CN101646457A - 抗硬骨素抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合人硬骨素的人源化抗体和嵌合抗体，并且该人源化抗体和嵌合抗体特征在于具有高亲和力和强中和性质。本发明抗体可用于增加骨量、骨矿物质密度和骨强度，并可用于治疗人类受试者中的多种障碍，例如骨质疏松症。

Description

抗硬骨素抗体
本发明在医学领域中，尤其在针对硬骨素(sclerostin)的抗体领域中。更特别地，本发明涉及特异性结合人硬骨素的高亲和力抗体及所述抗体用于人受试者中多种障碍或病症的治疗用途，所述人受试者受益于骨量(bonemass)、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中至少一项的提高。
骨质疏松症是其中骨矿物质密度(BMD)降低、骨微结构被破坏并且骨质疏松的骨处于骨折高风险的疾病。骨质疏松症是长期残疾和死亡的主要原因，尤其是老年人。虽然对骨质疏松症的有效治疗在于生活方式调整和药物治疗的形式，但目前可用的治疗在数量和效率上受限，通常与不期望的副作用相关联并且不被患者普遍接受。许多抗吸收剂(包括降钙素、二磷酸盐类、雌激素替代和选择性雌激素受体调节物(SERM))防止进一步的骨流失，但是骨一旦丢失就不能再重建。以人PTH(1-34)的形式获得增加骨量和骨矿物质密度并恢复骨结构的合成代谢剂(anabolic agent)。然而，该治疗剂需要每日皮下注射，经常注射一年或更长时间，导致不完整的患者顺应性。
SOST基因产物硬骨素在骨内的骨细胞中强表达。由于硬骨素作为骨形成的有效负调节物的作用，其是用于治疗型干涉障碍或病症的期望靶标，所述障碍或病症例如骨质疏松症受益于骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量和骨强度中至少一项的提高。因而，抗硬骨素抗体显示为治疗这类障碍或病症的有用合成代谢方法。PCT国际出版号WO 2006/119107公开了特定人源化抗硬骨素抗体的氨基酸序列，在所述抗体中所有的CDR完全是鼠类的，即并不是从小鼠中产生的抗体的CDR改变而来。
需要其他抗硬骨素抗体，其在硬骨素生物活性测定中以强结合亲和力结合人硬骨素并具有低IC50值。预计这种抗体比PTH(1-34)或抗硬骨素抗体更为治疗有效(尤其是对骨质疏松症而言)，并需要更低的施用频率，所述抗硬骨素抗体具有更低结合亲和力(即更高KD)或更高IC50值。还需要对人硬骨素特异性的抗体，其中被施用抗体的人受试者诱发对该抗体的免疫应答风险降低，或者抗体在生物活性测定中维持对人硬骨素具有高结合亲和力和低IC50值的性质的同时，不稳定性风险降低。本发明的抗硬骨素抗体满足了这些需要并提供了相关优势。
本发明抗体是嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体，其包含本文公开的特异性多肽序列，以高结合亲和力特异性结合人硬骨素并可用于增加哺乳动物，优选人中的骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量和骨强度中的至少一项。
在一个实施方案中，本发明抗体的至少一个CDR的氨基酸序列不同于亲本抗体(即啮齿动物(例如小鼠)中产生的抗体)中该位置上存在的CDR，而变体抗体即本发明人源化或嵌合抗体来自所述啮齿动物。优选地，相比于亲本抗体中存在的CDR序列，本发明抗体的CDR序列中的此类一个或多个氨基酸替换导致硬骨素生物活性测定中与人硬骨素更高的结合亲和力(即更高KD)、更低的IC50，或硬骨素生物活性测定中与人硬骨素更高的结合亲和力和更低的IC50。本发明抗体CDR序列中氨基酸替换亲本抗体CDR中存在的氨基酸可导致被施用抗体的人对抗体的免疫原性应答降低。此外，本发明抗体CDR序列中氨基酸替换亲本抗体CDR中存在的氨基酸可降低抗体不稳定的风险，例如可通过用不同氨基酸替换天冬酰胺残基由此降低脱酰胺作用风险。
在一个实施方案中，本发明抗体特异性结合人硬骨素并包含具有选自以下氨基酸序列的六个CDR区：(i)具有SEQ ID NO：20的HCDR1、具有SEQ ID NO：21的HCDR2、具有SEQ ID NO：22的HCDR3、具有SEQ IDNO：23的LCDR1、具有SEQ ID NO：24的LCDR2和具有SEQ ID NO：25的LCDR3；(ii)具有SEQ ID NO：26的HCDR1、具有SEQ ID NO：27的HCDR2、具有SEQ ID NO：28的HCDR3、具有SEQ ID NO：29的LCDR1、具有SEQ ID NO：30的LCDR2和具有SEQ ID NO：31的LCDR3；和(iii)具有SEQ ID NO：32的HCDR1、具有SEQ ID NO：33的HCDR2、具有SEQ ID NO：34的HCDR3、具有SEQ ID NO：35的LCDR1、具有SEQ IDNO：36的LCDR2和具有SEQ ID NO：37的LCDR3。
在另一实施方案中，本发明抗体特异性结合人硬骨素并包含重链可变区(“HCVR”)多肽和轻链可变区(“LCVR”)多肽，其中(i)HCVR具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列，LCVR具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列；(ii)HCVR具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列，LCVR具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列；或(iii)HCVR具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，LCVR具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明抗体特异性结合人硬骨素并包含重链多肽和轻链多肽，其中(i)重链多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链多肽具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列；(ii)重链多肽具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，轻链多肽具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或(iii)重链多肽具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，轻链多肽具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在一个实施方案中，优选以SEQ ID编号定义的如本文定义的本发明抗体进一步特征在于在25℃对人硬骨素具有约10pM或更低的结合亲和力(KD)。本发明优选抗体在25℃对食蟹猴(cynomologous monkey)硬骨素具有约100pM或更低的KD。本发明更优选的抗体在25℃对人硬骨素具有约10pM或更低的结合亲和力并在25℃对食蟹猴硬骨素具有约100pM或更低的结合亲和力。
在另一实施方案中，优选以SEQ ID编号定义的如本文定义的本发明抗体的特征在于在使用人硬骨素的骨特异性碱性磷酸酶测定中具有50nM或更少的IC50。优选地，这些抗体在25℃对人硬骨素也具有约10pM或更低的KD。更优选地，这些抗体在25℃对人硬骨素具有约10pM或更低的KD，并在25℃对食蟹猴硬骨素具有约100pM或更低的KD。
在另一实施方案中，本发明提供包含本发明抗体及可药用载体或稀释剂的药物组合物。优选地，该药物组合物包含本发明单克隆抗体的同质或基本同质群，及可药用载体或稀释剂。
本发明具体体现在本发明抗体用于制备药物的用途。本发明还具体体现在本发明抗体在用于增加动物，优选哺乳动物物种，更优选人受试者中骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中至少一项的方法中的用途。
本发明还提供了增加骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中至少一项的方法，其包括向需要其的人受试者施用有效量的本发明抗体。
本发明的一个实施方案提供了用于在人受试者中治疗疾病、病症或障碍的方法，所述人受试者受益于骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中至少一项的增加，所述疾病、病症或障碍包括，例如骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛、牙周病和多发性骨髓瘤。
本发明还具体体现在用于检测生物样品中硬骨素蛋白质的方法，其包括在足以允许所述抗体结合硬骨素蛋白质的条件和时间下温育本发明抗体与生物样品，并检测所述结合。用于这种检测测定的优选抗体具有SEQ IDNO：40的重链多肽和SEQ ID NO：41的轻链多肽；SEQ ID NO：42的重链多肽和SEQ ID NO：43的轻链多肽；SEQ ID NO：2的重链多肽和SEQ IDNO：5的轻链多肽；SEQ ID NO：3的重链多肽和SEQ ID NO：6的轻链多肽；或SEQ ID NO：4的重链多肽和SEQ ID NO：7的轻链多肽。
本发明还提供编码本发明抗体的分离的核酸分子；包含该核酸的载体，其任选地有效连接到被载体转化的宿主细胞识别的控制序列上；包含该载体的宿主细胞；用于产生本发明抗体的方法，其包括培养所述宿主细胞使得核酸表达，并任选地从宿主细胞培养基中回收抗体。
本发明提出了抗体，其特异性结合人硬骨素、在体外或体内中和或拮抗至少一种人硬骨素生物活性并进一步显示与人硬骨素的强结合亲和力。
当在本文中使用时，术语“硬骨素”指具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的全长人蛋白质或去除信号序列的蛋白质的成熟形式。
如本文中所用，意指本发明的抗硬骨素抗体(或简言之，“本发明抗体”)的术语“抗体”指单克隆抗体。如本文所用“单克隆抗体”指嵌合抗体或人源化抗体，除非另有说明。可使用例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术，例如CDR嫁接、或这些技术的组合或本领域容易已知的其他技术来产生本发明的单克隆抗体。“单克隆抗体”指来自单拷贝或克隆(包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是指产生单克隆抗体的方法。
“单克隆抗体”或“本发明抗体”或简单地“抗体”可以是完整的抗体(包含完整的或全长Fc区)，或包含抗原结合部分的抗体部分或片段，例如嵌合或人源化抗体的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。尤其优选的本发明抗体的抗原结合片段保留了体内或体外抑制或中和哺乳动物硬骨素的一种或更多种生物活性特征的能力。例如，在一个实施方案中，本发明抗体的抗原结合部分可以抑制成熟人硬骨素与一个或更多个其配体的相互作用和/或可以抑制人硬骨素的一种或更多种受体介导功能。
此外，如本文所用，“单克隆抗体”或“本发明抗体”或简单地“抗体”可以是通过用接头序列连接编码LCVR和HCVR的DNA产生的单链Fv片段。(参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994)。应理解不管是否详细说明抗原结合片段或部分，如本文所用的术语“抗体”包括这种片段或部分及单链形式，除非另有说明。只要蛋白质保留了特异性结合硬骨素的能力，其就包括在术语“抗体”内。
如本文所用，术语“特异性结合”指如通过本领域可用的技术，例如竞争ELISA、
Figure A20088000911800091
测定或
Figure A20088000911800092
测定所测定的，特异性结合对中一个成员不显著结合除其一个或多个特异性结合配偶体之外的分子的情形。该术语还适用于当例如本发明抗体的抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位特异的情况，在该情况下携带抗原结合结构域的抗体能够特异性结合携带该表位的多种抗原。术语“表位”指在一个或更多个抗体的抗原结合区中能够被抗体识别并结合的分子部分。
对于本发明抗体，短语“生物活性”包括，但不限于表位或抗原结合亲和力、在体内或体外中和或拮抗硬骨素生物活性的能力、在骨特异性碱性磷酸酶测定(例如，本文实施例2中所述)或其他体外活性测定中的IC50、抗体的体内和/或体外稳定性及例如当对人受体施用时抗体的免疫原性。使用本领域认可的技术，包括但不限于ELISA、竞争性ELISA、表面等离振子共振分析、不受限的体外和体内中和测定、受体结合及来自不同来源(包括人、灵长类)或根据需要的任何其他来源的组织切片的免疫组织化学观察或测定上述性质或特性。
对于硬骨素，短语“生物活性”包括，但不限于硬骨素对另一蛋白质(例如受体或TGF-β家族成员)的特异性结合、人硬骨素的一种或更多种受体介导的功能、信号转导、免疫原性、体内或体外稳定性、在体内或体外影响另一蛋白质的水平或活性(参见例如实施例2)、硬骨素表达水平和组织分布。
如本文所用，对本发明抗体的生物活性所用的术语“抑制”或“中和”指基本上拮抗、阻止、妨碍、抑制、减缓、中断、消除、中止、减少或颠倒硬骨素生物活性的能力(例如，本文实施例2中所测定)。
如此处所用，术语“Kabat编号”是本领域所公认的并指对氨基酸残基进行编号的系统，所述氨基酸残基比抗体重链区和轻链区中的其他氨基酸残基更易变(即，高变的)(Kabat，等，Ann.NY Acad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242(1991))。抗体可变区中的CDR位置遵循Kabat编号或简单地“Kabat”。
当多核苷酸置于与另一多核苷酸的功能关系中时，其为“有效连接的”。例如，如果其影响序列的转录，那么启动子或增强子有效连接编码序列。
此处互换使用的术语“受试者”和“患者”指哺乳动物，优选人。在某一实施方案中，受试者进一步特征在于其患有将从硬骨素水平降低或硬骨素生物活性降低中受益的疾病或障碍或病症。
术语“载体”指能够转运另一核酸的核酸分子，该核酸分子与该另一核酸已经有效连接，该术语包括，但不限于质粒和病毒载体。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中进行自主复制，而其他载体可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导有效连接至其的基因的表达。此处将这种载体称作“重组表达载体”(或简单地“表达载体”)。示例性载体为本领域所熟知。
如此处所用，表述“细胞”、“宿主细胞”和“细胞培养物”可互换使用，并包括各种细胞或细胞培养物，其为本发明任何分离的多核苷酸或包含编码本发明HCVR或LCVR或抗体的核苷酸序列的任何重组载体的受体。宿主细胞包括用一个或更多个重组载体或表达本发明单克隆抗体或其轻链或重链的多核苷酸转化、转导或感染的细胞。
全长抗体的各重链包含N端重链可变区(此处为“HCVR”)和重链恒定区。全长抗体的各轻链包含N端轻链可变区(此处为“LCVR”)和轻链恒定区。可将HCVR和LCVR区进一步再分成高变区，称为互补决定区(“CDR”)，其中散布着称为框架区(“FR”)的更保守区。抗体结合特定抗原或表位的功能性能力很大程度上受抗体可变区中存在的六个CDR的影响。各HCVR和LCVR包含三个CDR(HCVR中的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCVR中的LCDR1、LCDR2和LCDR3)和四个FR，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大多数残基。可变区内的CDR排位遵循Kabat。
轻链分类为κ或λ，并且由本领域已知的特定恒定区表征。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和Ig，并且这些中的几个还可以进一步分成亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。各重链类型的特征在于具有本领域早已知序列的特定恒定区。轻链恒定区κ和重链恒定区IgG1、IgG2、IgG3、IgG4是本发明抗体中的优选恒定区。更优选地，重链恒定区包含具有如SEQ ID NO：39多核苷酸编码的SEQ ID NO：38氨基酸序列的多肽。嵌合抗体可具有非人类来源，优选大鼠或鼠类来源的恒定区。
如此处所用，“抗原结合区”或“抗原结合部分”指抗体分子可变区内的一部分，其含有与抗原相互作用并赋予抗体对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。该抗体部分包括维持抗原结合残基正确构象所必需的框架氨基酸残基。
本发明的优选抗体包含具有SEQ ID NO：20、21、22、23、24和25氨基酸序列的六个CDR。本发明的另一优选抗体包含具有SEQ ID NO：32、33、34、35、36和37氨基酸序列的六个CDR。本发明更优选的抗体包含具有SEQ ID NO：26、27、28、29、30和31氨基酸序列的六个CDR。这些优选抗体的CDR存在于下文表1中说明的位置。CDR根据Kabat位于可变区中。
本发明优选抗体包含具有SEQ ID NO 17、18或19氨基酸序列的LCVR。本发明其他优选的单克隆抗体包含具有SEQ ID NO 14、15或16氨基酸序列的HCVR。更优选地，本发明的抗体包含SEQ ID NO：17的LCVR和SEQ ID NO：14的HCVR。本发明的可选抗体包含SEQ ID NO：19的LCVR和SEQ ID NO：16的HCVR。本发明更优选的抗体包含SEQID NO：18的LCVR和SEQ ID NO：15的HCVR。这种LCVR优选连接轻链恒定区，该轻链恒定区优选为人来源的，优选为κ链的。这种HCVR优选连接重链恒定区，该重链恒定区优选为人来源的，优选为IgG1或IgG4的；最优选连接包含SEQ ID NO：38的重链恒定区。
本发明的一个优选抗体包含具有SEQ ID NO：2的重链多肽和具有SEQ ID NO：5的轻链多肽。具有SEQ ID NO：2的重链多肽可以由，例如SEQ ID NO：8的多核苷酸序列编码，具有SEQ ID NO：5的轻链多肽可以由，例如SEQ ID NO：11的多核苷酸序列编码。
本发明的另一优选抗体包含具有SEQ ID NO：4的重链多肽和具有SEQ ID NO：7的轻链多肽。具有SEQ ID NO：4的重链多肽可以由，例如SEQ ID NO：10的多核苷酸序列编码，具有SEQ ID NO：7的轻链多肽可以由，例如SEQ ID NO：13的多核苷酸序列编码。
本发明的另一优选抗体包含具有SEQ ID NO：3的重链多肽和具有SEQ ID NO：6的轻链多肽。具有SEQ ID NO：3的重链多肽可以由，例如SEQ ID NO：9的多核苷酸序列编码，具有SEQ ID NO：6的轻链多肽可以由，例如SEQ ID NO：12的多核苷酸序列编码。
本发明的优选人源化抗体此处称作86、88和89。在下文表1中列出了它们序列的SEQ ID NO。
表1-蛋白质SEQ ID No
抗体 重链 轻链 HCVR   重链CDR1   重链CDR2   重链CDR3 LCVR   轻链CDR1   轻链CDR2   轻链CDR3
  86   2   5   14   20   21   22   17   23   24   25
  88   3   6   15   26   27   28   18   29   30   31
  89   4   7   16   32   33   34   19   35   36   37
优选地，本发明的抗体进一步特征在于在25℃对人硬骨素具有低于约10pM、8pM、6pM或4pM，更优选低于约2.2pM的KD，在所述抗体中所有六个CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重链、全部轻链，或全部重链和全部轻链受如此处SEQ ID NO所示的特定序列(参见，例如表1)的限制。此外，优选的是这种抗体进一步受限于在25℃对食蟹猴硬骨素具有低于约100pM、90pM或80pM，或更优选低于约75pM的KD。
优选地，本发明的抗体进一步特征在于在使用人硬骨素的骨特异性碱性磷酸酶测定(参见，例如此处的实施例2)中具有约50nM或更低，约40、35或30nM或更低，更优选约25nM，甚至更优选约20nM(例如20.2nM)或更低的IC50，在所述抗体中所有六个CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重链、全部轻链，或全部重链和全部轻链受如此处SEQ ID NO所示的特定序列的限制。
更优选地，本发明的抗体进一步特征在于在25℃对人硬骨素具有低于约10pM、8pM、6pM或4pM，更优选低于约2.2pM的KD，并且进一步特征还在于在使用人硬骨素的骨特异性碱性磷酸酶测定中具有约50nM或更低，约40、35或30nM或更低，更优选约25nM或更低，甚至更优选约20nM(例如20.2nM)或更低的IC50，在所述抗体中所有六个CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重链、全部轻链，或全部重链和全部轻链受如此处SEQ ID NO所示的特定序列的限制。
甚至更优选地，本发明的抗体进一步特征在于在25℃对人硬骨素具有低于约10pM、8pM、6pM或4pM，更优选低于约2.2pM的KD；并且在使用人硬骨素的骨特异性碱性磷酸酶测定中还具有约50nM或更低，约40、35或30nM或更低，更优选约25nM或更低，甚至更优选约20nM(例如20.2nM)或更低的IC50；并且进一步特征还在于在使用食蟹猴硬骨素的骨特异性碱性磷酸酶测定中还具有约75nM或更低的IC50，在所述抗体中所有六个CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重链、全部轻链，或全部重链和全部轻链受如此处SEQ ID NO所示的特定序列的限制。
抗体表达
本发明也涉及表达本发明抗硬骨素抗体的宿主细胞。可使用本领域已知的标准技术来完成产生本发明抗体的宿主细胞系的建系及分离。
本领域已知的多种宿主表达系统可用于表达本发明的抗体，其包括原核(细菌)和真核表达系统(如酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其他动物细胞、转基因动物和杂交瘤细胞)，以及噬菌体展示表达系统。
可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备本发明的抗体。为了重组表达抗体，用一个或更多个携带编码抗体免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段的重组表达载体转化、转导、感染等宿主细胞，使得轻链和/或重链在宿主细胞中表达。重链和轻链可从在一个载体中与其有效连接的不同启动子单独表达，或者，重链和轻链可从在两个载体(一个表达重链，一个表达轻链)中与其有效连接的不同启动子单独表达。任选地，重链和轻链可在不同的宿主细胞中进行表达。
此外，重组表达载体可编码信号肽，其促进抗硬骨素抗体轻链和/或重链从宿主细胞中的分泌。可将抗硬骨素抗体轻链和/或重链基因克隆至载体中，使得信号肽在框内有效连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。优选地，重组抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中，从所述培养基中可以回收或纯化抗体。
通过将编码HCVR的DNA有效连接到编码重链恒定区的另一DNA分子上，可以将编码HCVR区的分离DNA转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列为本领域所知。例如可通过标准的PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、任何种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类恒定区及如Kabat(上文)中描述的其任何同种型变体。优选的重链恒定区包含SEQ ID NO：38的多肽。
通过将编码LCVR的DNA有效连接到编码轻链恒定区的另一DNA分子上，可以将编码LCVR区的分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列为本领域所知。例如可通过标准的PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
用于本发明的优选哺乳动物宿主细胞是CHO细胞(例如，ATCCCRL-9096)、NS0细胞、SP2/0细胞和COS细胞(ATCC例如，CRL-1650、CRL-1651)、HeLa(ATCC CCL-2)。用于本发明的其他宿主细胞包括其他哺乳动物细胞、酵母细胞和原核细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间来产生抗体。可以使用标准的纯化方法从宿主细胞和/或培养基中回收抗体。
一旦表达了，可以根据本领域的标准方法，包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲和、反相、疏水性相互作用柱层析、凝胶电泳等来纯化本发明的完整抗体、各轻链和重链或其他免疫球蛋白形式。优选至少约90％、92％、94％或96％同质性的基本纯的免疫球蛋白，并最优选98到99％或更高同质性的免疫球蛋白用于药物用途。一旦部分纯化或纯化至如期望的同质性，无菌抗体然后就可以在药学上使用，如此处所述。
人源化抗体
优选地，待用于治疗目的的本发明抗体具有来自哺乳动物的框架区和恒定区(在一定程度上其存在于抗体中)序列，在所述哺乳动物中其用作治疗剂，以减少哺乳动物针对治疗性抗体诱发免疫反应的可能性。人源化抗体特别重要，因为它们对治疗应用有价值并降低人抗小鼠抗体反应的可能性，当对人受试者施用时用鼠类来源抗体或包含鼠类来源部分的抗体时经常观察到该人抗小鼠抗体反应。优选注射的人源化抗体比例如鼠类抗体具有更像天然发生的人抗体的半衰期，由此允许待对受试者施用的剂量更少并更不频繁。
如此处所用，术语“人源化抗体”指其中至少一部分为人来源的抗体。例如，人源化抗体可包含来自非人来源(如小鼠)抗体的部分和来自人来源抗体的部分，两者例如通过常规技术(例如合成)化学连接在一起或使用遗传工程技术制备成毗连多肽。
优选地，“人源化抗体”具有起源于或来自亲本抗体(即非人抗体，优选小鼠单克隆抗体)的CDR，而在其存在的程度上框架区和恒定区(或其主要部分或基本部分，即至少约90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)由核酸序列信息编码，所述核酸序列信息出现在人类种系免疫球蛋白区(参见，例如the International ImMunoGeneTics Database)或其重组或突变形式中，无论所述抗体是否在人类细胞中产生。优选地，从人源化抗体来源的非人亲本抗体的CDR优化人源化抗体的至少2、3、4、5或6个CDR，以产生期望的性质，例如改善的特异性、亲和力或中和作用，其可以通过筛选测定，例如ELISA测定来进行鉴定。优选地，本发明抗体中优化的CDR当与亲本抗体中存在的CDR相比时，包含至少一个氨基酸置换。与亲本抗体788和789的那些相比，本发明人源化抗体88和89的CDR中某些氨基酸置换(参见本文的实施例5和6)降低了抗体不稳定性的可能性(例如除去CDR Asn残基)或当对人受试者施用时降低了抗体的免疫原性(例如，由IMMUNOFILTERTM Technology预测的)。
人源化抗体优选含有来自非人抗体的最小序列。人源化抗体可包含既不在受体抗体中发现的残基，也不在从亲本抗体输入的CDR或框架序列中发现的残基。可使用本领域常规使用的方法使人源化抗体进行体外诱变，并因此，人源化重组抗体HCVR和LCVR区的框架区氨基酸序列是这样的序列，其当来自与人类种系HCVR和LCVR序列相关的那些序列时，可以不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分中。预期人源化重组抗体HCVR和LCVR框架区的这种氨基酸序列与人类种系序列至少90％、92％、94％、95％、96％、98％或更优选至少99％或最优选100％相同。
在优选实施方案中，本发明的人源化抗体包含人类种系轻链框架序列(参见，例如PCT WO 2005/005604)和人类种系重链框架序列(参见，例如PCT WO 2005/005604)。优选的人类种系轻链框架区来自人κ轻链基因，其选自A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L6、L8、O12、O2和O8。优选的人类种系重链框架区来自人重链，其选自VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VH1-24、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH1-18、VH1-69、VH3-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59、VH5-51(参见国际公开号WO2006/046935)。
本领域中有可获得的多种方法来产生人源化抗体。例如，可通过获得编码特异性结合硬骨素，优选人硬骨素的亲本抗体(例如，鼠类抗体或由杂交瘤产生的抗体)HCVR和LCVR的核酸序列、在所述HCVR和LCVR(非人类)中鉴定CDR并将此类CDR编码核酸序列移植到所选的人框架编码核酸序列上来产生人源化抗体。任选地，可通过随机诱变或在特定位置诱变来优化CDR区，以在将CDR区移植到框架区中之前用不同的氨基酸置换CDR中的一个或更多个氨基酸。或者，可使用本领域技术人员可获得的方法在将CDR区插入人框架区后对其进行优化。
在CDR编码序列移植到所选人框架编码序列上之后，然后表达编码人源化可变重链和可变轻链序列的所得DNA序列，以产生结合硬骨素的人源化抗体。可将人源化HCVR和LCVR表达为整个抗硬骨素抗体分子的部分，即表达为与人恒定域序列的融合蛋白。然而，HCVR和LCVR序列也可在不存在恒定序列的情况下进行表达，以产生人源化抗硬骨素Fv。
进一步描述参与人源化可使用小鼠抗体的方法的文献包括，例如Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321：522(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534(1988)]。
诊断用途
本发明抗体可用于诊断与人硬骨素的表达相关的障碍或疾病。以类似的方式，本发明抗体可用于在接受硬骨素相关病症治疗的受试者中监测硬骨素水平的测定。这种应用包括使用本发明抗体和标记检测生物样品，例如人体液或细胞或组织提取物中的硬骨素的方法(参见，例如本文中的实施例1)。本发明抗体可以在修饰或不修饰的情况下使用，并可通过可检测部分的共价或非共价连接来进行标记。
用于测定生物样品中硬骨素水平的多种常规方案，包括例如ELISA、RIA和FACS为本领域所知并为诊断硬骨素表达的改变或异常水平提供了基础。使用任何已知技术，例如通过在适合于形成抗原：抗体复合体的情况下组合包含硬骨素多肽的样品与例如本发明抗体来确定样品中存在的正常或标准硬骨素水平。抗体用可检测物质直接或间接标记，以利于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。通过多种方法，例如光量法定量所形成的标准复合体的量。样品中存在的硬骨素多肽的量然后与标准值进行比较。
治疗用途
硬骨素作为骨形成的负调节物起作用。(参见，例如Cytokine&Growth Factor Reviews，16：319-327，2005)。在成人中，首先在骨细胞中检测到了硬骨素mRNA，尽管申请人已经在软骨中发现了较低浓度的硬骨素mRNA。
当对需要其的人类受试者施用有效量时，包含本发明抗硬骨素单克隆抗体的药物组合物可用于提高椎骨(vertebral bone)或无椎骨(non-vertebral bone)或两者中骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中的至少一种。当对需要其的人类受试者施用有效量时，包含本发明抗硬骨素单克隆抗体的药物组合物可用于降低椎骨和/或无椎骨骨折的发生率。降低骨折发生率包括相对于未处理对照人群，降低人类受试者骨折的可能性或实际发生率。
此外，本发明抗体可用于治疗病症、疾病或障碍，其中硬骨素的存在引起或促进不期望的病理学效应，或者硬骨素水平或硬骨素生物活性的降低在人类受试者中具有治疗益处。这种病症、疾病或障碍包括，但不限于骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛、牙周病或多发性骨髓瘤。受试者可以是男性或女性。优选地，人类受试者处于椎骨和/或无椎骨骨折的风险中，更优选地人类受试者处于骨质疏松的风险中或患有骨质疏松症。人类受试者优选为女性，并更优选为处于闭经后骨质疏松风险或患有闭经后骨质疏松的女性。预期本发明的方法可对骨质疏松症任何阶段的受试者有益。
此外，预期了本发明抗体在制备用于治疗至少一种上述障碍的药物中的用途。
术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”旨在指其中减缓、中断、阻止、控制或中止此处所述障碍进程的所有过程，但并不必定表示所有障碍症状的全部消除。如此处所用，“治疗”包括施用本发明化合物用于在哺乳动物，优选在人中治疗疾病或病症，并包括：(a)抑制疾病的进一步进展，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病或障碍的减退或减缓其症状或并发症。可调整给药方案，以提供最佳的预期反应(例如，治疗反应)。例如，可以快速浓注施用，可以随时间过去施用若干单独剂量或根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。
药物组合物
本发明抗体可掺入适合于对人类受试者施用的药物组合物中。可单独或与可药用载体和/或稀释剂以单剂量或多剂量对人类受试者施用本发明抗体。设计这种药物组合物，以适合于所选的施用方式，并且使用适当的可药用稀释剂、载体和/或赋形剂，如分散剂、缓冲液、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。可根据在例如提供执业医生通常已知的配方技术纲要的Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995中公开的常规技术来设计这种组合物。用于药物组合物的合适载体包括任何材料，当其与本发明单克隆抗体组合时保留了分子活性并不与受试者免疫系统反应。
使用标准施用技术，对受试者施用包含本发明抗硬骨素单克隆抗体的药物组合物，所述受试者处于如此处描述的病理学或显示病理学，例如骨质疏松症、骨关节炎或其他骨退化障碍。
本发明的药物组合物优选含有“有效量”的本发明抗体。有效量指达到期望治疗结果所必需(对剂量、时间段和施用方式而言)的量。有效量的抗体可根据如疾病状态、年龄、性别和个体体重及抗体或抗体部分在个体中诱发期望反应的能力这些因素而变化。有效量也是其中抗体的治疗有益作用胜于其任何毒性或有害作用的量。
有效量是向受试者传递治疗益处所必需的活性剂的至少最小剂量，但比中毒剂量少。用另一种方式叙述，本发明抗体的有效量或治疗有效量是这样的量，其在哺乳动物，优选人中，(i)增加至少一种骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度，或(ii)治疗病症、障碍或疾病，其中硬骨素的存在引起或促进不期望的病理学效应，或(iii)硬骨素水平或硬骨素生物活性的降低导致哺乳动物，优选人中有益的治疗效果，该病症、障碍或疾病包括但不限于骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤。
如医学领域所熟知，任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括患者大小、人体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。剂量还根据疾病的类型和严重性而变化。典型剂量可以是，例如在0.001到1000μg；优选1到100μg范围内；然而，也考虑低于或高于这个示例性范围的剂量，尤其考虑到上述因素。每日肠胃外给药方案可以是约0.1μg/kg到约20mg/kg总体重，优选从约0.3μg/kg到约10mg/kg。可通过周期评估监测进程并相应地调整剂量。
这些建议的抗体量经过大量治疗判定。选择适当剂量和安排中的关键因素是所获得的结果。在该情况下考虑的因素包括治疗的特定障碍、各患者的临床状况、障碍原因、抗体递送的位点、抗体的特定类型、施用方法、施用安排和医生已知的其他因素。
本发明抗体的施用途径可以是口服、肠胃外、吸入或局部给药。优选地，本发明抗体可掺入适合于肠胃外施用的药物组合物中。如此处所用，术语肠胃外包括静脉施用、肌内施用、皮下施用、直肠施用、阴道施用或腹膜内施用。优选通过静脉或腹膜内或皮下注射的肠胃外递送。最优选皮下注射。用于这种注射的合适载体为本领域所熟知。
在制备和储存条件下，药物组合物在所提供的容器(包括，例如密封瓶、注射器或其他递送装置，例如pen)内通常必须无菌并且稳定。因而，在做成制剂后药物组合物必须是无菌滤过的，或就制成微生物学上可接受的。
提供以下实施例仅为说明性目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1ELISA测定
使用该测定在人血清样品中检测并定量硬骨素至0.4ng/ml的更低检测极限。抗体86为捕获抗体，而抗体88为检测抗体(抗体序列见表1)。
96孔板的内孔用100μl浓度为0.5μg/mL在pH为9.6的0.5M碳酸钠(“包被缓冲液”)中的全长抗硬骨素单克隆抗体86包被。将平板密封并在4℃温育过夜。随后将平板用TBST“洗涤缓冲液”(0.4M Tris-HCl、3M NaCl、0.1％Tween 20)洗涤三次。随后向每孔加入200μL PBS(Pierce，#37528)中的酪蛋白封闭缓冲液并将平板在室温下温育一小时。然后用洗涤缓冲液洗涤平板两次以除去封闭液。
为了生成标准曲线，在酪蛋白封闭缓冲液中制备浓度为0.35mg/mL的人硬骨素并在PBS中的酪蛋白封闭缓冲液中的5％混合人血清中连续稀释两倍(从1.25ng/ml至0ng/ml)。将人血清在用抗硬骨素单克隆抗体86包被的磁力珠的柱子上通过，以去除可能已内源存在于血清中的任何硬骨素。
将一百微升样品(酪蛋白封闭缓冲液中的5％的血清)或标准品一式两份加入孔中并进一步将平板在室温温育两小时。随后用洗涤缓冲液洗涤孔5次。
每孔加入一百微升已用Pierce EZ接合NHS-LC生物素试剂盒生物素化的检测抗体(全长抗硬骨素单克隆抗体88)。将平板在室温温育一小时并随后用洗涤缓冲液洗涤四次。链霉抗生素蛋白-辣根过氧化物酶用PBS中的酪蛋白封闭缓冲液按1∶2000稀释至终浓度为0.5μg/ml，随后每孔加入100μL，在室温温育一小时并随后用洗涤缓冲液洗涤7次。将OPD底物(Sigma P8806)按100μL/孔加入并允许反应在室温继续进行20分钟。随后通过加入100μL/孔1N HCl来终止反应。在OD 490nm处对平板读数。
实施例2中和-骨特异性碱性磷酸酶测定
骨特异性碱性磷酸酶是成骨细胞活性的生化指标。此处描述的骨特异性碱性磷酸酶测定基于硬骨素在多潜能鼠类细胞系C2C12中降低BMP-4和Wnt3a刺激的碱性磷酸酶水平的能力，而中和硬骨素活性的抗体将导致该测定中碱性磷酸酶活性的剂量依赖性增加。Wnt3a和BMP-4是成骨生长因子。
将C2C12细胞(ATCC，CRL 1772)按每孔3000-5000个细胞置于96孔组织培养板的添加有5％胎牛血清的MEM培养基中，随后在37℃下5％的CO2中温育过夜。待检测抗体用0.5X Wnt3a条件培养基稀释至不同终浓度。随后将培养基从组织培养板上的细胞中除去并加入每孔150μl预先混合的抗体BMP4-硬骨素溶液(人或食蟹猴)，其中抗体终浓度为30μg/ml至0.5μg/ml，BMP-4终浓度为25ng/ml且硬骨素蛋白质终浓度为1.0μg/ml且条件培养基为0.5X浓度。随后将平板在37℃下5％CO2中温育72小时。将培养基从组织培养板上的细胞中去除，用PBS洗涤细胞一次，随后将细胞板在-80℃和37℃间交替冻融三次。
通过在含10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中从1∶20份的融合细胞中培养L-Wnt-3A细胞和对照L细胞(分别为ATCC CRL-2647和CRL-2648)四天来制备Wnt3a条件培养基。所收集的培养基经0.2微米尼龙膜过滤并在-20℃长期贮存或4℃短期贮存。
通过每孔加入150μl碱性磷酸酶底物(1步PNPP，Pierce#37621)来测定碱性磷酸酶活性。随后将细胞板在室温温育60分钟，此时读取405nm处的OD值以测定碱性磷酸酶活性。下文表2中报道的抗体中和IC50值为来自两次独立实验的平均值。使用带有Sigmoid 4参数拟合方程的SigmaPlot Regression Wizard进行IC50计算。
表2
抗体   IC50(nM)使用人硬骨素   IC50(nM)使用食蟹猴硬骨素
  89   25.1   34.4
  88   20.2   23.7
  86   25.5   31.6
实施例3亲和结合
在KD受控条件下在KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments Inc.)上进行抗硬骨素抗体与人、食蟹猴(“cyno”)或大鼠硬骨素之间的平衡结合研究。通过该技术，低于其KD的固定浓度的抗体与多个浓度的硬骨素蛋白质混合并允许达到平衡。通过短暂地将该平衡后混合物暴露于硬骨素包被的珠子并接着用荧光标记的二级抗体检测来探测溶液中残留的游离未结合的抗体部分。通常将2pM待检测的抗硬骨素抗体与起始为2-50nM的不同浓度的并在含2pM待检测抗体的结合缓冲液(1X磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4、0.02％叠氮化钠和1mg/mL牛血清白蛋白)中进行三倍连续稀释的人、食蟹猴或大鼠硬骨素混合。允许这些溶液在25℃下以两天达到平衡。使用人硬骨素包被的azlactone珠(Sapidyne Instruments Inc.)探测未结合抗体的量。通过将50mg干azlactone珠与pH值为9.0-9.6的50mM碳酸钠缓冲液中的50mcg/ml人硬骨素过夜旋转进行反应来制备这些珠子。随后将珠子沉降下来并用封闭溶液(1M Tris，pH 8.0、加10mg/mL牛血清白蛋白)替换上清液并旋转一小时。用结合缓冲液将该珠子储存液稀释20倍并在三天内使用。在室温(ca 25℃)平衡的KinExA 3000仪器用于结合研究。通常6.25mL平衡后抗体/硬骨素溶液以0.25mL/分钟的流速拖拽过(brew over)装载有人硬骨素-azlactone珠的柱子，随后用流动缓冲液(running buffer)(含有0.02％叠氮化钠的1X磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)冲洗。通过测定从注入标记二级抗体(Cy5标记的山羊抗人Fab’2抗体)产生的荧光来定量结合到这些珠子上的游离抗硬骨素抗体部分。每一条件下分析两次重复样品并通过使用KinExA Pro软件拟合数据为1:1结合模型来测定KD。25℃下的KD平均值报道于下文表3中。
表3-亲和力
抗体   人硬骨素KD(pM)   大鼠硬骨素KD(pM)   Cyno硬骨素KD(pM)
  89   0.3   0.4   1.4
  88   2.2   2.2   75
  86   0.6   0.1   1.0
实施例4体内钙荧光素测定
大鼠钙荧光素测定允许在短期(10天)内直接评估骨形成及本发明的抗体在骨形成上的作用。钙荧光素是在新骨形成过程中整合到骨基质中的荧光染料标记。钙荧光素的定量测定反映了由药剂诱导的骨形成的程度。使用六月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(n＝6/剂量组)。每3天通过皮下注射(0天、3天和6天)PBS媒介中的1mg/kg或6mg/kg抗体对大鼠进行施用，或每日施用10μg/kg PTH或6mg/kg人IgG作为阴性对照。在第7天通过皮下注射钙荧光素并在第10天杀死大鼠。收集胫骨并进行切割以评估骨小梁形成(远侧干骺端)或皮质骨形成(胫骨骨干)并进行脱矿质及总钙荧光素的荧光染料定量。下文表4中显示的值是人IgG对照组设置为1.0时的平均值。数据显示本发明抗体的施用导致小梁和皮质骨形成。
表4
抗体   剂量mg/kg 相对小梁钙荧光素 相对皮质钙荧光素
  Hu IgG   6   1.00   1.00
  PTH   .01   1.45   1.89
  89   6   1.97   1.88
  88   6   1.90   2.18
  86   6   1.77   2.78
实施例5骨关节炎
SOST表达主要局限于骨组织。然而，在本文中申请人通过实时PCR测定确定另一具有显著SOST表达的组织是软骨。使用从正常或骨关节炎患者的软骨分离的RNA阵列也观察到SOST的软骨表达。此外，在阵列中，SOST的表达相对于骨关节炎的严重性升高，使得来自轻度骨关节炎的软骨中的表达强于对照中的表达，严重骨关节炎的软骨中的表达强于轻度骨关节炎的软骨中的表达，并且严重外科(从全膝关节置换术(kneereplacement surgery)中移除的)中的表达强于显示骨关节炎和SOST表达相关性的所有其他类型中表达。对硬骨素特异的抗体可用于治疗骨关节炎。
检测在大鼠Fc区具有鼠类可变区的抗硬骨素嵌合抗体、具有重链序列为SEQ ID NO：42和轻链序列为SEQ ID NO：43的抗体789在骨关节炎的MIA模型中封闭关节痛的能力。该抗体的可变区是用于产生人源化抗体89(具有SEQ ID NO：16的HCVR和具有SEQ ID NO：19的LCVR)的亲本序列。人源化抗体89和嵌合抗体789两者均结合同一表位。该骨关节炎模型利用直接将一碘乙酸盐(monoiodoacetate，MIA)注射入膝关节来诱导涉及炎症和细胞因子介导的疼痛和软骨损坏过程的OA样过程。仅用盐水注射大鼠的对侧膝，并将疼痛测定为2个后足承重上的差异。
MIA实验#1在“预防模式”中利用幼小的雄性Lewis大鼠(7-8周龄)，其中在MIA注射前施用抗硬骨素抗体。在MIA注射前一天，用10mg/kg抗硬骨素抗体、或10mg/kg对照IgG、或PBS(每组n＝6)向大鼠腹腔注射。第二天，将大鼠麻醉并用0.3mg溶解于50ul 0.9％无菌盐水的碘乙酸单钠注射右膝。单独用盐水注射左膝。使用包裹有塑料管套的带28G针头的胰岛素注射器经髌韧带进行注射，以允许仅5mm的穿刺进入膝关节。
在MIA注射后2天和7天进行疼痛测定(在抗体注射后的3天和8天)。在第7天进行疼痛测定后，施用第二剂量的抗体或对照注射。随后在MIA之后10天和14天进行额外的疼痛测定(在抗体第二次注射后的3天和7天)。
通过使用智能麻醉剂(incapacitance)检测器由注射后的腿的承重差异来测量疼痛。将大鼠放置到Perspex盒内并将其后爪放在压力感受器上。当大鼠保持不动时，进行1秒读数，随后进行两次额外读数并计算平均值。来自盐水注射的腿上的重量减去置于MIA注射腿上的重量，以获得承重的差异。
在MIA施用后第7天、第10天和第14天用抗硬骨素抗体与IgG(和PBS)对照相比，可见疼痛统计学显著降低(下文表5)。数值为以克计的MIA注射腿和盐水注射腿间的承重差异(平均值的标准误差)。
第二次MIA实验用年龄更大的大鼠(27周龄)并在“治疗模式”中进行，其中在MIA注射后施用抗体。如之前大鼠接受MIA或对照盐水注射，并随后在6天后腹腔注射10mg/kg抗硬骨素抗体、对照IgG、或PBS(每组n＝6)。在MIA之后第8天和第15天(抗体后2天和9天)如之前进行疼痛测定。在MIA之后第16天，施用第二次剂量的抗硬骨素抗体和对照，并在第21天(第二次抗体剂量之后5天)再次收集疼痛测定。
在施用抗硬骨素抗体(MIA后第8天)后的早期时间点上，抗体对疼痛没有效果，但在7天后，如通过以克计的MIA注射腿和盐水注射腿之间的承重差异测定，则存在趋于疼痛降低的趋势。在第二次抗体施用后5天也可以见到抗硬骨素抗体趋于减轻疼痛的趋势。在第15天和第21天嵌合抗体789与IgG对照分别具有p值为0.06和0.08的差异。综上，这些结果显示通过施用中和抗硬骨素抗体可以阻断由确定的MIA疾病导致的关节痛。
实施例6OVX大鼠研究
卵巢切除(OVX)的大鼠是用于绝经后骨质疏松症的极好公认模型。在本研究中，在OVX大鼠中检查包含鼠类可变区和大鼠Fc的本发明抗硬骨素抗体的效果。
将六月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠切除卵巢并在施用前允许骨损失1个月。一组大鼠(n＝8)未切除卵巢但进行模拟手术用于与卵巢切除的大鼠进行骨比较。将所有OVX大鼠随机分入治疗组(每组n＝7)并用PTH(1-38)、IgG对照(10mg/kg)或10mg/kg嵌合抗硬骨素抗体(具有SEQ ID NO：40重链和SEQ ID NO：41轻链的抗体788[该抗体的可变区为用于产生人源化抗体88的亲本序列]；具有SEQ ID NO：42重链和SEQID NO：43轻链的抗体789)处理共计58天。抗体均每3天一次经皮下施用，但PTH(1-38)按10mg/kg的剂量每日经皮下施用。处死后，取出股骨和椎骨用于定量计算机化断层显像(CT)分析，该分析使用CT扫描仪来检测股骨远端(骨小梁)和中段(骨皮质)以及第5节腰椎。骨定位于在塑型粘土上用于重现性测量并且从骺末端(股骨远端)2mm或骺(中段股骨干)10mm处进行股骨的扫描。
在脊骨中用L-5从标志物“V”结构扫描完成脊骨测定。通过产品软件包SYS-C320-V 1.5计算数据。在尸体剖检后参照：Turner CH，Burr DB，Basic biomechanical measurements of bone：a tutorial.Bone 14(4)：595-608，1993测量股骨骨干、L-5椎骨和股骨颈的生物机械特性。使用具有在分隔15mm的两个支撑物间的中间位置上的负荷的3点屈法(3-pointbending)，测量完整左股骨干段中的机械特性。将股骨定位，使得负荷点在距末端腘窝约7.5mm附近并且弯曲大约发生在内外侧轴上。在37℃盐水浴中检测样本。使用材料试验机(模型：1/S，MTS Corp，Minneapolis，MN)以10mm/分钟的十字头速度记录并使用TestWorks 4软件(MTSCorp.)分析负荷置换曲线以计算最大负荷。在去除后面过程并且使用钻石薄片锯(Buehler Isomet，Evanston，IL)将椎体末端制作平行后分析L-5椎骨的机械特性。椎骨样本以压缩形式装载，使用材料试验设备并使用TestWorks 4软件(MTS Corp.)分析。对于股骨颈测量，将股骨近极面向上垂直定位于装片卡盘中并且将负荷在股骨头中点向下应用。使用TestWorks 4软件(MTS Corp.)进行分析。平均值和平均值的标准误差在下文表5和表6中。数据显示嵌合抗体788和789在OVX大鼠中增加骨矿物质密度(“BMD”)、骨矿物质含量(“BMC”)和骨强度(最大负荷)。
表5
处理   股骨远端BMD(mg/cm3)   股骨远端BMC(mg)   股骨中段(mg/cm3)   股骨中段BMC(mg)   脊骨BMD(mg/cm3)   脊骨BMC(mg)
  Sham   ＊602   74.1   898   61.2   ＊587   165
  IgG   528   68.6   852   60.5   526   149
  PTH   ＊744   ＊95.3   ＊925   63.2   ＊642   ＊180
  788   ＊675   ＊91.4   ＊946   ＊68.6   ＊703   ＊209
  789   ＊710   ＊94.9   ＊951   ＊68.4   ＊721   ＊209
＊与IgG对照相比统计学显著增加，p＜0.05，Dunnett’s方法。
表6
处理   股颈最大负荷(Newtons)   中间股骨最大负荷(Newtons)   脊骨最大负荷(Newtons)
  Sham   96.5   134   236
  IgG   100.4   126   188
  PTH   117.6   128   ＊328
  2492788   ＊131.6   ＊147   ＊431
  2492789   ＊147.5   ＊153   ＊432
＊与IgG对照相比统计学显著增加，p＜0.05，Dunnett’s方法。
序列表
<110>伊莱利利公司
<120>抗硬骨素抗体
<130>X17563
<150>US 60/895813
<151>2007-03-20
<160>43
<170>PatentIn版本3.4
<210>1
<211>213
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Met Gln Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Val Cys Leu Leu Val His Thr
1               5                   10                  15
Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp
            20                  25                  30
Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg
    50                  55                  60
Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys
65                  70                  75                  80
Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser
                85                  90                  95
Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala
            100                 105                 110
Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser
        115                 120                 125
Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val
    130                 135                 140
Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg
145                 150                 155                 160
Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln
                165                 170                 175
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu
        195                 200                 205
Leu Glu Asn Ala Tyr
    210
<210>2
<211>444
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Thr Ile Tyr Pro Tyr His Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Glu Glu Asp Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
        435                 440
<210>3
<211>444
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Pro Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Phe Gln His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ser Asp Pro Glu Ile Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Gly Asp Thr Thr Tyr Lys Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
        435                 440
<210>4
<211>450
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Asp Phe Glu Ile Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gln Ile Asp Ala Glu Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
        115                 120                 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
    130                 135                 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145                 150                 155                 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
                165                 170                 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
            180                 185                 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
        195                 200                 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
    210                 215                 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        275                 280                 285
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    290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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                325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
        355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
                405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
            420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Leu Gly
    450
<210>5
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Gln Trp Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Lys Leu Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>6
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val His Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Trp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>7
<211>213
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ser Thr Ser Glu Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ser His Leu Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
            180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>8
<211>1332
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>8
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt     60
tcctgcaagg catctggata cacattcact gactactttc tgaactgggt gcgacaggcc    120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaact atttatcctt accatgatgg tactacctac    180
tctcagaagt tcaagggcag agtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac    240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggaa    300
gaggatggtc agttcgacta ctggggccaa ggaaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc    360
accaagggcc catcggtctt cccgctagcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca    420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac    480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc    540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc    600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat    660
ggtcccccat gcccaccctg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg    720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg    780
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg    840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg    900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag    960
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag   1020
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag   1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa   1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc   1200
tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc   1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc   1320
ctgtctctgg gt                                                       1332
<210>9
<211>1332
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>9
caggttcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc     60
tcctgcaagg tttccggctt ccccattaag gacacctttc agcactgggt gcgacaggct    120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggatgg agcgatcctg agatcggtga tactgaatat    180
gcctcgaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac    240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacaggcgac    300
accacataca agtttgactt ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc    360
accaagggcc catcggtctt cccgctagcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca    420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac    480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc    540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc    600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat    660
ggtcccccat gcccaccctg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg    720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg    780
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg    840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg    900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag    960
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag   1020
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag   1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa   1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc   1200
tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc   1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc   1320
ctgtctctgg gt                                                       1332
<210>10
<211>1350
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>10
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc     60
tcctgtaagg gttctgactt cgagattaaa gactactata tacattgggt gcgccagatg    120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggcag attgatgctg aggatggtga aactgaatat    180
gccccgaggt tccagggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac    240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagagagggt    300
tattactacg atgggcgcga ctactggtac ttcgatgtct ggggccaagg gaccacggtc    360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc cgctagcgcc ctgctccagg    420
agcacctccg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg    480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc    540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg    600
ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag    660
agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccctgcc cagcacctga gttcctgggg    720
ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc    780
cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac    840
tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc    900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc    960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc   1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag   1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac   1140
atcgccgtgg agtgggaaag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc   1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg   1260
tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac   1320
acacagaaga gcctctccct gtctctgggt                                    1350
<210>11
<211>642
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous  construct
<400>11
gacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgca gtgcaagtca gggcattcag tggtatttaa actggtatca gcagaaacca    120
gggaaagccc ctaagctcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg ggtcccatca    180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct    240
gaagattttg caacttacta ctgtcagcag catagtaaac ttcctcggac gttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca    360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat    420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag    480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg    540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc    600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc                       642
<210>12
<211>642
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>12
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgcac actgctgtag cctggtatca gcagaaacca    120
gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccaccc ggtggactgg agtcccatca    180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct    240
gaagattttg caacttacta ctgtcagcaa tatagcgatt atccgtggac gttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca    360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat    420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag    480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg    540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc    600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc                       642
<210>13
<211>639
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>13
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatccact ggtaccaaca gaaacctggc    120
caggctccca ggctcctcat ctatagcaca tccgagctgg cttctggcat cccagccagg    180
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa    240
gattttgcag tttattactg tcagcagctt agtcatctcc cgctcacgtt cggcggaggg    300
accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct    360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc    420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag    480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg    540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg    600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgc                           639
<210>14
<211>118
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Thr Ile Tyr Pro Tyr His Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Glu Glu Asp Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>15
<211>118
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Pro Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Phe Gln His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ser Asp Pro Glu Ile Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Gly Asp Thr Thr Tyr Lys Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>16
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Asp Phe Glu Ile Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gln Ile Asp Ala Glu Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>17
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Gln Trp Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Lys Leu Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>18
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val His Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Trp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>19
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ser Thr Ser Glu Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ser His Leu Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>20
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Phe Leu Asn
1               5                   10
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>21
Thr Ile Tyr Pro Tyr His Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>22
Glu Glu Glu Asp Gly Gln Phe Asp Tyr
1               5
<210>23
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>23
Ser Ala Ser Gln Gly Ile Gln Trp Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>24
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
1               5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>25
Gln Gln His Ser Lys Leu Pro Arg Thr
1               5
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>26
Gly Phe Pro Ile Lys Asp Thr Phe Gln His
1               5                   10
<210>27
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>27
Trp Ser Asp Pro Glu Ile Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>28
Gly Asp Thr Thr Tyr Lys Phe Asp Phe
1               5
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>29
Lys Ala Ser Gln Asp Val His Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>30
Trp Ala Ser Thr Arg Trp Thr
1               5
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>31
Gln Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Trp Thr
1               5
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>32
Asp Phe Glu Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His
1               5                   10
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>33
Gln Ile Asp Ala Glu Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>34
Gln Ile Asp Ala Glu Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>35
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>35
Gln Ile Asp Ala Glu Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>36
Ser Thr Ser Glu Leu Ala Ser
1               5
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>37
Gln Gln Leu Ser His Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>38
<211>322
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>38
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
1               5                   10                  15
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
        35                  40                  45
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
    50                  55                  60
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
65                  70                  75                  80
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
                85                  90                  95
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
            100                 105                 110
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
        115                 120                 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
    130                 135                 140
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
145                 150                 155                 160
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
                 165                 170                 175
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
            180                 185                 190
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
        195                 200                 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
    210                 215                 220
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
225                 230                 235                 240
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
                245                 250                 255
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
            260                 265                 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
        275                 280                 285
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
    290                 295                 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
305                 310                 315                 320
Leu Gly
<210>39
<211>970
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>39
ggcccatcgg tcttcccgct agcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc     60
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc    120
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc    180
gctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa    240
cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc    300
cccatgccca ccctgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc    360
cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt    420
ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt    480
gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag    540
cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc    600
caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg    660
agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag    720
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaagcaa    780
tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt    840
cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc    900
atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc    960
tctgggttga                                                           970
<210>40
<211>444
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>40
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Ser Thr
            20                  25                  30
Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Thr Gly Glu Ser Asn Tyr Asp Phe Asp Phe Trp Gly Leu Gly Thr
        100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
    115                 120                 125
Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
            180                 185                 190
Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
        195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys
    210                 215                 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
                245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe
            260                 265                 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro
        275                 280                 285
Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
    290                 295                 300
Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro
                325                 330                 335
Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys
            340                 345                 350
Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly
        355                 360                 365
Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro
    370                 375                 380
Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln
                405                 410                 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
            420                 425                 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
        435                 440
<210>41
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>41
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly
        115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile
    130                 135                 140
Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Ser Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr
            180                 185                 190
Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
    210
<210>42
<211>450
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>42
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu His Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Asp Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Thr Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp Ser Arg Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn
    130                 135                 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145                 150                 155                 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr
                165                 170                 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
    210                 215                 220
Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile
                245                 250                 255
Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His
        275                 280                 285
Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
    290                 295                 300
Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg
305                 310                 315                 320
Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile
        355                 360                 365
Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp
    370                 375                 380
Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr
385                 390                 395                 400
Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys
                405                 410                 415
Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His
            420                 425                 430
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>43
<211>213
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Miscellaneous construct
<400>43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
            20                  25                  30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly Gly
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Ser
    130                 135                 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly Val Leu Asp
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Ser Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr Thr
            180                 185                 190
Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Asn Glu Cys
    210

Claims (17)

1.特异性结合人硬骨素并包含具有选自以下氨基酸序列的六个CDR的抗体：
i)具有SEQ ID NO：20的HCDR1、具有SEQ ID NO：21的HCDR2、具有SEQ ID NO：22的HCDR3、具有SEQ ID NO：23的LCDR1、具有SEQ ID NO：24的LCDR2和具有SEQ ID NO：25的LCDR3；
ii)具有SEQ ID NO：26的HCDR1、具有SEQ ID NO：27的HCDR2、具有SEQ ID NO：28的HCDR3、具有SEQ ID NO：29的LCDR1、具有SEQ ID NO：30的LCDR2和具有SEQ ID NO：31的LCDR3；和
iii)具有SEQ ID NO：32的HCDR1、具有SEQ ID NO：33的HCDR2、具有SEQ ID NO：34的HCDR3、具有SEQ ID NO：35的LCDR1、具有SEQ ID NO：36的LCDR2和具有SEQ ID NO：37的LCDR3；
其中所述抗体的特征在于具有以下中的至少一种：
i)在25℃对人硬骨素具有10pM或更低的KD；
ii)在25℃对食蟹猴硬骨素具有100pM或更低的KD；或
iii)在使用人硬骨素的骨特异性碱性磷酸酶测定中具有50nM或更低的IC50。
2.特异性结合人硬骨素并包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，
i)所述重链可变区具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列；
ii)所述重链可变区具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列；或
iii)所述重链可变区具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
3.特异性结合人硬骨素并包含重链多肽和轻链多肽的抗体，其中
i)所述重链多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且所述轻链多肽具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
ii)所述重链多肽具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述轻链多肽具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或
iii)所述重链多肽具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，并且所述轻链多肽具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
4.特异性结合人硬骨素并包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链多肽的抗体。
5.权利要求2-4中任一项的抗体，其中所述抗体在25℃对人硬骨素具有10pM或更低的KD。
6.权利要求2-4中任一项的抗体，其中所述抗体在25℃对人硬骨素具有2.2pM或更低的KD。
7.权利要求2-6中任一项的抗体，其中所述抗体在使用人硬骨素的骨特异性碱性磷酸酶测定中具有50nM或更低的IC50。
8.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体包含选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定区的重链恒定区，和具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的多肽。
9.权利要求1-8中任一项的抗体在制备药物中的用途。
10.权利要求1-8中任一项的抗体在增加人类受试者中骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中的至少一种的方法中的用途。
11.权利要求1-8中任一项的抗体在用于制备用于增加人类受试者中骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中的至少一种的药物中的用途。
12.权利要求1-8中任一项的抗体在用于制备用于治疗人类受试者中选自骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病或障碍的药物中的用途。
13.在需要其的人类受试者中增加骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中的至少一种的方法，其包括对人类受试者施用有效量的权利要求1-8中任一项的抗体。
14.在需要其的人类受试者中治疗选自骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病或障碍的方法，其包括对人类受试者施用有效量的权利要求1-8中任一项的抗体。
15.在需要其的人类受试者中治疗骨质疏松症的方法，其包括对人类受试者施用有效量的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO：3的重链多肽和具有SEQ ID NO：6的轻链多肽。
16.包含权利要求1-8中任一项的抗体和可药用载体或稀释剂的药物组合物。
17.用于检测生物样品中硬骨素蛋白质的方法，其包括在足以允许抗体结合硬骨素蛋白质的条件和充足时间下，将选自以下的所述抗体与生物样品温育，并检测所述结合：
i)包含具有SEQ ID NO：40的重链多肽和具有SEQ ID NO：41的轻链多肽的抗体；和
ii)包含具有SEQ ID NO：42的重链多肽和具有SEQ ID NO：43的轻链多肽的抗体；
iii)包含具有SEQ ID NO：2的重链多肽和具有SEQ ID NO：5的轻链多肽的抗体；
iv)包含具有SEQ ID NO：3的重链多肽和具有SEQ ID NO：6的轻链多肽的抗体；和
v)包含具有SEQ ID NO：4的重链多肽和具有SEQ ID NO：7的轻链多肽的抗体。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016145961A1 (zh) * 2015-03-13 2016-09-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN107126560A (zh) * 2011-12-28 2017-09-05 安进公司 通过使用抗骨硬化蛋白抗体治疗牙槽骨流失的方法
WO2019020069A1 (zh) * 2017-07-27 2019-01-31 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种sost抗体药物组合物及其用途
CN109890845A (zh) * 2016-10-28 2019-06-14 伊莱利利公司 抗rankl抗体及其用途
CN110325548A (zh) * 2016-12-21 2019-10-11 美莱奥生物制药第三有限公司 抗硬化蛋白抗体在治疗成骨不全症中的用途
CN113784987A (zh) * 2019-01-22 2021-12-10 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101469329B (zh) 1998-11-27 2012-10-24 达尔文发现有限公司 增加骨矿化的组合物和方法
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
EA015166B1 (ru) 2003-06-16 2011-06-30 Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк. Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
BRPI0809026A2 (pt) * 2007-03-20 2014-09-23 Lilly Co Eli Anticorpos antiesclerotina
CL2008002775A1 (es) * 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
US20110044978A1 (en) * 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture
AR070141A1 (es) * 2008-01-23 2010-03-17 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticuerpos humanizados especificos para el factor von willebrand
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
RU2012147249A (ru) 2010-04-07 2014-05-20 Эббви Инк. TNF-α- СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ
AU2011239935A1 (en) 2010-04-16 2012-11-08 Novartis Ag Methods and compositions for improving implant osseointegration
BR112012028920B1 (pt) 2010-05-14 2021-03-23 Amgen Inc. Formulações líquidas estéreis de anticorpo de alta concentração e método para reduzir a viscosidade de uma formulação de proteína
US8834883B2 (en) 2010-06-14 2014-09-16 Vaccinex, Inc. Anti-VEGF antibodies and uses thereof
EP3757126A1 (en) 2010-11-05 2020-12-30 Novartis AG Methods of treating psoriatic arthritis using il-17 antagonists
JP5319651B2 (ja) * 2010-11-18 2013-10-16 日本電信電話株式会社 分析方法
CN108715614A (zh) 2010-11-30 2018-10-30 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
US9217040B2 (en) 2011-01-14 2015-12-22 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ROR-1 protein and methods for use of same
MX2013010011A (es) 2011-03-01 2014-10-24 Amgen Inc Agentes de unión biespecífica.
SG193610A1 (en) 2011-03-25 2013-11-29 Amgen Inc Anti - sclerostin antibody crystals and formulations thereof
PL3404041T3 (pl) 2011-04-19 2020-12-14 Amgen Inc. Sposób leczenia osteoporozy
WO2012149246A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Novartis Ag Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
HUE039786T2 (hu) 2011-08-04 2019-02-28 Amgen Inc Csonthiány-defektusok kezelési módszere
US9803009B2 (en) 2011-10-24 2017-10-31 Abbvie Inc. Immunobinders directed against TNF
CN104203978A (zh) * 2011-10-24 2014-12-10 艾伯维股份有限公司 针对硬化蛋白的免疫结合剂
UY34410A (es) 2011-10-24 2013-05-31 Abbvie Inc Inmunoligantes biespecificos dirigidos contra tnf
AU2013285488B2 (en) * 2012-07-05 2018-03-22 Ucb Pharma S.A. Treatment for bone diseases
WO2014015133A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 National Cheng Kung University Treatment of osteoarthritis using il-20 antagonists
US20140065144A1 (en) * 2012-08-30 2014-03-06 National Cheng Kung University Use of il-20 antagonists for promoting bone fracture healing
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
JOP20140049B1 (ar) * 2013-03-08 2021-08-17 Lilly Co Eli أجسام مضادة ترتبط بـ il-23
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
US9763911B2 (en) 2013-12-12 2017-09-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Prostacyclin compositions for regulation of fracture repair and bone formation
AR100270A1 (es) * 2014-05-19 2016-09-21 Lilly Co Eli Anticuerpos ang2
MA41101A (fr) * 2014-12-03 2017-10-10 Lilly Co Eli Dispositif d'injection de médicament automatique comportant une indication audible de progression d'injection
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
BR112017014258A2 (pt) * 2014-12-30 2018-03-06 Celgene Corp anticorpos anti-cd47 e usos dos mesmos
CA3015619A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human poliovirus receptor (pvr)
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
EP3496744A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 Amgen Inc. Method of improving connective tissue attachment using anti-sclerostin antibodies
EP3534950A4 (en) * 2016-11-01 2020-05-06 AnaptysBio, Inc. ANTIBODIES AGAINST PROGRAMMED DEATH-1 (PD-1)
PT3565844T (pt) 2017-01-09 2023-05-02 Tesaro Inc Métodos de tratamento de cancro com anticorpos anti-pd-1
EP3574010A4 (en) * 2017-01-30 2020-12-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-SCLEROSTIN ANTIBODIES AND METHOD OF USE
US11530240B2 (en) 2017-06-09 2022-12-20 The Regents Of The University Of California Catheter injectable cyclic peptide pro-gelators for myocardial tissue engineering
MX2020010092A (es) 2018-03-30 2020-10-28 Amgen Inc Variantes de anticuerpo c-terminales.
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
CN112702991A (zh) 2018-08-10 2021-04-23 安进公司 制备抗体药物配制品的方法
US20220275073A1 (en) 2019-08-12 2022-09-01 Amgen Inc. Anti-Sclerostin Antibody Formulations

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
CN101469329B (zh) * 1998-11-27 2012-10-24 达尔文发现有限公司 增加骨矿化的组合物和方法
US20040132021A1 (en) 2000-06-19 2004-07-08 Wendy Balemans Osteolevin gene polymorphisms
US20040023356A1 (en) 2002-06-14 2004-02-05 Robb Krumlauf Wise/Sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
WO2004047609A2 (en) * 2002-11-27 2004-06-10 Visiopharm Aps A method and a system for establishing a quantity measure for joint destruction
EA015166B1 (ru) * 2003-06-16 2011-06-30 Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк. Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител
WO2005005604A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Centocor, Inc. Engineered anti-target immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
WO2006046935A1 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Applied Molecular Evolution, Inc Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US20100036091A1 (en) 2006-11-10 2010-02-11 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
BRPI0809026A2 (pt) * 2007-03-20 2014-09-23 Lilly Co Eli Anticorpos antiesclerotina

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107126560A (zh) * 2011-12-28 2017-09-05 安进公司 通过使用抗骨硬化蛋白抗体治疗牙槽骨流失的方法
CN111196849A (zh) * 2015-03-13 2020-05-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN111196849B (zh) * 2015-03-13 2021-12-21 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途
TWI790617B (zh) * 2015-03-13 2023-01-21 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗硬骨素抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CN106661104B (zh) * 2015-03-13 2019-04-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2016145961A1 (zh) * 2015-03-13 2016-09-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US10449250B2 (en) 2015-03-13 2019-10-22 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-sclerostin antibody, antigen binding fragment and medical use thereof
CN106661104A (zh) * 2015-03-13 2017-05-10 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途
TWI730954B (zh) * 2015-03-13 2021-06-21 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗硬骨素抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CN109890845A (zh) * 2016-10-28 2019-06-14 伊莱利利公司 抗rankl抗体及其用途
CN109890845B (zh) * 2016-10-28 2022-07-01 伊莱利利公司 抗rankl抗体及其用途
CN110325548A (zh) * 2016-12-21 2019-10-11 美莱奥生物制药第三有限公司 抗硬化蛋白抗体在治疗成骨不全症中的用途
CN110325548B (zh) * 2016-12-21 2023-11-17 美莱奥生物制药第三有限公司 抗硬化蛋白抗体在治疗成骨不全症中的用途
US11498961B2 (en) 2017-07-27 2022-11-15 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. SOST antibody pharmaceutical composition and uses thereof
WO2019020069A1 (zh) * 2017-07-27 2019-01-31 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种sost抗体药物组合物及其用途
CN113784987A (zh) * 2019-01-22 2021-12-10 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法

Also Published As

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CY1114784T1 (el) 2016-12-14
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