進一步包含編碼前導序列之核苷酸序列。
本發明之核酸可使用此項技術中已知之任何適合重組方法獲得，包括但不限於藉由自表現所關注基因之細胞篩選庫、藉由自已知包括該基因之載體衍生所關注基因，或藉由使用標準技術自含有該基因之細胞及組織直接分離出所關注基因。替代地，可合成產生所關注基因。
在一些實施例中，本發明之核酸包含在載體內。在一些實施例中，本發明之核酸經由轉位子、CRISPR/Cas9系統、TALEN或鋅指核酸酶在細胞中表現。
在一些實施例中，編碼本發明之嵌合受體之核酸的表現可藉由將核酸可操作地連接至啟動子且將構築體併入表現載體中來達成。適合的載體可在真核細胞中複製及整合。典型的選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調控所需核酸序列之表現的啟動子。
在一些實施例中，本發明之表現構築體亦可使用標準基因遞送方案（例如，US5399346、US5580859及US5589466）用於核酸免疫及基因療法。在一些實施例中，本發明之載體為基因療法載體。
本發明之核酸可選殖至許多類型之載體中。舉例而言，核酸可選殖至包括但不限於質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒或黏質體之載體中。在一些實施例中，載體可為表現載體、複製載體、探針產生載體或定序載體。
在一些實施例中，質體載體包含轉位子/轉位酶系統以將本發明之核酸併入宿主細胞基因體中。使用轉位子及轉位酶質體系統在免疫細胞中表現蛋白質之方法一般描述於Chicaybam L, Hum Gene Ther. 2019年4月;30(4):511-522. doi: 10.1089/hum.2018.218；及Ptáčková P, Cytotherapy. 2018年4月;20(4):507-520. doi: 10.1016/j.jcyt.2017.10.001，各自以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，轉位子系統為Sleeping Beauty轉位子/轉位子酶或piggyBac轉位子/轉位子酶。
在一些實施例中，本發明之表現載體可以病毒載體形式提供至細胞。適合的病毒載體系統為此項技術中所熟知。舉例而言，病毒載體可衍生自反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。在一些實施例中，本發明之載體為慢病毒載體。慢病毒載體適用於長期基因轉移，因為這類載體允許轉殖基因之長期穩定整合及其在子細胞中的傳播。慢病毒載體亦優於衍生自致癌反轉錄病毒（例如，鼠類白血病病毒）之載體，因為慢病毒載體可轉導非增殖細胞。在一些實施例中，本發明之載體為腺病毒載體（A5/35）。在一些實施例中，本發明之載體含有在至少一種生物體中起作用之複製起點、啟動子序列、適宜的限制性核酸內切酶部位及一或多個可篩選標記（例如，WO01/96584；WO01/29058；及US6326193）。已經開發出多種基於病毒之系統用於將基因轉移至哺乳動物細胞中。所選基因可插入載體中且使用此項技術中已知之技術封裝於反轉錄病毒粒子中。重組病毒接著可分離且活體內或離體遞送至哺乳動物細胞中。多種反轉錄病毒系統為此項技術中已知的。
在一些實施例中，本發明之載體包括額外的啟動子元件，諸如調控轉錄起始頻率之強化子。強化子通常位於起始部位上游30 bp至110 bp之區，儘管許多啟動子已被證明亦含有在起始部位下游之功能元件。啟動子元件之間的間距可為靈活的，使得當元件相對彼此倒置或移動時保留啟動子功能。例如，在胸苷激酶（tk）啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始降低之前可增加至50 bp。視啟動子而定，個別元件可協作地或獨立地發揮活化轉錄功能。例示性啟動子可包括但不限於SFFV基因啟動子、EFS基因啟動子、CMV IE基因啟動子、EFla啟動子、泛素C啟動子及磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子。
在一些實施例中，能夠在哺乳動物細胞（諸如本發明之免疫反應性細胞）中表現本發明之核酸的啟動子為EF1a啟動子。原生EF1a啟動子驅動延長因子-1複合物之α次單元的表現，該複合物負責將胺基醯基tRNA酶遞送至核糖體。EF1a啟動子已廣泛地用於哺乳動物表現質體，且已被證明有效驅動來自選殖至慢病毒載體中之核酸的嵌合受體表現。
在一些實施例中，能夠在哺乳動物細胞（諸如本發明之免疫反應性細胞）中表現本發明之核酸的啟動子為構成型啟動子。例如，適合的構成型啟動子為即刻早期巨細胞病毒（CMV）啟動子。CMV啟動子為強構成型啟動子，其能夠驅動任何可操作地連接至啟動子之聚核苷酸序列的高水平表現。其他適合的構成型啟動子包括但不限於泛素C（UbiC）啟動子、猿猴病毒40（SV40）早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒（MMTV）啟動子、人類免疫缺乏病毒（HIV）長末端重複序列（LTR）啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）即刻早期啟動子、勞氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）啟動子、肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延長因子-la啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。
在一些實施例中，能夠在哺乳動物細胞（諸如本發明之免疫反應性細胞）中表現本發明之核酸的啟動子為誘導型啟動子。使用誘導型啟動子可提供當啟動子可操作地連接到核酸時能夠誘導或抑制本發明之核酸表現的分子開關。誘導型啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
在一些實施例中，本發明之載體可進一步包含信號序列以促進分泌、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子、允許游離型複製之元件及/或允許選擇之元件。
在一些實施例中，本發明之載體可進一步包含可篩選標記基因及/或報導基因，以促進自已經載體轉導之細胞群鑑別及選擇表現嵌合受體之細胞。在一些實施例中，可篩選標記可由與載體分開且用於共轉染程序之核酸編碼。可篩選標記或報導基因可側接適當調控序列，以允許在宿主細胞中表現。可篩選標記之實例包括但不限於抗生素抗性基因，諸如neo及其類似物。
在一些實施例中，報導基因可用於鑑別經轉導細胞且評估調控序列之功能。如本文所揭示，報導基因為不存在於受體生物體或組織中或由受體生物體或組織表現，且編碼表現產生諸如酶活性之可偵測特性之多肽的基因。報導基因之表現可在核酸已引入受體細胞中之後的適合時間分析。報導基因之實例包括但不限於編碼螢光素酶之基因、編碼β-半乳糖苷酶之基因、編碼氯黴素乙醯基轉移酶之基因、編碼分泌性鹼性磷酸酶之基因及編碼綠色螢光蛋白之基因。適合的表現系統為此項技術中所熟知且可使用已知技術製備或商購獲得。在一些實施例中，具有顯示報導基因之最高表現水平的最小5'側接區之構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區可連接至報導基因且用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
在一些實施例中，包含編碼本發明之EMCN特異性蛋白質（例如，嵌合受體）之核酸序列的載體進一步包含編碼增加嵌合受體活性之多肽的第二核酸。
在表現EMCN特異性蛋白質之細胞包含兩種或更多種異源蛋白質（例如，兩種或更多種嵌合受體）之實施例中，單一核酸可在單一調節控制元件（例如，啟動子）下編碼兩種或更多種蛋白質，或在包含於核酸中之各編碼蛋白質之核苷酸序列的獨立調節控制元件下編碼兩種或更多種蛋白質。在表現EMCN特異性蛋白質之細胞包含兩種或更多種異源蛋白質之一些實施例中，各異源蛋白質可由獨立核酸編碼。在一些實施例中，各獨立核酸包含其自身控制元件（例如，啟動子）。在一些實施例中，單一核酸編碼兩種或更多種嵌合受體且編碼嵌合受體之核苷酸序列在同一讀框中且表現為單一多肽鏈。在此類實施例中，兩種或更多種嵌合受體可由一或多個肽裂解部位，諸如自裂解部位或細胞內蛋白酶受質分開。適合的肽裂解部位可包括但不限於T2A肽裂解部位、P2A肽裂解部位、E2A肽裂解部位及F2A肽裂解部位。在一些實施例中，兩種或更多種嵌合受體包含T2A肽裂解部位。在一些實施例中，兩種或更多種嵌合受體包含E2A肽裂解部位。在一些實施例中，兩種或更多種嵌合受體包含T2A及E2A肽裂解部位。
將基因引入及表現至細胞中之方法為此項技術中熟知的。舉例而言，在一些實施例中，表現載體可藉由物理、化學或生物方式轉移至宿主細胞中。用於將核酸引入宿主細胞中之物理方式之實例包括但不限於磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射及電穿孔。用於將核酸引入宿主細胞中之化學方式之實例包括但不限於膠體分散系統、大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用於將核酸引入宿主細胞中之生物方式之實例包括但不限於使用DNA及RNA載體。
在一些實施例中，脂質體可用作非病毒遞送系統，以活體外、離體或活體內將本發明之核酸或載體引入宿主細胞中。在一些實施例中，核酸可與脂質締合，例如藉由囊封於脂質體之水性內部中、穿插在脂質體之脂質雙層中、經由與脂質體及核酸兩者締合之連接分子連接至脂質體、包覆於脂質體中、與脂質體複合、分散於含有脂質之溶液中、與脂質混合、與脂質組合、作為懸浮液含於脂質中、含於微胞中或與微胞複合，或以其他方式與脂質締合。如本文所揭示，脂質締合核酸或載體組合物不限於溶液中之任何特定結構。在一些實施例中，此類組合物可以雙層結構、作為微胞或以「塌陷」結構存在。此類組合物亦可穿插於溶液中，形成大小或形狀上不均勻的聚集物。如本文所揭示，脂質為可為天然存在或合成的脂肪物質。在一些實施例中，脂質可包括細胞質中天然存在之脂肪滴或含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別，諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。適合的脂質可自商業來源獲得，且包括但不限於二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼（「DMPC」）、二鯨蠟基磷酸酯（「DCP」）、膽固醇及二肉豆蔻基磷脂醯甘油（「DMPG」）。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿用作溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。如本文所用，「脂質體」可涵蓋藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成之多種單層及多層脂質媒劑。在一些實施例中，脂質體之特徵可為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。在一些實施例中，多層脂質體可具有由水性介質隔開之多個脂質層。當磷脂懸浮於過量水溶液中時，多層脂質體可自發性地形成。在一些實施例中，脂質組分可在形成封閉結構之前經歷自我重排，且可在脂質雙層之間截留水及溶解的溶質。在一些實施例中，脂質可呈現微胞結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。
在一些實施例中，將本發明之核酸或載體引入哺乳動物宿主細胞，諸如本發明之免疫反應性細胞中。在一些實施例中，本發明之核酸或載體在宿主細胞中的存在可藉由此項技術中已知之任何適合的分析來確認，包括但不限於南方墨點分析、北方墨點分析、RT-PCR、PCR、ELISA分析及西方墨點分析。
在一些實施例中，本發明之核酸或載體穩定地轉導至本發明之免疫反應性細胞中。在一些實施例中，展現核酸或載體穩定表現之細胞在轉導之後表現所編碼之嵌合受體至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少3個月、至少6個月、至少9個月或至少12個月。
在本發明之EMCN特異性蛋白質（例如，嵌合受體）於細胞中短暫表現之實施例中，本發明之編碼EMCN特異性蛋白質之核酸或載體轉染至本發明之免疫反應性細胞中。在一些實施例中，免疫反應性細胞在轉染之後表現EMCN特異性蛋白質約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或約15天。
在一些實施例中，核酸構築體編碼雙順反子編碼之嵌合抗原受體。在一些實施例中，所編碼之雙順反子嵌合抗原受體包含EMCN CAR（諸如EMCN抑制性CAR）及對第二抗原具有特異性之CAR（諸如靶向腫瘤之嵌合受體）。
在一些實施例中，核酸構築體編碼二價嵌合抗原受體。在一些實施例中，所編碼之二價嵌合抗原受體包含EMCN抗原結合域及第二抗原結合域。 醫藥組合物及投與
本發明之某些態樣係關於組合物（例如，醫藥組合物），其包含一或多種本發明之EMCN特異性蛋白質（例如，嵌合受體）或表現該一或多種EMCN特異性蛋白質之本發明之免疫反應性細胞。在一些實施例中，包含EMCN特異性蛋白質（例如，嵌合受體）或表現此類EMCN特異性蛋白質之經基因修飾之免疫反應性細胞的組合物可全身性地或直接提供至個體以用於治療增生性病症，諸如骨髓病症。在某些實施例中，將組合物直接注射至所關注器官（例如，受病症影響之器官）中。替代地，可例如藉由向循環系統（例如，腫瘤脈管系統）中投與來將組合物間接地提供至所關注器官。可在投與組合物之前、期間或之後提供擴增及分化劑以增加活體外或活體內T細胞、NK細胞或CTL細胞產生。
包含本發明之經基因修飾之細胞的組合物可在任何生理學上可接受之媒劑中投與，例如血管內投與，儘管其亦可引入骨骼或經基因修飾之細胞可找到用於再生及分化之適當部位的其他適宜部位（例如，胸腺）中。在一些實施例中，可投與至少1×10 5個細胞，最終達到1×10 10個或更多個細胞。包含本發明之經基因修飾之細胞的組合物可包含經純化之細胞群。用於測定細胞群中經基因修飾之細胞百分比的方法為此項技術中熟知且包括但不限於螢光活化細胞分選（FACS）。在一些實施例中，細胞群中經基因修飾之細胞的純度可為細胞群中細胞的約50%、約55%、約60%或約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或更多。劑量可由熟習此項技術者容易地調整（例如，純度降低可能需要增加劑量）。細胞可藉由注射、導管或其類似物引入。在一些實施例中，亦可包括因子，例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、G-CSF、MCSF、GM-CSF、γ-干擾素及紅血球生成素。
在某些實施例中，組合物為包含經基因修飾之細胞（諸如免疫反應性細胞或其前驅細胞）及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。投與可為自體或異源的。例如，可自一名個體獲得免疫反應性細胞或前驅細胞，且向同一個體或不同的相容個體投與。在一些實施例中，本發明之免疫反應性細胞或其後代可衍生自周邊血細胞（例如，活體內、離體或活體外衍生）且可經由局部注射投與，包括導管投與、全身注射、局部注射、靜脈內注射或非經腸投與。當投與本發明之治療組合物（例如，含有本發明之經基因修飾之細胞的醫藥組合物）時，其一般以單位劑量可注射形式（溶液、懸浮液、乳液）進行調配。 調配物
本發明之某些態樣係關於包含本發明之EMCN特異性蛋白質（例如，嵌合受體）或表現此類蛋白質之經基因修飾之細胞（例如，本發明之免疫反應性細胞）之組合物的調配物。在一些實施例中，包含經基因修飾之細胞的本發明之組合物可提供為無菌液體製劑，包括但不限於等滲水溶液、懸浮液、乳液、分散液及黏性組合物，其可經緩衝至選定pH。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組合物及固體組合物更易於製備。另外，液體組合物可更便於投與，尤其藉由注射來投與。在一些實施例中，黏性組合物可在適當黏度範圍內調配以提供與特定組織的較長接觸時段。液體或黏性組合物可包含載劑，其可為含有例如水、鹽水、磷酸緩衝鹽水、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）及其適合混合物的溶劑或分散介質。
在一些實施例中，可藉由將本發明之經基因修飾之細胞併入按需要具有各種量任何其他成分的足夠量的適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。此類組合物可與適合載劑、稀釋劑或賦形劑，諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或其類似物混合。在一些實施例中，組合物亦可經凍乾。根據投與途徑及所需製劑，組合物可含有輔助物質，諸如潤濕劑、分散劑、pH緩衝劑及抗微生物劑。
在一些實施例中，本發明之組合物可進一步包括可增強組合物之穩定性及無菌性的各種添加劑。此類添加劑之實例包括但不限於抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。在一些實施例中，可藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑（包括但不限於對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物）中之任一者來防止微生物污染。可藉由使用適合的延遲吸收之試劑（諸如單硬脂酸鋁及明膠）來實現本發明之可注射醫藥調配物之延長吸收。
在一些實施例中，本發明之組合物可為等滲的，亦即，滲透壓與血液及淚液相同。在一些實施例中，所需等滲性可使用例如氯化鈉、右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或其他無機或有機溶質來達成。
在一些實施例中，本發明之調配物的組分經選擇為化學惰性的且不會影響本發明之經基因修飾之細胞的存活力或功效。
關於本發明之經基因修飾之細胞的治療用途的一個考慮因素為達成最佳功效所需的細胞量。在一些實施例中，待投與之細胞之量將因所治療之個體而不同。在某些實施例中，向有需要個體投與的經基因修飾之細胞的量可在1×10 4個細胞至1×10 10個細胞範圍內。在一些實施例中，將視為有效劑量的細胞之精確量可基於各個體之個別因素，包括其體型、年齡、性別、體重及特定個體之病狀。熟習此項技術者可基於本發明及此項技術之知識而容易地確定劑量。 異源部分及修飾
在另一系列實施例中，本文中之EMCN特異性嵌合蛋白（例如，包括具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的抗原結合域的EMCN特異性嵌合蛋白）包括額外部分及/或修飾。 藥物結合物
在各種實施例中，包括如本文所描述之EMCN特異性抗原結合域之蛋白質與治療劑（亦即藥物）結合以形成抗體-藥物結合物。治療劑包括但不限於化學治療劑、成像劑（例如，放射性同位素）、免疫調節劑（例如，細胞介素、趨化介素或檢查點抑制劑）及毒素（例如，細胞毒性劑）。在某些實施例中，治療劑經由連接肽連接至抗原結合域，如本文更詳細討論。
製備可適於使藥物與本文所揭示之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者）結合之抗體-藥物結合物（ADC）的方法描述於例如美國專利第8,624,003號（鍋法）、美國專利第8,163,888號（一步）、美國專利第5,208,020號（兩步法）、美國專利第8,337,856號、美國專利第5,773,001號、美國專利第7,829,531號、美國專利第5,208,020號、美國專利第7,745,394號、WO 2017/136623、WO 2017/015502、WO 2017/015496、WO 2017/015495、WO 2004/010957、WO 2005/077090、WO 2005/082023、WO 2006/065533、WO 2007/030642、WO 2007/103288、WO 2013/173337、WO 2015/057699、WO 2015/095755、WO 2015/123679、WO 2015/157286、WO 2017/165851、WO 2009/073445、WO 2010/068759、WO 2010/138719、WO 2012/171020、WO 2014/008375、WO 2014/093394、WO 2014/093640、WO 2014/160360、WO 2015/054659、WO 2015/195925、WO 2017/160754、Storz (MAbs. 2015年11月-12月; 7(6): 989-1009)、Lambert等人 (Adv Ther, 2017 34: 1015). Diamantis等人 (British Journal of Cancer, 2016, 114, 362-367)、Carrico等人 (Nat Chem Biol, 2007. 3: 321-2)、We等人 (Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106: 3000-5)、Rabuka等人 (Curr Opin Chem Biol., 2011 14: 790-6)、Hudak等人 (Angew Chem Int Ed Engl., 2012: 4161-5)、Rabuka等人 (Nat Protoc., 2012 7:1052-67)、Agarwal等人 (Proc Natl Acad Sci USA., 2013, 110: 46-51)、Agarwal等人 (Bioconjugate Chem., 2013, 24: 846-851)、Barfield等人 (Drug Dev. and D., 2014, 14:34-41)、Drake等人 (Bioconjugate Chem., 2014, 25:1331-41)、Liang等人 (J Am Chem Soc., 2014, 136:10850-3)、Drake等人 (Curr Opin Chem Biol., 2015, 28:174-80)及York等人 (BMC Biotechnology, 2016, 16(1):23)中，各自出於其所有教示內容以全文引用的方式併入本文中。 額外結合部分
在各種實施例中，EMCN特異性蛋白質包括具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者的抗原結合域及一或多個額外結合部分。在某些實施例中，結合部分為抗體片段或抗體格式，包括但不限於全長抗體、Fab片段、Fv、scFv、串聯scFv、雙功能抗體、sc雙功能抗體、DART、tandAb、微型抗體、駱駝VHH及熟習此項技術者已知之其他抗體片段或格式。例示性抗體及抗體片段格式詳細描述於Brinkmann等人 (MABS, 2017, 第9卷, 第2期, 182-212)，出於其所有教示內容以引用的方式併入本文中。
在特定實施例中，一或多個額外結合部分連接至EMCN特異性抗原結合域之一或多個肽的C端，諸如VH及/或VL、Fab重鏈及/或輕鏈片段或scFv。在特定實施例中，一或多個額外結合部分連接至EMCN特異性抗原結合域之一或多個肽的N端，諸如VH及/或VL、Fab重鏈及/或輕鏈片段或scFv。
在某些實施例中，一或多個額外結合部分對不同於EMCN之抗原或表位具有特異性。在某些實施例中，一或多個額外結合部分對EMCN具有特異性。
在某些實施例中，一或多個額外結合部分使用活體外方法，包括但不限於反應性化學（例如，點擊化學）及親和標籤系統連接至本文所描述之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者）。在某些實施例中，一或多個額外結合部分經由Fc介導之結合（例如，蛋白A/G）連接至本文所描述之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者）。在某些實施例中，一或多個額外結合部分使用重組DNA技術連接至本文所描述之抗原結合域（例如，具有表1中所列之胺基酸序列中之一或多者），諸如編碼本文所描述之抗原結合域與相同表現載體（例如，質體）上之額外結合部分之間的融合產物之核苷酸序列。 功能性 / 反應性基團
在各種實施例中，本文所描述之抗原結合域（例如，具有表1中所列出之胺基酸序列中之一或多者）具有包含可用於下游製程，諸如連接至額外部分（例如，藥物結合物及額外結合部分）及下游純化製程之功能性基團或化學反應性基團的修飾。
在某些實施例中，修飾為化學反應性基團，包括但不限於反應性硫醇（例如，基於馬來醯亞胺之反應性基團）、反應性胺（例如，基於N-羥基琥珀醯亞胺之反應性基團）、「點擊化學」基團（例如，反應性炔基）及帶有醛之甲醯基甘胺酸（FGly）。在某些實施例中，修飾為功能性基團，包括但不限於親和肽序列（例如，HA、HIS、FLAG、GST、MBP及鏈黴素系統等）。在某些實施例中，功能性基團或化學反應性基團具有可裂解肽序列。在特定實施例中，可裂解肽藉由包括但不限於光裂解、化學裂解、蛋白酶裂解、還原條件及pH條件之方式裂解。在特定實施例中，蛋白酶裂解藉由細胞內蛋白酶進行。在特定實施例中，蛋白酶裂解藉由細胞外或膜相關蛋白酶進行。採用蛋白酶裂解之ADC療法更詳細描述於Choi等人 (Theranostics, 2012; 2(2): 156-178.)，出於其所有教示內容以全文引用的方式併入本文中。 治療方法
本發明之某些態樣係關於使用EMCN特異性蛋白質（例如，嵌合受體）及表現此類蛋白質之本發明之經基因修飾之細胞（例如，免疫反應性細胞）治療有需要個體的方法。在一些實施例中，本發明之方法適用於治療個體之癌症，諸如骨髓病症。在一些實施例中，骨髓病症為骨髓化生不良症候群、骨髓增生性腫瘤、慢性骨髓單核球性白血病、急性骨髓性白血病（AML）、急性骨髓母細胞性白血病、急性前髓細胞性白血病、急性骨髓單核球性白血病、慢性骨髓細胞性白血病或真性紅血球增多症。在一些實施例中，骨髓病症為AML。本發明之其他態樣係關於EMCN特異性嵌合受體及表現此類嵌合受體之本發明之經基因修飾之細胞（例如，免疫反應性細胞）在治療個體（諸如免疫功能不全人類個體）之病原體感染或其他感染性疾病之方法中的用途。在一些實施例中，本發明之方法可包含以有效達成所需效果之量投與本發明之經基因修飾之細胞，所需效果包括但不限於緩和現有病狀、預防病狀、治療現有病狀、管理現有病狀或預防病狀之復發或再發。在一些實施例中，有效量可在本發明之經基因修飾之細胞（例如，免疫反應性細胞）的一次或一系列投與中提供。在一些實施例中，有效量可以彈丸注射或藉由連續灌注提供。
如本文所揭示，「有效量」或「治療有效量」為足以影響治療後有益或所需臨床結果之量。有效量可以一或多次劑量投與個體。就治療而言，有效量為足以緩和、改善、穩定、逆轉或減緩疾病進展，或以其他方式減輕疾病之病理結果的量。有效量一般由醫師逐例確定且在熟習此項技術者之技能範圍內具有此項技術者之技能。在確定達成有效量之適當劑量時，通常考慮若干因素。此等因素包括個體之年齡、性別及體重、所治療之病狀、病狀之嚴重程度及所投與之免疫反應性細胞的形式及有效濃度。
對於使用抗原特異性細胞（例如免疫反應性細胞，諸如T細胞）之過繼免疫療法，通常輸注約1×10 6至1×10 10個細胞範圍內（例如，約1×10 9個細胞）之細胞劑量。在細胞投與個體中且隨後分化後，誘導特異性針對特定抗原之免疫反應性細胞。在一些實施例中，免疫反應性細胞之誘導可包括但不限於抗原特異性細胞之不活化，諸如藉由缺失或無反應性。不活化尤其適用於建立或重建耐受性，諸如在自體免疫病症中。經基因修飾之細胞可藉由此項技術中已知之任何方法投與，包括但不限於靜脈內、皮下、結節內、瘤內、鞘內、胸膜內、腹膜內及直接投與至胸腺。
在一些實施例中，使用方法涵蓋抑制免疫反應之方法。抑制免疫反應可指防止、減弱或抑制細胞介導之免疫反應，諸如由免疫調節細胞表面上表現之嵌合受體誘導。在實施例中，方法包括防止、減弱或抑制免疫調節細胞表面上表現之活化嵌合受體的活化。
在一些實施例中，本發明之嵌合抑制性受體用於預防、減弱、抑制或壓制由靶向腫瘤之嵌合受體（例如，活化CAR）起始之免疫反應。例如，免疫調節細胞表現識別抗原目標1（例如，非腫瘤抗原）之抑制性嵌合抗原及識別抗原目標2（例如，腫瘤目標）之靶向腫瘤之嵌合受體。在此實例中，當免疫調節細胞接觸目標細胞時，抑制性嵌合受體及靶向腫瘤之嵌合受體可或可不與其同源抗原結合。在此實例之情形下，在目標細胞為表現抗原目標1及抗原目標2之非腫瘤細胞的情況下，抑制性嵌合受體及靶向腫瘤之受體均可經活化。在此類情況下，抑制性嵌合受體之活化引起防止、減弱或抑制靶向腫瘤之嵌合受體傳訊，且免疫調節細胞未經活化。類似地，在目標細胞為僅表現抗原目標1之非腫瘤細胞的例示性情況下，僅抑制性嵌合受體可經活化。相比之下，在目標細胞為僅表現抗原目標2之腫瘤細胞的例示性情況下，抑制性嵌合受體不可經活化，而靶向腫瘤之嵌合受體可經活化，得到引起免疫調節細胞之活化的信號轉導。
由靶向腫瘤之嵌合受體起始之免疫反應的抑制可為靶向腫瘤之嵌合受體活化的抑制或降低、靶向腫瘤之嵌合受體之信號轉導的抑制或降低，或免疫調節細胞之活化的抑制或降低。與靶向腫瘤之嵌合受體之活化、信號轉導或者與缺乏抑制性嵌合受體之免疫調節細胞相比的免疫調節細胞之活化相比，抑制性嵌合受體可使靶向腫瘤之嵌合受體之活化、藉由靶向腫瘤之嵌合受體之信號轉導或藉由靶向腫瘤之嵌合受體之免疫調節細胞之活化抑制約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。在一些實施例中，抑制係指在活化之前或之後，靶向腫瘤之嵌合受體之活性的降低或減少。
免疫反應可為細胞介素或趨化介素自活化免疫調節細胞產生及分泌。免疫反應可為對目標細胞的細胞介導之免疫反應。
在一些實施例中，嵌合抑制性受體能夠壓制活化免疫調節細胞之細胞介素產生。在一些實施例中，嵌合抑制性受體能夠壓制對目標細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化誘導。 治療性治療
在一些實施例中，本發明之方法增加有需要個體之免疫反應。在一些實施例中，本發明之方法包括用於治療及/或預防個體之骨髓病症之方法。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，適用於療法之人類個體可包含可藉由臨床標準區分之兩個治療組。患有「晚期疾病」或具有「高腫瘤負荷」之個體為攜帶臨床上可量測之腫瘤之個體。臨床上可量測之腫瘤為可基於腫瘤塊偵測的腫瘤（例如，基於白血病細胞百分比，藉由觸診、CAT掃描、聲波記錄、乳房攝影或X射線；陽性生物化學或組織病理學標記本身不足以鑑別此群體）。在一些實施例中，向此等個體投與本發明之醫藥組合物以引發抗腫瘤反應，目標為緩和其病狀。在一些實施例中，腫瘤塊減少由於投與醫藥組合物而發生，但任何臨床改善將構成益處。在一些實施例中，臨床改善包括腫瘤之進展風險或速率降低或病理結果減輕。在一些實施例中，第二組適合的人類個體為「佐劑組」個體。此等個體係有骨髓病症病史，但已對另一治療模式有反應的個人。先前療法可包括但不限於手術切除、放射線療法及/或傳統化學療法。因此，此等個人不具有臨床上可量測之腫瘤。然而，其疑似具有疾病進展之風險，接近原始腫瘤部位或藉由轉移。在一些實施例中，此組可進一步細分為高風險及低風險個人。細分可基於在初始治療之前或之後觀測到的特徵來進行。此等特徵為臨床技術中所已知的，且針對各不同骨髓病症適合地定義。高風險子組之典型特徵為腫瘤已侵入鄰近組織，或顯示淋巴結受累之個體。
在如本文所描述之提高免疫反應之任何及所有態樣中，特徵或功能態樣之任何增加或減少或改變係相比於未與如本文所描述之免疫反應性細胞接觸之細胞。
提高免疫反應可為增強免疫反應或誘導免疫反應兩者。舉例而言，提高免疫反應涵蓋開始或起始免疫反應，或上升或擴增持續或現有免疫反應。在一些實施例中，治療誘導免疫反應。在一些實施例中，所誘導之免疫反應為適應性免疫反應。在一些實施例中，所誘導之免疫反應為先天性免疫反應。在一些實施例中，治療增強免疫反應。在一些實施例中，所增強之免疫反應為適應性免疫反應。在一些實施例中，所增強之免疫反應為先天性免疫反應。在一些實施例中，治療提高免疫反應。在一些實施例中，所提高之免疫反應為適應性免疫反應。在一些實施例中，所提高之免疫反應為先天性免疫反應。
在一些實施例中，另一組個體為具有骨髓病症之遺傳傾向性，但尚未證明骨髓病症之臨床徵象的個體。例如，對與AML相關之基因突變測試呈陽性但仍處於生育年齡之女性可受益於在預防性治療中接受本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）中之一或多者以預防AML發生，直至適合於進行預防性手術為止。在一些實施例中，個體可患有晚期形式之疾病，在此情況下治療目標可包括減輕或逆轉疾病進展及/或改善副作用。在一些實施例中，個體可具有已經治療之病狀的病史，在此情況下治療目標通常可包括降低或延遲復發之風險。 組合療法
在一些實施例中，表現一或多種蛋白質，包括本發明之抗原結合域（例如，scFv），諸如本發明之嵌合受體的本發明之經基因修飾之細胞（例如，免疫反應性細胞）可與其他已知藥劑及療法組合使用。在一些實施例中，本發明之組合療法包含可與一或多種額外治療劑組合投與的本發明之經基因修飾之細胞。在一些實施例中，經基因修飾之細胞及一或多種額外治療劑可同時、在相同或獨立組合物中或依序投與。對於依序投與，首先可投與經基因修飾，且其次可投與一或多種額外藥劑，或投與次序可顛倒。在一些實施例中，經基因修飾之細胞經進一步修飾以表現一或多種額外治療劑。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞可用於與以下組合之治療方案：手術、化學療法、輻射、免疫抑制劑（例如，環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯及FK506）、抗體或其他免疫去除劑（例如，CAMPATH或抗CD3抗體）、細胞毒素、氟達拉濱（fludarabme）、環孢素、FK506、雷帕黴素（rapamycin）、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞介素、照射及肽疫苗。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞可與淋巴球耗乏劑組合使用。在免疫療法之前，適合的淋巴球耗乏劑減少或降低淋巴球，例如B細胞淋巴球及/或T細胞淋巴球。適合的淋巴球耗乏劑之實例包括但不限於氟達拉濱、環磷醯胺、皮質類固醇、阿侖單抗（alemtuzumab）、全身照射（TBI）及其任何組合。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞可與化學治療劑組合使用。適合的化學治療劑包括但不限於蒽環黴素（anthracycline）（例如，小紅莓（doxorubicin））、長春花生物鹼（例如，長春鹼（vinblastine）、長春新鹼（vincristine）、長春地辛（vindesine）、長春瑞濱（vinorelbine））、烷化劑（例如，環磷醯胺、達卡巴嗪（decarbazine）、美法侖（melphalan）、異環磷醯胺（ifosfamide）、替莫唑胺（temozolomide））、免疫細胞抗體（例如，阿侖單抗、吉妥珠單抗（gemtuzumab）、利妥昔單抗、托西妥莫單抗（tositumomab））、抗代謝物（例如，葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷去胺酶抑制劑，諸如氟達拉濱）、mTOR抑制劑、TNFR糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白（GITR）促效劑、蛋白酶體抑制劑（例如，阿克拉黴素A （aclacinomycin A）、膠毒素（gliotoxin）或硼替佐米（bortezomib））、諸如沙立度胺（thalidomide）或沙立度胺衍生物（例如，來那度胺（lenalidomide））之免疫調節劑。
適用於組合療法之一般化學治療劑的實例包括但不限於阿那曲唑（anastrozole）（Arimidex®）、比卡魯胺（bicalutamide）（Casodex®）、硫酸博萊黴素（bleomycin sulfate）（Blenoxane®）、白消安（busulfan）（Myleran®）、白消安注射液（Busulfex®）、卡培他濱（capecitabine）（Xeloda®）、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑（carboplatin）（Paraplatin®）、卡莫司汀（carmustine）（BiCNU®）、氯芥苯丁酸（chlorambucil）（Leukeran®）、順鉑（cisplatin）（Piatinol®）、克拉屈濱（cladribine）（Leustatin®）、環磷醯胺（Cytoxan®或Neosar®）、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷（Cytosar-U®）、阿糖胞苷脂質體注射液（DepoCyt®）、達卡巴嗪（DTIC-Dome®）、更生黴素（dactinomycin）（放線菌素D（Actinomycin D），克斯美（Cosmegan））、鹽酸道諾黴素（daunorubicin hydrochloride）（Cerubidine®）、檸檬酸道諾黴素脂質體注射液（DaunoXome®）、地塞米松（dexamethasone）、多西他賽（docetaxel）（Taxotere®）、鹽酸小紅莓（Adriamycin®、Rubex®）、依託泊苷（etoposide）（Vepesid®）、磷酸氟達拉濱（Fludara®）、5-氟尿嘧啶（Adrucil®、Efudex®）、氟他胺（flutamide）（Eulexin®）、替紮他濱（tezacitibine）、吉西他濱（Gemcitabine）（二氟去氧胞苷）、羥脲（Hydrea®）、艾達黴素（Idarubicin）（Idaniycin®）、異環磷醯胺（IFEX®）、伊立替康（irinotecan）（Camptosar®）、L-天冬醯胺酶（ELSPAR®）、甲醯四氫葉酸鈣、美法侖（Alkeran®）、6-巰基嘌呤（Purinethol®）、甲胺喋呤（Folex®）、米托蒽醌（mitoxantrone）（Novantrone®）、麥羅塔（mylotarg）、太平洋紫杉醇（paclitaxel）（Taxol®）、菲尼克斯（phoenix）（Yttrium90/MX-DTPA）、噴司他汀（pentostatin）、含卡莫司汀之聚苯丙生20植入體（Gliadel®）、檸檬酸他莫昔芬（tamoxifen citrate）（Nolvadex®）、替尼泊苷（teniposide）（Vumon®）、6-硫鳥嘌呤、噻替派（thiotepa）、替拉紮明（tirapazamine）（Tirazone®）、注射用鹽酸拓朴替康（topotecan hydrochloride）（Hycamptin®）、長春鹼（Velban®）、長春新鹼（Oncovin®）及長春瑞濱（Navelbine®）。
適合的烷化劑之實例包括但不限於氮芥、伸乙基亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯）：尿嘧啶氮芥（Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil nitrogen mustard®. Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®）、雙氯乙基甲胺（chlormethine）（Mustargen®）、環磷醯胺（Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、Rev immune™）、異環磷醯胺（Mitoxana®）、美法侖（Alkeran®）、氯芥苯丁酸（Leukeran®）、哌泊溴烷（pipobroman）（Amedel®、Vercyte®）、三伸乙基三聚氰胺（Hemel®、Hexalen®、Hexastat®）、三伸乙基硫代磷胺、替莫唑胺（Temodar®）、噻替派（Thioplex®）、白消安（Busilvex®、Myleran®）、卡莫司汀（BiCNU®）、洛莫司汀（lomustine）（CeeNU®）、鏈脲菌素（streptozocin）（Zanosar®）及達卡巴嗪（DTIC-Dome®）。其他例示性烷化劑包括但不限於奧沙利鉑（Oxaliplatin）（Eloxatin®）；替莫唑胺（Temodar®及Temodal®）；更生黴素（亦稱為放線菌素-D，Cosmegen®）；美法侖（亦稱為L-PAM、L-溶肉瘤素及苯丙胺酸氮芥，Alkeran®）；六甲蜜胺（亦稱為六甲三聚氰胺（HMM），Hexalen®）；卡莫司汀（BiCNU®）；苯達莫司汀（Bendamustine）（Treanda®）；白消安（Busulfex®及Myleran®）；卡鉑（Paraplatin®）；洛莫司汀（亦稱為CCNU，CeeNU®）；順鉑（亦稱為CDDP、Platinol®及Platinol®-AQ）；氯芥苯丁酸（Leukeran®）；環磷醯胺（Cytoxan®及Neosar®）；達卡巴嗪（亦稱為DTIC、DIC及咪唑甲醯胺，DTIC-Dome®）；六甲蜜胺（亦稱為六甲三聚氰胺（HMM），Hexalen®）；異環磷醯胺（Ifex®）；普莫司汀（Prednumustine）；丙卡巴肼（Procarbazine）（Matulane®）；甲基二(氯乙基)胺（亦稱為氮芥、氮化芥子氣及甲氯乙胺鹽酸鹽，Mustargen®）；鏈脲菌素（Zanosar®）；噻替派（亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA，Thioplex®）；環磷醯胺（Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®）；及苯達莫司汀HC1（Treanda®）。
適合的mTOR抑制劑之實例包括但不限於坦羅莫司（temsirolimus）、地磷莫司（ridaforolimus）（迪福莫司（deferolimus））、AP23573、MK8669、依維莫司（everolimus）（Afimtor®或RADOOl）、雷帕黴素（AY22989，Sirolmius®）及XL765。
適合的免疫調節劑之實例包括但不限於阿夫妥珠單抗（afutuzumab）、派非格司亭（pegfilgrastim）（Neulasta®）、來那度胺（CC-5013，Revlimid®）、沙立度胺（Thalomid®）、艾可米得（actimid）（CC4047）及IRX-2。
適合的蒽環黴素之實例包括但不限於小紅莓（Adriamycin®及Rubex®）；博萊黴素（lenoxane®）；道諾黴素（鹽酸道諾黴素、道諾黴素及鹽酸紅比黴素，Cerubidine®）、道諾黴素脂質體（檸檬酸道諾黴素脂質體，DaunoXome®）、米托蒽醌（DHAD，Novantrone®）、表柔比星（Ellence™）；艾達黴素（Idamycin®，Idamycin PES®）、絲裂黴素C（Mutamycin®）；格爾德黴素（geldanamycin）；除莠黴素（herbimycin）；拉維黴素（ravidomycin）；及去乙醯基拉維黴素。
適合的長春花生物鹼之實例包括但不限於酒石酸長春瑞濱（Navelbine®）、長春新鹼（Oncovin®）及長春地辛（Eldisine®））；長春鹼（亦稱為硫酸長春鹼、長春花鹼及VLB、Alkaban-AQ®及Velban®）；及長春瑞濱（Navelbme®）。
適合的蛋白酶體抑制劑之實例包括但不限於硼替佐米（Velcade®）；卡非佐米（carfilzomib）；馬瑞佐米（marizomib）（NPI-0052）；檸檬酸伊沙佐米（ixazomib citrate）（MLN-9708）；迪蘭佐米（delanzomib）（CEP-18770）；及ONX-0912。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞與CD20抑制劑，例如抗CD20抗體或其片段組合投與。例示性抗CD20抗體包括但不限於利妥昔單抗、奧伐木單抗（ofatumumab）、奧瑞組單抗（ocrelizumab）、維妥組單抗（veltuzumab）、阿托珠單抗（obinutuzumab）、TRU-015（Trubion Pharmaceuticals）、奧卡妥珠單抗（ocaratuzumab）及Prol31921。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞與溶瘤病毒組合投與。在一些實施例中，溶瘤病毒能夠在癌細胞中選擇性地複製，且觸發癌細胞死亡或減緩癌細胞生長。在一些情況下，溶瘤病毒對非癌細胞無作用或作用最小。適合的溶瘤病毒包括但不限於溶瘤腺病毒、溶瘤單純疱疹病毒、溶瘤反轉錄病毒、溶瘤小病毒、溶瘤痘瘡病毒、溶瘤辛得比斯病毒（Sinbis virus）、溶瘤流感病毒或溶瘤RNA病毒（例如，溶瘤呼腸孤病毒、溶瘤新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水泡性口炎病毒（VSV））。在一些實施例中，溶瘤病毒為重組溶瘤病毒。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞與蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑（例如，SHP-I抑制劑或SHP-2抑制劑）組合投與個體。在一個實施例中，本發明之經基因修飾之細胞可與激酶抑制劑組合使用。適合的激酶抑制劑的實例包括但不限於CDK4抑制劑、CDK4/6抑制劑、BTK抑制劑、磷脂醯肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑、mTOR抑制劑、MNK抑制劑及退行性淋巴瘤激酶（ALK）抑制劑。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞與骨髓衍生抑制細胞（MDSC）之調節劑組合投與個體。MDSC累積於周邊及許多實體腫瘤之腫瘤部位。此等細胞抑制T細胞反應，藉此阻礙表現嵌合受體之細胞療法之功效。不受理論束縛，咸信投與MDSC調節劑增強本發明之經基因修飾之細胞的功效。MDSC之適合調節劑之實例包括但不限於MCS110及BLZ945。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞與抑制或降低免疫抑制性漿細胞活性之藥劑組合投與個體。免疫抑制性漿細胞已被證明阻礙T細胞依賴性免疫原性化學療法，諸如奧沙利鉑（Shalapour等人, Nature 2015, 521 :94- 101）。在一個實施例中，免疫抑制性漿細胞可表現IgA、介白素（IL）-10及PD-L1中之一或多者。
在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞與介白素-15（IL-15）多肽、介白素-15受體α（IL-I5Ra）多肽或IL-15多肽與IL-15Ra多肽之組合組合投與個體。在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞經進一步修飾以表現介白素-15（IL-15）多肽、介白素-15受體α（IL-I5Ra）多肽或IL-15多肽與IL-15Ra多肽之組合。
在一些實施例中，向患有骨髓病症（例如，AML）之個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及藥劑，例如細胞毒性或化學療法藥劑、生物療法（例如抗體，例如單株抗體或細胞療法）或抑制劑（例如，激酶抑制劑）。在一些實施例中，向個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及細胞毒性劑，例如CPX-351（Celator Pharmaceuticals）、阿糖胞苷、道諾黴素、沃薩洛辛（vosaroxin）（Sunesis Pharmaceuticals）、沙帕他濱（sapacitabine）（Cyclacel Pharmaceuticals）、艾達黴素或米托蒽醌。CPX-351為以5:1莫耳比包含阿糖胞苷及道諾黴素之脂質體調配物。在一些實施例中，向個體投與本文所描述之表現嵌合受體之細胞以及低甲基化劑，例如DNA甲基轉移酶抑制劑，例如阿紮胞苷（azacytidine）或地西他濱（decitabine）。在一些實施例中，向個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及生物療法，例如抗體或細胞療法，例如225Ac-林妥珠單抗（lintuzumab）（阿西替單抗-A（Actimab-A）；Actinium Pharmaceuticals）、IPH2102（Innate Pharma/Bristol Myers Squibb）、SGN-CD33A（Seattle Genetics）或吉妥珠單抗奧唑米星（gemtuzumab ozogamicin）（麥羅塔；Pfizer）。在一些實施例中，向個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及FLT3抑制劑，例如索拉非尼（sorafenib）（Bayer）、米哚妥林（midostaurin）（Novartis）、奎紮替尼（quizartinib）（Daiichi Sankyo）、克瑞拉尼（crenoianib）（Arog Pharmaceuticals）、PLX3397（Daiichi Sankyo）、AKN-028（Akinion Pharmaceuticals）或ASP2215（Astelias）。在一些實施例中，向個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及異檸檬酸去氫酶（IDH）抑制劑，例如AG-221（Celgene/Agios）或AG-120（Agios/Celgene）。在一些實施例中，向個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及細胞週期調控劑，例如類polo激酶1（Plkl）之抑制劑，例如沃拉替尼（volasertib）（Boehringer Ingelheim）；或週期素依賴性激酶9（Cdk9）之抑制劑，例如阿昔迪布（alvocidib）（Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis）。在一些實施例中，向個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及B細胞受體傳訊網路抑制劑，例如B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）之抑制劑，例如維奈托克（venetoclax）（Abbvie/Roche）；或布魯頓氏酪胺酸激酶（Button's tyrosine kinase，Btk）之抑制劑，例如依魯替尼（ibrutinib）（Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical）。在一些實施例中，向個體投與本發明之經基因修飾之細胞以及M1胺基肽酶之抑制劑；組蛋白去乙醯基酶（HDAC）之抑制劑，例如普拉諾他（pracinostat）（MEI Pharma）；多激酶抑制劑，例如瑞格斯替（rigosertib）（Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio）；或肽CXCR4反向促效劑，例如BL-8040（BioLineRx）。
在一些實施例中，可向個體投與增強本發明之經基因修飾之細胞之活性或健康度的藥劑。舉例而言，藥劑可抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子。在一些實施例中，調節或調控T細胞功能之分子為抑制性分子。在一些實施例中，抑制性分子，諸如計劃性死亡1（PD-1）可降低經基因修飾之細胞建立免疫效應反應之能力。適合的抑制性分子之實例包括但不限於PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM（例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5）、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LIR-1（LILRB1）、CD 160、2B4、CD80、CD86、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、HVEM（TNFRSF14或CD270）、KIR、A2aR、I類MHC、II類MHC、GAL9、腺苷及TGF β。抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子，例如藉由在DNA、RNA或蛋白質層級上抑制，可最佳化本發明之經基因修飾之細胞的表現。在一些實施例中，藥劑，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、成簇規律間隔短回文重複序列（CRISPR）、類轉錄活化因子效應核酸酶（TALEN）或鋅指核酸內切酶（ZFN）可用於抑制經基因修飾之細胞中之抑制性分子的表現。在一個實施例中，抑制劑為shRNA。在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞可經進一步修飾以表現抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、成簇規律間隔短回文重複序列（CRISPR）、類轉錄活化因子效應核酸酶（TALEN）或鋅指核酸內切酶（ZFN），可用於抑制經基因修飾之細胞中之抑制性分子的表現。
在一個實施例中，調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之藥劑在本發明之經基因修飾之細胞內受抑制。在此類實施例中，抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現的dsRNA分子連接至編碼本發明之嵌合受體之組分（例如，所有組分）的核酸。在一個實施例中，編碼抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現之dsRNA分子的核酸分子可操作地連接於啟動子，例如HI衍生或U6衍生之啟動子，使得調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現的dsRNA分子表現，例如在經基因修飾之細胞內表現。在一個實施例中，編碼抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現之dsRNA分子的核酸分子存在於包含編碼嵌合受體之組分（例如，所有組分）之核酸分子的相同載體（例如，慢病毒載體）上。在此實施例中，編碼抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現之dsRNA分子的核酸分子位於載體（例如，慢病毒載體）上，編碼嵌合受體之組分（例如，所有組分）之核酸的5'或3'。編碼抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現之dsRNA分子的核酸分子可在與編碼嵌合受體之組分（例如，所有組分）的核酸相同或不同之方向上轉錄。在一個實施例中，編碼抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現之dsRNA分子的核酸分子存在於除包含編碼嵌合受體之組分（例如，所有組分）之核酸分子的載體以外之載體上。在一個實施例中，編碼抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現之dsRNA分子的核酸分子在經基因修飾之細胞中短暫表現。在一個實施例中，編碼抑制調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之分子表現之dsRNA分子的核酸分子穩定整合於本發明之經基因修飾之細胞的基因體中。
在一個實施例中，調節或調控（例如，抑制）T細胞功能之藥劑可為結合至抑制性分子之抗體或抗體片段。舉例而言，藥劑可為結合至PD-l、PD-Ll、PD-L2或CTLA4之抗體或抗體片段。在一個實施例中，藥劑為結合至TIM3之抗體或抗體片段。在一個實施例中，藥劑為結合至LAG3之抗體或抗體片段。
在一些實施例中，增強經基因修飾之細胞之活性的藥劑為CEACAM抑制劑（例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5抑制劑）。在一個實施例中，CEACAM之抑制劑為抗CEACAM抗體分子。在一個實施例中，增強本發明之經基因修飾之細胞活性的藥劑為miR-17-92。在一些實施例中，增強經基因修飾之細胞之活性的藥劑為CD40L。在一些實施例中，增強經基因修飾之細胞之活性的藥劑為GM-CSF。在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞經進一步修飾以表現結合至本發明之抑制性分子的抗體或抗體片段。
在一個實施例中，增強本發明之經基因修飾之細胞活性的藥劑為細胞介素。細胞介素具有與免疫反應性細胞擴增、分化、存活及穩態相關之重要功能。可向接受本發明之經基因修飾之細胞的個體投與之細胞介素包括但不限於IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、L-15、IL-18及IL-21或其組合。細胞介素可一天投與一次或一天投與超過一次，例如一天兩次、一天三次或一天四次。細胞介素可投與超過一天，例如細胞介素投與2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週或4週。例如，細胞介素一天投與一次，持續7天。在一些實施例中，本發明之經基因修飾之細胞經進一步修飾以表現一或多種細胞介素，諸如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、L-15、IL-18及IL-21。
在一些實施例中，細胞介素可與經基因修飾之細胞同時或並行投與，例如在同一天投與。細胞介素可製備於與經基因修飾之細胞相同的醫藥組合物中，或可製備於獨立醫藥組合物中。替代地，細胞介素可在投與經基因修飾之細胞後不久，例如在投與經基因修飾之細胞後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天投與。在細胞介素在超過一天之給藥方案中投與之一些實施例中，細胞介素給藥方案之第一天可與經基因修飾之細胞投與同一天，或細胞介素給藥方案之第一天可為投與經基因修飾之細胞之後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一個實施例中，在第一天，向個體投與經基因修飾之細胞，且在第二天，細胞介素一天投與一次，持續接下來7天。在一些實施例中，細胞介素在投與經基因修飾之細胞之後投與一段時間，例如在投與經基因修飾之細胞之後至少2週、3週、4週、6週、8週、10週、12週、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或1年或更長時間。在一個實施例中，細胞介素在評估個體對經基因修飾之細胞之反應之後投與。 套組
本發明之某些態樣係關於用於治療及/或預防癌症（例如，AML）或其他疾病（例如，免疫相關或自體免疫病症）之套組。在某些實施例中，套組包括治療或預防組合物，其包含有效量的一或多種蛋白質，包括本發明之抗原結合域（例如，scFv），諸如本發明之嵌合受體；本發明之經分離之核酸；本發明之載體；及/或本發明之細胞（例如，免疫反應性細胞）。在一些實施例中，套組包含無菌容器。在一些實施例中，此類容器可為盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡鼓包裝或此項技術中已知的其他適合容器。容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或適合於盛裝藥劑之其他材料製成。
在一些實施例中，治療或預防組合物與關於向患有癌症（例如，AML）或具有罹患癌症之風險之個體投與治療或預防組合物的說明書一起提供。在一些實施例中，說明書可包括關於組合物用於治療及/或預防病症之用途的資訊。在一些實施例中，說明書包括但不限於治療或預防組合物之描述、劑量排程、用於治療或預防病症或其症狀之投與排程、注意事項、警告、適應症、禁忌症、劑量過量資訊、不良反應、動物藥理學、臨床研究及/或參考文獻。在一些實施例中，說明書可直接在容器（存在時）上，或者作為施加至容器的標籤，或者作為在容器中或與其一起供應的獨立薄片、小冊子、卡片或折頁來印刷。 所列舉實施例實施例1：一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區， a.其中該VH包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）； b.其中該VL包含具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區1（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3）；且 c.其中該抗體或其抗原結合片段係人源化的。 實施例2：一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區， a.其中該VH包含具有選自由SEQ ID NO: 2-5組成之群之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）； b.其中該VL包含具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區1（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3），且 c.其中該抗體或其抗原結合片段係人源化的。 實施例3：一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區， a.其中該VH包含具有選自由SEQ ID NO: 2-5組成之群之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）；且 b.其中該VL包含具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區1（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3）。 實施例4：如實施例2或實施例3之抗體或其抗原結合片段，其中該CDRH1具有如SEQ ID NO: 2中所闡述之胺基酸序列。 實施例5：如實施例1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 15。 實施例6：如實施例5之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有如SEQ ID NO: 12中所闡述之胺基酸序列。 實施例7：如實施例1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。 實施例8：如實施例7之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有如SEQ ID NO: 16中所闡述之胺基酸序列。 實施例9：如實施例1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該VL具有如SEQ ID NO: 20中所闡述之胺基酸序列。 實施例10：一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區， 其中該VH包含重鏈互補決定區1（CDR-H1）、重鏈互補決定區2（CDR-H2）及重鏈互補決定區3（CDR-H3），其含於具有選自由SEQ ID NO: 12-19組成之群之胺基酸序列的VH內；且 其中該VL包含輕鏈互補決定區1（CDR-L1）、輕鏈互補決定區2（CDR-L2）及輕鏈互補決定區3（CDR-L3），其含於具有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VL內。 實施例11：一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈（VH）區及可變輕鏈（VL）區，其中該VL具有如SEQ ID NO: 20中所闡述之胺基酸序列。 實施例12：一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈（VH）區及可變輕鏈（VL）區，其中該VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。 實施例13：如實施例10至12中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 15。 實施例14：如實施例13之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有如SEQ ID NO: 12中所闡述之胺基酸序列。 實施例15：如實施例10至12中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。 實施例16：如實施例15之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有如SEQ ID NO: 16中所闡述之胺基酸序列。 實施例17：如實施例10及12至16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該VL具有如SEQ ID NO: 20中所闡述之胺基酸序列。 實施例18：如實施例1至17中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為抗原結合片段。 實施例19：如實施例18之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段包含F(ab)片段、F(ab')片段或單鏈可變片段（scFV）。 實施例20：如實施例19之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段包含單鏈可變片段（scFv）。 實施例21：如實施例20之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv之VH及VL由肽連接子分開。 實施例22：如實施例21之抗體或其抗原結合片段，其中抗原結合域包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。 實施例23：如實施例21或實施例22之抗體或其抗原結合片段，其中該肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 21-37。 實施例24：如實施例20至23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID No: 65、67、69及70。 實施例25：一種嵌合蛋白，其包含如實施例1至24中任一項之抗體或其抗原結合片段及異源分子或部分。 實施例26：如實施例25之嵌合蛋白，其中該嵌合蛋白為抗體-藥物結合物，且其中該異源分子或部分包含治療劑。 實施例27：如實施例25之嵌合蛋白，其中該嵌合蛋白為嵌合抗原受體（CAR），且其中該異源分子或部分包含選自由以下組成之群的多肽：跨膜域、一或多個細胞內傳訊域、鉸鏈域、間隔區、一或多個肽連接子及其組合。 實施例28：如實施例27之嵌合蛋白，其中該CAR包含跨膜域。 實施例29：如實施例27或實施例28之嵌合蛋白，其中該CAR包含一或多個細胞內傳訊域。 實施例30：如實施例27至29中任一項之嵌合蛋白，其中該CAR為包含一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊域的活化CAR。 實施例31：如實施例27至29中任一項之嵌合蛋白，其中該CAR為包含一或多個抑制免疫反應之細胞內抑制性域的抑制性CAR。 實施例32：如實施例31之嵌合蛋白，其中該細胞內抑制性域包含酶抑制性域。 實施例33：如實施例31或實施例32之嵌合蛋白，其中該細胞內抑制性域包含細胞內抑制性共傳訊域。 實施例34：如實施例27至33中任一項之嵌合蛋白，其中該CAR在該抗原結合域與該跨膜域之間包含間隔區。 實施例35：如實施例34之嵌合蛋白，其中該間隔區具有選自由SEQ ID NO:41-52組成之群的胺基酸序列。 實施例36：一種組合物，其包含如實施例1至24中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施例25至35中任一項之嵌合蛋白及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。 實施例37：一種經工程改造之核酸，其編碼如實施例1至24中任一項之抗體或抗原結合片段或如實施例25至35中任一項之嵌合蛋白。 實施例38：一種表現載體，其包含如實施例37之經工程改造之核酸。 實施例39：一種組合物，其包含如實施例37之經工程改造之核酸或如實施例38之表現載體及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。 實施例40：一種製造經工程改造之細胞之方法，其包含用如實施例37之經工程改造之核酸或如實施例38之表現載體轉導經分離之細胞。 實施例41：一種經分離之細胞，其包含如實施例37之經工程改造之核酸、如實施例38之表現載體或如實施例39之組合物。 實施例42：一種經工程改造之細胞群，其表現如實施例37之經工程改造之核酸或如實施例38之表現載體。 實施例43：一種經分離之細胞，其包含如實施例1至24中任一項之抗原結合片段或如實施例25至35中任一項之嵌合蛋白。 實施例44：一種經工程改造之細胞群，其表現如實施例1至24中任一項之抗原結合片段或如實施例25至35中任一項之嵌合蛋白。 實施例45：如實施例41至44中任一項之細胞或細胞群，其中該嵌合蛋白經重組表現。 實施例46：如實施例41至45中任一項之細胞或細胞群，其中該嵌合蛋白自載體或該細胞之基因體之選定基因座表現。 實施例47：如實施例41至46中任一項之細胞或細胞群，其中該細胞或細胞群進一步包含在細胞表面上表現之一或多種靶向腫瘤之嵌合受體。 實施例48：如實施例47之細胞或細胞群，其中該一或多種靶向腫瘤之嵌合受體中之各者為嵌合抗原受體（CAR）或經工程改造之T細胞受體。 實施例49：如實施例41至48中任一項之細胞或細胞群，其中該細胞或細胞群選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ T細胞、細胞毒性T淋巴球（CTL）、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T（NKT）細胞、自然殺手（NK）細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球（TIL）、先天性淋巴細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、骨髓細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、紅血球、血小板細胞、人類胚胎幹細胞（ESC）、ESC衍生細胞、富潛能幹細胞、間葉基質細胞（MSC）、誘導性富潛能幹細胞（iPSC）及iPSC衍生細胞。 實施例50：如實施例41至49中任一項之細胞或細胞群，其中該細胞係自體的。 實施例51：如實施例41至49中任一項之細胞或細胞群，其中該細胞係同種異體的。 實施例52：一種醫藥組合物，其包含有效量之如實施例41至51中任一項之細胞或經工程改造之細胞群及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。 實施例53：一種醫藥組合物，其包含有效量之表現如實施例1至24中任一項之抗原結合片段或如實施例25至35中任一項之嵌合蛋白的經基因修飾之細胞及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。 實施例54：如實施例52或實施例53之醫藥組合物，其用於治療及/或預防腫瘤。 實施例55：一種治療有需要個體之方法，該方法包含投與治療有效劑量之如實施例36或實施例39之組合物，或如實施例41至51中任一項之細胞中之任一者，或如實施例52或實施例53之醫藥組合物。 實施例56：一種刺激個體之針對腫瘤細胞的細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量之如實施例36或實施例39之組合物，或如實施例41至51中任一項之細胞中之任一者，或如實施例52或實施例53之組合物。 實施例57：如實施例56之方法，其包含向該個體投與如實施例41至51中任一項之細胞，其中該經分離之細胞或細胞群表現如實施例31之包含活化CAR之嵌合蛋白。 實施例58：一種抑制個體之針對腫瘤細胞的細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量之如實施例36或實施例39之組合物，或如實施例41至51中任一項之細胞中之任一者，或如實施例52或實施例53之組合物。 實施例59：如實施例58之方法，其包含向該個體投與如實施例41至51中任一項之細胞，其中該經分離之細胞或細胞群表現如實施例31之包含抑制性CAR之嵌合蛋白。 實施例60：一種治療患有腫瘤之個體的方法，該方法包含投與治療有效劑量之如實施例36或實施例39之組合物，或如實施例41至51中任一項之細胞中之任一者，或如實施例52或實施例53之組合物。 實施例61：一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如實施例25至35中任一項之嵌合蛋白。 實施例62：如實施例61之套組，其中該套組進一步包含關於使用該嵌合蛋白來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。 實施例63：一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如實施例41至51中任一項之細胞或細胞群。 實施例64：如實施例63之套組，其中該套組進一步包含關於使用該細胞來治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。 實施例65：一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如實施例41之經工程改造之核酸。 實施例66：如實施例65之套組，其中該套組進一步包含關於使用該核酸來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。 實施例67：一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如實施例38之載體。 實施例68：如實施例67之套組，其中該套組進一步包含關於使用該載體來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。 實施例69：一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如實施例36、實施例39、實施例52或實施例53之組合物。 實施例70：如實施例69之套組，其中該套組進一步包含關於使用該組合物來治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。 實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到本文提供之一般說明，可實施各種其他實施例。
以下為用於進行本發明之所主張主題之特定實施例的實例。實例僅出於說明性目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。已努力確保關於所用數字（例如，量、溫度等）之準確性，但當然應允許一些實驗誤差及偏差。 實例 1 ：人源化抗 EMCN 抗原結合域之構築
為了產生人源化抗EMCN抗原結合域（ 例如scFv），首先將來自人類生殖系抗體之VH及VL序列分別與SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之鼠類衍生之抗EMCN VH及VL序列比對。鼠類衍生之抗EMCN VH及VL序列示於 表 5中。 表 5. 鼠類衍生之抗 EMCN VH 及 VL 序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSS 63 鼠類抗EMCN VH
DIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELK 64 鼠類抗EMCN VL
接下來，將CDR周圍之構架區（如Kabat註釋及編號方案所指定）用人類生殖系抗體序列置換。對於重鏈人類序列，針對構架區選擇可變重鏈3-23及3-33。對於輕鏈，且針對構架區選擇可變κ鏈2-30。VH 3-23、VH 3-33及VK 2-30之生殖系序列示於 表 6中。 表 6. VH 3-23 、 VH 3-33 及 VK 2-30 之生殖系序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAFDVWGQGTMVTVSS 65 人類生殖系VH 3-23
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAFDVWGQGTMVTVSS 66 人類生殖系VH 3-33
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPYTFGQGTKLEIK 67 人類生殖系VK 3-30
對於基於VH 3-33之人源化VH，併入額外突變以將位置50及52回復突變為存在於鼠類抗EMCN中之殘基。另外，對於基於2-23及2-33之人源化VH，CDR-H1經工程改造以與人類生殖系序列在CDR之位置3及4處匹配，如由Chothia註釋及編號方案所指定。
接下來，使用與人源化VL區（「VL 2-30」）配對之兩個人源化VH區（「VH 3-23」及「VH 3-33」）中之各者來工程改造單鏈可變片段（scFv）。對於各VH/VL組合，構築兩個定向（N端至C端）VH-肽連接子-VL及VL-肽連接子-VH。對於所有scFv，使用G4S3肽連接子。序列呈現於 表 7中。 表 7. 人源化抗 EMCN 抗體 scFv 序列
胺基酸 / 核酸序列 SEQ ID NO: 描述
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK 68 SB02927 scFv - EMCN VH3-23 V1 _ G4S3 _ EMCN VK2-30
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG 69 SB02927 scFv DNA
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK 70 SB02928 scFv - EMCN VH3-33 V1_G4S3_ EMCN VK2-30
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGCGGAGTTGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTTGCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTATCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG 71 SB02928 scFv DNA
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 72 SB02929 scFv - EMCN VK2-30 G4S3_ EMCN VH3-23 V1_
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCT 73 SB02929 scFv DNA
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 74 SB02930 scFv - EMCN VK2-30 G4S3_EMCN VH3-33 V1
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGCGGAGTTGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTTGCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTATCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCT 75 SB02930 scFv DNA
活化嵌合抗原受體（aCAR）經工程改造以包括人源化抗EMCN抗原結合域。所產生之人源化抗EMCN aCAR之架構及序列示於 表 8中。各aCAR包括scFV之N端的CD8信號序列及FLAG標籤、CD28跨膜（TM）域、CD28細胞內域（ICD）及CD3ζ活化域。 表 8. 包括人源化抗 EMCN scFv 之 CAR
胺基酸 / 核酸序列 SEQ ID NO: 描述
ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTGCCGGCGGAAGCGACTACAAGGACGACGATGACAAAGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGCCGCTGCTATCGAAGTGATGTACCCTCCTCCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTATTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAAAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA 76 SB02927 CAR DNA Seq- CD8ss-Flag - EMCN VH3-23 _ G4S3 _ EMCN VK2-30 - CD28TM-CD28ICD-CD3z
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ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTGCCGGCGGAAGCGACTACAAGGACGACGATGACAAAGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGCGGAGTTGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTTGCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTATCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGCCGCTGCTATCGAAGTGATGTACCCTCCTCCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTATTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAAAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA 78 SB02928 CAR DNA Seq - CD8ss-Flag- EMCN VH3-33_G4S3_ EMCN VK2-30 - CD28TM-CD28ICD-CD3z
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ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTGCCGGCGGAAGCGACTACAAGGACGACGATGACAAAGGCGGCAGCGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGCCGCTGCTATCGAAGTGATGTACCCTCCTCCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTATTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAAAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGC 80 SB02929 CAR DNA Seq- CD8ss-Flag-EMCN VK2-30_G4S3_EMCN VH3-23-CD28TM-CD28ICD-CD3z
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ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTGCCGGCGGAAGCGACTACAAGGACGACGATGACAAAGGCGGCAGCGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGCGGAGTTGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTTGCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTATCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGCCGCTGCTATCGAAGTGATGTACCCTCCTCCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTATTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAAAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA    82 SB02930 CAR DNA Seq - CD8ss-Flag-EMCN VK2-30_G4S3_EMCN VH3-33-CD28TM-CD28ICD-CD3z
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實例 2 ：人源化抗 EMCN 抗原結合域在 T 細胞殺傷分析中維持結合功能
進行CAR細胞殺傷分析以評估人源化抗EMCN抗原結合域是否有效地將CAR靶向至表現EMCN之細胞。人源化抗EMCN scFv之功能與具有親本鼠類抗EMCN抗原結合域之活化CAR進行比較。
將如 實例 1中所示之CAR構築體選殖至反轉錄病毒載體中。另外，作為對照，亦將包括親本鼠類抗EMCN之抗原結合域的等效aCAR（「SB02405」）選殖至反轉錄病毒載體中。接下來，產生反轉錄病毒，且用反轉錄病毒轉導先前冷凍且自人類供體PBMC分離之初代T細胞以表現CAR。在轉導後第9天，將T細胞及表現內皮黏蛋白之目標細胞混合在一起且共培養（ET比：1:1，96孔盤，200 μl總培養基體積）。對於目標細胞，已知表現CAR介導之殺傷之所關注潛在癌症目標（例如，FLT3（CD135）及CD33（SIGLEC3））的兩種細胞株SEM及Molm13各自經轉導以穩定表現EMCN。作為對照，亦使用未經轉導之SEM細胞及未經轉導之Molm13。在18小時共培育之後收集細胞，且T細胞對目標細胞之細胞毒性藉由流動式細胞測量術評估（使用FlowJo軟體進行分析）且呈現為殺傷%。殺傷分析之結果示於 圖 1中。
如圖 1所示，與包括親本鼠類抗EMCN抗原結合域之CAR相比，包括人源化抗EMCN抗原結合域中之各者的aCAR誘導至少同樣多或更多的表現EMCN之細胞株殺傷。 實例 3 ：在 NK 細胞殺傷分析中確認人源化抗 EMCN 抗原結合域功能
人源化抗EMCN scFv之功能藉由如 實例 2中所描述之T細胞殺傷分析評估，且在此實例中，在利用表現具有人源化抗EMCN抗原結合域之活化CAR的NK細胞之殺傷分析中確認。
如實例2中所描述，使用反轉錄病毒載體中之各者產生反轉錄病毒。用反轉錄病毒轉導初代供體衍生之NK細胞以表現CAR。在轉導後第3天，基於FLAG表位藉由流動式細胞測量術評估CAR之表現。各CAR之第3天表現示於 圖 2中。如圖 2所示，包括人源化抗EMCN抗原結合域之CAR中之各者的表現與包括親本抗原結合域之CAR的表現相當。
接下來，評估CAR NK細胞對目標細胞之殺傷。轉導後七天，將CAR NK細胞及表現內皮黏蛋白之目標細胞（如 實例 2中所描述之EMCN轉導之SEM細胞）混合在一起且共培養（ET比：1:1，96孔盤，200 μl總培養基體積）。作為對照，亦評估未經轉導之SEM細胞之NK細胞殺傷。在18小時共培育之後收集細胞，且T細胞對目標細胞之細胞毒性藉由流動式細胞測量術評估（使用FlowJo軟體進行分析）且呈現為殺傷%。殺傷分析之結果示於 圖 3中。
如圖 3所示，與包括親本鼠類抗EMCN抗原結合域之CAR相比，表現人源化抗EMCN aCAR之NK細胞誘導至少同樣多的表現EMCN之細胞株殺傷。 以引用的方式併入
本申請案中所引用之所有公開案、專利案、專利申請案及其他文獻皆以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的，引用的程度就如同個別地指示將各個別公開案、專利案、專利申請案及其他文獻以引用的方式併入以用於所有目的一樣。 等效物
雖然已說明且描述各種特定實施例，但以上說明書不具有限制性。應瞭解，可在不背離本發明之精神及範疇之情況下進行各種改變。熟習此項技術者在審閱本說明書後將顯而易知諸多變化形式。
無
專利或申請案檔案含有至少一張彩製圖式。在請求且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。
本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢將關於以下描述及隨附圖式得到更好的理解。
圖 1顯示表現本發明之人源化抗EMCN CAR之T細胞針對表現EMCN之目標細胞的殺傷活性。
圖 2顯示用各種抗EMCN CAR轉導之NK細胞的CAR表現。
圖 3顯示用各種抗EMCN CAR轉導之NK細胞針對表現EMCN之目標細胞的殺傷活性。

Claims (19)

  1. 一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（endomucin，EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區， 其中該VH包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）； 其中該VL包含具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區1（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3）；且 其中該抗體或其抗原結合片段係人源化的；或。
  2. 一種特異性結合至人類內皮黏蛋白（EMCN）之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變（VH）區及輕鏈可變（VL）區，其中該VH包含具有選自由SEQ ID NO: 2-5組成之群之胺基酸序列的VH互補區1（CDRH1）、具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的VH互補區2（CDRH2）及具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VH互補區3（CDRH3）， 其中該VL包含具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VL互補區1（CDRL1）、具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL互補區2（CDRL2）及具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL互補區3（CDRL3），且 視情況其中該抗體或其抗原結合片段係人源化的。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該VH具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19，或其中該VL具有如SEQ ID NO: 20中所闡述之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為抗原結合片段，視情況其中該抗原結合片段包含F(ab)片段、F(ab')片段或單鏈可變片段（scFv），視情況其中該抗原結合片段包含單鏈可變片段（scFv）。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv之VH及VL由肽連接子分開，視情況其中抗原結合域包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為該肽連接子，且VL為輕鏈可變域，視情況其中該肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 21-37。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 65、67、69及70。
  7. 一種嵌合蛋白，其包含如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段及異源分子或部分； 視情況其中該嵌合蛋白為抗體-藥物結合物，且其中該異源分子或部分包含治療劑； 視情況其中該嵌合蛋白為嵌合抗原受體（CAR），且其中該異源分子或部分包含選自由以下組成之群的多肽：跨膜域、一或多個細胞內傳訊域、鉸鏈域、間隔區、一或多個肽連接子及其組合，視情況其中該CAR包含跨膜域； 視情況其中該CAR包含一或多個細胞內傳訊域，視情況其中該CAR為包含一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊域的活化CAR；視情況其中該CAR為包含一或多個抑制免疫反應之細胞內抑制性域的抑制性CAR，視情況其中該細胞內抑制性域包含酶抑制性域； 視情況其中該細胞內抑制性域包含細胞內抑制性共傳訊域； 視情況其中該CAR在該抗原結合域與該跨膜域之間包含間隔區； 視情況其中該間隔區具有選自由SEQ ID NO:41-52組成之群的胺基酸序列。
  8. 一種經工程改造之核酸，其編碼如請求項1至6中任一項之抗體或抗原結合片段或如請求項7之嵌合蛋白。
  9. 一種表現載體，其包含如請求項8之經工程改造之核酸。
  10. 一種組合物，其包含如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項7之嵌合蛋白、如請求項8之經工程改造之核酸或如請求項9之表現載體及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。
  11. 一種製造經工程改造之細胞之方法，其包含用如請求項8之經工程改造之核酸或如請求項9之表現載體轉導經分離之細胞。
  12. 一種經分離之細胞，其包含如請求項1至6中任一項之抗原結合片段、如請求項7之嵌合蛋白、如請求項8之經工程改造之核酸、如請求項9之表現載體或如請求項10之組合物。
  13. 一種經工程改造之細胞群，其表現如請求項8之經工程改造之核酸、如請求項9之表現載體、如請求項1至6中任一項之抗原結合片段或如請求項7之嵌合蛋白。
  14. 如請求項12或13之細胞或細胞群，其中該嵌合蛋白經重組表現； 視情況其中該嵌合蛋白自載體或該細胞之基因體之選定基因座表現； 視情況其中該細胞或細胞群進一步包含在細胞表面上表現之一或多種靶向腫瘤之嵌合受體； 視情況其中，其中該一或多種靶向腫瘤之嵌合受體中之各者為嵌合抗原受體（CAR）或經工程改造之T細胞受體； 視情況其中該細胞或細胞群係選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ T細胞、細胞毒性T淋巴球（CTL）、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T（NKT）細胞、自然殺手（NK）細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球（TIL）、先天性淋巴細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、骨髓細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、紅血球、血小板細胞、人類胚胎幹細胞（ESC）、ESC衍生細胞、富潛能幹細胞、間葉基質細胞（MSC）、誘導性富潛能幹細胞（iPSC）及iPSC衍生細胞，視情況其中該細胞係自體的，視情況其中該細胞係同種異體的。
  15. 一種醫藥組合物，其包含有效量之如請求項12之經分離之細胞或如請求項13之經工程改造之細胞群及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合；或有效量之表現如請求項1至6中任一項之抗原結合片段或如請求項7之嵌合蛋白的經基因修飾之細胞及醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合，視情況其中該醫藥組合物用於治療及/或預防腫瘤。
  16. 一種治療有需要個體之方法，該方法包含投與治療有效劑量之如請求項10之組合物或如請求項12之經分離之細胞或如請求項15之醫藥組合物。
  17. 一種抑制個體之針對腫瘤細胞的細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量之如請求項10之組合物或請求項12之經分離之細胞，視情況其中該經分離之細胞或細胞群表現包含如請求項7之嵌合蛋白的嵌合蛋白。
  18. 一種治療患有腫瘤之個體的方法，該方法包含投與治療有效劑量之如請求項10之組合物或如請求項12之經分離之細胞或如請求項10之組合物。
  19. 一種用於治療及/或預防腫瘤之套組，其包含如請求項7之嵌合蛋白；如請求項12之經分離之細胞或如請求項13之細胞群；如請求項12之經工程改造之核酸；如請求項13之表現載體；如請求項10之組合物；視情況其中該套組進一步包含關於使用該細胞來治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書； 視情況其中該套組進一步包含關於使用該核酸來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書； 視情況其中該套組進一步包含關於使用該載體來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書； 視情況其中該套組進一步包含關於使用該組合物來治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書；或視情況其中該套組進一步包含關於使用該嵌合蛋白來產生一或多種抗原特異性細胞以治療及/或預防個體之腫瘤的書面說明書。
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