KR101123487B1 - 항?스클레로스틴 항체 - Google Patents

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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 높은 친화력 및 강한 중화 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화 및 키메라 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 인간 대상체의 골 질량, 골 무기질 밀도 및 골 강도를 증가시키고, 다양한 장애, 예를 들어 골다공증을 치료하는데 유용하다.
스클레로스틴, 골다공증, 인간화 항체, 키메라 항체

Description

항?스클레로스틴 항체 {ANTI-SCLEROSTIN ANTIBODIES}
본 발명은 의약 분야, 특히 스클레로스틴에 대한 항체 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 높은 친화력의 항체, 및 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 것이 유익한 인간 대상체의 다양한 장애 또는 증상에 대한 상기 항체의 치료적 용도에 관한 것이다.
골다공증은 골 무기질 밀도 (BMD)가 감소되고, 뼈의 미세구조가 파열되어, 골다공성 뼈가 골절될 위험이 큰 질환이다. 골다공증은 특히 노인에게 있어서 오랫동안 장애 및 사망의 주요 원인이 되어왔다. 골다공증에 대한 효과적인 치료법은 생활방식의 수정 및 약물요법의 형태로 존재하여 왔지만, 최근에 이용가능한 요법들은 그 수 및 효능에 있어서 한계가 있고, 종종 바람직하지 않은 부작용과 관련되며, 환자에게 보편적으로 허용가능하지 않다. 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐 대체제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM)를 비롯한 많은 항골흡수제(antiresorptive agent)가 추가의 골 손실을 막지만, 이들은 일단 손실된 뼈를 재건하지는 못한다. 골 질량 및 골 무기질 밀도를 증가시키고, 뼈의 구조를 복구시키는 동화 약물(anabolic agent)을 인간 PTH(1-34)의 형태로 이용가능하다. 그러나, 이러한 치료제는 종종 1년 또는 그 이상 동안 매일 피하로 주사해야 하기 때문에 환자의 편의성을 충족시키지 못한다.
SOST 유전자 생성물인 스클레로스틴은 뼈 내의 골세포에서 강력하게 발현된다. 뼈 형성의 강력한 음성적 조절인자로서의 그의 역할로 인해, 스클레로스틴은 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 및 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 것이 유익한 장애 또는 증상, 예를 들어 골다공증의 바람직한 치료적 중재의 표적이다. 따라서, 항-스클레로스틴 항체가 그러한 장애 또는 증상을 치료하는데 있어서 동화적 접근법으로서 유용하다는 것이 증명될 수 있다. PCT 국제출원 공개공보 제WO 2006/119107호는 모든 CDR이 완전히 뮤린과인, 즉 마우스에서 생성된 항체의 CDR로부터 개조되지 않은 것인, 특정 인간화 항-스클레로스틴 항체의 아미노산 서열을 개시한다.
강한 결합 친화력으로 인간 스클레로스틴에 결합하고 스클레로스틴 생물활성 검정에서 낮은 IC50 값을 갖는, 대안적 항-스클레로스틴 항체에 대한 요구가 존재한다. 그러한 항체는 특히 골다공증에 대하여 치료상 보다 효과적이며, 더 낮은 결합 친화력 (즉, 더 높은 KD) 또는 더 높은 IC50 값을 갖는 PTH(1-34) 또는 항-스클레로스틴 항체에 비해 덜 빈번하게 투여해도 될 것으로 예상된다. 또한, 항체가 투여된 인간 대상체에게서 유발되는 항체에 대한 면역 반응의 위험이 감소되거나, 또는 생물활성 검정에서 인간 스클레로스틴에 대해 높은 결합 친화력 및 낮은 IC50 값을 갖는 항체의 특성을 유지하면서 불안정성의 위험이 감소된 인간 스클레로스틴 에 특이적인 항체에 대한 요구도 존재한다. 본 발명의 항-스클레로스틴 항체는 이러한 요구들을 만족시키며, 관련 이점을 제공한다.
본 발명의 항체는 키메라 또는 인간화 모노클로날 항체로, 본원에서 개시하는 특정 폴리펩티드 서열을 포함하고, 높은 결합 친화력으로 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하며, 포유동물, 특히 인간에게서 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 및 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는데 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR은 변이 항체, 즉 본 발명의 인간화 또는 키메라 항체가 유래되는 어버이 항체, 즉 설치류 (예를 들어, 마우스)에서 생성된 항체에 존재하는 해당 위치에서의 CDR과 아미노산 서열이 상이하다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 CDR 서열에 있어서의 그러한 아미노산 치환(들)은 어버이 항체에 비해 인간 스클레로스틴과의 더 강한 결합 친화력 (즉, 더 낮은 KD), 스클레로스틴 생물활성 검정에서의 더 낮은 IC50, 또는 둘 모두를 야기한다. 어버이 항체의 CDR에 존재하는 것으로부터 본 발명의 항체의 CDR 서열로의 아미노산 치환은 항체가 투여된 인간에 의한 항체에 대한 면역원성 반응을 감소시킬 수 있다. 또한, 어버이 항체의 CDR에 존재하는 것으로부터 본 발명의 항체의 CDR 서열로의 아미노산 치환은, 예를 들어 아스파라긴 잔기를 상이한 아미노산으로 치환시키는 것에 의해 탈아미드화의 위험을 감소시킴으로써, 항체의 불안정성의 위험을 감소시킬 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 20을 갖는 HCDR1, 서열 21을 갖는 HCDR2, 서열 22를 갖는 HCDR3, 서열 23을 갖는 LCDR1, 서열 24를 갖는 LCDR2 및 서열 25를 갖는 LCDR3; (ii) 서열 26을 갖는 HCDR1, 서열 27을 갖는 HCDR2, 서열 28을 갖는 HCDR3, 서열 29를 갖는 LCDR1, 서열 30을 갖는 LCDR2 및 서열 31을 갖는 LCDR3; 및 (iii) 서열 32를 갖는 HCDR1, 서열 33을 갖는 HCDR2, 서열 34를 갖는 HCDR3, 서열 35를 갖는 LCDR1, 서열 36을 갖는 LCDR2 및 서열 37을 갖는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 6개의 CDR 영역을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 중쇄 가변 영역 ("HCVR") 폴리펩티드 및 경쇄 가변 영역 ("LCVR") 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 (i) HCVR은 서열 14의 아미노산 서열을 갖고 LCVR은 서열 17의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) HCVR은 서열 15의 아미노산 서열을 갖고 LCVR은 서열 18의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (iii) HCVR은 서열 16의 아미노산 서열을 갖고 LCVR은 서열 19의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 (i) 중쇄 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 갖고 경쇄 폴리펩티드는 서열 5의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) 중쇄 폴리펩티드는 서열 3의 아미노산 서열을 갖고 경쇄 폴리펩티드는 서열 6의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (iii) 중쇄 폴리펩티드는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고 경쇄 폴리펩티드는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 본원에서 정의되는 바와 같은, 바람직하게는 서열 번호로 정의되는 본 발명의 항체는 추가로 25℃에서 인간 스클레로스틴에 대해 약 10 pM 이하의 결합 친화력 (KD)을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 항체는 25℃에서 사이노몰거스(cynomologous) 원숭이 스클레로스틴에 대해 약 100 pM 이하의 KD를 갖는다. 보다 바람직한 본 발명의 항체는 25℃에서 인간 스클레로스틴에 대해 약 10 pM 이하의 결합 친화력을 갖고, 사이노몰거스 원숭이 스클레로스틴에 대해서는 25℃에서 약 100 pM 이하의 결합 친화력을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본원에서 정의되는 바와 같은, 바람직하게는 서열 번호로 정의되는 본 발명의 항체는 인간 스클레로스틴을 이용한 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정에서 50 nM 이하의 IC50을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 이들 항체는 또한 25℃에서 인간 스클레로스틴에 대해 약 10 pM 이하의 KD를 갖는다. 보다 바람직하게는, 이들 항체는 25℃에서 인간 스클레로스틴에 대해 약 10 pM 이하의 KD를 갖고, 사이노몰거스 원숭이 스클레로스틴에 대해서는 25℃에서 약 100 pM 이하의 KD를 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 제약 조성물은 균질하거나 실질적으로 균질한 본 발명의 모노클로날 항체 군집 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
본 발명은 약제를 제조하기 위한 본 발명의 항체의 용도로 구현된다. 본 발명은 추가로, 동물, 바람직하게는 포유동물 종, 보다 바람직하게는 인간 대상체의 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 방법에 있어서의 본 발명의 항체의 용도로 구현된다.
본 발명은 추가로 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 것이 필요한 인간 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체의 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 것이 유익한 인간 대상체의 질환, 증상 또는 장애, 예를 들어 골다공증, 골감소증, 골관절염, 골관절염 관련 통증, 치주 질환 및 다발성 골수종을 비롯한 질환, 증상 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 항체를 상기 항체가 스클레로스틴 단백질에 결합되도록 하는데 충분한 조건하에서 본 발명의 항체가 스클레로스틴 단백질에 결합되도록 하는데 충분한 시간 동안 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션하고, 그러한 결합을 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 스클레로스틴 단백질을 검출하는 방법으로 구현된다. 상기 검출 검정에 사용하는데 바람직한 항체는 서열 40을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 41을 갖는 경쇄 폴리펩티드; 서열 42를 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 43을 갖는 경쇄 폴리펩티드; 서열 2를 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 5를 갖는 경쇄 폴리펩티드; 서열 3을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 6을 갖는 경쇄 폴리펩티드; 또는 서열 4를 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 7을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 갖는다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자; 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 대조군 서열에 임의로 작동가능하게 연결된, 상기 핵산을 포함하는 벡터; 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포; 및 상기 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고, 임의로 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 항체 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 시험관내 또는 생체내에서 적어도 하나의 인간 스클레로스틴 생물활성을 중화시키거나 길항하며, 추가로 인간 스클레로스틴에 대해 강한 친화력을 나타내는 항체를 제시한다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "스클레로스틴"은 서열 1로 표현되는 아미노산 서열을 갖는 전장 인간 단백질, 또는 신호 서열이 제거된 성숙한 형태의 단백질을 말한다.
본 발명의 항-스클레로스틴 항체 (또는 간단히 "본 발명의 항체")와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 모노클로날 항체를 말한다. 본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"는 달리 지시되지 않는 한 키메라 항체 또는 인간화 항체를 말한다. 본 발명의 모노클로날 항체는, 예를 들어 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 예를 들어 CDR-그래프팅(CDR-grafting)을 이용하거나, 또는 이들 기술 또는 당업계 주지의 다른 기술을 조합하여 생산할 수 있다. "모노클로날 항체"는 그것이 생산되는 방법이 아니라, 예를 들어 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론을 비롯한 단일의 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 말한다.
"모노클로날 항체" 또는 "본 발명의 항체" 또는 간단히 "항체"는 무결점의 항체 (완전한 또는 전장 Fc 영역을 포함)이거나, 또는 항원-결합 부위를 포함하는 항체의 부위 또는 단편, 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체의 Fab 단편, Fab' 단편, 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 본 발명의 항체의 특히 바람직한 항원-결합 단편은 생체내 또는 시험관내에서 포유동물의 스클레로스틴의 하나 이상의 생물활성을 억제하거나 중화시키는 능력을 보유하는 것이다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 항원-결합 부위는 성숙한 인간 스클레로스틴이 그의 하나 이상의 리간드와 상호작용하는 것을 억제할 수 있고/있거나 인간 스클레로스틴의 하나 이상의 수용체-매개 기능을 억제할 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 것으로 "모노클로날 항체" 또는 "본 발명의 항체" 또는 간단히 "항체"는 LCVR 및 HCVR을 코딩하는 DNA를 링커 서열과 연결시켜 생산할 수 있는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다 (문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994] 참조). 항원-결합 단편 또는 부위의 특정 여부와 관계없이, 본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 달리 지시되지 않는한 이와 같은 단편 또는 부위 외에도 단일쇄 형태를 포함함을 이해한다. 단백질이 스클레로스틴에 특이적으로 결합되는 능력을 보유하는 한, 그것은 용어 "항체"에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다" 란, 특이적 결합쌍의 구성원 중 하나가 당업계에서 이용가능한 기술, 예를 들어 경쟁적 ELISA, 바이아코어(BIACORE, 등록상표) 검정, 또는 키넥사(KINEXA, 등록상표) 검정으로 측정하였을때, 그의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자에는 유의하게 결합하지 않는 상황을 말한다. 이 용어는 또한, 예를 들어 본 발명의 항체의 항원-결합 도메인이 다수의 항원에 의해 운반되는 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 적용되며, 이 경우 항원-결합 도메인을 운반하는 항체는 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체의 항원-결합 영역에서 항체에 의해 인식되어 결합될 수 있는 분자의 부위를 말한다.
본 발명의 항체와 관련된 어구 "생물활성"에는 에피토프 또는 항원 결합 친화력, 생체내 또는 시험관내에서 스클레로스틴의 생물활성을 중화시키거나 길항하는 능력, 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정 (예를 들어, 본원의 실시예 2에 기재되어 있음) 또는 다른 시험관내 활성 검정에서의 IC50, 항체의 생체내 및/또는 시험관내 안정성, 및 예를 들어 인간 대상체에게 투여한 경우의 항체의 면역원성이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기에서 언급한 특성 또는 특징들은 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분석, 한계없는 시험관내 및 생체내 중화 검정, 수용체 결합, 및 인간, 영장류, 또는 요구될 수 있는 임의의 다른 공급원을 비롯한 상이한 공급원으로부터의 조직과의 면역조직화학을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 당업계 공지의 기술을 이용하여 관찰 또는 측정할 수 있다.
스클레로스틴과 관련된 어구 "생물활성"에는 스클레로스틴의 다른 단백질 (예를 들어, 수용체 또는 TGF-β 패밀리 구성원)에 대한 특이적 결합, 인간 스클레로스틴의 하나 이상의 수용체-매개 기능, 신호 전달, 면역원성, 생체내 또는 시험관내 안정성, 생체내 또는 시험관내에서의 다른 단백질의 수치 또는 활성에 미치는 영향 (예를 들어, 실시예 2 참조), 스클레로스틴 발현 수치 및 조직 분포가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체의 생물활성과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "억제" 또는 "중화"는 스클레로스틴의 생물활성을 실질적으로 길항하거나, 방해하거나, 방지하거나, 제지하거나, 늦추거나, 파괴하거나, 제거하거나, 정지시키거나, 감소시키거나 또는 역행시키는 능력을 의미한다 (예를 들어, 본원의 실시예 2에서 측정되는 것과 같음).
본원에서 사용되는 용어 "카바트 넘버링(Kabat numbering)"은 당업계에 인식되어 있으며, 항체의 중쇄 및 경쇄 영역에서 다른 아미노산 잔기에 비해 보다 더 가변성인 (즉, 과가변성인) 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 말한다 (문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]). 항체의 가변 영역에서 CDR의 위치결정은 카바트 넘버링 또는 간단히 "카바트"에 따른다.
폴리뉴클레오티드는 그것이 다른 폴리뉴클레오티드와 기능적으로 상관관계에 놓일 경우 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간을 말한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 추가로 스클레로스틴 수치의 감소 또는 스클레로스틴 생물활성의 감소가 유익할 질환 또는 장애 또는 증상을 갖는 것을 특징으로 한다.
용어 "벡터"는 플라스미드 및 바이러스성 벡터를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌, 작동가능하게 연결된, 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제가 가능한 반면, 다른 벡터는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈과 통합되어 숙주의 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지휘할 수 있다. 그러한 벡터를 본원에서는 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")라 부른다. 그러한 벡터의 예는 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "숙주 세포", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, HCVR, LCVR 또는 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 임의의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 임의의 재조합 벡터(들)의 피전달자인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포에는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 경쇄 또는 중쇄를 발현하는 1 이상의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 감염된 세포가 포함된다.
전장 항체의 각 중쇄는 N-말단 중쇄 가변 영역 (본원에서는 "HCVR") 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 전장 항체의 각 경쇄는 N-말단 경쇄 가변 영역 (본원에서는 "LCVR") 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. HCVR 및 LCVR 영역은 프레임워크 영역 ("FR")이라 부르는 보다 보존적인 영역에 의해 산재된 상보성 결정 영역 ("CDR")이라 부르는 과가변 영역으로 더 나눌 수 있다. 특정 항원 또는 에피토프에 결합하는 항체의 기능은 항체의 가변 영역에 존재하는 6개의 CDR에 의해 크게 영향을 받는다. HCVR 및 LCVR은 각각 세 개의 CDR (HCVR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, LCVR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) 및 네 개의 FR로 이루어지고, 아미노 말단에서 카르복시 말단이 다음과 같은 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR은 항원과 특이적인 상호작용을 형성하는 대부분의 잔기를 함유한다. 가변 영역 내에서의 CDR의 위치결정은 카바트에 따른다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류되고, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 정의하며, 이들 몇몇은 추가로, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4와 같이 서브클래스로 나뉠 수 있다. 각 중쇄 유형은 이미 당업계에 공지되어 있는 서열을 갖는 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 경쇄 불변 영역 카파 및 중쇄 불변 영역 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4는 본 발명의 항체의 바람직한 불변 영역이다. 보다 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 서열 39를 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 서열 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 키메라 항체는 인간 이외, 바람직하게는 래트 또는 뮤린 기원의 불변 영역을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "항원-결합 영역" 또는 "항원-결합 부위"는 항원과 상호작용하고 항체에 항원에 대한 특이성 및 친화력을 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는, 항체 분자의 가변 영역 내의 부위를 말한다. 이 항체 부위는 항원-결합 잔기의 적절한 배열을 유지하는데 필요한 프레임워크 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 바람직한 항체는 서열 20, 21, 22, 23, 24 및 25의 아미노산 서열을 갖는 6개의 CDR을 포함한다. 본 발명의 또다른 바람직한 항체는 서열 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 아미노산 서열을 갖는 6개의 CDR을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 항체는 서열 26, 27, 28, 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 갖는 6개의 CDR을 포함한다. 이들 바람직한 항체의 CDR은 아래의 표 1에 나타낸 바와 같은 위치에 존재한다. CDR은 카바트에 따르면, 가변 영역 내에 위치한다.
본 발명의 바람직한 항체는 서열 17, 18 또는 19의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 모노클로날 항체는 서열 14, 15 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 항체는 서열 17의 LCVR 및 서열 14의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 또다른 항체는 서열 19의 LCVR 및 서열 16의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 항체는 서열 18의 LCVR 및 서열 15의 HCVR을 포함한다. 상기 LCVR은 바람직하게는 인간 기원의 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 카파 사슬에 바람직하게 연결된다. 상기 HCVR은 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 불변 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4, 가장 바람직하게는 서열 38을 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한가지 바람직한 항체는 서열 2를 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 5를 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 서열 2를 갖는 중쇄 폴리펩티드는, 예를 들어 서열 8의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열 5를 갖는 경쇄 폴리펩티드는, 예를 들어 서열 11의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 항체는 서열 4를 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 7을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 서열 4를 갖는 중쇄 폴리펩티드는, 예를 들어 서열 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열 7을 갖는 경쇄 폴리펩티드는, 예를 들어 서열 13의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 항체는 서열 3을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 6을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 서열 3을 갖는 중쇄 폴리펩티드는 서열 9의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열 6을 갖는 경쇄 폴리펩티드는 서열 12의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 바람직한 인간화 항체는 본원에서 86, 88 및 89라 칭한다. 이들의 서열은 아래의 표 1에 열거한 것과 같다.
Figure 112009057447729-pct00001
바람직하게는, 본 발명의 항체 (여기서, 모든 6개의 CDR, HCVR, LCVR, HCVR 및 LCVR, 완전한 중쇄, 완전한 경쇄, 또는 완전한 중쇄 및 완전한 경쇄는 본원의 서열 (예를 들어, 표 1 참조)에 의해 나타내어지는 특정 서열로 한정됨)는 추가로, 25℃에서 인간 스클레로스틴에 대해 약 10 pM, 8 pM, 6 pM 또는 4 pM 미만, 보다 바람직하게는 약 2.2 pM 미만의 KD를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 이러한 항체는 추가로 25℃에서 사이노몰거스 원숭이 스클레로스틴에 대해 약 100 pM, 90 pM 또는 80 pM 미만, 또는 보다 바람직하게는 약 75 pM 미만의 KD를 갖는 것으로 한정되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 (여기서, 모든 6개의 CDR, HCVR, LCVR, HCVR 및 LCVR, 완전한 중쇄, 완전한 경쇄, 또는 완전한 중쇄 및 완전한 경쇄는 본원의 서열에 의해 나타내어지는 특정 서열로 한정됨)는 추가로, 인간 스클레로스틴을 이용한 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정에서 (예를 들어, 본원의 실시예 2 참조) 약 50 nM 이하, 약 40, 35, 또는 30 nM 이하, 보다 바람직하게는 약 25 nM, 보다 더 바람직하게는 약 20 nM (예를 들어, 20.2 nM) 이하의 IC50을 갖는 것을 특징으로 한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 항체 (여기서, 모든 6개의 CDR, HCVR, LCVR, HCVR 및 LCVR, 완전한 중쇄, 완전한 경쇄, 또는 완전한 중쇄 및 완전한 경쇄는 본원의 서열에 의해 나타내어지는 특정 서열로 한정됨)는 추가로, 25℃에서 인간 스클레로스틴에 대해 약 10 pM, 8 pM, 6 pM 또는 4 pM 미만, 보다 바람직하게는 약 2.2 pM 미만의 KD를 갖는 것을 특징으로 하고, 또한 인간 스클레로스틴을 이용한 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정에서 약 50 nM 이하, 약 40, 35, 또는 30 nM 이하, 보다 바람직하게는 약 25 nM 이하, 보다 더 바람직하게는 약 20 nM (예를 들어, 20.2 nM) 이하의 IC50을 갖는 것을 특징으로 한다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 항체 (여기서, 모든 6개의 CDR, HCVR, LCVR, HCVR 및 LCVR, 완전한 중쇄, 완전한 경쇄, 또는 완전한 중쇄 및 완전한 경쇄는 본원의 서열에 의해 나타내어지는 특정 서열로 한정됨)는 추가로, 25℃에서 인간 스클레로스틴에 대해 약 10 pM, 8 pM, 6 pM 또는 4 pM 미만, 보다 바람직하게는 약 2.2 pM 미만의 KD를 갖는 것을 특징으로 하고; 또한, 인간 스클레로스틴을 이용한 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정에서 약 50 nM 이하, 약 40, 35, 또는 30 nM 이하, 보다 바람직하게는 약 25 nM 이하, 보다 더 바람직하게는 약 20 nM (예를 들어, 20.2 nM) 이하의 IC50을 갖는 것을 특징으로 하며; 또한, 사이노몰거스 원숭이 스클레로스틴을 이용한 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정에서 약 75 nM 이하의 IC50을 갖는 것을 특징으로 한다.
항체 발현
본 발명은 또한 본 발명의 항-스클레로스틴 항체를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포주의 제작 및 단리는 당업계에 공지되어 있는 표준 기술을 이용하여 달성할 수 있다.
원핵생물 (박테리아) 및 진핵생물 발현 시스템 (예컨대, 효모, 바큘로바이러스, 식물, 포유동물 및 기타 동물 세포, 트랜스제닉 동물, 및 하이브리도마 세포) 뿐만 아니라 파지 디스플레이 발현 시스템을 비롯한, 당업계에 공지되어 있는 매우 다양한 숙주 발현 시스템을 본 발명의 항체를 발현시키는데 이용할 수 있다.
본 발명의 항체는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자를 숙주 세포 내에서 재조합 발현시켜 제조할 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해서는, 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포 내에서 발현되도록 항체의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환, 형질도입, 또는 감염시킨다. 중쇄 및 경쇄는 하나의 벡터에 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 이와 달리 중쇄 및 경쇄는 두 개의 벡터 - 하나는 중쇄를 발현하고, 다른 하나는 경쇄를 발현하는 - 에 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 임의로는, 중쇄 및 경쇄는 상이한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다.
부가적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항-스클레로스틴 항체 경쇄 및/또는 중쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항-스클레로스틴 항체 경쇄 및/또는 중쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임(in-frame)으로 작동가능하게 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항체는 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되고, 그로부터 항체를 회수하거나 정제할 수 있다.
HCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 HCVR-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시켜 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 다른 포유동물 뿐만 아니라 인간의 중쇄 불변 영역 유전자 서열도 당업계에 공지되어 있다. 이들 영역을 아우르는 DNA 단편은, 예를 들어 표준 PCR 증폭을 이용하여 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 상기의 문헌 [Kabat]에 기술되어 있는 바와 같이, 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgM 또는 IgD), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 또는 서브클래스 불변 영역 및 이들의 임의의 동종이형 변이체일 수 있다. 바람직한 중쇄 불변 영역은 서열 38의 폴리펩티드를 포함한다.
LCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 LCVR-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시켜 전장 경쇄 유전자 (및 그 외에도, Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 다른 포유동물 뿐만 아니라 인간의 경쇄 불변 영역 유전자 서열도 당업계에 공지되어 있다. 이들 영역을 아우르는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 이용하여 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
본 발명에 사용하는데 바람직한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포 (예를 들어, ATCC CRL-9096), NSO 세포, SP2/0 세포 및 COS 세포 (ATCC 예를 들어, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2)이다. 본 발명에 사용하기 위한 부가적인 숙주 세포로는 다른 포유동물 세포, 효모 세포, 및 원핵생물 세포가 포함된다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 경우, 숙주 세포에서 항체가 발현되도록 하는데, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지에 항체가 분비되도록 하는데 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하는 것에 의해 항체가 생산된다. 항체는 표준 정제 방법을 이용하여 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
일단 발현되면, 본 발명의 무결점 항체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는 황산 암모늄 침전법, 이온 교환법, 친화성, 역상, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동법 등을 비롯한 당업계의 표준 절차에 따라 정제할 수 있다. 균질도가 적어도 약 90％, 92％, 94％ 또는 96％인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 균질도가 98 내지 99％ 이상인 것이 제약 용도로 가장 바람직하다. 부분적으로, 또는 목적하는 바와 같이 균질하게 정제되면, 멸균된 항체를 이후 본원에서 가리키는 바와 같이 치료적으로 사용할 수 있다.
인간화 항체
바람직하게는, 치료 목적으로 사용할 본 발명의 항체는 포유동물 유래의 프레임워크 및 불변 영역 서열을 (항체에 존재하는 범위까지) 가지고, 이는 포유동물이 치료용 항체에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성을 감소시킨 치료제로서 사용될 것이다. 인간화 항체는 치료 분야에 있어서 유익하고 뮤린 기원의 항체 또는 뮤린 기원의 부위를 포함하는 항체를 인간 대상체에게 투여하였을때 자주 관찰되는 인간 항-마우스 항체 반응의 가능성을 감소시키기 때문에 특히 흥미롭다. 바람직하게는, 주사된 인간화 항체는, 예를 들어 뮤린 항체의 반감기에 비해 자연 발생 인간 항체와 같은 또는 그 이상의 반감기를 가질 수 있어, 대상체에 투여될 용량을 적게하거나 그 빈도를 줄일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 적어도 하나의 부위가 인간 기원의 것인 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화 항체는, 예를 들어 통상적인 기술 (예를 들어, 합성)에 의해 화학적으로 함께 연결되거나 유전 공학 기술을 이용하여 연속 폴리펩티드로 제조된, 인간이 아닌 기원, 예컨대 마우스 항체 유래의 부위 및 인간 기원의 항체 유래의 부위를 포함할 수 있다.
바람직하게는, "인간화 항체"는 어버이 항체, 즉, 인간이 아닌 항체 (바람직하게는 마우스 모노클로날 항체)로부터 기원되거나 유래된 CDR을 갖는 반면, 프레임워크 및 불변 영역은 그것이 존재하는 범위까지 (또는 그의 상당한 또는 실질적인 부위, 즉, 적어도 약 90％, 92％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％까지) 인간 생식주 면역글로불린 영역 (예를 들어, 국제 면역유전학 데이터베이스(International ImMunoGeneTics Database) 참조) 또는 이들의 재조합되거나 돌연변이된 형태에서 발견되는 핵산 서열 정보에 의해 코딩된다 (상기 항체가 인간 세포에서 생산되는지 여부와는 관계없음). 바람직하게는, 인간화 항체의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR은 선별 검정, 예를 들어 ELISA 검정에 의해 동정될 수 있는 목적으로 하는 특성, 예를 들어 개선된 특이성, 친화력 또는 중화도를 갖도록 인간화 항체가 유래되는 인간이 아닌 어버이 항체의 CDR로부터 최적화된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체에서 최적화된 CDR은 어버이 항체에 존재하는 것과 비교할 경우 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 인간화 항체 88 및 89의 CDR에서 특정 아미노산 치환은 어버이 항체 788 및 789에 비해 (본원의 실시예 5 및 6 참조) 항체의 불안정성 가능성을 감소시키거나 (예를 들어, CDR Asn 잔기의 제거) 또는 인간 대상체에게 투여하였을때 항체의 면역원성 가능성을 감소시킨다 (예를 들어, 이뮤노필터(IMMUNOFILTER, 상표명) 기술에 의해 예측됨).
인간화 항체는 바람직하게는 인간이 아닌 항체 유래의 서열을 최소한으로 함유한다. 인간화 항체는 피전달자 항체에서도, 어버이 항체로부터 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 당업계에서 통상 사용되는 방법에 의해 시험관내에서 돌연변이 유발될 수 있으므로, 인간화 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 영역의 프레임워크 영역 아미노산 서열은 인간 생식주 HCVR 및 LCVR 서열과 관련된 서열로부터 유래되었지만, 생체내 인간 항체 생식주 목록 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 인간화 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 프레임워크 영역의 그러한 아미노산 서열은 인간 생식주 서열과 적어도 90％, 92％, 94％, 95％, 96％, 98％ 또는 그 이상, 바람직하게는 적어도 99％, 또는 가장 바람직하게는 100％ 동일한 것으로 예상된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 인간 생식주 경쇄 프레임워크 서열 (예를 들어, PCT WO 2005/005604 참조) 및 인간 생식주 중쇄 프레임워크 서열 (예를 들어, PCT WO 2005/005604 참조)을 포함한다. 바람직한 인간 생식주 경쇄 프레임워크 영역은 A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, O2, 및 O8로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 카파 경쇄 유전자 유래의 것이다. 바람직한 인간 생식주 중쇄 프레임워크 영역은 VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51 (국제출원 공개공보 제WO2006/046935호 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 중쇄 유래의 것이다.
인간화 항체를 생성하기 위해 이용가능한 방법들이 당업계에 다양하게 존재한다. 예를 들어, 인간화 항체는 스클레로스틴, 바람직하게는 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 어버이 항체 (예를 들어, 뮤린 항체 또는 하이브리도마에 의해 제조된 항체)의 HCVR 및 LCVR을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 상기 HCVR 및 LCVR (인간 이외의 것)에서 CDR을 동정하고, 그러한 CDR-코딩 핵산 서열을 선택된 인간 프레임워크-코딩 핵산 서열에 그래프팅하여 생산할 수 있다. 임의로는, CDR 영역을 프레임워크 영역에 그래프팅하기 이전에, CDR 내의 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산으로 치환시키기 위하여 무작위로 또는 특정 위치에 돌연변이를 유발시켜 CDR 영역을 최적화할 수 있다. 별법으로, 당업자에게 이용가능한 방법을 이용하여 인간 프레임워크 영역에 삽입한 후 CDR 영역을 최적화할 수 있다.
CDR-코딩 서열을 선택된 인간 프레임워크 코딩 서열에 그래프팅한 후, 인간화 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 코딩하는 결과물인 DNA 서열을 발현시켜 스클레로스틴에 결합하는 인간화 항체를 생산한다. 인간화 HCVR 및 LCVR은 전체 항-스클레로스틴 항체 분자의 일부로서, 즉 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 그러나, HCVR 및 LCVR 서열은 불변 서열 없이도 또한 발현되어 인간화 항-스클레로스틴 Fv를 생산할 수 있다.
이용할 수 있는 마우스 항체의 인간화에 관한 방법을 기술한 추가의 참고문헌들로는, 예를 들어 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991] 및 윈터(Winter)와 그의 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)])이 있다.
진단 용도
본 발명의 항체는 인간 스클레로스틴의 발현과 관련된 장애 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 항체는 스클레로스틴-관련 증상으로 치료를 받고 있는 대상체에서 스클레로스틴 수치를 모니터링하기 위한 검정에 사용될 수 있다. 그러한 적용법은 본 발명의 항체, 및 생물학적 샘플, 예를 들어 인간 체액 또는 세포 또는 조직 추출물에서 스클레로스틴을 검출하기 위한 표지를 이용하는 방법을 포함한다 (예를 들어, 본원의 실시예 1 참조). 본 발명의 항체는 개조하거나 또는 개조하지 않고 사용할 수 있으며, 검출가능한 모이어티와 공유적으로 또는 비공유적으로 부착되어 표지될 수 있다.
예를 들어, ELISA, RIA, 및 FACS를 비롯하여 생물학적 샘플에서 스클레로스틴의 수치를 측정하기 위한 다양한 통상적인 프로토콜이 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 변화되거나 비정상적인 스클레로스틴 발현 수치를 진단하기 위한 기초를 제공한다. 샘플 내에 존재하는 정상 또는 표준 스클레로스틴 수치는, 예를 들어 스클레로스틴 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 항원:항체 복합체를 형성하는데 적합한 조건하에서, 예를 들어 본 발명의 항체와 함께 조합하는 등, 임의의 공지된 기술을 이용하여 수립한다. 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 물질에 의해 표지되어, 결합 또는 비결합된 항체의 검출을 용이하게 한다. 적합한 검출가능한 물질로는 다양한 효소, 배합군, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 있다. 형성된 표준 복합체의 양은, 예컨대 광도측정 수단과 같은 다양한 방법을 이용하여 정량한다. 이어서 샘플에 존재하는 스클레로스틴 폴리펩티드의 양을 표준 수치와 비교한다.
치료적 용도
스클레로스틴은 골 형성의 음성적 조절인자로서 기능한다 (예를 들어, 문헌 [Cytokine & Growth Factor Reviews, 16:319-327, 2005] 참조). 지원자의 연골에서는 비록 낮은 농도로 발견되기는 하였지만, 성인에게서 스클레로스틴 mRNA는 주로 골세포 내에서 검출된다.
본 발명의 항-스클레로스틴 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 그 유효량을 척추뼈 또는 척추 이외의 뼈, 또는 둘 모두에서 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시킬 필요가 있는 인간 대상체에게 투여할 경우, 척추뼈 또는 척추 이외의 뼈, 또는 둘 모두에서 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는데 사용할 수 있다. 본 발명의 항-스클레로스틴 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 그 유효량을 척추뼈 또는 척추 이외의 뼈의 골절 발생을 감소시킬 필요가 있는 인간 대상체에게 투여할 경우, 척추뼈 또는 척추 이외의 뼈의 골절 발생을 감소시키는데 사용할 수 있다. 골절 발생을 감소시킨다는 것에는 치료하지 않은 대조군 군집에 비해 인간 대상체의 골절 발생 가능성 또는 실제 골절 발생을 감소시킨다는 것이 포함된다.
또한, 본 발명의 항체는 스클레로스틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 유발 또는 그에 기여하거나, 스클레로스틴 수치 또는 스클레로스틴 생물활성의 감소가 인간 대상체에게 치료적으로 유익한 증상, 질환, 또는 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 그러한 증상, 질환 또는 장애에는 골다공증, 골감소증, 골관절염, 골관절염 관련 통증, 치주 질환 또는 다발성 골수종이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 대상체는 남성이거나 여성일 수 있다. 바람직하게는 척추뼈 및/또는 척추 이외의 뼈가 골절될 위험이 있는 인간 대상체이고, 보다 바람직하게는 골다공증의 위험이 있거나 골다공증을 앓고 있는 인간 대상체이다. 인간 대상체는 바람직하게는 여성이고, 보다 바람직하게는 폐경후 골다공증의 위험이 있거나 폐경후 골다공증을 앓고 있는 여성이다. 본 발명의 방법은 골다공증의 어떤 단계에 있는 대상체에도 유익할 것으로 기대된다.
부가적으로, 상기에서 언급한 장애 중 적어도 하나를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 본 발명의 항체의 용도가 의도된다.
용어 "치료" 및 "치료하는"은 본원에서 기술하는 장애의 진행을 늦추거나, 중단시키거나, 저지하거나, 조절하거나, 또는 멈추는 것일 수 있는 모든 과정을 지칭하는 것으로 의도되지만, 반드시 모든 장애 징후를 전부 제거하는 것을 가리키는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질환 또는 증상을 치료하기 위해 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하고, (a) 질환이 추가로 진행되는 것을 억제하고, 즉 그의 진전을 저지하고; (b) 질환을 경감시키는 것, 즉 질환 또는 장애가 퇴보되도록 하거나 그의 징후 또는 합병증을 완화시키는 것을 포함한다. 투여 요법은 목적으로 하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일의 볼루스를 투여할 수 있거나, 용량을 수 회로 나누어 시간의 경과에 따라 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 따라 그에 비례하여 용량을 감소 또는 증가시킬 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 항체는 인간 대상체에 투여하는데 적합한 제약 조성물에 병합될 수 있다. 본 발명의 항체는 인간 대상체에 단독으로, 또는 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제와 조합하여 단일 또는 다중 용량으로 투여할 수 있다. 그러한 제약 조성물은 선택된 투여 방식에 따라 적절하게 설계되며, 제약상 허용되는 희석제, 담체, 및/또는 부형제, 예컨대 분산제, 완충액, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 적절하게 사용된다. 상기 조성물은, 예를 들어 당업자에게 일반적으로 공지되어 있는 제형화 기술의 개론을 제공하는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]에 기술되어 있는 통상적인 기술에 따라 설계될 수 있다. 제약 조성물용으로 적합한 담체에는, 본 발명의 모노클로날 항체와 조합할 경우, 분자의 활성을 유지하고 대상체의 면역 시스템과는 비-반응성인 임의의 물질이 포함된다.
본 발명의 항-스클레로스틴 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 표준 투여 기술을 이용하여 본원에서 기술하는 바와 같은 병상, 예를 들어 골다공증, 골관절염 또는 기타 골 퇴화성 장애의 위험이 있거나 그러한 병상을 나타내는 대상체에게 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 본 발명의 항체의 "유효량"을 함유한다. 유효량이란 목적으로 하는 치료 결과를 얻는데 필요한 (투여량에서의, 투여 기간 동안의 및 투여 수단에 대한) 양을 말한다. 항체의 유효량은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 목적으로 하는 반응을 이끌어내는 항체 또는 항체 부위의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 유효량은 또한 치료적으로 유익한 효과가 항체의 임의의 독성 또는 불리한 효과를 능가하는 것이다.
유효량은 대상체에게 치료적 이점을 부여하는데 필요한 활성 작용제의 최소 용량 이상이지만 독성 용량 미만이다. 다시 말하면, 본 발명의 항체의 유효량 또는 치료적 유효량은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 (i) 골 질량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키거나; 또는 골다공증, 골감소증, 골관절염, 류마티스 관절염, 치주 질환 또는 다발성 골수종을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌, (ii) 스클레로스틴의 존재가 바람직하지 않은 병리 효과를 유발하거나 또는 그에 기여하는 증상, 장애 또는 질환를 치료하거나; 또는 (iii) 스클레로스틴 수치 또는 스클레로스틴 생물활성의 감소가 포유동물, 바람직하게는 인간에게 유익한 치료 효과를 야기하는 양이다.
의학 업계에서 널리 공지되어 있는 바와 같이, 임의의 한 대상체에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여할 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강, 및 그 밖에 동시에 투여할 약물을 비롯한 많은 인자들에 의존적이다. 용량은 또한, 질환의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 전형적인 용량은, 예를 들어 0.001 내지 1000 ㎍; 바람직하게는 1 내지 100 ㎍의 범위일 수 있지만; 특히 상기에서 언급한 인자들을 고려하여 이러한 예시적 범위 미만 또는 초과의 용량도 계획할 수 있다. 매일 비경구적으로 투여하는 요법은 총 체중 kg 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 20 mg, 바람직하게는 약 0.3 ㎍ 내지 약 10 mg일 수 있다. 경과는 정기적인 평가에 의해 모니터링할 수 있고, 이에 따라 용량을 조정할 수 있다.
이와 같은 항체의 제안된 양은 치료적 판단에 많은 영향을 받는다. 적절한 용량 및 스케쥴의 선택에서의 핵심 인자는 얻어진 결과이다. 이러한 상황에서 고려할 인자로는 치료될 특정 장애, 개별적인 환자의 임상 증상, 장애의 원인, 항체의 전달 부위, 항체의 특정 유형, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 진료의에게 공지된 그 밖의 인자가 있다.
본 발명의 항체의 투여 경로는 경구 또는 비경구이거나, 흡입에 의하거나, 국소적일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 비경구 투여에 적합한 제약 조성물에 병합될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구에는, 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 또는 복강내 투여가 포함된다. 정맥내 또는 복강내 또는 피하 주사에 의한 비경구 전달이 바람직하다. 피하 주사가 가장 바람직하다. 이와 같은 주사에 적합한 비히클은 당업계에 널리 공지되어 있다.
제약 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서, 예를 들어 밀봉된 바이알, 주사기, 또는 기타 전달 수단, 예를 들어 펜을 비롯한 제공된 용기 내에서 무균성이고 안정적이어야 한다. 따라서, 제약 조성물은 제형의 제조 후에 무균 여과될 수 있거나, 또는 다르게는 미생물학적으로 허용가능하게 제조될 수 있다.
하기 실시예는 설명적 목적을 위해서만 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예 1 ELISA 검정
본 검정은 인간 혈청 샘플에서 스클레로스틴을 검출 하한인 0.4 ng/ml까지 검출 및 정량하는데 사용된다. 항체 86은 포획 항체이고, 항체 88은 검출 항체이다 (항체 서열에 대해서는 표 1 참조).
96-웰 플레이트의 내벽을 전장 항-스클레로스틴 모노클로날 항체 86 100 ㎕ 를 이용하여 0.5 M 탄산 나트륨 (pH 9.6) 중의 0.5 ㎍/mL의 농도로 코팅하였다 ("코팅 완충액"). 상기 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후 상기 플레이트를 TBST "세척 완충액" (0.4 M 트리스-HCl, 3 M NaCl, 0.1％ 트윈 20)로 3회 세척하였다. 이어서 각 웰에 PBS 중의 카세인 차단 완충액 (피어스(Pierce), #37528) 200 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 플레이트를 세척 완충액 중에서 2회 세척하여 차단 용액을 제거하였다.
표준 곡선을 얻기 위해, 카세인 차단 완충액 중에서 농도 0.35 mg/mL의 인간 스클레로스틴을 제조하고, PBS 중의 카세인 차단 완충액 중의 5％ 풀 인간 혈청 내에서 2 배로 연속 희석시켰다 (1.25 ng/ml에서 0 ng/ml로). 인간 혈청을 항-스클레로스틴 모노클로날 항체 86으로 코팅된 자기 비드 컬럼에 흘려내려 혈청에 내생적으로 존재해 있을 수 있는 임의의 스클레로스틴을 제거하였다.
100 ㎕의 샘플 (카세인 차단 완충액 중의 5％ 혈청) 또는 표준물을 중복하여 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가로 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 상기 웰을 세척 완충액으로 5회 세척하였다.
피어스 EZ 링크 NHS-LC 바이오틴 키트로 바이오틴화된 검출 항체 (전장 항-스클레로스틴 모노클로날 항체 88) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 스트렙타비딘-홀스래디시 퍼옥시다제(Streptavidin-horseradish peroxidase)를 PBS 중의 카세인 차단 완충액 내에서 1:2000으로 최종 농도 0.5 ㎍/ml까지 희석시킨 후, 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 세척 완충액을 이용하여 7회 세척하였다. OPD 기질 (시그마(Sigma) P8806)을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 20분 동안 반응이 계속되게 하였다. 이어서, 1 N HCl을 100 ㎕/웰로 첨가하여 반응을 종료시켰다. 상기 플레이트를 OD 490 nm에서 판독하였다.
실시예 2 중화 - 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정
골 특이적 알칼리 포스파타제는 조골세포 활성의 생화학적 지표이다. 본원에서 기술하는 골 특이적 알칼리 포스파타제 검정은 다잠재성 뮤린 세포주, C2C12에서 BMP-4 및 Wnt3a-자극 알칼리 포스파타제 수치를 감소시키는 스클레로스틴의 능력을 기초로 하며, 스클레로스틴 활성을 중화시키는 항체는 이 검정에서 알칼리 포스파타제의 활성을 용량-의존적으로 증가시킬 것이다. Wnt3a 및 BMP-4는 골형성 성장 인자이다.
5％ 소 태아 혈청이 보충된 MEM 배지 내의 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 C2C12 세포 (ATCC, CRL 1772)를 3000 내지 5000 세포로 평판배양한 후, 5％ CO2 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션하였다. 시험 대상인 항체를 0.5×Wnt3a-조건화 배지에서 다양한 최종 농도로 희석시켰다. 이어서, 조직 배양 플레이트 상의 세포로부터 배지를 제거하고, 미리 혼합한 항체-BMP4-스클레로스틴 용액 (인간 또는 사이노몰거스 원숭이)을 웰당 150 ㎕ 첨가하여, 항체의 최종 농도는 30 ㎍/ml에서 0.5 ㎍/ml, BMP-4의 최종 농도는 25 ng/ml, 스클레로스틴 단백질의 최종 농도는 1.0 ㎍/ml 및 조건화 배지의 농도는 0.5×가 되었다. 이후 상기 플레이트를 5％ CO2 중에서 37℃로 72시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 조직 배양 플레이트 상의 세포로부터 제거하고, 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 세포 평판배양물을 -80℃ 및 37℃ 사이에서 교대로 3회 동결 및 해동시켰다.
Wnt3a 조건화 배지는 L-Wnt-3A 세포 및 대조군 L-세포 (각각 ATCC CRL-2647 및 CRL-2648)를 4일 동안 10％ FBS 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 DMEM 중에서 융합성 세포의 1:20 스플릿으로부터 성장시켜 제조하였다. 수집된 배지를 0.2 ㎛의 나일론 막을 통해 여과하고, -20℃에서 장기간 동안 또는 4℃에서 단기간 동안 저장하였다.
알칼리 포스파타제 활성은 알칼리 포스파타제 기질 (1-스텝 PNPP, 피어스 #37621)을 웰당 150 ㎕씩 첨가하여 측정하였다. 이어서, 세포의 평판배양물을 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 후 405 nm에서 OD를 판독하여 알칼리 포스파타제 활성을 판단하였다. 아래의 표 2에 보고한 항체 중화 IC50 값은 2 번의 별개 실험치의 평균값이다. IC50은 시그모이드(Sigmoid) 4-매개변수 적합 방정식을 이용하여 시그마플롯 회귀 분석법(SigmaPlot Regression Wizard)으로 계산하였다.
Figure 112009057447729-pct00002
실시예 3 친화 결합
KD-조절된 조건하에 KinExA 3000 기구 (사피딘 인스트루먼츠 인크.(Sapidyne Instruments Inc.)) 상에서 항-스클레로스틴 항체와 인간, 사이노몰거스 ("사이노") 원숭이 또는 래트 스클레로스틴 사이의 평형 결합을 연구하였다. 이 기술을 이용하여, 항체의 KD 미만으로 고정된 농도의 항체를 다양한 농도의 스클레로스틴 단백질과 혼합하고, 평형이 되게 하였다. 용액 중에 잔류하는 유리, 비결합 항체 분획은 평형화된 혼합물을 스클레로스틴-코팅된 비드에 잠시 노출시킨 후 형광으로 표지된 2차 항체로 검출하여 탐침하였다. 전형적으로 시험 대상인 항-스클레로스틴 항체 2 pM을, 2 내지 50 nM에서 출발하여 시험 대상인 항체를 2 pM 함유하는 결합 완충액 (1× 포스페이트 완충 염수 용액, pH 7.4, 0.02％ 나트륨 아지드 및 1 mg/mL 소 혈청 알부민) 중에서 3배 연속 희석시킨 다양한 농도의 인간, 사이노, 또는 래트 스클레로스틴과 혼합하였다. 이 용액이 25℃에서 이틀에 걸쳐 평형에 이르도록 하였다. 비결합된 항체의 양은 인간 스클레로스틴-코팅된 아즐락톤 비드 (사피딘 인스트루먼츠, 인크.)를 이용하여 탐침하였다. 이들 비드는 무수 아즐락톤 비드 50 mg을 인간 스클레로스틴 50 mcg/ml과 pH 9.0 내지 9.6의 탄산 나트륨 완충액 50 mM에서 하룻밤 교대로 반응시켜 제조하였다. 이후 비드가 침강되도록 하고, 상청액을 차단 용액 (1 M 트리스, pH 8.0 + 10 mg/mL 소 혈청 알부민)으로 대체하고, 1시간 동안 교대시켰다. 이 비드 축적물을 결합 완충액 중에서 20배 희석하고, 3일 내에 사용하였다. 실온 (대략 25℃)에서 평형화된 KinExA 3000 기구를 결합 연구에 사용하였다. 전형적으로 평형화된 항체/스클레로스틴 용액 6.25 mL를 팩킹된 인간 스클레로스틴-아즐락톤 비드 컬럼으로부터 0.25 mL/분의 유속으로 흡입해낸 후, 구동 완충액 (0.02％ 나트륨 아지드를 함유하는 1× 포스페이트 완충 염수 용액, pH 7.4)으로 세정하였다. 상기 비드에 결합된 유리 항-스클레로스틴 항체 분획은 표지된 2차 항체 (Cy5-표지된 염소 항-인간 Fab'2 항체)를 주입한 결과인 형광을 측정하여 정량하였다. 각 증상에 대한 2개의 복제 샘플을 분석하고, KinExA 프로 소프트웨어를 이용하여 데이터를 1:1 결합 모델에 피팅시켜 KD를 판단하였다. 25℃에서의 KD 값의 평균을 아래의 표 3에 보고하였다.
Figure 112009057447729-pct00003
실시예 4 생체내 칼세인 검정:
래트 칼세인 검정은 단기간 (10 일)에 걸친 골 형성 및 골 형성에 대한 본 발명의 항체의 효과의 직접 평가를 가능하게 한다. 칼세인은 새로운 골 형성 동안에 골 기질에 병합되는 플루오로크롬 표지이다. 칼세인의 정량 측정값은 약리 작용제에 의해 유도되는 골 형성의 정도를 반영한다. 6개월된 암컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 래트를 이용하였다 (투여 그룹 당 n=6). 래트에게 피하 주사로 매 3 일마다 (0 일째, 3 일째, 및 6 일째) PBS 비히클 중의 항체를 1 mg/kg 또는 6 mg/kg, 또는 매일 PTH를 10 ㎍/kg, 또는 음성적 대조군으로서 인간 IgG를 6 mg/kg 투여하였다. 7 일째에 칼세인을 피하로 주사하고 10 일째에 래트를 희생시켰다. 경골을 수집하고 잘라서 해면 골 형성 (원위 골간단부(distal metaphysis)) 또는 피질 골 형성 (경골 골간부(diaphysis))을 평가하고, 총 칼세인의 무기질소실 및 플루오로크롬을 정량하였다. 아래의 표 4에 나타낸 값은 인간 IgG 대조군을 1.0으로 설정했을때의 평균값이다. 이들 데이터는 본 발명의 항체의 투여가 해면 및 피질 골 형성을 야기함을 입증하였다.
Figure 112009057447729-pct00004
실시예 5 골관절염
SOST 발현은 주로 골 조직에 제한된다. 그러나, 본 출원인은 본원에서 실시간 PCR로 측정하여 SOST가 상당히 발현되는 또다른 조직이 연골임을 판단하였다. 연골의 SOST 발현은 또한 정상 또는 골관절염 환자의 연골로부터 단리된 RNA 배열을 이용하여 관찰하였다. 게다가, 이 배열에서 SOST의 발현은 골관절염의 중증도에 비례하여 증가되어, 경증 골관절염 연골에서의 발현은 대조군보다 많았고, 중증 골관절염 연골에서의 발현은 경증의 경우보다 많았으며, 외과적으로 중증인 골관절염 연골 (무릎 치환술에 의해 제거된 것)에서의 발현은 그 밖의 모든 경우보다 많아, 골관절염과 SOST 발현의 상관관계를 입증하였다. 스클레로스틴에 특이적인 항체를 골관절염을 치료하는데 사용할 수 있다.
래트 Fc 영역 상에 뮤린 가변 영역을 갖는 항-스클레로스틴 키메라 항체 (중쇄에 대해서는 서열 42 및 경쇄에 대해서는 서열 43을 갖는 항체 789)에 대해, 골관절염 MIA 모델에서 관절 통증을 막을 수 있는 능력을 시험하였다. 이 항체의 가변 영역은 인간화 항체 89 (서열 16을 갖는 HCVR 및 서열 19를 갖는 LCVR) 세대에 대한 어버이 서열이었다. 인간화 항체 89 및 키메라 항체 789는 모두 동일한 에피토프에 결합하였다. 이 골관절염 모델은 무릎 관절에 모노요오도아세테이트(MIA)를 직접 주사하는 방법을 이용하여 염증성 및 사이토카인 매개 통증 및 연골 파괴 과정을 수반하는 OA-유사 과정을 유도하였다. 래트의 반대쪽 무릎에는 염수만을 주사하고, 두 뒷다리의 체중 부하에서의 차이로 통증을 판단하였다.
MIA 실험 #1에서는 어린 수컷 루이스(Lewis) 래트 (7 내지 8 주령)를, MIA를 주사하기 전에 항-스클레로스틴 항체를 투여하는 "예방 모드"로 사용하였다. MIA를 주사하기 전날에, 래트에 항-스클레로스틴 항체를 10 mg/kg, 또는 대조군 IgG 또는 PBS를 10 mg/kg 복강 주사하였다 (그룹 당 n = 6). 다음날, 래트를 마취시키고 오른쪽 무릎에 0.9％ 멸균 염수 50 ㎕ 중에 용해된 모노나트륨 요오도아세테이트 0.3 mg을 주사하였다. 왼쪽 무릎에는 염수 만을 주사하였다. 주사는 무릎 관절에 5 mm만 주입되도록 플라스틱 관 덮개로 커버된 28G 바늘을 갖는 인슐린 주사기를 이용하여 무릎 인대를 통해 주사하였다.
통증은 MIA를 주사하고 2 일 및 7 일째 (항체를 주사하고 3 일 및 8 일째)에 측정하였다. 7 일째에 통증을 측정한 후에는, 제2 용량의 항체 또는 대조군을 주사 투여하였다. MIA를 주사한 후 10 일 및 14 일째 (항체를 두번째 주사하고 3 일 및 7 일째)에 추가로 통증을 측정하였다.
통증은 인커패시턴스 테스터(incapacitance tester)를 이용하여 주사한 다리의 체중 부하에 있어서의 차이로 측정하였다. 래트를 그 뒷발이 압력 센서에 닿도록 하여 펄스펙스(Perspex) 박스에 두었다. 래트에게 신뢰할만한 증상이 없는 경우, 1초 판독한 후 2 추가 판독하여 그 평균을 계산하였다. MIA를 주사한 다리에 가해지는 체중을 염수를 주사한 다리에 가해지는 체중에서 감하여 체중 부하의 차이를 나타내었다.
MIA를 투여한 후 7 일, 10 일, 및 14 일째 되는 날, IgG (및 PBS) 대조군과 비교하여 항-스클레로스틴 항체의 경우에, 통증에 있어서의 통계적으로 현저한 감소가 관찰되었다 (아래의 표 5). 수치들은 g 값으로, MIA를 주사한 다리와 염수를 주사한 다리 사이의 체중 부하 차이를 나타낸다 (평균의 표준 오차).
두 번째 MIA 실험은 늙은 래트 (27 주령)를 대상으로, MIA를 주사한 후에 항체를 투여하는 "치료 모드"로 하였다. 상기한 바와 같이 래트에게 MIA 또는 대조군 염수를 주사하고, 그 후 6 일째에 항-스클레로스틴 항체, 대조군 IgG, 또는 PBS를 10 mg/kg 복강 주사하였다 (그룹 당 n = 6). MIA를 주사한 후 8 일 및 15 일째 (항체를 주사한 후 2 일 및 9 일째)에 상기한 바와 같이 통증을 측정하였다. MIA를 주사한 후 16 일째에 두 번째 용량의 항-스클레로스틴 항체 및 대조군을 투여하고, 21 일째 (두 번째 항체 투여 후 5 일째)에 다시 통증 측정치를 수집하였다.
항-스클레로스틴 항체를 투여한 후 초기 (MIA 투여 후 8 일째)에는 통증에 대해 항체가 아무런 효과가 없었지만, 7 일 후에는 MIA를 주사한 다리와 염수를 주사한 다리 사이의 체중 부하 차이 (g)로 측정되는 바와 같이 통증이 감소되는 경향이 나타났다. 항-스클레로스틴 항체에 의한 통증이 감소되는 경향은 또한 두 번째 항체 투여 후 5 일째에도 관찰되었다. 키메라 항체 789는 IgG 대조군과 15 일째 및 21 일째에 각각 p-값이 0.06 및 0.08로 차이가 있었다. 이러한 결과들은 모두, 이미 발생된 MIA 질환 경과로 인해 야기되는 관절 통증이 이를 중화시키는 항-스클레로스틴 항체의 투여에 의해 차단됨을 입증한다.
실시예 6 OVX 래트 연구
난소적출 (OVX) 래트는 폐경후 골다공증 모델로 널리 인식되어 있다. 본 연구에서는, OVX 래트에 있어서 뮤린 가변 영역 및 래트 Fc를 포함하는 본 발명의 항-스클레로스틴 항체의 효과를 조사하였다.
6 개월령의 암컷 스프라그-다울리 래트의 난소를 적출하고, 투여 전 1 개월 동안 골이 손실되도록 하였다. 한 그룹의 래트 (n=8)는 난소를 적출하지 않았지만, 난소를 적출한 래트와의 골 비교를 위해 겉보기 수술을 하였다. 모든 OVX 래트에서 무작위로 치료 그룹을 고르고 (각각 n=7), PTH (1-38), IgG 대조군 (10 mg/kg) 또는 키메라 항-스클레로스틴 항체 (서열 40의 중쇄 및 서열 41의 경쇄를 갖는 항체 788 (이 항체의 가변 영역은 인간화 항체 88 세대에 대한 어버이 서열임); 서열 42의 중쇄 및 서열 43의 경쇄를 갖는 항체 789) 10 mg/kg으로 총 58일 동안 치료하였다. 항체는 매 3일 마다 모두 피하로 투여하고, PTH (1-38)는 매일 10 mg/kg씩 피하로 투여하였다. 희생시킨 후에는 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캐너를 이용한 정량적 CT 분석을 위해 대퇴골과 척추골을 떼어내어 원위 대퇴골 (해면 골) 및 중간부 (피질 골)와 5번째 요추를 측정하였다. 재현성있는 측정을 위해 뼈를 몰딩 클레이(molding clay) 상에 위치시키고, 골단의 끝에서 2 mm 지점 (원위 대퇴골) 또는 골단에서 10 mm 지점 (중간부 대퇴골)에서 대퇴골을 스캔하였다.
척추골은 척추골의 기준점인 "V" 구조에서부터 L-5를 스캐닝하여 측정하였다. 제조품인 소프트웨어 패키지 SYS-C320-V 1.5를 이용하여 데이터를 계산하였다. 대퇴골 골간부, L-5 척추골 및 대퇴골 경부의 생체역학적 특성은 부검 후 문헌 [Turner CH, Burr DB, Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial. Bone 14(4):595-608, 1993]에 따라 측정하였다. 중간부의 역학적 특성은 무결점의 왼쪽 대퇴골에 대하여 하중이 15 mm 떨어진 두 지지점 사이의 중간에 적용되는 3-지점 벤딩을 이용하여 측정하였다. 하중 지점이 원위 슬와로부터 근위쪽으로 약 7.5 mm가 되도록 대퇴골을 위치시키고, 내축-외축에 대해 벤딩하였다. 표본을 37℃의 염수조 내에서 시험하였다. 재료 시험기 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 MTS Corp.사 모델: 1/S)를 이용하여 10 mm/분의 크로스헤드 속도로 하중-변위 곡선을 기록하고, 테스트워크스(TestWorks) 4 소프트웨어 (MTS Corp.)로 분석하여 최고 하중을 계산하였다. 뒤돌기(posterior process)를 제거하고 다이아몬드 웨이퍼용 톱 (미국 일리노이주 에바스톤 소재의 뷰흘러 이소멧(Buehler Isomet))을 이용하여 중추의 말단을 평행하게 한 후 L-5 척추골의 역학적 특성을 분석하였다. 재료 시험 장치를 이용하여 척추골 견본에 압축 하중을 가하고, 테스트워크스 4 소프트웨어 (MTS Corp.)를 이용하여 분석하였다. 대퇴골 경부를 측정하기 위해, 근위쪽이 위가 되도록 대퇴골을 수직으로 실장 척(mounting chuck) 내에 위치시키고, 하중을 대퇴골 두의 중앙에서 아래 방향으로 가하였다. 테스트워크스 4 소프트웨어 (MTS Corp.)를 이용하여 이를 분석하였다. 평균값 및 평균값의 표준 오차를 아래의 표 5 및 6에 나타내었다. 이들 데이터는 키메라 항체 788 및 789가 OVX 래트에서 골 무기질 밀도 ("BMD"), 골 무기질 함량 ("BMC") 및 골 강도 (최고 하중)를 증가시킴을 입증하였다.
Figure 112009057447729-pct00005
Figure 112009057447729-pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company Korytko, Andrew I. Marquis, David Matthew Smith , Eric Michael Swanson , Barbara Anne <120> Anti-Sclerostin Antibodies <130> X17563 <150> US 60/895813 <151> 2007-03-20 <160> 43 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Val Cys Leu Leu Val His Thr 1 5 10 15 Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30 Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45 Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60 Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80 Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala 100 105 110 Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 115 120 125 Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val 130 135 140 Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg 145 150 155 160 Leu Val 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360 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc cgctagcgcc ctgctccagg 420 agcacctccg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600 ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccctgcc cagcacctga gttcctgggg 720 ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac 840 tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggaaag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact 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ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatccact ggtaccaaca gaaacctggc 120 caggctccca ggctcctcat ctatagcaca tccgagctgg cttctggcat cccagccagg 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 240 gattttgcag tttattactg tcagcagctt agtcatctcc cgctcacgtt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgc 639 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Miscellaneous construct <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Phe Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 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175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val 195 200 205 Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg 210 215 220 Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val 225 230 235 240 Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile 245 250 255 Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp 260 265 270 Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg 305 310 315 320 Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr 340 345 350 Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile 355 360 365 Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp 370 375 380 Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr 385 390 395 400 Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys 405 410 415 Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 43 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Miscellaneous construct <400> 43 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Ser 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly Val Leu Asp 145 150 155 160 Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Ser Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210

Claims (17)

  1. 6개의 CDR을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열 26의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 27의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 28의 아미노산 서열을 갖고, LCDR1은 서열 29의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2는 서열 30의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열 31의 아미노산 서열을 갖는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역를 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역이 서열 15의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역이 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 중쇄 폴리펩티드가 서열 3의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 폴리펩티드가 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
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  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 골다공증, 골감소증, 골관절염, 골관절염 관련 통증 및 치주 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 대상체의 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 골다공증을 치료하기 위한 제약 조성물.
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