CN103649118A - 双特异性结合剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双特异性抗硬化蛋白(anti-sclerostin)/抗DKK1结合剂，和抗硬化蛋白与抗DKK1结合剂的组合，以及相关治疗方法。

Description

双特异性结合剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月1日提交的美国临时申请号61/448,089和2011年5月5日提交的美国临时申请号61/482,979的优先权益。

本申请含有符合ASCII“txt”的序列表，其用作37C.F.R.第1.821(c)和1.821(e)节所要求的计算机可读形式(CRF)与纸质拷贝二者，且其全部内容以引用方式并入本文。于2012年2月29日创建的“txt”文件的名称是A-1598-US-NP_SequenceListing_022912_ST25_AddedSeq485-496.txt且大小为471KB。

发明背景

发明领域

本发明涉及双特异性抗硬化蛋白(anti-sclerostin)/抗DKK1结合剂和抗硬化蛋白与抗DKK1结合剂的组合以及相关治疗方法。

发明背景

个体的骨质量在一生中发生两个或三个不同阶段的变化(参见Riggs,West J.Med.154:63 77(1991))。第一阶段发生于男性与女性二者中且进展至达到峰值骨质量。此第一阶段是经由软骨内生长板的线性生长和因一定速率的骨膜外积(periosteal apposition)所致的径向生长来达成。第二阶段始于30岁左右(对于小梁骨(扁骨，例如椎骨和骨盆)来说)和约40岁(对于骨皮质(例如，发现于四肢中的长骨)来说)且持续至老年。此阶段的特征在于缓慢骨损失且发生于男性与女性二者中。在女性中，还发生第三阶段的骨损失，这最有可能是因为绝经后雌激素缺乏。仅在此阶段期间，女性可自骨皮质和自小梁隔室(trabecular compartment)损失另外的骨质量(参见Riggs，见上文)。

骨矿物质含量损失可因众多种病状引起且可能产生显著医学问题。举例来说，骨质疏松症是人的衰竭性疾病且特征在于骨骼骨质量和矿物质密度显著降低、骨结构劣化(包括骨微结构降级和对应骨脆性增加(即，骨强度降低))和患病个体对骨折的敏感性。人的骨质疏松症之前通常为临床骨量减少(骨矿物质密度比年轻成人骨的平均值低1个标准偏差以上但小于2.5个标准偏差)，美国有约2千5百万人发现这种病状。在美国已诊断出另有7千8百万患者患有临床骨质疏松症(定义为骨矿物质含量比成熟年轻成人骨低2.5个标准偏差以上)。骨质疏松症在人群中的频率随年龄而增加。在高加索人中，骨质疏松症主要发生于女性，所述女性在美国占骨质疏松症患者库的80%。老年人骨骼骨的增加的脆性和对骨折的敏感性会因此群体偶尔跌倒的风险较大而加重。髋关节骨折、腕骨骨折和椎骨骨折是最常见骨质疏松症相关性损伤。具体地说，髋关节骨折对于患者来说极不舒适且费用昂贵，且对于女性来说，与高死亡率和发病率相关联。

尽管已认为骨质疏松症会因骨质量降低而增加骨折风险，但当前用于骨骼病症的可用治疗很少可增加成人骨密度，且大多数当前可用治疗主要通过抑制进一步骨再吸收而非刺激新骨形成来起作用。目前指定雌激素用于延缓骨损失。然而，关于患者是否获得任何长期益处和雌激素是否对75岁以上患者具有任何作用存在一些争议。然而，人们相信使用雌激素会增加乳癌和子宫内膜癌的风险。也已建议将降钙素、骨钙素连同维生素K或高剂量膳食钙连同或不连同维生素D用于绝经后女性。然而，高剂量钙经常具有不期望的胃肠副作用，且必须连续监测血清和尿钙水平(例如，Khosla和Riggs,Mayo Clin.Proc.70:978982,1995)。

骨质疏松症的其它现行治疗方法包括双膦酸盐(例如，Fosamax^TM、Actonel^TM、Bonviva^TM、Zometa^TM、奥帕膦酸盐(olpadronate)、奈立膦酸盐(neridronate)、替鲁膦酸钠片(skelid)、骨复舒(bonefos))、甲状旁腺激素、钙受体拮抗剂(calcilytic)、拟钙剂(calcimimetic)(例如，锐克钙(cinacalcet))、他汀(statin)、合成代谢类固醇、镧盐和锶盐以及氟化钠。然而，这些治疗剂经常与不期望的副作用相关(参见Khosla和Riggs，见上文)。

硬化性狭窄(一种由骨过度生长和骨强而致密所阐释的骨骼疾病)中不存在硬化蛋白(SOST基因产物)(Brunkow等，Am.J.Hum.Genet.,68:577 589,2001；Balemans等，Hum.Mol.Genet.,10:537 543,2001)。已显示硬化蛋白抑制剂增加骨矿化速率并因此增加骨矿物质密度(Padhi等，J Bone Miner Res.2010年6月；在印刷之前以电子形式出版)。同样，已显示Dkk-1参与尤其在骨折修复中骨形成的调控、和其在各种其它骨损失相关性疾病(例如，癌症和糖尿病)中的作用(Komatsu等，J.Orthop.Res.2010年7月；28(7):928-36；Gavriatolpoulou等，Expert Opin.Ther.Targets.2009年7月；13(7):839-48)。

Dickkopf-1(Dkk-1)是参与胚胎头诱导并拮抗Wnt的分泌蛋白(Glinka等，Nature 391:357-362(1998))。前人已描述了人Dkk-1的氨基酸序列和编码其的核苷酸(美国专利号6,344,541、6844422、7,057,017；公布专利申请号20050069915；Krupnick等，Gene 238:301-313(1999))。人们认为Dkk-1在人中的表达局限于胎盘，从而表明Dkk-1在胚胎发育中具有作用(Krupnick等，见上文)。Allen和同事(美国公布专利申请号20040038860)描述了与LRP5、HBM或LRP6与Dkk-1之间的相互作用有关的测定。结合Dkk-1的抗体已描述于上述专利和专利申请以及美国公布专利申请号20050079173和20060127393中。

人Dkk-1是Dickkopf基因家族的成员，所述家族包括Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3和Dkk4(Krupnick等，见上文)。尽管已显示Dkk-1和Dkk-4抑制非洲爪蟾(Xenopus)胚胎中由Wnt-诱导的二级轴诱导，但此二者皆不会阻断由非洲爪蟾蓬乱蛋白(Dishevelled)或卷曲蛋白(Frizzled)触发的轴诱导，从而表明其Wnt抑制活性在Wnt信号传导途径中是位于卷曲蛋白上游(Krupnick等，见上文)。已表明，Dkk-1可对骨形成具有抑制作用，从而使其成为预防或治疗骨质疏松症的潜在靶标(Patel和Karensky,N.Eng.J.Med.346:1572-1573(2002)；Boyden等，N.Eng.J.Med.346:1513-1521(2002))。

发明概述

本文提供有效治疗需要增加造骨的病状(例如，骨折修复或与病理性病状如多发性骨髓瘤相关的骨损失)的新颖抑制剂。另外，本文提供增加骨合成代谢的多特异性药剂，其包括DKK-1与硬化蛋白抑制剂的组合。所述组合可用于治疗(例如)骨质疏松症，加速骨折愈合，和用于许多需要增加造骨速率的病状。具体地说，DKK-1抑制剂和硬化蛋白抑制剂可以是两种单独抑制剂，例如，抗硬化蛋白抗体和抗DKK-1抗体。或者，DKK-1抑制剂和硬化蛋白抑制剂可为单分子实体。非限制性实例包括双特异性结合分子，如DVD-Ig、双特异性抗体和双特异性连接体。

在这个实施方案的一个方面中，适于用本发明分子治疗的患者是罹患转移至骨的癌症者，且在另一方面中，患者是罹患多发性骨髓瘤者。在又一方面中，患者是选自患有骨质疏松症、骨量减少、佩吉特氏病(Paget′s disease)、牙周炎、类风湿性关节炎和因活动抑制(immobilization)所致的骨损失的患者。在其它实施方案中，患者是选自患有可能或可能不因潜在骨质量损失引起的骨损害者，所述骨质量损失如由与癌症(例如，多发性骨髓瘤)相关的骨质疏松症或溶骨性病变所造成。此骨损害的实例包括(但不限于)矫形外科程序、牙科程序、植入手术、关节置换(例如，髋关节置换、膝关节置换等)、骨移植、骨整容手术和骨修复，如骨折愈合、不连接愈合(nonunion healing)、延迟性连接愈合(delayed union healing)和面部重建。可在所述程序、置换、移植、手术或修复之前、期间和/或之后施用一种或多种组合物。

在一个实施方案中，提供包含多肽链的结合分子，其中所述多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1二者。

在另一实施方案中，提供包含多肽链的结合分子，其中所述多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中：VL1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1二者。

在又一实施方案中，提供包含第一和第二多肽链的结合分子，其中所述第一多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中VH1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1。

在另一实施方案中，提供包含4条多肽链的结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中VH1和VH2重链可变结构域包含选自由以下结合剂组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408，且其中VL1和VL2轻链可变结构域包含选自由以下结合剂组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

在又一实施方案中，提供包含4条多肽链的结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子包含选自由以下组成的组的VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对：

SEQ ID NO:18与20；22与24；26与28；30与32；34与36；38与40；42与44；46与48；50与52；54与76；56与72；58与60；62与64；66与68；70与72；74与76；78与80；82与84；86与88；和90与92。

在另一实施方案中，提供包含4条多肽链的结合分子，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子包含3个VH1 CDR、3个VH2 CDR、3个VL1CDR和3个VL2 CDR，其中配对的VH1和VL1 CDR以及配对的VH2和VL2 CDR是选自由以下组成的组：SEQ ID NO:

97-102；105-110；113-118；121-126；129-134；137-142；145-150；153-158；161-166；169-174；177-182；185-190；193-198；201-206；209-214；217-222，

或SEQ ID NO:

225-230；233-238；241-246；249-254；257-262；265-270；273-278；281-286；289-294；297-302；305-310；313-318；321-326；329-334；337-342；345-350；353-358；361-366；369-374；377-382；385-390；393-398；401-406；409-414。

在另一实施方案中，提供产生结合硬化蛋白和DKK-1的结合分子的方法，其包括以下步骤：(a)获得可结合硬化蛋白或DKK-1的第一亲本抗体或其抗原结合部分；(b)获得可结合硬化蛋白或DKK-1的第二亲本抗体或其抗原结合部分；(c)构建包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n的第一和第三多肽链，其中：VH1是得自所述第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自所述第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，限制条件为其不为CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；(d)构建包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的第二和第四多肽链，其中：VL1是得自所述第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自所述第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；和(e)表达所述第一、第二、第三和第四多肽链，以产生结合硬化蛋白与DKK-1的结合分子。

在另一实施方案中，提供包含本发明结合分子的药物组合物。在又一实施方案中，提供本发明结合分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂的组合。

在一个实施方案中，提供治疗骨病症的方法，其包括向有需要的患者施用本发明的结合分子。在另一实施方案中，提供加速骨折修复的方法，其包括向有需要的患者施用本发明的结合分子。在另一实施方案中，提供增加骨密度的方法，其包括向有需要的患者施用本发明的结合分子。在又一实施方案中，提供增加骨强度的方法，其包括向有需要的患者施用本发明的结合分子。

在参照以下详细描述和附图后，本发明的这些和其它方面将变得显而易见。

附图简述

图1汇总对结合huDKK1或huScl的双特异性huAb的ELISA分析。

图2汇总对结合huDKK1或huScl的双特异性大鼠-Ab的ELISA分析。

图3汇总对同时结合huDKK1和huScl的双特异性Ab的ELISA分析。

图4汇总体外生物测定结果，其显示当使用相同摩尔比时，rAB-4-11H10与对照Mab具有类似的中和活性。

图5汇总来自体内研究的腰椎和全腿的骨质量密度(BMD)和骨矿物质含量(BMC)的变化百分比数据，其中所述体内研究使用用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKK1 mAb、抗硬化蛋白mAb与DKK1 mAb的组合和13C7-11H10双特异性试剂治疗的小鼠。

图6汇总对在用抗硬化蛋白/抗DKK-1组合疗法治疗后基因表达数据的分析。

图7和8汇总用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKK1 mAb、抗硬化蛋白mAb与DKK1 mAb的组合和13C7-11H10双特异性试剂治疗的小鼠的腰椎和股骨-胫骨的BMD变化百分比。

图9和10汇总来自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKK1 mAb、抗硬化蛋白mAb与DKK1 mAb的组合和13C7-11H10双特异性试剂治疗的小鼠的骨强度的变化百分比。

图11含有来自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKK1 mAb、抗硬化蛋白mAb与DKK1 mAb的组合和13C7-11H10双特异性试剂治疗的小鼠的小鼠股骨的剖面影像。

图12汇总扭转模型中来自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKK1mAb和DKK1 mAb以及13C7-11H10双特异性试剂治疗的大鼠的骨强度的变化百分比。

图13至14汇总来自用媒介物、6.147-2x-Ab5双特异性试剂、6.37-AbL-Ab23双特异性试剂、Ab5K-AbS-6.147双特异性试剂、6.147-AbL-27H6双特异性试剂和8G2-AbL-6.37.5双特异性试剂治疗的大鼠的腰椎和股骨-胫骨的BMD的变化百分比。

图15至16汇总来自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKK1 mAb和13C7-11H10双特异性试剂治疗的小鼠的骨强度的变化百分比。

图17汇总成骨细胞supertopflash竞争测定的结果，其显示大鼠13C7-11H10在用Wnt蛋白处理的成骨细胞MC3T3E1细胞中保持亲本抗体的中和活性。

图18汇总成骨细胞supertopflash竞争测定的结果，其显示大鼠和人DVD-Ig在用Wnt1蛋白处理的成骨细胞MC3T3E1STF细胞中具有针对硬化蛋白与Dkk1二者的有效中和活性。

图19汇总AlphaScreen竞争测定的结果，其显示DVD-Ig抑制Lrp6与硬化蛋白或Dkk1的结合。

图20是称为DVD-Ig的代表性双特异性结合分子的示意图。

发明详述

本文的各部分标题仅用于组织目的，且不应解释为限制本文所述的标的物。本申请中所引用的所有参考文献皆明确地以引用方式并入本文。除非本文另外定义，否则结合本发明所用的科学和技术术语应具有本领域的技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数含义且复数术语应包括单数含义。

本文提供有效治疗需要增加造骨的病状(例如，骨折修复或与病理性病状如多发性骨髓瘤相关的骨损失)的新颖双特异性分子。另外，本文提供增加骨合成代谢的药剂的组合，其包括DKK-1与硬化蛋白抑制剂的组合。所述组合可用于治疗(例如)骨质疏松症，增加骨折愈合速率，和用于许多需要增加造骨速率的病状。组合治疗剂可呈两种单独抑制剂的形式，例如抗硬化蛋白抗体和双特异性分子，或可以是单分子实体，例如双特异性结合分子。

报导指示Dkk-1表达在不连接骨折模型中有所升高(Bajada，等，2009 Bone;45(4):726-35.)。同样，健康骨表达较低水平的Dkk-1，此有助于解释单独Dkk-1抗体对完好骨的BMD的作用有限。因此，倘若愈合反应强得令人惊奇，包括峰值载荷在相对较短的时期内显著增加，则硬化蛋白与Dkk-1抑制剂的组合用于治疗骨折尤其有用。已意外地发现包含硬化蛋白与DKK-1二者的抑制剂的双特异性分子产生的生物反应比任一单独单一疗法都强。

如本文所用，双特异性分子在其两个结合区中的一者上结合一种抗原且在其第二结合区上结合不同抗原。因此，举例来说，双特异性抗体可具有两个不同抗原结合区且对于其所结合的每一抗原来说都是单价的。双特异性分子的又一非限制性实例是DVD-Ig，其在其两个臂的每一者上可具有两个不同抗原结合区，因此对于两种不同抗原来说都是二价的。本文所提供的双特异性和双功能性硬化蛋白和DKK-1结合分子可包括如本文所述的一个或多个CDR或一个或多个可变区。在一些情形下，双特异性或双功能性抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。所述双特异性抗体可通过多种方法(包括(但不限于)杂交瘤融合或连接Fab′片段)产生。例如，参见Songsivilai和Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等，1992,J.Immunol.148:1547-1553。

双特异性分子也可根据本发明通过融合产生。在一个实例中，可将其连接(例如，通过表达融合蛋白、化学连接、高亲和力非共价缔合等)至一种或多种其它结合分子。这些结合分子的实例包括(但不限于)另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以产生双特异性分子。

双特异性分子也可通过选择和/或工程改造特异性结合两种不同抗原(如DKK-1和硬化蛋白)的抗体来产生。例如，参见Bostrom等，2009，Science323:1610-1614。

双特异性分子也可包含对硬化蛋白的第一结合特异性和对第二靶标的第二结合特异性。举例来说，第二靶标可以是硬化蛋白的不同于第一表位的另一表位。另一实例是包含至少一种对硬化蛋白的第一结合特异性和对Dkk-1内的表位的第二结合特异性的双特异性分子。另一实例是包含至少一种对硬化蛋白的第一结合特异性和对LRP4内的表位的第二结合特异性的双特异性分子。另外，对于双特异性分子具有多特异性的本发明来说，所述分子除包括第一和第二靶表位外，还可进一步包括第三结合特异性。

双特异性结合剂的形式

在一个方面中，本发明的特征在于包含抗硬化蛋白结合剂和抗DKK1结合剂或其片段的双特异性或多特异性分子。可将本发明抗体或其抗原结合区衍生至或连接至另一功能分子，例如，另一肽或蛋白(例如，受体的另一抗体或配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。实际上，可将本发明抗体衍生至或连接至超过一种的其它功能分子以产生结合超过两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这些多特异性分子也意欲由本文所用的术语“双特异性分子”或“双特异性结合分子”或“双特异性结合蛋白”所涵盖。

为产生本发明的双特异性分子，可将本发明抗体功能性连接(例如，通过化合偶合、基因融合、非共价缔合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以产生双特异性分子。

因此，本发明包括包含至少一种对硬化蛋白的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。举例来说，第二靶表位是硬化蛋白的不同于第一靶表位的另一表位。另一实例是包含至少一种对硬化蛋白的第一结合特异性和对Dkk-1内的表位的第二结合特异性的双特异性分子。另一实例是包含至少一种对硬化蛋白的第一结合特异性和对LRP4内的表位的第二结合特异性的双特异性分子。另外，对于双特异性分子具有多特异性的本发明来说，所述分子除包括第一和第二靶表位外，还可进一步包括第三结合特异性。

在某些实施方案中，双特异性形式是双可变结构域(DVD)Ig。在某些实施方案中，DVD-Ig形式在免疫球蛋白上的每一臂上包含两个可变结构域，从而获得每分子总共4个可变结构域。在一个实施方案中，本发明结合蛋白是包含4条多肽链的能够结合两个抗原的DVD-Ig，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中VH1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域。所涵盖组合的非限制性实例在本文中提供于表1的SEQ ID NO:17-92中，其描述了DVD-Ig重链和轻链的核酸和氨基酸序列。然而，涵盖本文所提供的抗体或其片段(包括CDR)的任何组合。

DVD-Ig的非限制性实例可参见美国专利号7,612,181、美国专利申请公布号US 20110008766A1、US 20090311253A1、US20100047239A1、US 20090215992A1、US 20070081996A1、US20070071675A1、US 20070041905A1、US 20100260668A1、US20100076178A1、US 20090304693A1、US 20090311253A1和US20100233079A1。DVD-Ig的其它非限制性实例可参见国际专利申请公布号WO 2007024715A2、WO 2008024188A2、WO 2009134776A2、WO 2009149185A2、WO 2009149189A2、WO 2010065882A1、WO2010127284A2和WO 2010127294A2。

术语“接头”用于表示包含两个或更多个通过肽键接合的氨基酸残基的多肽且任选地用于连接一个或多个抗原结合部分。这些接头多肽为本领域中所熟知(例如，参见Holliger,P.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等(1994)Structure2:1121-1123)。举例来说，DVD-Ig的X1可以是选自本文表1中所述接头序列中的任一者的接头。

在具体实施方案中，接头可经过突变以进行氨基酸取代，从而改变其性质。举例来说，对于包含AbL接头的DVD-Ig来说，可观察到O-糖基化。为解决此问题，可将一个或多个Ser或Thr残基(下文带下划线者)改变为甘氨酸(Gly；G)或谷氨酰胺(Gln；Q)，这取决于每一DVD-Ig中发生O-糖基化的具体位点，如通过肽作图所确定。

ASTKGPSVFPLAP HC

TVAAPSVFIFPP LC

QPKAAPSVTLFPP LC

可在重链接头和轻链接头的任一者或二者中取代位点。

在一个实施方案中，结合蛋白不包含X2。在另一实施方案中，X1是接头，限制条件为其不为CH1。

在一个实施方案中，可变重链与可变轻链二者皆包含相同接头。在另一实施方案中，可变重链与可变轻链包含不同接头。在另一实施方案中，可变重链与可变轻链二者皆包含短(约6个氨基酸或更短)接头。在另一实施方案中，可变重链与可变轻链二者皆包含长(多于6个氨基酸)接头。在另一实施方案中，可变重链包含短接头且可变轻链包含长接头。在另一实施方案中，可变重链包含长接头且可变轻链包含短接头。

在某些实施方案中，双特异性形式是进一步包含结合硬化蛋白或DKK-1的单体结构域的免疫球蛋白。例如，参见美国专利号7,503,907和7,820,790和美国专利公布号20040175756、20050048512、20050053973和20060223114。在一个实施方案中，双特异性分子包含多个单体结构域，或者称为高亲和性聚合体(avimer)。高亲和性聚合体包含两个或更多个各自为30个至35个氨基酸的通过接头肽连结的肽序列。在某些实施方案中，个别序列是衍生自各种膜受体的A结构域且具有通过二硫键和钙稳定的刚性结构。在一些实施方案中，每一A结构域可结合靶蛋白的某一表位。结合相同蛋白的不同表位的结构域的组合会增加与此蛋白的亲和力，即称为亲合力的作用。在一个实施方案中，单体结构域或高亲和性聚合体是位于免疫球蛋白的Fc区内。

在某些实施方案中，双特异性形式是连接体(linkerbody)。“连接体”是二价、双特异性抗体。连接体是通过使用接头接合抗体的VL与其各别重链来构建的。可通过在每一重链的Fc中引入相反电荷对突变使分别代表对DKK和硬化蛋白的特异性的两半结合在一起。举例来说，第一Fc含有392D和409D，而第二Fc含有356K和359K(例如，参见Kannan Gunasekhran等，J.Biol Chem，2010年6月)。

在某些实施方案中，双特异性形式包含肽结合区(例如肽模拟物)。也提供基于本文所述的可变区结构域和CDR的模拟物(例如，“肽模拟物”或“拟肽”)。这些类似物可为肽、非肽或肽与非肽区的组合。Fauchere,1986,Adv.Drug Res.15:29；Veber和Freidinger,1985,TINS第392页；和Evans等，1987,J.Med.Chem.30:1229，所述文献出于任何目的以引用方式并入本文。可使用在结构上与在治疗上有用的多肽相类似的肽模拟物来产生类似治疗性或预防性作用。这些化合物经常是借助计算机化分子建模来开发的。通常，本发明的拟肽是在结构上与显示期望的生物学活性(如此处能够特异性结合Dkk-1或硬化蛋白)的抗体类似，但一个或多个肽键联任选地通过本领域中熟知的方法置换为选自以下的键联的蛋白：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH.2--、--CH--CH-(顺和反)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸置换L-赖氨酸)可在本发明的某些实施方案中用于产生更稳定的蛋白。另外，包含共有序列或实质上一致的共有序列变化的限制性肽可通过本领域中已知的方法来产生(Rizo和Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem.61:387，以引用方式并入本文)；举例来说，通过添加能够形成可使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基。

在某些实施方案中，双特异性结合分子是双特异性双功能抗体。双特异性双功能抗体(Db)利用双功能抗体形式进行表达。双功能抗体是通过将连结VH和VL结构域的接头的长度减至约5个残基自scFv片段产生的(参见Peipp,M.和T.Valerius(2002)Biochem.Soc.Trans.30(4):507-11)。接头大小的这种减小有助于通过VH和VL结构域的交叉配对使两条多肽链二聚化。双特异性双功能抗体是通过在相同细胞内表达两条具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的多肽链来产生。过去已产生众多种不同的双特异性双功能抗体，且其中的大多数是在细菌中以可溶形式表达。然而，最近的比较研究证明，可变结构域的取向可影响活性结合位点的表达和形成(参见Mack,M.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(15):7021-5)。然而，相对于串联scFv分子，细菌中的可溶表达代表重要优点。然而，由于在单一细胞中表达两条不同多肽链，因此无活性同源二聚体可连同活性异源二聚体一起产生。这使得需要实施另外的纯化步骤来获得双特异性双功能抗体的同源制剂。一种促使双特异性双功能抗体产生的方法是产生隆凸与孔洞(knob-into-hole)双功能抗体(参见Holliger,P.,T.Prospero和G.Winter(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(14):6444-8.18)。证明此方法可用于针对HER2和CD3的双特异性双功能抗体。通过用Phe交换Va137和用Trp交换Leu45在VH结构域中引入大隆凸，且通过在抗HER2或抗CD3可变结构域中使Phe98突变成Met和使Tyr87突变成Ala在VL结构域中产生互补孔洞。通过使用此方法，可使双特异性双功能抗体的产生自72%(以亲本双功能抗体计)增加至超过90%(以隆凸与孔洞双功能抗体计)。也已将双功能抗体融合至Fc以产生更多称为二-双功能抗体的Ig样分子(参见Lu,D.，等(2004)J.Biol.Chem.279(4):2856-65)。另外，前人已描述在IgG的重链中包含两个Fab重复且能够结合4个抗原分子的多价抗体构建体(参见WO 0177342A1和Miller,K.，等(2003)J.Immunol.170(9):4854-61)。

在某些实施方案中，双特异性结合分子可属于多特异性结合分子。此形式的非限制性实例可参见国际专利申请公布号WO2009018386A1和美国专利申请公布号US 20090155275。

在某些实施方案中，双特异性形式是结构域抗体。“结构域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫学功能性免疫球蛋白片段。在一些情形下，两个或更多个VH区与肽接头共价接合以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同抗原。例如，参见美国专利公布号20100234570和20040219643A1。

在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，抗体片段包括(例如)来自本文所提供的新颖双特异性分子序列的Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。其也可为轻链或重链二聚体或任何最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等，美国专利号4,946,778中所述。

双特异性分子可通过使用本领域中已知的方法使结合部分化学偶联来制备。当结合部分是蛋白或肽时，可使用多种偶合剂或交联剂进行共价偶联。实例包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5′-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-l-甲酸磺基琥珀酰亚氨基酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpovsky等，1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其它方法包括以下文献中所述者：Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.第78期,118-132；Brennan等，1985 Science 229:81-83和Glennie等，1987 J.Immunol.139:2367-2375。偶联剂包括SATA和磺基-SMCC，二者皆购自Pierce Chemical公司(Rockford,IL)。当结合部分是抗体时，其可通过两条重链的铰链区的巯基键结来偶联。在一个实施方案中，铰链区经过修饰以含有奇数个巯基残基，以使得存在未与对应重链或轻链对等部分形成二硫键联的游离巯基。

双特异性分子可包含至少两种单链分子。制备双特异性分子的方法的非限制性实例描述于各种专利公布中，包括美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；美国专利号5,482,858和美国专利申请号2010/0076178。

或者，两个结合部分皆可在同一载体中编码且在同一宿主细胞中表达并组装。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(abl):!或配体×Fab融合蛋白时，此方法尤其有用。本发明的双特异性分子可以是包含一种单链抗体和一种结合决定簇的单链分子或包含两种结合决定簇的单链双特异性分子。

本文公开结合硬化蛋白和DKK-1的抗体的非限制性实例。本领域的技术人员应了解，本文所述的抗体可用于本发明的双特异性分子的背景下。

双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过(例如)以下测定来证实:酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或蛋白质免疫印迹(Western Blot)测定。所述测定中的每一者通常通过采用对相关复合物具有特异性的标记试剂(例如，抗体)来检测特别关注的蛋白-抗体复合物的存在。

硬化蛋白结合分子

本发明提供可用于本发明的双特异性分子中的硬化蛋白结合分子。在某些实施方案中，硬化蛋白结合分子是抗体或其片段。在某些实施方案中，双特异性分子包含本文所述免疫球蛋白的VH和/或VL结构域。在其它实施方案中，双特异性分子包含轻链CDR1、CDR2、CDR3中的至少一者和至少一个重链CDR1、CDR2或CDR3。硬化蛋白结合分子的CDR序列的非限制性实例提供于本文表1中。

所提供双特异性分子的硬化蛋白结合组分可包括表1中所列CDR中的一者、二者、三者、四者、五者或六者。预期双特异性分子可包括来自上文所列单一抗体的两个或更多个CDR、或来自上文所列抗体的任何组合的两个或更多个CDR。一些硬化蛋白结合组分包括轻链CDR3与重链CDR3二者。某些硬化蛋白结合组分具有表1中所列CDR的变异体形式，其中一个或多个(即，2个、3个、4个、5个或6个)CDR各自与表1中所列的CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。举例来说，硬化蛋白结合组分可包括轻链CDR3与重链CDR3二者，其各自分别与表1中所列的轻链CDR3序列和重链CDR3具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。一些所提供硬化蛋白结合组分的CDR序列也可与表1中所列的CDR序列不同，以使得任何给定CDR的氨基酸序列与表1中所列的序列相差不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基。与所列序列的差异通常是(但不限于)保守取代。

进一步预期本文所述轻链中的每一者可与本文所述重链中的任一者组合以形成双特异性分子的硬化蛋白结合组分。本文所提供的某些硬化蛋白结合组分包含轻链可变结构域，所述结构域包含与本文所提供轻链可变结构域的序列相差仅1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸残基的氨基酸序列，其中每一此序列差异皆独立地是一个氨基酸的缺失、插入或取代、或其组合。某些硬化蛋白结合组分中的轻链可变区包含与本文所提供轻链可变区的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列一致性的氨基酸序列。

本文所提供的某些硬化蛋白结合组分包含重链可变结构域，所述结构域包含与本文所提供重链可变结构域的序列相差仅1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸残基的氨基酸序列，其中每一此序列差异皆独立地是一个氨基酸的缺失、插入或取代、或其组合。某些硬化蛋白结合组分中的重链可变区包含与本文所提供重链可变区的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，双特异性分子的结合硬化蛋白的部分是选自公开于美国专利号7,744,874、美国专利号7,592,429和美国专利申请公布号2009/0130113中的那些硬化蛋白结合分子。在一个具体实施方案中，涵盖包含来自上文专利和专利申请中所公开的抗体的结合硬化蛋白的VH和VL的DVD-Ig。

DKK-1结合剂

本发明提供可用于本发明的双特异性分子中的DKK-1结合分子。在某些实施方案中，DKK-1结合分子是抗体或其片段。在某些实施方案中，双特异性分子包含本文所述免疫球蛋白的VH和/或VL结构域。在其它实施方案中，双特异性分子包含轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2或CDR3中的至少一者。DKK-1结合分子的CDR序列的非限制性实例提供于表1中。

所提供双特异性分子的DKK-1结合组分可包括表1中所列CDR中的一者、二者、三者、四者、五者或六者。预期双特异性分子可包括来自表1中所列单一抗体的两个或更多个CDR、或来自表1中所列抗体的任何组合的两个或更多个CDR。一些DKK-1结合组分包括轻链CDR3与重链CDR3二者。某些DKK-1结合组分具有表1中所列CDR的变异体形式，其中一个或多个(即，2个、3个、4个、5个或6个)CDR各自与表1中所列的CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。举例来说，DKK-1结合组分可包括轻链CDR3与重链CDR3二者，其各自分别与表1中所列的轻链CDR3序列和重链CDR3具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。一些所提供DKK-1结合组分的CDR序列也可与表1中所列的CDR序列不同，以使得任何给定CDR的氨基酸序列与表1中所列的序列相差不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基。与所列序列的差异通常是(但不限于)保守取代。

进一步涵盖本文所述轻链中的每一者可与本文所述重链中的任一者组合以形成双特异性分子的DKK-1结合组分。本文所提供的某些DKK-1结合组分包含轻链可变结构域，所述结构域包含与本文所提供轻链可变结构域的序列相差仅1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸残基的氨基酸序列，其中每一此序列差异皆独立地是一个氨基酸的缺失、插入或取代、或其组合。某些DKK-1结合组分中的轻链可变区包含与本文所提供轻链可变区的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的氨基酸序列。

本文所提供的某些DKK-1结合组分包含重链可变结构域，所述结构域包含与本文所提供重链可变结构域的序列相差仅1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸残基的氨基酸序列，其中每一此序列差异皆独立地是一个氨基酸的缺失、插入或取代、或其组合。某些DKK-1结合组分中的重链可变区包含与本文所提供重链可变区的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，双特异性分子的结合DKK-1的部分是选自公开于美国专利号7,709,611、美国专利公布号2008/0193449、美国专利号7,642,238、美国专利号7,700,101和WO 2007/084344中的那些DKK-1结合分子。在一个具体实施方案中，涵盖包含来自上述专利和专利申请中所公开的抗体的结合硬化蛋白的VH和VL的DVD-Ig。

抗体和结合表位

本发明的双特异性结合分子可包含本文所提供的抗硬化蛋白和抗DKK-1抗体和其片段。术语“抗体”是指可与完好抗体竞争与靶抗原特异性结合的任何同种型的完好免疫球蛋白或其片段，且包括(例如)嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。“抗体”是一种抗原结合蛋白。完好抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情形下，可包括较少链，如骆驼科动物(camelid)中可仅包含重链的天然抗体。抗体可仅源自单一来源，或可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可源自两种不同抗体，如下文所进一步阐述。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可通过重组DNA技术或通过完好抗体的酶促或化学裂解在杂交瘤中产生。除非另有说明，否则术语“抗体”除包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外也包括其衍生物、变异体、片段和突变蛋白。此外，除非明确排除，否则抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微小抗体、结构域抗体、合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(本文中有时称为“抗体偶联物”)和其片段。

天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每一此四聚体通常是由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一条全长“轻”链(在某些实施方案中，约25kDa)和一个全长“重”链(在某些实施方案中，约50-70kDa)。每一链的氨基端部分通常包括通常负责抗原识别的具有约100个至10个或更多个氨基酸的可变区。每一链的羧基端部分通常界定可负责作用功能的恒定区。通常将人轻链归类为κ轻链和λ轻链。通常将重链归类为μ、δ、γ、α或ε，且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干亚类，包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括(但不限于)IgM1和IgM2。同样可将IgA细分成亚类，包括(但不限于)IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区是由约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链也包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。例如，参见FundamentalImmunology Ch.7(Paul,W.编著，第二版Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的，其全部内容以引用方式并入本文)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗体结合位点。

可变区通常展现具有由三个超变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构。来自每一对的两条链的CDR是通过框架区对齐，这可使其能够与特定表位结合。自N端至C端，轻链可变区与重链可变区二者皆通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸在每一结构域中的分配通常是依照Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等，Nature,342:878-883(1989)的定义。

在某些实施方案中，在不存在抗体轻链下，抗体重链结合抗原。在某些实施方案中，在不存在抗体重链下，抗体轻链结合抗原。在某些实施方案中，在不存在抗体轻链下，抗体结合区结合抗原。在某些实施方案中，在不存在抗体重链下，抗体结合区结合抗原。在某些实施方案中，在不存在其它可变区下，个别可变区特异性结合抗原。

在某些实施方案中，对CDR的定义性描述和对包含抗体的结合位点的残基的鉴别是通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来达成。在某些实施方案中，这可通过那些本领域的技术人员已知的多种技术中的任一者(例如X射线结晶学)达成。在某些实施方案中，可采用各种分析方法来鉴别或接近CDR区。这些方法的实例包括(但不限于)Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和接触定义。

Kabat定义是对抗体中的残基编号的标准且通常用于鉴别CDR区。例如，参见Johnson和Wu，Nucleic Acids Res.,28:214-8(2000)。Chothia定义与Kabat定义类似，但Chothia定义考虑某些结构环区的位置。例如，参见Chothia等，J.Mol.Biol.,196:901-17(1986)；Chothia等，Nature,342:877-83(1989)。AbM定义使用模拟抗体结构的计算机程序整合套件(由Oxford Molecular Group制造)。例如，参见Martin等，Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272(1989)；“AbM^TM,A ComputerProgram for Modeling Variable Regions of Antibodies”，Oxford,UK;Oxford Moleculare有限公司。AbM定义使用知识数据库与从头算(abinitio)方法的组合自一级序列模拟抗体的三级结构，从头算方法如那些由Samudrala等，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using aCombined Hierarchical Approach”，PROTEINS,Structure,Function andGenetics增刊，3:194-198(1999)所述者。接触定义是基于对可获得复杂晶体结构的分析。例如，参见MacCallum等，J.Mol.Biol.,5:732-45(1996)。

按照惯例，通常将重链中的CDR区称为H1、H2和H3且沿自氨基端至羧基端的方向依序编号。通常将轻链中的CDR区称为L1、L2和L3且沿自氨基端至羧基端的方向依序编号。

术语“轻链”包括全长轻链和其具有足量可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域是位于多肽的氨基端处。轻链包括κ链和λ链。

术语“重链”包括全长重链和其具有足量可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域(CH1、CH2和CH3)。VH结构域是位于多肽的氨基端处，且CH结构域是位于羧基端处，其中CH3最靠近多肽的羧基端。重链可具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。

当认为抗体结合指定残基内(例如Dkk-1内)的表位时，举例来说，这意指所述抗体特异性结合由指定残基(例如，Dkk-1的指定区段)组成的多肽。这一抗体不一定接触Dkk-1内的每一残基。Dkk-1内的每一单一氨基酸取代或缺失也不一定显著影响结合亲和力。抗体的表位特异性可以多种方式来确定。举例来说，一种方法涉及测试一批约15个氨基酸的重叠肽，其涵盖Dkk-1的序列且相差小数目的氨基酸的增量(例如，3个氨基酸)。将所述肽固定于微量滴定盘的孔内。固定可通过将肽的一端生物素化来实现。任选地，相同肽的不同试样可于N端和C端处进行生物素化且出于比较目的固定于单独孔中。此可用于鉴别末端特异性抗体。任选地，可包括端接所关注特定氨基酸处的其它肽。此方法可用于鉴别针对Dkk-1的内部片段的末端特异性抗体。针对与各种肽中的每一者的特异性结合来筛选抗体或免疫学功能片段。表位定义为带有抗体显示特异性结合的所有肽所共有的氨基酸区段。

也提供结合位于Dkk-1的羧基端部分中的构象表位的抗体和其功能片段以用于本发明的双特异性分子。Dkk-1的羧基端含有几个半胱氨酸残基，所述残基形成产生几个环的二硫键簇。本发明提供用于本发明的双特异性分子中的抗体，其结合所述环中的二者，由此中和Dkk-1抑制Wnt活性的能力。用于本发明的双特异性分子中能够结合上述构象表位的示例性抗体是单克隆抗体11H10和1F11，各包含轻链和重链。用于本发明的双特异性分子中的其它实例可见于2010年10月27日申请的美国专利申请号61/407,128和2011年10月27日申请的国际专利申请号PCT/US 2011/058025。包含所述两个环的表位是由SEQID NO:190的半胱氨酸残基220与237之间和SEQ ID NO:190的半胱氨酸残基245与263之间的二硫键形成。因此，形成所述表位的两个环体包括SEQ ID NO:190的氨基酸221-236和246-262。所述环内参与结合的区段包括SEQ ID NO:190的氨基酸221-229和SEQ ID NO:190的氨基酸246-253。因此，本文所提供用于本发明的双特异性分子中的某些抗体和片段特异性结合上述区。举例来说，一些所述抗体和片段结合包含SEQ ID NO:190的氨基酸221至262或由其组成的肽。

竞争抗体

也提供可用于本发明双特异性结合分子中的抗体和其免疫功能片段，其与所例示抗体或功能片段中的一者竞争与Dkk-1或硬化蛋白的特异性结合。这些抗体和片段也可与所例示抗体中的一者结合相同表位。预期与所例示抗体或片段竞争或结合相同表位的抗体和片段显示类似功能性质。例示所抗体和片段包括本文所述者，包括本文列出的具有重链和轻链、可变区结构域和CDR者。在具体实施方案中，本发明涵盖双特异性结合分子，例如所提供的DVD-Ig(例如本发明的SEQ ID NO 17-92)，其包含所提供抗体的VH和VL，和与所述双特异性结合分子竞争结合的结合分子。结合竞争可以是针对DKK-1和/或硬化蛋白。竞争测定(例如Biacore测定)为本领域中所熟知。

每一个别免疫球蛋白链通常是由若干“免疫球蛋白结构域”构成，每一者由90个至110个左右氨基酸组成且具有特有折叠模式。所述结构域是构成抗体多肽的基本单元。在人中，IgA和IgD同种型含有4条重链和4条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；且IgM同种型含有5条重链和5条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负责作用功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。举例来说，IgG重链含有称为CH1、CH2和CH3的3个C区结构域。提供用于本发明的双特异性分子中的抗体可具有所述同种型和亚型中的任一者。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包括重链中的约120个至130个氨基端氨基酸和轻链中的约100个至110个氨基端氨基酸。在某些实施方案中，不同抗体的可变区的氨基酸序列即使在相同物种的抗体之间也有广泛不同。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。

术语“中和抗原结合蛋白”或“中和抗体”分别是指结合配体且防止或降低所述配体的生物学作用的用于本发明的双特异性分子中的抗原结合蛋白或抗体。这可通过(例如)直接阻断配体上的结合位点或通过结合配体且经由间接手段(例如配体中的结构或能量改变)改变配体的结合能力来达成。在一些实施方案中，所述术语也可表示防止所结合的蛋白实施生物学功能的抗原结合蛋白。在评估抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫学功能片段)的结合和/或特异性中，当过量抗体将结合配体的结合伴侣的量减少至少约1-20、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-98%、98-99%或更多(如体外竞争性结合分析中所测量)时，抗体或片段可实质上抑制配体与其结合伴侣的结合。在一些实施方案中，中和能力是经由竞争测定来表征和/或描述。在一些实施方案中，中和能力是按照IC₅₀或EC₅₀值来描述。

在某些实施方案中，提供用于本发明的双特异性分子中的抗体与硬化蛋白或Dkk-1的结合亲和力(Ka)是至少10⁴或10⁵/M x秒，如通过本领域中所熟知的技术(例如Biacore或KinExA)所测量。其它抗体的Ka是至少10⁶/M x秒、10⁷/M x秒、10⁸/M x秒或10⁹/M x秒。所提供的某些抗体具有低解离速率。举例来说，一些抗体的Koff是1x10^-4s-1、1x10^-5s-1或更低。

单克隆抗体可使用本领域中已知的任何技术来产生，例如通过在免疫方案完成后自转基因动物收获的脾细胞永生化来产生。可使用本领域中已知的任何技术使脾细胞永生化，例如通过将其与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合程序中的骨髓瘤细胞优选地不产生抗体，其具有高融合效率，且具有使其不能在某些仅支持期望融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中生长的酶缺陷。用于小鼠融合中的适宜细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXO Bul；用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210。可用于细胞融合的其它细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。

在一些情形下，杂交瘤细胞系是通过以下方式来产生：用Dkk-1免疫原对动物(例如具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)进行免疫；自免疫动物收获脾细胞；将所收获脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，由此产生杂交瘤细胞；自杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，且鉴别产生可结合Dkk-1多肽的抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系和通过其产生的抗Dkk-1单克隆抗体涵盖于本发明中。

由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可使用抗体技术内已知的任何有用技术来纯化。杂交瘤或mAb可进行进一步筛选以鉴别具有特定性质(例如阻断Wnt诱导的活性的能力)的mAb。这些筛选的实例提供于下文实例中。

也提供基于上述序列的嵌合和人源化抗体。用作治疗剂的单克隆抗体在使用前可以各种方式来修饰。一个实例是“嵌合”抗体，其是由来自不同抗体的蛋白区段构成的抗体，所述区段经过共价接合以产生功能性免疫球蛋白轻链或重链或其免疫学功能部分。通常，重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列一致或同源，而所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的对应序列一致或同源。关于与嵌合抗体有关的方法，例如，参见美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1985)。CDR移植描述于(例如)美国专利号6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101中。

通常，制备嵌合抗体的目标是产生使来自预期患者物种的氨基酸的数目最大化的嵌合体。一个实例是“CDR-移植”抗体，其中所述抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个互补决定区(CDR)，而所述抗体链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的对应序列一致或同源。对于在人中的应用来说，经常将来自啮齿类动物抗体的V区或所选CDR移植至人抗体中，以置换人抗体的天然V区或CDR。

一种有用类型的嵌合抗体是“人源化”抗体。通常，人源化抗体是自初始在非人动物中培育的单克隆抗体产生。此单克隆抗体中的通常来自抗体的非抗原识别部分的某些氨基酸残基经过修饰以与对应同种型的人抗体中的对应残基同源。人源化可(例如)使用各种方法通过用啮齿类动物可变区的至少一部分取代人抗体的对应区来实施(例如，参见美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等，1986,Nature321:522-25；Riechmann等，1988,Nature 332:323-27；Verhoeyen等，1988,Science 239:1534-36)。在某些实施方案中，来自除人以外的物种的恒定区可连同人可变区使用以产生杂交抗体。

也提供完全人抗体。多种方法可用于制备对给定抗原具有特异性的完全人抗体，而不使人暴露至所述抗原(“完全人抗体”)。实施完全人抗体的产生的一种手段是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源性Ig基因已去活的小鼠中是在小鼠(即可用任何期望抗原进行免疫的动物)中产生完全人单克隆抗体(MAb)的一种手段。使用完全人抗体可使有时可通过将小鼠Mab或小鼠衍生Mab作为治疗剂施用给人而引起的免疫原性和过敏反应最小化。

完全人抗体可通过对能够在内源性免疫球蛋白产生不存在下产生人抗体谱系的转基因动物(通常为小鼠)进行免疫来产生。用于此目的的抗原通常具有6个或更多个邻接氨基酸且任选地偶联至载体，例如半抗原。例如，参见Jakobovits等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-2555；Jakobovits等，1993,Nature 362:255-258；和Bruggermann等，1993,Year in Immunol.7:33。在这一方法的一个实例中，转基因动物是通过以下方式来产生：使其中编码小鼠免疫球蛋白重链和轻链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座失能且向小鼠基因组中插入含有编码人重链和轻链蛋白的基因座的人基因组DNA的大片段。然后将具有人免疫球蛋白基因座的不完全补体的部分修饰动物杂交以获得具有所有期望免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，所述转基因动物产生对免疫原具有免疫特异性但具有人而非鼠类氨基酸序列的抗体(包括可变区)。关于此方法的其它详情参见(例如)WO 96/33735和WO94/02602。与制备人抗体的转基因小鼠有关的其它方法描述于美国专利号5,545,807、6,713,610、6,673,986、6,162,963、5,545,807、6,300,129、6,255,458、5,877,397、5,874,299和5,545,806；PCT公布WO 91/10741、WO 90/04036和EP 546073B1和EP 546073A1中。

上述转基因小鼠(本文中称为“HuMab”小鼠)含有编码未重排人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微小基因座以及使内源性μ和.κ.链基因座去活的靶向突变(Lonberg等，1994,Nature368:856-859)。因此，小鼠展现降低的小鼠IgM或.κ.的表达和对免疫的反应，且引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG.κ.单克隆抗体(Lonberg等，见上文；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93;Harding和Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci764:536-546)。HuMab小鼠的制备详细地描述于以下文献中：Taylor等，1992,Nucleic Acids Research,20:6287-6295；Chen等，1993,International Immunology5:647-656；Tuaillon等，1994,J.Immunol.152:2912-2920；Lonberg等，1994,Nature368:856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology 113:49-101；Taylor等，1994,International Immunology 6:579-591；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N．Y Acad.Sci.764:536-546；Fishwild等，1996,NatureBiotechnology 14:845-851。进一步参见美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429以及美国专利号5,545,807；国际公布号WO 93/1227、WO 92/22646和WO 92/03918。用于在所述转基因小鼠中产生人抗体的技术也公开于WO 98/24893和Mendez等，1997,Nature Genetics 15:146-156中。举例来说，可使用HCO7和HCO12转基因小鼠品系来产生适用于本文的结合剂。

使用杂交瘤技术，可自转基因小鼠(例如那些上文所述者)产生并选择具有期望特异性的抗原特异性人MAb。可使用适宜载体和宿主细胞来克隆和表达这些抗体，或可自培养的杂交瘤细胞收获抗体。

完全人抗体也可衍生自噬菌体展示文库(如Hoogenboom等，1991,J.Mol.Biol.227:381；和Marks等，1991,J.Mol.Biol.222:581中所公开)。噬菌体展示技术经由以下方式来模拟免疫选择：在丝状噬菌体的表面上展示抗体谱系且随后通过其与所选抗原的结合来选择噬菌体。一种此类技术描述于PCT公布号WO 99/10494中，其描述使用这一方法来分离MPL-受体和msk-受体的高亲和力和功能性拮抗抗体。

本文提供的双特异性分子也可阻断或减少硬化蛋白和/或Dkk-1与LRP5和/或LRP6之间的结合，由此刺激至少一种与Wnt信号传导相关的活性。

也提供用于产生抗体和选择性结合剂的核酸分子、载体和宿主细胞。某些双特异性分子或片段包括表1中列出的1个、2个、3个、4个、5个或所有6个抗硬化蛋白或抗DKK-1抗体CDR，且在某些实施方案中，双特异性结合分子将包含总共12个CDR(6个来自VH且6个来自VL)。

也提供包括上述双特异性分子和片段中的任一者的药物组合物。这些组合物通常也包括缓冲剂、药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂或防腐剂。也提供上述抗体和片段在药物组合物或药剂的制备中的用途。

变异体

允许用于本发明的双特异性分子中的抗体或片段中的一些是上文所公开抗体和片段的变异体形式(例如，那些具有表1中列出的序列者)。举例来说，抗体或片段中的一些是在表1中列出的一个或多个重链或轻链可变区或CDR中具有一个或多个保守氨基酸取代者。

可基于共同侧链性质将天然氨基酸分成以下类别：1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)碱性：His、Lys、Arg；5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。保守氨基酸取代可涉及用相同类别的另一成员交换所述类别中一者的一个成员。保守氨基酸取代可涵盖非天然氨基酸残基，其通常是通过化学肽合成而非在生物系统中合成来纳入。所述残基包括拟肽和氨基酸部分的其它反转或倒置形式。

非保守取代可涉及用上述类别中一者的一个成员交换另一类别的一个成员。可将这些取代残基引入与人对应序列同源的区中，或引入所述分子的非同源区中。

在进行这些改变时，根据某些实施方案，可考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。蛋白的亲水性曲线是通过对每一氨基酸指配一数值(“亲水性指数”)且随后沿肽链重复地对所述值取平均值来计算。每一氨基酸已基于其疏水性和电荷特性指配亲水性指数。其是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

本领域中理解亲水性曲线在对蛋白赋予交互生物学功能上的重要性(例如，参见Kyte等，1982,J.Mol.Biol.157:105-131)。已知可将某些氨基酸取代为具有类似亲水性指数或分数的其它氨基酸且其仍保持类似生物学活性。在基于亲水性指数进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水性指数在+/-2内的氨基酸的取代。在本发明的一些方面中，包括那些在+/-1内者，且在本发明的其它方面中，包括那些在+/-0.5内者。

本领域中也理解，同样氨基酸的取代可基于亲水性有效地进行，尤其在由此产生的生物学功能蛋白或肽意欲用于免疫学实施方案中时，如在本情形下。在某些实施方案中，蛋白的最大局部平均亲水性(如通过其毗邻氨基酸的亲水性所控制)与其免疫原性和抗原结合或免疫原性(即与蛋白的生物学性质)相关联。

已将以下亲水性值指配给所述氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-1)；谷氨酸(+3.0+/-1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/-1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水性值在+/-2内的氨基酸的取代，在其它实施方案中，包括那些在+/-1内者，且在其它实施方案中，包括那些在+/-0.5内者。在一些情形下，也可基于亲水性鉴别来自一级氨基酸序列的表位。所述区也称为“表位核心区”。

本领域的技术人员将能使用常规技术来确定本文所述多肽的适宜变异体。本领域的技术人员可通过靶向据信对活性不重要的区域来鉴别分子中可进行改变而不破坏活性的适宜区域。本领域的技术人员也应能够鉴别分子中在类似多肽之间保守的残基和部分。在其它实施方案中，甚至可使可能对生物活性或结构重要的区域经受保守的氨基酸取代，而不会破坏生物学活性或不会不利地影响多肽结构。

另外，本领域的技术人员可回顾鉴别类似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。根据这一比较，可预测蛋白中与相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基的重要性。本领域的技术人员可选择化学上类似的氨基酸取代用于这些预测的重要氨基酸残基。

已有多个科学出版物致力于对二级结构的预测。参见Moult,1996,Curr.Op.，Biotech.7:422-427；Chou等，1974,Biochemistry13:222-245；Chou等，1974,Biochemistry113:211-222；Chou等，1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47:45-148；Chou等，1979,Ann.Rev.Biochem.47:251-276；和Chou等，1979,Biophys.J.26:367-384。然而，当前可使用计算机程序来辅助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性建模。举例来说，序列一致性大于30%或相似度大于40%的两个多肽或蛋白质经常具有相似的结构形态。蛋白质结构数据库(PDB)最新进展已增强对二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白结构中的潜在折叠数目。参见Holm等，1999,Nucl.Acid.Res.27:244-247。有人提出(Brenner等，1997,Curr.Op.Struct.Biol.7:369-376)，给定多肽或蛋白中的折叠数目有限，且一旦解析出结构的关键数目，即可更显著地提高结构预测的准确性。

预测二级结构的其它方法包括“线串(threading)”(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7:377-87；Sippl等，1996,Structure4:15-19)、“曲线分析”(Bowie等，1991,Science253:164-170；Gribskov等，1990,Meth.Enzym.183:146-159；Gribskov等，1987,Proc.Nat.Acad.Sci.84:4355-4358)以及“进化连接(evolutionary linkage)”(参见Holm,1999，见上文；和Brenner,1997，见上文)。

在本发明的一些实施方案中，进行如下氨基酸取代：其(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(4)赋予或改进这些多肽的其它物理化学或功能性质。举例来说，可在天然序列中进行单一或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守氨基酸取代)。可在抗体中位于形成分子间接触的结构域外侧的所述部分中进行取代。在这些实施方案中，可使用不会实质上改变亲本序列的结构特性的保守氨基酸取代(例如，不会扰乱表征亲本或天然抗体的二级结构的一个或多个置换氨基酸)。本领域中公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编著)，1984,W.H.New York:Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden和Tooze编著)，1991,NewYork:Garland Publishing；和Thornton等，1991,Nature354:105中，所述文献各自以引用方式并入本文。

本发明也涵盖与亲本多肽的氨基酸序列相比糖基化位点的数目和/或类型已经改变的本发明的双特异性分子的糖基化变异体。在某些实施方案中，抗体蛋白变异体包含数目大于或小于天然抗体的N-连接糖基化位点。N-连接糖基化位点的特征在于以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基。产生此序列的氨基酸残基的取代为N-连接碳水化合物链的添加提供潜在新位点。或者，消除或改变此序列的取代将防止存在于天然多肽中的N-连接碳水化合物链的添加。举例来说，可通过Asn的缺失或通过用不同氨基酸取代Asn来减少糖基化。在其它实施方案中，产生一个或多个新N-连接位点。抗体通常在Fc区中具有N-连接糖基化位点。

其它变异体包括半胱氨酸变异体，其中亲本或天然氨基酸序列中的一个或多个半胱氨酸残基自另一氨基酸(例如，丝氨酸)缺失或被其取代。半胱氨酸变异体尤其在抗体必须再折叠成生物学活性构形时有用。半胱氨酸变异体中的半胱氨酸残基可少于天然抗体，且通常具有偶数数目以使非成对半胱氨酸所致的相互作用最小化。

也提供基于本文所述可变区结构域和CDR的模拟物(例如，“肽模拟物”或“拟肽”)。所述类似物可为肽、非肽或肽与非肽区的组合。Fauchere,1986,Adv.Drug Res.15:29；Veber和Freidinger,1985,TINS第392页；和Evans等，1987,J.Med.Chem.30:1229，所述文献出于任何目的以引用方式并入本文。可使用在结构上与在治疗上有用的多肽相类似的肽模拟物来产生类似治疗性或预防性作用。经常借助计算机化分子建模来研发这些化合物。通常，本发明拟肽是在结构上与展示期望的生物学活性(例如此处能够特异性结合Dkk-1)的抗体类似，但具有一个或多个任选地通过本领域中熟知方法由选自以下的连接置换的肽连接的蛋白：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH.2--、--CH--CH-(顺和反)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸置换L-赖氨酸)可在本发明的某些实施方案中用于产生更稳定的蛋白。另外，包含共有序列或实质上一致的共有序列的限制性肽变化可通过本领域中已知的方法来产生(Rizo和Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem.61:387，以引用方式并入本文)；举例来说，通过添加能够形成可使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基。

也提供用于本文所述本发明的双特异性分子中的抗体和片段的衍生物。衍生抗体或片段可包含赋予抗体或片段期望性质(例如在特定应用中延长半衰期)的任何分子或物质。衍生抗体可包含(例如)可检测(或标记)部分(例如，放射性、比色、抗原或酶促分子、可检测珠粒(例如磁性或电子致密(例如，金)珠粒)或结合另一分子(例如，生物素或抗生蛋白链菌素(streptavidin)的分子))、治疗性或诊断性部分(例如，放射性、细胞毒性或药用活性部分)或增加抗体对于特定应用(例如，施用给个体，例如人个体，或其它体内或体外应用)的适宜性的分子。可用于衍生抗体的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。连接白蛋白且聚乙二醇化的抗体衍生物可使用本领域中的熟知技术来制备。在一个实施方案中，抗体是偶联或以其它方式连接至转甲状腺素蛋白(transthyretin)(TTR)或TTR变异体。TTR或TTR变异体可经过(例如)选自由以下组成的组的化学品化学修饰：葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。

其它衍生物包括双特异性分子或其片段与其它蛋白或多肽的共价或聚集偶联物，例如通过表达包含融合至双特异性分子多肽的N端或C端的异源多肽的重组融合蛋白。举例来说，偶联肽可为异源信号(或前导序列)多肽(例如，酵母α因子前导序列)或如表位标签等肽。含有双特异性分子的融合蛋白可包含被添加以促进分子的纯化或鉴别的肽(例如聚His)。也可将双特异性分子多肽连接至FLAG肽，如Hopp等，Bio/Technology6:1204,1988和美国专利号5,011,912中所述。FLAG肽具有高抗原性且提供由特异性单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，从而使得能够快速分析和便捷地纯化所表达的重组蛋白。可用于制备使FLAG肽融合至给定多肽的融合蛋白的试剂可自市面购得(Sigma,St.Louis,Mo.)。

本文所用术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。也包括这些多肽的含有可促进二聚化的铰链区的截短形式。包含Fc部分(和自其形成的寡聚体)的融合蛋白提供可在蛋白A或蛋白G管柱上通过亲和色谱便捷地纯化的优点。

描述于PCT申请WO 93/10151和美国专利号5,426,048和5,262,522(其中每一者以引用方式并入本文)中的一种适宜Fc多肽是自人IgG1抗体Fc区的N端铰链区延伸至天然C端的单链多肽。另一有用Fc多肽是美国专利号5,457,035和Baum等，1994,EMBO J.13:3992-4001中所述的Fc突变蛋白。此突变蛋白的氨基酸序列与WO93/10151中所呈现的天然Fc序列一致，只是氨基酸19已自Leu变为Ala，氨基酸20已自Leu变为Glu，且氨基酸22已自Gly变为Ala。突变蛋白所展现针对Fc受体的亲和力降低。

在其它实施方案中，可用如本文所公开的双特异性分子的重链和/或轻链的可变部分取代抗体重链和/或轻链的可变部分。

或者，寡聚体是包含多个双特异性分子多肽且具有或不具有肽接头(间隔肽)的融合蛋白。适宜的肽接头包括那些描述于美国专利号4,751,180和4,935,233中者。

制备寡聚双特异性分子衍生物的另一方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域是促进发现所述结构域的蛋白寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初是在若干种DNA-结合蛋白中鉴别出来的(Landschulz等，1988,Science240:1759)，且此后发现其存于多种不同蛋白中。已知亮氨酸拉链包括二聚化或三聚化的天然肽和其衍生物。适于产生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉链接构域的实例描述于PCT申请WO 94/10308中，且衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe等，1994,FEBS Letters344:191中，其以引用方式并入本文。修饰亮氨酸拉链的使用允许与其融合的异源蛋白进行稳定三聚化，此描述于Fanslow等，1994,Semin.Immunol.6:267-78中。在一种方法中，在适宜宿主细胞中表达包含融合至亮氨酸拉链肽的双特异性分子片段或衍生物的重组融合蛋白，且自培养物上清液回收形成的可溶性寡聚双特异性分子片段或衍生物。

在另一方面中，本发明提供具有至少1天的体外或体内(例如，当施用给人个体时)半衰期的双特异性分子。在一个实施方案中，抗体具有至少3天的半衰期。在另一实施方案中，抗体或其一部分具有4天或更长的半衰期。在另一实施方案中，抗体或其一部分具有8天或更长的半衰期。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合部分经过衍生或修饰以使其与未衍生或未修饰的抗体相比具有更长的半衰期。在另一实施方案中，抗体可含有点突变以延长血清半衰期，如WO00/09560中所述。

也提供编码本发明双特异性分子的多肽链或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体的核酸、足以用作鉴别、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的杂交探针、PCR引物或测序引物的多核苷酸、抑制多核苷酸表达的反义核酸和上述的互补序列。核酸可具有任何长度。其长度可为(例如)5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、750个、1,000个、1,500个、3,000个、5,000个或更多个核苷酸，和/或可包含一个或多个另外的序列(例如调控序列)，和/或为较大核酸(例如载体)的一部分。核酸可为单链或双链核酸且可包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变异体(例如肽核酸)。

可自已用Dkk-1或硬化蛋白或其免疫原性片段免疫的小鼠B细胞分离编码抗体多肽(例如重链或轻链、仅可变结构域、或全长)的DNA。可通过如聚合酶链反应(PCR)等常用程序来分离DNA。噬菌体展示是可制备抗体的衍生物的已知技术的另一实例。在一种方法中，为所关注抗体的组分的多肽是在任何适宜重组表达系统中表达，且使所表达多肽组装以形成抗体分子。

本发明进一步提供在特定杂交条件下与其它核酸杂交的核酸。杂交核酸的方法为本领域中所熟知。例如，参见Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定义，中等严谨杂交条件使用含有5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗溶液、含有约50%甲酰胺、6×SSC的杂交缓冲液和55℃的杂交温度(或其它类似杂交溶液，例如含有约50%甲酰胺者，且杂交温度为42℃)，且洗涤条件为60℃、0.5×SSC、0.1%SDS。严谨杂交条件在6×SSC中于45℃下杂交，随后在0.1×SSC、0.2%SDS中于68℃下洗涤一或多次。此外，本领域的技术人员可操作杂交和/或洗涤条件以提高或降低杂交严谨性，从而使得包含核苷酸序列彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致的核酸通常仍可相互杂交。

影响杂交条件选择的基本参数和设计适宜条件的指导描述于(例如)以下文献中：Sambrook、Fritsch和Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.，第9章和第11章；和Current Protocols in MolecularBiology,1995,Ausubel等编著，John Wiley&Sons公司，第2.10节和第6.3-6.4节)，且可由本领域的技术人员根据(例如)DNA的长度和/或碱基组成来容易地确定。

可通过突变向核酸中引入改变，由此在其所编码多肽的氨基酸序列中产生改变。可使用任何本领域中已知的技术来引入突变。在一个实施方案中，使用(例如)定点诱变方案来改变一个或多个特定氨基酸残基。在另一实施方案中，使用(例如)随机诱变方案来改变一个或多个随机选择的残基。无论采用何种制备方式，皆可表达突变体多肽并针对期望性质来筛选。

可将突变引入核酸中而不显著改变其所编码多肽的生物学活性。举例来说，可实施核苷酸取代，以在非必需氨基酸残基处导致氨基酸取代。或者，可向核酸中引入一个或多个突变以选择性改变其所编码多肽的生物学活性。举例来说，突变可定量或定性地改变生物学活性。定量改变的实例包括增加、降低或消除活性。定性改变的实例包括改变抗体的抗原特异性。

可对本文所述重链和轻链进行保守修饰(和对编码核酸进行对应修饰)以产生具有功能和生物化学特性的双特异性分子。达成这些修饰的方法描述于上文中。

涵盖与本发明的双特异性分子一起使用的单链抗体可通过经由氨基酸桥键(短肽接头)连接本文提供的重链和轻链可变结构域(Fv区)片段从而产生单多肽链来形成。这些单链Fv(scFv)可通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间来制备。可使所得多肽自身折叠以形成抗原结合单体，或其可形成多聚体(例如二聚体、三聚体、或四聚体)，此视两个可变结构域之间柔性接头的长度而定(Kortt等，1997,Prot.Eng.10:423；Kortt等，2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合包含不同VL和VH的多肽，可形成结合不同表位的多聚体scFv(Kriangkum等，2001,Biomol.Eng.18:31-40)。所研发用于产生单链抗体的技术包括那些描述于以下文献中者：美国专利号4,946,778；Bird,1988,Science242:423；Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward等，1989,Nature334:544,de Graaf等2002,Methods Mol Biol.178:379-87。

本发明的蛋白和其功能片段可以各种方式进一步修饰。举例来说，若欲将其用于治疗目的，则将其与聚乙二醇偶联(聚乙二醇化)以延长血清半衰期或增强蛋白递送。或者，可将标的抗体或其片段的V区与不同抗体分子的Fc区融合。用于此目的的Fc区可进行修饰以使其不结合补体，由此降低当使用融合蛋白作为治疗剂时诱导患者细胞溶解的可能性。另外，可将标的抗体或其功能片段与人血清白蛋白偶联以延长抗体或其片段的血清半衰期。本发明抗体或其片段的另一有用融合伴侣是转甲状腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，因此抗体-TTR融合蛋白可形成可增加其结合亲合力的多价抗体。

或者，本文所述抗体和片段的功能和/或生物化学特性的实质性修饰可通过在重链和轻链的氨基酸序列中产生取代来达成，所述取代在其对维持以下方面的作用上显著不同：(a)取代区域中分子骨架的结构，例如，呈折叠片或螺旋构形，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。“保守氨基酸取代”可涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，从而使得对所述位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有很少影响或没有影响。此外，多肽中的任何天然残基也可进行丙氨酸取代，如先前已针对丙氨酸扫描诱变所述。

标的抗体的氨基酸取代(无论保守抑或非保守)可由那些本领域的技术人员通过施加常规技术来实施。可使用氨基酸取代来鉴别本文所提供本发明的抗体或双特异性分子的重要残基，或增加或降低本发明的所述抗体或双特异性分子与人Dkk-1或硬化蛋白的亲和力或改进本文所述其它双特异性分子的结合亲和力。

表达

双特异性分子和功能片段可通过多种常用技术中的任一者来制备以表达表1中提供的核酸序列，或表达编码表1中提供的氨基酸序列中的任一者的核酸序列。

举例来说，双特异性分子可使用本领域中已知的任何技术通过重组表达系统产生。例如，参见Monoclonal Antibodies,Hybridomas:ANew Dimension in Biological Analyses,Kennet等(编著)Plenum Press,New York(1980):and Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Lane(编著)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。

本发明的双特异性分子可在杂交瘤细胞系中或在除杂交瘤以外的细胞系中表达。可使用编码抗体的表达构建体来转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。转化可使用将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法来实施，包括(例如)在病毒或噬菌体中包装多核苷酸和通过本领域中已知的转染程序用构建体转导宿主细胞，如由美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455所例示。所用最佳转化程序将视所转化宿主细胞的类型而定。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域中所熟知且包括(但不限于)葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中多核苷酸的囊封、混合核酸与带正电脂质和直接向细胞核中微注射DNA。

本发明的重组表达构建体通常包含编码包含以下中的一者或多者的多肽的核酸分子：重链恒定区(例如，CH1、CH2和/或CH3)；重链可变区和任选地至少一个或多个重链可变区；轻链恒定区；轻链可变区和任选地至少两个或更多个轻链可变区；双特异性分子的轻链或重链的一个或多个CDR；和任选地多个可变区之间的接头序列。使用标准连接技术将所述核酸序列插入合适表达载体中。在一些实施方案中，所用载体采用使用蛋白报告物(例如二氢叶酸还原酶)的蛋白-片段互补测定(例如，参见美国专利号6,270,964)。适宜表达载体可购自(例如)Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(先前为“Clontech”)。用于克隆和表达本发明的抗体和片段的其它有用载体包括那些描述于Bianchi和McGrew,Biotech Biotechnol Bioeng84(4):439-44(2003)中者。其它适宜表达载体论述于(例如)Methods Enzymol，第185卷(D.V.Goeddel编著)，1990,New York:Academic Press中，其以引用方式并入本文。

通常，任何宿主细胞中所用表达载体会含有用于质粒维持和外源核苷酸序列克隆和表达的序列。这些序列(统称为“侧接序列”)通常包括以下可操作连接的核苷酸序列中的一者或多者：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码多肽的核酸以进行表达的多接头区和可选标记物组件。

任选地，所述载体可含有“标签”编码序列，即，位于编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸序列编码聚His(例如，六His)；或另一“标签”，例如

、HA(来自流感病毒的血凝集素)或myc，存在用于所述标签的市售抗体。标签通常在抗体蛋白表达后与其融合，且可用作自宿主细胞亲和纯化抗体的手段。举例来说，可通过管柱色谱使用针对作为亲和力基质的标签的抗体来达成亲和纯化。任选地，随后可通过各种手段(例如使用某些裂解用肽酶)自纯化抗体多肽去除标签。

表达载体中的侧接序列可以是同源(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源(即，来自除宿主细胞物种或品系以外的物种)、杂交(即，来自一种以上来源的侧接序列的组合)、合成或天然的。因此，侧接序列的来源可为任何原核或真核有机体、任何脊椎动物或无脊椎动物有机体、或任何植物，限制条件为所述侧接序列在所述宿主细胞体系中起作用且可通过所述宿主细胞体系活化。

用于本发明的载体中的侧接序列可通过本领域中所熟知若干方法中的任一者来获得。通常，本文中所用的侧接序列已预先通过作图和/或通过限制性内切酶消化来确定且因此其可使用合适限制性内切酶自适当组织来源分离。在一些情况下，可知侧接序列的全核苷酸序列。在本文中，可使用用于核酸合成或克隆的本文所述方法来合成侧接序列。

倘若已知所有或仅一部分侧接序列时，则其可使用PCR和/或通过使用来自相同或另一物种的适宜寡核苷酸和/或侧接序列片段筛选基因组文库来获得。倘若未知侧接序列，则含有侧接序列的DNA片段可自可含有(例如)编码序列或甚至另一种或多种基因的较大片DNA分离。可通过限制性内切酶消化达成分离以产生适当的DNA片段，继而使用琼脂糖凝胶纯化、Qiagen

管柱色谱(Chatsworth, Calif.)或本领域的技术人员已知的其它方法实施分离。那些本领域的技术人员应易于明了用以完成此目的的适宜酶的选择。

复制起点通常为原核表达载体、尤其那些可购得者的一部分，并且所述起点有助于载体在宿主细胞中的扩增。若所选载体不含复制起点，则其可根据已知序列以化学方式合成并连接至所述载体中。举例来说，质粒pBR322(New England Biolabs,Beverly,Mass.)的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌(gram-negative bacteria)且多种起点(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒(例如HPV或BPV))可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般来说，哺乳动物表达载体不需要哺乳动物复制起点(举例来说，经常使用SV40起点，此仅是由于其含有早期启动子)。

本发明的表达和克隆载体通常将含有由宿主有机体识别且可操作地连接至编码双特异性分子或其免疫学功能片段的核酸的启动子。启动子是控制结构基因转录的位于结构基因的起始密码子上游(即，5′)的非转录序列(通常在约100bp至1000bp内)。习惯上，将启动子归为如下两类中的一类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子可因应培养条件的一些变化(例如，存在或不存在营养素和温度变化)而起始来自在其控制下的DNA的转录水平升高。另一方面，组成型启动子可起始连续基因产物产生；即，对基因表达有极小或没有实验控制。由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子为本领域中所熟知。通过限制酶消化自来源DNA去除启动子或通过聚合酶链反应扩增启动子并将期望启动子序列插入载体中，将适宜启动子可操作地连接至DNA编码双特异性分子。

与酵母菌宿主一起使用的适宜启动子也为本领域中所熟知。酵母菌增强子有利地与酵母菌启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的适宜启动子为本领域中所熟知且包括(但不限于)那些自如以下等病毒的基因组获得者：多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如，腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒和最佳猿病毒40(SV40)。其它适宜哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热激启动子和肌动蛋白启动子。

用于本发明的重组表达载体实践中的特定启动子包括(但不限于)：SV40早期启动子区(Bemoist和Chambon,1981,Nature 290:304-10)、CMV启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)的3′长端重复序列中所含启动子(Yamamoto等，1980,Cell 22:787-97)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444-45)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982,Nature 296:39-42)、如β-内酰胺酶启动子等原核表达载体(Villa-Kamaroff等，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75:3727-31)或tac启动子(DeBoer等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。也可使用展现组织特异性且已用于转基因动物中的以下动物转录控制区：胰腺腺泡细胞中活跃的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984,Cell 38:63946；Ornitz等，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399409；MacDonald,1987,Hepatology 7:425-515)、胰腺β细胞中活跃的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature 315:115-22)、睪丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中活跃的小鼠哺乳动物肿瘤病毒控制区(Leder等，1986,Cell 45:485-95)、肝中活跃的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987,Genes andDevel.1:268-76)、肝中活跃的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-48；Hammer等，1987,Science 235:53-58)、肝中活跃的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987,Genes andDevel.1:161-71)、骨髓细胞中活跃的β-球蛋白基因控制区(Mogram等，1985,Nature 315:338-40；Kollias等，1986,Cell 46:89-94)、脑中寡树突细胞中活跃的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987,Cell 48:703-12)、骨骼肌中活跃的肌凝蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985,Nature 314:283-86)、下丘脑中活跃的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986,Science 234:1372-78)和最具体来说淋巴样细胞中活跃的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984,Cell 38:647-58；Adames等，1985,Nature 318:533-38；Alexander等，1987,Mol.CellBiol.7:1436-44)。

可将增强子序列插入载体中以增加编码本发明的双特异性分子或其免疫学功能片段的核酸在更高等真核生物中的转录。增强子是作用于启动子以增加转录的DNA的顺式作用组件，其长度通常为约10-300bp。增强子是以相对独立的方式定向并定位。其已发现于转录单元的5′和3′。已知若干增强子序列可自哺乳动物基因(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)获得。也可使用来自病毒的增强子序列。SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强组件。尽管可将增强子在核酸分子的5′位或3′位剪接至载体中，但通常将其置于启动子的5′位点处。

在表达载体中，转录终止序列通常位于多肽编码区末端的3′处且可用于终止转录。用于在原核细胞中表达的转录终止序列依序为富含G-C的片段和聚-T序列。尽管所述序列可自文库容易地克隆或甚至作为载体的一部分购得，但其也可使用用于核酸合成的方法(例如，那些本文所述者)来容易地合成。

可选标记基因组件编码在选择性培养基中生长的宿主细胞存活和生长所需蛋白。用于表达载体中的典型选择标记基因编码以下蛋白：(a)赋予原核宿主细胞以抗生素或其它毒素(例如，安比西林(ampicillin)、四环素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin))抗性；(b)补足细胞的营养缺陷型不足；或(c)供给自复合培养基中无法获得的关键营养素。可选标记物的实例包括卡那霉素抗性基因、安比西林抗性基因和四环素抗性基因。细菌性新霉素(neomycin)抗性基因也可用于在原核宿主细胞与真核宿主细胞二者中选择。

可使用其它选择基因来扩增将表达的基因。扩增是不能以单一拷贝和高足够水平表达以允许细胞在某些选择条件下存活和生长的基因在连续世代重组细胞的染色体内串联重复的过程。哺乳动物的适宜可扩增可选标记物的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶。在所述标记物的应用中，在选择压力下放置哺乳动物细胞转化体，其中仅有所述转化体借助存于载体中的选择基因独特地适于存活。通过在连接增加培养基中选择剂的浓度的条件下培养转化细胞来施加选择压力，由此仅允许那些选择基因已经扩增的细胞存活。在所述情况下，毗邻于选择基因的DNA(例如编码本发明的双特异性分子的DNA)是与选择基因共扩增的。

核糖体结合位点通常为mRNA的翻译起始所需且其特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。所述组件通常位于启动子的3′处和欲表达多肽编码序列的5′处。

在一些情形下，举例来说，倘若期望在真核宿主细胞表达系统中进行糖基化，则各种前序列可进行操作以提高糖基化或产率。举例来说，可改变特定信号肽的肽酶裂解位点或添加前序列，这也可影响糖基化。最终蛋白产物可在-1位(相对于成熟蛋白的第一氨基酸)中具有随表达产生的一个或多个可能未完全去除的另外的氨基酸。举例来说，最终蛋白产物可具有在肽酶裂解位点中所发现附接至氨基端的一或两个氨基酸残基。或者，若酶在成熟多肽内的此区域处进行切割，则使用一些酶裂解位点可产生期望多肽的略截短但仍具有活性的形式。

倘若市售表达载体缺乏如上文所述期望侧接序列中的一些，则可通过将所述序列个别地连接至载体中来修饰所述载体。在已视需要对载体进行选择和修饰后，将编码双特异性分子或其免疫学功能片段的核酸分子插入载体的适当位点中。

将含有编码本发明抗体或其免疫学功能片段的序列的完整载体插入适宜宿主细胞中以供扩增和/或多肽表达。可通过常规方法来达成双特异性分子或其免疫学功能片段的表达载体至所选宿主细胞的转化，所述方法包括(例如)转染、感染、氯化钙、电穿孔、显微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖方法或其它已知技术。所选方法在一定程度上随欲用宿主细胞的类型而变化。所述方法和其它适宜方法为那些本领域的技术人员所熟知。

当在合适条件下培养时，转化的宿主细胞合成双特异性分子或其功能片段，随后可自培养基(若宿主细胞将所述双特异性分子或其功能片段分泌至培养基中)或直接自产生其的宿主细胞(若不分泌所述双特异性分子或其功能片段)收集所述双特异性分子或其功能片段。合适宿主细胞的选择应视各种因素而定，例如期望表达程度、活性(例如糖基化或磷酸化)所期望或所需的多肽修饰和折叠成生物活性分子的容易性。

可用作表达用宿主的哺乳动物细胞系为本领域中所熟知且包括(但不限于)许多可自美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection(ATCC))获得的永生化细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和诸多其它细胞系。在某些实施方案中，用于表达特定DNA构建体的最好的细胞系可通过以下方式来选择：测试各种细胞系以确定具有最高表达水平并产生具有组成型Dkk-1结合性质的抗体者。

制剂

在某些实施方案中，本发明也提供包含标的双特异性分子或其片段连同以下中的一者或多者的组合物：药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。这些组合物可含有有效量的双特异性分子或其免疫学功能片段。因此，也包括本文所提供的抗体和片段在药物组合物或药剂的制备中的用途。这些组合物可用于治疗多种疾病，如下文有关示例性应用的部分中所列者。

用于医药制剂的可接受的制剂组分在所用剂量和浓度下对接受者无毒。除所提供的双特异性分子、抗体和片段外，本发明组合物也可含有改进、维持或保持(例如)组合物的以下性质的组分：pH、渗透性、粘性、澄清度、色彩、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。用于配制药物组合物的适宜材料包括(但不限于)氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如乙酰盐、硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；增积剂(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯基吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普流尼克(pluronic)、PEG、山梨糖醇酐酯、聚山梨糖醇酯(例如聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80)、曲拉通(triton)、胺丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapol))；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物(优选地为氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药用佐剂。(参见Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，(A.R.Gennaro编著)，1990,MackPublishing Company)，其以引用方式并入本文。

药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可为水性或非水性。用于这些组合物的适宜媒介物或载剂包括注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，可能补充一般用于肠胃外施用的组合物中的其它材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它示例性媒介物。包含双特异性分子或其片段的组合物可由具有期望纯度的所选组合物与可选配制剂混合制备呈冻干饼或水溶液形式以供储存。此外，可使用适合赋形剂(例如蔗糖)将双特异性分子或其片段配制成冻干物。

制剂组分是以施用位点可接受的浓度存在。有利地使用缓冲液来将组合物维持在生理pH或略低pH，通常在约4.0至约8.5，或介于约5.0至8.0之间的pH范围内。药物组合物可包含pH约6.5-8.5的TRIS缓冲液，或pH约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，且可进一步包括山梨糖醇或其适宜取代物。

药物组合物可涉及有效量的双特异性分子或其片段与适于制造片剂的无毒赋形剂的混合物。可由片剂溶于灭菌水中或另一合适媒介物中来制备呈单位剂型的溶液。适宜赋形剂包括(但不限于)惰性材料，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶(acacia)；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。

其它药物组合物是呈持续或控制递送制剂形式。可使用配制多种其它持续或控制递送手段(例如脂质体载剂、生物可蚀性微粒或多孔珠粒和储积注射)的技术(参见例如PCT/US93/00829，其阐述用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放)。持续释放制剂可包括半透性聚合物基质的成形物品形式(例如薄膜或微胶囊)、聚酯、水凝胶、聚乳酸(美国专利号3,773,919和EP 058,481)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙基酯的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers 22:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981,J Biomed Mater Res 15:167-277和Langer,1982,Chem Tech 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，文献同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放组合物也可包括脂质体，其可通过本领域中已知的几种方法中的任一者制备。参见例如Eppstein等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692；EP036,676；EP 088,046和EP 143,949。

欲用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。可通过无菌滤膜过滤来达成灭菌。若组合物冻干，则可在冻干和复原之前或之后实施灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施方案中，将肠胃外组合物置于具有无菌进入埠的容器中，所述容器是(例如)具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶、或注射用即用型无菌预填充注射器。

在本发明的药物组合物已配制后，其可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存于无菌小瓶中。这些制剂可以即用形式或以在施用前复原的形式(例如，冻干)储存。

用于配制药物组合物的组分优选地具有高纯度且实质上不含潜在有害的污染物(例如，至少National Food(NF)级、通常至少分析级且更通常至少医药级)。此外，意欲体内使用的组合物通常是无菌的。就必须在使用前合成给定化合物的程度来说，所得产物通常实质上不含可在合成或纯化过程期间存在的任何潜在毒剂、尤其任何内毒素。用于肠胃外施用的组合物也是无菌的，实质上等渗的且是在GMP条件下制得。

本发明提供产生多剂量或单剂量施用单位的试剂盒。举例来说，本发明试剂盒各自可含有具有干燥蛋白的第一容器与具有水性稀释剂的第二容器二者，包括(例如)单和多室预填充注射器(例如，液体注射器、溶解注射器(lyosyringe)或无针注射器)。

本发明的药物组合物可肠胃外(通常通过注射)递送。可在以下部位进行注射：眼内、腹膜内、门静脉内、肌内、静脉内、鞘内、大脑内(实质内)、脑室内、动脉内、病灶内、病灶周围或皮下。滴眼剂可用于眼内施用。在一些情形下，注射可局限于治疗所欲靶向的一块或多块特定骨附近。对于肠胃外施用来说，抗体可以无热原肠胃外可接受的水溶液形式施用，所述溶液包含存于药学上可接受的媒介物中的所期望双特异性分子或其片段。尤其适宜的肠胃外注射用媒介物是无菌蒸馏水，其中将双特异性分子或其片段配制成无菌等渗溶液并以适宜方式保存。

可通过浓注或连接地通过输注、通过植入器件、持续释放系统或达成延长释放的其它构件来施用包含标的双特异性分子和其功能片段的药物组合物。也可经由植入上面已吸收或囊封有期望分子的膜、海绵或另一合适材料来局部施用药物组合物。倘若使用植入器件，则可将所述器件植入任一适宜组织或器官中，且可经由扩散、定时释放浓注或连续释放来递送期望分子。可用诸如以下等试剂来配制制剂：可注射微球、生物可蚀性粒子、聚合化合物(例如聚氨酸；聚乙醇酸；或共聚(乳酸/乙醇酸)(PLGA))、珠粒或脂质体，所述试剂可提供随后可经由储积注射递送的产物的受控或持续释放。具有玻尿酸的制剂具有延长在循环中的持续时间的作用。

包含双特异性分子或其功能片段的标的组合物可配制成用于吸入。在所述实施方案中，将双特异性分子配制成吸入用干燥粉末，或也可用推进剂将双特异性分子吸入溶液配制用于气溶胶递送，例如通过雾化。肺施用进一步描述于PCT/US94/001875中，其描述化学修饰蛋白的肺递送且其是以引用方式并入本文。

本发明的某些药物组合物可经由消化道(如口服)递送。可在存在或不存在那些通常用于复合如片剂和胶囊等固体剂型的载剂的情况下配制以此方式施用的标的双特异性分子或其片段。胶囊可设计成在胃肠道中某时释放制剂的活性部分，此时可使生物利用度最大化且使全身前降解最小化。可包括其它试剂以促进双特异性分子或其功能片段的吸收。对于口服施用来说，可使用修饰氨基酸来赋予消化酶抗性。也可使用稀释剂、矫味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和结合剂。

也可离体使用包含双特异性分子或其片段的标的组合物。在这些情形下，使自患者移出的细胞、组织或器官暴露于特异性分子或与其一起培养。然后可将培养细胞植回所述患者或不同患者中或用于其它目的。

在某些实施方案中，可使用如那些本文所述的方法等方法通过植入某些已遗传工程改造的细胞中来递送双特异性分子或其片段，以表达和分泌多肽。这些细胞可以是动物或人细胞，且可以是自体、异源或异种细胞，或可永生化。为降低免疫反应的机会，可将细胞囊封以避免周围组织的浸润。囊封材料通常是允许蛋白产物释放但防止患者的免疫系统或来自周围组织的其它有害因素破坏细胞的生物兼容性、半透性聚合外套或膜。

剂量

可施用所提供的药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。“有效量”通常是指活性成分(即，双特异性分子或其免疫学功能片段)达成期望作用的足够但无毒的量的量，所述期望作用是症状的严重程度和/或频率的降低或消除和/或损害的改良或治疗。“治疗有效量”是指足以治疗疾病状态或症状或以其它方式防止、阻碍、延缓或逆转疾病或任何其它不期望的症状的进展的量。“预防有效量”是指有效防止、阻碍或延缓疾病状态或症状发作的量。

一般来说，抗体或片段的毒性和治疗效能可根据标准医药程序在细胞培养物和/或实验动物中测定，包括(例如)测定LD50(群体中的50%死亡的剂量)和ED50(群体中的50%治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用间的剂量比是治疗指数且其可表示为比率LD50/ED50。展现大治疗指数的组合物优选。

可使用自细胞培养和动物研究获得的数据来配制用于人的剂量范围。活性成分的剂量通常在具有极低毒性或无毒性的循环浓度(包括ED50)的范围内。视所用剂型和所用施用途径而定，剂量可在此范围内变化。

欲在治疗上或预防上采用的包含双特异性分子或其片段的药物组合物的有效量应视(例如)治疗治疗背景和目标而定。因此，本领域的技术人员应了解，根据某些实施方案，用于治疗的合适剂量量可部分地视以下因素而定：所递送分子、使用双特异性分子的适应症、施用途径和患者的体型(体重、身体表面尺寸或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康情况)。临床医师可滴定剂量并改进施用途径以获得最好的治疗作用。典型剂量在约0.1μg/kg至最高约100mg/kg或更多的范围内，视上述因素而定。在某些实施方案中，剂量可在0.1μg/kg直至约150mg/kg或1μg/kg直至约100mg/kg或5μg/kg直至约50mg/kg的范围内。在某些实施方案中，剂量是至少0.1μg/kg。在某些实施方案中，剂量是至少1μg/kg。在某些实施方案中，剂量是至少5μg/kg。在某些实施方案中，剂量是至少5mg/kg。在某些实施方案中，剂量是至少10mg/kg。在某些实施方案中，剂量是至少50mg/kg。在某些实施方案中，剂量是至少100mg/kg。

施用频率应视制剂中双特异性分子或其免疫学功能片段的药物动力学参数而定。举例来说，临床医师应施用组合物直至达到达成期望作用的剂量。因此可以单次剂量施用组合物，或随时间以两次或更多次剂量施用(每次剂量可含有或可不含有相同量的期望分子)，或经由植入器件或导管以连续输注方式施用。可随时间连续或间歇地进行治疗。合适剂量的进一步细分是由那些本领域的技术人员以常规方式来实施且在其所实施的常规任务的范围内。可借助使用合适剂量反应数据来确定合适剂量。

为通过靶向硬化蛋白和/或Dkk-1治疗医学病症，可向患者施用一定量的包含标的双特异性分子或其片段的组合物且维持时间足以诱导至少一个反映病症严重程度的指标的持续改良。若患者展现对至少两个相隔至少1周至7周或在一些情形下1周至6周的时刻的改良，则将所述改良视为“持续”。合适间隔在某种程度上应视所治疗疾病状况而定；确定用于确定改良是否持续的合适间隔在熟练医师的范围内。改良程度是基于体征或症状来确定，且也可采用施用患者的调查问卷，例如生活质量调查问卷。

可评估反应患者疾患程度的各种指标以确定治疗的量和时间是否足够。通过在施用第一剂量的抗体之前检测患者来确定所选一个或多个指标的基线值。优选地，在施用第一剂量的约60天内实施基线检测。若抗体是施用来治疗急性症状，例如治疗骨折，则在已发生损伤后实际上尽可能快地施用第一剂量。

改良是通过施用标的双特异性分子或其片段直至患者对于所选一个或多个指标表达相对于基线的改良来诱导。在治疗慢性病状时，此改良程度是通过在至少一个月或更长时间的时段(例如，1个月、2个月或3个月或更长时间或无限期)内重复施用此药剂来获得。1周至6周时段或甚至单次剂量经常足以治疗急性病状。对于损伤或急性病状来说，单一剂量可能足够。

尽管患者在治疗后的疾患程度可根据一个或多个指标出现改良，但治疗可在相同量下或在减少剂量或频率下持续无限期。在治疗已减少或中断后，若症状会再次出现，则随后可以原始量重新开始治疗。

可使用标的双特异性分子和其片段来检测生物试样中的硬化蛋白和/或Dkk-1。这些用途允许鉴别产生蛋白的细胞或组织或用作检测硬化蛋白和/或Dkk-1过度产生或产生不足的病理性病状的诊断法。所提供的抗体和片段也可用于筛选结合硬化蛋白和/或Dkk-1的分子的方法。举例来说，可使用多种竞争性筛选方法。在一些方法中，使双特异性分子所结合的硬化蛋白和/或Dkk-1分子或其片段与本文所公开的抗体或片段以及另一分子(即，候选分子)接触。双特异性分子或片段与硬化蛋白和/或Dkk-1之间结合的减少是分子结合靶标的指标。双特异性分子或片段的结合可使用多种方法(例如，ELISA)来检测。双特异性分子或片段与靶标之间的结合的检测可通过以检测方式标记抗体来简化。在一些方法中，进一步分析在初始筛选展现结合的分子以确定其是否抑制硬化蛋白和/或Dkk-1活性(例如，所述分子是否活化Wnt信号传导)。

治疗方法和用途

在另一方面中，公开上述抗体或片段在治疗多种疾病中的用途。举例来说，某些方法涉及向有需要的患者施用有效量的本文所述的本发明双特异性分子或片段以治疗关节炎、因应干细胞更新的疾病、发炎性疾病、神经疾病、眼部疾病、肾脏疾病、肺部疾病和皮肤疾病。一些治疗方法涉及治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎或骨关节炎。使用某些抗体和片段来治疗以下疾病：(a)因应干细胞更新且是选自由以下组成的组的疾病：糖尿病、慢性心脏衰竭和肌肉疾病；(b)选自由以下组成的组的发炎性疾病：克隆氏病(Crohn′s disease)、结肠炎和发炎性肠病；(c)选自由以下组成的组的神经疾病：阿兹海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森氏病(Parkinson′s disease)和亨庭顿氏病(Huntington′s disease)；(d)选自由以下组成的组的眼部疾病：黄斑变性和视网膜病变；(e)选自由以下组成的组的肾脏疾病：末期肾脏疾病、慢性肾脏疾病、肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎和IgA肾病变；(f)选自由以下组成的组的肺部疾病：慢性阻塞性肺部疾病、特发性肺部纤维化和囊性纤维化；或(g)因化学疗法诱导的对肠上皮的损害所致的皮肤疾病。

本文进一步提供治疗或防止骨质量损失的方法，其包含向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的双特异性分子。在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含选自US 7,744,874、US 2009/0130113、US 7,592,429、US 2008/0193449、US 7,642,238和US 7,700,101中任一者中所述抗体的可变区或本文所述其免疫学功能片段。在所述实施方案的一个实施方案中，患者是罹患转移至骨的癌症者，且在另一方面中，患者是罹患多发性骨髓瘤者。

可通过本发明组合物治疗的特定病状包括发育不良，其中骨的生长或发育异常。这些病状的代表性实例包括软骨发育不全、锁骨颅骨发育不全、内生软骨瘤病、纤维性发育不良、高歇氏病(Gaucher′sDisease)、低血磷性佝偻症、马尔方氏综合症(Marfan′s syndrome)、多发性遗传性外生骨疣、神经纤维瘤病、成骨不全、骨硬化症、脆弱性骨硬化症、硬化性病灶、假关节和化脓性骨髓炎。

可治疗或预防的其它病状包括众多种原因的骨量减少、骨质疏松症和骨损失。这些病状的代表性实例包括牙周疾病、抗癫痫药物诱导的骨损失、原发性和继发性甲状旁腺功能亢进、家族性甲状旁腺功能亢进综合症、失重诱导的骨损失、男性的骨质疏松症、绝经后骨损失、骨关节炎、肾性骨营养不良、浸润性骨病、口骨损失、颌骨坏死、幼年型佩吉特氏病、肢骨纹状肥大、代谢性骨病、肥大细胞增多症、镰状细胞疾病、缺血性骨病(例如雷格-卡尔夫-柏斯氏病(Legg-Calve-Perthes disease)、局限性游走性骨质疏松症)、贫血状态、由类固醇引起的病状、糖皮质激素诱导的骨损失、肝素诱导的骨损失、骨髓病症、坏血病、营养不良、钙缺乏、特发性骨量减少或骨质疏松症、先天性骨量减少或骨质疏松症、酒精中毒、慢性肝病、绝经后状态、慢性发炎性病状、类风湿性关节炎、发炎性肠病、溃疡性结肠炎、发炎性结肠炎、克隆氏病、月经过少、闭经、妊娠病状、糖尿病、甲状腺机能亢进、甲状腺病、甲状旁腺病、库欣氏病(Cushing′s disease)、肢端肥大症、性腺功能减退症、活动抑制或废用(disuse)、反射性交感神经营养不良综合症、局限性骨质疏松症、骨软化症、关节置换相关性骨损失、HIV相关性骨损失、生长激素损失相关性骨损失、囊性纤维化相关性骨损失、纤维性发育不良、化学疗法相关性骨损失、肿瘤诱导的骨损失、癌症相关性骨损失、激素消融性骨损失、多发性骨髓瘤、药物诱导的骨损失、神经性厌食、疾病相关性面骨损失、疾病相关性颅骨损失、疾病相关性颌骨损失、疾病相关性头盖骨损失和太空旅行相关性骨损失。其它病状涉及衰老相关性骨损失，包括衰老相关性面骨损失、衰老相关性颅骨损失、衰老相关性颌骨损失和衰老相关性头盖骨损失。

本发明组合物也可用于改良以下的结果：矫形外科程序、牙科程序、植入手术、关节置换(例如，髋关节或膝关节)、骨移植、骨整容手术和骨修复(例如骨折愈合、不连接愈合、延迟性连接愈合和面部重建)。可在所述程序、置换、移植、手术或修复之前、期间和/或之后施用一种或多种组合物。

在某些实施方案中，设想本发明结合分子的局部递送，例如(但不限于)骨折位点、脊柱融合或牙科相关性适应症。在一个实施方案中，经由局部注射将结合分子递送至治疗位点。在另一实施方案中，将另外的结合序列添加至本发明结合分子以引导结合分子抵抗局限于骨细胞外基质的蛋白，此可改良于治疗位点的保留时间和结合分子的PK，由此改良效能。所述蛋白的非限制性实例包括(但不限于)1型胶原、骨唾液蛋白和牙本质基质蛋白。在某些实施方案中，另外的结合序列是结合局限于骨细胞基质的蛋白的结合肽或高亲和性聚合体序列。

以下是由本发明所涵盖具体实施方案的非限制性列表：

预期当VH1或来自VH1的CDR是选自硬化蛋白结合剂时，VH2或来自VH2的CDR是选自DKK-1结合剂。反之，当VH1或来自VH1的CDR是选自DKK-1结合剂时，VH2或来自VH2的CDR是选自硬化蛋白结合剂。进一步预期，当VL1或来自VL1的CDR是选自硬化蛋白结合剂时，VL2或来自VL2的CDR是选自DKK-1结合剂。反之，当VL1或来自VL1的CDR是选自DKK-1结合剂时，VL2或来自VL2的CDR是选自硬化蛋白结合剂。

1.一种包含多肽链的结合分子，其中所述多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1二者。

2.如实施方案1所述的结合分子，其中VH1和VH2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408。

3.一种包含多肽链的结合分子，其中所述多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中：VL1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1二者。

4.如实施方案3所述的结合分子，其中VL1和VL2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

5.如实施方案1或3所述的结合分子，其中(X2)n不存在。

6.一种包含第一和第二多肽链的结合分子，其中所述第一多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中VH1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1二者。

7.如实施方案6所述的结合分子，其中所述VH1和VH2重链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408，且其中所述VL1和VL2轻链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215或DKK-1结合剂SEQID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

8.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中(X1)n是选自由SEQID NO:415-482组成的组的氨基酸序列。

9.如实施方案6所述的结合分子，其中所述结合分子包含两条第一多肽链和两条第二多肽链。

10.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述Fc区是选自由天然序列Fc区和变异型序列Fc区组成的组。

11.如实施方案10所述的结合分子，其中所述Fc区是选自由来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fc区组成的组。

12.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH1和所述第二多肽链的所述VL1是得自相同亲本抗体或其抗原结合部分。

13.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH1和所述第二多肽链的所述VL1是得自不同亲本抗体或其抗原结合部分。

14.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH2和所述第二多肽链的所述VL2是得自相同亲本抗体或其抗原结合部分。

15.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH2和所述第二多肽链的所述VL2是得自不同亲本抗体或其抗原结合部分。

16.如实施方案1、3或6所述的结合分子，限制条件为所述接头(X1)n不为CH1。

17.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分以不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的效能结合所述第一抗原。

18.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分以不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的亲和力结合所述第一抗原。

19.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分是选自由人抗体、CDR移植抗体和人源化抗体组成的组。

20.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分是选自由以下组成的组：Fab片段；F(ab′)₂片段；二价片段，其包含于铰链区由二硫桥键连接的两个Fab片段；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段；经分离互补决定区(CDR)；单链抗体；和双功能抗体。

21.如实施方案1、3或6所述的结合分子，其中所述结合分子具有由所述第一亲本抗体或其抗原结合部分或所述第二亲本抗体或其抗原结合部分展现的至少一种期望性质。

22.如实施方案21所述的结合分子，其中所述期望性质是选自一个或多个抗体参数。

23.如实施方案21所述的结合分子，其中所述抗体参数是选自由以下组成的组：抗原特异性、与抗原的亲和力、效能、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。

24.一种包含4条多肽链的结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述VH1和VH2重链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408，且其中所述VL1和VL2轻链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ IDNO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

25.如实施方案24所述的结合分子，限制条件为所述接头(X1)n不为CH1。

26.一种包含4条多肽链的结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子包含选自由以下组成的组的VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对：

SEQ ID NO:18与20；22与24；26与28；30与32；34与36；38与40；42与44；46与48；50与52；54与76；56与72；58与60；62与64；66与68；70与72；74与76；78与80；82与84；86与88；90与92；486与488；490与492；和494与496。

27.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:18与20。

28.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:22与24。

29.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:26与28。

30.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:30与32。

31.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:34与36。

32.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:38与40。

33.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:42与44。

34.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:46与48。

35.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:50与52。

36.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:54与76。

37.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:56与72。

38.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:58与60。

39.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:62与64。

40.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:66与68。

41.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:70与72。

42.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:74与76。

43.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:78与80。

44.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:82与84。

45.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:86与88。

46.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:90与92。

47.如实施方案1、3和6所述的结合分子，其中所述硬化蛋白结合剂的VH包含3个选自由以下SEQ ID NO组成的组的CDR，其中每一组成员皆具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

100、101、102；108、109、110；116、117、118；124、125、126；132、133、134；140、141、142；148、149、150；156、157、158；164、165、166；172、173、174；180、181、182；188、189、190；196、197、198；204、205、206；212、213、214；和220、221、222，

且其中所述DKK1结合剂的VH包含3个选自由以下SEQ ID NO组成的组的CDR，其中每一组成成员具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

228、229、230；236、237、238；244、245、246；252、253、254；260、261、262；268、269、270；276、277、278；284、285、286；292、293、294；300、301、302；308、309、310；316、317、318；324、325、326；332、333、334；340、341、342；348、349、350；356、357、358；364、365、366；372、373、374；380、381、382；388、389、390；396、397、398；404、405、406；和412、413、414。

48.如实施方案1、3和6所述的结合分子，其中所述硬化蛋白结合剂的VL包含3个选自由以下SEQ ID NO组成的组的CDR，其中每一组成员皆具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

97、98、99；105、106、107；113、114、115；121、122、123；129、130、131；137、138、139；145、146、147；153、154、155；161、162、163；169、170、171；177、178、179；185、186、187；193、194、195；201、202、203；209、210、211；和217、218、219，

且其中所述DKK1结合剂的VL包含3个选自由以下SEQ ID NO组成的组的CDR，其中每一组成成员具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

a)225、226、227；233、234、235；241、242、243；249、250、251；257、258、259；265、266、267；273、274、275；281、282、283；289、290、291；297、298、299；305、306、307；313、314、315；321、322、323；329、330、331；337、338、339；345、346、347；353、354、355；361、362、363；369、370、371；377、378、379；385、386、387；393、394、395；401、402、403；和409、410、411。

49.如实施方案1、3和6所述的结合分子，其中所述硬化蛋白结合剂的VH包含3个选自由以下SEQ ID NO组成的组的CDR，其中每一组成员皆具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

100、101、102；108、109、110；116、117、118；124、125、126；132、133、134；140、141、142；148、149、150；156、157、158；164、165、166；172、173、174；180、181、182；188、189、190；196、197、198；204、205、206；212、213、214；和220、221、222，

且其中所述DKK1结合剂的VH包含3个选自由以下SEQ ID NO组成的组的CDR，其中每一组成成员具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

228、229、230；236、237、238；244、245、246；252、253、254；260、261、262；268、269、270；276、277、278；284、285、286；292、293、294；300、301、302；308、309、310；316、317、318；324、325、326；332、333、334；340、341、342；348、349、350；356、357、358；364、365、366；372、373、374；380、381、382；388、389、390；396、397、398；404、405、406；和412、413、414。

且其中所述硬化蛋白结合剂的VL包含3个选自由以下SEQ IDNO组成的组的CDR，其中每一组成成员具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

97、98、99；105、106、107；113、114、115；121、122、123；129、130、131；137、138、139；145、146、147；153、154、155；161、162、163；169、170、171；177、178、179；185、186、187；193、194、195；201、202、203；209、210、211；和217、218、219，

且其中所述DKK1结合剂的VL包含3个选自由以下SEQ ID NO组成的组的CDR，其中每一组成成员具有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)：

225、226、227；233、234、235；241、242、243；249、250、251；257、258、259；265、266、267；273、274、275；281、282、283；289、290、291；297、298、299；305、306、307；313、314、315；321、322、323；329、330、331；337、338、339；345、346、347；353、354、355；361、362、363；369、370、371；377、378、379；385、386、387；393、394、395；401、402、403；和409、410、411。

50.一种包含4条多肽链的结合分子，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子包含3个VH1 CDR、3个VH2 CDR、3个VL1 CDR和3个VL2 CDR，其中所述配对的VH1和VL1 CDR和配对的VH2和VL2 CDR是选自由以下组成的组：SEQ ID NO:

97-102；105-110；113-118；121-126；129-134；137-142；145-150；153-158；161-166；169-174；177-182；185-190；193-198；201-206；209-214；217-222，

或SEQ ID NO:

a)225-230；233-238；241-246；249-254；257-262；265-270；273-278；281-286；289-294；297-302；305-310；313-318；321-326；329-334；337-342；345-350；353-358；361-366；369-374；377-382；385-390；393-398；401-406；409-414。

51.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:161-163，所述VH1CDR是SEQ ID NO:164-166，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:385-387，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:388-390。

52.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:385-387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388-390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:161-163，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:164-166。

53.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:153-155，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:156-158，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:385-387，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:388-390。

54.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:385-387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388-390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:153-155，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:156-158。

55.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:409-411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412-414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:121-123，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:124-126。

56.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:409-411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412-414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:177-179，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:180-182。

57.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:409-411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412-414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:97-99，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:100-102。

58.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:385-387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388-390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105-107，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:108-110。

59.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:97-99，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:100-102，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:409-411，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:412-414。

60.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:385-387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388-390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105-107，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:108-110。

61.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:409-411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412-414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105-107，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:108-110。

62.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:105-107，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:108-110，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:385-387，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:388-390。

63.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:105-107，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:108-110，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:409-411，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:412-414。

64.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQ IDNO:369-371，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:372-374，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105-107，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:108-110。

65.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述(X1)n是选自由SEQ ID NO:415-484组成的组。

66.如实施方案50-64所述的结合分子，其中所述(X1)n是选自由SEQ ID NO:440、441、437、438、431、432、483和484组成的组。

67.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:440。

68.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:441。

69.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:437。

70.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:438。

71.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:440。

72.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:441。

73.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:483。

74.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:484。

75.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:431。

76.如实施方案50至64所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:432。

77.如实施方案1、3、6、24、26和50所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n和VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n链上的所述(X1)n是不同的。

78.一种产生结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子的方法，其包含以下步骤：(a)获得可结合硬化蛋白或DKK-1的第一亲本抗体或其抗原结合部分；(b)获得可结合硬化蛋白或DKK-1的第二亲本抗体或其抗原结合部分；(c)构建包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n的第一和第三多肽链，其中：VH1是得自所述第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自所述第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，限制条件为其不为CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；(d)构建包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的第二和第四多肽链，其中：VL1是得自所述第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自所述第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；和(e)表达所述第一、第二、第三和第四多肽链，以产生结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子。

79.如实施方案78所述的方法，其中所述VH1和VH2重链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408，且其中所述VL1和VL2轻链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

80.如实施方案78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分中的每一者和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分中的每一者是单独地选自由人抗体、CDR移植抗体和人源化抗体组成的组。

81.如实施方案78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分中的每一者和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分中的每一者是单独地选自由以下组成的组：Fab片段；F(ab′)₂片段；二价片段，其包含于铰链区由二硫桥键连接的两个Fab片段；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段；分离的互补决定区(CDR)；单链抗体和双功能抗体。

82.如实施方案78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分具有由所述结合分子展现的至少一种期望性质。

83.如实施方案78所述的方法，其中所述第二亲本抗体或其抗原结合部分具有由所述结合分子展现的至少一种期望性质。

84.如实施方案78所述的方法，其中所述Fc区是选自由天然序列Fc区和变异型序列Fc区组成的组。

85.如实施方案78所述的方法，其中所述Fc区是选自由来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fc区组成的组。

86.如实施方案78所述的方法，其中所述期望性质是选自一个或多个抗体参数。

87.如实施方案78所述的方法，其中所述期望性质是选自一个或多个抗体参数。

88.如实施方案78所述的方法，其中所述抗体参数是选自由以下组成的组：抗原特异性、与抗原的亲和力、效能、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。

89.如实施方案78所述的方法，其中所述抗体参数是选自由以下组成的组：抗原特异性、与抗原的亲和力、效能、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。

90.如实施方案78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的亲和力不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的亲和力。

91.如实施方案78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的效能不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的效能。

92.如实施方案78所述的方法，限制条件为所述接头不为CH1。

93.一种药物组合物，其包含如实施方案1至77中任一实施方案所述的结合分子。

94.如实施方案1至77中任一实施方案所述的结合分子，其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一者或多者组合。

95.一种治疗骨病症的方法，其包含向有需要的患者施用如实施方案1至77中任一实施方案所述的结合分子。

96.一种加速骨折修复的方法，其包含向有需要的患者施用如实施方案1至77中任一实施方案所述的结合分子。

97.一种增加骨密度的方法，其包含向有需要的患者施用如实施方案1至77中任一实施方案所述的结合分子。

98.一种增加骨强度的方法，其包含向有需要的患者施用如实施方案1至77中任一实施方案所述的结合分子。

99.如实施方案96至98所述的方法，其中与未治疗患者相比，使BMC增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。

100.如实施方案96至98所述的方法，其中与未治疗患者相比，使BMD增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。

101.一种多核苷酸，其编码如实施方案1至77中任一实施方案所述的结合分子。

102.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:486与488。

103.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:490与492。

104.如实施方案26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQ IDNO:494与496。

105.如实施方案50所述的结合分子，其中所述VL1CDR是SEQID NO:225-227，所述VH1CDR是SEQ ID NO:228-230，所述VL2CDR是SEQ ID NO:105-107，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:108-110。

如某些国家管辖区所允许，本文所公开所有参考文献的全文以引用方式并入本文，如同每一者皆出于任何目的(包括授予本发明权利和描述本发明)个别地并入本文一般。以下实施例仅提供用于阐释本文所提供抗体、片段和组合物的某些方面且因此不应视为限制所要求发明的范围。

表1

^*注意，对于SEQ ID NO 17-92和485-496来说，CDR是黑体/突出显示且重链恒定区是黑体/斜体。

实施例

实施例1

双特异性双可变结构域Ig分子：抗硬化蛋白和抗DKK1的工程改 造

使用针对人硬化蛋白和DKK1的抗体来构建若干组双可变结构域(DVD)Ig分子。轻链和重链基因的DNA是得自小鼠、大鼠或异种小鼠(xenomouse)杂交瘤。为构建双结构域轻链，通过接头(轻链的CL1结构域的前12个氨基酸)将抗人硬化蛋白抗体的VL结构域串联融合至抗hu DKK1抗体轻链可变结构域的N端、随后CL以形成全长DVD-Ig轻链。

同样，通过接头(重链上CH1的前13个或12个氨基酸)将抗hu硬化蛋白抗体的重链可变结构域(VH)串联融合至抗hu DKK1抗体的VH的N端、随后整个重链恒定区。DVD的另一形式是抗DKK1的VH/VL借助各别接头位于抗硬化蛋白的重链/轻链的N端上。

两个轻链可变结构域之间的接头是源自CL1区，而两个重链可变结构域之间的接头是源自重链恒定区的CH1区。经由独特限制位点将所有DNA构建体克隆至pTT5载体中。

所产生DVD-Ig分子的一个实例是大鼠嵌合DVD AB-4-11H10，其中将小鼠抗hu硬化蛋白抗体AB-4的VL/VH接合至大鼠抗hu DKK111H10抗体的轻链/重链的N端且含有大鼠IgG2a恒定区。也制备具有颠倒取向的可变结构域的DVD，其中将大鼠抗hu DKK1 11H10的可变结构域(VL/VH)融合至小鼠抗硬化蛋白AB-4的轻链/重链的N端。

选择大鼠恒定结构域源接头以提供结构稳定性以及制备更像大鼠的构建体。此类型的大鼠化(ratized)双特异性抗体在用于短期和长期大鼠模型中时，应具有较小潜在免疫原性风险。

实施例2

硬化蛋白-DKK1DVD-Ig的表达

如下在Wave生物反应器(25L)中实施硬化蛋白-DKK1 DVD-Ig的大规模产生：

以3E5个活细胞/ml(VC/ml)向3L烧瓶中各自接种1L 293-6E细胞。使用F17表达培养基且补充1.1mg/ml普流尼克、6mM L-谷氨酰胺和25μg/ml遗传霉素。在48hr后，实施细胞计数且观察到介于99.1%至99.9%之间的存活率。通过在具有11.25升新鲜F17培养基的50L Wave袋中混合11.25升293-6E培养物来获得以1:2稀释的培养物。24hr后实施另一细胞计数且确定98.5%存活率。随后在F17培养基中实施1:10稀释且0.5mg总质粒DNA/升培养物(或12.5mg)添加3ml PEI Max/mgDNA。每一抗体链添加等量DNA(6.25mg)。转染后24小时，将625ml(25ml/升培养物)进料(由存于具有0.1%普流尼克的F17中的20%胰蛋白胨N1组成)添加至培养物中，随后孵育5天。随后，实施细胞计数且观察到82.9%细胞存活率。然后通过以4000rpm离心45分钟来收获条件化培养基(CM)且用0.2μm过滤器过滤CM。在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE来分析抗体的等分试样。

实施例3

用于体内研究的硬化蛋白-DKK1 DVD-Ig的纯化和配制

自瞬时细胞培养物纯化硬化蛋白-DKK1 DVD-Ig。纯化方案使用亲和力色谱、随后疏水性相互作用色谱(HIC)。

细胞培养液浓缩

在4℃下使用TFF(切向流过滤)器件实施细胞培养液的浓缩。使用PES 10kD MWCO(5×1sq.ft.)膜将产物浓缩约10倍。横向流是0.7L/sq.ft/min，且TMP是25-30psi。

蛋白G色谱

在室温下实施蛋白G色谱，但细胞培养液在加载期间保持为冷。流动速率保持恒定在每分钟0.2管柱体积。

将20升澄清细胞培养液浓缩10倍，用一半体积的1.2M柠檬酸钠、75mM Tris(pH9)稀释且随后加载至在0.4M柠檬酸钠、25mM Tris(pH9)中平衡的230mL蛋白G琼脂糖快速流动管柱(Protein GSepharose Fast Flow column)(XK50,19.6cm2×12.5cm)中。在加载细胞培养液后，用0.4M柠檬酸钠、25mM Tris(pH9)洗涤管柱直至280nm下的吸光度返回至基线。在洗涤后，用0.1M乙酸(pH3)自管柱溶析抗体且收集整个溶析峰。溶析汇集物含有2.197克产物。在溶析后，立即用1M Tris碱将蛋白G汇集物调节至pH 7。

苯基HP色谱

在室温下实施苯基HP色谱，以每毫升树脂约7mg蛋白结合。流动速率保持恒定在每分钟0.2管柱体积。

通过添加20mM磷酸钠、3M硫酸铵(pH 7，至0.6M硫酸铵的最终浓度)对蛋白G汇集物实施条件化以结合至苯基HP上。将115mL(245mg)条件化蛋白G汇集物加载至在20mM磷酸钠、0.6M硫酸铵pH7中平衡的35mL苯基HP管柱(XK 26,5.3cm2×6.6cm)上。在加载后，用20mM磷酸钠、0.6M硫酸铵(pH 7)洗涤管柱直至流出物于280nm下的吸光度返回至基线。使用20管柱体积线性梯度的存于20mM磷酸钠中的递减硫酸铵(0.6-0M)(pH 7)来溶析来自苯基HP管柱的产物。收集0.5管柱体积分数且通过大小排除HPLC分析以确定纯度。基于主峰%汇集各部分以形成产物汇集物。回收86%产物，产生210mg。

配制：缓冲液交换和浓缩

在4℃下使用再生纤维素10kD MWCO透析卡匣(dialysis cassette)实施缓冲液交换。在4℃下使用PES 10kD MWCO离心器件实施浓缩。回收率是85%。

将80mL(80mg)苯基HP汇集物以缓冲液交换成10mM Tris、250mM L-脯氨酸(pH 7.5)。通过对照3升10mM Tris、250mM L-脯氨酸(pH7.5)透析3次来实施透析。透析后产物汇集物的体积是113mL，蛋白浓度为0.674mg/mL。在透析后，使用离心浓缩器件将产物汇集物浓缩至18.5mL。然后将产物汇集物无菌过滤(0.22微米)。过滤的纯块状物的浓度测量为3.65mg/mL。总体回收率是73%或67.6mg。过滤的纯块状物的内毒素含量测量为小于0.07EU/mg。过滤的纯块状产物储存于4℃下。

实施例4

硬化蛋白和DKK1 ELISA

同时通过ELISA捕获测定来测定各种双特异性抗体特异性结合硬化蛋白和Dkk1的能力。用存于96孔半区板(Costar，目录编号为3694)中的涂布缓冲液(0.015M Na2CO3,0.035M NaHCO3,pH 9.6)中的20ml/孔1mg/ml小鼠抗huScl MAb56H2涂布板且在RT下孵育1小时或在4℃下培养过夜。用100ml/孔洗涤溶液(含有0.2%Tween20的PBS，BIO-RAD)将板洗涤一次且随后添加100ml/孔阻断溶液(含有1%BSA、1%山羊血清和0.5%Tween20的PBS)并在RT下保持1小时。添加人硬化蛋白(20ml/孔10ng/ml于阻断溶液中稀释的母液)且在室温下孵育1小时，随后如上文所述洗涤。将20ml/孔的各稀释双特异性Ab(0nM、0.008nM、0.04nM、0.2nM、1nM、5nM、25nM、125nM、625nM)、亲本Ab(阳性对照)和非DKK1/Scl相关性IgG(人或大鼠IgG，阴性对照)添加于阻断溶液中且将板在室温下孵育1小时。在洗涤溶液中孵育后，将20ml/孔于阻断溶液中稀释的huDKK1-生物素(10ng/ml)添加至所述板中且在室温下保持1小时且随后添加于洗涤溶液中。将于阻断溶液中稀释的中性链亲和素(Neutravidin)-HRP稀释液(Pierce，目录编号为31001)以1:50,000稀释添加至孔(20ml/孔)中，随后在RT下孵育1小时且随后用100ml/孔洗涤溶液洗涤3次。作为最终步骤，将20ml/孔SuperSignal ELISA Femto(Thermo,目录编号为37074)工作溶液添加至所述板中且使用光度计在425nm下读取信号。如图1至3中所汇总的数据显示，所有测试的双特异性制剂皆能够同时结合两种靶标且因此接合抗体可变区的接头序列以及每一可变结构域与一个配体的结合皆不会对第二配体的结合构成显著空间限制。

实施例5

硬化蛋白和DKK1 Biacore测定

为进一步证明双特异性抗体可结合两种靶标，通过Biacore测定来评估四价双特异性结合活性。简单地说，将山羊抗huIgG Fc片段特异性抗体以高表面密度(>3,500RU，经固定)固定至CM5芯片的所有4个流动小室(flowcell)。在25mM Tris(pH 8.5)、250mM NaCl、0.005%P-20、0.1mg/mL BSA中将双特异性抗体稀释至20nM且捕获于个别流动小室上。在相同缓冲液中将配体(人Dkk-1和人硬化蛋白)稀释至100nM且依序注射于所捕获双特异性Ig上。

感测图显示，当用第一抗原(人Dkk1或人硬化蛋白)使双特异性抗体饱和且注射第二抗原时，观察到第二结合信号。当颠倒抗原注射序列时，此观察结果是类似的。对两个单独结合事件的观察显示，双特异性抗体可同时结合两种配体。

实施例6

成骨细胞Wnt活化生物测定

工程改造的双特异性抗体能够中和两种靶标阻断经典Wnt信号传导的能力，如成骨细胞Wnt活化测定中所证明。用Super-TOPFlash报告子构建体转染MC3T3-E1细胞，且选择并评价稳定细胞系。将克隆C10鉴别为最佳克隆且已在各种条件下对其实施充分表征且其显示在与纯化硬化蛋白或Dkk1蛋白一起孵育后因Wnt途径活化的抑制而降低报告子活性。在扩增培养基(含有10%FBS、1X Pen-Strep-Glu和1.0μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的Αlpha-MEM培养基)中培养细胞。当细胞达到80%铺满时，将培养基转换为分化培养基(扩增培养基、50μg/ml抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸盐)并保持4天。在分化后，此细胞系产生以自分泌方式触发经典Wnt活化的内源性蛋白。抽吸培养基且将含有各种浓度的单特异性或双特异性抗体的100μL新鲜DM(与Dkk1和/或硬化蛋白一起预孵育4hr且在37℃下保持45-60min)添加至所述孔中且保持24hr。依照厂商说明书(Promega的荧光素酶测定系统，目录编号：E4530)测量荧光素酶活性。

所测试的各种大鼠和人双特异性抗体能够在硬化蛋白与Dkk1二者存在下以剂量依赖性方式活化成骨细胞经典Wnt途径，从而进一步证明，所述抗体可同时中和两种可溶性蛋白的Wnt抑制功能。

实施例7

Wnt诱导的荧光素酶生物测定

工程改造的双特异性抗体能够中和Dkk1并阻断Wnt1诱导的TCF/LEF荧光素酶活性，如在基于成骨细胞的测定中所确定。通过慢病毒转导利用T细胞因子(TCF)-反应性荧光素酶构建体、Tet阻抑物构建体和多西环素(doxycycline)诱导型Wnt1构建体来工程改造成骨细胞MC3T3E1/TetON-Wnt1/STF-Luc 5号细胞系。在此测定中，将多西环素(10ng/ml)添加至培养基中并保持22-26hr会诱导Wnt1表达和经由Wnt1与细胞表面LRP5/6和卷曲蛋白受体的结合的信号转导，从而导致荧光素酶报告子基因表达。在硬化蛋白和/或Dkk1存在下孵育MC3T3E1/TetON-Wnt1/STF-luc 5号细胞且Wnt信号传导因硬化蛋白和Dkk1与LRP5/6的竞争性结合而受到抑制。将人Dkk1蛋白(0.1μg/ml)或人硬化蛋白(1μg/ml)与对照PBS或双特异性抗体的连接稀释液预混合。24hr后，如上文所述测定荧光素酶信号，且通过使用PRISM软件将数据绘成曲线。如图4和18中所汇总，双特异性抗体以剂量依赖性方式抑制硬化蛋白和Dkk1并恢复由Wnt1诱导的Wnt信号传导。

实施例8

硬化蛋白和/或DKK1的结合剂的筛选方法

使用纯化的生物素标记的Dkk1和硬化蛋白以及纯化的带His标签的Lrp6或Lrp5建立筛选双特异性抗体、肽体(peptibody)和高亲和性聚合体阻断硬化蛋白或Dkk1结合Lrp6的能力的方法。使用AlphaScreen测定来测定双特异性制剂/肽/高亲和性聚合体阻断Scl或Dkk1结合Lrp6/Lrp5的能力。首先在室温下将5μl生物素-Scl(或生物素-Dkk1)和5μl Lrp6-His孵育1小时，且随后添加5μl双特异性试剂且再保持1小时，之后添加10μl供体/受体珠粒混合物。将反应物再孵育1小时，随后在EnVision装置上以520-620nM读取AlphaScreen信号。双特异性试剂处理孔中信号的损失指示，双特异性制剂阻断Dkk1和硬化蛋白与Lrp5/Lrp6结合且因此可允许各种Wnt蛋白触发经典信号传导。图19汇总来自一个此类筛选实验的数据。

实施例9

体内小鼠骨质量和骨强度模型

所述研究和结果汇总于图5中。研究设计：此研究中使用总共45只10周龄B6D2F1雄性小鼠。在研究开始时，将动物分成5组(n=9/组)，其中各组的体重与股骨-胫骨区处的BMD(通过体内DXA测定)二者均衡。每周两次皮下向小鼠注射媒介物(脯氨酸)或硬化蛋白-Ab(Scl-Ab)或DKK1-Ab或Scl-Ab与DKK1-Ab的组合(组合)或双特异性抗体(Bisp-Ab)，持续3周。由于分子量差异，因此以等摩尔浓度(1.82×10-5M)给予抗体18.2mg/kg Scl-Ab、18.07mg/kg DKK1-Ab、18.2mg/kgScl-Ab+18.07mg/kg DKK1-Ab(组合组中)和25mg/kg Bisp-Ab。每周一次通过体内DXA扫描动物以监测药物治疗对腰椎和股骨-胫骨区的骨合成代谢作用；然后于研究结束时将其无痛处死。收集股骨以供通过μCT进行离体密度测定和骨强度分析。

体内密度测定：通过DXA(GE Lunar PIXImus II)扫描动物的胫骨-腓骨接合处至股骨颈(股骨-胫骨)和腰椎(LV1-5)的区域以测定所述位点处的面积BMD。

离体密度测定：使用桌面微CT系统(eXplore Locus SP,GEHealthcare,London,Ontario,Canada)扫描股骨且以13μm的分辨率重新构建。检测跨越骨皮质的皮质骨干中段处股骨高度10%的区域(阈值为800mg/cc)和跨越小梁远端股骨的10%的区域(对于媒介物和DKK1-Ab来说，阈值为500mg/cc；对于Scl-Ab来说，阈值为550mg/cc；且对于组合和Bisp-Ab来说，阈值为600mg/cc)。测量骨干中段区的骨皮质面积(Ct.Ar)和剖面惯性矩(CSMI)。评估远端股骨的松质骨体积分数(BV/TV)、小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)和小梁BMD(Tb.BMD)。

生物力学：在至失效的3点弯曲中测试股骨骨干中段，且评估骨强度参数最大载荷和劲度(MTS 858Mini Bionix II；跨距长度=6mm；位移速率=6mm/min)。

统计分析：使用GraphPad Prism(v.5.01)来实施统计学分析。使用单因子Anova和Tukey Kramer事后测试实施比较。将数据报告为平均值+SEM，且将p<0.05视为显著。

结果：

体内BMD：对于组合组和Bisp-Ab组来说，早在治疗后一周，即注意到腰椎区(LV1-5)与股骨-胫骨区二者处的BMC和BMD皆显著增加，且在治疗时段内反应以大于单独Scl-Ab和DKK1-Ab的程度持续增加。图X中所示的数据代表研究结束(3周)时胫骨-股骨的BMC自基线的变化%。所有治疗与媒介物治疗组相比皆导致显著增加的BMC，媒介物治疗组与基线相比仅降低-3.5%。与基线相比，用Scl-Ab治疗的动物的BMC增加27%，Dkk1-Ab使BMC增加13%，组合使BMC增加51%且Bisp-Ab使BMC增加48%。通过组合或Bisp-Ab治疗所诱导腰椎与股骨-胫骨二者的BMC和BMD的增加显著大于单独Scl-Ab或Dkk1-Ab。

骨质量和骨强度：与媒介物相比，DKK1-Ab显著增加远端股骨BV/TV(+47%)、Tb.N(+30%)和Tb.vBMD(+23%)，但不增加Tb.Th(+13%)。与媒介物相比，DKK1-Ab不显著影响骨干Ct.Ar(+3%)和CSMI(+1%)。DKK1-Ab治疗不影响股骨干弯曲强度。

与媒介物相比，Scl-Ab显著增加远端股骨BV/TV(+76%)、Tb.N(+21%)、Tb.Th(+71%)和Tb.vBMD(+47%)。与媒介物相比，Scl-Ab显著增加骨干Ct.Ar(+24%)，但不增加CSMI(+22%)。与媒介物相比，Scl-Ab显著增加股骨干最大载荷(+29%)和劲度(+24%)。

与媒介物相比，组合显著增加远端股骨BV/TV(+278%)、Tb.N(+64%)、Tb.Th(+175%)和Tb.vBMD(+149%)。与媒介物相比，组合显著增加骨干Ct.Ar(+37%)和CSMI(+44%)。与媒介物相比，组合显著增加股骨干最大载荷(+47%)和劲度(+46%)。组合中的所有所述参数的平均值皆显著大于那些针对单独Scl-Ab组(CSMI除外)和DKK1-Ab组所观察者。

与组合类似，与媒介物相比，Bisp-Ab显著增加远端股骨BV/TV(+228%)、Tb.N(+57%)、Tb.Th(+152%)和Tb.vBMD(129%)。与媒介物相比，Bisp-Ab显著增加骨干Ct.Ar(+35%)和CSMI(+39%)。与媒介物相比，Bisp-Ab显著增加股骨干最大载荷(+45%)和劲度(+44%)。Bisp-Ab中的所有所述参数的平均值皆显著大于那些针对单独Scl-Ab组(CSMI除外)和DKK1-Ab组所观察者。

概述：与任一单一疗法相比，组合治疗与Bisp-Ab治疗二者皆导致骨质量和骨强度的更大增加。所述结果明确指示，在此小鼠模型中，组合治疗与Bisp-Ab治疗二者皆对增强骨质量和骨强度具有意外协同作用。

结论：双特异性-Ab，即对硬化蛋白与Dkk1二者具有抑制性作用的分子，对低骨质量和骨修复相关性病状的治疗活性似乎强于单独Scl-Ab或DKK1-Ab。

实施例10

Sost-Ab与Dkk1-Ab的组合疗法增加PTHR1表达

为更好地理解Sost-和Dkk1-抗体组合治疗对骨形成的协同影响的潜在分子机制，研究骨合成代谢途径成员的表达。用媒介物(Veh)、Dkk1-Ab(10mg/kg 2x/wk)、Sost-Ab(10mg/kg 2x/wk)、组合(combo 5mg/kg或10mg/kg 2x/wk)将7至9个月龄雄性斯普拉道来氏大鼠(Sprague Dawley rat)治疗两周。在第14天处死动物且移出大鼠股骨并清洗掉所有肌肉。移出骺和软骨且用冰冷PBS冲洗股骨以去除骨髓。然后将骨在液氮中快速冷冻并粉碎。使用PureLink^TMPro 96总RNA纯化试剂盒(Invitrogen;Carlsbad,CA)来纯化骨RNA。利用AffymetrixQuantiGene-Plex2.0 Panel 331140(Affymetrix;Santa Clara,CA)来分析基因表达。

用组合疗法治疗使大量骨合成代谢相关性基因的表达增加的程度远远大于任一单独疗法。所述基因包括骨细胞(DMP1)、经典Wnt-信号传导途径(Axin2)、骨原性(Col1A1)和成骨细胞转录(Osterix)生物学的标记物。意外地，也观察到甲状旁腺激素(PTH)信号传导途径组分PTH受体1(PTHR1)的协同增加(下图XX)。如图6中所汇总的所述数据表明，Sost-Ab与Dkk1-Ab的组合治疗对骨合成代谢的协同作用可部分地归因于源自组合治疗的PTH信号传导的意外增加。

实施例11

结合分子的高通量(HT)表达

产生以下硬化蛋白/DKK1配对：

硬化蛋白	DKK1
		13F3	6.37.5
13F3	6.147
		20C3	6.37.5
20C3	6.147
		46H1	6.37.5
46H1	6.147
		38B12	6.3755
38B12	6.147
		13C7	6.37.5
13C7	6.147
		Ab23	6.37.5
Ab23	6.147
		Ab23	PD17
13F3	PD17
		20C3	PD17
46H1	PD17
		38B12	PD17
13C7	PD17
		19D11	6.37.5

测试每对的两种不同取向和每一取向的5种不同接头(GGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、CL/CH1的前6个氨基酸、CL/CH1的前13个氨基酸)。在96孔板中使结合分子在粘附适应性2936E细胞中瞬时表达。在转染前24小时将粘附2936E细胞以5E4个细胞/每孔播种于聚-D-赖氨酸涂布的96孔组织培养板中的补充有0.01%普流尼克F68、25μg/ml G418和5%FBS的Freestyle 293表达培养基(Gibco编号为12338)中且在37℃下于5%CO2中孵育过夜。

在转染当天，将结合分子的各100ng(40ng/μl)对应HC DNA和LCDNA混合在一起。将25μl/孔预混合的Freestyle培养基：FugeneHD(Roche，目录编号为04-709-713-001)(24:1)添加至DNA混合物中。在室温下孵育15-30min后，将整个转染混合物添加至前一天播种的培养板中，且在轻轻摇动的同时进行混合。将培养板放回37℃、5%CO2孵育器中过夜。第二天，抽吸出培养基和转染混合物且用含有0.5%胰蛋白胨的130μl无血清培养基置换。将所述板再孵育6天。在转染第7天收获条件化培养基(CM)。将板以1000rpm旋转5min以将任何细胞碎片制成球粒。将上清液小心地转移至无菌聚丙烯块中。

在ForteBio QK上使用蛋白A生物传感器(ForteBio，目录编号为18-5010)测量CM中结合分子的浓度。将蛋白A生物传感器在运行前于试样缓冲液中浸泡10min。在运行开始时，将预润湿生物传感器于两倍稀释的CM试样中浸渍2min且记录捕获分子。利用Data Analysis6.3软件使用预加载的IgG1浓度标准曲线来计算试样浓度。

如本文实施例4中所述实施ELISA筛选。如本文实施例6和7中所述实施WNT测定。

结论：HT筛选可鉴别具有针对硬化蛋白和Dkk1的有效双中和活性的若干完全人DVD-Ig候选物。在157个筛选候选物中，35%在HT表达筛选中显示良好瞬时表达，其中若干候选物产生大于10μg/ml的表达浓度。

实施例12

在完好年轻生长小鼠模型中刺激骨形成和增加骨强度

研究设计：此研究中使用总共45只10周龄B6D2F1雄性小鼠。在研究开始时，将动物分成5组(n=9/组)，其通过体重与股骨-胫骨区处的BMD(通过体内DXA测定)二者平衡。每周两次皮下向小鼠注射媒介物(脯氨酸)或硬化蛋白-Ab(Scl-Ab)或DKK1-Ab或Scl-Ab与DKK1-Ab的组合(组合)或13C7-11H10，持续3周。由于分子量差异，因此以等摩尔浓度(1.82×10^-5M)给予抗体18.2mg/kg Scl-Ab、18.07mg/kg DKK1-Ab、18.2mg/kg Scl-Ab+18.07mg/kg DKK1-Ab(组合组中)和25mg/kg13C7-11H10。每周一次通过体内DXA扫描动物以监测药物治疗对腰椎和股骨-胫骨区的骨合成代谢作用；然后于研究结束时将其无痛处死。收集股骨以供通过μCT进行离体密度测定和骨强度分析。

体内密度测定：通过DXA(GE Lunar PIXImus II)扫描动物的胫骨-腓骨接合处至股骨颈(股骨-胫骨)和腰椎(LV1-5)的区域以测定所述位点处的面积BMD。

离体密度测定：使用桌面微CT系统(eXplore Locus SP,GEHealthcare,London,Ontario,Canada)扫描股骨且以13μm的分辨率重新构建。检测跨越骨皮质的皮质骨干中段处股骨高度10%的区域(阈值为800mg/cc)和跨越小梁远端股骨的10%的区域(对于媒介物和DKK1-Ab来说，阈值为500mg/cc；对于Scl-Ab来说，阈值为550mg/cc；且对于组合和Bisp-Ab来说，阈值为600mg/cc)。测量骨干中段区的骨皮质面积(Ct.Ar)和剖面惯性矩(CSMI)。评估远端股骨的松质骨体积分数(BV/TV)、小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)和小梁BMD(Tb.BMD)。

生物力学：在至失效的3点弯曲中测试股骨骨干中段，且评估骨强度参数最大载荷和劲度(MTS 858 Mini Bionix II；跨距长度=6mm；位移速率=6mm/min)。

统计分析：使用GraphPad Prism(v.5.01)来实施统计学分析。使用单因子Anova和Tukey Kramer事后测试实施比较。将数据报告为平均值+SEM，且将p<0.05视为显著。

结果：

体内BMD：对于组合组和13C7-11H10组来说，早在治疗后一周，即注意到腰椎区(LV1-5)与股骨-胫骨区二者处的BMC和BMD皆显著增加，且在治疗时段内反应以大于单独Scl-Ab和DKK1-Ab的程度持续增加。所示数据代表研究结束(3周)时胫骨-股骨的BMC自基线的变化%。所有治疗与媒介物治疗组相比皆导致显著增加的BMC，媒介物治疗组与基线相比仅降低-3.5%。与基线相比，用Scl-Ab治疗的动物的BMC增加27%，Dkk1-Ab使BMC增加13%，组合使BMC增加51%且13C7-11H10使BMC增加48%。通过组合或Bisp-Ab治疗所诱导腰椎与股骨-胫骨二者的BMC和BMD的增加显著大于单独Scl-Ab或Dkk1-Ab。

骨质量和骨强度：

与媒介物相比，DKK1-Ab显著增加远端股骨BV/TV(+47%)、Tb.N(+30%)和Tb.vBMD(+23%)，但不增加Tb.Th(+13%)。与媒介物相比，DKK1-Ab不显著影响骨干Ct.Ar(+3%)和CSMI(+1%)。DKK1-Ab治疗不影响股骨干弯曲强度。

与媒介物相比，Scl-Ab显著增加远端股骨BV/TV(+76%)、Tb.N(+21%)、Tb.Th(+71%)和Tb.vBMD(+47%)。与媒介物相比，Scl-Ab显著增加骨干Ct.Ar(+24%)，但不增加CSMI(+22%)。与媒介物相比，Scl-Ab显著增加股骨干最大载荷(+29%)和劲度(+24%)。

与媒介物相比，组合显著增加远端股骨BV/TV(+278%)、Tb.N(+64%)、Tb.Th(+175%)和Tb.vBMD(+149%)。与媒介物相比，组合显著增加骨干Ct.Ar(+37%)和CSMI(+44%)。与媒介物相比，组合显著增加股骨干最大载荷(+47%)和劲度(+46%)。组合中的所有所述参数的平均值皆显著大于那些针对单独Scl-Ab组(CSMI除外)和DKK1-Ab组所观察者。

与组合类似，与媒介物相比，13C7-11H10显著增加远端股骨BV/TV(+228%)、Tb.N(+57%)、Tb.Th(+152%)和Tb.vBMD(129%)。与媒介物相比，13C7-11H10显著增加骨干Ct.Ar(+35%)和CSMI(+39%)。与媒介物相比，13C7-11H10显著增加股骨干最大载荷(+45%)和劲度(+44%)。13C7-11H10中的所有所述参数的平均值皆显著大于那些针对单独Scl-Ab组(CSMI除外)和DKK1-Ab组所观察者。

此实施例的结果汇总于图7-11中。与任一单一疗法相比，组合治疗与13C7-11H10治疗二者皆导致骨质量和骨强度的更大增加。所述结果明确指示，在完好小鼠模型中，组合治疗与13C7-11H10治疗二者皆对增强骨质量和骨强度具有协同作用。

实施例13

在大鼠闭合股骨骨折模型中刺激骨折股骨的骨形成和增加骨强 度。

研究设计：使12周龄雄性斯普拉道来氏(SD)大鼠(平均体重为428g)经受单侧闭合股骨中骨干骨折，如先前所报导(Bonnarens F，等JOrthop Res 1984;2:97-101)。简单地说，将18号注射器针头穿过股骨髁插入骨髓管中，且用作内部固定。然后经由于大腿前方(侧向)面加载钝性冲击使股骨经受横向骨折。在骨折后一天，每周两次经皮下向动物(n=18/组)注射盐水媒介物、Scl-Ab(25mg/kg)、DKK1-Ab(25mg/kg)或DVD-Ig 13C7-11H10、6.147-2x-Ab5、6.37-AbL-Ab23、Ab5K-AbS-6.147、6.147-AbL-27H6或8G2-AbL-6.37.5(每一图上所指示)(34.37mg/kg)。在骨折后5周时，将动物无痛处死；收集骨折和非骨折对侧(CL)股骨以供密度测定和生物力学分析。此研究已经Amgen的Institution Animal Care and Use Committee批准。

通过DXA进行密度测定：自骨折股骨移出髓内钉，随后进行密度测定分析。通过双能量x射线吸收测定(DXA;GE Lunar PIXImus II)离体扫描股骨；对骨折股骨的中央30%或整个对侧完好股骨实施分析以确定面积骨矿物质含量(BMC)。

通过pQCT进行密度测定：也通过周边式定量式计算机断层扫描(pQCT;Stratec XCT研究SA+;Germany)以100μm的分辨率对两种股骨进行扫描。于骨折股骨骨痂的中央和侧股骨(BMC)的中点对3个0.5-mm切片实施分析。

生物力学：将每一股骨的近端和远端嵌入Slow Set Lab Plaster(Heraeus-Kulzer)中以分离14-16mm长中央区。在失效扭转中以2.0deg/sec的角位移速率测试所述骨折和CL股骨(MTS 858 Mini BionixII,MTS Corp.,Mineapolis,USA)。评估骨强度参数，包括最大扭矩(N-mm)、失效能量(N-mm.度)和扭转劲度(N/mm)。

统计学分析：使用GraphPad Prism(v.5.01)通过未配对双侧t-测试来确定各组间的统计学差异，其中将p<0.05视为显著。

结果：骨折股骨：与媒介物对照相比，Scl-Ab与DKK1-Ab二者皆显示骨折骨痂的骨质量和骨强度的类似改良，如通过DXA(+17%至21%)和pQCT(+13%至22%)的BMC的显著增加所证明。与媒介物对照相比，骨质量的所述增加与骨折股骨的42-44%的最大扭矩增加相关。

DVD-Ig将骨折骨痂处的骨质量和骨强度显著增强至大于单独Scl-Ab或DKK1-Ab的程度。与媒介物相比，DVD-Ig组的骨折骨痂BMC大44%(通过DXA)和32%(pQCT)。与媒介物相比，骨质量的此增强与DVD-Ig组中最大扭矩的85%增加相关。另外，与单独Scl-Ab组或单独DKK1-Ab组相比，DVD-Ig组的DXA BMC显著更高。

非骨折对侧股骨：DKK1-Ab不会显著影响非骨折对侧股骨的骨干骨质量和骨强度。然而，与媒介物相比，Scl-Ab分别使中骨干皮质厚度和最大扭矩显著增加13%和22%。与媒介物相比，DVD-Ig分别使对侧股骨骨皮质厚度和最大扭矩显著增加13%和20%，所述变化与那些Scl-Ab组的变化类似。将数据表达为平均值±SE，^*p<0.05对媒介物。

此实施例的结果汇总于图12-16中。

实施例14

Lrp6/硬化蛋白和Lrp6/Dkk1 α筛选测定

基本上如Silverman等，2005 Nature Biotech 23(12):1556-1561中所述实施AlphaScreen竞争测定。通过在存于384孔Greiner微量滴定板中的测定缓冲液(40mM HEPES pH 7.5,100mM NaCl,1mM CaCl2,0.1%BSA,0.05%Tween-20)中连续稀释亲本和DVD-Ig蛋白来产生剂量反应曲线。将痕量的室内纯化和化学生物素化的重组人或大鼠硬化蛋白(最多1.5nM)添加至微量滴定板中，随后添加含有小鼠LRP6-his或rhLRP6-Fc(R&D Systems)(最多6-12nM)和AlphaScreen“供体”抗生蛋白链菌素和“受体”蛋白A珠粒(各10mg/ml)(PerkinElmer)的混合物。将微量滴定板密封且在室温下孵育过夜。将复合物形成的抑制测量为化学发泡信号的减少，如在Fusion板读数器(PerkinElmer)上使用680nm下的激发和520-620nm下的发射所测量。结果汇总于图19中。

Claims (98)

1.一种结合分子，其包含多肽链，其中所述多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白(sclerostin)与DKK-1二者。

2.如权利要求1所述的结合分子，其中VH1和VH2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408。

3.一种结合分子，其包含多肽链，其中所述多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中：VL1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1二者。

4.如权利要求3所述的结合分子，其中VL1和VL2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

5.如权利要求1或3所述的结合分子，其中(X2)n不存在。

6.一种结合分子，其包含第一和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中VH1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；并且其中所述第二多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是得自第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子特异性结合硬化蛋白与DKK-1。

7.如权利要求6所述的结合分子，其中所述VH1和VH2重链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408，并且其中所述VL1和VL2轻链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

8.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中(X1)n是选自由SEQID NO:415至482组成的组的氨基酸序列。

9.如权利要求6所述的结合分子，其中所述结合分子包含两条第一多肽链和两条第二多肽链。

10.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述Fc区是选自由天然序列Fc区和变异型序列Fc区组成的组。

11.如权利要求10所述的结合分子，其中所述Fc区是选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fc区组成的组。

12.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH1和所述第二多肽链的所述VL1是得自相同的亲本抗体或其抗原结合部分。

13.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH1和所述第二多肽链的所述VL1是得自不同的亲本抗体或其抗原结合部分。

14.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH2和所述第二多肽链的所述VL2是得自相同的亲本抗体或其抗原结合部分。

15.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一多肽链的所述VH2和所述第二多肽链的所述VL2是得自不同的亲本抗体或其抗原结合部分。

16.如权利要求1、3或6所述的结合分子，限制条件为所述接头不为CH1。

17.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的效能不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的效能。

18.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的亲和力不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的亲和力。

19.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分是选自由人抗体、CDR移植抗体和人源化抗体组成的组。

20.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分是选自由以下组成的组：Fab片段；F(ab′)₂片段；二价片段，其包含两个于铰链区由二硫桥键连接的Fab片段；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段；分离的互补决定区(CDR)；单链抗体；和双功能抗体(diabody)。

21.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述结合分子具有至少一种由所述第一亲本抗体或其抗原结合部分或所述第二亲本抗体或其抗原结合部分展现的期望性质。

22.如权利要求21所述的结合分子，其中所述期望性质是选自一个或多个抗体参数。

23.如权利要求21所述的结合分子，其中所述抗体参数是选自由以下组成的组：抗原特异性、与抗原的亲和力、效能、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。

24.一种结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子，其包含四条多肽链，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；并且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述VH1和VH2重链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408，并且其中所述VL1和VL2轻链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

25.如权利要求24所述的结合分子，限制条件为所述接头不为CH1。

26.一种结合硬化蛋白与DKK-1二者的结合分子，其包含四条多肽链，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；并且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子包含选自由以下组成的组的VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对：

SEQ ID NO:18与20；22与24；26与28；30与32；34与36；38与40；42与44；46与48；50与52；54与76；56与72；58与60；62与64；66与68；70与72；74与76；78与80；82与84；86与88；90与92；486与488；490与492；和494与496。

27.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:18与20。

28.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:22与24。

29.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:26与28。

30.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:30与32。

31.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:34与36。

32.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:38与40。

33.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:42与44。

34.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:46与48。

35.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:50与52。

36.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:54与76。

37.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:56与72。

38.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:58与60。

39.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:62与64。

40.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:66与68。

41.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:70与72。

42.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:74与76。

43.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:78与80。

44.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:82与84。

45.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:86与88。

46.如权利要求26所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n与VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的配对是SEQID NO:90与92。

47.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述硬化蛋白结合剂的VH包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

a)100、101、102；

b)108、109、110；

c)116、117、118；

d)124、125、126；

e)132、133、134；

f)140、141、142；

g)148、149、150；

h)156、157、158；

i)164、165、166；

j)172、173、174；

k)180、181、182；

l)188、189、190；

m)196、197、198；

n)204、205、206；

o)212、213、214；和

p)220、221、222，

并且其中所述DKK1结合剂的VH包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

a)228、229、230；

b)236、237、238；

c)244、245、246；

d)252、253、254；

e)260、261、262；

f)268、269、270；

g)276、277、278；

h)284、285、286；

i)292、293、294；

j)300、301、302；

k)308、309、310；

l)316、317、318；

m)324、325、326；

n)332、333、334；

o)340、341、342；

p)348、349、350；

q)356、357、358；

r)364、365、366；

s)372、373、374；

t)380、381、382；

u)388、389、390；

v)396、397、398；

w)404、405、406；和

x)412、413、414。

48.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述硬化蛋白结合剂的VL包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

a)97、98、99；

b)105、106、107；

c)113、114、115；

d)121、122、123；

e)129、130、131；

f)137、138、139；

g)145、146、147；

h)153、154、155；

i)161、162、163；

j)169、170、171；

k)177、178、179；

l)185、186、187；

m)193、194、195；

n)201、202、203；

o)209、210、211；和

p)217、218、219，

并且其中所述DKK1结合剂的VL包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

b)225、226、227；

c)233、234、235；

d)241、242、243；

e)249、250、251；

f)257、258、259；

g)265、266、267；

h)273、274、275；

i)281、282、283；

j)289、290、291；

k)297、298、299；

l)305、306、307；

m)313、314、315；

n)321、322、323；

o)329、330、331；

p)337、338、339；

q)345、346、347；

r)353、354、355；

s)361、362、363；

t)369、370、371；

u)377、378、379；

v)385、386、387；

w)393、394、395；

x)401、402、403；和

y)409、410、411。

49.如权利要求1、3或6所述的结合分子，其中所述硬化蛋白结合剂的VH包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

a)100、101、102；

b)108、109、110；

c)116、117、118；

d)124、125、126；

e)132、133、134；

f)140、141、142；

g)148、149、150；

h)156、157、158；

i)164、165、166；

j)172、173、174；

k)180、181、182；

l)188、189、190；

m)196、197、198；

n)204、205、206；

o)212、213、214；和

p)220、221、222，

并且其中所述DKK1结合剂的VH包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

a)228、229、230；

b)236、237、238；

c)244、245、246；

d)252、253、254；

e)260、261、262；

f)268、269、270；

g)276、277、278；

h)284、285、286；

i)292、293、294；

j)300、301、302；

k)308、309、310；

l)316、317、318；

m)324、325、326；

n)332、333、334；

o)340、341、342；

p)348、349、350；

q)356、357、358；

r)364、365、366；

s)372、373、374；

t)380、381、382；

u)388、389、390；

v)396、397、398；

w)404、405、406；和

x)412、413、414，

并且其中所述硬化蛋白结合剂的VL包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

a)97、98、99；

b)105、106、107；

c)113、114、115；

d)121、122、123；

e)129、130、131；

f)137、138、139；

g)145、146、147；

h)153、154、155；

i)161、162、163；

j)169、170、171；

k)177、178、179；

l)185、186、187；

m)193、194、195；

n)201、202、203；

o)209、210、211；和

p)217、218、219，

并且其中所述DKK1结合剂的VL包含选自由以下SEQ ID NO组成的组的3个CDR：

a)225、226、227；

b)233、234、235；

c)241、242、243；

d)249、250、251；

e)257、258、259；

f)265、266、267；

g)273、274、275；

h)281、282、283；

i)289、290、291；

j)297、298、299；

k)305、306、307；

l)313、314、315；

m)321、322、323；

n)329、330、331；

o)337、338、339；

p)345、346、347；

q)353、354、355；

r)361、362、363；

s)369、370、371；

t)377、378、379；

u)385、386、387；

v)393、394、395；

w)401、402、403；和

x)409、410、411。

50.一种结合分子，其包含四条多肽链，其中第一和第三多肽链包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n，其中：VH1是第一重链可变结构域；VH2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；并且其中第二和第四多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n，其中VL1是第一轻链可变结构域；VL2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述结合分子包含3个VH1 CDR、3个VH2 CDR、3个VL1 CDR和3个VL2 CDR，其中所述配对的VH1和VL1 CDR和配对的VH2和VL2 CDR是选自由以下组成的组：

SEQ ID NO:

a)97至102；

b)105至110；

c)113至118；

d)121至126；

e)129至134；

f)137至142；

g)145至150；

h)153至158；

i)161至166；

j)169至174；

k)177至182；

l)185至190；

m)193至198；

n)201至206；

o)209至214；

p)217至222，

或SEQ ID NO:

b)225至230；

c)233至238；

d)241至246；

e)249至254；

f)257至262；

g)265至270；

h)273至278；

i)281至286；

j)289至294；

k)297至302；

l)305至310；

m)313至318；

n)321至326；

o)329至334；

p)337至342；

q)345至350；

r)353至358；

s)361至366；

t)369至374；

u)377至382；

v)385至390；

w)393至398；

x)401至406；

y)409至414。

51.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:161至163，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:164至166，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:385至387，并且所述VH2CDR是SEQ IDNO:388至390。

52.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:385至387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388至390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:161至163，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:164至166。

53.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:153至155，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:156至158，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:385至387，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:388至390。

54.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:385至387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388至390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:153至155，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:156至158。

55.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:409至411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412至414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:121至123，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:124至126。

56.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:409至411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412至414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:177至179，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:180至182。

57.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:409至411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412至414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:97至99，并且所述VH2 CDR是SEQ ID NO:100至102。

58.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:385至387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388至390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105至107，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:108至110。

59.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:97至99，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:100至102，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:409至411，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:412至414。

60.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:385至387，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:388至390，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105至107，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:108至110。

61.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:409至411，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:412至414，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105至107，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:108至110。

62.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:105至107，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:108至110，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:385至387，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:388至390。

63.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:105至107，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:108至110，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:409至411，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:412至414。

64.如权利要求50所述的结合分子，其中所述VL1 CDR是SEQID NO:369至371，所述VH1 CDR是SEQ ID NO:372至374，所述VL2 CDR是SEQ ID NO:105至107，并且所述VH2 CDR是SEQ IDNO:108至110。

65.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述(X1)n是选自由SEQ ID NO:415至484组成的组。

66.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述(X1)n是选自由SEQ ID NO:440、441、437、438、431、432、483和484组成的组。

67.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:440。

68.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:441。

69.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:437。

70.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n链的所述(X1)n是SEQ ID NO:438。

71.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:440。

72.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:441。

73.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:483。

74.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:484。

75.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:431。

76.如权利要求50至64中任一项所述的结合分子，其中所述VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的所述(X1)n是SEQ ID NO:432。

77.如权利要求1、3、6、24、26和50中任一项所述的结合分子，其中所述VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n和VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n链上的所述(X1)n不同。

78.一种产生结合硬化蛋白与DKK-1的结合分子的方法，其包括以下步骤：(a)获得可结合硬化蛋白或DKK-1的第一亲本抗体或其抗原结合部分；(b)获得可结合硬化蛋白或DKK-1的第二亲本抗体或其抗原结合部分；(c)构建包含VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n的第一和第三多肽链，其中：VH1是得自所述第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一重链可变结构域；VH2是得自所述第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，限制条件为其不为CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；(d)构建包含VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n的第二和第四多肽链，其中：VL1是得自所述第一亲本抗体或其抗原结合部分的第一轻链可变结构域；VL2是得自所述第二亲本抗体或其抗原结合部分的第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；并且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；和(e)表达所述第一、第二、第三和第四多肽链，以产生结合硬化蛋白与DKK-1的结合分子。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述VH1和VH2重链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQID NO:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和216，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400和408，并且其中所述VL1和VL2轻链可变结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：硬化蛋白结合剂SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215，或DKK-1结合剂SEQ ID NO:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399和407。

80.如权利要求78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分各自和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分各自分别地选自由人抗体、CDR移植抗体和人源化抗体组成的组。

81.如权利要求78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分各自和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分各自分别地选自由以下组成的组：Fab片段；F(ab′)₂片段；二价片段，其包含两个于铰链区由二硫桥键连接的Fab片段；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段；分离的互补决定区(CDR)；单链抗体，和双功能抗体。

82.如权利要求78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分具有至少一种由所述结合分子展现的期望性质。

83.如权利要求78所述的方法，其中所述第二亲本抗体或其抗原结合部分具有至少一种由所述结合分子展现的期望性质。

84.如权利要求78所述的方法，其中所述Fc区是选自由天然序列Fc区和变异型序列Fc区组成的组。

85.如权利要求78所述的方法，其中所述Fc区是选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fc区组成的组。

86.如权利要求78所述的方法，其中所述期望性质是选自一个或多个抗体参数。

87.如权利要求78所述的方法，其中所述期望性质是选自一个或多个抗体参数。

88.如权利要求78所述的方法，其中所述抗体参数是选自由以下组成的组：抗原特异性、与抗原的亲和力、效能、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。

89.如权利要求78所述的方法，其中所述抗体参数是选自由以下组成的组：抗原特异性、与抗原的亲和力、效能、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。

90.如权利要求78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的亲和力不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的亲和力。

91.如权利要求78所述的方法，其中所述第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的效能不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的效能。

92.如权利要求78所述的方法，限制条件为所述接头不为CH1。

93.一种药物组合物，其包含如权利要求1至77中任一项所述的结合分子。

94.如权利要求1至77中任一项所述的结合分子，其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一者或多者组合。

95.一种治疗骨病症的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求1至77中任一项所述的结合分子。

96.一种加速骨折修复的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求1至77中任一项所述的结合分子。

97.一种增加骨密度的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求1至77中任一项所述的结合分子。

98.一种增加骨强度的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求1至77中任一项所述的结合分子。

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