CN112702991A

CN112702991A - 制备抗体药物配制品的方法

Info

Publication number: CN112702991A
Application number: CN201980053004.7A
Authority: CN
Inventors: A·沙尔玛; B·德朗萨特
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2021-04-23
Also published as: IL280642A; US20210308265A1; BR112021002506A2; EA202190482A1; SG11202100952QA; KR20210043607A; JP2024045250A; CA3108693A1; AU2019316575A1; WO2020033788A1; JP2021534117A; JP7425041B2; EP3833327A1; MX2021001554A; MA53272A

Abstract

本披露提供了用于制备粘度为10cP或更低的抗体药物配制品的材料和方法，所述方法包括在大于30℃的温度下将包含抗原结合蛋白的组合物与包含钙的渗滤缓冲液进行交换。

Description

制备抗体药物配制品的方法

本申请要求2018年8月10日提交的美国临时申请号62/717,357的优先权权益，将其披露内容通过引用以其整体并入本文。

通过引用并入以电子方式提交的材料

通过引用以其整体并入与本文同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，该序列表标识如下：名称为“53022A_SeqListing.txt”的ASCII(文本)文件，17,859字节，创建于2019年8月8日。

通过引用并入

以下申请通过引用以其整体特此并入：于2012年8月2日提交的国际专利申请号PCT/US 2012/049331，其要求于2011年8月4日提交的美国临时专利申请号61/515,191的权益；于2006年4月25日提交的美国专利申请号11/410,540，其要求于2006年4月17日提交的美国临时专利申请号60/792,645、于2006年3月13日提交的美国临时专利申请号60/782,244、于2006年2月24日提交的美国临时专利申请号60/776,847、和于2005年5月3日提交的美国临时专利申请号60/677,583的权益；以及于2006年4月25日提交的美国专利申请号11/411,003(以美国专利号7,592,429发布)，其要求于2006年4月17日提交的美国临时专利申请号60/792,645、于2006年3月13日提交的美国临时专利申请号60/782,244、于2006年2月24日提交的美国临时专利申请号60/776,847、和于2005年5月3日提交的美国临时专利申请号60/677,583的权益。以下申请也通过引用特此并入：于2008年9月17日提交的美国专利申请号12/212,327，其要求于2007年9月17日提交的美国临时专利申请号60/973,024的权益；以及于2010年6月29日提交的美国专利申请号12/811,171，其是依照于2008年12月15日提交的国际专利申请号PCT/US 08/86864的35U.S.C.§371的美国国家阶段申请，其要求于2007年12月14日提交的美国临时专利申请号61/013,917的权益。

背景技术

高度浓缩的液体抗体配制品可用于以较小体积的载体递送一定剂量的治疗剂。然而，高度浓缩的蛋白质配制品存在几个问题，包括由于微粒的形成而导致的不稳定和由于抗体的大分子性质进行的众多分子间相互作用而导致的粘度增加。高粘性配制品也难以制造，难以吸入注射器且难以注射。在操作粘性配制品时使用力会导致过度起泡，这可导致活性生物制剂的变性和失活。

发明内容

在一方面，本文描述了制备粘度为10cP或更低的抗体药物配制品的方法，该方法包括在大于30℃的温度下将包含该抗体的组合物与包含钙盐的渗滤缓冲液进行缓冲液交换。在一些实施例中，抗体是洛莫索珠单抗(romosozumab)、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、维汀-本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、卡那单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达克珠单抗、地诺单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、或优特克单抗、维多珠单抗(vedolizumab)。

在一些实施例中，交换步骤通过超滤/渗滤进行。在一些实施例中，组合物包含浓度为至少70mg/mL、至少71mg/mL、至少72mg/mL、至少73mg/mL、至少74mg/mL、至少75mg/mL、至少76mg/mL、至少77mg/mL、至少78mg/mL、至少79mg/mL、至少80mg/mL、至少81mg/mL、至少82mg/mL、至少83mg/mL、至少84mg/mL、至少85mg/mL、至少86mg/mL、至少87mg/mL、至少88mg/mL、至少89mg/mL、至少90mg/mL、至少91mg/mL、至少92mg/mL、至少93mg/mL、至少94mg/mL、至少95mg/mL、至少96mg/mL、至少97mg/mL、至少98mg/mL、至少99mg/mL、至少100mg/mL、至少101mg/mL、至少102mg/mL、至少103mg/mL、至少104mg/mL、至少105mg/mL、至少106mg/mL、至少107mg/mL、至少108mg/mL、至少109mg/mL、至少110mg/mL、至少111mg/mL、至少112mg/mL、至少113mg/mL、至少114mg/mL、至少115mg/mL、至少116mg/mL、至少117mg/mL、至少118mg/mL、至少119mg/mL、或至少120mg/mL的抗体。在一些实施例中，组合物包含浓度范围为从70mg/mL至210mg/mL的抗体。在一些实施例中，组合物包含浓度小于210mg/mL的抗体。在一些实施例中，交换步骤在30℃和40℃之间(例如37℃)或大于35℃的温度下进行。

在一些实施例中，钙盐是乙酸钙。

在一些实施例中，渗滤缓冲液包含至少20mM(例如约23mM)乙酸钙。

在一些实施例中，渗滤缓冲液还包含任选地浓度为约1％至约15％的多元醇(例如蔗糖)。在一些实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为约7％的蔗糖。

在一些实施例中，交换步骤之后的抗体药物配制品包含约50mM乙酸盐和约12mM钙。

本披露的方法任选地还包括过滤抗体药物配制品和/或将抗体药物配制品等分成药物产品形式的步骤。

除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放性术语(即，意指“包括但不限于”，并允许存在一个或多个特征或组分)。应理解，虽然说明书中的多个实施例是使用“包含”语言呈现的，但在多种情况下，也可以使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来描述相关的实施例。除非上下文另有指示，否则应注意，术语“一种/一个(a或an)”是指一种/一个或多种/多个，例如，“一种/一个免疫球蛋白分子”应理解为代表一种/一个或多种/多个免疫球蛋白分子。同样地，术语“一种/一个(a或an)”、“一种或多种/一个或多个(one ormore)”以及“至少一种/至少一个(at least one)”可以互换地使用。此外，本文使用的“和/或”应被视为具有或不具有另一个指定特征或组分的两个指定特征或组分中的每一个的具体披露内容。因此，如在本文中例如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一项：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

还应理解，当描述值范围时，所描述的特征可以是在该范围内找到的单个值。例如，“从约pH 4至约pH 6的pH”可以是但不限于，pH 4、4.2、4.6、5.1、5.5等，以及这些值之间的任何值。另外，“从约pH 4至约pH 6的pH”不应被解释为意指所考虑配制品的pH在储存期间在pH 4至pH 6的范围内变化2个pH单位，而是指溶液的pH可以在该范围内挑选值，并且pH在约该pH下保持缓冲。

在本文描述的任何范围内，该范围的端点包括在该范围内。然而，该描述还考虑了排除较低和/或较高端点的相同范围。从本申请的整体，包括附图和具体实施方式，本发明的另外的特征和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且所有这些特征都旨在作为本发明的方面。同样，本文描述的本发明的特征可以重组成另外的实施例，这些实施例也旨在作为本发明的方面，无论这些特征的组合是否在上文作为本发明的一个方面或实施例具体提及。而且，只有本文描述为对本发明至关重要的这些限制才应被视为这样的限制；本文未描述为至关重要的、本发明的缺少限制的变化旨在作为本发明的方面。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[生物医学与分子生物学简明词典],Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRCPress[CRC出版社]；The Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞与分子生物学词典],第3版,1999,Academic Press[学术出版社]；以及the Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology[牛津生物化学与分子生物学词典],修订的,2000,Oxford University Press[牛津大学出版社]为技术人员提供了本披露中使用的许多术语的综合词典。

单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。本文提供的小标题不是本披露的不同方面或各方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。

本文引用的所有参考文献通过引用以其整体特此并入。

附图说明

图1是显示各种浓度的乙酸钙对抗体组合物的粘度的影响的图。将粘度(cP.Y轴)针对抗体浓度(mg/mL，X轴)作图。

图2提供了不存在乙酸钙情况下的超滤参数。

图3提供了存在乙酸钙情况下的超滤参数。

图4是显示温度对抗体组合物的粘度的影响的图。将进料压力(psi，Y轴)针对渗余液浓度(mg/mL，X轴)作图。

具体实施方式

本披露是基于如下发现：在大于30℃的温度下将包含抗体的组合物与包含钙盐的渗滤缓冲液进行缓冲液交换可得到粘度为10cP或更低的抗体药物配制品。

配制较高浓度抗体的能力提供了改进的患者剂量方案、更小的注射体积、更宽范围的装置选择、以及供应链注意事项方面的改进。许多抗体在较高浓度下都非常粘稠，可能会限制加工和药物递送选择。特别地，由于加工时间长、压力高、加工所需的膜面积大以及产品回收率可能很差，高粘度的抗体组合物可能对于最终药物物质超滤/渗滤工艺步骤是有问题的。如本文所述，考虑到钙盐的溶解度随温度升高而降低，升高的温度和钙盐(例如乙酸钙)的组合在降低组合物的粘度方面出人意料地有效。

如本文所用，术语“超滤”或“UF”是指使溶液或悬浮液经膜(例如半透膜)以将产物(例如蛋白质)与溶液或悬浮液中的其他材料分离的任何技术。例如，超滤膜保留大于膜孔的分子，而较小的分子(如盐、溶剂和水)则自由通过膜。被膜保留的溶液被称为“浓缩液”或“渗余液”，而穿过膜的溶液被称为“滤液”或“渗透液”。超滤可用于增加溶液或悬浮液中大分子的浓度。在一方面，超滤用于增加溶液中蛋白质的浓度。

本披露的膜过滤器如超滤膜可具有0.001至0.1微米的孔径。在一些实施例中，膜过滤器的孔径为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055、0.060、0.065、0.070、0.075、0.080、0.085、0.090、0.095或0.100微米。在一些实施例中，本披露的膜过滤器的分子截留值为15千道尔顿(kDa)至50kDa或更高。例如，在一些实施例中，膜滤器的分子截留值为15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa，或任何中间值。在一些实施例中，膜的截留分子量为30kDa。

如本文所用，术语“渗滤”或“DF”用于指例如，使用超滤膜从含有蛋白质、肽、核酸或其他生物分子的溶液或混合物中去除、替换或降低盐或溶剂的浓度。渗滤可能导致或可能不会导致保留组分(包括蛋白质)的浓度增加。例如，在连续渗滤中，以与产生滤液相同的速率将溶剂连续地添加到渗余液中。在这种情况下，渗余液体积和保留组分的浓度在处理过程中不会改变。另一方面，在不连续或顺序稀释渗滤中，超滤步骤之后是将溶剂添加到渗余液侧；如果添加到渗余液侧的溶剂的体积不等于或大于产生的滤液的体积，则保留组分将具有高浓度。渗滤可用于改变大分子溶液或悬浮液的pH、离子强度、盐组成、缓冲液组成或其他性质。

如本文所用，术语“超滤/渗滤”或“UF/DF”是指顺序或同时完成超滤和/或渗滤的任何方法、技术或技术组合。

在一些实施例中，在缓冲液交换步骤之前测量包含抗体的组合物的粘度，并且在大于30℃的温度下将起始组合物与包含钙盐的渗滤缓冲液进行缓冲液交换后，测量所得配制品的粘度。测量粘度的方法是本领域公知的，并且这些方法包括例如使用毛细管粘度计或锥板流变仪。可以使用任何方法，其条件是使用相同的方法来比较起始组合物和所得配制品。

如本文所用，术语“粘度”是指“绝对粘度”。绝对粘度(有时称为动态或简单粘度)是运动粘度和流体密度的乘积：绝对粘度＝运动粘度x密度。运动粘度的尺寸为L²/T，其中L是长度并且T是时间。通常，运动粘度以厘司(cSt)表示。运动粘度的SI单位是mm²/s，其是1cSt。绝对粘度以厘泊(cP)的单位表示。绝对粘度的SI单位是毫帕-秒(mPa-s)，其中1cP＝1mPa-s。

粘度测量可以在储存或施用温度(例如2℃-8℃或25℃(室温))下进行。在一些实施例中，在储存和/或施用温度下所得药物组合物的绝对粘度为15cP或更低、14cP或更低、13cP或更低、12cP或更低、11cP或更低、10cP或更低、9cP或更低、8cP或更低、7cP或更低、6cP或更低、5cP或更低，或4cP或更低。

“渗滤缓冲液”是本身不包含抗体但用于制备包含抗体的配制品的缓冲液。渗滤缓冲液包含钙盐。示例性钙盐包括但不限于乙酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、谷氨酸钙、琥珀酸钙和氯化钙。在一些实施例中，钙盐以从5mM至150mM的浓度范围存在于渗滤缓冲液中。在一些实施例中，钙盐以从10mM至30mM的浓度范围存在于渗滤缓冲液中。在一些实施例中，钙盐以至少10mM、至少11mM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM、至少21mM、至少22mM、至少23mM、至少24mM、至少25mM、至少26mM、至少27mM、至少28mM、至少29mM或至少30mM的浓度存在于渗滤缓冲液中。在某些实施例中，渗滤缓冲液中钙盐的浓度不大于约20mM、不大于约21mM、不大于约22mM、不大于约23mM、不大于约24mM、不大于约25mM、不大于约26mM、不大于约27mM、不大于约28mM、不大于约29mM或不大于约30mM。考虑了具有前述终点的组合的任何范围，该范围包括但不限于从约0.5mM至约30mM、从约20mM至约30mM、或从约20mM至约25mM。在一些实施例中，钙盐以如下浓度存在于渗滤缓冲液中，该浓度可使由本文披露的缓冲液交换步骤产生的抗体组合物(与在大于30℃的温度下与包含钙盐的渗滤缓冲液进行缓冲液交换之前的抗体组合物相比)的粘度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或更高，或者达到10cP或更低、9cP或更低、8cP或更低、7cP或更低、6cP或更低、或5cP或更低的粘度。

在本文描述的所有范围中，本文所述的阳离子、阴离子或盐的浓度与渗滤缓冲液有关。在本文描述的任何范围内，该范围的端点包括在该范围内。然而，该描述还考虑了排除较低和/或较高端点的相同范围。

在一些实施例中，本文所述的渗滤缓冲液除钙盐外还包含浓度为至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM或至少约15mM的缓冲液(例如乙酸盐缓冲液)。在一些实施例中，浓度不大于约10mM、不大于约15mM、不大于约20mM、不大于约25mM、不大于约30mM、不大于约35mM、不大于约40mM、不大于约45mM或不大于约50mM。考虑了具有前述终点的组合的任何范围，该范围包括但不限于从约5mM至约15mM、或从约5mM至约10mM、或从约20mM至约30mM、或从约20mM至约25mM。优选地将缓冲液添加至pH保持在约5-6或5-5.5或4.5-5.5的浓度。在一些实施例中，当配制品中的钙盐是乙酸钙时，乙酸盐的总浓度为约10mM至约60mM、或约20mM至约40mM。

在一些方面，渗滤缓冲液包含总浓度为至少约10mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM或至少约50mM的乙酸盐。在一些实施例中，乙酸盐的浓度不大于约30mM、不大于约35mM、不大于约40mM，不大于约45mM、不大于约50mM、不大于约55mM、不大于约60mM、不大于约65mM、不大于约70mM、不大于约75mM、不大于约80mM、不大于约85mM或不大于约90mM。考虑了具有前述终点的组合的任何范围，该范围包括但不限于：约10mM至约50mM、约20mM至约50mM、约20mM至约40mM、约30mM至约50mM、或约30mM至约75mM。通过非限制性实例的方式，含有10mM乙酸钙的溶液将具有20mM乙酸盐阴离子和10mM钙阳离子(因为钙阳离子具有二价的性质)，而含有10mM乙酸钠的溶液将具有10mM钠阳离子和10mM乙酸盐阴离子。

在一些实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、或至少约15mM的谷氨酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液。在一些实施例中，浓度不大于约10mM、不大于约15mM、不大于约20mM、不大于约25mM、不大于约30mM、不大于约35mM、不大于约40mM、不大于约45mM或不大于约50mM。考虑了具有前述终点的组合的任何范围，该范围包括但不限于从约5mM至约15mM、或从约5mM至约10mM、或从约20mM至约30mM、或从约20mM至约25mM。优选地将缓冲液添加至pH保持在约5-6或5-5.5或4.5-5.5的浓度。

在一些实施例中，渗滤缓冲液中离子(阳离子和阴离子)的总浓度为至少约10mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、或至少约85mM。在一些实施例中，离子的总浓度不大于约30mM、不大于约35mM、不大于约40mM、不大于约45mM、不大于约50mM、不大于约55mM、不大于约60mM、不大于约65mM、不大于约70mM、不大于约75mM、不大于约80mM、不大于约85mM、不大于约90mM、不大于约95mM、不大于约100mM、不大于约110mM、不大于约120mM、不大于约130mM、不大于约140mM、不大于约150mM、不大于约160mM、不大于约170mM、不大于约180mM、不大于约190mM、或不大于约200mM。考虑了具有前述终点的组合的任何范围，该范围包括但不限于：约30mM至约60mM、或约30mM至约70mM、或约30mM至约80mM、或约40mM至约150mM、或约50mM至约150mM。通过非限制性实例的方式，10mM乙酸钙的溶液将具有30mM总浓度的离子(10mM阳离子和20mM阴离子)。

在多种实施例中，在大于30℃的温度下将抗体组合物与渗滤缓冲液进行缓冲液交换。在一些实施例中，缓冲液交换在30℃和40℃之间的温度下进行。在一些实施例中，缓冲液交换在大于35℃的温度下进行。在一些实施例中，缓冲液交换在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃进行。在一些实施例中，缓冲液交换在37℃进行。

本文描述的渗滤缓冲液任选地包含至少一种多元醇。多元醇涵盖一类赋形剂，其包括糖(例如甘露糖醇、蔗糖、或山梨糖醇)和其他多羟基醇(例如丙三醇和丙二醇)。聚合物聚乙二醇(PEG)包括在这个类别中。多元醇通常用作液体和冻干的肠胃外蛋白质配制品两者中的稳定赋形剂和/或等张剂。多元醇可以保护蛋白质免受物理和化学降解途径的影响。

示例性多元醇包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘氨酸、精氨酸HCL、多羟基化合物(包括例如多糖，如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、磺丁基环糊精(captisol)、N-甲基吡咯烷、纤维素和透明质酸)、和氯化钠(Carpenter等人,Develop.Biol.Standard[生物标准化的发展]74:225,(1991))。

另外的多元醇包括但不限于丙二醇、甘油(丙三醇)、苏糖、苏糖醇、赤藓糖、赤藓糖醇、核糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、来苏糖、麦芽糖醇、山梨糖醇、山梨糖、葡萄糖、甘露糖、甘露糖醇、左旋糖、右旋糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、木糖醇、肌醇、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖、1,2,6-己三醇等。高级糖包括葡聚糖、丙二醇或聚乙二醇。与非还原糖相比，还原糖，例如果糖、麦芽糖或半乳糖更容易氧化。糖醇的另外的实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇或异麦芽酮糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原糖苷。单糖苷包括通过还原二糖(例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖)而获得的化合物。

在一些实施例中，该至少一种多元醇选自下组，该组由以下组成：单糖、二糖、环状多糖、糖醇、线性支链型葡聚糖和线性非支链型葡聚糖、或其组合。在一些实施例中，该至少一种多元醇是选自下组的二糖，该组由以下组成：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇和山梨糖醇或其组合。

在一些实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为约0％至约40％w/v、或约0％至约20％w/v、或约1％至约15％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为至少0.5、至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少30、或至少40％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14％至约15％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为约1％至约15％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在又另一个实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为约9％、约9.5％、约10％、约10.5％、约11％、约11.5％、或约12％的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，渗滤缓冲液包含浓度为约9％至约12％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，该至少一种多元醇(例如糖)在渗滤缓冲液中的浓度为约9％w/v。在一些实施例中，该至少一种多元醇选自由以下组成的组：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇和山梨糖醇或其组合。在一些实施例中，该多元醇是蔗糖，并且以从约5％至约9％w/v的浓度范围存在于渗滤缓冲液中。

在一些实施例中，渗滤缓冲液包含20mM乙酸钙、7％蔗糖。在一些实施例中，渗滤缓冲液的pH范围是从4至6。在一些实施例中，渗滤缓冲液的pH为4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6。在一些实施例中，渗滤缓冲液的pH为5.1。

超滤/渗滤

超滤/渗滤(在本文中通常也称为UF/DF)选择性地利用可渗透的(多孔的)膜过滤器来基于其分子大小分离溶液和悬浮液的组分。膜保留大于膜孔的分子，而可渗透的较小的分子(如盐、溶剂和水)则自由通过膜。被膜保留的溶液被称为浓缩液或渗余液。穿过膜的溶液被称为滤液或渗透液。选择膜进行浓缩的一个参数是其对于待浓缩样品的保留特性。作为一般规则，膜的截留分子量(MWCO)应为待保留分子的分子量的1/3至1/6。这是为了确保完全保留。MWCO距样品越近，浓缩过程中一些小的产品损失的风险就越大。可以与本披露的方法一起使用的膜的实例包括Omega^TMPES膜(30kDa MWCO，即，大于30kDa的分子被膜保留而小于30kDa的分子允许通过膜的滤液侧)(颇尔公司(Pall Corp.),华盛顿港,纽约州)；Pelicon^TM30kD再生纤维素膜(密理博西格玛公司(Millipore Sigma))；

-GV注射器驱动过滤器单元，PVDF 0.22μm(密理博公司(Millipore Corp.),比勒利卡,马萨诸塞州)；

-GP注射器驱动过滤器单元，PES 0.22mu.m；

0.22μm过滤器单元(密理博公司,比勒利卡,马萨诸塞州)；和Vivaspin浓缩器(MWCO 10kDa，PES；MWCO 3kDa，PES)(赛多利斯公司(Sartorius Corp.),埃奇伍德,纽约州)

UF/DF有两种形式，包括不连续模式的UF/DF和连续模式的UF/DF。可以根据任一模式来进行本披露的方法。

连续UF/DF(也称为恒定体积UF/DF)涉及通过以与产生滤液相同的速率向渗余液中添加水或新缓冲液来洗去渗余液(样品)中的原始缓冲盐(或其他低分子量物质)。因此，渗余液体积和产品浓度在UF/DF过程中不会改变。除去的盐量与产生的滤液体积(相对于渗余液体积)有关。产生的滤液体积通常以“渗滤体积”提及。单个渗滤体积(DV)是开始渗滤时的渗余液的体积。为了连续渗滤，以与产生滤液相同的速率添加液体。当收集的滤液的体积等于起始渗余液体积时，已处理了1DV。

不连续UF/DF包括两种不同的方法：不连续的顺序UF/DF和体积减少的不连续UF/DF。通过顺序稀释进行的不连续UF/DF涉及首先用水稀释样品至预定体积。然后通过UF将已稀释的样品浓缩回其原始体积。通过体积减少进行的不连续UF/DF涉及首先将样品浓缩至预定体积，然后用水或替换缓冲液将样品稀释回其原始体积。与连续UF/DF一样，重复此过程直到去除不需要的溶质(例如离子赋形剂)的水平。

可以根据本领域已知的常规技术，使用水例如WFI作为UF/DF介质进行UF/DF(例如，Industrial Ultrafiltration Design and Application of DiafiltrationProcesses[工业超滤设计及渗滤工艺应用],Beaton和Klinkowski,J.Separ.Proc.Technol.[分离工艺技术杂志],4(2)1-10(1983))。用于进行UF/DF的可商购设备的实例包括Millipore Labscale^TMTFF System(密理博公司)、LV Centramate^TM、实验室切向流系统(颇尔公司)、UniFlux系统(GE医疗集团(GE Healthcare))、

UD(赛多利斯斯泰帝生物技术公司(Sartorius Stedim Biotech))、

FlexReadyTFF(EMD密理博公司(EMD Millipore))、Akta^TMReadyflux(GE医疗集团)、Allegro^TM一次性TFF(颇尔公司)和不锈钢橇如Cogent TFF系统。

取决于溶液中的蛋白质，使用渗滤缓冲液进行的缓冲液交换步骤可以进行任意次，其中一次渗滤步骤等于一次总体积交换。在一个实施例中，渗滤过程进行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次或多达被认为是达到预期结果所必需的多次。当已经将一定体积的渗滤缓冲液(其等于抗体组合物的起始体积)添加到渗余液侧时，实现了单轮或单步渗滤。

在多种实施例中，交换步骤之后的所得渗滤配制品包含约50mM乙酸盐和约12mM钙。

本披露的方法还提供了以高水平浓缩抗原结合蛋白而不增加所得渗滤配制品的粘度的手段。使用本披露的方法获得的水性配制品中抗原结合蛋白的浓度可以是根据所需浓度的任何量。例如，根据本文描述的方法制备的组合物中抗原结合蛋白的浓度为至少约70mg/ml、至少约71mg/ml、至少约72mg/ml、至少约73mg/ml、至少约74mg/ml、至少约75mg/ml、至少约76mg/ml、至少约77mg/ml、至少约78mg/ml、至少约79mg/ml、至少约80mg/ml、至少约81mg/ml、至少约82mg/ml、至少约83mg/ml、至少约84mg/ml、至少约85mg/ml、至少约86mg/ml、至少约87mg/ml、至少约88mg/ml、至少约89mg/ml、至少约90mg/ml、至少约91mg/ml、至少约92mg/ml、至少约93mg/ml、至少约94mg/ml、至少约95mg/ml、至少约96mg/ml、至少约97mg/ml、至少约98mg/ml、至少约99mg/ml、至少约100mg/ml、至少约101mg/ml、至少约102mg/ml、至少约103mg/ml、至少约104mg/ml、至少约105mg/ml、至少约106mg/ml、至少约107mg/ml、至少约108mg/ml、至少约109mg/ml、至少约110mg/ml、至少约111mg/ml、至少约112mg/ml、至少约113mg/ml、至少约114mg/ml、至少约115mg/ml、至少约116mg/ml、至少约117mg/ml、至少约118mg/ml、至少约119mg/ml、至少约120mg/ml、至少约121mg/ml、至少约122mg/ml、至少约123mg/ml、至少约124mg/ml、至少约125mg/ml、至少约126mg/ml、至少约127mg/ml、至少约128mg/ml、至少约129mg/ml、至少约130mg/ml、至少约131mg/ml、至少约132mg/ml、至少约132mg/ml、至少约133mg/ml、至少约134mg/ml、至少约135mg/ml、至少约136mg/ml、至少约137mg/ml、至少约138mg/ml、至少约139mg/ml、至少约140mg/ml、至少约141mg/ml、至少约142mg/ml、至少约143mg/ml、至少约144mg/ml、至少约145mg/ml、至少约146mg/ml、至少约147mg/ml、至少约148mg/ml、至少约149mg/ml、至少约150mg/ml、至少约151mg/ml、至少约152mg/ml、至少约153mg/ml、至少约154mg/ml、至少约155mg/ml、至少约156mg/ml、至少约157mg/ml、至少约158mg/ml、至少约159mg/ml、或至少约160mg/ml，并且范围可以高达例如约300mg/ml、约290mg/ml、约280mg/ml、约270mg/ml、约260mg/ml、约250mg/ml、约240mg/ml、约230mg/ml、约220mg/ml、约210mg/ml、约200mg/ml、约190mg/ml、约180mg/ml、或约170mg/ml。考虑了具有前述终点的组合的任何范围，该范围包括但不限于：约70mg/ml至约250mg/ml、约70mg/ml至约200mg/ml、约70mg/ml至约210mg/ml、约70mg/ml至约160mg/ml、约100mg/ml至约250mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、或约100mg/ml至约180mg/ml。

如本文所用的“抗原结合蛋白”意指特异性结合指定抗原的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、肽体、抗体片段、抗体构建体、融合蛋白和抗原受体(包括嵌合抗原受体(CAR))。该术语涵盖包含至少两个全长重链及两个全长轻链的完整抗体，以及其衍生物、变体、片段及突变。抗原结合蛋白还包括结构域抗体，例如以下进一步描述的纳米抗体及scFv。

在一些实施例中，抗原结合蛋白是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式、包含重链和轻链且包含可变区和恒定区的蛋白质。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区一般为约100-110个或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。可变区由每条轻链和重链的N末端区形成，而恒定区由每条重链和轻链的C末端部分形成。(Janeway等人,“Structure of the Antibody Molecule and theImmunoglobulin Genes[抗体分子结构与免疫球蛋白基因的结构]”,Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版Elsevier Science Ltd./Garland Publishing[爱思唯尔科学有限公司/加兰出版社],(1999))。

本领域中已描述抗体CDR的通用结构和性质。简言之，在抗体骨架中，CDR包埋在重链和轻链可变区中的框架内，其中这些CDR构成主要负责抗原结合和识别的区域。可变区包含至少三个重链或轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],Public Health Service N.I.H.[国立卫生研究院公共卫生服务部],马里兰州贝塞斯达；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，在框架区(由Kabat等人,1991指定框架区1-4，即FR1、FR2、FR3和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)内。

人类轻链分成κ和λ轻链。重链分成μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本发明的实施例包括抗体的所有此类类别或同种型。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如人类κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人类α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，抗体为同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一个。IgG1抗体特别易于还原二硫键，并因此代表了本披露的一个优选的实施例。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施例中，抗体包含基本上类似于由哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人类等产生的天然存在的抗体的序列。在这方面，抗体可以被认为是哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人类抗体等。在某些方面，单克隆抗体是人类抗体。在某些方面，单克隆抗体是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”在本文中用于指含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或更一般而言，含有来自至少两个物种的氨基酸序列区段的抗体。术语“人源化”在关于抗体使用时，是指具有至少来自非人类来源的CDR区的抗体，这些抗体经工程化以具有比原始来源抗体更类似于真实人类抗体的结构和免疫功能。例如，人源化可涉及将来自非人类抗体(例如小鼠抗体)的CDR接枝到人类抗体中。人源化也可涉及选择氨基酸取代以使非人类序列看起来更类似人类序列。

本披露的方法还适合于获得包含抗原结合蛋白，例如抗体片段(如scFv、Fab和VHH/VH)的配制品，这些抗体片段保留完整的抗原结合能力。scFv和Fab都是可以在原核宿主中容易地产生的广泛使用的片段。其他抗体蛋白质产物包括经二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚体和多聚体抗体形式，如双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体，或包含由连接于寡聚结构域的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小的片段是骆驼科重链Ab的VHH/VH以及单结构域Ab(sdAb)。最常用于产生新颖抗体形式的构建基块为单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，其包含由约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的V结构域(VH和VL结构域)。肽体或肽-Fc融合体是又一种抗体蛋白质产物。肽体的结构由接枝到Fc结构域上的生物活性肽组成。本领域中充分描述肽体。参见，例如，Shimamoto等人.,mAbs 4(5):586-591(2012)。

在一些实施例中，抗原结合蛋白是scFv、Fab VHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、二聚体抗体、多聚体抗体(例如，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体)、miniAb、骆驼科重链抗体的肽体VHH/VH、sdAb、双特异性或三特异性抗体、BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白或BsAb缀合物。

抗原结合蛋白可以是呈单体形式或者聚合体、寡聚体或多聚体形式。在抗体包含两种或更多种不同抗原结合区片段的某些实施例中，抗体被视为双特异性的、三特异性的或多特异性的，或者二价的、三价的或多价的，这取决于由抗体识别和结合的不同表位的数目。

有利地，这些方法不限于抗体的抗原特异性。因此，抗体(或抗体片段或抗体蛋白质产物)几乎对任何抗原都具有任何结合特异性。在示例性方面中，抗体与激素、生长因子、细胞因子、细胞表面受体或其任何配体结合。在一些实施例中，抗体是洛莫索珠单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、维汀-本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达克珠单抗、地诺单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗、维多珠单抗，或前述任一者的生物仿制药。

在一些实施例中，抗体选自由以下组成的组：莫罗单抗-CD3(以商标名称Orthoclone

市售的产品)、阿昔单抗(以商标名称

市售的产品)、利妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)(美国专利号5,843,439)、巴利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、达克珠单抗(以商标名称

市售的产品)、帕利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、英利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、曲妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)、阿仑单抗(以商标名称

市售的产品)、阿达木单抗(以商标名称

市售的产品)、托西莫单抗-I131(以商标名称

市售的产品)、依法利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、西妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)、替伊莫单抗(以商标名称

市售的产品)、奥马珠单抗(以商标名称

市售的产品)、贝伐单抗(以商标名称

市售的产品)、那他珠单抗(以商标名称

市售的产品)、兰尼单抗(以商标名称

市售的产品)、帕尼单抗(以商标名称

市售的产品)、依库丽单抗(以商标名称

市售的产品)、赛妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)、戈利木单抗(以商标名称

市售的产品)、卡那单抗(以商标名称

市售的产品)、卡妥索单抗(以商标名称

市售的产品)、优特克单抗(以商标名称

市售的产品)、托珠单抗(以商标名称

市售的产品)、奥法木单抗(以商标名称

市售的产品)、地诺单抗(以商标名称

市售的产品)、贝利木单抗(以商标名称

市售的产品)、瑞西巴库单抗、伊匹单抗(以商标名称

市售的产品)、和帕妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)。

在一些实施例中，抗体是抗硬骨素抗体。“抗硬骨素抗体”或“与硬骨素结合的抗体”是与SEQ ID NO:1的硬骨素结合的抗体或其部分。重组人类硬骨素/SOST可从例如，R&D系统公司(R&D Systems)(明尼阿波里斯市，明尼苏达州，美国；2006目录号1406-ST-025)商购。美国专利号6,395,511和6,803,453、以及美国专利公开号2004/0009535和2005/0106683(通过引用特此并入)通常是指抗硬骨素抗体。适用于本披露上下文的硬骨素抗体的实例也描述在美国专利公开号2007/0110747和2007/0072797中，将其通过引用特此并入。关于产生硬骨素抗体的材料和方法的另外的信息可以在美国专利公开号20040158045(通过引用特此并入)中找到。

如本文所用，“特异性结合”意指抗体优先结合抗原而不是其他蛋白质。在一些实施例中，“特异性结合”意指抗体对抗原的亲和力高于对其他蛋白质的亲和力。

在一些或任何实施例中，抗体与SEQ ID NO:1的硬骨素、或其天然存在的变体以小于或等于1x10^-7M、小于或等于1x10^-8M、小于或等于1x10^-9M、小于或等于1x10^-10M、小于或等于1x10^-11M、或小于或等于1x10^-12M的亲和力(Kd)进行结合。使用多种技术确定亲和力，其中一个实例是亲和力ELISA测定。在多种实施例中，通过BIAcore测定确定亲和力。在多种实施例中，通过动力学方法确定亲和力。在多种实施例中，通过平衡/溶液方法确定亲和力。美国专利公开号2007/0110747(其披露内容通过引用并入本文)含有适用于确定抗体对硬骨素的亲和力(Kd)的亲和力测定的另外的描述。

在多个方面，抗体包含与选自CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3的CDR具有至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的至少一个CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO:2中给出的序列，CDR-H2具有SEQ ID NO:3中给出的序列，CDR-H3具有SEQ ID NO:4中给出的序列，CDR-L1具有SEQ ID NO:5中给出的序列，CDR-L2具有SEQ ID NO:6中给出的序列，并且CDR-L3具有SEQ ID NO:7中给出的序列。在多个方面，抗硬骨素抗体包含两个CDR或六个CDR。

在优选的实施例中，抗硬骨素抗体包含如下六个CDR的组：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2、SEQ ID NO:4的CDR-H3、SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2、和SEQ ID NO:7的CDR-L3。

在一些或任何实施例中，抗体包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列，该重链可变区包含与SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列具有至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列。在多个方面，与SEQ ID NO:8或9相比，序列的差异位于对应序列中的CDR区域之外。在一些或任何实施例中，抗体包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ IDNO:8中所示的氨基酸序列，该重链可变区包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

在一些或任何实施例中，抗硬骨素抗体包含重链(例如，两条重链)的全部或部分和轻链(例如，两条轻链)的全部或部分，该重链包含与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO 10中所示的氨基酸序列具有至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列。

在一些或任何实施例中，抗硬骨素抗体包含重链(例如，两条重链)的全部或部分和轻链(例如，两条轻链)的全部或部分，该重链包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列具有至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO 12中所示的氨基酸序列具有至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列。

其他抗硬骨素抗体的实例包括但不限于披露于国际专利公开号WO 2008/092894、WO 2008/115732、WO 2009/056634、WO 2009/047356、WO 2010/100200、WO 2010/100179、WO2010/115932、和WO 2010/130830(其每个通过引用以其整体并入本文)中的抗硬骨素抗体。

本领域技术人员将理解，一些蛋白质(如抗体)可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达蛋白质的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化、和天冬酰胺脱酰胺的变化。频繁的修饰是由于羧肽酶的作用而丧失羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)(如描述在Harris,RJ.Journal of Chromatography[色谱学杂志]705:129-134,1995中)。

其他修饰包括对脯氨酸和赖氨酸的羟基化、对丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化、对赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties[蛋白质：结构和分子性质],W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],旧金山,第79-86页[1983]，通过引用以整体并入)、对N末端胺的乙酰化、和对任何C末端羧基基团的酰胺化。

可以将包含一种或多种本文描述的抗体的药物组合物与提供关于使用此类药物组合物的说明书的包装材料一起放置在容器内(例如，小瓶或注射器)。通常，此类说明书将包括描述抗体浓度，以及在某些实施例中，可能是重新配制药物组合物所必需的赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐水或PBS)的相对量的明确表达。

实例

该实例描述了代表性的抗体纯化方法，该方法使用升高温度的缓冲液交换(例如，通过超滤和渗滤(UF/DF))步骤来浓缩抗体并将其缓冲液交换为20mM乙酸钙、7％蔗糖的渗滤缓冲液(pH 5.1)，以产生浓度为120g/L的、包含抗体的最终药物组合物。该方法出人意料的结果是能够使用更高的温度(例如37℃)和钙盐(例如乙酸钙)两者从过量浓缩中回收高浓度的蛋白质。乙酸钙具有随温度升高而溶解度降低的性质(参见例如，Apelblat,A.和Manzurola,E.；J.Chem.Thermodynamics[化学热力学杂志],1999,31,1347-1357)。

溶解度与温度之间的这种反比关系表明，在与含有乙酸钙的配制品进行缓冲液交换(例如，UF/DF)的过程中使用升高的温度可能导致异常沉淀或其他潜在的负面副作用。换句话说，提高含有乙酸钙的配制品的温度似乎会降低缓冲盐的溶解度。尽管在渗滤缓冲液中乙酸钙(Ca(Ac)₂)的目标浓度相对较低，为约20mM Ca(Ac)²，但在UF过程中(尤其是在过量浓缩步骤期间)超滤膜表面上盐的局部浓度可能高得多。这些高的局部Ca(Ac)₂浓度连同升高的温度以及非常高的蛋白质浓度出人意料地使超滤过程能够提供高产率。

图1显示了乙酸钙对过量浓缩材料的粘度的影响。添加10mM至23mM之间的钙显著降低了粘度。这也显示在图2和图3的UF/DF参数中，其中随着钙的添加，Cwall(膜表面的最大蛋白质浓度)从186mg/mL增加到220mg/mL。

图4显示了温度对粘度的影响。针对给定的UF/DF条件，温度升高降低了粘度和所产生的进料压力。

有趣的是，过量浓缩后UF库的钙浓度与渗滤(DF)缓冲液不一致。渗滤是在55g/L的浓度下完成的，且将缓冲液转化为20mM乙酸钙、7％蔗糖，pH 5.1，超过10个渗滤体积(DV)。过量浓缩使蛋白质浓度增加了3.3倍(至180g/L)。如果将钙浓缩至相同程度，则20mM的钙DF缓冲液浓度将增加到至少65mM。出人意料的是，实验观察结果是相反的，其中在过量浓缩时钙浓度降低至低于DF缓冲液浓度。如下表1中所示，目标20mM Ca浓度导致仅8.2mM的过量浓缩钙水平。

表1.在生产的各个阶段过程中的钙浓度的汇总。

表2.在过量浓缩过程中的钙排阻的汇总。

抗体浓度(mg/mL)	实际钙浓度(mM)
		66.15	14.1
98.66	12.6
		118.59	12.1
135.49	11.7
		153.24	10.7
173.99	10.2

尽管体积排阻效应可以改变渗余液缓冲液的组成，但由于过滤过程中温度升高和/或局部蛋白质浓度高而导致的溶解度变化，钙离子也可能优先与蛋白质配位或分配。

该实例描述了代表性的抗体纯化方法，该方法使用升高温度的缓冲液交换(例如，通过超滤和渗滤(UF/DF))步骤来进行浓缩并与包含钙盐的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，以产生最终抗体药物组合物(例如，约120g/L)。考虑到乙酸钙在升高的温度下的溶解度影响，能够使用更高的温度(例如37℃)和更高浓度的钙盐(例如乙酸钙)两者从过量浓缩中回收高浓度的蛋白质是出人意料的。

序列表

<110> Amgen Inc.

<120> 制备抗体药物配制品的方法

<130> 31173/53022A

<150> US 62/717,357

<151> 2018-08-10

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 190

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 人类硬骨素

<400> 1

Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu

1 5 10 15

Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr

20 25 30

Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu

35 40 45

Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg

50 55 60

Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu

65 70 75 80

Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile

85 90 95

Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile

100 105 110

Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly

115 120 125

Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys

130 135 140

Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly

145 150 155 160

Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala

165 170 175

Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr

180 185 190

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo HCDR1

<400> 2

Asp Tyr Asn Met His

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo HCDR2

<400> 3

Glu Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo HCDR3

<400> 4

Leu Gly Tyr Asp Asp Ile Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romoLCDR1

<400> 5

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo LCDR2

<400> 6

Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo LCD3

<400> 7

Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo轻链可变区

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Asp Asp Ile Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo重链可变区

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo轻链

<400> 10

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asp Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 11

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo重链野生型

<400> 11

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Glu Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Asp Asp Ile Tyr Asp Asp Trp Tyr

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

145 150 155 160

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

210 215 220

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

225 230 235 240

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

245 250 255

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo轻链野生型，无信号序列

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> romo重链野生型，无信号序列

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Asp Asp Ile Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys

210 215 220

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

Claims

1.一种制备粘度为10cP或更低的抗体药物配制品的方法，所述方法包括在大于30℃的温度下将包含所述抗体的组合物与包含钙盐的渗滤缓冲液进行缓冲液交换。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述交换步骤通过超滤/渗滤进行。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含浓度为至少90mg/mL的抗体。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含浓度为至少120mg/mL的抗体。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述交换步骤在30℃和40℃之间的温度下进行。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述交换步骤在大于35℃的温度下进行。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述交换步骤在37℃进行。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述钙盐是乙酸钙。

9.如权利要求所述的方法，其中所述渗滤缓冲液包含至少20mM乙酸钙。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述渗滤缓冲液包含约23mM乙酸钙。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述渗滤缓冲液还包含多元醇。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述多元醇是蔗糖。

13.如权利要求12所述的方法，其中渗滤缓冲液包含以约1％至约15％的浓度存在的蔗糖。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述渗滤缓冲液包含浓度为约7％的蔗糖。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，所述方法进一步包括过滤所述药物配制品的步骤。

16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述药物配制品等分成药物产品形式的步骤。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述抗体是洛莫索珠单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、维汀-本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达克珠单抗、地诺单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、或优特克单抗、维多珠单抗。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述交换步骤之后的所述药物配制品包含约50mM乙酸盐和约12mM钙。