ES2446293T3 - Anticuerpos anti-esclerostina - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente a la esclerostina humana, en elque el anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende seis CDR con las siguientes secuencias deaminoácidos: HCDR1 con SEQ ID NO: 26, HCDR2 con SEQ ID NO: 27, HCDR3 con SEQ ID NO: 28, LCDR1con SEQ ID NO: 29, LCDR2 con SEQ ID NO: 30 y LCDR3 con SEQ ID NO: 31.

Description

Anticuerpos anti-esclerostina

La presente invención pertenece al campo de la medicina, en particular en el campo de los anticuerpos dirigidos contra la esclerostina. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos de alta afinidad que se unen específicamente a la esclerostina humana y al uso terapéutico de los anticuerpos para varios trastornos o afecciones en sujetos humanos que se benefician de un incremento en al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo o resistencia ósea.

La osteoporosis es una enfermedad en la que se reduce la densidad mineral ósea (DMO), se deteriora la microarquitectura ósea y los huesos osteoporósicos tienen un alto riesgo de fractura. La osteoporosis sigue siendo un causa principal de discapacidad a largo plazo y de mortalidad, en particular entre los ancianos. Aunque los tratamientos eficaces para la osteoporosis se presentan en forma de una modificación del estilo de vida y farmacoterapia, los tratamientos actualmente disponibles son limitados en número y eficacia, a menudo están asociados con efectos secundarios no deseados y no son universalmente aceptables para los pacientes. Varios agentes antirresortivos incluidos calcitonina, bisfosfonatos, reemplazo de estrógeno y moduladores selectivos de receptores de estrógeno (MSRE) evitan una pérdida ósea adicional, pero no reconstruyen el hueso una vez que se ha perdido. Está disponible un agente anabólico que incrementa la masa ósea y la densidad mineral ósea y restablece la arquitectura ósea en forma de PTH(1-34) humano. Sin embargo, este agente terapéutico requiere diariamente una inyección subcutánea, a menudo durante un año o más, lo que da como resultado un cumplimiento por parte del paciente menor del completo.

La esclerostina, el producto génico de SOST, se expresa fuertemente en los osteocitos dentro del hueso. Debido a su papel como regulador negativo potente de formación ósea, la esclerostina es un objetivo deseable para la intervención terapéutica para trastornos o afecciones lo que se beneficiaría de un incremento en al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo y resistencia ósea, por ejemplo, osteoporosis. Por lo tanto, los anticuerpos anti-esclerostina pueden resultar útiles como un enfoque anabólico para el tratamiento de dichos trastornos o afecciones. La publicación internacional PCT N.º WO 2006/119107 divulga secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanizados anti-esclerostina particulares en los que todas las CDR son totalmente murinas, es decir, no están alteradas de las CDR de un anticuerpo generado en un ratón. El documento WO 2006/119062 divulga anticuerpos o fragmentos de los mismos que se pueden unir a la esclerostina, lo que se dice que es útil para tratar una amplia variedad de afecciones relacionadas con los huesos.

Existe la necesidad de obtener un anticuerpo anti-esclerostina alternativo que se una a la esclerostina humana con una fuerte afinidad de unión y que tenga un valor de CI50 bajo en un ensayo de bioactividad de esclerostina. Se podría prever que un anticuerpo de este tipo es más eficaz terapéuticamente, en particular para la osteoporosis, y requiere una dosificación menos frecuente que PTH(1-34) o un anticuerpo anti-esclerostina con una afinidad de unión menor (es decir, una KD mayor) o un valor de CI50 mayor. También existe una necesidad de obtener un anticuerpo específico para la esclerostina humana donde exista una disminución en el riesgo de una respuesta inmunitaria para el anticuerpo provocada por un sujeto humano administrado con el anticuerpo o una disminución en el riesgo de inestabilidad mientras que se mantienen las propiedades del anticuerpo de tener una alta afinidad de unión para esclerostina humana y un valor de CI50 bajo en un ensayo de bioactividad. Los anticuerpos antiesclerostina de la presente invención satisfacen estas necesidades y proporcionan ventajas relacionadas.

Los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados, comprenden una secuencia polipeptídica específica divulgada en el presente documento, se unen específicamente a la esclerostina humana con una alta afinidad de unión y se pueden usar para incrementar al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo y resistencia ósea en un mamífero, preferentemente un ser humano.

En un modo de realización, al menos una CDR en un anticuerpo de la invención difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDR en la posición presente en un anticuerpo origina, es decir, el anticuerpo generado en un roedor (por ejemplo, un ratón), a partir del que se deriva el anticuerpo variante, es decir, el anticuerpo humanizado o quimérico de la invención. Preferentemente, dicha(s) sustitución/sustituciones de aminoácidos en una secuencia de CDR de un anticuerpo de la invención da como resultado una mayor afinidad de unión (es decir, KD menor) con esclerostina humana, una CI50 menor en un ensayo de bioactividad de esclerostina, o ambas, que las presentes en el anticuerpo original. Una sustitución de aminoácidos en una secuencia de CDR de un anticuerpo de la invención de la presente en la CDR del anticuerpo original puede dar como resultado una disminución en la respuesta inmunógena para el anticuerpo por un ser humano administrado con el anticuerpo. Además, una sustitución de aminoácidos en una secuencia de CDR de un anticuerpo de la invención de la presente en la CDR del anticuerpo original puede disminuir el riesgo de inestabilidad del anticuerpo, por ejemplo, por la sustitución de un residuo de asparagina con un aminoácido diferente disminuyendo de este modo el riesgo de desaminación.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente a la esclerostina humana, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende seis CDR con las siguientes secuencias de aminoácidos: HCDR1 con SEQ ID NO: 26, HCDR2 con SEQ ID NO: 27, HCDR3 con SEQ ID NO: 28, LCDR1 con SEQ ID NO: 29, LCDR2 con SEQ ID NO: 30 y LCDR3

con SEQ ID NO: 31.

Preferentemente, el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera en el que, la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

Aún más preferentemente, el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención comprende un polipéptido de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y un polipéptido de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de la presente invención, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención para su uso como medicamento.

Preferentemente, el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención se usa para incrementar al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, o resistencia ósea en un sujeto humano, y más en particular para tratar una enfermedad o trastorno seleccionado de osteoporosis, osteopenia, artrosis, dolor asociado con artrosis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal, o mieloma múltiple en un sujeto humano.

Un anticuerpo divulgado en el presente documento se une específicamente a la esclerostina humana y comprende seis regiones CDR con secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en de (i) HCDR1 con SEQ ID NO: 20, HCDR2 con SEQ ID NO: 21, HCDR3 con SEQ ID NO: 22, LCDR1 con SEQ ID NO: 23, LCDR2 con SEQ ID NO: 24, y LCDR3 con SEQ ID NO: 25; (ii) HCDR1 con SEQ ID NO: 26, HCDR2 con SEQ ID NO: 27, HCDR3 con SEQ ID NO: 28, LCDR1 con SEQ ID NO: 29, LCDR2 con SEQ ID NO: 30, y LCDR3 con SEQ ID NO: 31; y (iii) HCDR1 con SEQ ID NO: 32, HCDR2 con SEQ ID NO: 33, HCDR3 con SEQ ID NO: 34, LCDR1 con SEQ ID NO: 35, LCDR2 con SEQ ID NO: 36, y LCDR3 con SEQ ID NO: 37.

En un caso, un anticuerpo se une específicamente a la esclerostina humana y comprende un polipéptido de región variable de cadena pesada ("HCVR") y un polipéptido de región variable de cadena ligera ("LCVR") en el que (i) la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (ii) la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; o (iii) la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

En otro caso, un anticuerpo se une específicamente a la esclerostina humana y comprende un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera en el que, (i) el polipéptido de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y el polipéptido de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; (ii) el polipéptido de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y el polipéptido de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; o (iii) el polipéptido de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y el polipéptido de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.

En un caso, los anticuerpos como se definen en el presente documento, definidos preferentemente con un número de SEQ ID, se caracterizan además por tener una afinidad de unión (KD) para la esclerostina humana de aproximadamente 10 pM o menos a 25 ºC. Los anticuerpos preferentes tiene una KD para la esclerostina de macacos de Java de aproximadamente 100 pM o menos a 25 ºC. Los anticuerpos más preferentes tienen una afinidad de unión para la esclerostina humana de aproximadamente 10 pM o menos a 25 ºC y una afinidad de unión para la esclerostina de macacos de Java de aproximadamente 100 pM o menos a 25 ºC.

En otro caso, los anticuerpos como se define en el presente documento, definidos preferentemente con un número de SEQ ID, se caracterizan por tener una CI50 de 50 nM o menos en un ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso usando esclerostina humana. Preferentemente, estos anticuerpos también tienen una KD para la esclerostina humana de aproximadamente 10 pM o menos a 25 ºC. Más preferentemente, estos anticuerpos tienen una KD para la esclerostina humana de aproximadamente 10 pM o menos a 25 ºC y una KD para la esclerostina de macacos de Java de aproximadamente 100 pM o menos a 25 ºC.

En otro caso, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende una población homogénea o sustancialmente homogénea de un anticuerpo monoclonal de la invención y un vehículo

o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención engloba el uso de un anticuerpo de la invención para la preparación de un medicamento. Para su uso en un procedimiento para incrementar al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo

o resistencia ósea en un animal, preferentemente una especie de mamífero, más preferentemente un sujeto

humano.

En el presente documento se divulga un procedimiento de incremento de al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo o resistencia ósea que comprende administrar a un sujeto humano que lo necesite, una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención.

En el presente documento se divulga también un procedimiento para tratar una enfermedad, afección o trastorno, en un sujeto humano, que se beneficia de un incremento en al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo o resistencia ósea, incluidos, por ejemplo, osteoporosis, osteopenia, artrosis, dolor asociado con artrosis, enfermedad periodontal y mieloma múltiple.

En el presente documento también se divulga un procedimiento para detectar la proteína esclerostina en una muestra biológica, que comprende incubar un anticuerpo de la invención con la muestra biológica en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que dicho anticuerpo se una a la proteína esclerostina, y detectar dicha unión. Un anticuerpo preferente para su uso en dicho ensayo de detección tiene un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO:40 y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 41; un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 42, y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 43; un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 2 y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 5; un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 3 y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 6; o un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 4 y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 7.

En el presente documento se divulgan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo de la invención; un vector que comprende ese ácido nucleico, opcionalmente unido de forma funcional a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una célula huésped que comprende ese vector; un procedimiento para producir un anticuerpo de la invención que comprende cultivar la célula huésped de modo que se exprese el ácido nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del medio de cultivo de célula huésped.

La invención presenta anticuerpos que se unen específicamente a la esclerostina humana, neutralizan o antagonizan al menos una bioactividad de esclerostina humana in vitro o in vivo y presentan además una fuerte afinidad de unión con la esclerostina humana. Cuando se usa en el presente documento, el término "esclerostina" se refiere a la proteína humana de longitud completa con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o a la forma madura de la proteína con la secuencia señal retirada.

El término "anticuerpo," en referencia a un anticuerpo anti-esclerostina de la invención (o simplemente, "anticuerpo de la invención"), como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal. Un "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, a menos que se indique de otro modo. Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden producir usando, por ejemplo, tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas, por ejemplo, injertos de CDR, o combinaciones de dichas tecnologías fácilmente conocidas en la técnica. "Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon, incluido, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota, o de fago, y no el procedimiento por el que se produce.

Un "anticuerpo monoclonal" o "anticuerpo de la invención" o simplemente "anticuerpo" puede ser un anticuerpo intacto (que comprende una región Fc de completa o de longitud completa), o una porción o fragmento de un anticuerpo que comprende una porción de unión a antígeno, por ejemplo, un fragmento Fab, fragmento Fab’, o fragmento F(ab’)2 de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los fragmentos de unión a antígeno particularmente preferentes de un anticuerpo de la invención retienen la capacidad de inhibir o neutralizar una o más bioactividades características de una esclerostina de mamífero in vivo o in vitro. Por ejemplo, en un modo de realización, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención puede inhibir la interacción de la esclerostina humana madura con uno o más de sus ligandos y/o puede inhibir una o más funciones mediadas por receptor de la esclerostina humana.

Además, un "anticuerpo monoclonal" o "anticuerpo de la invención" o simplemente "anticuerpo", como se usa en el presente documento, puede ser un fragmento Fv de cadena ligera que se puede producir uniendo el ADN que codifica la LCVR y la HCVR con una secuencia enlazadora. (Véase, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Se entiende que independientemente de si se especifican los fragmentos o porciones de unión a antígeno, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye dichos fragmentos o porciones así como formas monocatenarias, a menos que se indique de otro modo. Siempre que la proteína retenga la capacidad para unirse específicamente a esclerostina, se incluye dentro del término "anticuerpo".

La expresión "se une específicamente", como se usa en el presente documento, se refiere a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no se une específicamente a moléculas distintas de su(s) compañero(s) de unión específica, medido por una técnica disponible en la técnica, por ejemplo, ELISA de competición, ensayo BIACORE® o ensayo KINEXA®. También se puede aplicar el término cuando, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención es específico para un epítopo particular que es llevado por varios

antígenos, caso en el que el anticuerpo que lleva el dominio de unión a antígeno se podrá unir específicamente a los diversos antígenos que llevan el epítopo. El término "epítopo" se refiere a esa porción de una molécula que se puede reconocer por y unirse por un anticuerpo a una o más de las regiones de unión a antígeno del anticuerpo.

El término "bioactividad", en referencia a un anticuerpo de la invención, incluye, pero no se limita a, afinidad de unión a epítopo o antígeno, capacidad para neutralizar o antagonizar una bioactividad de esclerostina in vivo o in vitro, CI50 en un ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso (por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2, en el presente documento) u otro ensayo de actividad in vitro, la estabilidad in vivo y/o in vitro del anticuerpo y las propiedades inmunógenas del anticuerpo, por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano. Las propiedades

o características mencionadas anteriormente se pueden observar o medir usando técnicas reconocidas en la técnica incluidas, pero sin limitarse a, ELISA, ELISA competitiva, análisis de resonancia de plasmón superficial, ensayos de neutralización in vitro e in vivo sin límite, unión a receptor e inmunohistoquímica con secciones de tejido de diferentes fuentes incluidas humano, primate, o cualquier otra fuente como se pueda necesitar.

El término "bioactividad" en referencia a esclerostina, incluye, pero no se limita a, unión específica de esclerostina a otra proteína (por ejemplo, un receptor o miembro de la familia de TGF-ß), una o más funciones mediadas por receptor de esclerostina humana, transducción de señal, propiedades inmunógenas, estabilidad in vivo o in vitro, afectando a los niveles o la actividad de otra proteína in vivo o in vitro (véase por ejemplo, el ejemplo 2), niveles de expresión de esclerostina y distribución tisular.

El término "inhibir" o "neutralizar", como se usa en el presente documento con respecto a una bioactividad de un anticuerpo de la invención, quiere decir la capacidad para antagonizar, prohibir, prevenir, restringir, ralentizar, interrumpir, eliminar, detener, reducir o invertir sustancialmente una bioactividad de esclerostina (por ejemplo, medido en el ejemplo 2, en el presente documento).

El término "numeración de Kabat", como se usa en el presente documento, se reconoce en la técnica y se refiere a un sistema de numeración de residuos aminoacídicos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones de cadena pesada y ligera del anticuerpo (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH N.º 91-3242 (1991)). La colocación de las CDR en la región variable de un anticuerpo sigue la numeración de Kabat o simplemente, "Kabat". Un polinucleótido se "une de forma funcional" cuando se coloca en relación funcional con otro polinucleótido. Por ejemplo, un promotor o potenciador se une de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. Los términos "sujeto" y "paciente", usados de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a un mamífero, preferentemente un humano. E un determinado modo de realización, el sujeto se caracteriza además con una enfermedad o trastorno o afección que se beneficiaría de una disminución en el nivel de esclerostina o disminución en la bioactividad de esclerostina.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido de forma funcional incluido, pero sin limitarse a, plásmidos y vectores víricos. Ciertos vectores se pueden replicar de forma autónoma en una célula huésped dentro de la que se introducen mientras que otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes” (o simplemente "vectores de expresión"). Los vectores ejemplares son bien conocidos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "célula huésped" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable e incluyen una celda individual o cultivo celular que es un receptor de cualquier polinucleótido aislado de la invención o cualquier vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HCVR, una LCVR o un anticuerpo de la invención. Una célula huésped incluye células transformadas, transducidas o infectadas con uno o más vectores recombinantes o un polinucleótido que expresa un anticuerpo monoclonal de la invención o una cadena ligera o cadena pesada del mismo.

Cada cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa se compone de una región variable de cadena pesada N-terminal (en el presente documento "HCVR") y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera de un anticuerpo de longitud completa se compone de una región variable de cadena ligera N-terminal (en el presente documento "LCVR") y una región constante de cadena ligera. Las regiones HCVR y LCVR se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad denominadas “regiones determinantes de la complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones estructurales” (FR). La capacidad funcional de un anticuerpo para unir un antígeno o epítopo particular está grandemente influenciada por las seis CDR presentes en la región variable del anticuerpo. Cada HCVR y LCVR se compone de tres CDR (HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en la HCVR y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en la LCVR) y cuatro FR, dispuestas desde el amino terminal hasta el carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. La colocación de CDR dentro de la región variable sigue la numeración de Kabat.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y se caracterizan por una región constante particular como

se conoce en la técnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE, respectivamente y varias de estas se pueden dividir además en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante particular con una secuencia fácilmente conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera kappa y las regiones constantes de cadena pesada IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 son regiones constantes preferentes en los anticuerpos de la invención. Más preferentemente, la región constante de cadena pesada comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 codificada por un polinucleótido con SEQ ID NO:

39. Los anticuerpos quiméricos pueden tener regiones constantes de origen no humano, preferentemente de rata o murino.

Como se usa en el presente documento, la "región de unión a antígeno" o "porción de unión a antígeno” se refiere a esa porción de una molécula de anticuerpo, dentro de la región variable, que contiene los residuos de aminoácidos que interaccionan con un antígeno y confieren en el anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno. Esta porción de anticuerpo incluye los residuos de aminoácidos estructurales necesarios para mantener la conformación apropiada de los residuos de unión a antígeno.

Un anticuerpo preferente comprende seis CDR con secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 y

25. Otro anticuerpo preferente comprende seis CDR con secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 y 37. Un anticuerpo más preferente comprende seis CDR con secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 y 31. Las CDR de estos anticuerpos preferentes existen en la posición establecida en la tabla 1 a continuación. Las CDR se colocan en la región variable de acuerdo con Kabat.

Un anticuerpo preferente comprende una LCVR con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 17, 18 o 19. Otros anticuerpos monoclonales preferentes comprenden una HCVR con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 15 o 16. Más preferentemente, un anticuerpo comprende una LCVR de SEQ ID NO: 17 y una HCVR de SEQ ID NO:

14. Un anticuerpo alternativo comprende una LCVR de SEQ ID NO: 19 y una HCVR de SEQ ID NO: 16. Un anticuerpo más preferente comprende una LCVR de SEQ ID NO: 18 y una HCVR de SEQ ID NO: 15. Preferentemente, dichas LCVR se unen a una región constante de cadena ligera, preferentemente de origen humano, preferentemente una cadena kappa. Preferentemente, dichas HCVR se unen de manera funcional a una región constante de cadena pesada, preferentemente de origen humano, preferentemente IgG1 o IgG4, lo más preferentemente una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:38.

Un anticuerpo preferente comprende un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 2 y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 5. El polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 2 se puede codificar, por ejemplo, por una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 8, el polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 5 se puede codificar, por ejemplo, por un polinucleótido de SEQ ID NO: 11.

Otro anticuerpo preferente comprende un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 4 y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 7. El polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO:4 se puede codificar, por ejemplo, por una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 10, el polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 7 se puede codificar, por ejemplo, por un polinucleótido de SEQ ID NO: 13.

Otro anticuerpo preferente comprende un polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO: 3 y un polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 6. El polipéptido de cadena pesada con SEQ ID NO:3 se puede codificar por una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 9, el polipéptido de cadena ligera con SEQ ID NO: 6 se puede codificar por un polinucleótido de SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos humanizados preferentes se denominan en el presente documento 86, 88 y 89. Los SEQ ID NO de sus secuencias son como se enumeran en la tabla 1 dada a continuación.

Tabla 1- SEQ ID NO de proteína

Anticuerpo

Cadena pesada Cadena ligera HCVR CDR1 pesada CDR2 pesada CDR3 pesada LCVR CDR1 ligera CDR2 ligera CDR3 ligera

86

2 5 14 20 21 22 17 23 24 25

88

3 6 15 26 27 28 18 29 30 31

89

4 7 16 32 33 34 19 35 36 37

Preferentemente, un anticuerpo en el que las seis CDR, la HCVR, la LCVR, la HCVR y la LCVR, la cadena pesada completa, la cadena ligera completa, o la cadena pesada completa y la cadena ligera completa están limitadas por una secuencia particular como se muestra por un SEQ ID NO en el presente documento (véase, por ejemplo, la tabla 1) se caracteriza además por tener una KD para esclerostina humana a 25 ºC de menos de aproximadamente 10 pM, 8 pM, 6 pM o 4 pM, más preferentemente menos de aproximadamente 2,2 pM. Adicionalmente, es preferente que dicho anticuerpo esté limitado además por tener una KD para esclerostina de macaco de Java a 25 ºC de menos de aproximadamente 100 pM, 90 pM o 80 pM, o más preferentemente de menos de aproximadamente 75 pM.

Preferentemente, un anticuerpo en el que las seis CDR, la HCVR, la LCVR, la HCVR y la LCVR, la cadena pesada completa, la cadena ligera completa, o la cadena pesada completa y la cadena ligera completa están limitadas por una secuencia particular como se muestra por un SEQ ID NO en el presente documento se caracteriza además por tener una CI50 en un ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso usando esclerostina humana (véase, por ejemplo, el ejemplo 2 en el presente documento) de aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 40, 35, o 30 nM o menos, más preferentemente de aproximadamente 25 nM, aún más preferentemente de aproximadamente 20 nM (por ejemplo, 20,2 nM) o menos.

Más preferentemente, un anticuerpo en el que las seis CDR, la HCVR, la LCVR, la HCVR y la LCVR, la cadena pesada completa, la cadena ligera completa, o la cadena pesada completa y la cadena ligera completa están limitadas por una secuencia particular como se muestra por un SEQ ID NO en el presente documento se caracteriza además por tener una KD para esclerostina humana a 25 ºC o menos de aproximadamente 10 pM, 8 pM, 6 pM o 4 pM, más preferentemente menos de aproximadamente 2,2 pM, y también se caracteriza por tener una CI50 en un ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso usando esclerostina humana de aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 40, 35, o 30 nM o menos, más preferentemente aproximadamente 25 nM o menos, aún más preferentemente de aproximadamente 20 nM (por ejemplo, 20,2 nM) o menos.

Aún más preferentemente, un anticuerpo en el que las seis CDR, la HCVR, la LCVR, la HCVR y la LCVR, la cadena pesada completa, la cadena ligera completa, o la cadena pesada completa y la cadena ligera completa están limitadas por una secuencia particular como se muestra por un SEQ ID NO en el presente documento se caracteriza además por tener una KD para esclerostina humana a 25 ºC o menos de aproximadamente 10 pM, 8 pM, 6 pM o 4 pM, más preferentemente menos de aproximadamente 2,2 pM; también se caracteriza por tener una CI50 en un ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso usando esclerostina humana de aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 40, 35, o 30 nM o menos, más preferentemente de aproximadamente 25 nM o menos, aún más preferentemente de aproximadamente 20 nM (por ejemplo, 20,2 nM) o menos; y también se caracteriza por tener una CI50 en un ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso usando esclerostina de macaco de Java de aproximadamente 75 nM o menos.

Expresión de anticuerpo

La presente invención también está dirigida a células huésped que expresan un anticuerpo anti-esclerostina de la invención. La creación y el aislamiento de líneas de células huésped que producen un anticuerpo de la invención se pueden lograr usando técnicas estándar conocidas en la técnica.

Se puede usar una amplia variedad de sistemas de expresión de huésped conocidos en la técnica para expresar un anticuerpo de la presente invención incluyendo sistemas de expresión procariotas (bacterianos) y eucariotas (tales como levaduras, baculovirus, células vegetales, células de mamífero y otras células animales, animales transgénicos y células de hibridoma), así como los sistemas de expresión de presentación en fagos. Un anticuerpo de la invención se puede preparar por expresión recombinante de genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo de manera recombinante, una célula huésped se transforma, transduce, se infecta o similar con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y/o pesadas de inmunoglobulina del anticuerpo de modo que las cadenas ligeras y/o pesadas se expresan en la célula huésped. La cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar independientemente a partir de diferentes promotores a los que están unidos de forma funcional en un vector o, de forma alternativa, la cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar independientemente a partir de diferentes promotores a los que están unidos de forma funcional en dos vectores (uno que expresa la cadena pesada y uno que expresa la cadena ligera). Opcionalmente, la cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar en diferentes células huésped.

Adicionalmente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo anti-esclerostina desde una célula huésped. El gen de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo anti-esclerostina se puede clonar dentro del vector de modo que el péptido señal se une de manera funcional en fase al amino terminal del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo. Preferentemente, los anticuerpos recombinantes se segregan en el medio en el que se cultivan las células huésped, a partir del que se pueden recuperar o purificar los anticuerpos.

Un ADN aislado que codifica una región HCVR se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo de forma funcional el ADN que codifica la HCVR a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadenas pesadas. Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humanos, así como de otros mamíferos, son conocidos en la técnica. Los fragmentos de ADN que engloban estas regiones se pueden obtener, por ejemplo, por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser de cualquier tipo , (por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM o IgD), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) o subclase de región constante y cualquier variante alotípica de la misma como se describe en Kabat (supra). Una región constante de cadena pesada preferente comprende el polipéptido de SEQ ID NO:38.

Un ADN aislado que codifica una región LCVR se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa

(así como en un gen de cadena ligera de Fab) uniendo de manera funcional el ADN que codifica la LCVR a otra molécula de ADN que codifica una región constante de cadena ligera. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humanos, así como de otros mamíferos, son conocidos en la técnica. Los fragmentos de ADN que engloban estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Las células huésped de mamífero preferentes para su uso en la invención son células CHO (por ejemplo, ATCC CRL-9096), células NS0, células SP2/0 y células COS (ATCC por ejemplo, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2). Células huésped adicionales para su uso en la invención incluyen otras células de mamífero, células de levadura y células procariotas. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células huésped de mamífero, se producen los anticuerpos cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar de la célula huésped y/o del medio de cultivo usando procedimientos de purificación estándar.

Una vez expresados, los anticuerpos intactos, las cadenas ligeras y pesadas individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, intercambio iónico, afinidad, cromatografía en columna de interacción hidrófoba, fase inversa, electroforesis en gel y similares. Las inmunoglobulinas sustancialmente puras con una homogeneidad de al menos aproximadamente un 90 %, 92 %, 94 % o 96 % son preferentes, y con una homogeneidad de un 98 a un 99 % o más las más preferentes, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, los anticuerpos estériles se usar a continuación terapéuticamente, como se indica en el presente documento.

Anticuerpo humanizado

Preferentemente, un anticuerpo de la invención que se va a usar con propósitos terapéuticos, tiene la secuencia de la región estructural y constante (en la medida en que existe en el anticuerpo) derivada del mamífero en el que se usaría como agente terapéutico para disminuir la posibilidad de que el mamífero provoque una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo terapéutico. Los anticuerpos humanizados son de particular interés puesto que son valiosos para una aplicación terapéutica y disminuyen la probabilidad de una respuesta al anticuerpo anti-ratón humano observada frecuentemente con anticuerpos de origen murino o anticuerpos que comprenden porciones que son de origen murino cuando se administra a un sujeto humano. Preferentemente, los anticuerpos humanizados inyectados pueden tener una semivida más parecida a la de los anticuerpos humanos naturales que a la de, por ejemplo, los anticuerpos murinos, permitiendo de este modo que se administren dosis más pequeñas y menos frecuentes a un sujeto.

El término "anticuerpo humanizado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo en el que al menos una porción es de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender porciones derivadas de un anticuerpo de origen no humano, tal como un ratón, y porciones derivadas de un anticuerpo de origen humano, unidas entre sí, por ejemplo, químicamente por técnicas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o preparadas como un polipéptido contiguo usando técnicas de ingeniería genética.

Preferentemente, un "anticuerpo humanizado" tiene CDR que se originan de o se derivan de un anticuerpo original, es decir, un anticuerpo no humano (preferentemente un anticuerpo monoclonal de ratón), mientras que la región estructural y constante, en la medida en que esté presente, (o una porción significativa o sustancial de la misma, es decir, al menos aproximadamente un 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 %) se codifican por la información de la secuencia de ácido nucleico que se produce en la región de inmunoglobulina de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, the International ImMunoGeneTics Database) o en las formas recombinada o mutada de las mismas tanto si dichos anticuerpos se producen o no en una célula humana. Preferentemente, al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de un anticuerpo humanizado se optimizan a partir de las CDR de un anticuerpo original no humano a partir del que se deriva el anticuerpo humanizado, para generar una propiedad deseada, por ejemplo, especificidad, afinidad o neutralización mejoradas, lo que se puede identificar por un ensayo de cribado, por ejemplo, un ensayo de ELISA. Preferentemente, una CDR optimizada en un anticuerpo de la invención comprende al menos una sustitución aminoacídica cuando se compara con la presente en el anticuerpo original. Determinadas sustituciones de aminoácidos en las CDR de los anticuerpos humanizados 88 y 89 de la invención en comparación con las de los anticuerpos originales 788 y 789 (véanse los ejemplos 5 y 6 en el presente documento) disminuyen la probabilidad de inestabilidad del anticuerpo (por ejemplo, retirada de residuos de Asn de CDR) o disminuyen la probabilidad de inmunogenicidad del anticuerpo cuando se administra a un sujeto humano (por ejemplo, como se predice por tecnología IMMUN-OFILTER™).

Preferentemente, los anticuerpos humanizados contienen una secuencia mínima derivada de un anticuerpo no humano. Los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR o secuencias estructurales importadas del anticuerpo original. Los anticuerpos humanizados se pueden someter a mutagénesis in vitro usando procedimientos de uso rutinario en la técnica y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de regiones estructurales de las regiones HCVR y LCVR de los anticuerpos

recombinantes humanizados son secuencias que, aunque se derivan de las relacionadas con las secuencias de HCVR y LCVR de línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Se contempla que dichas secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales HCVR y LCVR de los anticuerpos recombinantes humanizados son idénticas al menos en un 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 98 % o más preferentemente al menos en un 99 % o lo más preferentemente en un 100 % a una secuencia de línea germinal humana.

En modos de realización preferentes, un anticuerpo humanizado de la presente invención comprende secuencias estructurales de cadena ligera de línea germinal humana (véase, por ejemplo, el documento PCT WO 2005/005604) y secuencias estructurales de cadena pesada de línea germinal humana (véase, por ejemplo, el documento PCT WO 2005/005604). Las regiones estructurales de cadena ligera humana preferentes son de un gen de cadena ligera kappa humana seleccionado del grupo que consiste en: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, O2 y O8. Las regiones estructurales de cadena pesada humana preferentes son de una cadena pesada humana seleccionada del grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH39, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51 (véase, la publicación internacional n.º WO2006/046935).

Existen múltiples procedimientos disponibles en la técnica para generar anticuerpos humanizados. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos humanizados obteniendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican la HCVR y la LCVR de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo murino o anticuerpo preparado por un hibridoma) que se une específicamente a la esclerostina, preferentemente esclerostina humana, identificando las CDR en dicha HCVR y LCVR (no humana), e injertando dichas secuencias de ácidos nucleicos que codifican CDR sobre secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones estructurales humanas seleccionadas. Opcionalmente, una región CDR se puede optimizar mutagenizando aleatoriamente o en localizaciones particulares para sustituir uno o más aminoácidos en la CDR con un aminoácido diferente antes de injertar la región CDR dentro de la región estructural. De forma alternativa, una región CDR se puede optimizar posteriormente a la inserción en la región estructural humana usando procedimientos disponibles para un experto en la técnica.

Después de que las secuencias que codifican CDR se injerten sobre las secuencias que codifican las regiones estructurales humanas seleccionadas, las secuencias de ADN resultantes que codifican las secuencias ligera variable y pesada variable humanizadas se expresan a continuación para producir un anticuerpo humanizado que se une a la esclerostina. La HCVR y LCVR humanizadas se pueden expresar como parte de una molécula completa de anticuerpo anti-esclerostina, es decir, como una proteína de fusión con secuencias de dominio constante humano. Sin embargo, las secuencias de HCVR y LCVR también se pueden expresar en ausencia de secuencias constantes para producir un Fv anti-esclerostina humanizado.

Las referencias que describen además procedimientos que implican la humanización de un anticuerpo de ratón que se puede usar incluyen, por ejemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991 y el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)].

Usos de diagnóstico

Se puede usar un anticuerpo de la invención para diagnosticar un trastorno o enfermedad asociado con la expresión de la esclerostina humana. De modo similar, se puede usar el anticuerpo de la invención en un ensayo para monitorizar los niveles de esclerostina en un sujeto que está siendo tratado para una afección asociada a esclerostina. Dichas aplicaciones incluyen procedimientos que utilizan un anticuerpo de la invención y una marca para detectar esclerostina en una muestra biológica, por ejemplo, en un fluido corporal humano o en una célula o extracto de tejido (véase, por ejemplo, el ejemplo 1 en el presente documento). Se pueden usar los anticuerpos de la invención con o sin modificación, y se pueden marcar por enlace covalente o no covalente de un resto detectable.

En la técnica se conocen una variedad de protocolos convencionales para medir los niveles de esclerostina en una muestra biológica, incluidos, por ejemplo, ELISA, RIA, y FACS, y proporcionan una base para diagnosticar niveles alterados o anormales de la expresión de esclerostina. Los niveles de esclerostina normales o estándar presentes en una muestra se establecen usando cualquier técnica conocida, por ejemplo, combinando una muestra que comprende un polipéptido de esclerostina con, por ejemplo, un anticuerpo de la invención en condiciones adecuadas para formar un complejo antígeno:anticuerpo. El anticuerpo está marcado directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. La cantidad de un complejo formado estándar se cuantifica por diversos procedimientos, tales como, por ejemplo, medios fotométricos. Las cantidades de polipéptido de esclerostina presente en muestras se comparan a continuación con los valores estándar.

Usos terapéuticos

La esclerostina funciona como un regulador negativo de formación ósea. (véase, por ejemplo, Cytokine & Growth Factor Reviews, 16:319-327, 2005). En adultos, el ARNm de esclerostina se detecta principalmente en osteocitos

aunque los solicitantes han descubierto menores concentraciones en el cartílago.

Se puede usar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-esclerostina de la invención para incrementar al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo o resistencia ósea en hueso vertebral o no vertebral, o ambos, cuando se administra una cantidad eficaz a un sujeto humano que lo necesita. Se puede usar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-esclerostina de la invención para reducir la incidencia de fractura de hueso vertebral y/o no vertebral, cuando se administra una cantidad eficaz a un sujeto humano que lo necesita. Reducir la incidencia de fractura incluye reducir la probabilidad o incidencia real de fractura para un sujeto humano en comparación con una población control no tratada.

Además, un anticuerpo de la invención puede ser útil para el tratamiento de afecciones, enfermedades o trastornos en los que la presencia de esclerostina provoca o contribuye a efectos patológicos no deseados o una disminución de los niveles de esclerostina o de la bioactividad de esclerostina tiene un beneficio terapéutico en sujetos humanos. Dichas afecciones, enfermedades o trastornos incluyen, pero no se limitan a, osteoporosis, osteopenia, artrosis, dolor asociado con artrosis, enfermedad periodontal o mieloma múltiple. Los sujetos pueden ser hombres o mujeres. Preferentemente, un sujeto humano está en riesgo de fractura de hueso vertebral y/o no vertebral, más preferentemente un sujeto humano está en riesgo de, o padeciendo, osteoporosis. Preferentemente, el sujeto humano es una mujer y más preferentemente una mujer en riesgo de o que tiene osteoporosis post-menopáusica. Se contempla que el procedimiento de la invención puede beneficiar a un sujeto en cualquier estadio de la osteoporosis.

Adicionalmente, se contempla el uso de un anticuerpo de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente.

Se pretende que los términos "tratamiento" y "tratar" se refieran a todos los procedimientos en los que puede haber una ralentización, interrupción, detención, control o parada de la progresión de los trastornos descritos en el presente documento, pero no indica necesariamente una eliminación total de todos los síntomas del trastorno. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, incluye la administración de un compuesto de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o afección en un mamífero, en particular en un ser humano, e incluye: (a) inhibir la progresión adicional de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o trastorno o aliviar los síntomas o complicaciones del mismo. Se pueden ajustar los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o incrementar la dosis de forma proporcional según se indique por las exigencias de la situación terapéutica.

Composición farmacéutica

Se puede incorporar un anticuerpo de la invención en una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto humano. Se puede administrar un anticuerpo de la invención a un sujeto humano solo o en combinación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable en dosis individuales o múltiples. Dichas composiciones farmacéuticas están diseñadas para ser apropiadas para el modo de administración seleccionado y se usan diluyentes, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de dispersión, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares, según sea apropiado. Dichas composiciones se pueden diseñar de acuerdo con técnicas convencionales divulgadas, por ejemplo, en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19ª Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 que proporciona un compendio de técnicas de formulación como se conocen generalmente por los médicos. Los vehículos adecuados para las composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material que, cuando se combina con un anticuerpo monoclonal de la invención, retiene la actividad de la molécula y no es reactivo con el sistema inmunitario del sujeto.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-esclerostina de la presente invención se puede administrar a un sujeto en riesgo de o que presenta patologías como se describen en el presente documento, por ejemplo, osteoporosis, artrosis u otros trastornos degenerativos óseos, usando técnicas de administración estándar.

Una composición farmacéutica de la invención contiene preferentemente una "cantidad eficaz" de un anticuerpo de la invención. Una cantidad eficaz se refiere a una cantidad necesaria (a dosificaciones y durante periodos de tiempo y para los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, se compensa con los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Una cantidad eficaz es al menos la dosis mínima, pero menos de una dosis tóxica, de un agente activo que es necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Dicho de otra forma, una cantidad eficaz o cantidad

terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención es una cantidad que, en mamíferos, preferentemente seres humanos, (i) incrementa al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo o resistencia ósea, o (ii) trata una afección, trastorno o enfermedad en el que la presencia de esclerostina provoca o contribuye a un efecto patológico no deseado, o (iii) produce una disminución en los niveles de esclerostina o resultados de bioactividad de esclerostina en un efecto terapéutico beneficioso en un mamífero, preferentemente un ser humano, incluidos, pero no limitados a, osteoporosis, osteopenia, artrosis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal o mieloma múltiple.

Como es bien conocido en la técnica médica, las dosificaciones para un sujeto cualquiera dependen de muchos factores, incluidos la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. La dosis puede variar además dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 Ig; preferentemente de 1 a 100 Ig; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, en especial considerando los factores mencionados anteriormente. Un régimen de dosificación parenteral diario puede ser de aproximadamente 0,1 Ig/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal total, preferentemente de aproximadamente 0,3 Ig/kg a aproximadamente 10 mg/kg. El progreso se puede monitorizar por evaluación periódica, y la dosis ajustada en consecuencia.

Estas cantidades sugeridas de anticuerpo están sometidas a un gran criterio terapéutico. El factor clave en la selección de una dosis apropiada y su planificación es el resultado obtenido. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el procedimiento de administración, la planificación de administración y otros factores conocidos por los médicos.

La vía de administración de un anticuerpo de la presente invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. Preferentemente, los anticuerpos de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. Se prefiere la administración parenteral por inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea. La inyección subcutánea es la más preferente. Los vehículos adecuados para dichas inyecciones son bien conocidos en la técnica.

Típicamente, la composición farmacéutica debe ser estéril y estable en condiciones de fabricación y almacenamiento en el envase proporcionado, incluyendo, por ejemplo, un vial sellado, jeringuilla u otro dispositivo de administración, por ejemplo, una pluma. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas se pueden filtrar de forma estéril después de preparar la formulación, o se pueden preparar de otro modo microbiológicamente aceptable.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos, y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 Ensayo ELISA

Se usa este ensayo para detectar y cuantificar la esclerostina en muestras de suero humano hasta un límite de detección inferior de 0,4 ng/ml. El anticuerpo 86 es el anticuerpo de captura, mientras que el anticuerpo 88 es el anticuerpo de detección (véase la tabla 1 para las secuencias de anticuerpos).

Se recubren los pocillos internos de una placa de 96 pocillos con 100 Il de anticuerpo monoclonal anti-esclerostina de longitud completa 86 a una concentración de 0,5 Ig/ml en carbonato de sodio 0,5 M a pH 9,6 ("tampón de recubrimiento"). Se sella la placa y se incuba durante la noche a 4 ºC. A continuación, se lava la placa tres veces con TBST "tampón de lavado" (Tris-HCl 0,4 M, NaCl 3 M, Tween 20 al 0,1 %). A continuación, se añaden 200 Il de tampón de bloqueo de caseína en PBS (Pierce, n.º 37528) por pocillo y se incuba la placa durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, se lava la placa dos veces en tampón de lavado para retirar la solución de bloqueo.

Para generar una curva estándar, se prepara esclerostina humana a una concentración de 0,35 mg/ml en tampón de bloqueo de caseína y se diluye en serie dos veces (de 1,25 ng/ml a 0 ng/ml) en suero humano agrupado al 5 % en tampón de bloqueo de caseína en PBS. El suero humano se pasa por una columna de perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-esclerostina 86 para retirar cualquier esclerostina que pueda haber quedado presente de forma endógena en el suero .

Se añaden cien microlitros de muestras (suero al 5 % en tampón de bloqueo de caseína) o estándares a pocillos por duplicado y a continuación se incuba la placa a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación se lavan las placas 5 veces con tampón de lavado.

Se añaden por pocillo cien microlitros de anticuerpo de detección (anticuerpo monoclonal anti-esclerostina de longitud completa 88) que se ha biotinilado con el kit de biotina Pierce EZ link NHS-LC. Se incuba la placa a

temperatura ambiente durante una hora y a continuación se lava cuatro veces con tampón de lavado. Se diluye estreptavidina-peroxidasa de rábano picante 1:2000 en tampón de bloqueo de caseína en PBS hasta una concentración final de 0,5 Ig/ml, a continuación se añaden 100 Il por pocillo, se incuba a temperatura ambiente durante una hora y a continuación se lava 7 veces con tampón de lavado. Se añade sustrato OPD (Sigma P8806) a 100 Il/pocillo y se deja que continúe la reacción a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación se termina la reacción añadiendo 100 Il/pocillo de HCl 1 N. Se lee la placa a DO 490 nm.

Ejemplo 2 Neutralización - ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso

La fosfatasa alcalina específica de hueso es un indicador bioquímico de la actividad de osteoblastos. El ensayo de fosfatasa alcalina específico de hueso descrito en el presente documento se basa en la capacidad de esclerostina para disminuir los niveles de fosfatasa alcalina estimulada por BMP-4 y Wnt3a en la línea celular murina multipotencial, C2C12, mientras que un anticuerpo que neutraliza la actividad de esclerostina daría como resultado un incremento dependiente de la dosis de la actividad de fosfatasa alcalina en este ensayo. Wnt3a y BMP-4 son factores de crecimiento osteogénicos.

Se plaquean células C2C12 (ATCC, CRL 1772) a 3000-5000 células por pocillo en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos en medio MEM complementado con suero fetal bovino al 5 %, a continuación se incuba a 37 ºC en CO2 al 5 % durante la noche. Se diluye el anticuerpo que se va a someter a prueba en medio condicionado con 0,5X Wnt3a hasta varias concentraciones finales. A continuación se retira el medio de las células en la placa de cultivo de tejido y se añaden 150 μl por pocillos de una solución premezclada de anticuerpo-BMP4-esclerostina (humano o macaco de Java) en la que el anticuerpo está a una concentración final de 30 Ig/ml a 0,5 Ig/ml, BMP-4 está a una concentración final de 25 ng/ml y la proteína esclerostina está a una concentración final de 1,0 Ig/ml y el medio condicionado está a una concentración 0,5X. A continuación se incuba la placa a 37 ºC en CO2 al 5 % durante 72 horas. Se retira el medio de las células en la placa de cultivo de tejido, se lavan las células una vez con PBS, a continuación la placa de células se congela y se descongela tres veces alternando entre -80 ºC y 37 ºC.

Se prepara el medio condicionado con Wnt3a haciendo crecer células L-Wnt-3A y células L de control (ATCC CRL2647 y CRL-2648, respectivamente) durante cuatro días, de una distribución 1:20 de células confluentes, en DMEM con FBS al 10 % y L-glutamina 2 mM. Se filtra el medio recogido a través de membranas de nailon de 0,2 micrones y se almacenan a largo plazo a -20 ºC o a corto plazo a 4 ºC.

Se mide la actividad de fosfatasa alcalina añadiendo 150 Il por pocillo de sustrato de fosfatasa alcalina (1-etapa PNPP, Pierce n.º 37621). A continuación se incuba la placa de células durante 60 minutos a temperatura ambiente, momento en el que se lee DO a 405 nm para determinar la actividad de fosfatasa alcalina. Los valores de neutralización de anticuerpo CI50 informados en la tabla 2 a continuación son promedios de 2 experimentos separados. Los cálculos de CI50 se realizan usando SigmaPlot Regression Wizard con una ecuación de ajuste de 4 parámetros sigmoideo.

Tabla 2

Anticuerpo

CI50 (nM) Usando esclerostina humana CI50 (nM) Usando esclerostina Cyno

89

25,1 34,4

88

20,2 23,7

86

25,5 31,6

Ejemplo 3 Unión por afinidad

Se realizan estudios de unión de equilibrio entre un anticuerpo anti-esclerostina y esclerostina humana, no macaco de Java ("cyno") o bien de rata en un instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc.) en condiciones controladas para KD. Con esta técnica, se mezcla una concentración fijada de anticuerpo por debajo de su KD con varias concentraciones de proteína esclerostina y se deja que se llegue al equilibrio. La fracción de anticuerpo no unido, libre, que permanece en solución se sondea exponiendo brevemente esta mezcla equilibrada a perlas recubiertas con esclerostina seguido de detección con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. Típicamente, se mezclan 2 pM de un anticuerpo anti-esclerostina que se va a someter a prueba con concentraciones variables de esclerostina humana, de cyno, o rata comenzando a 2-50 nM y realizando diluciones de tres veces en serie en tampón de unión (solución salina tamponada con fosfato 1X, pH 7,4, azida de sodio al 0,02 % y 1 mg/ml de seroalbúmina bovina) que contiene 2 pM del anticuerpo que se va a someter a prueba. Se deja que estas soluciones lleguen al equilibrio durante dos días a 25 ºC. La cantidad de anticuerpo unido se sondea usando perlas de azlactona recubiertas con esclerostina humana (Sapidyne Instruments Inc.). Estas perlas se preparan haciendo reaccionar 50 mg de perlas de azlactona secas con 50 mcg/ml de esclerostina humana en un tampón de carbonato de sodio 50 mM a pH 9,0-9,6 con rotación durante la noche. A continuación se deja que las perlas sedimenten y se reemplaza el sobrenadante con solución de bloqueo (Tris 1 M, pH 8,0, más 10 mg/ml de seroalbúmina bovina) y se rotan durante una hora. Se diluye esta reserva de perlas 20 veces en tampón de unión y se usa en el plazo de tres

días. Se usa un instrumento KinExA 3000 equilibrado a temperatura ambiente (ca 25 ºC) para los estudios de unión. Típicamente, se pasan 6,25 ml de la solución equilibrada de anticuerpo/esclerostina sobre una columna de relleno de perlas de azlactona con esclerostina humana a un caudal de 0,25 ml/minuto, a continuación se aclara con tampón de desplazamiento (solución salina tamponada con fosfato 1X, pH 7,4 con azida de sodio al 0,02 %). Se cuantifica la fracción de anticuerpo anti-esclerostina libre unido a estas perlas midiendo la fluorescencia que resulta de un anticuerpo secundario marcado inyectado (anticuerpo Fab’2 anti-humano de cabra marcado con Cy5). Se analizan dos muestras duplicadas para cada condición y se determina KD ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático KinExA Pro. Se informa del promedio de los valores de KD a 25 ºC en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3 - Afinidad

Anticuerpo

KD (pM) esclerostina humana KD (pM) esclerostina de rata KD (pM) esclerostina Cyno

89

0,3 0,4 1,4

88

2,2 2,2 75

86

0,6 0,1 1,0

Ejemplo 4 Ensayo de calceína in vivo:

El ensayo de calceína en ratas permite la evaluación directa de la formación ósea durante un periodo de tiempo corto (10 días) y el efecto de un anticuerpo de la invención sobre la formación ósea. La calceína es una marca de fluorocromo que se incorpora en la matriz ósea durante la formación de hueso nuevo. La medida cuantitativa de calceína refleja el grado de formación ósea inducido por agentes farmacológicos. Se usan ratas Sprague-Dawley hembra de seis meses de esas (n=6/grupo de dosis). Se dosifican las ratas cada 3 días por inyección subcutánea (días 0, 3 y 6) con 1 mg/kg o 6 mg/kg de anticuerpo en vehículo PBS, o con 10 Ig/kg de PTH diariamente o con 6 mg/kg de IgG humana como control negativo. La calceína se inyecta por vía subcutánea el día 7 y las ratas se sacrifican el día 10. Se recogen las tibias y se cortan para evaluar la formación ósea trabecular (metáfisis distal) o formación ósea cortical (diáfisis tibial) y se someten a desmineralización y cuantificación de fluorocromos de la calceína total. Los valores mostrados en la tabla 4 a continuación son promedios con el control de IgG humana fijado en 1,0. Los datos demuestran que la administración de anticuerpos de la invención da lugar a la formación ósea tanto trabecular como cortical.

Tabla 4

Anticuerpo

Dosis mg/kg Calceína trabecular relativa Calceína cortical relativa

Hu IgG

6 1,00 1,00

PTH

0,01 1,45 1,89

89

6 1,97 1,88

88

6 1,90 2,18

86

6 1,77 2,78

Ejemplo 5 Artrosis

La expresión de SOST se limita principalmente al tejido óseo. Sin embargo, los solicitantes determinan en el presente documento que otro tejido con expresión de SOST significativa es el cartílago medido por PCR en tiempo real. La expresión en cartílago de SOST también se observa usando una matriz de ARN aislada del cartílago de pacientes normales o con artrosis. Además, en la matriz, la expresión de SOST se incrementa con relación a la gravedad de la artrosis de modo que la expresión en el cartílago de artrosis leve es mayor que el control, grave es mayor que leve, y quirúrgica grave (retirado de cirugía de artroplastia de rodilla) es mayor que todos los demás lo que demuestra una correlación de artrosis y expresión de SOST. Se puede usar un anticuerpo específico para esclerostina para tratar la artrosis.

Se somete a un anticuerpo quimérico anti-esclerostina con una región variable murina en una región Fc de rata, anticuerpo 789 con SEQ ID NO:42 para cadena pesada y SEQ ID NO:43 para cadena ligera, para determinar la capacidad de bloquear el dolor en las articulaciones en el modelo MIA de artrosis. La región variable de este

anticuerpo era la secuencia original para la generación del anticuerpo humanizado 89 (HCVR con SEQ ID NO: 16 y LCVR con SEQ ID NO: 19). Ambos, el anticuerpo humanizado 89 y el anticuerpo quimérico 789 se unen al mismo epítopo. El modelo de artrosis utiliza inyecciones de monoyodoacetato (MIA) directamente en la articulación de la rodilla para inducir un proceso similar a la OA que implica un dolor mediado por citocinas e inflamatorio y un proceso de destrucción del cartílago. Se inyecta la rodilla contralateral de una rata sólo con solución salina, y se mide el dolor como la diferencia en el soporte de peso de las 2 patas traseras.

El experimento MIA n.º 1 utiliza ratas Lewis macho jóvenes (7-8 semanas de edad) en el "modo de prevención" en el que se administra el anticuerpo anti-esclerostina antes de las inyecciones MIA. El día antes de las inyecciones MIA, se inyectan las ratas con 10 mg/kg de anticuerpo anti-esclerostina i.p. o bien 10 mg/kg de IgG de control, o bien PBS (n = 6 por grupo). Al día siguiente, se anestesian las ratas y se inyectan las rodillas derechas con 0,3 mg de yodoacetato de monosodio disuelto en 50 ul de solución salina estéril al 0,9 %. Se inyectan las rodillas izquierdas sólo con solución salina. Las inyecciones son a través del ligamento rotuliano usando una jeringuilla de insulina con una aguja 28G cubierta con una envoltura de tubo de plástico para permitir una penetración de sólo 5 mm en la articulación de la rodilla.

Se toman medidas del dolor 2 y 7 días después de la inyección de MIA (3 y 8 días después de la inyección de anticuerpo). Después de la medida del dolor el día 7, se administra una segunda dosis de inyección del anticuerpo o del control. A continuación se toman medidas del dolor adicionales 10 y 14 días después de MIA (3 y 7 días después de la segunda inyección del anticuerpo).

Se mide el dolor por la diferencia en el soporte de peso de las patas inyectadas con el uso de un comprobador de incapacitancia. Se colocan las ratas en una caja Perspex con sus patas traseras sobre sensores de presión. Cuando las ratas están quietas de forma fiable, se toma una lectura de 1 segundo, seguido de 2 lecturas adicionales y se calcula el promedio. Se resta el peso colocado sobre la pata inyectada con MIA del de la pata inyectada con solución salina para dar la diferencia en soporte de peso.

Se observa una disminución estadísticamente significativa en el dolor con el anticuerpo anti-esclerostina en comparación con control de IgG (y PBS) los días 7, 10 y 14 después de la administración de MIA (tabla 5 a continuación). Los valores son diferencias de soporte de peso entre la pata inyectada con MIA y la pata inyectada con solución salina en gramos (error estándar de la media).

Se lleva a cabo un segundo experimento con MIA con ratas más mayores (27 semanas de edad) y en el "modo de tratamiento" en el que se administra el anticuerpo después de que se inyecte MIA. Las ratas reciben inyecciones de MIA o de solución salina de control como antes y después, 6 días después se inyectan i.p. 10 mg/kg de anticuerpo anti-esclerostina, IgG de control, o PBS (n = 6 por grupo). Los días 8 y 15 después de MIA (2 y 9 días después del anticuerpo) se toman medidas del dolor como antes. El día 16 después de MIA, se administra una segunda dosis del anticuerpo anti-esclerostina y de los controles, y el día 21 (5 días después de la segunda dosis de anticuerpo) se recogen de nuevo medidas del dolor.

En el primer punto temporal después de la administración del anticuerpo anti-esclerostina (día 8 post-MIA) no se produce efecto del anticuerpo sobre el dolor, pero 7 días después, se produce una tendencia hacia una disminución en el dolor medido por diferencias de soporte de peso entre la pata inyectada con MIA y la pata inyectada con solución salina en gramos. También se observa la tendencia hacia una reducción en el dolor con anticuerpo antiesclerostina 5 días después de la segunda dosificación de anticuerpo. El anticuerpo quimérico 789 difirió del control de IgG con un valor p de 0,06 y 0,08 los días 15 y 21, respectivamente. Juntos, estos resultados demuestran que el dolor en las articulaciones que resulta del proceso de enfermedad por MIA establecido se interrumpe administrando anticuerpo anti-esclerostina neutralizante.

Ejemplo 6 Estudios en ratas OVX

La rata ovariectomizada (OVX) es un modelo bien reconocido para la osteoporosis postmenopáusica. En este estudio, se examinan los efectos de anticuerpos anti-esclerostina de la invención que comprenden una región variable murina y una Fc de rata en la rata OVX.

Se ovariectomizan ratas Sprague-Dawley hembra de seis meses de edad y se deja que pierdan hueso durante 1 mes antes de la dosificación. No se ovariectomiza un grupo de ratas (n=8) pero se operan de forma simulada para su comparación con las ratas ovariectomizadas. Se aleatorizan todas las ratas OVX en grupos de tratamiento (n=7 cada uno) y se tratan con PTH (1-38), control de IgG (10 mg/kg) o bien 10 mg/kg de anticuerpo anti-esclerostina quimérico (anticuerpo 788 con cadena pesada de SEQ ID NO: 40 y cadena ligera de SEQ ID NO:41 [la región variable de este anticuerpo fue la secuencia original para la generación del anticuerpo humanizado 88]; anticuerpo 789 con cadena pesada de SEQ ID NO: 42 y cadena ligera de SEQ ID NO: 43) durante un total de 58 días. Se dosifican todos los anticuerpos por vía subcutánea una vez cada 3 días, mientras que se dosifica PTH (1-38) diariamente por vía subcutánea a 10 mg/kg. Tras sacrificarlas, se retiran los fémures y las vértebras para el análisis de tomografía axial computarizada cuantitativa (TAC) usando un escáner TAC para medir el fémur distal (hueso trabecular) y la diáfisis media (hueso cortical) así como la 5a vértebra lumbar. Se colocan los huesos en arcilla de moldeo para medidas reproducibles y se toman barridos de los fémures a 2 mm desde el extremo de la epífisis (fémur distal) o 10 mm de la epífisis (diáfisis femoral).

Se realizan medidas vertebrales con L-5 escaneada a partir de una estructura "V" marcada en la vértebra. Se calculan los datos por el programa informático de fabricación SYS-C320-V 1,5. Se miden las propiedades biomecánicas de la diáfisis femoral, la vértebra L-5 y el cuello femoral postnecropsia de acuerdo con: Turner CH, 5 Burr DB, Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial. Bone 14(4):595-608, 1993. Se miden las propiedades mecánicas de la diáfisis para fémures izquierdos intactos usando una flexión en 3 puntos con carga aplicada en el punto intermedio entre dos soportes separados 15 mm. Se colocan los fémures de forma que el punto de carga esté aproximadamente 7,5 mm proximal desde el espacio poplíteo distal y la flexión se produce sobre el eje medial-lateral. Se someten a prueba los especímenes en un baño de solución salina a 37 ºC. Se registran las curvas 10 de desplazamiento de carga a una velocidad de cruce de 10 mm/min usando una máquina de prueba de materiales (modelo: 1/S, MTS Corp, Minneapolis, MN) y se analizan usando el programa informático TestWorks 4 (MTS Corp.) para calcular la carga máxima. Se analizaron las propiedades mecánicas de la vértebra L-5 después de retirar los procesos posteriores y se pusieron en paralelo los extremos del centro usando una sierra de diamante de fabricación de obleas (Buehler Isomet, Evanston, IL). Se cargan los especímenes vertebrales en compresión, usando el 15 dispositivo de prueba de materiales y se analizan usando el programa informático TestWorks 4 (MTS Corp.). Para las medidas de cuello femoral, se coloca el fémur verticalmente en un soporte de montaje con el proximal hacia arriba y se aplicó carga hacia abajo en el punto medio de la cabeza femoral. Se realizó el análisis con el programa informático TestWorks 4 (MTS Corp.). El promedio de los valores y el error estándar de los valores medios están en las tablas 5 y 6 a continuación. Los datos demuestran que los anticuerpos quiméricos 788 y 789 incrementan la 20 densidad mineral ósea ("DMO"), el contenido mineral óseo ("CMO") y la resistencia ósea (carga máxima) en ratas

OVX.

Tabla 5

Tratamiento

DMO fémur dist. (mg/cm3) CMO fémur dist(mg) DMO fémur med. (mg/cm3) CMO fémur (mg) DMO vértebra l (mg/cm3) CMO vértebra l (mg)

Simulado

*602 74,1 898 61,2 *587 165

IgG

528 68,6 852 60,5 526 149

PTH

*744 *95,3 *925 63,2 *642 *180

788

*675 *91,4 *946 *68,6 *703 *209

789

*710 *94,9 *951 *68,4 *721 *209

* Incremento estadísticamente significativo del control de IgG, p<0,05, procedimiento Dunnett.

Tabla 6

Tratamiento Carga máxima del cuello femoral (Newtons) Carga máxima del fémur medio (Newtons) Carga máxima vertebral (Newtons) Simulado 96,5 134 236 IgG 100,4 126 188 PTH 117,6 128 *328 2492788 *131,6 *147 *431 2492789 *147,5 *153 *432 * Incremento estadísticamente significativo del control de IgG, p<0,05, procedimiento Dunnett.

25 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Eli Lilly y Company Korytko, Andrew I. Marquis, David Matthew Smith, Eric Michael

15 Swanson , Barbara Anne

<120> Anticuerpos anti-esclerostina

5 <130> X17563

<150> US 60/895813

<151> 20/03/2007

10 <160> 43

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

<211> 213 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 2

<210> 3

<211> 444

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 3

<210> 4

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 4

<210> 5

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 5

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 6

<210> 7

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 7

<210> 8

<211> 1332

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 8

<210> 9

<211> 1332

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 9

<210> 10

<211> 1350

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 10

<210> 11

<211> 642

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 11

<210> 12

<211> 642

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 12

10 <210> 13

<211> 642

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> Construcción miscelánea

<400> 13

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 14

<210> 15

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 15

<210> 16 10 <211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea 15 <400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 17

10 <210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 18

<210> 19

<211> 106

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 19

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 20

10 <210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 15 <223> Construcción miscelánea

<400> 21

<210> 22

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial 10 <220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 23

<210> 24 15 <211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea 20 <400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT 25 <213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 25

30 <210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 26

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 28

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 30

10 <210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 15 <223> Construcción miscelánea

<400> 31

<210> 32

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 32

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial 30 <220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 33

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 34

<210> 35

<211> 17

<212> PRT 15 <213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 35

20 <210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> Construcción miscelánea

<400> 36

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 37

10 <210> 38

<211> 322

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 15 <223> Construcción miscelánea

<400> 38

<210> 39

<211> 970

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 39

<210> 40

<211> 444

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 40

<210> 41

<211> 214 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 41 10

<210> 42

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 42

<210> 43

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción miscelánea

<400> 43

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente a la esclerostina humana, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende seis CDR con las siguientes secuencias de aminoácidos: HCDR1 con SEQ ID NO: 26, HCDR2 con SEQ ID NO: 27, HCDR3 con SEQ ID NO: 28, LCDR1

   5 con SEQ ID NO: 29, LCDR2 con SEQ ID NO: 30 y LCDR3 con SEQ ID NO: 31.
2. 2. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera en el que, la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

   10 3. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende un polipéptido de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y un polipéptido de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

3. 4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

   15 5. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 para su uso como medicamento.

4. 6. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el incremento de al menos uno de entre masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, o resistencia ósea en un sujeto humano.

   20 7. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de entre osteoporosis, osteopenia, artrosis, dolor asociado con artrosis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal o mieloma múltiple en un sujeto humano.

5. 8. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el 25 tratamiento de osteoporosis.