EA017203B1

EA017203B1 - Связывающие молекулы человека, способные нейтрализовать вирус гриппа h5n1, и их применение

Info

Publication number: EA017203B1
Application number: EA200970255A
Authority: EA
Inventors: Эдвард Норберт Ван Ден Бринк; Корнелис Адриан Де Крэйф; Марк Тросби
Original assignee: Круселл Холланд Б.В.
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2012-10-30
Also published as: MX2009002174A; CA2663388C; MY170607A; WO2008028946A3; JP5161882B2; US20160024188A1; AU2007293662A1; US9109017B2; ZA200901171B; PL2059532T3; US20090311265A1; IL197390A0; JP2012245003A; JP5701827B2; US8192927B2; EP2059532B1; US8691223B2; JP2010502207A; HRP20130163T1; EP2450377A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, таким как моноклональные антитела человека, которые связываются с вирусом гриппа H5N1 и обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа H5N1. Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим антитела, их последовательностям и композициям, включающим указанные антитела, а также к способам идентификации или получения антител. Указанные антитела могут быть использованы для диагностики, профилактики и/или лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные антитела обеспечивают перекрестную защиту in vivo от разных подтипов вируса гриппа, что позволяет предотвратить и/или лечить грипп, вызываемый подтипами вируса гриппа на основе Н5, Н2, Н6, Н9 и H1.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к медицине. В частности, настоящее изобретение относится к диагностике, профилактике и/или лечению гриппа, вызываемого вирусом гриппа Η5Ν1.

Уровень техники

Вирусы гриппа состоят из трех типов А, В и С. Вирусы гриппа типа А инфицируют целый ряд птиц и млекопитающих, включая человека, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и цыплят. Вирусы гриппа типа А вызывают у животных легкие локализованные формы инфекций дыхательных путей и кишечника. Однако существуют высокопатогенные штаммы вируса гриппа типа А, такие как Η5Ν1, которые вызывают системные инфекции у домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. Животные, инфицированные вирусом гриппа типа А, часто являются переносчиками вирусов гриппа, при этом установлено, что некоторые подтипы могут передаваться человеку.

Вирусы гриппа типа А можно классифицировать на подтипы на основании аллельных вариаций в антигенных областях двух генов, кодирующих поверхностные гликопротеины, а именно гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ΝΑ), которые необходимы для присоединения и высвобождения вируса из клетки. Другие основные вирусные белки включают нуклеопротеин, структурный белок нуклеокапсида, мембранные белки (М1 и М2), полимеразы (РА, РВ и РВ2) и неструктурные белки (N81 и N82).

В настоящее время известны шестнадцать подтипов НА (Н1-Н16) и девять антигенных вариантов ΝΑ (Ν1-Ν9) вируса гриппа типа А. Ранее были известны только три подтипа, поражающие человека (Η1Ν1, Η1Ν2 и Η3Ν2). Однако за последние годы были получены данные о том, что патогенный подтип Η5Ν1 вируса птичьего гриппа типа А смог преодолеть межвидовой барьер и инфицировать человека, став причиной смерти нескольких субъектов, что было зарегистрировано в Гонконге в 1997 и 2003 гг.

Вирус птичьего гриппа поражает у человека клетки дыхательных путей, а также кишечник, печень, селезенку, почки и другие органы. Для птичьего гриппа характерны такие симптомы как жар, затруднение дыхания, включая одышку и кашель, лимфопения, диарея и нарушение регулирования уровней сахара в крови. В отличие от сезонного гриппа наибольшему риску подвергаются здоровые взрослые люди, составляющие основную часть населения. Из-за высокой патогенности определенных подтипов вируса птичьего гриппа типа А, в частности Η5Ν1, и продемонстрированной ими способности инфицировать человека существует большой экономический и общественный риск для здоровья людей, обусловленный указанными вирусными штаммами, включая реальную опасность распространения эпидемии и пандемии данного заболевания. Масштаб опасности можно проиллюстрировать пандемией гриппа в 1918 г., который стал причиной смерти более 50 млн человек.

В настоящее время нет эффективных вакцин от гриппа, вызываемого Η5Ν1, поэтому пассивная иммунотерапия с использованием иммуноглобулинов может быть альтернативным методом лечения. Как было отмечено в научной литературе, пассивная вакцинация во время пандемии 1918 г. позволила вдвое сократить смертность. Таким образом, с учетом благоприятного терапевтического воздействия иммуноглобулинов на людей существует потребность в связывающих молекулах, предпочтительно в связывающих молекулах человека, способных нейтрализовать Η5Ν1. Настоящее изобретение позволяет получить такие связывающие молекулы и показывает, что они могут быть использованы в медицине, в частности для диагностики, профилактики и/или лечения гриппа, вызываемого Η5Ν1.

Описание чертежей

На фиг. 1 показан анализ методом иммуноблоттинга разных гемагглютининов (НА) с использованием антител СК6307 (левая часть), СР6323 (средняя часть) и СВ5111 (правая часть). Рекомбинантные НА подвергали анализу методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Ό8-ΡΑΟΕ) и иммуноблоттинга. В полосах 1 показан §ΗΑ штамма Η5Ν1Τν; в полосах 2 показан рекомбинантный НА, подтип Н5 (А/Вьетнам/1203/2004 (Η5Ν1)); в полосах 3 показан рекомбинантный НА, подтип Н3 (А/Вайоминг/3/2003 (Η3Ν2)); и в полосах 4 показан рекомбинанный НА, подтип Η1 (А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1). Указано также положение, где могут быть обнаружены НА0, НА1 и НА2.

На фиг. 2 показана средняя клиническая оценка для группы мышей, полученная при выполнении исследования (пример 12), в котором за один день до инфицирования вирусом гриппа Η5Ν1 мышам профилактически вводили в разных дозах три моноклональных антитела человека против Η5Ν1: СР6261. СВ6323 и СВ6325.

На фиг. 3 показано изменение массы тела во время профилактического введения мышам антител против Η5Ν1 в течение 21 дня после инфицирования (пример 12).

На фиг. 4 показано число выживших мышей в разных группах при выполнении исследования, представленного на фиг. 2 и 3 (пример 12).

На фиг. 5 показана смертность в зависимости от дозы антител против Η5Ν1, вводимой при выполнении исследования, представленного на фиг. 2-4 (пример 12).

На фиг. 6 показана средняя клиническая оценка для группы мышей, полученная при выполнении исследования (пример 13), в котором мышей инфицировали смертельной дозой вируса гриппа Η5Ν1 и в разные периоды времени после инфицирования (4 ч, 1, 2 и 3 дня) вводили моноклональное антитело против Η5Ν1 СВ6261 или неродственное антитело СР2006 (которое вводили в 1-й день после инфицирования).

- 1 017203

На фиг. 7 показано число выживших животных в каждой группе при выполнении исследования, представленного на фиг. 6. Все животные в группах 1-4 за исключением одного животного в группе 1 были живы в течение всего исследования до 21-го дня после инфицирования. Все животные в группе 5 умерли на 9-й день.

На фиг. 8 показнаа средняя масса тела мышей в каждой группе при выполнении исследования, представленного на фиг. 6. Массу тела мышей в группе 5 прекратили измерять на 9-й день, так как все мыши в указанной группе умерли к данному времени. Все остальные мыши в группах 1-4 достигли нормальной массы тела на 21-й день после инфицирования, хотя скорость восстановления массы тела в каждой группе зависела от времени начала лечения.

На фиг. 9 показано процентное значение выживших животных в каждой группе при выполнении исследования, в котором мышей инфицировали смертельной дозой вируса гриппа Η1Ν1 и в разные периоды времени (за 1 день до инфицирования, через 1, 2 и 3 дня после инфицирования) вводили моноклональное антитело против Η5Ν1 СК.6261 или неродственное антитело СВ57 (которое вводили в 1-й день после инфицирования).

На фиг. 10 показана средняя масса тела мышей в каждой группе при выполнении исследования, представленного на фиг. 9. Массу тела мышей в группе 5 прекратили измерить на 9-й день, так как все мыши в указанной группе умерли к данному времени. Все остальные мыши в группах 1-4 достигли нормальной массы тела на 21-й день после инфицирования, хотя скорость восстановления массы тела в каждой группе зависела от времени начала лечения.

Описание изобретения

Ниже приведены определения терминов, использованных в настоящем описании изобретения.

В значении, использованном в настоящем описании изобретения, термин связывающая молекула означает интактный иммуноглобулин, включающий моноклональные антитела, такие как химерные, гуманизированные или моноклональные антитела человека, или антигенсвязывающий и/или содержащий вариабельную область фрагмент иммуноглобулина, конкурирующий с интактным иммуноглобулином за специфическое связывание с партнером связывания иммуноглобулина, например Η5Ν1. Независимо от структуры антигенсвязывающий фрагмент связывается с антигеном, узнаваемым интактным иммуноглобулином. Антигенсвязывающий фрагмент может включать пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 или 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности связывающей молекулы.

Термин связывающая молекула в используемом здесь значении включает все классы и подклассы иммуноглобулинов, известные в данной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей связывающие молекулы можно разделить на пять основных классов интактных антител: 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дС и 1дМ, при этом некоторые из указанных классов можно далее разделить на подклассы (изотипы), например 1дА1, 1дА2, 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4.

Антигенсвязывающие фрагменты включают, в частности, фрагменты области, определяющей комплементарность, (СЭЯ)ЕаЬ. Е(аЬ'), Е(аЬ')₂, Εν, бАЬ. Еб, одноцепочечные антитела (κοΕν), двухвалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела, триатела, тетратела (поли)пептиды, содержащие, по меньшей мере, фрагмент иммуноглобулина, достаточный для обеспечения специфического связывания антигена с (поли)пепитидом и т.д. Вышеуказанные фрагменты могут быть получены методами синтеза, путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов либо генетически созданы методами рекомбинантных ДНК. Методы получения таких фрагментов хорошо известны в данной области и описаны, например, в публикации ЛпЦЬоб1С5: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Ебйеб Ьу: Е. Наботе апб Ό. Ьапе (1988), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1б 8рппд НагЬог, №те Уогк, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент могут иметь один или несколько сайтов связывания. При наличии нескольких сайтов связывания такие сайты связывания могут быть одинаковыми или разными.

Связывающая молекула может быть голой или неконъюгированной связывающей молекулой, но также может быть частью иммуноконъюгата. Голая или неконъюгированная связывающая молекула является связывающей молекулой, которая не конъюгирована, функционально не связана или каким-либо другим образом физически или функционально не связана с эффекторной частью или меткой, такой как, например, токсическое вещество, радиоактивное вещество, липосома, фермент. Следует отметить, что голые или неконъюгированные связывающие молекулы включают также связывающие молекулы, которые были стабилизированы, полимеризованы, гуманизированы или изменены каким-либо другим образом за исключением присоединения эффекторной части или метки. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят все модифицированные после трансляции голые и неконъюгированные связывающие молекулы, включая модификации, произведенные в естественном окружении клетки, продуцирующей связывающую молекулу, клеткой, продуцирующей рекомбинантную связывающую молекулу, и введенные человеком после получения исходной связывающей молекулы. Термин голая или неконъюгированная связывающая молекула, несомненно, предполагает способность связывающей молекулы образовывать функциональные связи с эффекторными клетками и/или молекулами после введения в ор

- 2 017203 ганизм, так как некоторые из таких взаимодействий необходимы для оказания биологического действия. Поэтому отсутствие связанной эффекторной группы или метки применимо к определению голой или неконъюгированной связывающей молекулы ίη νίΐτο, но не ίη νίνο.

В используемом здесь значении термин биологический образец означает образцы разных типов, включая пробы крови и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые образцы ткани, такие как биоптат или культуры ткани, или клетки, полученные из указанных образцов, и их потомство. В определение данного термина входят также образцы, которые были каким-либо образом изменены после их получения, например в результате обработки реагентами, солюбилизации или обогащения определенными компонентами, такими как белки или полинуклеотиды. Указанный термин служит для определения разных типов клинических образцов, полученных у любого вида, а также включает клетки в культуре, клеточные супернатанты и клеточные лизаты.

Термин области, определяющие комплементарность (СЭК.) в используемом здесь значении означает последовательности в вариабельных областях связывающих молекул, таких как иммуноглобулины, которые обычно в значительной степени способствуют образованию антигенсвязывающего сайта, комплементарного по форме и распределению заряда узнаваемого эпитопа антигена. Области СЭК. могут быть специфичными к линейным эпитопам, эпитопам прерывистого типа или конформационным эпитопам белков или фрагментов белков, присутствующим в белке в нативной конформации или в некоторых случаях в денатурированной форме, например в результате солюбилизации в 8Ό8. Эпитопы могут также состоять из посттрансляционных модификаций белков.

Термин делеция в используемом здесь значении означает изменение аминокислотной или нуклеотидной последовательности, в которой отсутствует один или несколько аминокислотных или нуклеотидных остатков по сравнению с исходной часто природной молекулой.

Термин регулирующая экспрессию последовательность нуклеиновой кислоты в используемом здесь значении означает полинуклеотидные последовательности, необходимые для экспрессии и/или влияющие на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регулирующие экспрессию последовательности нуклеиновых кислот, в частности соответствующие инициирующие и терминирующие транскрипцию, промоторные, энхансерные последовательности; репрессорные или активаторные последовательности; эффективные РНК-процессирующие сигналы, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, усиливающие эффективность трансляции (например, сайты связывания рибосомы); последовательности, повышающие устойчивость белка; и при желании последовательности, усиливающие секрецию белка, могут представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, проявляющую активность в выбранном организме-хозяине, и могут быть выделены из генов, кодирующих белки, которые являются гомологичными или гетерологичными организму-хозяину. Специалисту в данной области хорошо известны методы идентификации и использования регулирующих экспрессию последовательностей.

Термин функциональный вариант в используемом здесь значении означает связывающую молекулу, включающую нуклеотидную и/или аминокислотную последовательность, которая изменена одним или несколькими нуклеотидами и/или аминокислотами по сравнению с нуклеотидными и/или аминокислотными последовательностями исходной связывающей молекулы, но при этом по-прежнему может конкурировать за связывание с партнером связывания, например Η5Ν1, с исходной связывающей молекулой. Другими словами, модификации аминокислотной и/или нуклеотидной последовательности исходной связывающей молекулы не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания связывающей молекулы, кодированной данной нуклеотидной последовательностью или содержащей данную аминокислотную последовательность, т.е. связывающая молекула по-прежнему может узнавать и связывать свою мишень. Функциональный вариант может содержать консервативные модификации последовательности, включающие замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Указанные модификации могут быть произведены стандартными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и неспецифический ПЦР-опосредованный мутагенез, и могут включать природные, а также неприродные нуклеотиды и аминокислоты.

Консервативные замены аминокислот включают замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, обладающим аналогичными структурными или химическими свойствами. В данной области определены семейства аминокислотных остатков с одинаковыми боковыми цепями. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), лишенными заряда полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Специалисту в данной области должно быть известно, что могут быть использованы другие классификации семейств аминокислотных остатков, отличные от вышеуказанной классификации. Кроме того, вариант может содержать неконсервативные замены аминокислот, например замену аминокислоты

- 3 017203 аминокислотным остатком, обладающим другими структурными или химическими свойствами. Подобные незначительные вариации могут также включать делеции или инсерции аминокислот либо как делеции, так и инсерции. Аминокислотные остатки, которые могут быть заменены, вставлены или удалены без нарушения иммунологической активности, можно определить с помощью компьютерных программ, хорошо известных в данной области.

Мутация в нуклеотидной последовательности может быть единственным изменением, произведенным в локусе (точковая мутация), таким как транзиция или трансверсия, или, альтернативно, в одном локусе может быть вставлено, удалено или заменено несколько нуклеотидов. Кроме того, одно или несколько изменений может быть произведено в любом числе локусов нуклеотидной последовательности. Мутации могут быть выполнены любым приемлемым методом, известным в данной области.

Термин хозяин в используемом здесь значении означает организм или клетку, в которую введен вектор, такой как клонирующий вектор или вектор экспрессии. Организм или клетка могут быть прокариотическими или эукариотическими. Следует отметить, что в определение данного термина входит не только определенный организм или клетка, но также потомство такого организма или клетки. Так как в последующих поколениях могут иметь место определенные изменения, возникшие вследствие мутации или под влиянием окружающей среды, такое потомство фактически может не быть идентичным исходному организму или клетке, но по-прежнему входит в определение термина хозяин в значении, используемом в настоящем описании изобретения.

Термин человеческий применительно к связывающим молекулам по настоящему изобретению означает молекулы, которые непосредственно получены у человека или созданы на основе человеческой последовательности. Если связывающая молекула получена или создана на основе человеческой последовательности и затем модифицирована, такая молекула по-прежнему считается человеческой в значении, используемом в настоящем описании изобретения. Другими словами, термин человеческий применительно к связывающим молекулам включает связывающие молекулы, содержащие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека или созданные на основе вариабельных или константных областей, присутствующих в лимфоцитах человека и модифицированных каким-либо образом. Таким образом, связывающие молекулы человека могут содержать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека, включать замены и/или делеции (например, мутации, введенные, например, путем неспецифического или сайт-специфического мутагенеза ίη νίίτο или в виде соматической мутации ίη νίνο). Термин на основе использован в настоящем описании изобретения применительно к ситуации, когда последовательность нуклеиновой кислоты может быть точно скопирована с матрицы или получена с незначительными мутациями, например, при помощи подверженных ошибкам методов ПЦР, или синтезирована в соответствии с матрицей в виде точной копии или с незначительными модификациями. Полусинтетические молекулы, полученные на основе последовательностей человека, также считаются человеческими в соответствии с определением, используемым в настоящем описании изобретения.

Термин инсерция, известный также как термин добавление, означает изменение в аминокислотной или нуклеотидной последовательности, представляющее собой добавление одного или нескольких аминокислотных или нуклеотидных остатков по сравнению с исходной последовательностью.

Термин выделенный применительно к связывающим молекулам по настоящему изобретению означает связывающие молекулы, которые, по существу, не содержат других белков или полипептидов, в частности не содержат других связывающих молекул, обладающих другими антигенными специфичностями, а также, по существу, не содержат другого клеточного вещества и/или химических веществ. Например, связывающие молекулы, полученные рекомбинантными методами, предпочтительно, по существу, не содержат культуральной среды, и связывающие молекулы, полученные методами химического синтеза, предпочтительно, по существу, не содержат химических предшественников или других химических веществ, т.е. указанные молекулы отделены от химических предшественников или других химических веществ, используемых в процессе синтеза белка. Термин выделенный применительно к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы по настоящему изобретению, означает молекулы нуклеиновых кислот, в которых нуклеотидные последовательности, кодирующие связывающие молекулы, не содержат других нуклеотидных последовательностей, в частности нуклеотидных последовательностей, кодирующих связывающие молекулы, которые связываются с партнерами связывания, отличными от Η5Ν1. Кроме того, термин выделенный относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые, по существу, полностью отделены от других клеточных компонентов, сопровождающих нативную молекулу нуклеиновой кислоты в естественных условиях в природном хозяине, таких как, например, рибосомы, полимеразы или геномные последовательности, с которыми данная молекула связана в естественных условиях. Кроме того, выделенные молекулы нуклеиновых кислот, такие как молекулы кДНК, могут, по существу, не содержать другого клеточного вещества или культуральную среду при получении рекомбинантными методами или могут, по существу, не содержать химических предшественников или других химических веществ при получении методами химического синтеза.

Термин моноклональное антитело в используемом здесь значении означает препарат молекул ан

- 4 017203 титела с одинаковым молекулярным составом. Моноклональное антитело характеризуется одной специфичностью связывания и сродством к конкретному эпитопу. Таким образом, термин моноклональное антитело человека означает антитело, обладающее одной специфичностью связывания, которое содержит вариабельные и константные области, выделенные из последовательностей иммуноглоблулина зародышевой линии клеток человека или полученные на их основе или выделенные из полностью синтетических последовательностей. Способ получения моноклонального антитела не имеет конкретного значения.

Термин природный в значении, используемом в настоящем описании изобретения применительно к объекту, означает, что данный объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме, которая может быть выделена из природного источника и не была намеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, является природной последовательностью.

Термин молекула нуклеиновой кислоты в значении, используемом в настоящем изобретении, означает полимерную форму нуклеотидов и включает смысловые и антисмысловые цепи РНК, кДНК, геномной ДНК, а также синтетические формы и смешанные полимеры вышеуказанной молекулы. Нуклеотид является рибонуклеотидом, дезоксинуклеотидом или модифицированной формой нуклеотида любого типа. В определение данного термина входят также одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. Кроме того, полинуклеотид может включать природные и модифицированные нуклеотиды либо те и другие вместе, связанные природными и/или неприродными нуклеотидными связями. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химическими или биохимическими методами либо могут содержать неприродные или производные нуклеотидные основания, что должно быть хорошо известно специалистам в данной области. Такие модификации включают, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как неполяризованные связи (например, метилфосфонаты, сложные фосфортриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.), поляризованные связи (например, фосфортиоаты, фосфордитиоаты и т.д.), части с боковыми цепями (например, полипептиды), интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), хелаторы, алкилаторы и модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). В определение вышеуказанного термина входит также любая топологическая конформация, включающая одноцепочечные, двухцепочечные, частично дуплексные, триплексные, шпилькообразные, кольцевые и подобные висячему замку конформации. Кроме того, указанный термин включает синтетические молекулы, имитирующие способность полинуклеотидов связываться с определенной последовательностью при помощи водородной связи и других химических взаимодействий. Такие молекулы известны в данной области и включают, например, молекулы, в которых фосфатные связи в остове молекулы заменены пептидными связями. Применительно к последовательности нуклеиновой кислоты указанная молекула включает комплемент за исключением особо оговоренных случаев. Таким образом, в определение молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей определенную последовательность, входит комплементарная цепь с комплементарной последовательностью. Комплементарная цепь может быть также использована, например, в терапии антисмысловыми последовательностями при создании гибридизирующих зондов и праймеров для ПЦР.

Термин функционально связанный относится к двум или более элементам последовательности нуклеиновой кислоты, которые обычно физически связаны и функционально взаимодействуют друг с другом. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если данный промотор может инициировать или регулировать транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности, при этом считается, что кодирующая последовательность контролируется промотором.

Термин фармацевтически приемлемый наполнитель означает любое инертное вещество, объединенное с активной молекулой, такой как лекарственное средство, агент или связывающая молекула, для получения отвечающей требованиям или стандартной лекарственной формы. Фармацевтически приемлемый наполнитель является наполнителем, который не токсичен для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и совместим с другими ингредиентами композиции, содержащей данное лекарственное средство, агент или связывающую молекулу. Фармацевтически приемлемые наполнители широко применяются в данной области.

Термин специфическое связывание в используемом здесь значении применительно к взаимодействию связывающей молекулы, например антитела, и партнера связывания, например антигена, означает, что данное взаимодействие зависит от наличия у партнера связывания определенной структуры, например антигенной детерминанты или эпитопа. Другими словами, антитело предпочтительно связывает или узнает своего партнера связывания, даже если такой партнер связывания находится в смеси с другими молекулами или организмами. Связывание может быть опосредовано ковалентными или нековалентными взаимодействиями либо комбинацией обоих взаимодействий. Таким образом, термин специфическое связывание означает иммуноспецифическое связывание с одним антигеном или его фрагментом и отсутствие иммуноспецифического связывания с другими антигенами. Связывающая молекула, которая иммуноспецифически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низким сродством, определяемым, например, при помощи радиоиммуноанализов (К1А), твердофазных иммуноферментных анализов (ЕЬ18А), В1АСОКЕ или других анализов, известных в дан

- 5 017203 ной области. Связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, могут перекрестно взаимодействовать с родственными антигенами. Связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, предпочтительно перекрестно не взаимодействуют с другими антигенами.

Термин замена в используемом здесь значении означает замену одной или нескольких аминокислот или нуклеотидов соответственно другими аминокислотами или нуклеотидами.

Термин терапевтически эффективное количество означает количество связывающей молекулы по настоящему изобретению, которое позволяет эффективно предотвращать, ослаблять и/или лечить состояние, возникающее вследствие инфицирования Η5Ν1.

Термин лечение означает терапевтическое лечение, а также профилактические или превентивные меры, направленные на лечение, прекращение развития или, по меньшей мере, замедление развития заболевания. Нуждающимися в лечении субъектами являются субъекты, страдающие заболеванием, возникшим вследствие инфицирования Η5Ν1, а также субъекты, инфицирование которых Η5Ν1 необходимо предотвратить. Субъекты, которые частично или полностью выздоровели после инфицирования Η5Ν1, могут также нуждаться в лечении. Профилактика предполагает ингибирование или уменьшение распространения Η5Ν1 либо ингибирование или уменьшение возникновения, развития или прогрессирование одного или нескольких симптомов, ассоциированных с инфицированием Η5Ν1.

Термин вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть вставлена вторая молекула нуклеиновой кислоты для введения хозяину, где она будет реплицирована и в некоторых случаях экспрессирована. Другими словами, вектор может переносить молекулу нуклеиновой кислоты, с которой он связан. В определение термина вектор в значении, используемом в настоящем описании изобретения, входят клонирующие векторы и векторы экспрессии. Векторы включают, не ограничиваясь ими, плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и дрожжевые искусственные хромосомы (УАС), а также векторы, полученные из бактериофагов, растительных или животных (включая человека) вирусов. Векторы включают ориджин репликации, узнаваемый предполагаемым хозяином, и в случае векторов экспрессии, промотор и другие регуляторные области, узнаваемые хозяином. Вектор, содержащий вторую молекулу нуклеиновой кислоты, вводят в клетку путем трансформации, трансфекции или использования механизмов проникновения вирусов. Некоторые векторы могут автономно реплицировать в хозяине, в который они были введены (например, векторы с репликацией бактериального типа могут реплицировать в бактериях). Другие векторы могут быть интегрированы в геном хозяина при введении в хозяина и, таким образом, реплицируют вместе с геномом хозяина.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам человека, способным специфически связываться с вирусом гриппа Η5Ν1 и обладающим нейтрализующей активностью в отношении Η5Ν1. Настоящее изобретение относится также к связывающим молекулам, связывающимся с эпитопом в белке гемагглютинина, который является одинаковым в разных подтипах вируса гриппа и поэтому родственным связывающим молекулам, перекрестно взаимодействующим с подтипами вируса гриппа Н5, Η1, Η2, Н6 и Н9, такими как Η5Ν1, Η1Ν1 и другими штаммами гриппа, содержащими белок НА с вышеуказанными эпитопами. Настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим, по меньшей мере, область связывания связывающих молекул человека. Настоящее изобретение далее относится к применению связывающих молекул человека по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения субъекта, страдающего гриппом, вызываемым вирусом Η5Ν1, или находящегося в условиях повышенного риска возникновения гриппа, вызываемого вирусом Η5Ν1. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению связывающих молекул человека по настоящему изобретению для диагностики/обнаружения Η5Ν1.

Подробное описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы, способные специфически связываться с вирусом гриппа типа А, в частности с вирусом гриппа типа А подтипа Η5Ν1. Связывающие молекулы предпочтительно являются связывающими молекулами человека. Связывающие молекулы по настоящему изобретению предпочтительно обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа типа А подтипа Η5Ν1. Другим объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы, способные специфически связываться с разными штаммами вируса гриппа Η5Ν1 и/или обладают нейтрализующей активностью в отношении указанных штаммов. Указанные штаммы могут входить в штаммы вируса гриппа Η5Ν1 клада 1, клада 2 или клада 3. Филогенетические анализы генов НА, выполненные во время вспышки гриппа, вызванного Η5Ν1, в 2004 и 2005 гг., показали наличие двух разных линий генов НА, получивших название кладов 1 и 2. Вирусы в каждом из указанных кладов распространены в неперекрывающихся географических районах Азии. Вирусы Η5Ν1 с Индокитайского полуострова полностью соответствуют кладу 1, в то время как изоляты Η5Ν1, полученные в нескольких соседних странах, отличаются от изолятов клада 1 и относятся к более разнообразному кладу 2. Вирусы Η5Ν1 клада 1 были выделены у людей и птиц во Вьетнаме, Таиланде и Камбодже, но только у птиц - в Лаосе и Малайзии. Вирусы клада 2 были обнаружены в вирусах, выделенных исключительно у птиц в Китае, Индонезии, Японии и Южной Корее. Вирусы, выделенные у птиц и людей в Гонконге в

- 6 017203

2003 и 1997 гг., образовали соответственно клады 1' (также определяемые в кладе 1) и 3 (см. АНО С1оЬа1 1пПиспха Ргодгат ЗитуеШаисе №1\уогк. 2005). Гемагглютинины указанных кладов имеют разные аминокислотные последовательности. Примеры штаммов клада 1 включают. не ограничиваясь ими, А/Гонконг/213/03, А/Вьетнам/1194/04, А/Вьетнам/1203/04 и А/Таиланд/1(КА№1)/2004. Примеры штаммов клада 2 включают, не ограничиваясь ими, А/Индонезия/5/05, А/горный гусь/Куинхай/1А/05, А/индейка/Турция/1/05 и А/Аньхой/1/05. Примеры штаммов клада 3 включают, не ограничиваясь ими, А/Гонконг/156/97 и А/гусь/Гуандун/1/96. Другие штаммы можно найти, например, в публикации АНО С1оЬа1 1пПиепха Ргодгат ЗитуеШаисе №1\тогк. 2005 и на сайте 1Шр://\у\у\у.\у1ю.ш1/с5г/Й15еа5е/ау1ап 1иПиепха/дшйеПпеУгесотпюпйаНопуассше.рйГ. Связывающие молекулы по настоящему изобретению предпочтительно могут специфически связываться со штаммами клада 1, клада 2 и клада 3 и обладают нейтрализующей активностью в отношении указанных штаммов. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут специфически связываться с вирусом гриппа Η5Ν1, который является жизнеспособным, живым и/или инфективным или находится в инактивированной/ослабленной форме. Методы инактивации/ослабления вируса гриппа Η5Ν1 хорошо известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, воздействие формалином, β-пропиолактоном (ВРЬ), мертиолатом и/или ультрафиолетовым светом.

Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут также специфически связываться с одним или несколькими фрагментами вируса гриппа Η5Ν1, такими как, например, препарат одного или нескольких белков и/или (поли)пептидов, полученных из подтипа Η5Ν1, или одного или нескольких белков и/или полипептидов Η5Ν1, полученных рекомбинантными методами. При осуществлении способов лечения и/или профилактики гриппа, вызываемого вирусом Η5Ν1, связывающие молекулы предпочтительно могут специфически связываться с доступными поверхностными белками Η5Ν1, такими как поверхностные гликопротеины, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ΝΑ), которые необходимы для присоединения и высвобождения вируса из клетки, или мембранные белки (М1 и М2). В конкретном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут специфически связываться с молекулой НА штаммов Η5Ν1. Связывающие молекулы могут специфически связываться с субъединицей НА1 и/или НА2 молекулы НА. Связывающие молекулы могут специфически связываться с линейными, структурными и/или конформационными эпитопами в субъединице НА1 и/или НА2 молекулы НА. Молекула НА может быть очищена от вирусов или получена рекомбинантными методами и необязательно выделена перед использованием. Альтернативно НА может быть экспрессирован на поверхности клеток.

В диагностических целях связывающие молекулы могут также специфически связываться с белками, не присутствующими на поверхности Η5Ν1, которые включают нуклеопротеин, структурный белок нуклеокапсида, полимеразы (РА, РВ и РВ2) и неструктурные белки (N81 и N82). Нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности белков разных штаммов Η5Ν1 могут быть найдены в базе данных СеиВаик, базе данных последовательностей вирусов гриппа NСВI, базе данных последовательностей вирусов гриппа (Ι8Ό), базе данных ЕМВЬ и/или других базах данных. Специалисты в данной области могут легко получить доступ к соответствующим базам данных с целью нахождения таких последовательностей.

В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут специфически связываться с фрагментом вышеуказанных белков и/или полипептидов, если указанный фрагмент содержит по меньшей мере один эпитоп, узнаваемый связывающими молекулами по настоящему изобретению. Термин эпитоп в используемом здесь значении означает часть, способную связываться со связывающей молекулой по настоящему изобретению с достаточно высоким сродством с образованием обнаруживаемого комплекса антиген-связывающая молекула. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут или не могут специфически связываться с внеклеточной частью НА (именуемым также в настоящем описании изобретения растворимым гемагглютинином (&ΗΑ)).

Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть интактными молекулами иммуноглобулина, такими как поликлональные или моноклональные антитела, либо связывающие молекулы могут быть антигенсвязывающими фрагментами, включающими, не ограничиваясь ими, ЕаЬ, Е(аЬ'), Е(аЬ')₂, Εν, йАЬ, Ей, фрагменты области, определяющей комплементарность (СЭЯ), одноцепочечные антитела (ксЕу), двухвалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела, триатела, тетратела и (поли)пептиды, содержащие по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина, достаточный для обеспечения специфического связывания антигена со штаммами вируса гриппа Η5Ν1 или его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению являются моноклональными антителами человека.

Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы в невыделенной или выделенной форме. Кроме того, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы отдельно или в смеси, включающей по меньшей мере одну связывающую молекулу (ее вариант или фрагмент) по настоящему изобретению. Другими словами, связывающие молекулы могут быть использованы в комбинации, например, в виде фармацевтической композиции, содержащей две или более связывающих молекул по настоящему изобретению, их вариантов или фрагментов. Например, свя

- 7 017203 зывающие молекулы, обладающие разной, но комплементарной активностью, могут быть объединены в монотерапии для достижения требуемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта, и, альтернативно, связывающие молекулы, обладающие одинаковой активностью, могут быть также объединены в монотерапии для достижения требуемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта. Указанная смесь может далее необязательно включать по меньшей мере одно другое лекарственное средство. Для профилактики и/или лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа Η5Ν1, могут быть использованы такие лекарственные средства, как, например, ингибиторы М2 (например, амантидин, римантадин) и/или ингибиторы нейраминидазы (например, занамивир, озелтамивир).

Связывающие молекулы по настоящему изобретению обычно могут связываться со своими партнерами связывания, т.е. вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментами, с константой сродства (значение Ка), которая меньше 0,2х10^-4 М, 1,0х10^-5 М, 1,0х10^-6 М, 1,0х10^-7 М, предпочтительно меньше 1,0х10^-8 М, более предпочтительно меньше 1,0х10^-9 М, более предпочтительно меньше 1,0х10^-10 М, еще предпочтительнее меньше 1,0 х10^-11 М и, в частности, меньше 1,0 х10^-12 М. Константы сродства могут быть разными для разных изотипов антител. Например, аффинное связывание для изотипа 1дМ соответствует сродству связывания, равному по меньшей мере примерно 1,0х10^-7 М. Константы сродства можно измерить, используя резонанс поверхностного плазмона, например, в системе В1ЛСОКЕ (Рйатшаша Вюкепкот АВ, Ирр8а1а, Елтебеп).

Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут связываться с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом в растворимой форме, например в образце или суспензии, или могут связываться с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом, связанным или прикрепленным к носителю или субстрату, например на титрационных микропланшетах, мембранах, гранулах и т.д. Носители или субстраты могут быть изготовлены из стекла, пластика (например, полистирола), полисахаридов, найлона, нитроцеллюлозы, тефлона и т.д. Поверхность таких носителей может быть твердой или пористой и может иметь любую удобную форму. Кроме того, связывающие молекулы могут связываться с вирусом гриппа Η5Ν1 в очищенной/выделенной или неочищенной/невыделенной форме.

Связывающие молекулы по настоящему изобретению обладают нейтрализующей активностью. Нейтрализующую активность можно измерить методами, представленными в настоящем описании изобретения. Альтернативные анализы, позволяющие измерить нейтрализующую активность, описаны, например, в руководстве \УНО Мапиа1 оп Ашша1 1пГ1иепха П1адпо8щ апб 8игуеШапее, Оепеуа: \Уог1б НеаИй Отдашкабоп, 2005, уегаюп 2002.5. Настоящее изобретение относится к выделенной связывающей молекуле человека, способной узнавать и связываться с эпитопом в субъединице НА2 белка гемагглютинина (НА) вируса гриппа, отличающейся тем, что указанная связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Н5. Примеры штаммов вируса гриппа, которые содержат такой НА подтипа Н5 и являются важными штаммами с учетом опасности пандемии, включают Η5Ν1, Η5Ν2, Η5Ν8 и Η5Ν9. Особенно предпочтительными являются связывающие молекулы, которые, по меньшей мере, нейтрализуют штамм вируса гриппа Η5Ν1. Указанная связывающая молекула по настоящему изобретению предпочтительно не зависит от эпитопа субъединицы НА1 белка НА для связывания с указанным белком НА. Известное антитело мыши, описанное в данной области (С179), которое связывается с тем же эпитопом в домене НА2, зависит также от связывания с эпитопом в домене НА1 белка НА. Такое условие является неблагоприятным, так как создает возможность для ускользания мутантов, которые не могут быть больше узнаны антителом. Кроме того, ряд антител по настоящему изобретению (таких как СК.6307 и СК.6323) не зависит от конформационных эпитопов и узнает эпитоп НА2 даже в уменьшенной форме (при использовании вестерн-блоттинга). Такие антитела обладают преимуществом по сравнению с антителами, известными в данной области, так как, если изменение конформации вызвано белком НА вследствие мутации в другой части белка, такое изменение конформации скорее всего не воспрепятствует связыванию антител по настоящему изобретению с эпитопом НА2, в то время как антитела, зависящие от конформации, могут утратить способность связываться при возникновении таких мутаций.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающая молекула по настоящему изобретению также обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Η1, и указанная связывающая молекула предпочтительно обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Н2, Н6 и/или Н9. В настоящем описании изобретения показано, что связывающие молекулы по настоящему изобретению взаимодействуют с эпитопом, присутствующим в эпитопах НА2, имеющихся в подтипах Н5, Η1, Η2, Н6 и Н9, а также показано, что связывающие молекулы по настоящему изобретению перекрестно нейтрализуют подтипы вируса гриппа благодаря наличию данного эпитопа. Можно сделать вывод о том, что связывающие молекулы по настоящему изобретению, которые зависят от связывания с определенной частью домена НА2 (а не от другого подверженного мутациям эпитопа в НА1) могут перекрестно нейтрализовать подтипы вируса гриппа, так как указанные молекулы, по-видимому, не зависят от связывания с доменами в НА1, которые могут быть существенно изменены в результате дрейфа антигенов. На основании настоящего описания изобретения квалифицированный специалист может теперь определить, дейст

- 8 017203 вительно ли антитело перекрестно взаимодействует с белками НА из разных подтипов и способно ли данное антитело нейтрализовать вирусы гриппа разных подтипов ίη νίνο.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающая молекула по настоящему изобретению связывается с эпитопом в субъединицу НА2, выбираемой из группы, включающей аминокислотную последовательность ΟνΤΝΚνΝΞΙΙΌΚ (8ЕО ΙΌ N0: 368), ΟνΤΝΚνΝδΙΙΝΚ (8Е0 ΙΌ N0: 369), ΟνΤΝΚΕΝδΙΙΌΚ (8ΕΟ ΙΌ N0: 370), ΟνΤΝΚνΝΚΙΙΌΚ (8ΕΟ ΙΌ N0: 371), ΟΙΤΝΚνΝδνΙΕΚ (8ΕΟ ΙΌ N0: 372), ΟΙΤΝΚΕΝδνΙΕΚ (8ΕΟ ΙΌ N0: 373), ΟΙΤΝΚνΝδΙΙΌΚ (8ΕΟ ΙΌ N0: 374) и ΚΙΤ^ΚΥΝΝΙνΌΚ (8Ε0 ΙΌ N0: 375). Как можно заключить из данных, приведенных в табл. 13, определенные связывающие молекулы по настоящему изобретению СК6261, СК6325 и СК6329 взаимодействуют с эпитопом ΟνΤΝΚνΝδΙΙΌΚ (8Е0 ΙΌ N0: 368), присутствующем в Η5Ν1, и на указанные молекулы не влияет мутация в эпитопе Τ6ΗΚΝ в НА1, который влияет на связывание С179. Кроме того, на некоторые связывающие молекулы, такие как СК6307 и СК6323, не влияет ускользающий мутант, как указано в публикации 0кипо с1 а1. (1993), образующийся в результате мутации валин глутаминовая кислота в положении 6 (выраженный последовательностью ΟΥΤΝΚΕΝΞΙΙΌΚ (8Е0 ΙΌ N0: 370)). Указанный эпитоп является частью удлиненной альфа-спирали в области НА2. Остатки в данном предполагаемом эпитопе, которые в соответствии с прогнозом являются наиболее растворимыми, обозначены жирным шрифтом и подчеркнуты, ΟνΤΝΚΕΝΞΙΙΌΚ (8Е0 ΙΌ N0: 370). Указанные аминокислоты должны быть наиболее доступными для связывающей молекулы и, таким образом, могут образовывать наиболее важную область эпитопа. В соответствии с данной точкой зрения выделенные аминокислоты являются абсолютно консервативными по идентичности и положению во всех представленных последовательностях. Указанную информацию можно использовать для прогнозирования связывающих эпитопов в подтипах вируса гриппа, не содержащих вышеуказанные последовательности (т.е. штаммы Н3, Н7 и В).

Предпочтительной связывающей молекулой по настоящему изобретению является связывающая молекула, выбираемая из группы, состоящей из

a) связывающей молекулы, включающей область ί.'ΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 1, область ί.'ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 2 и область ί’ΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 3;

b) связывающей молекулы, включающей область ί.'ΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 16, область СОК.2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 17 и область СБК3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 18;

c) связывающей молекулы, включающей область ί.'ΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 1, область ΕΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 22 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 23;

ά) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 27, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 28 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 29;

е) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 39, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 40 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 41;

1) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 45, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 46 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 47;

д) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 1, область ΕΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 49 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 50;

Б) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 52, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 53 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 54;

ί) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 262, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 263 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 264;

_)) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0 : 268, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 269 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 270;

k) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 274, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 275 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 276;

l) связывающей молекулы, включающей область ί.'ΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0 : 280, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 281 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 282;

т) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 286, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 287 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 288;

п) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 292, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 293 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 294;

о) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 304, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 305 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 306; и

р) связывающей молекулы, включающей область ΕΌΚ1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 310, область ί’ΌΚ2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 311 и область ΕΌΚ3 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 312.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающая молекула по настоящему изобретению предназначена для применения в качестве лекарственного средства и предпочтительно для диагностики, терапевтического и/или профилактического лечения гриппа. В одном варианте осуществления изобретения причиной возникновения указанного гриппа является вирус гриппа, вызывающий вспышку пандемии или способный вызвать вспышку пандемии (см. А0 2007/045674 и таблицы, приведенные в указанной публикации). Штамм вируса гриппа, вызывающий вспышку пандемии, при которой

- 9 017203 болезнь, обусловленную указанными штаммами, можно лечить связывающими молекулами по настоящему изобретению, выбирают из группы, включающей вирусы Η1Ν1, Η5Ν1, Η5Ν2, Η5Ν8, Η5Ν9, на основе Н2 и Η9Ν2.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей связывающую молекулу по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению связывающей молекулы по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для диагностики, профилактики и/или лечения гриппа. Такой грипп может возникнуть в небольшой группе населения, но может также распространиться по всему миру в виде сезонной эпидемии или, что еще хуже, в виде глобальной пандемии, при которой миллионы людей окажутся в группе риска. Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, способным нейтрализовать штаммы вируса гриппа, вызывающие такие сезонные эпидемии, а также возможную пандемию. Важно отметить, что с помощью связывающих молекул по настоящему изобретению можно прогнозировать необходимую защиту и лечение от многочисленных штаммов вируса гриппа, так как из вышеизложенного следует, что благодаря связыванию с эпитопом, который является общим для белков НА разных штаммов вируса гриппа, можно перекрестно нейтрализовать такие штаммы, используя связывающие молекулы по настоящему изобретению. Такое положение является весьма благоприятным, поскольку связывающие молекулы могут защитить млекопитающих при введении до или после инфицирования (как показано в примерах), а также в тех случаях, когда не ясно (на ранних стадиях заболевания), вызвано ли данное заболевание штаммом на основе Η1, Н2, Н5, Н6 или Н9. Молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики или лечения гриппа у работников здравоохранения, военных и всего населения. Связывающие молекулы по настоящему изобретению можно получать и хранить в больших количествах, так как они обеспечивают защиту от разных штаммов, вызывающих пандемию, что позволит подготовиться к возможной пандемии гриппа в будущем.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы человека по настоящему изобретению отличаются тем, что указанные связывающие молекулы человека выбирают из группы, состоящей из

a) связывающей молекулы человека, включающей область СЭКТ тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 2, область СОВ3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 3, область СЭКТ легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 4, область С0К2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 5, и область СОВ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 6;

b) связывающей молекулы человека, включающей область СЭКТ тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 2, область СОВ3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 3, область СЭКТ легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 7, область С0К2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 8, и область СОВ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 9;

c) связывающей молекулы человека, включающей область СЭКТ тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 2, область СОВ3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 3, область СЭКТ легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 10, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 11, и область СОВ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 12;

б) связывающей молекулы человека, включающей область СЭКТ тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 2, область СОВ3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 3, область СЭКТ легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 13, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 14, и область СОВ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 15;

е) связывающей молекулы человека, включающей область СЭКТ тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 16, область С0К2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 17, область СОВ3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 18, область СЭКТ легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 19, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 20, и область СОВ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 21;

1) связывающей молекулы человека, включающей область СЭКТ тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 22, область СОВ3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 23, область СЭКТ легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 24, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ:

- 10 017203

25, и область ΟΌΚ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш N0: 26;

д) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 27, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 28, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 29, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 30, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 31, и область ί.ΌΕ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 32;

к) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 2, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 3, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 33, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 34, и область ί.ΌΕ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 35;

ί) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 2, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 3, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 36, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 37, и область ί.ΌΕ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 38;

_)) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 39, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 40, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 41, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 42, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 43, и область ί.ΌΕ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 44;

k) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 45, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 46, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 47, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 7, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 8, и область ί.ΌΕ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 48;

l) связывающей молекулы человека, включающей область СОК! тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 1, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 49, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 50, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 33, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 34, и область ί.ΌΕ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 51;

т) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 52, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 53, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 54, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 55, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 56, и область ί.ΌΕ3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 57;

п) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 262, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 263, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 264, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 265, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 266, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 267;

о) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 268, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 269, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 270, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 271, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 272, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 273;

р) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 274, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 275, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 276, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 277, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность

- 11 017203

8ЕО ΙΌ N0: 278, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 279;

с.|) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 280, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 281, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 282, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 283, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 284, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 285;

г) связывающей молекулы человека, включающей область СОК! тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 286, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 287, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 288, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 289, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 290, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 291;

к) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК 1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 292, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 293, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 294, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 295, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 296, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 297;

ΐ) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 304, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 305, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 306, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 307, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 308, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 309;

и) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 310, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 311, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 312, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 313, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 314, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 315;

ν) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0 : 238, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 239, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 240, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 241, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 242, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 243;

ν) связывающей молекулы человека, включающей область ί.ΌΕ1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 244, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 245, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 246, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 247, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 248, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 249;

x) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 250, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 251, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 252, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 253, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 254, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 255;

y) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 256, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 257, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 258, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последова

- 12 017203 тельность 8ЕО ГО N0: 259, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 260, и область СГОК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 261; и

ζ) связывающей молекулы человека, включающей область СЭК 1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 298, область СЭК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 299, область СЭК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 300, область СЭК1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 301, область СЭК2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 302, и область СЭК3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 303.

В конкретном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают область СГОК1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 1, область СГОК2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2, и область СГОК3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3. Области СОК связывающих молекул по настоящему изобретению представлены в табл. 7. Области СОК определены в соответствии с описанием, приведенным в публикации КаЬа1 е1 а1. (1991) 8сциспссз οί Рго1с1пз οί Ιιηιηιιποίοβίοαΐ НИстсМ. В одном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы могут включать две, три, четыре, пять или все шесть областей СОК, рассмотренных в настоящем описании изобретения. Связывающие молекулы по настоящему изобретению предпочтительно включают по меньшей мере две области СЭК, рассмотренные в настоящем описании изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают УН1-69 УН-области зародышевой линии клеток (см. публикацию ТотНпзоп Ι.Μ., ^1Шаш8 8.С., 0., СотЬсй 8.1, \Уш1сг О. У-ВА8Е 8сс.|испсс ОйссЮгу. СатЬпйдс Ипйсй Ктдйош: МКС

СсПгс Шг Рго1ст Епдтссгтд (1997)). В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности, выбираемой из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 59, 8Е0 ГО N0: 61, 8ЕО ГО N0: 63, 8ЕО ГО N0: 65, 8ЕО ГО N0: 67, 8ЕО ГО N0: 69, 8ЕО ГО N0: 71, 8ЕО ГО N0: 73, 8ЕО ГО N0: 75, 8ЕО ГО N0: 77, 8ЕО ГО N0: 79, 8ЕО ГО N0: 81, 8ЕО ГО N0: 83, 8ЕО ГО N0: 317, 8ЕО ГО N0: 321, 8ЕО ГО N0: 325, 8ЕО ГО N0: 329, 8ЕО ГО N0: 333, 8ЕО ГО N0: 337, 8ЕО ГО N0: 341, 8ЕО ГО N0: 345, 8ЕО ГО N0: 349, 8ЕО ГО N0: 353, 8ЕО ГО N0: 357, 8ЕО ГО N0: 361 и 8ЕО ГО N0: 365. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности, выбираемой из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 85, 8Е0 ГО N0: 87, 8Е0 ГО N0: 89, 8Е0 ГО N0: 91, 8ЕО ГО N0: 93, 8ЕО ГО N0: 95, 8ЕО ГО N0: 97, 8ЕО ГО N0: 99, 8ЕО ГО N0: 101, 8ЕО ГО N0: 103, 8ЕО

ГО N0: 105, 8ЕО ГО N0: 107, 8ЕО ГО N0: 109, 8ЕО ГО N0: 319, 8ЕО ГО N0: 323, 8ЕО ГО N0: 327, 8ЕО

ГО N0: 331, 8ЕО ГО N0: 335, 8ЕО ГО N0: 339, 8ЕО ГО N0: 343, 8ЕО ГО N0: 347, 8ЕО ГО N0: 351, 8ЕО

ГО N0: 355, 8Е0 ГО N0: 359, 8Е0 ГО N0: 363 и 8Е0 ГО N0: 367. Вариабельные области тяжелых и легких цепей связывающей молекулы по настоящему изобретению представлены в табл. 8.

Другим объектом настоящего изобретения являются функциональные варианты связывающих молекул по настоящему изобретению. Молекулы считаются функциональными вариантами связывающей молекулы по настоящему изобретению, если указанные варианты могут конкурировать с исходными связывающими молекулами за специфическое связывание с вирусом гриппа Н5Ю или его фрагментом. Другими словами, функциональные варианты по-прежнему могут связываться с вирусом гриппа Н5Ю или его фрагментом. Функциональные варианты предпочтительно могут конкурировать за специфическое связывание по меньшей мере с двумя (или более) разными штаммами вируса гриппа Н5М или его фрагментами, которые специфически связываются исходными связывающими молекулами. Кроме того, молекулы считаются функциональными вариантами связывающей молекулы по настоящему изобретению, если они обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа Н5Н1. предпочтительно в отношении по меньшей мере двух (или более) штаммов вируса гриппа №N1, которые могут быть нейтрализованы исходной связывающей молекулой. Функциональные варианты включают, не ограничиваясь ими, производные, которые, по существу, аналогичны первичной структуре последовательности, но содержат, например, химические и/или биохимические модификации ш νίΙΐΌ или ш у|уо, отсутствующие в исходной связывающей молекуле. Такие модификации включают, в частности, ацетилирование, ацилирование, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, перекрестное связывание, образование дисульфидной связи, гликозилирование, гидроксилирование, метилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование и тому подобные.

Альтернативно, функциональные варианты могут быть связывающими молекулами по настоящему изобретению, включающими аминокислотную последовательность, содержащую замены, инсерции, делеции или их комбинации одной или нескольких аминокислот по сравнению с аминокислотными последовательностями исходных связывающих молекул. Кроме того, функциональные варианты могут включать усечения аминокислотной последовательности у одного или обоих амино- или карбоксиконцов.

- 13 017203

Функциональные варианты по настоящему изобретению могут обладать одинаковым или разным, более высоким или более низким сродством связывания по сравнению с исходной связывающей молекулой, но по-прежнему способны связываться с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом. Например, функциональные варианты по настоящему изобретению могут обладать более высоким или более низким сродством связывания с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом по сравнению с исходными связывающими молекулами. Аминокислотные последовательности вариабельных областей, включающих, но не ограничиваясь ими, рамки считывания, гипервариабельные участки, в частности области СБКЗ, предпочтительно являются модифицированными. Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи обычно включают три гипервариабельных участка, содержащих три СБВ, и более консервативные области, так называемые рамки считывания (ВВ). Гипервариабельные участки содержат аминокислотные остатки из СБВ и аминокислотные остатки из гипервариабельных петель. Функциональные варианты, входящие в объем настоящего изобретения, по меньшей мере примерно на 50-99%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60-99%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 70-99%, еще предпочтительнее по меньшей мере примерно на 80-99%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 90-99%, по меньшей мере примерно на 95-99% и, в частности, по меньше мере на 97-99% гомологичны аминокислотным последовательностям исходных связывающих молекул по настоящему изобретению. Для выполнения оптимального сравнительного анализа аминокислотных последовательностей и определения подобных или идентичных аминокислотных остатков могут быть использованы компьютерные алгоритмы, такие как Сар или ΒοκΙ.Γίί, известные специалисту в данной области. Функциональные варианты могут быть получены в результате изменения исходных связывающих молекул или их частей общими методами молекулярной биологии, известными в данной области, которые включают, не ограничиваясь ими, подверженные ошибкам методы ПЦР, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сайт-направленный мутагенез и перестановку тяжелых и/или легких цепей. В одном варианте осуществления изобретения функциональные варианты по настоящему изобретению обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа Η5Ν1. Указанная нейтрализующая активность может быть аналогична, выше или ниже по сравнению с исходными связывающими молекулами. Поэтому в определение термина связывающая молекула (человека) входят также функциональные варианты связывающей молекулы (человека).

Другим объектом настоящего изобретению являются иммуноконъюгаты, т. е. молекулы, включающие по меньшей мере одну связывающую молекулу по настоящему изобретению и по меньшей мере одну метку, например обнаруживаемую часть/агент. В объем настоящего изобретения входят также смеси иммуноконъюгатов по настоящему изобретению или смеси по меньшей мере одного иммуноконъюгата по настоящему изобретению и другой молекулы, такой как лекарственное средство, другая связывающая молекула или иммуноконъюгат. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут включать несколько меток. Указанные метки могут быть одинаковыми или разными и могут быть нековалентно связаны/конъюгированы со связывающими молекулами. Метки могут быть также связаны/конъюгированы непосредственно со связывающими молекулами человека путем ковалентного связывания. Альтернативно, метки могут быть связаны/конъюгированы со связывающими молекулами при помощи одного или нескольких связующих соединений. Квалифицированному специалисту должны быть хорошо известны методы конъюгирования меток со связывающими молекулами.

Метки иммуноконъюгатов по настоящему изобретению могут представлять собой лекарственные средства, но могут также быть обнаруживаемыми частями/агентами. Метки, приемлемые для применения в терапии и/или профилактике, могут быть токсинами или их функциональными частями, антибиотиками, ферментами, другими связывающими молекулами, усиливающими фагоцитоз или иммунную стимуляцию. Иммуноконъюгаты, включающие обнаруживаемый агент, могут быть использованы в диагностике, например для определения инфицирования субъекта штаммами вируса гриппа Η5Ν1 или контроля за развитием или прогрессированием гриппа, обусловленного вирусом гриппа Η5Ν1, в виде части процедуры клинического исследования, например для определения эффективности назначенной схемы лечения. Однако иммуноконъюгаты могут быть также использованы для обнаружения других вирусов гриппа, для аналитических и/или диагностических целей. Обнаруживаемые части/агенты включают, не ограничиваясь ими, ферменты, искусственно введенные группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества, радиоактивные вещества, металлы, излучающие позитроны, и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. Метки, используемые для мечения связывающих молекул с целью обнаружения, анализа и/или диагностики, зависят от конкретных методов обнаружения/анализа/диагностики и/или от методов, используемых для иммуногистохимического окрашивания образцов (ткани), проточной цитометрии, цитометрического обнаружения сканирующим лазером, флуоресцентных иммуноанализов, твердофазных иммуноферментных анализов (ЕЫ8Л), радиоиммуноанализов (В1А), биоанализов (например, анализов фагоцитоза), вестерн-блоттинга и т.д. Приемлемые метки, используемые для обнаружения/анализа/диагностики, и/или методы их применения, известные в данной области, находятся в компетенции квалифицированного специалиста.

Кроме того, связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению

- 14 017203 могут быть также присоединены к твердым носителям, которые особенно полезны при выполнении иммуноанализов ίη νίίΓΟ или очистки вируса гриппа Η5Ν1 или его фрагмента. Такие твердые носители могут быть пористыми или непористыми, плоскими или неплоскими. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть гибридизированы с последовательностями-маркерами, такими как пептид, для облегчения очистки. Такие примеры включают, не ограничиваясь ими, гексагистидиновую метку, гемагглютининовую (НА) метку, тус-метку или флаговую метку. Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антител. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть конъюгированы/связаны с одним или несколькими антигенами. Указанные антигены предпочтительно являются антигенами, узнаваемыми иммунной системой субъекта, в организм которого введен конъюгат связывающая молекула-антиген. Антигены могут быть одинаковыми, но могут также отличаться друг от друга. Методы конъюгирования, используемые для присоединения антигенов к связывающим молекулам, хорошо известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, применение перекрестносшивающих агентов. Связывающие молекулы по настоящему изобретению связываются с вирусом гриппа Η5Ν1, и антигены, присоединенные к связывающим молекулам, инициируют мощную атаку Т-клеток на конъюгат, что в конечном счете вызывает разрушение вируса гриппа Η5Ν1.

Помимо получения иммуноконъюгатов химическими методами путем прямого или непрямого конъюгирования, например с помощью линкера, иммуноконъюгаты могут быть получены в виде слитых белков, содержащих связывающие молекулы по настоящему изобретению и соответствующую метку. Слитые белки могут быть получены методами, известными в данной области, такими как, например, методы рекомбинантных ДНК, используемые для создания молекул нуклеиновых кислот, включающих нуклеотидные последовательности, кодирующие связывающие молекулы, вместе с нуклеотидными последовательностями, кодирующими приемлемые метки и затем экспрессирующими молекулы нуклеиновых кислот.

Другим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая, по меньшей мере, связывающую молекулу, функциональный вариант или иммуноконъюгат по настоящему изобретению. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы в качестве промежуточных веществ для клонирования, например, в процессе созревания аффинности, описанного выше. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот являются выделенными или очищенными.

Специалисту должно быть понятно, что функциональные варианты указанных молекул нуклеиновых кислот также входят в объем настоящего изобретения. Функциональные варианты являются последовательностями нуклеиновых кислот, которые могут быть транслированы при помощи стандартного генетического кода с образованием аминокислотной последовательности, идентичной последовательности, транслированной из исходных молекул нуклеиновых кислот.

Молекулы нуклеиновых кислот предпочтительно кодируют связывающие молекулы, включающие вышеописанные области СОЯ. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, включающие две, три, четыре, пять или даже все шесть областей СОЯ связывающих молекул по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, включающие тяжелую цепь, содержащую вышеуказанные последовательности вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, включающие легкую цепь, содержащую вышеуказанные последовательности вариабельной области легкой цепи. Нуклеотидные последовательности связывающих молекул по настоящему изобретению приведены в разделе Примеры (см., например, табл. 6 и 8).

Другим объектом настоящего изобретения являются векторы, т.е. конструкции нуклеиновых кислот, включающие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Векторы могут быть получены из плазмид, такие как Е, Я1, ЯР1, Со1, рВЯ322, ТОЬ, Τί и т.д.; космид; фагов, таких как лямбда, лямбдоид, М13, Ми, Р1, Р22, Οβ. Т-четный, Т-нечетный, Т2, Т4, Т7 и т.д.; растительных вирусов. Векторы могут быть использованы для клонирования и/или экспрессии связывающих молекул по настоящему изобретению и даже в генотерапии. В объем настоящего изобретения входят также векторы, включающие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, функционально связанных с одной или несколькими регулирующими экспрессию молекулами нуклеиновых кислот. Выбор вектора зависит от методов рекомбинантных ДНК и используемого хозяина. Векторы могут быть введены в клетки-хозяева путем трансфекции фосфатом кальция, инфицирования вирусом, трансфекции, опосредованной ΌΕΑΕ-декстраном, трансфекции липофектамином или электропорации. Векторы могут реплицировать автономно или вместе с хромосомой, в которую они была интегрированы. Векторы предпочтительно содержат один или несколько селектируемых маркеров. Выбор маркеров может зависеть от выбранных клеток-хозяев, хотя данное условие не является критическим для настоящего изобретения, как должно быть хорошо известно специалистам в данной области. Указанные маркеры включают, не ограничиваясь ими, канамицин, неомицин, пуромицин, гигромицин, зеоцин, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (Η8Υ-ΤΚ), ген дигидрофолат-редуктазы мыши (бМг). В объем

- 15 017203 настоящего изобретения входят также векторы, включающие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы человека по настоящему изобретению, функционально связанные с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, кодирующих белки или пептиды, которые могут быть использованы для выделения связывающих молекул человека. Указанные белки или пептиды включают, не ограничиваясь ими, глутатион-З-трансферазу, мальтозасвязывающий белок, металлсвязывающий полигистидин, зеленый флуоресцентный белок, люциферазу и бета-галактозидазу.

Хозяева, содержащие одну или несколько копий вышеуказанных векторов, являются дополнительным объектом настоящего изобретения. Хозяевами предпочтительно являются клетки-хозяева. Клеткихозяева включают, не ограничиваясь ими, клетки млекопитающих, растений, насекомых, грибов или бактерий. Бактериальные клетки включают, не ограничиваясь ими, клетки грамположительных бактерий или грамотрицательных бактерий, в частности несколько видов рода ЕксйепсЫа, таких как Е.соБ и Ркеийотопак. В группе клеток грибов предпочтительно используют дрожжевые клетки. Экспрессия в дрожжах может быть достигнута при использовании таких штаммов дрожжей как РюЫа райопк, Зассйаготусек сегеуыае и Иапкепи1а ро1утогрйа. Кроме того, в качестве клеток-хозяев могут быть использованы клетки насекомых, такие как клетки дрозофилы и 8Г9. Клетками-хозяевами могут быть также растительные клетки, в частности клетки культурных растений, таких как лесные растения, или клетки растений, предназначенных для получения пищевых продуктов и сырья, таких как злаки или медицинские растения, клетки декоративных растений или клетки цветочных культур.

Трансформированные (трансгенные) растения или растительные клетки получают известными методами, например путем переноса генов, опосредованного агробактериями, трансформации листовых дисков, трансформации протопласта в результате переноса ДНК, индуцированного полиэтиленгликолем, электропорации, обработки ультразвуком, микроинъекции или ударного переноса генов. Кроме того, приемлемой экспрессирующей системой может быть система на основе бакуловируса. Экспрессирующие системы с использованием клеток млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки СОЗ, клетки ΒΗΚ, клетки Ν8Θ или клетки меланомы Боуса, являются предпочтительными в настоящем изобретении. Клетки млекопитающих позволяют получить экспрессированные белки с посттрансляционными модификациями, которые больше всего подобны природным молекулам млекопитающих. Так как настоящее изобретение относится к молекулам, которые могут быть введены человеку, особенно предпочтительной является экспрессирующая система, полностью принадлежащая человеку. Поэтому еще предпочтительнее клетки-хозяева являются клетками человека. Примерами клеток человека являются, в частности, клетки ^Ьа, 911, АТ1080, А549, 293 и ΗΕΚ293Έ В предпочтительных вариантах осуществления изобретения продуцирующие клетки человека включают, по меньшей мере, функциональную часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей область Е1 аденовируса в экспрессируемом формате. В более предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные клетки-хозяева получают из сетчатки глаза человека и иммортализуют нуклеиновыми кислотами, включающими последовательности Е1 аденовируса, в частности, клетки 911 или линию клеток, депонированную в европейскую коллекцию культур клеток (ЕСАСС), САМЕ, ЗаБкЬшу, ΧνίΗκΙιίΐΌ 8Р4 О1С, Сгеа1 ΒπΙат, 26 февраля 1996 г. под номером 96022940 и продаваемую под товарным знаком РЕЕ.С6® (РЕЕ.С6 является зарегистрированным товарным знаком компании Сгисе11 ЫоПапй Β.ν.). Клетки РЕЕ.С6, предназначенные для указанных целей, являются клетками, депонированными под номером 96022940, или клетками-предшественниками, пассажами в обратном или прямом направлении, потомством клетокпредшественников депонированных клеток, а также производными любых вышеуказанных клеток. Рекомбинантные белки в клетках-хозяевах могут быть получены методами, хорошо известными в данной области. Использование клеток, продаваемых под товарным знаком РЕЕ.С6®, в качестве основы для получения представляющих интерес белков описано в публикации XVО 00/63403, которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Дополнительным объектом настоящего изобретения является способ получения связывающей молекулы по настоящему изобретению. Данный способ включает стадии: а) культивирования хозяина по настоящему изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию связывающей молекулы, и Ь) необязательно выделения экспрессированной связывающей молекулы. Экспрессированные связывающие молекулы могут быть выделены из бесклеточного экстракта, но указанные молекулы предпочтительно выделяют из культуральной среды. Вышеуказанный способ получения может быть также использован для создания функциональных вариантов связывающих молекул и/или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Методы выделения белков, таких как связывающие молекулы, из бесклеточных экстрактов или культуральной среды хорошо известны специалисту в данной области. Связывающие молекулы, функциональные варианты и/или иммуноконъюгаты, полученные вышеописанным способом, также входят в объем настоящего изобретения.

Альтернативно, помимо экспрессии в хозяевах, таких как клетки-хозяева, связывающие молекулы и иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть синтезированы в стандартных синтезаторах пептидов или в бесклеточных системах трансляции с использованием нуклеиновой кислоты РНК, выделенной из молекул ДНК по настоящему изобретению. Связывающие молекулы и иммуноконъюгаты,

- 16 017203 полученные вышеописанными методами синтеза или в бесклеточных системах трансляции, также входят в объем настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть также продуцированы в организме трансгенных животных, отличных от человека, таких как кролики, козы или коровы, и секретированы, например, в молоко.

В другом альтернативном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению, предпочтительно связывающие молекулы человека, специфически связывающиеся с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом, могут быть получены в организме трансгенных млекопитающих, отличных от человека, таких как, например, трансгенные мыши или кролики, экспрессирующие гены иммуноглобулина человека. Трансгенные млекопитающие, отличные от человека, предпочтительно имеют геном, включающей трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, кодирующие все или части связывающих молекул человека по настоящему изобретению. Трансгенные млекопитающие, отличные от человека, могут быть иммунизированы очищенным или обогащенным препаратом вируса гриппа Η5Ν1 или его фрагмента. Методы иммунизации млекопитающих, отличных от человека, хорошо известны в данной области. См. публикации Иапд АпйЬоЛек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Εάίΐβά Ьу: Е. Наг1оте, Ό. Ьапе (1998), СоИ 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу, СоИ 8ргтд НагЬог, Νο\ν Уогк и Сиггеп! РгоЮсоЕ ίη 1ттипо1оду, Еййей Ьу: ЕЕ. СоЕдап, А.М. КгшкЬеек, Ό.Η. МагдиНек, Е.М. 811еуае11. А. 8!гоЬег (2001), Чо1т А11еу & 8оп5 1пс., №\ν Уогк, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Методы иммунизации часто включают множественные иммунизации с использованием или без использования адъювантов, таких как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, но могут также включать иммунизации голой ДНК. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы человека продуцированы В-клетками, плазматическими клетками и/или клетками памяти, полученными у трансгенных животных. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы человека продуцированы гибридомами, которые получают в результате гибридизации В-клеток, полученных у вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, с иммортализованными клетками. В-клетки, плазматические клетки и гибридомы, полученные у вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, и связывающие молекулы человека, полученные у вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, В-клетки, плазматические клетки и/или клетки памяти и гибридомы также входят в объем настоящего изобретения.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ идентификации связывающей молекулы, такой как связывающая молекула человека, например, моноклональное антитело человека или его фрагмент, специфически связывающиеся с вирусом гриппа Η5Ν1, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие связывающие молекулы, который включает стадии: (а) контактирования коллекции связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом в условиях, обеспечивающих связывание; (Ь) по меньшей мере, однократный отбор реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом; (с) разделения и отделения реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом, от реплицируемых генетических упаковок, которые не связываются с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом. Реплицируемая генетическая упаковка по настоящему изобретению может быть прокариотической или эукариотической и включает клетки, споры, дрожжи, бактерии, вирусы, (бактерио)фаг, рибосомы и полисомы. Предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Связывающие молекулы, такие как, например, одноцепочечные Εν-фрагменты, отображены на реплицируемой генетической упаковке, то есть присоединены к группе или молекуле, локализованной на наружной поверхности реплицируемой генетической упаковки. Реплицируемая генетическая упаковка является подвергаемой скринингу единицей, включающей исследуемую связывающую молекулу, связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную связывающую молекулу. Молекула нуклеиновой кислоты должна быть реплицирована ίη νί\Ό (например, в виде вектора) или ίη νίΙΐΌ (например, методом ПЦР, транскрипции и трансляции). Репликация ίη νί\Ό может быть автономной (в случае клетки), с помощью факторов хозяина (в случае вируса) или с помощью хозяина и вируса-хелпера (в случае фагомида). Реплицируемые генетические упаковки, отображающие коллекцию связывающих молекул, получают путем введения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих отображаемые экзогенные связывающие молекулы, в геномы реплицируемых генетических упаковок с образованием слитых белков с эндогенными белками, которые обычно экспрессированы на наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок. Экспрессия слитых белков, перенос к наружной поверхности и сборка позволяют получить отображение экзогенных связывающих молекул на наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок.

Стадии отбора при осуществлении вышеуказанного способа по настоящему изобретению могут быть выполнены с использованием живых, еще инфективных или инактивированных вирусов гриппа Η5Ν1. Вирус гриппа Η5Ν1 может быть инактивирован методами инактивации вирусов, хорошо известными специалисту в данной области, такими как обработка формалином, β-пропиолактоном (ВРЬ), мертиолатом и/или ультрафиолетовым светом. Методы испытания с использованием живого, инфективного и/или жизнеспособного, частично или полностью инактивированного вируса гриппа Η5Ν1 хорошо из

- 17 017203 вестны специалисту в данной области. Вирус гриппа Η5Ν1, используемый при осуществлении вышеуказанного способа, может быть не выделен, например может присутствовать в сыворотке и/или крови инфицированного субъекта. Используемый вирус гриппа Η5Ν1 может быть также выделен из культуры клеток в приемлемой среде.

В одном варианте осуществления изобретения вирус гриппа Η5Ν1 находится в суспензии при контактировании с реплицируемыми геномными упаковками. Альтернативно, указанные вирусы могут быть также связаны с носителем в процессе контактирования. В одном варианте осуществления изобретения первый и последующий отборы могут быть произведены в отношении штамма вируса гриппа Η5Ν1 одного клада. Альтернативно первый и последующий циклы отбора могут быть произведены в отношении штаммов вируса гриппа Η5Ν1 разных кладов (например, первый отбор выполняют в отношении штаммов клада 1 и второй отбор выполняют в отношении штаммов клада 2 или 3).

Альтернативно, стадии отбора могут быть выполнены в присутствии фрагмента вируса гриппа Η5Ν1, такого как, например, препараты клеточных мембран, рекомбинантные белки или полипептиды Η5Ν1, слитые белки, включающие белки или полипептиды Η5Ν1, клетки, экспрессирующие рекомбинантные белки или полипептиды Η5Ν1, и тому подобные. Внеклеточно экспонированные части указанных белков или полипептидов также могут быть использованы в качестве отбираемого материала. Фрагменты вируса гриппа Η5Ν1 могут быть иммобилизованы на приемлемом материале перед использованием или могут быть использованы в суспензии. В одном варианте осуществления изобретения отбор может быть произведен в отношении разных фрагментов вируса гриппа Η5Ν1 или фрагментов разных штаммов вируса гриппа Η5Ν1. Специалисту в данной области должны быть известны методы обнаружения приемлемых отбираемых комбинаций. Отбор может быть произведен методами ΕΜ8Α или РΑС8.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения связывающей молекулы, специфически связывающейся со штаммом вируса гриппа Η5Ν1 или его фрагментом, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую связывающую молекулу, который включает стадии: а) выполнения вышеописанного метода идентификации связывающих молекул и Ь) отделения от выделенной реплицируемой генетической упаковки связывающей молекулы и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную связывающую молекулу. Коллекция связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок может быть коллекцией ксРу или РаЬ. При обнаружении или идентификации нового 8сРу или РаЬ вышеуказанным методом идентификации связывающих молекул или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы, ДНК, кодирующая зсРу или РаЬ, может быть выделена из бактерий или фагов и объединена при помощи стандартных методов молекулярной биологии с образованием конструкций, кодирующих зсРаЬ, двухвалентные зсРу, РаЬ или полные иммуноглобулины человека требуемой специфичности (например, Ι§6, ΙβΑ или 1дМ). Указанные конструкции могут быть трансфецированы в приемлемые линии клеток, в результате чего могут быть получены полные моноклональные антитела человека (см. публикации Ηυ13 е! а1., 1999; Вое1 е! а1., 2000).

Как было отмечено выше, предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Методы отображения на фаге, используемые для идентификации и получения связывающих молекул (человека), например моноклональных антител (человека), в настоящее время являются хорошо разработанными методами, известными специалисту в данной области. Указанные методы описаны, например, в патенте США № 5696108; Вийоп апй ВагЬаз, 1994; йе КгшГ е! а1., 1995Ь и Рйаде Э|зр1ау: Α ЬаЬогаФгу Мапиа1. Еййей Ьу: С.Р. ВагЬаз, Ό.Β. Вийоп, ЕК. 8сой апй 6.1. 811уегтап (2001), Со1й 8ргтд Иагйог ЬаЬогаЮгу Ргезз, Со1й 8ргтд ШЛот, №\ν Уогк. Все указанные публикации полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Для создания библиотек отображения на фаге коллекции генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей моноклонального антитела человека экспрессируют на поверхности бактериофага, предпочтительно нитевидного бактериофага, частиц, например, в форме одноцепочечных Ру (зсРу) или РаЬ (см. публикацию йе Кгш£ е! а1., 1995Ь). Большие библиотеки фагов, экспрессирующих фрагменты антитела, обычно содержат более 1,0х10⁹ специфичностей антител и могут быть собраны из ν-областей иммуноглобулина, экспрессированных в В-лимфоцитах иммунизированных или неиммунизированных субъектов. В конкретном варианте осуществления изобретения фаговую библиотеку связывающих молекул, предпочтительно фаговую библиотеку зсРу, создают из РНК, выделенной из клеток, полученных у субъекта, вакцинированного против вируса гриппа (например, Η5Ν1), недавно вакцинированного против неродственного патогенного организма, недавно переболевшего гриппом, вызванным вирусом гриппа Η5Ν1, или у здорового субъекта. РНК может быть выделена из костного мозга или периферической крови, предпочтительно из лимфоцитов периферической крови, выделенных В-клеток или даже из субпопуляций В-клеток, таких как В-клетки памяти. Субъект может быть животным, предпочтительно человеком. В предпочтительном варианте осуществления изобретения библиотеки могут быть собраны из ν-областей иммуноглобулина, экспрессированных В-клетками памяти 1§м.

Альтернативно, библиотеки отображения на фаге могут быть созданы из вариабельных областей иммуноглобулина, которые были частично собраны ш νίίτο для введения дополнительного разнообразия антител в библиотеку (полусинтетические библиотеки). Например, собранные ш νίίτο вариабельные области содержат фрагменты синтезированных, рандомизированных или частично рандомизированных

- 18 017203

ДНК в указанных областях молекул, необходимых для специфичности антител, например в областях СОЯ. Фаговые антитела, специфичные к вирусу гриппа Η5Ν1, можно выбрать из библиотеки путем введения вируса или его фрагмента в фаговую библиотеку для связывания фагов, экспрессирующих фрагменты антитела, специфичные к данному вирусу или его фрагменту. Несвязанные фаги удаляют промыванием и связанные фаги элюируют для инфицирования бактерий Е.сой и последующего размножения. Для достаточного обогащения фагов, специфически связывающихся с вирусом или его фрагментом, обычно необходимо несколько циклов отбора и размножения. При желании, прежде чем ввести в фаговую библиотеку вирус или его фрагмент, указанную фаговую библиотеку можно сначала очистить, подвергая фаговую библиотеку воздействию материала, не являющегося мишенью, такого как вирусы или их фрагменты другого штамма, т.е. вирусы гриппа, отличные от вируса Η5Ν1. Указанные очищающие вирусы или их фрагменты могут быть связаны с твердой фазой или могут находиться в суспензии. Фаги могут быть также отобраны путем связывания со сложными антигенами, такими как сложные смеси белков или (поли)пептидов Η5Ν1, необязательно содержащие другой материал. Клетки-хозяева, экспрессирующие один или несколько белков или (поли)пептидов вируса гриппа Η5Ν1, также могут быть использованы для отбора. Метод отображения на фаге с использованием указанных клеток-хозяев может быть расширен и усовершенствован в результате удаления неродственных связывающих веществ в процессе скрининга путем добавления избытка клеток-хозяев, не содержащих молекулы-мишени или содержащих молекулы, не являющиеся мишенями, которые подобны, но не идентичны мишени, что позволяет значительно повысить вероятность обнаружения требуемых связывающих молекул. Очистка может быть произведена до, во время или после скрининга вирусом или его фрагментами. Указанный метод получил название метода МАВ8ТЯАСТ® (МАВ8ТЯАСТ® является зарегистрированным товарным знаком компании Сгисе11 ИоПапб В.У., см. также патент США № 6265150, который включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки).

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения связывающей молекулы, потенциально обладающей нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа Η5Ν1, предпочтительно, по меньшей мере, в отношении штаммов вируса гриппа Η5Ν1 клада 1, клада 2 и клада 3, который включает стадии: (а) выполнения способа получения связывающей молекулы, специфически связывающейся с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей описанную выше связывающую молекулу, и (Ь) подтверждения того, что выделенная связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью в отношении данного вируса, предпочтительно, по крайней мере, в отношении штаммов вируса гриппа Η5Ν1 клада 1 и клада 2. Анализы, подтверждающие наличие у связывающей молекулы нейтрализующей активности, хорошо известны в данной области (см. \¥ΗΟ Мапиа1 оп Ашша1 1пГ1иепха П1адпо818 апб Зиг^'еШапсе, 6еηеνа: \Уог1б Иеа1111 Огдашзабоп, 2005 \^гег8юп 2002.5).

Другим объектом настоящего изобретения является связывающая молекула, обладающая нейтрализующей активностью, получаемая описанными выше способами.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются композиции, содержащие, по меньшей мере, связывающую молекулу, предпочтительно моноклональное антитело человека по настоящему изобретению, по меньшей мере, ее функциональный вариант, по меньшей мере, иммуноконъюгат по настоящему изобретению или их комбинацию. Кроме того, указанные композиции могут содержать стабилизирующие молекулы, такие как альбумин, или полиэтиленгликоль, или соли. Предпочтительно используемыми солями являются соли, которые сохраняют требуемую биологическую активность связывающих молекул и не вызывают каких-либо нежелательных токсикологических эффектов. При необходимости связывающие молекулы человека по настоящему изобретению могут быть покрыты определенным веществом или нанесены на определенное вещество для защиты от воздействия кислот или других естественных или искусственных условий, которые могут инактивировать связывающие молекулы.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются композиции, содержащие, по меньшей мере, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Указанные композиции могут включать водные растворы, такие как водные растворы, содержащие соли (например №1С1 или вышеописанные соли), детергенты (например, додецилсульфат натрия (8Ό8)) и/или другие приемлемые компоненты.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, связывающую молекулу, такую как моноклональное антитело человека по настоящему изобретению (ее функциональный фрагмент или вариант), по меньшей мере, иммуноконъюгат по настоящему изобретению, по меньшей мере, композицию по настоящему изобретению или их комбинации. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению далее включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемые наполнители хорошо известны специалисту в данной области. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может далее включать по меньшей мере одно другое лекарственное средство. Приемлемые средства также хорошо известны специалисту в данной области.

В одном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции могут включать две или более связывающие молекулы, обладающие нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа Η5Ν1. В одном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы обладают синерги

- 19 017203 ческой нейтрализующей активностью при использовании в комбинации. Другими словами, указанные композиции включают по меньшей мере две связывающие молекулы, обладающие нейтрализующей активностью, отличаясь тем, что указанные связывающие молекулы оказывают синергическое действие, направленное на нейтрализацию вируса гриппа Η5Ν1. В используемом здесь значении термин синергический означает, что объединенное действие связывающих молекул, используемых в комбинации, является более сильным, чем их аддитивные действия при отдельном применении. Синергически действующие связывающие молекулы могут связываться с разными структурами в одинаковых или разных фрагментах вируса гриппа Η5Ν1. Синергическое действие вычисляют при помощи комбинационного индекса. Понятие комбинационного индекса (С1) было введено Чоу и Талалаем (1984). Композиции могут также включать одну связывающую молекулу, обладающую нейтрализующей активностью, и одну связывающую молекулу, специфически связывающуюся с Η5Ν1, которая не обладает нейтрализующей активностью. Не обладающие и обладающие нейтрализующей активностью молекулы, специфически связывающиеся с Η5Ν1, могут также синергически нейтрализовать вирус гриппа Η5Ν1.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может далее включать по меньшей мере одно другое терапевтическое, профилактическое и/или диагностическое средство. Указанная фармацевтическая композиция предпочтительно включает по меньшей мере одно другое профилактическое и/или терапевтическое средство. Указанные другие терапевтические и/или профилактические средства предпочтительно являются средствами, способными предотвращать и/или лечить грипп, вызываемый вирусом гриппа Η5Ν1, и/или состояние, возникшее после такого гриппа. Терапевтические и/или профилактические средства включают, не ограничиваясь ими, противовирусные средства. Такие средства могут быть связывающими молекулами, мелкими молекулами, органическими или неорганическими соединениями, ферментами, полинуклеотидными последовательностями, противовирусными пептидами и т.д. Другими средствами, которые в настоящее время используют для лечения субъектов, инфицированных вирусом гриппа Η5Ν1, являются ингибиторы М2 (например, амантидин, римантадин) и/или ингибиторы нейраминидазы (например, занамивир, озелтамивир). Указанные средства могут быть использованы в комбинации со связывающими молекулами по настоящему изобретению. Средства, способные предотвращать и/или лечить грипп, вызываемый вирусом гриппа Η5Ν1, и/или состояние, возникшее после такого гриппа, которые находятся на экспериментальной стадии, также могут быть использованы в качестве других терапевтических и/или профилактических средств, пригодных для использования в настоящем изобретении.

Связывающие молекулы или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть испытаны на приемлемых животных моделях до их введения человеку. Такие животные модели включают, не ограничиваясь ими, мышей, хорьков и обезьян.

Фармацевтические композиции должны быть стерильными и устойчивыми в условиях изготовления и хранения. Связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции по настоящему изобретению могут быть получены в виде порошка, предназначенного для восстановления в соответствующем фармацевтически приемлемом наполнителе, до или во время введения. В случае стерильных порошков, используемых для получения стерильных инъекционных растворов, предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые позволяют получить порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным требуемым ингредиентом из ранее стерилизованного фильтрованием раствора.

Альтернативно связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции по настоящему изобретению могут находиться в растворе, при этом соответствующий фармацевтически приемлемый наполнитель может быть добавлен и/или смешан до или во время введения для получения стандартной дозированной инъецируемой формы. Фармацевтически приемлемый наполнитель, используемый при осуществлении настоящего изобретения, предпочтительно может быть пригоден для достижения высокой концентрации лекарственного средства, для сохранения требуемой текучести и, при необходимости, для замедления абсорбции.

На выбор оптимального способа введения фармацевтических композиций влияют несколько факторов, которые включают физико-химические свойства активных молекул в композициях, неотложность клинической ситуации и соответствие концентраций активных молекул в плазме требуемому терапевтическому действию. Например, при необходимости, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть получены вместе с носителями, защищающими их от быстрого высвобождения, например, в виде композиций с пролонгированным действием, которые включают имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Для указанной цели могут быть использованы поддающиеся биологическому разложению, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимер молочной кислоты. Кроме того, может быть необходимо нанести на связывающие молекулы покрытие или вводить связывающие молекулы вместе с веществом или соединением, предотвращающим инактивацию связывающих молекул человека. Например, связывающие молекулы могут быть введены субъекту в приемлемом носителе, таком как липосомы или разбавитель.

Способы введения можно разделить на две основные категории: пероральные и парентеральные спо

- 20 017203 собы введения. Предпочтительным способом введения является внутривенное введение или ингаляция.

Лекарственные формы для перорального введения могут быть получены в виде таблеток, пастилок, лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых капсул, мягких желатиновых капсул, сиропов или эликсиров, пилюль, драже, жидкостей, гелей или взвесей. Указанные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, включающие, не ограничиваясь ими, инертные разбавители, гранулирующие и дезинтегрирующие вещества, связывающие вещества, смазывающие вещества, консерванты, красители, ароматизаторы или подсластители, растительные или минеральные масла, смачивающие вещества и загустители.

Могут быть также получены фармацевтические композиции по настоящему изобретению, предназначенные для парентерального введения. Композиции для парентерального введения могут иметь форму водных или неводных изотонических стерильных нетоксичных растворов или суспензий, предназначенных для инъекций или вливаний. Растворы или суспензии могут включать агенты, нетоксичные для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, такие как 1,3-бутандиол, раствор Рингера, раствор Хэнкса, изотонический раствор хлорида натрия, масла, жирные кислоты, местнодействующие анестезирующие средства, консерванты, буферы, вещества, повышающие вязкость или растворимость, водорастворимые антиоксиданты, растворимые в масле антиоксиданты и хелатообразователи металлов.

Другим объектом настоящего изобретения является применение связывающих молекул, таких как моноклональные антитела человека (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, в качестве лекарственного средства. Таким образом, в объем настоящего изобретения входит также способ лечения и/или профилактики гриппа, вызываемого вирусом гриппа Η5Ν1, при помощи связывающих молекул, иммуноконъюгатов, композиций или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Вышеуказанные молекулы могут быть использованы для диагностики, профилактики, лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа Η5Ν1, или для комбинации указанных целей. Указанные молекулы пригодны для лечения субъектов, страдающих гриппом, вызываемым вирусом гриппа Η5Ν1, которые ранее не подвергались никакому лечению, и субъектов, которые ранее подвергались лечению или в настоящее время проходят курс лечения от гриппа, вызываемого вирусом гриппа Η5Ν1. Связывающие молекулы могут быть использованы для введения таким субъектам, как работники здравоохранения, родственники инфицированных субъектов, рабочие птицеферм и т.д.

Вышеуказанные молекулы или композиции могут быть использованы вместе с другими молекулами, пригодными для диагностики, профилактики и/или лечения. Связывающие молекулы могут быть использованы ш У11го. ех угуо или ш угуо. Например, связывающие молекулы. такие как моноклональные антитела человека (или их функциональные варианты), иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить вместе с вакциной против вируса гриппа Η5Ν1 (при наличии такой вакцины). Альтернативно, указанную вакцину можно также вводить до или после введения молекул по настоящему изобретению. Вместо вакцины вместе со связывающими молекулами по настоящему изобретению могут быть использованы противовирусные средства. Приемлемые противовирусные средства были указаны выше.

Молекулы по настоящему изобретению обычно входят в состав композиций и фармацевтических композиций по настоящему изобретению в терапевтически или диагностически эффективном количестве. Альтернативно, указанные молекулы могут быть получены и введены отдельно. Например, другие молекулы, такие как противовирусные средства, могут быть введены системно, в то время как связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть введены внутривенно.

Схемы введения лекарственного средства могут быть определены с возможностью достижения оптимальной требуемой реакции (например, терапевтической реакции). Приемлемая доза может составлять, например, 0,1-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,5-15 мг/кг массы тела. Кроме того, например, можно ввести одну ударную дозу, несколько разделенных доз, повторяемых через определенные интервалы времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от сложившейся терапевтической ситуации. Молекулы и композиции по настоящему изобретению предпочтительно являются стерильными. Методы стерилизации указанных молекул и композиций хорошо известны в данной области. Другие молекулы, используемые для диагностики, профилактики и/или лечения, могут быть введены в соответствии со схемой введения, предложенной для связывающих молекул по настоящему изобретению. Другие молекулы, вводимые отдельно, могут быть введены субъекту до (например, за 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60 мин, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 7 дней, 2, 4 или 6 недель), одновременно или после (например, через 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60 мин, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 7 дней, 2, 4 или 6 недель) введения одной или нескольких связывающих молекул человека или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Точную схему введения обычно определяют в процессе клинических испытаний с участием людей.

Связывающие молекулы человека и фармацевтические композиции, содержащие связывающие молекулы человека, обычно используют и часто предпочтительно используют для введения людям в качестве терапевтических средств ш угуо, так как иммунная реакция реципиента на введенное антитело часто оказывается менее выраженной, чем при введении моноклональной, химерной или гуманизированной

- 21 017203 связывающей молекулы мыши.

Другим объектом настоящего изобретения является применение связывающих молекул, таких как нейтрализующие моноклональные антитела человека (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгатов, молекул нуклеиновых кислот, композиций или фармацевтических композиций по настоящему изобретению, для получения лекарственного средства для диагностики, профилактики, лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа Η5Ν1, или для комбинации указанных целей.

В объем настоящего изобретения входят также наборы, включающие, по меньшей мере, связывающую молекулу, такую как нейтрализующее моноклональное антитело человека (его функциональные фрагменты и варианты), по меньшей мере, иммуноконъюгат, по меньшей мере, молекулу нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, композицию, по меньшей мере, фармацевтическую композицию, по меньшей мере, вектор, по меньшей мере, хозяина по настоящему изобретению или их комбинацию. Вышеуказанные компоненты, входящие в наборы по настоящему изобретению, необязательно упакованы в соответствующие емкости и снабжены этикеткой с информацией о применении для диагностики, профилактики и/или лечения указанных заболеваний. Вышеуказанные компоненты могут храниться в емкостях для одной или нескольких доз в виде водного, предпочтительно стерильного раствора или в виде лиофилизованной, предпочтительно стерильной восстанавливаемой композиции. Указанные емкости могут быть изготовлены из разных материалов, таких как стекло или пластик, и могут обеспечивать стерильный доступ (например, указанная емкость может быть баллоном с раствором для внутривенного введения или флаконом с пробкой, проницаемой для иглы для подкожных инъекций). В комплект набора могут входить дополнительные емкости, содержащие фармацевтически приемлемый буфер. В набор могут далее входить другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, которые включают другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, культуральную среду для одного или нескольких приемлемых хозяев и, возможно, даже по меньшей мере одно другое терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство. К набору могут прилагаться инструкции, обычно вкладываемые в коммерческие упаковки терапевтических, профилактических или диагностических продуктов, которые содержат, например, информацию о показаниях, применении, дозировке, изготовлении, введении, противопоказаниях и/или предупреждения, относящиеся к применению таких терапевтических, профилактических или диагностических продуктов.

Настоящее изобретение далее относится к способу обнаружения вируса гриппа Η5Ν1 в образце, который включает стадии: (а) контактирования образца с диагностически эффективным количеством связывающей молекулы (ее функциональных фрагментов и вариантов) или иммуноконъюгата по настоящему изобретению и (Ь) выявления специфического связывания связывающей молекулы или иммуноконъюгата с молекулой образца. Образцом может быть биологический образец, включающий, не ограничиваясь ими, кровь, сыворотку, стул, мокроту, носоглоточные аспираты, бронхиальный лаваж, мочу, ткань или другой биологический материал, полученный у (потенциально) инфицированных субъектов, или небиологический образец, такой как вода, питье и т. д. (Потенциально) инфицированные субъекты, которыми могут быть люди, а также животные, предположительно являющиеся носителями вируса гриппа Η5Ν1, могут быть исследованы на наличие вируса с помощью связывающих молекул человека или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Образец может быть сначала обработан методами, позволяющими сделать его более приемлемым для обнаружения вируса. Обработка образца, предположительно и/или действительно содержащего вирус, предполагает расщепление вируса на антигенные компоненты, такие как белки, (поли)пептиды или другие антигенные фрагменты. Связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению контактируют с образцом в условиях, делающих возможным образование иммунологического комплекса между связывающими молекулами человека и вирусом или его антигенными компонентами, которые могут присутствовать в образце. Образование иммунологического комплекса, свидетельствующего о присутствии вируса в образце, затем обнаруживают и измеряют приемлемыми средствами. Такие методы включают иммуноанализы гомогенного и гетерогенного связывания, такие как радиоиммуноанализы (К1Л), ЕЬ18А, иммунофлуоресцентные анализы, иммуногистохимические анализы, РАС8, В1АСОВЕ и анализы методом вестерн-блоттинга.

Предпочтительными методами выполнения анализов, в частности, применяемыми для широкомасштабного клинического исследования сыворотки и крови субъектов и получаемых из крови продуктов, являются ЕЫ8А и вестерн-блоттинг. Особенно предпочтительным анализом является ЕЫ8А. Связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению, используемые в качестве реагентов при выполнении указанных анализов, обычно связывают с внутренней поверхностью лунок титрационных микропланшетов. Связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть непосредственно связаны с лункой титрационного микропланшета. Однако максимальное связывание связывающих молекул или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению с лунками может быть достигнуто в результате предварительной обработки лунок полилизином до введения связывающих молекул или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Кроме того, связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть ковалентно связаны с лунками известными методами. Связывающие молекулы или иммуноконъюгаты обычно используют для покрытия в количестве 0,01-100 мкг/мл, хотя могут быть использованы большие, а также меньшие количества. За- 22 017203 тем в лунки, покрытые связывающими молекулами или иммуноконъюгатами по настоящему изобретению, добавляют образцы.

Кроме того, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации специфических связывающих рецепторов вируса гриппа Η5Ν1. Связывающими рецепторами могут быть эпитопы белков и/или полипептидов. Указанные эпитопы могут быть линейными, структурными и/или конформационными. В одном варианте осуществления изобретения связывающие рецепторы могут быть идентифицированы при помощи анализа ΡΕΡδί,ΆΝ (см. АО 84/03564, АО 93/09872, 81ооЩга с1 а1., 1996). Альтернативно, можно исследовать рандомизированную пептидную библиотеку, включающую пептиды, полученные из белка вируса гриппа Η5Ν1, с целью обнаружения пептидов, способных связываться со связывающими молекулами по настоящему изобретению. Обнаруженные связывающие рецепторы/пептиды/эпитопы могут быть использованы в качестве вакцин и для диагностики гриппа, вызываемого вирусом гриппа Η5Ν1. В том случае, если связывающие молекулы связываются с фрагментами, отличными от белков и/или полипептидов, связывающие рецепторы могут быть идентифицированы масс-спектрометрией, высокоэффективной жидкостной хроматографией и спектроскопией ядерного магнитного резонанса.

Другим объектом настоящего изобретения является способ скрининга связывающей молекулы (ее функционального фрагмента или варианта) в отношении специфического связывания с эпитопом вируса гриппа Η5Ν1, подобному эпитопу, связываемому связывающей молекулой человека по настоящему изобретению, который включает стадии: (а) контактирования исследуемой связывающей молекулы, связывающей молекулы по настоящему изобретению и вируса гриппа Η5Ν1 или его фрагмента; (Ь) определения способности исследуемой связывающей молекулы конкурировать за специфическое связывание с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом со связывающей молекулой по настоящему изобретению. На следующей стадии можно определить, обладают ли отобранные связывающие молекулы, способные специфически связываться с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом, нейтрализующей активностью. Связывающая молекула, способная конкурировать за специфическое связывание с вирусом гриппа Η5Ν1 или его фрагментом со связывающей молекулой по настоящему изобретению, также входит в объем настоящего изобретения. В описанном выше способе скрининга специфическое связывание с тем же эпитопом предполагает также специфическое связывание, по существу, или в основном с тем же эпитопом, с которым связывается связывающая молекула по настоящему изобретению. Способность блокировать связывание или конкурировать со связывающими молекулами по настоящему изобретению за связывание с вирусом гриппа Η5Ν1 обычно показывает, что исследуемая связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания вируса гриппа Η5Ν1, который в структурном отношении перекрывает сайт связывания вируса гриппа Η5Ν1, иммуноспецифически узнаваемый связывающими молекулами по настоящему изобретению. Альтернативно, указанная способность может показывать, что исследуемая связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания, расположенным достаточно близко к сайту связывания, иммуноспецифически узнаваемому связывающими молекулами по настоящему изобретению, что позволяет пространственно или каким-либо другим образом ингибировать связывание связывающих молекул по настоящему изобретению с вирусом гриппа Η5Ν1.

Как правило, конкурентное ингибирование измеряют при помощи анализа, при выполнении которого антигенную композицию, т.е. композицию, содержащую вирус гриппа Η5Ν1 или его фрагменты, смешивают с эталонными связывающими молекулами, т. е. связывающими молекулами по настоящему изобретению, и исследуемыми связывающими молекулами. Исследуемые связывающие молекулы обычно присутствуют в избытке. Для таких простых исследований конкурентного связывания могут быть использованы методы на основе ЕЬ18А и вестерн-блоттинга. Используя вторичные антитела вида или изотипа, специалист в данной области может обнаружить только связанные эталонные связывающие молекулы, связывание которых будет меньше в присутствии исследуемой связывающей молекулы, узнающей, по существу, тот же эпитоп. При выполнении исследования конкурентного связывания между эталонной связывающей молекулой и любой исследуемой связывающей молекулой (независимо от вида или изотипа) можно сначала пометить эталонную связывающую молекулу обнаруживаемой меткой, такой как, например, биотин, ферментативная, радиоактивная или другая метка, позволяющей произвести последующую идентификацию. Связывающие молекулы, идентифицированные при помощи указанных анализов конкурентного связывания (конкурирующие связывающие молекулы или перекрестно взаимодействующие связывающие молекулы), включают, не ограничиваясь ими, антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, связывающиеся с эпитопом или сайтом связывания, с которыми связывается эталонная связывающая молекула, т. е. связывающая молекула по настоящему изобретению, а также антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, связывающиеся с эпитопом или сайтом связывания, расположенным достаточно близко к эпитопу, с которым связывается эталонная связывающая молекула в процессе конкурентного связывания между исследуемыми связывающими молекулами и эталонной связывающей молекулой. Конкурирующие связывающие молекулы по настоящему изобретению, присутствуя в избытке, предпочтительно ингибируют специфическое связывание эталонной связывающей молекулы с выбранным видом-мишенью по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50% и наиболее предпочтительно по меньшей

- 23 017203 мере на 75-90% или даже больше. Идентификация одной или нескольких конкурирующих связывающих молекул, которые связываются примерно, по существу, в основном или с тем же эпитопом, что и связывающие молекулы по настоящему изобретению, не вызывает никаких технических трудностей. Так как конкурирующие связывающие молекулы идентифицируют по сравнению с эталонной связывающей молекулой, т.е. связывающей молекулой по настоящему изобретению, очевидно, что для идентификации конкурирующей связывающей молекулы, которая связывается с тем же или, по существу, с тем же эпитопом, что и эталонная связывающая молекула, нет необходимости определять эпитоп, с которым связывается эталонная связывающая молекула и конкурирующая связывающая молекула.

Примеры

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано приведенными ниже примерами. Приведенные примеры не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1. Создание библиотек отображения на фаге ксБу с использованием РНК, экстрагированной из В-клеток памяти.

Периферическую кровь брали у нормальных здоровых доноров при помощи венопунктирования и помещали в пробирки для проб с антикоагулянтом ΕΌΤΆ. Пробу крови (45 мл) дважды разводили РВ8, 30 мл аликвоты наносили на 10 мл фиколл-гипака (Рйагшааа) и центрифугировали с ускорением 900/д без перерывов в течение 20 мин при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли непосредственно над белым слоем, содержащим лимфоциты и тромбоциты. Затем указанный слой осторожно удаляли (~10 мл), переносили в чистую 50-мл пробирку, трижды промывали 40 мл РВ8 и центрифугировали с ускорением 400/д в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления тромбоцитов. Полученный после центрифугирования осадок, содержащий лимфоциты, ресуспендировали в среде КРМ1, содержащей 2% БВ8, и определяли число клеток методом подсчета клеток. Примерно 1/10⁸ лимфоцитов окрашивали для флуоресцентной сортировки клеток, используя СЭ24, СЭ27 и поверхностный 1дМ в качестве маркеров для выделения В-клеток памяти 1дМ. Для физической сортировки и выделения В-клеток памяти использовали устройство Всс1оп Оюкиъоп 01д11а1 Уап1аде, действующее в режиме предельного напряжения сдвига. Лимфоциты были получены в виде небольшой компактной популяции в окне Б8С/88С. В-клетки памяти (СО24+/СО27+) затем отделяли от не подвергнутых воздействию В-клеток (ί.Ό24+/ί.Ό27-) и Т-клеток памяти (СО24-/СИ27+). На следующей стадии В-клетки памяти 1дМ (1дМ+) отделяли от В-клеток-переключателей памяти (1дМ-) путем экспрессии 1дМ. На данной стадии Вклетки памяти 1дМ сортировали в отдельной пробирке. Клетки в количестве 1/10⁵ собирали в ОМЕМ/50% БВ8 и после окончания сортировки центрифугировали с ускорением 400/д в течение 10 мин и лизировали в 500 мкл раствора для экстрации полной РНК ΤΚΙΖΘΕ (1пуйгодеп). РНК экстрагировали из раствора для лизиса с использованием 200 мкл хлороформа и осаждали изопропанолом в соответствии с инструкцией, прилагаемой к раствору ΤΚΙΖΘΕ. Затем вводили 1 мкл красителя для гранул (Ыоуодеп) для усиления и визуализации процесса гранулирования. Полную РНК растворяли в 23 мкл ИЕРСобработанной ультрачистой воды (1пуйгодеп) и использовали для конверсии кДНК при помощи обратной транскриптазы 8ирег8спр1 III (1пуйгодеп). К образцу РНК добавляли 1 мкл произвольных гексамеров (500 нг/мкл) (Рготеда), смешивали и плавили при 65°С в течение 5 мин в устройстве для ПЦР с нагреваемой крышкой. Образец быстро охлаждали на влажном льду и добавляли следующие компоненты: 8 мкл 5-кратного буфера ΚΤ (250 мМ трис-НС1, рН 8,3, 375 мМ КС1, 15 мМ МдС1₂), 2 мкл нескольких ДЫТР (по 10 мМ каждого) Цпуйгодеп), 2 мкл ΌΤΤ (100 мМ), 2 мкл ингибитора РНКазы (40 ед./мкл) (Рготеда), 2 мкл 8ирег5спр1 III (200 ед./мкл) (1пуйгодеп). Полученную смесь сначала инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре и затем на 1 ч переносили в устройство для ПЦР с нагреваемой крышкой при 50°С. Взаимодействие прекращали, нагревая до 75°С в течение 15 мин. Полученную кДНК разбавляли до 200 мкл ультрачистой водой и хранили при -20°С до последующего применения.

Было выполнено два цикла амплификации при помощи ПЦР с использованием наборов праймеров, показанных в табл. 1 и 2, для выделения УН- и УЪ-областей иммуноглобулина из соответствующего донорского спектра. Была использована следующая композиция для амплификации методом ПЦР: 5 мкл матричной кДНК, 32,75 мкл ультрачистой воды, 2,5 мкл каждого праймера (10 мкМ), 5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (200 мМ трис-НС1, рН 8,4, 500 мМ КС1), 1,5 мкл МдС1₂ (50 мМ), 0,5 мкл нескольких άΝΤΓ (по 25 мМ каждого), 0,25 мкл Τа^-полимеразы (5 ед./мкл) ([пуйгодеп). В результате выполнения первого цикла амплификации соответствующей кДНК с использованием наборов праймеров, указанных в табл. 1, было получено 7, 6 и 9 продуктов, содержащих примерно 650 пар оснований, соответственно для УН-области, У-области каппа-цепи и У-области лямбда-цепи. Для амплификации УН-области Вклеток памяти ЦМ использовали константный праймер ОСМ в комбинации с ОН1-ОН7. Для амплификации первого цикла была использована следующая программа термической циклизации: 2 мин при 96°С (стадия денатурации), 30 циклов по 30 с при 96°С/30 с при 55°С/60 с при 72°С, конечное удлинение в течение 10 мин при 72°С и охлаждение при 4°С. Продукты наносили и выделяли из 1% агарозного геля в колонках для гелевой экстракции (01адеп) и элюировали в 50 мкл 1 мМ трис-НС1, рН 8,0. Десять процентов продуктов, полученных в первом цикле (5 мкл), подвергали амплификации второго цикла с использованием праймеров, приведенных в табл. 2. Указанные праймеры были удлинены сайтами рестрикции,

- 24 017203 позволяющими выполнять направленное клонирование соответствующих УЪ- и УН-областей в векторе отображения на фаге РИУ-С0б. Для амплификации второго цикла была использована следующая программа ПЦР: 2 мин при 9б°С (стадия денатурации), 30 циклов по 30 с при 9б°С/30 с при бО°С/бО с при 72°С, конечное удлинение в течение 10 мин при 72°С и охлаждение при 4°С. Продукты, полученные во втором цикле (~350 пар оснований), сначала группировали в соответствии с естественной частотой 1сегментов, обнаруженных в генных продуктах иммуноглобулина, в результате чего было получено 7, б и 9 пулов соответственно для УН-области, У-области каппа-цепи и У-области лямбда-цепи (см. табл. 3 и 4). Для достижения нормализованного распределения последовательной иммуноглобулина в иммунной библиотеке б пулов У-области каппа-цепи и 9 пулов У-области лямбда-цепи смешивали в соответствии с процентными значениями, указанными в табл. 3. Единственный конечный пул УЪ-области (3 мкг) расщепляли в течение ночи рестрикционными ферментами 8а11 и ΝοΐΙ, наносили и выделяли из 1,5% агарозного геля (~350 пар оснований) в колонках для гелевой экстракции 01адеп и лигировали с 8а11-ΝοΐΙразрезанным вектором РИУ-С0б (~5000 пар оснований) следующим образом: 10 мкл вектора РЭУ-С0б (50 нг/мкл), 7 мкл вставки УЪ-области (10 нг/мкл), 5 мкл 10-кратного буфера для лигирования (ΝΕΒ), 2,5 ДНК-лигазы Т4 (400 ед./мкл) (ΝΕΒ), 25,5 мкл ультрачистой воды (отношение вектора к вставке было равно 1:2). Лигирование выполняли в течение ночи на водяной бане при 1б°С. Затем объем удваивали, добавляя воду, экстрагировали равным объемом фенола-хлороформа-изоамилового спирта (75:24:1) (Ιηуйгодеп) и затем хлороформом (Мегск) и осаждали 1 мкл красителя для гранул (Νονοβοη). 10 мкл ацетата натрия (3М, рН 5,0) и 100 мкл изопропанола в течение 2 ч при -20°С. Полученный образец центрифугировали с ускорением 20000хд в течение 30 мин при 4°С. Полученный осадок промывали 70% этанолом и центрифугировали в течение 10 мин с ускорением 20000хд при комнатной температуре. Этанол удаляли при помощи вакуумной аспирации, осадок после центрифугирования подвергали воздушной сушке, в течение нескольких минут и растворяли в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1, рН 8,0. 1 мкл лигируемой смеси использовали для трансформации 40 мкл электрокомпетентных клеток ТС-1 (81та1адепе) в охлаждаемой 0,1 см кювете для электропорации (Вютаб), используя для указанной цели устройство СепернЪег II (Вюгаб) с установками 1,7 кВ, 200 Ом, 25 мкф (временная константа ~4,5 мс). Сразу же после импульсной обработки бактерии вымывали из кюветы 1000 мкл среды 8ОС (1пуйгодеп), содержащей 5% (мас./об.) глюкозы (81дша), при 37°С и переносили в 15 мл круглодонную пробирку с культурой. Использовали еще 500 мкл 8ОС/глюкозы для вымывания оставшихся бактерий из кюветы и добавляли в пробирку с культурой. Бактерии восстанавливали культивированием в течение 1 ч при 37°С в термостате с шейкером, вращающемся со скоростью 220 об/мин. Трансформированные бактерии культивировали на больших 240 мм квадратных чашках Петри (ΝυΝΟ), содержащих 200 мкл агара 2ΤΥ (1б г/л бактотриптона, 10 г/л бактодрожжевого экстракта, 5 г/л №С1, 15 г/л агара, рН 7,0), в который вводили 50 мкг/мл ампициллина и 5% (мас./об.) глюкозы (81дша). Титр 1:1000 культивировали для подсчета на 15 см чашках Петри, содержащих такую же среду. Процесс трансформации повторяли последовательно 20 раз, полную библиотеку культивировали на 30 больших квадратных чашках Петри и выращивали в течение ночи на паровой бане для культуры при 37°С. При выполнении рассмотренного способа обычно получали около 1 х 10⁷ КОЕ. Промежуточную библиотеку УЪ-областей легких цепей собирали с планшетов, осторожно соскабливая бактерии в 10 мкл среды 2ΤΥ для одного планшета. Массу клеток определяли, измеряя оптическую плотность при б00 нм (ОИб00), и двукратное количество бактерий, соответствующее 500 ОИ, использовали для получения максимальной плазмидной ДНК в двух колонках Р500 шах1ртер (01адеп) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Аналогично вариабельным УЪ-областям продукты УН-1Н второго цикла сначала смешивали до достижения нормального распределения 1-сегментов (см. табл. 4), в результате чего было получено 7 субпулов УН-областей, именуемых РН1-РН7. Полученные пулы смешивали до достижения нормализованного распределения последовательностей в процентных значениях, указанных в табл. 4, в результате чего была получена одна фракции УН-областей, которую расщепляли рестрикционными ферментами 81ΪΙ и ΧΙιοΙ и лигировали с промежуточной библиотекой 8Гб-Х1ю1-разрезанных векторов РИУ-УЪ, которая была получена в соответствии с приведенным выше описанием. Лигирование, очистку, последующую трансформацию ТС1 и сбор бактерий выполняли точно так же, как было описано для промежуточной библиотеки УЪ-областей (см. выше). Конечную библиотеку (примерно 5х10^б КОЕ) проверяли в отношении частоты вставок при помощи ПЦР колоний с использованием набора праймеров, фланкирующих вставленные УН-УЪ-области. Более чем у 95% колоний были обнаружены вставки требуемой длины (см. табл. 5). Продукты ПЦР колоний были использованы для последующего анализа последовательностей ДНК с целью проверки изменения последовательностей и определения процентного значения колоний, имеющих полную открытую рамку считывания (ОВР). Полученное значение обычно превышало 70% (см. табл. 5). Кроме того, анализировали частоту мутаций в генах У-области. Из 50 последовательностей 47 (94%) не имели конфигурацию зародышевой линии клеток, что свидетельствует о процессе мутации и соответствует фенотипу В-клеток памяти, использованных в качестве источника РНК для библиотеки. И наконец, библиотеку изымали, амплифицировали с помощью фагов-хелперов СТ (см. XVО 02/103012) и использовали для отбора фагового антитела методами пэннинга, описанными ниже.

- 25 017203

Пример 2. Отбор фагов, несущих одноцепочечные Εν-фрагменты против Η5Ν1.

Фрагменты антитела отбирали, используя библиотеки отображения антител на фаге, созданные в соответствии с приведенным выше описанием, общепринятым методом отображения на фаге и методом МАВЗТВАСТ®, описанным в патенте США № 6265150 и публикации νΘ 98/15833 (которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Кроме того, в настоящем изобретении были использованы методы и фаги-хелперы, описанные в публикации νΘ 02/103012 (которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки).

Отбор производили в отношении рекомбинантного гемагглютинина (НА) подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/2004; см. ЗЕО ΙΌ ΝΘ: 110), полученного при использовании векторов на основе бакуловируса в клетках насекомых (Рго1еш Заепсек, СТ, ИЗА). Аминокислотная последовательность НА из изолята А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1Τν) и консенсусная аминокислотная последовательность, представляющая НА из штаммов, выделенных в Индонезии и Китае (Η5Ν1ΙΟ), показаны соответственно в ЗЕО ΙΌ ΝΘ: 111 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 112. Отбор также производили в отношении растворимого рекомбинантного НА (8ΗΛ) из Η5Ν1.

Последовательность, кодирующую внеклеточную (растворимую) часть НА (&ИА) из изолята А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1), представляющую НА, идентифицированный в штаммах гриппа, выделенных в Таиланде и Вьетнаме (κΗΛ штамма Η5Ν1Τν, ЗЕО ΙΌ ΝΘ:113) в 2004 г. (клад 1), и консенсусную последовательность, представляющую растворимые части НА штаммов Η5Ν1, выделенных в Индонезии и Китае (ША штамма Η5Ν1ΙΟ, ЗЕО ΙΌ ΝΘ: 114) в 2003/2004 гг. (клад 2), клонировали в векторе экспрессии, содержащем тус- и Ык-метку, стандартными методами клонирования ДНК. НА штаммов Η5Ν1Τν и Η5Ν1Ιί.' отличаются в 9 положениях аминокислотных остатков, локализованных в субъединице НА1 молекул. ДНК трансфецировали стандартными методами в клетках РЕЕ.С6 с целью временной и/или устойчивой экспрессии. кИА очищали от супернатанта культуры при помощи аффинной хроматографии хелата металла в колонках ΕΕ ШкТгар™ (Атегкйат Вюкаепсе) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Антигены НА (рекомбинантные НА и ША штамма Η5Ν1Τν) разводили в РВЗ (5,0 мкг/мл), вводили в пробирки М.1пс-1ттипо Мах1Зогр™ (Шпс) и инкубировали в течение ночи при 4°С на вращающемся колесе. Содержимое иммунологических пробирок удаляли и пробирки трижды промывали в блокирующем буфере (2% обезжиренного сухого молока (ЕЬК) в РВЗ). Затем иммунологические пробирки полностью заполняли блокирующим буфером и инкубировали в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Кроме того, иммунологические пробирки сенсибилизировали в течение ночи антителом против тусметки и инкубировали с блокирующим буфером, содержащим 5 мкг/мл тус-меченного ША штамма Η5Ν1Τν. Аликвоты собранной библиотеки отображения на фаге (500-1000 мкл, 0,5х10¹³ - 1х10¹³ КОЕ, амплифицированные с помощью фага-хелпера СТ (см. νΘ 02/103012)) блокировали в блокирующем буфере, содержащем 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной методом, отличным от нагревания, и 2% сыворотки мыши, в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Блокированную фаговую библиотеку вводили в иммунологические пробирки, инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и промывали промывочным буфером (0,05% (об./об.) твина-20 в РВЗ) для удаления несвязанных фагов. Связанные фаги элюировали из соответствующего антигена, инкубируя с 1 мл 100 мМ триэтиламина (ТЕА) в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем элюированные фаги смешивали с 0,5 мл 1М трис-ПС1, рН 7,5, до достижения нейтрального значения рН. Полученную смесь использовали для инфицирования 5 мл культуры Е.со11, окрашенной ХЫ-синим, которая была выращена при 37°С до ΘΌ при 600 нм, равной примерно 0,3. Фаги оставляли инфицировать бактерии, окрашенные ХЫ-синим, в течение 30 мин при 37°С. Затем смесь центрифугировали в течение 10 мин с ускорением 3000хд при комнатной температуре и бактериальный осадок ресуспендировали в 0,5 мл среды из 2-триптона и дрожжевого экстракта (2ΤΥ). Полученную бактериальную взвесь распределяли в две чашки с агаровой средой 2ΤΥ, содержащей тетрациклин, ампициллин и глюкозу. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С, колонии соскабливали с чашек и использовали для получения обогащенной фаговой библиотеки в соответствии с описанием, приведенным в публикациях Эе КгшГ е1 а1. (1995а) и νΘ 02/103012. Соскобленные бактерии использовали для инокуляции среды 2ΤΥ, содержащей ампициллин, тетрациклин и глюкозу, и выращивали при 37°С до ΘΌ при 600 нм, равной ~0,3. Доблавляли фаги-хелперы СТ и оставляли инфицировать бактерии, после чего указанную среду заменяли средой 2ΤΥ, содержащей ампициллин, тетрациклин и канамицин. Культуру продолжали инкубировать в течение ночи при 30°С. На следующий день бактерии удаляли из среды 2ΤΥ центрифугированием, после чего фаги в среде осаждали полиэтиленгликолем (РЕС) 6000/№1С1. И, наконец, фаги растворяли в 2 мл РВЗ, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (ВЗА), стерилизовали фильтрованием и использовали для следующего цикла отбора.

Альтернативно, отбор фагов производили в линиях клеток, экспрессирующих полноразмерный НА. С указанной целью клетки РЕЕ.С6 трансфецировали векторами экспрессии, содержащими полную кодирующую последовательность непроцессированного НА из изолята А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1Τν) и консенсусную последовательность, представляющую непроцессированные НА штаммов Η5Ν1, выделен

- 26 017203 ных в Индонезии и Китае (Η5Ν1ΙΟ). Параллельно с отбором каждого фага выполняли анализ методом проточной цитометрии с использованием антитела против НА, чтобы убедиться в экспрессии НА Η5Ν1Τν- и Н5№1С-трансфецированными клетками РЕК.С6 (данные не приведены). Нетрансфецированные клетки РЕК.С6 в количестве 10х10⁶ ресуспендировали в 0,5 мл собранной фаговой библиотеки и 0,5 мл культуральной среды для РЕК.С6, содержащей 4% ЕЬК, и инкубировали в течение 1 ч в переворачивающемся роторе, вращающемся со скоростью 5 об/мин, при 4°С. Смесь фаговой библиотеки/нетрансфецированных клеток РЕК.С6 центрифугировали в течение 5 мин с ускорением 300хд при 4°С и супернатант, содержащий фаги, удаляли во второй раз с 10х10⁶ нетрансфецированных клеток РЕК.С6. Удаленный фаговый препарат смешивали с 1 х 10⁶ НА-экспрессирующих клеток РЕК.С6 и инкубировали в течение 2 ч в переворачивающемся роторе, вращающемся со скоростью 5 об/мин, при 4°С. Затем клетки центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 3000хд и клеточный дебрис ресуспендировали в 1 мл РВ8/0,05% твина-20 для вымывания несвязанных фагов. Клетки центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 3000хд и повторяли промывку еще 5 раз. После каждой промывки клетки переносили в новую пробирку. Связанные фаги элюировали из антигена, инкубируя с 1 мл 100 мМ ТЕА в течение 10 мин в переворачивающемся роторе, вращающемся со скоростью 5 об/мин, при комнатной температуре. Клетки центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 3000хд и элюированные фаги переносили в 50 мл пробирку, содержащую 0,5 мл 1М раствора ηΜοΗΟΙ, рН 7,5. Выделение и размножение элюированных фагов производили в соответствии с приведенным выше описанием. Были выполнены два цикла отбора до выделения отдельных одноцепочечных фаговых антител. После второго цикла отбора отдельные колонии Е.сой использовали для получения моноклональных фаговых антител. Отдельные колонии выращивали до лог-фазы на 96-луночном планшете и инфицировали фагами-хелперами VС8-М13, после чего в течение ночи происходило образование фаговых антител. Супернатанты, содержащие фаговые антитела, использовали при выполнении анализа ЕЫ8А для связывания с антигенами НА. Альтернативно, фаговые антитела осаждали РЕС/№1С1 и стерилизовали фильтрованием для выполнения анализа методом проточной цитометрии.

Пример 3. Проверка наличия НА-специфических одноцепочечных фаговых антител.

Отобранные одноцепочечные фаговые антитела, полученные в результате вышеописанного скрининга, проверяли методом ЕЫ8А в отношении специфичности, т.е. связывания с антигенами НА. Для указанной цели экспрессированный в бакуловирусе рекомбинантный НА (Рго!еш 8с1епсек, СТ, И8А) и очищенные ^А штаммов Η5Ν1Τν и Η5Ν11С наносили на планшеты для ЕБ18А Махщогр™. Антитело против тус-метки тА 9Е10 (Косйе) иммобилизовали на планшетах для ЕЫ8А Махщогр™ в качестве отрицательного контрольного антитела. Покрытые планшеты трижды промывали РВ8, содержащим 0,1% об./об. твина-20, и блокировали в РВ8, содержащем 3% В8А или 2% ЕЬК, в течение 1 ч при комнатной температуре. Отобранные одноцепочечные фаговые антитела инкубировали в течение 1 ч в таком же объеме РВ8, содержащего 4% ЕЬК, для получения блокированных фаговых антител. Содержимое планшетов удаляли, планшеты трижды промывали РВ8/0,1% твина-20 и в лунки добавляли блокированные одноцепочечные фаговые антитела. Планшеты инкубировали в течение 1 ч, промывали РВ8/0,1% твина20 и производили обнаружение связанных фаговых антител (путем измерения ΟΌ при 492 нм), используя антитело против М13, конъюгированное с пероксидазой. Одновременно выполняли контрольный эксперимент, в котором вместо одноцепочечного фагового антитела использовали отрицательное контрольное одноцепочечное фаговое антитело. В результате отбора на разных антигенах НА с использованием библиотеки В-клеток памяти 1дМ было получено 92 уникальных одноцепочечных фаговых антитела, специфичных к рекомбинантному НА или ^А.

Альтернативно, при помощи анализа методом проточной цитометрии исследовали реактивность одноцепочечных антител, отобранных для связывания с НА-экспрессирующими клетками РЕК.С6. Фаги, осажденные РЕС/№С1. смешивали с равным объемом смеси РВ8/2% ЕЬК и блокировали в течение 30 мин на льду. Блокированные фаги добавляли к осажденным на гранулы клеткам (нетрансфецированные клетки РЕК.С6 и НА-экспрессирующие клетки РЕК.С6) и инкубировали в течение 1 ч на льду. Клетки трижды промывали РВ8/1% В8А, центрифугировали в течение 1 мин с ускорением 300хд и визуализировали связывание одноцепочечных фаговых антител с клетками, используя биотинилированное антитело против М13 (Ейхдега1б) и затем конъюгат стрептавидина-фикоэритрина (Са1!ад). Отбор с использованием НА-экспрессирующих клеток РЕК.С6 позволил получить 24 уникальных одноцепочечных фаговых антитела, которые не были идентифицированы во время отбора с использованием других белков рекомбинантного НА.

Пример 4. Исследование НА-специфических ксЕу-фрагментов.

Из отобранных клонов специфических одноцепочечных фаговых антител (ксЕу) была получена плазмидная ДНК и стандартными методами были определены нуклеотидные и аминокислотные последовательности. Идентичность нуклеотидной и аминокислотной последовательности и генов νΗ- и νΕобластей (см. публикацию Тотйпкоп 1.М. е! а1. V-ВА8Е 8ецнепсе О1гес!огу. СатЬпбде Иш!еб Кшдбот: МКС СеШге Гог Рго!еш Епдшееппд (1997)) ксЕу-фрагментов показана в табл. 6. Области СОК НАспецифических иммуноглобулинов показаны в табл. 7.

- 27 017203

Пример 5. Создание полностью человеческих молекул иммуноглобулина (моноклональные антитела человека) из отобранных одноцепочечных Εν-фрагментов.

Вариабельные области тяжелых и легких цепей 5сЕ\'-фрагментов клонировали методом рестрикционного гидролиза для экспрессии в 1д6-векторах экспрессии р1д-С911-НСу1 (см. ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 141), рЮС909-Ск (см. 5>ЕО ΙΌ ΝΟ: 142) или р!д-С910-СЕ (см. ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 143). Нуклеотидные последовательности для всех конструкций проверяли стандартными методами, известными специалисту в данной области. Полученные экспрессирующие конструкции, кодирующие тяжелые и легкие цепи !дС 1 человека, временно экспрессировали вместе в клетках 293Т, при этом были получены супернатанты, содержащие антитела Ι§61 человека, которые очищали стандартными методами очистки. Антитела !дС1 человека титровали в диапазоне концентраций от 10 до 0,003 мкг/мл против Н5 (данные не приведены). В качестве контрольного антитела использовали антитело, специфичное к 8АК8-СоУ. Молекулы !дС1 характеризовались такой же реактивностью, которая была продемонстрирована для одноцепочечных фаговых антител.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи антител, именуемых СЯ6141, СЯ6255, СЯ6257, СЯ6260, СЯ6261, СЯ6262, СЯ6268, СЯ6272, СЯ6296, СЯ6301, СЯ6307, СЯ6310, СЯ6314, СЯ6323, СЯ6325, СЯ6327, СЯ6328, СЯ6329, СЯ6331, СЯ6332, СЯ6334, СЯ6336, СЯ6339, СЯ6342, СЯ6343 и СЯ6344, а также вариабельные области тяжелой и легкой цепей приведены в табл. 8. Связывание ΙβΟ против НА с НА-экспресирующими клетками РЕЯ.С6 исследовали при помощи проточной цитометрии. Анализ связывания антитела с НА методом проточной цитометрии показал, что антитела СЯ6255, СЯ6257, СЯ6260, СЯ6261, СЯ6262, СЯ6268, СЯ6307, СЯ6310, СЯ6314, СЯ6323, СЯ6325, СЯ6331 и СЯ6344 связаны с НА (ШМТУрэкспрессирующими клетками РЕЯ.С6 (см. табл. 9). Антитела СЯ6261 и СЯ6344 также демонстрировали связывания с нетрансфецированными контрольными клетками, но полученные сигналы были примерно в 10 раз слабее сигналов, полученных для связывания с НА (Ж^ТУрэкспрессирующими клетками РЕЯ.С6 (см. табл. 9). Не было обнаружено связывания контрольного антитела СЯ3014 с НА-экспрессирующими клетками и нетрансфецированными контрольными клетками.

Пример 6. Нейтрализация ίη тПго вируса гриппа Η5Ν1 ШМ-специфическими Ι§6 (анализ нейтрализации вируса).

Для определения способности отобранных Ι§6 блокировать вирус гриппа Η5Ν1 ίη ν 11го были выполнены анализы нейтрализации вируса (УЛА). УЛА выполняли с использованием клеток МОСК (АТСС ССЬ-34). Клетки МОСК культивировали в культуральной среде для клеток МОСК (среда МЕМ, содержащая антибиотики, 20 мМ ИЕРЕЗ и 0,15% (мас./об.) бикарбоната натрия (полная среда МЕМ), содержащей 10% (об./об.) фетальной телячьей сыворотки). Реанжированный штамм ΝΙΒΡ6-14 вируса Η5Ν1, использованный при выполнении данного анализа, разводили до титра 4х10³ ТСГО 50/мл (доза, инфицирующая 50% культуры ткани в 1 мл), который вычисляли методом Спирмана и Карбера. Препараты Ι§6 (200 мкг/мл) дважды последовательно разводили (1:2 - 1:16) в полной среде МЕМ в дублированных лунках. 25 мкл соответствующего титра ΙβΟ смешивали с 25 мкл взвеси вируса (100 ТСГО 50/25 мкл) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем взвесь переносили в виде двух копий на 96-луночные планшеты, содержащие конфлюэнтные культуры МОСК в 50 мкл полной среды МЕМ. До использования клетки МОСК высевали в количестве 3х 10⁴ на лунку в культуральную среду для клеток МОСК, выращивали до слияния клеток, промывали 300-350 мкл РВ8, рН 7,4, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл полной среды МЕМ. Инокулированные клетки культивировали в течение 3-4 дней при 33°С и ежедневно проверяли появление цитопатического эффекта (СРЕ). СРЕ сравнивали с положительным контрольным образцом (клетки, инокулированные ΝΙΒΚ6-14) и отрицательным контрольным образцом (псевдоинокулированные клетки). Полное отсутствие СРЕ в отдельной культуре клеток определяли как защитное действие. При выполнении данного анализа в качестве положительного контрольного образца использовали антитело овцы против НА вируса гриппа Η5Ν1 А/Вьетнам/1194/04 (04/214, ΝΙΒ3Ε). Кроме того, культуры исследовали на наличие вируса при помощи иммуногистохимии. С указанной целью удаляли супернатант культуры и клетки фиксировали 40% (об./об.) ацетона и 60% (об./об.) метанола в течение 15 мин. Фиксированные клетки блокировали в течение 30 мин при 37°С в блокирующем буфере (200 мМ №С1, 0,2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (В8А), 0,01% тримерозала, 0,2% (об./об.) твина-20, 20 мМ ι])βο-ΗΟ1, рН 7,45), содержащем 2% (мас./об.) В8А и 5% (об./об.) козьей сыворотки. Затем клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 50 мкл смеси моноклональных антител мыши против вируса гриппа типа А (СНепнсоп). разведенной в отношении 1:1000 в промывочном буфере. Выполнив три промывки промывочным буфером, добавляли 50 мкл биотин-конъюгированного антитела козы против Ι§6 мыши (1аск§оп), разведенного в отношении 1:1000 в промывочном буфере, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Выполнив три промывки промывочным буфером, добавляли 50 мкл конъюгата стрептавидина-пероксидазы (Са1Ь1осНет), разведенного в отношении 1:3000 в промывочном буфере, и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Выполнив еще три промывки промывочным буфером, окрашивание визуализировали раствором АЕС (0,12% (мас./об.) 3-амино-9-этилкарбазола, 30% (об./об.) Ν-Νдиметилформамида и 70% (об./об.) ацетатного буфера), содержащим раствор 1 мкл Η₂Ο₂/1 мл АЕС. Вы

- 28 017203 полнив три промывки промывочным буфером, окрашивание анализировали под микроскопом.

Антитела человека против НА, именуемые СК6255, СК6257, СК6260, СК6261, СК6262, СК6268, СК6307, СК6310, СК6314, СК6323, СК6325, СК6331 и СК6344, анализировали вышеописанным методом νΝΑ. Все антитела нейтрализовали реаранжированный штамм ΝΙΒΚΟ-14 вируса гриппа Η5Ν1. Концентрации (в мкг/мл), при которых указанные антитела защищают культуры МОСК от СРЕ, приведены в табл. 10. В лунках, в которых был обнаружен цитопатический эффект (СРЕ), наличие вируса было подтверждено иммуногистохимическим окрашиванием (данные не приведены).

Для более точного определения нейтрализующей активности Н51М1-специфических 1дС ίη νίίΐΌ повторяли анализы нейтрализации вируса с использованием ΝΙΒΚΟ-14, но в данном случае препараты 1д6 дополнительно разводили. Препараты 1д6 (200 мкг/мл) последовательно дважды разводили (1:1 1:512) в полной среде МЕМ и исследовали в четырежды дублированных лунках при выполнении вышеописанного анализа νΝΑ. Нейтрализующую активность антител человека против Η5Ν1, именуемых СК6255, СК6257, СК6260, СК6261, СК6262, СК6268, СК6272, СК6307, СК6310, СК6314, СК6323, СК6325, СК6327, СК6328, СК6329, СК6331, СК6332, СК6334, СК6336, СК6339, СК6342, СК6343 и СК6344, определяли методом νΝΑ. Все антитела, за исключением СК6272 и СК6339, нейтрализовали реаранжированный штамм ΝΙΒΡ6-14 вируса гриппа Η5Ν1. Концентрации (в мкг/мл, в присутствии 100 ТСГО 50 вируса), при которых указанные антитела защищают культуры МОСК от СРЕ, приведены в табл. 11. В лунках, в которых был обнаружен цитопатический эффект (СРЕ), наличие вируса было подтверждено иммуногистохимическим окрашиванием (данные не приведены).

Пример 7. Анализ методом иммуноблоттинга Н5Ш-специфических 1дС.

Для дальнейшего исследования специфичности антител против НА разные антигены рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа типа А анализировали методом 808-РАСЕ в восстановительных условиях с последующим выполнением анализа антител против НА методом иммуноблоттинга. Полипептид НА0 состоит из субъединиц НА1 и НА2. Антитело СК5111, Н5Ш-специфическое контрольное антитело, узнавало субъединицу НА1 и интактный (нерасщепленный) полипептид НАО &ΗΑ штамма Η5Ν1Τν (см. фиг. 1, правая часть, полоса 1). Кроме того, антитело СК5111 узнавало субъединицу НА1 рекомбинантного НА подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/2004 (Η5Ν1); см. 8ЕО ГО ΝΟ: 110), полученную с использованием векторов на основе бакуловируса в клетках насекомых (Рго!еш Заепсек, СТ, И8А) (фиг. 1, правая часть, полоса 2). Нерасщепленный полипептид НА0 не был обнаружен в указанном препарате НА. Разницу в размере субъединиц НА, показанных в полосах 1 и 2, можно объяснить разным гликозилированием НА, экспрессированного в клетках насекомых и клетках РЕК.С6. Антитело СК111 не узнавало полипептиды НА1 и/или НА0 рекомбинантного НА подтипа Η1 (А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1)) (см. фиг. 1, правая часть, полоса 4) или рекомбинантного НА подтипа Н3 (А/Вайоминг/3/2003 (Η3Ν2)) (фиг. 1, правая часть, полоса 3).

Антитела СК6307 и СК6323 узнавали субъединицы НА2 5ΗΛ штамма Η5Ν1Τν (см. фиг. 1, левая и средняя части, полосы 1) и рекомбинантный НА подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/2002 (Η5Ν1) (см. фиг. 1, левая и средняя части, полосы 2). Интересно отметить, что субъединица НА2, присутствующая в интактных, нерасщепленных полипептидах НА0, не была узнана. По-видимому, эпитоп, узнаваемый антителами СК6307 и СК6323, становится доступным при расщеплении НА0. Кроме того, антитела СК6307 и СК6323 узнавали субъединицу НА2 рекомбинантного НА подтипа Η1 (А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1)) (см. фиг. 1, левая и средняя часть, полосы 4), но не узнавали субъединицу НА2 рекомбинантного НА подтипа Н3 (А/Вайоминг/3/2003 (Η3Ν2)) (см. фиг. 1, левая и средняя части, полосы 3), причем оба рекомбинантных НА были получены с использованием векторов на основе бакуловируса в клетках насекомых (Рго!еш 8с1епсе5, СТ, И8А). Так как сайт связывания нейтрализующих антител СК6307 и СК6323 является консервативным в штаммах вируса гриппа типа А подтипов Η1 и Н5, молекулу, содержащую указанный сайт связывания, можно считать (частью) вакцины, способной индуцировать широкий перекрестно реактивный ответ антитела против вируса гриппа.

Вслед за антителами СК.6307 и СК6323 анализу методом иммуноблоттинга были подвергнуты антитела, именуемые СК6141, СК6296 и СК6301. Каждое из трех указанных антител было способно связываться с субъединицей НА2 5ИА штамма Η5Ν1Τν и рекомбинантным НА подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/2004; Η5Ν1) (данные не приведены).

Пример 8. Анализ методом РАС8 с целью определения специфичности к субъединицам 45Ν1специфических 1дС.

Чтобы определить влияние субъединицы НА1 на связывание антител против Η5Ν1, выполняли анализ, в котором субъединицу НА1 выделяли из НА-экспрессирующих клеток РЕК.С6. НАэкспрессирующие клетки РЕК.С6 трижды промывали РВ8, рН 7,4 и инкубировали в течение 10 мин в подкисленном РВ8, рН 4,9. Затем клетки промывали РВ8, рН 7,4 и в течение 10 мин обрабатывали 10 мкг/мл трипсина в РВ8, рН 7,4 для расщепления молекул НА0 на субъединицы НА1 и НА2, связанные дисульфидной связью. И, наконец, клетки инкубировали в течение 20 мин в 20 мМ ИТТ в РВ8, рН 7,4 для отделения субъединицы НА1 от мембраносвязанной субъединицы НА2. Необработанные клетки и клетки, обработанные кислотой/трипсином/ОТТ, дважды промывали РВ8, содержащим 1% мас./об. В8А. Для выполнения анализа методом проточной цитометрии использовали 2,5х10⁵ клеток на одно окраши

- 29 017203 вание. Не было обнаружено окрашивания обработанных и необработанных клеток отрицательным контрольным антителом СЯ3014. Антитело СЯ5111, связывающееся с субъединицей НА1 при выполнении анализа методом иммуноблоттинга, окрашивало популяцию необработанных НА-экспрессирующих клеток РЕЯ.С6, в то время как обработанные клетки не были узнаны (данные не приведены). Полученные результаты снова подтверждают, что антитело СЯ5111 узнает субъединицу НА1. Обработанные и необработанные клетки были одинаково окрашены антителами СЯ6307 и СЯ6323 (данные не приведены). Выделение субъединицы НА1, очевидно, не влияло на связывание указанных антител, что снова подтверждает результаты анализа методом иммуноблоттинга, свидетельствующие о том, что указанные антитела связываются с субъединицей НА2. Антитела СЯ6325 и СЯ6331 связывались с необработанными клетками, при этом связывание с обработанными клетками было значительно меньше связывания с необработанными клетками (данные не приведены). Полученные результаты позволяют предположить, что сродство указанных антител к эпитопу значительно уменьшено вследствие изменения конформации, вызванного обработкой кислотой или удалением дисульфидной связи, связывающей субъединицы НА1 и НА2.

Пример 9. Анализ методом ЕЫ8А конкурентного связывания гемагглютинина с фаговыми антителами и 1дС.

Для идентификации антител, связывающихся с неперекрывающимися, неконкурирующими эпитопами, выполняли анализ методом ЕБ18А конкурентного связывания с гемагглютинином. Планшеты Мшс-Ипшипо™ Махщогр Е96 сенсибилизовали в течение ночи при 4°С 0,5 мкг/мл рекомбинантного НА подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/2004 (Η5Ν1) (Рго1еш 8с1еисе5) в РВ8. Несенсибилизированный белок вымывали и лунки блокировали 300 мкл РВ8, содержащего 2% мас./об. обезжиренного сухого молока (блокирующий раствор) в течение 1 ч при комнатной температуре. Блокирующий раствор удаляли и 50 мкл 10 мкг/мл 1дС против Η5Ν1 в блокирующем растворе в расчете на одну лунку инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 50 мкл фагового антитела в блокирующем растворе в концентрации, которая в два раза превышала концентрацию, вызывающую 50% максимальное связывание (которая была определена в предыдущем анализе), и инкубировали в течение еще 1 ч при комнатной температуре. Лунки трижды промывали РВ8, содержащим 0,1% об./об. твина-20. Связанное фаговое антитело обнаруживали при помощи конъюгированного с пероксидазой антитела против М13. Лунки снова промывали в соответствии с приведенным выше описанием и выполняли анализ методом ЕЫ8А, добавляя 100 мкл реагента ОРО (81дта). Взаимодействие прекращали, добавляя 50 мкл 1М раствора Η₂8Ο₄, и измеряли ΟΌ при 492 нм. Связывание фагового антитела в присутствии 1дС было выражено в виде процентного значения связывания при отсутствии 1дС, которое было задано равным 100%. В качестве контрольных антител использовали фаговое антитело 8С05-111 и соответствующий 1дС СЯ5111, которые узнают эпитоп в субъединице НА1 гемагглютинина Н5.

Результаты показывают, что большинство фаговых антител и 1дС связываются с перекрывающим эпитопом в рекомбинантном НА подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/2004 (Η5Ν1)) (данные не приведены). Связывание фагового антитела 8С05-111 было блокировано 1дС СЯ5111, но не любым другим 1дС, из чего следует, что другие 1дС узнают эпитоп, отличный от области связывания СЯ5111. Пять 1дС, СЯ6262, СЯ6272, СЯ6307, СЯ6339 и СЯ6343, в меньшей степени конкурировали за связывание, чем остальные 1дС (более 25% остаточного связывания). Для 1дС СЯ6262, СЯ6272, СЯ6339 и СЯ6343 подобный результат можно объяснить более низким сродством к НА. Полученный результат можно подтвердить тем, что с фаговыми антителами, соответствующими указанным антителам, более эффективно конкурировали другие 1дС. Связывание фагового антитела 8С06-307 было блокировано 1дС СЯ6307 и менее эффективно блокировано другими 1дС. Из вышеизложенного следует, что антитела 8С06-307 и СЯ6307 узнают особый эпитоп, который отличается от эпитопа, узнаваемого другими 1дС.

Пример 10. Анализ методом ЕБ18А перекрестной реактивности гемагглютинина при использовании 1дС против Η5Ν1.

Чтобы определить, является ли эпитоп антител против Η5Ν1 консервативной в НА, отличных от подтипа Н5, выполняли анализ методом ЕЫ8А перекрестной реактивности гемагглютинина. Планшеты Nиηс-Iттиηо™ Махщогр Е96 (Мтс) сенсибилизировали в течение ночи при 4°С 0,5 мкг/мл рекомбинантного НА подтипа Η1 (А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1)), подтипа 3 (А/Вайоминг/3/03 (Η3Ν2)), подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/04 (Η5Ν1)), подтипа Н7 (А/Нидерланды/219/03 (Η7Ν7) и подтипа Н9 (А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2)) (Рго1еш 8с1еисе5 Согр.) в РВ8. Кроме того, на планшеты в течение ночи наносили препараты ВРЬ-инактивированного вируса, содержащие 0,5 мкг/мл НА штамма А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1), и реаранжированного штамма МВЕС-14 (А/Вьетнам/1194/04 (Η5Ν1)) в РВ8. Лунки трижды промывали РВ8, содержащим 0,1% об./об. твина-20, для удаления несенсибилизированного белка и затем блокировали 300 мкл РВ8, содержащего 2% мас./об. обезжиренного сухого молока (блокирующий раствор), в течение 1 ч при комнатной температуре. Блокирующий раствор удаляли и 100 мкл/лунку 5 мкг/мл антител против Η5Ν1 в блокирующем растворе инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки трижды промывали РВ8, содержащим 0,1% об./об. твина-20, и связанные антитела обнаруживали при помощи конъюгированного с пероксидазой антитела мыши против 1дС че

- 30 017203 ловека (Таскзоп). Взаимодействие осуществляли и результат измеряли в соответствии с приведенным выше описанием. В табл. 12 показано, что все ЦС против Η5Ν1 связывались с рекомбинантным НА подтипа Н5 (А/Вьетнам/1203/2004 (Η5Ν1)) и препаратом ВРЬ-инактивированного вируса штамма ΝΙΕΡ614, содержащего НА штамма А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1). Все испытанные 1дС против Η5Ν1 не узнавали рекомбинантные НА подтипов Н3 и Н7. Интересно отметить, что все 1дС против Η5Ν1, за исключением СВ5111 и СВ6307, связывались с рекомбинантным НА подтипов Η1 и Н9 и препаратом ВРЬинактивированного вируса штамма А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1). Полученный результат показывает, что эпитоп большинства 1дС против Η5Ν1 является консервативным в молекулах НА разных подтипов.

Пример 11. Картирование эпитопов 1дС против Η5Ν1.

Окуно и др. (1993) и Смирнов и др. (1999) продемонстрировали наличие общего эпитопа для НА вируса гриппа типа А подтипов Η1, Н2 и Н5 и возможность нейтрализации указанных подтипов моноклональным антителом мыши С179 против указанного эпитопа. Указанный конформационный эпитоп состоит из двух разных сайтов, расположенных в субъединицах НА1 и НА2. Оба сайта расположены в непосредственной близости от середины стволовой области молекулы НА. Чтобы оценить способность вышеописанных антител против НА узнавать указанный эпитоп, были созданы молекулы НА с заменами аминокислот в данной области.

Эпитоп, узнаваемый антителом С179 (Такага В1о 1пс.), относился к областям, включающим остатки 318-322 субъединицы НА1 и остатки 47-58 субъединицы НА2 (нумерация аминокислот соответствует описанной Окуно и др., 1999). Вирусы, содержащие НА с заменой Тйг на Ьуз в положении 318 субъединицы НА1 или с заменой Vа1 на С1и в положении 52 субъединицы НА2, не были узнаны и нейтрализованы антителом С179. Указанные мутации (замена Тйг на Ьуз в положении 318, мутация I; замена Vа1 на С1и в положении 52, мутант II), замена Ьеи на Ме! в положении 320 субъединицы НА1 (мутант III, Ме1320 присутстует в области 318-322 НА1 подтипов Н3 и Н7), замена 8ег на Лщ в положении 54 субъединицы НА2 (мутант IV, Αγ§54 присутствует в области 47-58 НА2 подтипов Н3 и Н7) и замена Α3ρ на Αзη в положении 57 субъединицы НА2 (мутант V, Α3^7 присутствует в области 47-58 НА2 штамма А/Гонконг/156/97 (Η5Ν1)) вводили в полноразмерный НА из изолята А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1Τν) и трансфецировали клетки РЕВ.С6. Связывание антитела С179 и антител человека против НА с клетками РЕВ.С6, экспрессирующими указанные мутанты, определяли при помощи вышеописанного анализа РΑС8.

Антитело СВ5111 против эпитопа в субъединице НА1 и поликлональное сывороточное антитело овцы против Н5 подтвердили экспрессию Η5Ν1Τν и мутантов НА в результате трансфекции клеток РЕВ.С6 (данные не приведены). Не было обнаружено окрашивания отрицательным контрольным антителом СВ3014 или при отсутствии антитела (данные не приведены). В соответствии с предположением антитело С179 не узнавало мутанты I и II, содержащие замены аминокислот, такие же как в НА вирусов, не узнаваемых антителом С179 (см. Окуно и др., 1993). Кроме того, антитело С179 не связывалось с мутантом IV, при этом связывание антитела С179 с мутантами III и V оставалось неизменным. Аналогичная картина реактивности была обнаружена для антитела СВ6342, из чего следует, что антитела С179 и СВ6342 узнают один и тот же эпитоп. Антитела СВ6261, СВ6325 и СВ6329 узнавали все мутанты, за исключением мутанта II. Можно предположить, что эпитоп антител СВ6261, СВ6325 и СВ6329 отличается от эпитопа антитела С179. Так как замены в субъединице НА1 не устраняли связывание указанных антител, наиболее вероятно, что их эпитоп расположен в субъединице НА2. Антитела СК.6307 и СВ6323 узнавали все мутанты, из чего следует, что эпитоп указанных антител также отличается от эпитопа антитела С179. Краткий обзор последовательности мутантов и связывания антител приведен в табл. 13. В заключение на основании полученных результатов следует отметить, что антитела СВ6261, СВ6325, СВ6329, СВ6307 и СВ6323 являются идеальными кандидатами для связывания и нейтрализации вирусов гриппа, содержащих мутации в эпитопе, узнаваемого моноклональным антителом С179 мыши, которые не могут быть нейтрализованы указанным антителом из-за наличия указанных мутаций.

Пример 12. Профилактическая активность моноклональных антител ЦС человека против летального инфицирования вирусом Η5Ν1 ш νίνο.

Мышам вводили смертельную дозу штамма А/Гонконг/156/97 вируса гриппа Η5Ν1 для исследования профилактического действия моноклональных антител ЦС человека СВ6261, СВ6323 и СВ6325. За один день до инфицирования 8 группам по 10 мышей в каждой внутрибрюшинно вводили разные дозы антитела. В качестве отрицательного контрольного антитела одной группе мышей вводили неродственное контрольное антитело (СВ3014). Клинические признаки, снижение массы тела и смертность контролировали в течение 21 дня после инфицирования. Данное исследование было выполнено для оценки профилактического действия моноклональных антител ЦС человека против Η5Ν1 ш νίνο.

Штамм Η5Ν1 был первоначально получен у трехлетнего ребенка, страдающего респираторным заболеванием. Указанный вирус дважды пассировали на клетках МОСК. Серию вирусов [титр 8.1 1од ТСГО₅₀/мл], используемых для инфицирования мышей, размножали один раз в яйцах с развивающимися эмбрионами.

самок мышей Ва1Ь/с в возрасте 7 недель распределяли в 8 групп по 10 мышей в каждой, которым

- 31 017203 делали следующие инъекции до инфицирования вирусом Η5Ν1:

1) 15 мг/кг СВ6261

2) 5 мг/кг СВ6261

3) 2 мг/кг СВ6261

4) 0,7 мг/кг СВ6261

5) 15 мг/кг СВ6323

6) 15 мг/кг СВ6325

7) 500 мкл иммунной сыворотки кролика против Η5Ν1 (100-кратное разведение)

8) 15 мг/кг СВ3014.

Всех животных акклиматизировали и содержали в течение 6 дней до начала исследования. За один день до инфицирования вирусом Η5Ν1 мышам внутрибрюшинно вводили 500 мкл антитела. Животных инокулировали назально в 0-й день 25 ББ₅₀ вируса (примерно 50 мкл) и наблюдали в течение 21 дня. Фактическую дозу введенного вируса определяли титрованием нескольких повторных образцов, полученных из инокулята, оставшегося после окончания инокуляции животных. Титры вируса (ТСШ₅₀/мл) инокулята определяли на клетках МОСК. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии непреднамеренной инактивации вируса во время получения или введения инокулята. Группа 8 служила в качестве отрицательной контрольной группы. Животным в указанной группе инъецировали неродственное моноклональное антитело (СВ3014) в 0-й день. Группа 7 служила в качестве положительной контрольной группы. Мышам в указанной группе инъецировали поликлональное сывороточное антитело кролика, полученное против вируса гриппа Η5Ν3.

Клинические признаки и массу тела определяли ежедневно, начиная с дня, предшествующего исследованию (-1-й день), и до 21-го дня после инокуляции вирусом. Клинические признаки оценивали в соответствии со следующей системой оценок (0 = отсутствие клинических признаков; 1 = жесткая шерсть; 2 = жесткая шерсть, пониженная реакция на раздражение, пассивность во время осмотра; 3 = жесткая свалявшаяся шерсть, затрудненное дыхание, пассивность во время осмотра; 4 = жесткая свалявшаяся шерсть, затрудненное дыхание, не переворачивается на живот, будучи положенным на спину) и регистрировали. Выживших животных умерщвляли на 21-й день и собирали у них кровь. Для анализа уровней антитела 1дС в сыворотке у каждой мыши в 0-й день брали пробы крови. Сыворотку получали стандартным методом. Для получения сыворотки после инфицирования брали кровь у выживших животных на 21-й день. Сыворотку хранили при -20±2°С до выполнения анализа в присутствии антител, специфичных к вирусу. Сыворотку исследовали в дублированных пробах, используя 4 гемагглютинирующие единицы (ИАИ) субстрата ΗΚ/97 вируса Η5Ν1. Титры были выражены в виде обратной величины самого высокого титра сыворотки, содержащего ΗΙ, начиная с разведения 1/10.

В период акклиматизации все мыши были активными и выглядели здоровыми без признаков заболевания. Средние клинические оценки (общая клиническая оценка, деленная на число живых мышей в каждой группе), вычисляемые ежедневно, приведены на фиг. 2 (средняя клиническая оценка в группе), в табл. 14 (клинические оценки) и табл. 15 (расстройство дыхания). Появление отрицательных клинических признаков было отмечено на 3-й день после инфицирования группы, которую инокулировали отрицательным контрольным антителом СВ3014 (группа 8). Расстройство дыхания было впервые зарегистрировано на 6-й день и продолжалось в течение 1-4 дней. Клинические признаки не были обнаружены у мышей, которым вводили 15 мг/кг СВ6325 (группа 6). В группе 5 (СВ6323) у одной мыши были отмечены слабые клинические признаки (оценка 1) с 5-го по 8-й день, и на следующий день указанная мышь умерла. В группе 1 одна мышь умерла на 13-й день, при этом у указанной мыши не были выявлены предшествующие клинические признаки. Более высокие дозы антитела СВ6261 в среднем соответствовали более позднему появлению и более слабым клиническим признакам. Расстройство дыхания было отмечено в группе, которой вводили самую низкую дозу (0,7 мг/кг), и не было обнаружено в группах, которых вводили более высокие дозы (2, 5 и 15 мг/кг). У всех мышей наблюдалось улучшение клинического состояния с 9-го по 13-й день (группа 2, 3 и 5) или на 17-й день (группа 4). У мышей, которым вводили поликлональное антитело кролика (группа 1), возникла тяжелая форма заболевания в течение 3 дней, и затем все мыши умерли, из чего следует, что антитело кролика не защитило мышей от инфицирования ίη νίνο. Две мыши (одна в группе 4 и одна в группе 8) были умерщвлены на 10-й день и выведены из исследования, так как указанные животные были сильно больны (оценка 4).

У животных, инфицированных вирусом Η5Ν1, наблюдалось снижение массы тела в разной степени (фиг. 3). Пропорциональное снижение массы тела и время начала снижения массы тела зависели от дозы антитела. В группах, которым вводили самую высокую дозу антител, масса тела постоянно увеличивалась в течение указанного периода времени сопоставимо с приростом массы тела в данном возрасте. В группе животных, инокулированных самой низкой дозой СВ6261, масса тела снижалась быстрее, чем в группах животных, которым вводили более высокие дозы антитела. Общая потеря массы тела была больше в группах, которым вводили более низкую дозу, при этом средняя потеря массы тела составила примерно 15 и 40% от первоначальной массы тела в группах, инокулированных соответственно 2 или 0,7 мг/кг СК6261. В группах, которым вводили более низкую дозу, масса тела снова увеличивалась, когда у животных наблюдалось некоторое клиническое улучшение.

- 32 017203

На фиг. 4 показано число мышей, остававшихся живыми в группе каждый день. Существует четкая взаимосвязь между количеством введенного антитела и средним временем выживания. На фиг. 5 показана смертность в зависимости от дозы. Первые мыши умерли через 7 дней после инокуляции в группе, которой вводили самую низкую дозу (0,7 мг/кг), и в группе мышей, которым вводили отрицательное контрольное антитело СЯ3014. При введении 0,7 мг/кг антитела СЯ6261 выжили менее 50% животных. Однако при введении самой высокой дозы антитела выжили 9-10 мышей. Ни одна мышь не выжила в группе, которой вводили отрицательное контрольное антитело (СЯ3014), из чего следует, что в данном исследовании действительно была использована доза, вызывающая 100% летальное инфицирование.

Для оценки способности антител 1дС обеспечивать полную защиту от инфицирования выполняли анализ ΗΙ, используя сыворотку, полученную на 21-й день у мышей, которым вводили 15 мг/кг СЯ6261 (группа 1). Полученные данные должны показать, что мыши были инфицированы вирусом Η5Ν1, хотя и без клинического проявления.

Полученные результаты показывают, что по меньшей мере три антитела человека против Η5Ν1, идентифицированные и созданные в соответствии с настоящим описанием изобретения (СЯ6261, СЯ6323 и СЯ6325), способны в отдельности обеспечить защиту от смертельной дозы вируса гриппа Η5Ν1 ίη νίνο. Была выявлена четкая зависимость доза - ответная реакция между количеством введенного антитела СЯ6261 и средним временем выживания. Результаты показывают, что каждое испытанное моноклональное антитело 1дС против Η5Ν1 могло предотвратить клиническое проявление заражения Η5Ν1 у мышей при введении в дозе 15 мг/кг за один день до инфицирования.

Пример 13. Защитное и терапевтическое действие моноклональных антител человека против Η5Ν1, введенных после инфицирования смертельной дозой вируса гриппа Η5Ν1 ίη νίνο.

Было выполнено исследование с целью изучения терапевтического действия моноклональных антител по настоящему изобретению, представленных антителом СЯ6261, в постинфекционной модели против летального инфицирования вирусом гриппа Η5Ν1 Α/ΗΚ/97 ίη νίνο. Серия и тип вируса, а также возраст мышей были такими же, как в примере 12. В качестве отрицательного контрольного антитела одной группе мышей инъецировали неродственное контрольное антитело (СЯ2006). Клинические признаки, снижение массы тела и смертность контролировали в течение 21 дня после инфицирования.

самок мышей Ва1Ь/с в возрасте 7 недель распределяли в 5 групп, которым вводили антитело на разных стадиях после инфицирования следующим образом:

1) 10 мышей; 15 мг/кг СЯ6261 через 4 ч после инфицирования,

2) 14 мышей; 15 мг/кг СЯ6261 через 1 день после инфицирования,

3) 10 мышей; 15 мг/кг СЯ6261 через 2 дня после инфицирования,

4) 10 мышей; 15 мг/кг СЯ6261 через 3 дня после инфицирования,

5) 14 мышей; 15 мг/кг СЯ2006 через 1 день после инфицирования.

Все животных акклиматизировали и содержали в течение 6 дней до начала исследования. Животных инокулировали назально в 0-й день 25 ЬП₅₀ вируса гриппа Η5Ν1 (примерно 50 мкл) и контролировали в течение 21 дня. Фактическую дозу введенного вируса определяли титрованием нескольких повторных образцов, полученных из инокулята, оставшегося после окончания инокуляции животных. Титры вируса (ТСШ5₀/мл) инокулята определяли на клетках МОСК. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии непреднамеренной инактивации вируса во время получения или введения инокулята. В определенные периоды времени после инокуляции мышам внутрибрюшинно вводили 500 мкл антитела. Группа 5 служила в качестве отрицательной контрольной группы. Животным в указанной группе инъецировали неродственное моноклональное антитело (СЯ2006) через 1 день после инфицирования.

Клинические признаки и массу тела определяли ежедневно, начиная с дня, предшествующего исследованию (-1-й день), и до 21-го дня. Клинические признаки оценивали в соответствии с примером 12 по шкале оценок от 0 до 4. Выживших животных умерщвляли на 21-й день и собирали у них кровь. Для оценки патологических изменений 4 животных из групп 2 и 5 были умерщвлены на 6-й день после заражения. Указанные животные были заранее выбраны в 0-й день и содержались отдельно от других животных. По указанной причине в группах 2 и 5 вначале было 14 животных и после отбора осталось 10 мышей. Клинические признаки и массу тела определяли с -1-го до 21-го дня после инокуляции вирусом.

В период акклиматизации все мыши были активными и выглядели здоровыми без признаков заболевания. Средние клинические оценки (общая клиническая оценка, деленная на число живых мышей в каждой группе), вычисляемые ежедневно, приведены на фиг. 6 (средняя клиническая оценка в группе), в табл. 16 (клинические оценки) и табл. 17 (расстройство дыхания). Во всех группах имелись мыши, у которых клинические признаки появились в 1-й день после инфицирования. В зависимости от времени введения антитела клинические признаки уменьшались, и во всех группах клинические признаки отсутствовали на 15-й день. В контрольной группе 5 у всех животных наблюдались тяжелые клинические признаки, при этом все животные умерли или были умерщвлены, так как на 9-й день оценки клинических признаков достигли 4-го уровня. Из вышеизложенного следует, что животным была введена смертельная доза вируса гриппа. В группе 1, в которой животным вводили антитело через 4 ч после инфицирования, у некоторых животных не возникли клинические признаки, в то время как у других животных такие признаки появились. Число животных, у которых выявленные клинические признаки могли быть оценены

- 33 017203 по указанной шкале, указано в табл. 16. Так как вирус гриппа может оказывать сильное воздействие на органы дыхания, также измеряли расстройство дыхания; результаты данного измерения приведены в табл. 17.

На фиг. 7 и в табл. 18 указано число выживших животных и приведен уровень смертности соответственно для всех групп. По неизвестным причинам одна мышь в группе 1, которой антитело было введено через 4 ч после инфицирования, умерла на 10-й день. Все остальные животные в группах, которым вводили антитело после инфицирования вирусом гриппа, выжили и были здоровы на 21-й день. О выздоровлении ясно свидетельствуют данные массы тела, полученные у всех мышей. На фиг. 8 показана средняя масса тела в каждой группе мышей в течение 21 дня исследования. Несмотря на уменьшение массы тела у всех мышей после инфицирования, масса тела вернулась к нормальному уровню после введения антитела. Возврат к нормальной массе тела зависел от времени введения антитела, при этом животные, которым вводили антитело через 4 ч после инфицирования, выздоравливали быстрее и достигли нормальной массы тела на 7-й день, животные, которым вводили антитело через 3 дня после инфицирования, достигли нормальной массы тела на 17-й день. В конце исследования, т.е. на 21-й день, все животные достигли массы тела, имевшейся у них до инфицирования. Все животные, которым вводили отрицательное контрольное антитело, не восстановили массу тела, и измерения были прекращены в связи с их гибелью на 9-й день.

Полученные результаты показывают, что введение в период после инфицирования моноклонального антитела против вируса гриппа Η5Ν1 по настоящему изобретению, представленного антителом СЕ6261. помогает спасти млекопитающих, в данном случае мышей, после заражения смертельной дозой вируса гриппа Η5Ν1. Даже на поздней стадии, через 3 дня после инфицирования, указанное антитело позволяет ослабить клинические симптомы до уровня, на котором невозможно обнаружить клинические признаки заболевания. Весьма удивительным является то, что на 21-й день после инфицирования все животные, которым вводили антитело, достигли нормальной массы тела и не имели никаких остаточных клинических признаков.

Пример 14. Перекрестная защита ίη νίνο от летального инфицирования гетерологичными подтипами вируса гриппа при использовании моноклональных антител против НА вируса Η5Ν1.

Как было описано выше (пример 11), некоторые антитела по настоящему изобретению, повидимому, узнают один эпитоп в домене НА2 белка гемагглютинина Н5. В примере 7 было показано, что определенные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут взаимодействовать с эпитопом НА2 без учета конформации, другими словами, укладка белка гемагглютинина не влияет на нейтрализующую активность и защитное действие антител по настоящему изобретению.

В данной области известны последовательности частей белка гемагглютинина вируса гриппа, не подверженных дрейфу антигенов (= изменение иммунодоминантных областей в области НА1 белка, что делает необходимым ежегодное обновление вакцин против гриппа). Эпитоп в НА2, узнаваемый антителами СК6261, СК6325 и СК6329, находится в аминокислотной последовательности ΟνΤΝΚνΝδΙΙΌΚ (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 368, см. табл. 13), а также присутствует в белках гемагглютинина подтипов Η1 и Н9, см. табл. 22. В примере 10 было показано, что взаимодействие связывающих молекул по настоящему изобретению с указанным эпитопом не ограничивается НА белка Н5, и указанные молекулы узнают также НА в белках Η1 и Н9 (см. табл. 12). Таким образом, связывающие молекулы по настоящему изобретению узнают эпитоп, присутствующий в нескольких белках НА разных серотипов вируса гриппа.

Для исследования перекрестной применимости указанных антител в терапии ίη νίνο был выполнен эксперимент на мышах, которым вводили антитело в соответствии со схемой, описанной в примере 13. При выполнении данного эксперимента мышам вводили очень высокую, смертельную дозу другого вируса гриппа, вызвавшего вспышку пандемии в 1918 г. и в настоящее время являющегося причиной сезонного заболевания людей, а именно Η1Ν1. Затем мышам вводили антитело по настоящему изобретению, представленное антителом СК6261, и в течение 3 недель после инфицирования контролировали клинические признаки, расстройство дыхания и массу тела. Было установлено, что указанные связывающие молекулы, которые позволяли спасти мышей, инфицированных вирусом Η5Ν1, были также способны спасти млекопитающих, инфицированных вирусом Η1Ν1, как описано ниже.

Исследование было выполнено для изучения терапевтического действия моноклональных антител, представленных антителом СК6261, в постинфекционной модели против летального инфицирования вирусом гриппа Η1Ν1 Ά/^δΝ/33 ίη νίνο. Серию вирусов, полученных из АТСС (νΚ-219), размножали один раз в яйцах с развивающимися эмбрионами. Титр был равен 8,5 1од ТСШ₅₀/мл. В качестве отрицательной контрольной группы одной группе мышей инъецировали неродственное моноклональное антитело (1§С1, λ, именуемое 'СК57', изотип, соответствующий отрицательному контрольному антителу). Клинические признаки, снижение массы тела и смертность контролировали в течение 21 дня после инфицирования.

самок мышей Ва1Ь/с в возрасте 6-8 недель распределяли в 5 групп, которым вводили антитело на разных стадиях инфицирования следующим образом:

1) 10 мышей; 15 мг/кг СК6261 за 1 день до инфицирования,

2) 10 мышей; 15 мг/кг СК6261 через 1 день после инфицирования,

- 34 017203

3) 10 мышей; 15 мг/кг СК6261 через 2 дня после инфицирования,

4) 10 мышей; 15 мг/кг СК6261 через 3 дня после инфицирования,

5) 10 мышей; 15 мг/кг отрицательного контрольного антитела СК57 через 1 день после инфицирования.

Всех животных акклиматизировали и содержали в течение по меньшей мере 4 дней до начала исследования. Животных инокулировали назально в 0-й день смертельной дозой вируса Η1Ν1 (6,6 1од Τί.ΊΌ₅₀; эквивалент 25-кратного количества ЬО₅₀) в количестве примерно 50 мкл и вели наблюдение. В определенные периоды времени до/после инокуляции мышам внутрибрюшинно вводили 500 мкл антитела. Общее состояние здоровья мышей контролировали на протяжении всего исследования. Клинические признаки и массу тела оценивали ежедневно, начиная с дня, предшествующего исследованию (-1-й день), и до 21-го дня. Клинические признаки оценивали по шкале оценок от 0 до 4, описанной в примерах 12 и 13. Выживших животных умерщвляли на 21 день и собирали у них кровь.

Уровень смертности, приведенный для каждой группы в табл. 19, показывает число живых мышей в каждой исследуемой группе на протяжении всего эксперимента. Две мыши умерли вскоре после инокуляции (в 1-й день, одна в группе 2 и одна в группе 3) и были исключены из анализа, что было заранее определено планом исследования. Все мыши в контрольной группе 5 умерли на 9-й день, так же как в предыдущем исследовании с использованием вируса гриппа Η5Ν1 (см. табл. 18). Число животных в процентном выражении, выживших после заражения смертельной дозой вируса гриппа Η1Ν1, представлено также в виде графика на фиг. 9. Число мышей с соответствующими клиническими признаками в каждой группе приведено в табл. 20. Клинические признаки не были обнаружены в группе 1, в то время как в группах 2, 3 и 4 у нескольких мышей появились клинические признаки, которые полностью исчезли через 14 дней после инокуляции. У всех животных в группе 5 клинические признаки начали появляться на 2-й день. Ни одна из мышей в указанной группе не выздоровела. Число мышей с расстройством дыхания категории 2 или 3 приведено в табл. 21. Клиническое расстройство дыхания не было обнаружено после 13-го дня в группах 1-4, в то время как все оставшиеся мыши в контрольной группе 5 страдали сильным расстройством дыхания.

На фиг. 10 показана средняя масса тела мышей в каждой исследуемой группе. Очевидно, что измерения мышей в группе 5 после 8-го дня не производились. Как показано на данной фигуре, все мыши, которым вводили антитело против Η5Ν1 и у которых исчезли клинические признаки, восстановили предполагаемую массу тела на 21-й день.

Антитела были способны защитить указанных мышей при введении до инфицирования или после инфицирования. Инфицирующая доза была достаточно высокой: 25-кратное количество дозы ΤΌ₅₀, что свидетельствует о способности антител обеспечивать очень сильную защиту против вируса, даже присутствующего в легких в высоких титрах. Такой результат имеет важное значение, так как высокопатогенные вирусы, подобные Η5Ν1, реплицируют с достижением высокого титра после инфицирования и подобные вирусные нагрузки часто приводят к серьезным последствиям для инфицированных людей. Кроме того, все защищенные мыши полностью выздоровели с течением времени после летального инфицирования. Можно сделать вывод о том, что антитела против Η5Ν1 по настоящему изобретению (такие как СК6261, СК6325 и СК6329), связывающиеся с (отдельными) эпитопами в области НА2, которая не подвержена дрейфу антигенов, обеспечивают перекрестную защиту ίη νίνο от нескольких серотипов вируса гриппа, что делает ненужным создание антител против подверженной сильной мутации области НА1. Следует отметить, что связывающие молекулы по настоящему изобретению, которые не ограничиваются эпитопами, присутствующими только в НА серотипа Н5 вируса гриппа, могут быть также использованы для профилактического или терапевтического лечения всех серотипов вируса гриппа, содержащих одинаковый эпитоп в устойчивой области НА2, таких как Η1Ν1, и вирусов гриппа, содержащих белки гемагглютинина Н2, Н6 и Н9.

Пример 15. Исследования сродства.

Исследования сродства были выполнены методом анализа резонанса поверхностного плазмона в аналитической системе ЫЛсоге3000 при 25 и 37°С с использованием ΗΒ8-ΕΡ (В1асоге АВ, 8тейеп) в качестве разделяющего буфера, подаваемого со скоростью потока 75 мкл/мин. Ι§6 иммобилизовали на четырехканальном (Рс) сенсорном чипе исследовательского сорта СМ5 (В1асоге АВ, 8^ейеп) при помощи аминной связи. Разные количества НА из вируса Η5Ν1 (А/Вьетнам/1203/2004) инъецировали для анализа взаимодействия связывания между белком НА и иммобилизованными Ι§6. В конце каждого измерения производили регенерацию 20 мМ Νη0Η для удаления связанного НА, оставляя иммобилизованный Ι§6 на чипе.

Константы сродства определяли для антител СК6261, СК6323 и СК6325. Инъецировали четырехкратные титры НА в пяти концентрациях (100 мкл на одну инъекцию) с последующей фазой диссоциации, равной 3600 с, и регенерацией 10 мкл 20 мМ Νη0Η. Полученные данные согласовывали при помощи модели 1:1 (Ьапдтшг). Однако нельзя было вычислить точную константу диссоциации (ΚΌ). Данная проблема была связана с чрезвычайно низкими скоростями диссоциации при 25°С (даже при длительном измерении), что вызывало неприемлемую ошибку при вычислении. При повторении экспериментов при 37°С происходила видимая диссоциации, но все же недостаточная для точного измерения ΚΌ. Экспери

- 35 017203 менты были выполнены с целью получения определенной ΚΏ для антител. Установлено, что указанные антитела находятся, по меньшей мере, в однозначном нМ диапазоне и, наиболее вероятно, в пМ диапазоне сродства. Указанные эксперименты показывают, что связывающие молекулы по настоящему изобретению обладают очень высоким сродством к своему эпитопу, присутствующему в белке НА вируса гриппа.

Ниже приведены последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, определяемые в настоящем описании изобретения как 8Ер П) N0: 58-143, 8Е(.Э П) N0: 212-237 и 8Ер П) N0: 316-367.

ΞΕΟ ΙΡ N0:58 даддЬдсадс ЬсЕЬдсаадд ссЕддасаад дсассдаадЕ абддадсбда дддбассадд адбдсЬадса ддсддсасад адсЬддааса адсддссбдС ассбасаСсб сссаададсе ддасссЬссд сссдаддбда ЬддСасдЬдд

СддЬддадСс сЪБсбддадд ддссЪдадЪд Ьссадддсад дсадссбдсд Ъдсдсдааас ссаадддссс ссдсссСддд дсддсдссЬЬ асадссСдад дсаасдбдаа дсдасаадас ЬдЬСссбдСб ссСдсдСддб асддсдСдда йддддсъдад ссссССссдс даЬдддаддд адЬсасдабЪ абсЬдаддас СаСддасдбс садсдбдБЪс седссбддбд дассадсддс садсдбддбд ссасаадссс ссасассЬдс сссссссаад ддСддасдбд ддбдсасаас аасадсассй ассдддГддй дадсдрдсрс ааддадЬаса адРдсааддЬ дадсаасаад адсааддсса дадаРдасса аРсдссдЬдд дйдсРддаса Ьддсадсадд асссадаада адддссадсс адаассаддй адрдддадад дсдасддсад дсаасдЪдЫ: дссРдадссЬ ссдддадссс дЪсссЪсасс саасддссад сГЬсРЬссРд садсбдсадс дадссссддс дЪдаадаадс адсСабдсЪа аЬсаЪсссЪа ассдсддасд асддссабдб ^ддддсааад ссссЬддссс ааддасЬасЪ дЬдсасассб ассдСдссса адсаасасса ссссссйдсс сссааддаса адссасдадд дссаадасса ассдйдсЬдс дсссЬдссЬд саддрдраса ЬдРсРддйда сссдадааса Расадсаадс дрдардсасд аад сЬдддЬссбс Ссадс^дддЬ йЪБЪЪддЦас аЬЪЪсдсддд асбасСдбдс ддассасддЬ ссадсадсаа Ьссссдадсс СссссдссдЪ дсадсадссб адд^ддасаа сЪдсссссда сссЪсаСдаБ ассссдаддб адссссддда ассаддасйд сссссаРсда сссйдссссс адддсЫюЪа асйасаадас ЬсассдЪдда аддсссйдса ддЬдааадйс дсдасаддсс аасааааБас сасадЬЬЬас дааасабаЬд сассдЬсбсд дадсассадс сдЬдассдбд дсЬдсададс дддсасссад асдсдЬддад дсЬдсбдддс садссддасс даадйЬсаас ддадсадСас дсБдаасддс даадассаЪс садссдддад ссссадсдас сасссссссЬ саададссдд саассасРас

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1353

3ΕΩ ΙΡ N0:59

Е

V

0

ь

V

Е

8

О

А

Е

V

к

К

Р

6

8

V

К

V

8

С

к

А

8

С

Р

Е

К

3

Υ

А

I

3

и

V

к

0

А

Р

с

Ω

6

Р

Е

И

О

с

I

Р

I

Е

е

т

Т

К

Υ

А

Р

К

Е

Ω

О

К

V

Т

I

Т

А

Р

Ό

Е

А

с

Т

V

Υ

м

Е

Ь

8

ь

к

8

Е

Р

т

А

М

Υ

С

А

к

Н

М

Θ

Υ

Ω

V

К

Е

Т

м

Р

V

и

О

К

С

Т

V

т

V

8

А

8

т

к

О

Р

8

V

Г

Р

ь

А

Р

8

К

8

Т

8

6

с

Т

А

ь

6

С

ь

V

К

Р

Υ

Г

Р

Е

Р

V

Т

V

8

N

3

С

А

ь

Т

3

с

V

н

Т

Е

Р

А

V

Ь

Ω

3

С

Ь

Υ

8

ь

3

8

V

т

V

Р

8

3

Ъ

О

Т

Ω

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

Т

К

V

Р

К

к

V

Е

Р

к

8

с

Р

К

Т

н

т

С

Р

С

Р

А

Р

Е

ь

Ь

б

О

Р

8

V

Г

ь

Е

Р

К

Р

К

υ

т

ь

м

I

8

К

т

Р

Е

V

Т

С

V,

V

Ό

V

8

н

Е

Р

Е

V

К

г

N

Υ

V

Р

Θ

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

К

Е

Ώ

Υ

N

8

т

Υ

к

V

8

V

ь

Т

V

Ь

Н

Ω

Р

и

Ь

N

6

К

Е

Υ

к

С

к

V

8

N

к

А

ь

Р

А

Р

I

Е

к

Т

I

3

к

А

к

О

Ω

Р

к

Е

Р

Ω

V

Υ

т

ь

Р

8

К

Е

м

Т

к

N

Ω

V

3

Ь

т

с

Ь

V

К

О

Е

Υ

Р

3

Ώ

I

А

V

Е

и

Е

3

N

О

Ω

Р

Е

N

Υ

К

Т

Р

V

ь

Р

3

Р

с

8

Е

Ь

Υ

3

К

ь

т

V

Р

К

8

К.

и

0

Ω

6

N

V

Г

3

с

8

V

М

Н

Е

А

Ь

Н

N

Н

Υ

т

Ω

К

8

Ь

8

Ь

8

Р

с

К

8ΕΩ ΙΡ N0:60 саддбссадс ЕддЕдсадбс ЬддддсЬдад дрдаадаадс с'ЬдддЬ.сс'Ьс дд'ЬдааадЪс ЬсЫдсаадд сЬГсРддадд ссссЬЬссдс адсРаГдсЪа РсадсЪдддЬ дсдасаддсс ссЪддасаад ддссЬдадЬд даРдддаддд аЬсаРсссЬа 'Ь'ЬЬ'Ь'ЬддЬас аасаааайас дсассдаадЪ Ессадддсад адЬсасдаП ассдсддасд а'ЬЕ’Ьсдсддд сасадЬ+'Ьас аРддадсЬда дсадссЬдсд аЬсРдаддас асддссаЬд! асЪасЪдЬдс дааасаЬаРд дддрассадд Ьдсдсдааас ЪаЬддасдЬс Еддддсааад ддассасддЪ сассдЬсЬсд адРдсРадса ссаадддссс садсдЪдЫс ссссЬддссс ссадсадсаа дадсассадс ддсддсасад ссдсссРддд сРдссРддйд ааддасйасЬ Ессссдадсс сдрдассдрд адсбддааса дсддсдссГГ дассадсддс дРдсасассЪ ЬссссдссдЬ дсбдсададс адсддссйдр асадссРдад садсдрддрд ассдрдссса дсадсадссЪ дддсасссад ассЪасаЬсб дсаасдйдаа ссасаадссс адсаасасса аддЬддасаа асдсдЬддад сссаададсЬ дсдасаадас ссасассРдс ссссссбдсс сРдсссссда дсРдсРдддс ддасссйссд ЕдЕЕссЕдЕЕ сссссссаад сссааддаса сссЕсаЕдаЕ садссддасс сссдаддЪда ссЕдсдЕддЕ ддЪддасдЕд адссасдадд ассссдаддЕ даадЪЬсаас ЕддЕасдЕдд асддсдЬдда ддрдсасаас дссаадасса адссссддда ддадсадЕас аасадсассЕ ассдддЪддЕ дадсдЕдсЕс ассдЕдсЕдс ассаддасЕд дсЕдаасддс ааддадЕаса адЬдсааддб дадсаасаад дсссЬдссЪд сссссаЬсда даадассаЕс адсааддсса адддссадсс ссдддадссс саддЕдЕаса сссЕдссссс садссдддад дадаЕдасса адаассаддЕ дЕсссЕсасс ЕдГсЕддЕда адддсЕЪсЕа ссссадсдас аРсдссдЬдд адрдддадад саасддссад сссдадааса асЕасаадас сасссссссЕ дЕдсЕддаса дсдасддсад сЕЕсЕЕссЕд Еасадсаадс Ъсассдйдда саададссдд Ьддсадсадд дсаасдЕдЕЕ садсЕдсадс дЕдаЕдсасд аддсссЕдса саассасЕас асссадаада дссЕдадссЕ дадссссддс аад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1353

3ΕΩ ΙΡ N0:61

Ω

V

Ω

ь

V

Ω

8

С

А

Е

V

к

Р

Θ

8

V

к

V

8

С

К

А

8

С

с

Р

Г

к

3

Υ

А

I

3

И

V

к

Ω

А

Р

о

Ω

Θ

Р

Е

И

М

О

с

I

Р

I

Е

О

т

К

Υ

А

Р

К

Е

Ω

с

к

V

т

I

Т

А

Ό

ϋ

Е

А

с

Т

V

Υ

м

Е

Ь

3

Ь

к

8

Е

Р

Т

А

М

Υ

с

А

к

Н

м

Θ

Υ

Ω

V

к

Е

т

М

Р

V

И

О

К

С

т

Т

V

т

V

8

А

8

Т

К

С

Р

8

V

Е

Р

Ь

А

Р

8

К

3

Т

8

С

с

т

А

Ь

С

Ь

V

К

Р

Υ

Г

Р

Е

Р

V

Т

V

8

И

N

3

С

А

Ь

Т

8

С

V

н

Т

Г

Р

А

V

Ь

Ω

3

с

Ь

Υ

8

ь

3

V

т

V

Р

3

8

ь

С

Т

Ω

Т

Υ

I

С

N

V

N

Н

К

Р

8

N

Т

К

V

Р

к

к.

V

Е

Р

к

8

с

Р

к

Н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

О

0

Р

3

V

Е

ь

Г

Р

К

Р

к

Р

т

ь

м

I

8

К

т

Р

Е

V

т

с

V

Р

V

8

Н

Е

Р

Е

V

к

г

N

И

Υ

V

Р

С

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

К.

Е

Ώ

Υ

N

8

т

Υ

- 36 017203

ε

V

0 б

V Е

3 С А

Ε V

к к

Р

(3 3

3

V К V 3

с

к

А 3

6

8 Р

РЕЗУ

А I

3 И V Е

Ω

А

Р

С

0

<3

Р

Е

И

м

С

<3

I

Р

I

Р

3

Т

К

У

А

Р

К

Р

<2

8

К

V

Т

I

Т

А

Б

р

А

0

Τ

V

У

м

Е

ь

3

Б

к

3

Е

В

т

А

м

Υ

С

А

к

н

м

<3

У

0

V

Е

Т

м

Б

V

И

8

к

С

τ

Τ

V

т

V

5

3

А

3

Т

к

(3

Р

3

V

Р

Б

А

Р

3

к

3

т

3

8

3

Т

А

Б

8

С

Б

V

к

Б

Υ

Ε

Р

Е

Р

V

т

V

8

И

N

3

<3

А

Б

Т

3

С

V

н

т

Р

А

V

Б

0

5

3

С

Б

У

3

Б

5

3

V

τ

V

Р

5

Б

б

С

Т

0

Т

У

I

С

N

V

N

н

К

Р

Б

N

т

К

V

Б

к

К

V

Е

Р

К

8

С

В

К

т

Н

τ

С

Р

С

Р

А

Р

Е

Б

о

<3

Р

3

V

Р

Б

Р

К

Р

к

в

Т

Б

И

I

3

Е

т

Р

Е

V

Т

с

V

в

V

3

н

Е

В

Р

Е

V

к

Р

N

Υ

V

Б

С

V

Е

V

н

N

А

К

Т

к

Р

Е

0

Υ

N

3

т

У

к

V

3

V

ь

Т

V

Б

Н

Ω

Ώ

N

Б

N

(3

к

Е

Υ

к

С

К

V

3

N

К

А

Б

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

К

Α

к

с

0

Р

е

Е

Р

0

V

Υ

т

ь

Р

3

к

Е

м

т

к

N

Ω

V

3

Б

т

с

Б

V

к

8

Р

Υ

Р

5

Б

I

А

V

Е

к

Е

3

N

С

0

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

Б

8

Б

с

3

г

Р

Б

У

5

К

ь

т

V

В

К

3

К

и

Ω

0

8

N

V

Р

3

с

3

V

М

н

Е

А

Б

Н

N

н

Υ

т

Ω

К

3

Б

3

Б

3

Р

8

К

3Ε0

ΙΒ N0:

64

Е

V

0 ь

V

Е

3 8 А Е

УККРСЗЗУКУЗСКА36С;РРЕЗУА13ИУЕ

0

А

Р

8

0

с

Р

Е

И

м

8

с

I

Р

I

Р

8

Т

К

Υ

А

Р

к

Р

0

8

Е

V

Т

I

Т

А

В

в

Р

А

8

Т

V

У

м

Е

Б

3

Б

к

3

Е

в

т

А

м

У

Υ

С

А

к

Н

м

с

У

0

V

Е

Т

м

В

V

И

с

к

8

Т

V

Т

V

5

3

А

3

Т

к

8

Р

5

V

Р

Б

А

Р

3

К

3

т

3

с;

6

Т

А

Б

8

С

Б

V

к

в

У

Р

Е

Р

V

Т

V

Б

N

3

С

А

Б

т

3

8

V

н

т

Р

А

V

Б

0

3

Б

8

Б

У

5

Б

5

3

V

т

V

Р

3

Б

8

Т

0

Т

У

I

С

N

V

N

Н

К

Р

3

N

Т

К

V

В

к

Е

V

Е

Р

К

3

С

В

к

т

и

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

Б

8

с

Р

5

V

Р

Ь

Р

К

Р

К

в

Т

Б

М

I

3

Е

т

Р

Е

V

т

с

V

в

V

3

н

Е

В

Р

Е

V

К

Р

N

И

У

V

В

8

V

Е

V

н

N

А

К

т

К

Р

Е

0

Υ

N

3

т

Υ

Е

V

3

V

Б

Т

V

Б

Н

0

В

и

Б

N

8

К

Е

У

к

С

К

V

3

N

К.

А

Б

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

к

А

к

8

0

Р

Е

Р

0

V

у

Т

Б

Р

3

Е

м

т

к

N

0

V

Б

Т

с

Б

V

К

8

Е

У

₽

3

в

I

А

V

Е

и

Е

3

N

8

0

Р

Е

N

У

К

Т

Р

V

Б

В

3

В

С

3

Р

Б

Υ

3

К

Б

т

V

в

к

3

Е

И

0

8

N

V

Р

3

с

3

V

М

Н

Е

А

Б

Н

N

н

Υ

т

<2

К

Б

3

Б

3

Р

8

К

8Е0

ΙΒ N0:

:66

- 37 017203

дадаасаасг аидсасдадд

0

V

О

В

V

0

5

С

А

Е

V

к

Р

3

V

К

V

3

С

К

А

3

с

(3

т

Р

5

3

Υ

А

I

3

V?

V

к

0

А

Р

С

0

<3

Ь

Е

И

м

с

3

I

м

3

м

Р

в

т

Т

N

Υ

А

0

к

р

0

3

е

V

т

I

Т

А

в

Е

Р

т

3

А

Υ

м

Е

Ь

К

3

ь

к

3

Е

в

т

А

V

Υ

С

А

к

3

Υ

Р

Е

Υ

г

0

В

И

8

0

3

т

ь

V

Т

V

3

А

3

Т

к

3

Р

3

V

г

Р

в

А

Р

5

3

к

3

т

3

<3

т

А

в

8

С

В

V

к

в

Υ

г

Р

Е

Р

V

т

V

3

И

N

3

А

ь

т

3

8

V

н

Т

Р

А

V

в

0

3

8

3

В

Υ

3

в

3

V

т

V

Р

3

ь

8

т

0

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

к

Р

5

N

т

К

V

η

к

V

Е

Р

к

3

с

В

К

т

н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

Ь

ь

3

Р

3

V

Р

ь

Р

К

Р

К

в

т

ь

и

I

3

К

т

Р

Е

V

Т

с

V

В

V

3

н

Е

ϋ

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

в

3

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

к

Е

0

Υ

N

3

т

Υ

к

V

3

V

ь

т

V

Ь

н

0

ϋ

VI

Ь

N

3

к

Е

Υ

к

С

К

V

3

N

к

А

в

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

к

А

к

с

О

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

в

Р

3

к

Е

м

т

К

N

0

V

3

в

т

с

В

V

к

8

Р

Υ

Р

3

в

I

А

V

Е

и

Е

3

N

с

0

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

Ь

В

3

В

с

3

1?

Р

В

Υ

5

К

ь

т

V

в

к

3

К

к

Ώ

0

з

к

V

Р

3

с

3

V

М

н

Е

А

В

Н

N

н

Υ

Т

0

К

3

в

3

в

3

Р

С

К

ЗЕО

Ш N0:

: 70

0

V

0

В

V

0

3

8

Ь

V

к

Р

3

8

3

В

Е

в

3

С

А

3

Р

т

Р

3

Υ

3

м

N

и

V

Е

0

А

Р

8

К

3

Ь

Е

И

V

3

5

I

3

5

3

5

Υ

I

Υ

V

β

3

V

К

8

Е

Р

т

I

3

Е

В

N

А

К

N

3

В

Υ

В

0

м

N

3

В

Е

А

Е

в

т

А

V

Υ

с

А

Е

3

Υ

3

А

Υ

Е

3

Р

В

Υ

И

8

0

О

т

ь

V

т

V

3

А

3

т

К

8

Р

3

V

Р

ь

А

Р

3

К

5

т

5

8

т

А

ь

С

В

V

К

β

Υ

Р

Е

Р

V

Т

V

3

и

N

3

8

А

В

т

3

V

Н

т

Р

А

V

ь

0

3

С

В

Υ

3

В

3

V

т

V

Р

3

В

3

т

0

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

Т

К

V

β

К

V

Е

Р

к

3

с

В

К

т

н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

в

В

3

Р

3

V

Р

в

Р

К

Р

К

в

т

В

м

I

8

Е

т

Р

Е

V

т

с

V

β

V

5

н

Е

β

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

β

8

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

Е

0

Υ

N

8

т

Υ

к

V

3

V

ь

Т

V

Ь

Н

0

в

и

В

N

8

к

Е

Υ

к

С

К

V

3

N

к

А

ь

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

к

А

к

8

0

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

в

Р

5

Е

м

Т

к

N

0

V

3

В

т

с

В

V

К

8

Р

Υ

Р

3

β

I

А

V

Е

И

Е

3

N

8

0

Р

Е

N

Υ

К

Т

Р

V

в

β

3

β

8

3

Р

ь

Υ

3

К

В

т

V

в

к

5

Е

И

0

3

N

V

Р

3

с

3

V

М

н

Е

А

ь

Н

N

^н

Υ

Т

0

К

3

в

5

в

3

Р

3

К

ЗЕф

ΙΒ N0

: 72

- 38 017203

Ε

V

0 ь

V

Е

3 <3 А Е

νΚΚΡΟ33νΚν33ΚΑ3Ο<3ΡΡΚ3ΥΑΙ3ΚνΚ

0

А

Р

С

0

С

Р

Е

Μ-

м

о

с

I

Р

I

Р

(3

т

К

Υ

А

Р

К

Р

<2

с

в

V

Т

I

т

А

Р

Е

А

С

Τ

V

Υ

м

Е

Ъ

3

ε

ь

к

3

Е

ϋ

т

А

м

Υ

с

А

к

н

м

С

Υ

<2

V

к

Е

Т

м

Р

V

И

С

К

С

τ

Τ

V

т

V

3

8

А

3

т

к

с

Р

3

V

Р

ь

А

Р

3

к

3

т

3

(3

с

т

А

ь

с

С

ь

V

К

Р

Υ

Ρ

Р

Е

Р

V

Т

V

3

и

N

8

(3

А

ь

Т

3

с

V

н

Т

Р

А

V

ь

0

8

(3

Ь

Υ

3

ь

3

V

τ

V

Р

3

8

3

Ь

3

т

0

т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

т

К

V

р

к

В

V

Е

Р

к

3

с

Ό

к

т

н

τ

С

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

с

3

Р

3

V

Р

ь

Р

К

Р

К

р

т

ь

м

I

3

к

т

Р

Е

V

т

с

V

о

V

8

н

Е

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

η

а

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

В

Е

0

Υ

N

8

т

Υ

к

V

3

V

ь

Т

V

Ь

Н

0

о

И

Ь

N

<3

К

Е

Υ

к

С

К

V

8

N

к

А

ь

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

к

Α

к

с

0

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

ь

Р

3

В

Е

м

Т

К

N

0

V

3

Ь

т

с

Ь

V

к

Θ

Р

Υ

Р

3

Р

I

А

V

Е

и

Е

3

N

с

0

р

Е

N

Υ

к

Т

Р

V

Ь

υ

8

Ώ

с

3

Р

ь

Υ

8

К

Ь

Т

V

Р

к

3

К

и

0

<3

N

V

Р

3

с

8

V

М

н

Е

А

ь

Н

N

н

Υ

т

0

К

8

ь

3

ь

8

Р

<3

К

8ΕΩ

ΙΡ ΝΟ:

: 74

Е

V

0 ь

V

Е

3 Θ А Е

УККРЗЗЗУКУЗСКАЗЗЗРРКЗУА18ИУН

0

А

Р

С

0

С

Р

Ξ

И

м

Θ

а

I

Р

I

Р

6

т

к

Υ

А

Р

к

р

ΰ

С

к

V

т

I

т

А

Ώ

Р

А

(3

Т

V

Υ

м

Е

Ь

3

ь

В

3

Е

Р

т

А

м

Υ

с

А

к

н

м

с

Υ

<2

V

в

Е

т

м

Р

V

И

с

к

<3

Т

V

т

V

8

3

А

3

т

К

(3

Р

3

V

Р

А

Р

3

к

3

т

3

(3

О

т

А

ь

6

С

ь

V

к

Р

Υ

Р

Ξ

Р

V

т

V

3

и

N

3

6

А

ь

Т

3

с

V

н

т

Р

А

V

ь

О

3

8

С

ь

Υ

3

ь

3

5

V

т

V

Р

3

ь

<3

т

δ

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

т

К

V

Ό

к

В

V

Е

Р

к

3

с

Р

К

т

н

т

С

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

<3

3

Р

5

V

Р

ь

Р

К

Р

К

Р

Т

ъ

М

I

5

к

т

Р

Е

V

Т

с

V

Ώ

V

3

н

Е

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

Р

с

V

Е

V

н

КГ

А

К

т

К

Р

К

Е

О

Υ

N

3

т

Υ

к

V

3

V

ь

Т

V

ь

н

0

Р

N

Ь

N

3

к

Е

Υ

к

С

к

V

8

N

К

А

Ь

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

8

к

А

к

<3

0

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

Ь

Р

3

в

Е

м

Т

к

N

О

V

8

Ь

т

с

Ь

V

К

С

Р

Υ

Р

3

Р

I

А

V

Е

и

Е

3

N

с

ΰ

Р

Е

N

Υ

К

т

Т

Р

V

ъ

Р

3

υ

с;

8

Р

ь

Υ

3

к

ь

Т

V

Р

к

3

В

И

0

С

N

V

Р

3

с

3

V

М

н

Е

А

ь

н

N

н

Υ

Т

о

к

8

Ь

3

ь

3

Р

(3

к

5Е<2

ΙΡ ΝΟ:

:76

Е

V

о ь

V Е

3 С А

Ε V

ККРСЗЗУКУЗСКАЗСбТРВЗУВ!

Б И V В

О

А

Р

3

0

<3

Ь

Е

и

м

а

Р

I

е

м

Р

3

Т

N

Υ

А

Ω

N

к

0

с

к

Ь

Т

I

т

А

Р

Е

3

т

8

т

А

Υ

м

Е

ь

3

ь

к

5

Е

Р

т

А

V

Υ

С

А

к

3

8

3

Υ

Р

А

Υ

ъ

Р

н

И

3

О

3

т

Ь

V

Т

V

3

А

3

т

к

<3

Р

3

V

Р

ь

А

Р

3

к

3

Т

3

с

3

т

А

ь

3

с

ь

V

к

Р

Υ

Р

Е

Р

V

т

V

3

и

N

3

(3

А

ь

т

5

3

V

Н

т

Р

А

V

ь

0

3

8

Ь

Υ

3

ъ

3

V

т

V

Р

3

5

3

ь

С

Т

о

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

т

К

V

Р

к

V

Е

Р

к

3

с

Р

к

т

н

т

с

Р

С

₽

А

Р

Е

ъ

Р

с

Р

3

V

Р

ь

Р

К

Р

к

Р

т

ь

м

I

3

в

т

Р

Е

V

т

с

V

Р

V

3

н

Е

Ό

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

Р

3

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

К

Е

О

Υ

N

3

т

Υ

к

V

3

V

ь

Т

V

Ь

Н

О

Ό

и

Ь

N

а

К

Е

Υ

к

С

К

V

5

N

к

А

ь

Р

А

Р

I

Е

к

Т

I

3

к

А

к

3

О

Р

в

Е

Р

Ω

V

Υ

т

ь

Р

3

В

Е

м

т

К

N

Ω

V

3

ь

т

с

Ь

V

к

3

Р

Υ

Р

Ξ

Р

I

А

V

Е

и

Е

3

N

С

О

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

ь

Р

3

Ό

О

8

Р

Ь

Υ

3

к

ь

Т

V

Р

к

3

В

и

О

с

N

V

Р

3

с

3

V

М

н

Е

А

ь

Н

N

н

Υ

т

о

К

3

ь

3

ь

5

Р

3

к

ЗЕО

ΙΡ ΝΟ:

:78

- 39 017203

Вддсадсадд дсаасдЪдВВ садсЬдсадс дЪдаЬдсасд аддсссбдса саассасЬас 1320 асссадаада дссЪдадссВ дадссссддс аад 1353

5Е0 ΙΡ N0:79

Е

V

О

ь

V

Е

3

0

А

Е

V

К

Р

О

3

V

К

V

3

с

к

А

3

с

<3

т

Р

3

г

Υ

3

м

3

и

V

к

0

А

Р

с

0

ь

Е

И

М

0

I

Р

м

к

О

т

N

Υ

А

0

к

г

<2

с

к

V

т

I

т

А

V

Е

5

т

3

Т

А

Υ

м

Е

V

3

ь

к

3

Е

Р

т

А

V

Υ

с

А

к

О

Р

к

о

I

Υ

м

Р

V

и

О

К

о

т

V

т

V

3

А

3

т

к

0

Р

3

V

Р

Ь

А

Р

3

К

3

т

3

с

о

т

А

ь

с

С

ь

V

К

Р

Υ

Р

Е

Р

V

т

V

3

и

N

3

С

А

ь

т

3

С

V

н

т

Р

А

V

ъ

<2

3

<3

Ь

Υ

3

ь

3

V

т

V

Р

3

ь

С

т

0

т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

5

N

т

К

V

Р

к

V

Е

Р

к

3

с

Р

к

т

н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

0

С

Р

3

V

Р

ь

Р

К

Р

К

Р

т

ь

м

I

3

к

т

Р

Е

V

т

с

V

Р

V

3

н

Е

Р

Е

V

к

Р

N

и

Υ

V

Ό

с

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

к

Е

0

Υ

N

8

т

Υ

к

V

5

V

ь

Т

V

Ь

Н

0

Р

N

Ь

N

с

к

Е

Υ

к

С

К

V

3

N

к

А

ь

Р

А

Р

I

Е

к

т

I

Б

к

А

к

с

0

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

ь

Р

3

к

Е

м

т

к

N

0

V

3

ъ

т

с

ь

V

к

о

г

Υ

Р

3

Р

I

А

V

Е

и

Е

5

N

с

0

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

ь

Р

3

Р

с

3

Р

ь

Υ

3

к

ь

т

V

Р

к

3

К

и

0

С

N

V

Р

3

С

5

V

М

н

Е

А

Ь

н

N

н

Υ

Т

0

к

3

ъ

5

ь

3

Р

о

к

ЗЕО

ΙΡ N0:

: 8(

)

даддЪдсадс ЪддВддад-Сс ЬддддсЪдад дЬдаадаадс сЪдддЪссгс ддВдааддбс 60 ЪссЬдсаадд сЬ'Ьс'Ьддадд сассВВсадс адсЬаЬдсЬа ВсадсЬдддЬ дсдасаддсс 120 ссЪддасаад ддсЪЪдадВд даВдддаддд аЬсаЬсддВа ЪдЪВсддЪас адсааасЪас 180 дсасадаадб бссадддсад адбсасдаЪЪ ассдсддасд ааВСВасдад сасадссЪас 240 аЬддадсЬда дсадссЬдад аСсбдаддас асддссдЬде аВЪасВдВдс дададдаааВ 300 ЬаВЪасЪаВд ададВадВсЬ сдасВасЬдд ддссадддаа сссбддЬсас сдбсВсдадВ 360 дсбадсасса адддссссад сдЪдбЬсссс сЬддссссса дсадсаадад сассадсддс 420 ддсасадссд сссбдддсЪд ссЪддЬдаад дасЬасЪЬсс ссдадсссдЪ дассдбдадс 480 Ъддаасадсд дсдссВВдас садсддсдВд сасассЪВсс ссдссдЬдсЕ дсададсадс 540 ддссВдВаса дссЪдадсад сдВддбдасс дрдсссадса дсадссЬддд сасссадасс 600 ВасаВсВдса асдбдаасса саадсссадс аасассаадд Вддасааасд сдЪддадссс 660 аададсЪдсд асаадассса сассЬдсссс сссВдсссВд сссссдадсВ дсВдддсдда 720 сссВссдВдб ВссВдВЪссс ссссаадссс ааддасассс Ьсабдабсад ссддассссс 780 даддВдассВ дсдВддЪддЬ ддасдЬдадс сасдаддасс ссдаддВдаа дЪВсаасЕдд 840 ЕасдЕддасд дсдЕддаддЕ дсасаасдсс аадассаадс сссдддадда дсадСасаас 900 адсассВасс дддВддбдад сдЬдсбсасс дбдсЪдсасс аддасЪддсЪ даасддсаад 960 дадбасаадВ дсааддЬдад саасааддсс сЪдссВдссс ссабсдадаа дассабсадс 1020 ааддссаадд дссадссссд ддадссссад дЬдЬасассс Ьдссссссад ссдддаддад 1080 аЪдассаада ассаддбдВс ссВсассЪдб сВддВдаадд дсЬЪсЬассс садсдасаЪс 1140 дссдЬддадЬ дддададсаа сддссадссс дадаасаасЪ асаадассас ссссссВдВд 1200 сЬддасадсд асддсадсВВ сВВссВдЪас адсаадсбса ссдбддасаа дадссддЬдд 1260 садсадддса асдЬдЪЬсад сПдсадсдЪд аЬдсасдадд сссЕдсасаа ссасВасасс 1320 садаададсс ВдадссВдад ссссддсаад 1350

5Е0 ΙΡ N0:81

Е

V

0

ь

V

Е

3

<3

А

Е

V

к

Р

0

Б

3

V

к

V

3

с

к

А

3

о

О

Т

г

3

Б

Υ

А

I

Б

и

V

к

0

А

Р

с

0

е

ь

Е

и

М

6

<3

I

<3

М

Р

с

т

А

Ν-

Υ

А

О

к

Р

□

С

к

V

т

I

Т

А

В

Е

Р

т

3

Т

А

Υ

м

Е

ъ

3

5

Ь

к

3

Е

Ό

т

А

V

Υ

С

Α

к

а

N

Υ

Е

3

ь

Р

Υ

И

С

о

с

т

ь

V

т

V

3

А

3

Т

К

о

Р

3

V

Р

ь

А

Р

3

к

Б

т

3

6

с

Т

А

ь

б

С

ь

V

к

Р

Υ

Р

Е

Р

V

т

V

3

И

N

Б

с

А

Ь

т

Б

Θ

V

н

т

Р

А

V

ь

0

3

о

ь

Υ

3

ь

3

Б

V

т

V

Р

3

ь

Θ

Т

Ω

Т

Υ

I

С

N

V

N

Н

К

Р

3

N

т

К

V

Р

к

V

Е

Р

к

3

с

Ώ

К

т

н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

С

о

Р

3

V

Г

Ь

Р

К

Р

К

Р

т

ь

м

I

3

к

т

Р

Е

V

т

с

V

Р

V

3

н

Е

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

Р

б

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

К

Е

0

Υ

N

3

т

Υ

Е

V

3

V

ь

т

V

Ь

Н

О

Р

и

Ь

N

<3

к

Е

Υ

к

С

к

V

3

N

к

А

:ь

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

Б

к

А

к

с

0

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

ь

Р

3

к

Е

м

т

к

N

0

V

5

ь

т

с

ь

V

к

о

Р

Υ

Р

3

Р

I

А

V

Е

и

Е

3

N

с

Ώ

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

ь

Ό

3

Р

е

3

Р

ь

Υ

3

к

ь

т

V

Р

к

3

к

и

0

о

N

V

Е

Б

с

3

V

М

Н

Е

А

Ь

н

N

н

Υ

т

0

К

3

ь

5

ь

5

Р

с

к

5Е0

ΙΡ ΝΟ

: 82

саддВдсадс Вдд±дсад1:с ЬддддсЬдад дЬдаадаадс сЪддд£сс±с ддЬдададЬс 60 ЪссВдсаадд сВЪсВддаад саЬсРРсада аасЬабдсВа ЬдадсЬдддЪ дсдасаддсс 120 ссСддасаад ддсВВдадЬд дабдддаддд аЬсаВсдсЬа ЬВВВбдддас ассааадЬас 180 дсасадаадВ Вссадддсад адбсасдаЪЪ ассдсддасд ааЪсдасдад сасВдВсВас 240 аЬддаасбда дсддасВдад аЪсбдаддас асддссаЪдб аЬЬасЬдЪдс даддаЪСссс 300 сасВаВааВГ: ъъддЬВсддд дадВЬаВВЪс дасЬасВддд дссадддаас ссЕддЪсасс 360 дВсВсдадВд сВадсассаа дддссссадс дВдЕЪссссс Еддсссссад садсаададс 420 ассадсддсд дсасадссдс ссВдддсВдс сЬддВдаадд асВасВЬссс сдадсссдЬд 480 ассдвдадсВ ддаасадсдд сдссВВдасс адсддсдЬдс асассВЪссс сдссдЪдсЪд 540 сададсадсд дссВдВасад ссЬдадсадс дВддВдассд Вдсссадсад садссЪдддс 600 асссадассВ асаВсВдсаа сдЬдаассас аадсссадса асассааддЪ ддасааасдс 660 дЪддадссса ададсЬдсда саадасссас ассЕдссссс ссЬдсссЪдс ссссдадсВд 720 сЪдддсддас ссЕссдЪдбЬ ссЬдЪВсссс сссаадссса аддасасссЪ саЬдаЬсадс 780 сддасссссд аддЪдассВд сдВддЕддЪд дасдВдадсс асдаддассс сдаддЪдаад 840 ЬВсаасВддЪ асдВддасдд сдВддаддЪд сасаасдсса адассаадсс ссдддаддад 900 садВасааса дсассВассд ддВддВдадс дВдсВсассд ВдсВдсасса ддасВддсВд 960 аасддсаадд адВасаадВд сааддВдадс аасааддссс ВдссВдсссс саВсдадаад 1020 ассаВсадса аддссааддд ссадссссдд дадссссадд ВдВасасссВ дссссссадс 1080 сдддаддада Вдассаадаа ссаддВдВсс сВсассВдВс ВддВдааддд сВВсВасссс 1140 адсдасаВсд ссдВддадВд ддададсаас ддссадсссд адаасаасВа саадассасс 1200 сссссВдВдс Вддасадсда сддсадсВВс ВВссВдВаса дсаадсВсас сдВддасаад 1260 адссддВддс адсадддсаа сдВдВВсадс ВдсадсдВда Вдсасдаддс ссВдсасаас 1320 сасВасассс адаададссВ дадссВдадс сссддсаад 1359

ЗЕО ΙΡ N0:83

0

V

о

Ь

V

0

3

о

А

Е

V

к

Р

с

3

V

К

V

Б

с

к

А

3

б

3

I

Р

к

N

Ύ

А

м

3

И

V

к

0

А

Р

С

0

с

Ь

Е

И

М

б

6

I

А

I

Р

6

т

Р

К

Υ

А

0

к

Р

о

с

к

V

Т

I

Т

А

В

Е

3

т

3

т

V

Υ

м

Е

ь

5

С

ь

К

3

Е

Р

т

А

м

Υ

С

А

к

I

Р

н

Υ

N

Р

б

3

О

3

Υ

Г

Ό

Υ

и

б

о

О

т

ъ

V

т

V

5

3

А

Б

т

К

с

Р

3

V

Р

ь

А

Р

3

к

3

т

3

О

Т

А

ь

б

С

в

V

к

Р

Υ

Р

Е

Р

V

Т

V

Б

и

N

3

С

А

ь

т

Б

О

V

н

т

Р

А

V

ь

0

Б

8

С

Ь

Υ

3

ь

5

3

V

т

V

Р

3

Б

3

ь

О

Т

0

т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

т

К

V

в

к

К

V

Е

Р

к

3

с

В

к

т

н

т

с

Р

С

Р

А

Р

Е

ь

о

б

Р

3

V

Р

ь

Р

К

Р

К

в

т

ь

м

I

3

К

т

Р

Е

V

т

с

V

Р

V

3

н

Е

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

Р

с

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

К

Е

0

Υ

N

3

т

Υ

к

V

3

V

ь

Т

V

ь

н

с

Р

и

Ь

N

О

К

Е

Υ

к

С

К

V

3

N

к

А

ь

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

Б

к

А

к

с

0

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

ь

Р

3

К

Е

м

Т

К

N

О

V

3

Е

т

С

В

V

К

б

Р

Υ

Р

3

Р

I

А

V

Е

И

Е

3

N

с

О

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

ь

Р

3

О

с

3

Р

ь

Υ

Б

К

В

т

V

Р

к

5

К

и

О

0

б

N

V

Р

3

с

3

V

М

Н

Е

А

Ь

н

N

Н

Υ

т

0

К

Б

ь

3

ь

3

Р

б

К

ЗЕО

ΙΡ ΝΟ:

: 84

ВссВаВдВдс ВдасВсадсс асссВсадсд ВсВдддассс ссдддсадад ддВсассаВс60

ВсВВдВВсВд даадсасдВВ саасаВсдда адВааВдсВд ВадасВддВа ссддсадсВс120 ссаддаасдд сссссааасВ ссВсаВсВаВ адВааВааВс адсддсссВс аддддВсссВ180 дассдаВВсВ сВддсВссад дВсВддсасс ВсадссВссс ВддссаВсад ВдддсВссад240

ВсВдаддаВд аддсВдаВВа ВВасВдВдса дсаВдддаВд асаВссВдаа ВдВВссддВа300

ВВсддсддад ддассаадсВ дассдВссВа ддВдсддссд саддссадсс сааддссдсВ360 сссадсдВда сссВдВВссс ссссВссВсс даддадсВдс аддссаасаа ддссасссВд420 дВдВдссВса ВсадсдасВВ сВасссВддс дссдВдассд ВддссВддаа ддссдасадс480 адссссдВда аддссддсдВ ддадассасс асссссадса адсададсаа саасаадВас540 дссдссадса дсВассВдад ссВсассссс дадсадВдда ададссассд дадсВасадс600

ВдссаддВда сссасдаддд садсассдВд дадаадассд Вддсссссас сдадВдсадс660

ЗЕО ΙΡ N0:85 3ΥνΒΤ0ΡΡ3Α36ΤΡ60ΕνΤΙ303Θ3ΤΡΝΙ63ΝΑνΒΝΥΚ 0ЪРОТАРКЬЬ1УЗЫЫ0КР5СУРРКР5 3 3К5ОТЗА5ЬА1 ЗСЬОЗЕРЕАРУУСААИРР1ЬЫ7РУРСеОТКЬТУЬ<ЗААА О<2РКААРЗУТЬЕРРЗЗЕЕЕ<2АИКАТЬ^СЬ13РЕУРСАУ

- 41 017203

- 42 017203

5Е0 ΙΡ N0:107

03ννΤ0ΡΡ3ν5νΑΡ ΡΟ0Α₽νΡννΥΡΡ3Ρ νΕΑΘΡΕΑΏΥΥΟΟνΜ РКААРЗУТРРРРЗЗ АИКАРЗЗРУКАСУЕ ΚΚ3ΗΚ3Υ3Ο0νΤΗΞ

Ο 0 Ε Ρ

Ρ 3

Ε Ε

Τ Τ е з

ΤΑΕΙΤΟΘδΝ

ЗО1РЕЕЕЗС 33ΡΗΥνΡ0Τ ΡβΑΝΚΑΤΡν

ΤΡ5Κ03ΝΝΚ ТУЕКТУАРТ

Ν I <3 3 К 3V

Ν 3 (3 Ν ΤΑ

Τ К V Τ VΡ

С Ρ I 3 Ρ ΡΥ

Υ А Α 3 3 ΥΡ

Ε С3

Η

Τ

Ρ и υ о о к ρ τ ι з к А А А 6 о САУТУ Ь Τ Ρ Е О

ЗЕО ΙΡ N0:108 асбдЬдЬРда сасадссдсс сРсадЪдЪсЬ ддддссссад Ъдсасрддда дсадсРссаа саРсддддса ддРРакдаСд ссаддаасад сссссааасР ссРсаЪсЪаР дд+аасадса дассдаЬЬсб сЬддсЪссаа дРсЬддсасд Рсадссассс асЬддддасд аддссдаЫха ГйасЪдсдда асаЬдддаеа ЬЪсддаасЬд ддассааддр сассдЬссЪа ддЪдсддссд сссадсдрда сссЬдРЪссс ссссЬссксс даддадсбдс дЬдЬдссЬса РсадсдасРЬ сЬасссРддс дссдСдассд адссссдрда аддссддсдр ддадассасс асссссадса дссдссадса дсЬассЬдад ссЪсассссс дадсадЬдда Ъдссаддрда сссасдаддд садсассдЪд дадаадассд ддсададддр РасасЬддРа аРсддсссСс: ЪдддсаЬсас: дсадссЬдад саддссадсс: аддссаасаа ЪддссРддаа адсададсаа ададссассд Ьддсссссас:

сассаЬсбсс ссадсадсРЪ аддддЬсссР сддаскссад ЬдсЪЬаЬдРс сааддссдсЪ ддссасссбд ддссдасадс саасаадбас дадсЬасадс сдад+дсадс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

ЗЕО ΙΡ N0:109

ΤνΡΤ0ΡΡ3ν3ΟΑ₽ι30ΚνΤΙ3 0Τα333ΝΙΟΑΟΥΡνΗ

ΟΡΡσΤΑΡΚΡΡΙΥΟΝ3ΝΕΡ30νΡΡΕΡ303Κ3(3Τ8ΑΤ

ΤΟΡΟΤΟΡΕΑΡΥΥΟ(3ΤΗΡ53Ρ5ΆΥνΡΘΤΟΤΚνΤνΡ(3

0ζ)ΡΚΑΑΡ5νΤΡΡΡΡ35ΕΕΡΟΑΝΚΑΤΡνθΡΙ5ΡΡΥΡ

ΤνΑΝΚΑΏ33ΡνΚΑθνΕΤΤΤΡ3Κ03ΝΝΚΥΑΑ33ΥΡ3

Ε0«Κ3ΗΚ8Υ3Ο0νΤΗΕ5δΤνΕΚΤνΑΡΤΕΟ5

И Υ О ρ σ ι А А А

С А V Ь Т Р

ЗЕО ΙΡ N0:110

ΜΕΚΐνΡΡΡΆΐν5ΡνΚ8Ρ<3ΙΟΙΟΥΗΑΝΝ5ΤΕθν

ΝνΤνΤΗΑΟΡΙΡΕΚΚΗΝ(3ΚΡΟΡΡΡ(3νΚΡΡΙΡΕΡ

ΡΡΟΝΡΜΟΡΕΡΙΝνΡΞΝ3ΥΐνΕΚΑΝΡνΝΡΡΟΥΡ

ΕΕΡΚΗΡΡ3ΕΙΝΗΡΕΚΙ0ΙΙΡΚ33Ν33ΗΕΑ3Ρ0

Υ0ΟΚ33ΡΕΕΝννΝΡΙΚΚΝ3ΤΥΡΤΙΚΕ3ΥΝΝΤΝ

ΡΝ(3ΙΗΗΡΝΡΑΑΕ<3ΤΚΡΥΟΝΡΤΤΥΙ3ν0Τ3ΤΕΝ

ΙΑΤΕ8ΚνΝ603(3ΕΜΕΕΡΝΤΙΕΚΡΝΡΑΙΝΕΕ5Ν

ΕΥΑΥΚΐνΚΚ(3Ρ3ΤΙΜΚ3ΕΡΕΥΟΝΟΝΤΚΟ0ΤΡΜ

ΜΡΡΗΝΙΗΡΡΤΙ(3ΕΟΡΚΥνΚ3ΝΕΡνΡΑΤΟΡΕΝ3

ΕΚΚΕΘΡΡ<3ΑΙΑ6ΡΙΕΟ<3Ν<2ΟΜνΡ(3ΚΥΟΥΗΗ3Ν

ΑΑϋΚΕ3Τ0ΚΑΙΡΘνΤΝΚνΝ3ΙΙΡΚΜΝΤ0ΡΕΑν

ΡΕΕΕΙΕΝΡΝΚΚΜΕΡΟΡΡΡνΝΤΥΝΑΕΡΡνΡΜΕΝ

ΗΡ3ΝνΚΝΡΥΡΚνΕΡΟΡΕΡΝΑΚΕΡΟΝ(3ΟΓΕΓΥΗ

ΜΕ3νΕΝΟΤΥΡΥΡ0Υ3ΕΕΑΕΡΚΕΕΕΙ3ΘνΚΡΕ3

Ρ3ΙΥ3ΤνΑ33ΡΑΡΑΙΜνΑΟΡ3ΡΗΜ08ΝΟ3Ρ0Ο

Ρ Τ I Μ Ε К С 5 V А Ο И Ο Ρ Ρ Ν Ρ Υ V 3 5 А С Ρ 0 Ε Ρ Ρ Ρ V 0 Ε Ρ V Ρ Ε <3 Ν Ρ I А Ρ Ο А I Ν 3 5 Ρ 0 Ε Ε Ε К Ε 0 <3 3 Ο Υ Ο Ε Ε Ρ Ν Ν Ε Ε Τ Ρ Ρ Ρ К С Ρ Ν Ε С

I Ο I У ί I Ε

3Ε0 ΙΡ N0:111

ΜΕΚίνΣΙ,ΡΑΐνεί,νκεΡΟΙΟΙΟΥΗ ΝντνΤΗΑΟΡΙΡΕΚΤΗΝΟΚΡΟΡΡΡΟ ΡΡΟΝΡΜΟΡΕΡΙΝνΡΕΗΒΥΐνΕΚΑΝ ΕΕΡΚΗΡΡ3ΕΙΝΗΡΕΚΙ0ΙΙΡΚ33Ν ΥΟ0Κ33ΕΕΕΝννΝΡΙΚΚΝ3ΤΥΡΤΙ ΡΝ0ΙΗΗΡΝΡΑΑΕΟΤΚΡΥΟΝΡΤΤΥΙ ΙΑΤΕ3ΚνΝΟ03(3ΕΜΕΡΡΜΤΙΡΚΡΝ ΕΥΑΥΚΐνΚΚΟΡ3ΤΙΜΚ8ΕΡΕΥΟΝΟ ΜΡΡΗΝΙΗΡΡΤΙ(3ΕΟΡΚΥνΚ3ΝΕΡν

ΑΝΝΒΤΕΟνΡΤΙΜΕΚ

УКРР1РЕРСЗУАСИ ΡνΝΡΡΟΥΡΟΡΡΝΡΥ ЗЗНЕАЗРСУЗЗАСР ΚΚ3ΥΝΝΤΝ0ΕΡΡΡν 5ν(3Τ5ΤΡΝ<3ΕΡνΡΕ ΡΑΙΝΡΕ3ΝΟΝΡΙΑΡ ΝΤΚΟ0ΤΡΜΟΑΙΝ53

ΡΑΤ0ΡΕΝ3ΡΟΕΕΕΕ

Ε

к

К

Ε

<3

Ρ

Θ

Α

I

Α

<3

Ρ

I

Ε

(3

0

и

0

СЗ

Μ

V

Ρ

СЗ

И

Υ

СЗ

Υ

Η

3

Ν

Ε

Ω

С

3

(3

Υ

Α

Ρ

К

Ε

3

Τ

0

К

А

I

ρ

Θ

V

Τ

Ν

к

V

Ν

3

I

ϋ

К

Μ

Ν

τ

0

Ε

Α

V

0

Ε

Ρ

Ν

Ρ

Ε

к

Ε

I

Ε

Ν

Ρ

Ν

К

Μ

Ε

ρ

0

Ρ

ь

ρ

V

и

τ

Υ

Ν

Α

Ε

Ь

Ρ

V

Ρ

Μ

Ε

Ν

Ε

Τ

ь

η

Ρ

Η

Ρ

3

Ν

V

К

Ν

Ρ

Υ

ϋ

к

V

Ε

Ρ

0

Ρ

Ε

ρ

Ν

Α

к

Ε

Ρ

С

Ν

0

С

Ε

Ρ

Υ

Η

К

С

Ώ

Ν

Ε

С

Μ

Ε

3

V

Ε

Ν

Θ

τ

Υ

0

Υ

Ρ

0

Υ

3

Ε

Α

Ε

Ь

к

Ε

I

3

(3

V

К

Ρ

Ε

3

I

(3

I

Υ

0

I

Ρ

5

I

Υ

3

Τ

V

Α

5

3

Ρ

Α

Ρ

Α

I

Μ

V

Α

<3

ь

3

Ρ

И

Μ

С

3

Ν

Θ

3

Ρ

0

С

Ε

5Ε<2

ΙΡ ΝΟ:

: 112

Μ

Ε

К

I

V

Ρ

Α

I

V

3

Ρ

V

к

3

Ρ

Ω

I

с

I

<3

Υ

Η

Α

Ν

3

τ

Ε

Ω

V

ϋ

Τ

I

Μ

Ε

к

Ν

V

Τ

V

Τ

Η

Α

0

Ρ

I

Ρ

Ε

к

Τ

Η

Ν

(3

κ

Ρ

с

ρ

Ρ

ρ

СЗ

V

К

Ρ

ь

I

Ρ

Ε

Ό

С

3

V

Α

Θ

и

Ь

Ρ

0

Ν

Ρ

Μ

С

ρ

Ε

Р

I

Ν

V

Ρ

Ε

Η

3

Υ

I

V

Ε

К

Α

Ν

Ρ

Α

Ν

Ρ

С

Υ

Ρ

(3

Ν

Ρ

Ν

ϋ

Υ

Ε

Ρ

К

Η

Ρ

Ь

3

Ε

I

Ν

Η

Ρ

Ε

К

I

0

I

Ρ

К

3

N

3

Ρ

Η

Ε

Α

3

<3

V

3

Α

С

Ρ

Υ

Ώ

0

К

3

Ρ

ρ

Ε

N

V

Η

Ρ

I

К

к

Ν

3

Υ

Ρ

Τ

I

к

К

3

Υ

Ν

Τ

Ν

0

Ε

ϋ

Ρ

ь

V

Ρ

и

(3

I

Η

Ρ

Ν

Ρ

А

Α

Ε

0

Τ

Ε

Ь

Υ

Ω

Ν

Ρ

τ

Τ

Υ

I

3

V

<3

Τ

3

Τ

Ρ

Ν

0

Ε

Ρ

V

Ρ

к

I

Α

Τ

к

3

к

V

Ν

е

0

3

<3

к

Μ

Ξ

Ρ

Η

Τ

I

Ρ

К

Ρ

Ν

Ρ

Α

I

Ν

Ρ

Ε

3

Ν

(3

Ν

Ρ

I

Α

Ρ

Ε

Υ

Α

Υ

к

I

V

К

к

Θ

Ο

3

Α

I

Μ

К

3

Ε

Ρ

Ε

Υ

<3

Ν

С

Ν

Τ

к

С

0

Τ

Ρ

Μ

6

Α

I

Ν

3

Μ

Ρ

Η

Ν

I

Η

Ρ

ь

Т

I

6

Ε

С

Ρ

К

Υ

V

к

3

Ν

Ε

Ρ

V

Ρ

Α

τ

0

Ρ

Ε

Ν

3

Ρ

0

Ε

К

к

С

Ρ

(3

А

I

Α

С

Ρ

I

Ε

С

<3

И

0

(3

Μ

V

ϋ

СЗ

И

Υ

С

Υ

Η

3

Ν

Ε

0

Θ

3

0

Υ

Α

Ρ

к

Ε

3

τ

0

К

А

I

ρ

(3

V

Τ

Ν

к

V

Ν

3

I

ϋ

К

Μ

Ν

τ

0

Ρ

Ε

Α

V

0

Ε

Ρ

Ν

Ρ

Ε

I

Ε

Ν

ь

N

К

Μ

Ε

ρ

<3

Ε

ь

ϋ

V

и

τ

Υ

Ν

Α

Ε

Ρ

V

Ρ

Μ

Ε

Ν

Ε

Τ

Ρ

Ο

Ρ

Η

Ρ

3

Ν

V

к

Ν

Ρ

Υ

Р

К

V

К

Ρ

0

Ь

к

ρ

Ν

А

к

Ε

Ь

<3

Ν

СЗ

С

Γ

Ε

Ρ

Υ

Η

К

С

υ

Ν

Ε

С

Μ

Ε

3

V

Ε

Ν

0

τ

Υ

Р

Υ

Ρ

0

Υ

3

Ε

Α

Ε

Ρ

к

К

Ε

I

3

С

V

К

Ρ

Ε

3

I

0

I

Υ

0

I

Ь

3

I

Υ

3

Τ

V

Α

3

Ρ

Α

Ρ

Α

I

Μ

V

Α

α

Ρ

3

Ρ

Η

Μ

С

3

Ν

(3

3

Ρ

Ω

С

Ε

3Ε0

ΙΡ ΝΟ

: 113

Μ

Ε

К

I

V

Ρ

А

I

V

8

ь

V

к

8

Ό

Ω

I

С

I

С

Υ

Η

Α

Ν

5

τ

Ε

Ω

V

Ώ

Τ

I

Μ

Ε

К

Ν

V

Τ

V

Τ

Η

Α

0

Р

I

Ρ

Ε

к

τ

Η

Ν

Θ

К

Ρ

С

Ρ

ϋ

(3

V

К

Ρ

I

Ρ

Ε

0

3

V

Α

Θ

Ν

ь

Ρ

С

Ν

Ρ

Μ

С

Ρ

Е

Ρ

I

Ν

V

Ρ

Ε

И

3

Υ

I

V

Ε

к

Α

Ν

Ρ

V

Ν

ϋ

Ρ

С

Υ

Ρ

С

ϋ

Ρ

Ν

Ώ

Υ

Ε

Ρ

К

Η

Ρ

3

Е

I

Ν

Η

Ρ

Ε

К

I

0

I

Ρ

К

3

И

3

Η

Ε

Α

3

Ρ

С

V

3

Ά

С

Ρ

Υ

0

К

3

Ρ

Е

Ν

V

и

Ρ

I

К

к

Ν

5

τ

Υ

Ρ

Τ

I

к

Ε

3

Υ

Ν

Τ

Ν

Ω

Ε

η

Ь

Ρ

V

Ρ

И

(3

I

Η

Ρ

Ν

Р

А

Α

Ε

0

τ

к

Ρ

Υ

Ω

Ν

Ρ

τ

Υ

I

3

V

С

Τ

3

Τ

Ρ

Ν

Ω

Ε

ь

V

Ρ

Ε

I

Α

τ

Ε

3

к

V

Ν

С

0

3

<3

Ε

Μ

Ε

Ρ

и

Τ

I

Ρ

к

Ρ

Ν

Ρ

Α

I

Ν

Ρ

Ε

3

Ν

(3

Ν

Ρ

I

Α

Ρ

Ε

Υ

Α

Υ

к

I

V

К

<3

Ρ

3

Τ

I

Μ

К

3

Ε

Ρ

Ε

Υ

С

Ν

С

Ν

Τ

к

С

0

Τ

Ρ

Μ

(3

Α

I

Ν

Ξ

5

Μ

Ρ

Ε

Η

Ν

I

Η

Ρ

ь

Τ

I

С

Ε

С

Ρ

К

Υ

V

к

3

Ν

к

ь

V

Ρ

Α

τ

<3

Ρ

Ε

Ν

3

Ρ

Ω

к

Ε

К

к

С

Ρ

С

А

I

Α

С

Ρ

I

Ε

0

(3

И

0

(3

Μ

V

ρ

(3

Η

Υ

С

Υ

Η

3

Ν

Ε

Ω

0

3

α

Υ

Α

Ρ

к

Ε

3

τ

Ω

К

А

I

Ρ

<3

V

Τ

Ν

к

V

Ν

3

I

ρ

к

Μ

Ν

τ

0

Ρ

Ε

Α

V

0

Ε

Ρ

Ν

Ρ

Ε

Η

к

I

Ε

Ν

Ρ

N

К

Μ

Ε

Ώ

<3

Ρ

ϋ

V

и

τ

Υ

Ν

Α

Ε

Ь

Ρ

V

Ρ

Μ

Ε

Ν

Ε

Τ

Ρ

Η

Ρ

3

Ν

V

К

Ν

ь

Υ

Ώ

к

V

Ε

Ρ

0

Ρ

к

Ρ

Ν

Α

к

Ε

Ρ

С

Ν

<3

С

Ε

Ρ

Υ

Η

К

С

ϋ

Ν

Ε

С

Μ

Ε

3

V

Ε

Ν

0

τ

Υ

ϋ

Υ

Ρ

0

Υ

3

Ε

Α

К

Ρ

к

Ε

I

3

(3

V

К

Ρ

Ε

3

I

0

I

Υ

0

I

0

Η

3

С

0

К

3

Р

Ε

С

Ρ

Ε

Ρ

Ε

Ω

к

Ρ

I

3

Ε

Ρ

Ν

Μ

Η

Τ

<3

Η

5Ε0

ΙΡ ΝΟ:

: 114

Μ

Ε

К

I

V

Ρ

А

I

V

3

Ρ

V

К

3

ϋ

Ω

I

С

I

0

Υ

Η

Α

Ν

3

Τ

Ε

0

V

Э

Τ

I

Μ

Ε

К

Ν

V

τ

V

Τ

Η

Α

0

Р

I

Ρ

Ε

К

τ

Η

Ν

СЗ

К

Ρ

С

ϋ

Ь

Ρ

6

V

К

Ρ

I

Ρ

К

Ώ

С

3

V

Α

С

и

Ρ

С

Ν

Ρ

Μ

С

Ρ

Е

Ρ

I

Ν

V

Ρ

Ε

И

3

Υ

I

V

Ε

К

Α

Ν

Ρ

Α

Ν

Ρ

С

Υ

Ρ

СЗ

Ν

Ρ

Ν

Ρ

Υ

Ε

ь

К

Η

Ρ

3

К

I

Ν

Η

Ε

К

I

Ω

I

Ρ

К

3

И

3

Ρ

Η

Ε

Α

3

(3

V

3

Α

С

Ρ

Υ

ω

0

К

5

3

Ρ

Γ

К

Ν

V

Ν

Ρ

I

К

к

Ν

3

Υ

Ρ

Τ

I

к

Ε

3

Υ

Ν

τ

Ν

0

Ξ

υ

Ρ

V

Ρ

и

σ

I

Η

Ρ

Ν

Р

Α

Ε

Ω

Τ

к

Ь

Υ

0

Ν

Ρ

Τ

τ

Υ

I

3

V

0

Τ

3

Τ

Ρ

Ν

0

Ε

Ρ

V

Ρ

к

I

Α

τ

Ε

3

к

V

Ν

С

0

5

0

Ε

Μ

Ε

Ρ

Η

Τ

I

Ρ

к

Ρ

Ν

Ρ

Α

I

Ν

Ρ

Ε

3

Ν

(3

Ν

Ρ

I

Ά

Ρ

Ε

Υ

Α

Υ

к

I

V

К

0

Ρ

3

Α

I

Μ

к

3

Ε

Ρ

Ε

Υ

α

Ν

С

Ν

Τ

к

С

0

Τ

Ρ

Μ

Θ

Α

I

Ν

3

Μ

Ρ

Η

Ν

I

Η

Ρ

Р

Τ

I

0

Ε

С

Ρ

к

Υ

V

к

5

Ν

Ε

Ь

V

Ρ

Α

τ

0

ь

Ε

Ν

3

Ρ

0

Ε

К

к

Ε

0

Ρ

(3

А

I

Α

С

Γ

I

Ε

<3

С

И

0

Μ

V

Ρ

С

и

Υ

α

Υ

Η

3

Ν

Ε

Ω

0

3

С

Υ

Α

Ρ

К

Ε

3

τ

0

К

Α

I

η

0

V

Τ

Ν

к

V

Ν

3

I

Ρ

К

Μ

Ν

τ

0

Ρ

Ε

Α

V

<3

Ε

Ρ

Ν

Ρ

Ε

I

Ε

Ν

Ρ

N

К

Μ

Ε

ρ

0

Ρ

V

и

τ

Υ

Ν

Α

Ε

Ρ

V

Ρ

Μ

Ε

Ν

Ε

Τ

Ρ

Η

Ρ

3

Ν

V

К

Ν

Ρ

Υ

Ρ

к

V

Ε

Ρ

0

Ρ

Ε

Ρ

Ν

Α

к

Ε

Ρ

0

Ν

Ο

С

Ρ

Ε

Ρ

Υ

Η

К

С

υ

Ν

Ε

С

Μ

Ε

3

V

Ε

Ν

<3

τ

Υ

ϋ

Υ

Ρ

0

Υ

3

Ε

Α

Ε

Ь

к

К

Ε

I

3

0

V

К

ь

Ε

3

I

0

I

Υ

Ω

I

0

Η

3

С

0

Ε

3

Р

Ε

0

Ρ

Ε

Ρ

Ε

0

К

Ρ

I

3

Ε

Ρ

Ν

Μ

Η

τ

0

Η

- 43 017203

ссгхгддсас адаадссадд сдсадссхда

- 44 017203

ддсссдадЪд даъдддаддд

0

V

0

Ь

V

0

3

с

С

ь

V

к

Р

<3

а

3

ь

к

ь

5

с

А

3

<5

Е

т

Р

5

3

Υ

8

м

N

н

V

к

0

А

Р

<3

К

(3

β

Е

и

V

3

I

8

3

8

3

Υ

I

Υ

V

β

3

V

К

с

к

Р

т

I

3

в

В

N

А

к

N

3

ь

Υ

ь

0

М

N

5

ь

к

А

Е

β

т

А

V

Υ

с

А

к

с

й

е

3

Υ

с

А

Υ

Е

с

Р

в

Υ

И

С

0

с

Т

ь

V

т

V

8

3

Θ

т

σ

С

8

<3

с

Т

СЗ

8

с

т

(3

<3

3

т

Е

I

V

ь

Т

0

8

Р

а

т

β

8

ь

3

Р

Θ

Е

К

А

т

β

3

С

к

А

3

0

к

V

3

Υ

β

А

и

Υ

0

к

Р

13

0

А

Р

К

ь

I

Υ

С

А

3

Т

К

А

С

I

Р

β

К

Р

3

<3

3

<3

3

<3

т

β

Р

т

ь

т

I

3

к

ь

Е

Р

Е

β

3

А

V

Υ

С

0

Υ

Θ

К

Т

Р

ь

т

Р

(3

С

т

к

V

Е

I

к

К

ΞΕΟ

Ю N0:

.129

Ьддсддадх:с сддддссдад

- 45 017203 дссадСсада дЪдЫадсад садсЕасЕьа дссЕддЦасс адсадааасс СддссаддсЬ 540 сссаддсЬсс ксаЪсБабдд Ьдсабссадс адддссасЪд дсаксссада саддЕЕсадЬ 600 ддсадЕдддС сЪдддасада сРЬсасЕсес ассаЬсадса дасСддадсс ЕдаадаЕЬЪР 660 дсадЬдБаЪЪ асЪдЬсадса дЪаЬддкадс Есасссадаа сЬЬЪсддсдд адддассаад 720 дСддадаЬса аасдЪ 735

3ΕΩ ΙΡ N0:134

Е

V

ΰ

Ь

V

Е

3

О

А

Е

V

к

К

Р

С

3

5

V

к

V

3

С

к

А

3

с

С!

т

Р

3

Υ

б

I

3

и

V

Е

0

А

Р

С

0

Θ

Ь

Е

N

М

а

Р

I

е

м

Р

с

3

т

N

У

А

0

N

Р

С!

а

Е

Д

т

I

т

А

Р

Е

8

Т

3

т

А

Υ

м

Е

ь

3

ь

к

3

Е

Р

т

А

V

Υ

с

А

Е

3

а

Υ

Р

А

Υ

ь

Р

н

N

О

0

О

Т

Ь

V

Т

V

3

с

Т

Θ

е

3

6

б

т

6

3

а

т

с

3

Т

Е

I

V

ь

т

0

5

Р

с

т

Д

3

д

3

Р

О

Е

к

А

т

ь

3

с

К

А

3

0

3

V

3

Υ

ь

А

и

Υ

О

0

К

Р

б

С!

А

Р

к

Д

I

Υ

б

А

3

Н

А

Т

с

I

Р

к

Р

3

а

5

С

3

с

т

р

Р

т

ь

Т

I

5

Е

ь

Е

Р

Е

Р

А

V

Υ

с

0

Υ

<3

3

Р

к

т

Е

(3

С

<3

т

К

V

Е

I

к

Е

ЗЕО

ΙΡ ΝΟ:

: 135

даддСдсадс СддСддадЬс ЕддддсЕдад дрдаадаадс сддддЬссЕс ддСдааддРс 60 Ьсс+дсаадд сеЬсЪддадд сассЫсадс ЬЬсБаеЬсЬа ЕдадсЕдддЪ дсдасаддсс 120 ссЬддасаад дасСЬдадСд даЕдддаддд аЕсаЪсссРа РдЬЬРдд+ас аасааасРас 1В0 дсасадаадЬ Рссадддсад ад^сасдаЬР ассдсддЪсд ааСссасдад сасадссСас 240 аЬддаддСда дсадссЕдад аЬсСдаддас асддссдГХЕ аЕЕасЕдЕдс дададдЬдаЬ 300 аадддИаЬсЕ асЬасЬасСа саЬддасдСс Еддддсааад ддассасддЪ сассдЬсЬсд 360 адсддЬасдд дсддЕЕсадд сддаассддс адсддсасЬд дсдддбсда.с дсадЬсСдсс 420 седасЬсадс с^дссбссдЦ д^сЕдддксС ссСддасадС сдаСсассаЬ сЬссЪдсасР 480 ддаассадса д+дасдЕЕдд ЬддЕЕаРаас ГаРдЬс+ссР ддрассааса дсасссаддс 540 ааадссссса аасЕсаСдаб СГаЕдаддцс адСааесддс ссЕсаддддЕ еъсЬааЪсдс 600 ЬЬсБсЪддсБ ссаадЬсБдд саасасддсс ЕсссЬдасса ЕсГсГдддсЬ ссаддсЪдад 660 дасдаддсСд аЕЕаСЕасЬд садсЬсаЪаЬ асаадсадса дсасЬсЫ-дЬ сЕЕсддаасР 720 дддассаадд ЪсассдИссЪ аддЬ 744

3ΕΩ ГД N0:136

ΕνΟΣνΕΕΟΑΞνΚΚ

ОАРС05ЬЕИМС01

ЗТАУМЕУЗЗДЕЗЕ

ТТУТУЗЗСТССЗб

051Т13СТСТ55О

5ΝΒΡ36ν3ΝΕΡ36 ЗУТЗЗЗТДУРбТС

ΡΟ33νΚν36ΚΑ566

ΙΡΜΡΟΤΤΝΥΆΩΚΡζ)

ΡΤΑνΥΥ6ΑΒ6ΡΚΟΙ

ΟΤ6δ5Τ055ΤΟ5Α1 νΟΟΥΝΥνΒΗΥΟΩΗΡ 3Κ36ΝΤΆ3ΡΤΙ36Ιι Т К V Т V ь о

ТРЗРУЗМЗИУЕ ακνΤΙΤΑνΕ3Τ ΥΥΥΥΜΡνΝ6ΚΘ ТОРАЗУЗСЗРС ΟΚΑΡΚΡΜΙΥΕν ΩΆΕΡΕΑΡΥΥ63

3ΕΩ ΙΡ N0:137 даддСдсадс Ьссбдсаадд ссЕддасаад дсасадаад£ аСддадсСда ЬаЕЕасХаЬд ддЪасдддсд асдсадссдс аасаасаЬЬд сЕддЕсдЕсЕ

ЬддЬддадСс сЕЕс^ддадд ддсГХдадйд Ьссадддсад дсадссЕдад ададЕадЦсС дЕЪсаддсдд сс^сддСдЬс даадБаааад аЬдаЪдаЕад аасЕсЬддда асасддссас ЬаЬЬасЬдЬс аддЬдСддда дЬсассдЬсс ЪаддЪ ьддддседад сассС+садс дайдддаддд ад!сасда1С аЕсЕдаддас сдасЕасЪдд аассддсадс адьддсссса ЬдЪдсасЬдд сдассддссс сс-Ьдасса+с ЁадЬадЬад!

дбдаадаадс адсЪаСдсЬа аЬсаЪсддЪа ассдсддасд асддссдЬдЬ ддссадддаа ддсасЕддсд ддасадасдд Еассадсада ЬсадддаЪсс адсадддЬсд даЬсаЫаСд сЪдддЬсск.с ЕсадсЕдддЕ ЕдЬЪсддЬас ааСССасдад аЕЕасЬдЕдс сссЬддЬсас ддЬсдасдса ссаддаЕЕас адссаддсса сЪдадсда!Ъ аадссдддда ЕсСЕсддаас ддЪдааддЬс дсдасаддсс адсааасбас сасадссбас дададдаааЬ сдЬсЬсдадс дЬсЕдЬсдЕд с+д+ддддда ддссссЪдЪд сЬсСддсГсс Гдаддссдас Сдддассаад

12 0 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 735

5ΕΏ ΙΡ N0:138

Е V

Ρ

д

V

Е

3

б А Е V К К

Р

О

3

V

к

V

3

с

К

А

3 С С

1 Т Р 3 3 Υ А I

3

Ν

V Ε

Ω А

Р

а

0

б

Д

Е И М (

3 3 1

I

6

м

Р

с

т

А

N

Υ

А

Ό

К Р с

1 6 В V Т I Т А

Ρ

Ε

Γ τ

5

т

А

Υ

И

Е

Ь 3

3

Д

К 3 Ξ

Р

т

А

V

Υ

с

А

к

б

N

Υ Υ Υ

ЕЗЗДРУИб

ο

а

τ

Д

V

Т

V

3

о т

с

б

3 С б

т

б

3

б

т

6

б

3

т

0

3

V V т

0 Ρ Р 3 V 3 V А

Ρ

б

0

т

А

Е

I

т

С

с с

N

I б 3

к

3

V

И

и

Υ

0

к

Р

б

О А Р

νΡννΥΡΡΒ

Ρ

в

ρ

3

О

I

Р

Е

Р 5

С

3

N 3 б

N

т

А

т

д

т

I

3

Е

V

Е

А б Р

ΕΑργγαςν

и

Ρ

5

3

Р

н

Υ

V

Р С

Т

С

Т К V

т

V

Д

б

3ΕΩ ΙΡ N0:139 саддЬдсадс ЪддЬдсадСс Ьддддс+дад д+даадаадс сЬдддбссЬс дд+дадад-ьс 60 СссЬдсаадд сЫсСддаад саЬсЫсада аасЬаЬдсЬа ДдадсСдддЬ дсдасаддсс 120 ссЬддасаад ддсЬЪдадЪд даЪдддаддд аЪсаДсдсЬа ССЬЫдддас ассааадЬас 180 дсасадаадЪ Ьссадддсад адЬсасдаЪЪ ассдсддасд ааЬсдасдад сасЪд+сЬас 240 аЕддаасЬда дсддасЬдад аЕсЬдаддас асддссаЪдЪ аЕЕасСдЪдс даддаЫссс 300 сасЬаЬааЫ ЫддЪЬсддд дадЫаШс дасЪасЪддд дссадддаас ссСддСсасс 3 60 дЬсЬсдадсд дЬасдддсдд ЬЬсаддсдда ассддсадсд дсасЪддсдд дЬсдасдасЬ 420 дЬдСЬдасас адссдсссЬс ад+дЬсЬддд дссссадддс ададддДсас саЬсСссЪдс 480 ас+дддадса дсЬссаасаЬ сддддсаддЪ ДабдаВдЬас асЪддЬасса дсадсЫсса 540 ддаасадссс ссааасЪссЪ са+сЪаЬддЬ аасадсаа+с ддсссЬсадд ддЪсссСдас 600 сдаЫс+сЪд дсЬссаад+с СддсасдЬса дссасссЪдд дсаЬсассдд асЪссадас! 660 ддддасдадд ссдаЬСаЬЬа сЬдсддааса бдддаЬадса дсседадЬдс СЬаьдСсЬСс 720 ддаасЪддда ссааддГсас сдЬссЬаддЬ 750

3ΕΩ ΙΡ N0:140

Ω

V

Ω

Д

V

Ω

3

Ο

А

Ε

V

κ

Ρ

6

3

V

Β

V

3

С

κ

А

3

6

8

I

Ρ

Β

Ν

Υ

А

Μ

8

Ν

V

Κ

0

Α

Ρ

6

Ω

6

Д

Ε

И

Μ

6

I

А

I

Ρ

6

τ

Ρ

κ

Υ

А

Ω

κ

Ρ

Ω

6

Β

V

τ

I

τ

А

Ρ

Ε

3

τ

3

Τ

V

Υ

Μ

Ε

Д

3

б

Д

Ε

3

Ε

Ώ

Τ

А

Μ

Υ

С

А

Β

I

Ρ

Η

Υ

Ν

Ρ

6

3

6

3

Υ

Ρ

Υ

и

6

Ω

Ο

τ

Д

V

τ

V

3

6

Τ

6

3

Ο

6

τ

6

3

6

τ

6

3

τ

V

Д

τ

Ω

Ρ

3

V

3

6

А

Ρ

6

Ω

Β

V

τ

I

3

С

Τ

6

3

5

Ν

I

6

А

6

Υ

Ρ

V

Η

и

Υ

Ω

Д

Ρ

6

τ

А

Ρ

κ

Д

I

Υ

6

Ν

3

Ν

Β

Ρ

3

6

V

Ρ

Β

Ρ

8

6

3

Κ

3

6

τ

3

А

τ

д

6

I

τ

6

Д

Ω

τ

6

Ρ

Ε

А

0

Υ

С

6

τ

И

Ρ

3

Д

3

А

Υ

V

Ρ

6

Τ

6

τ

κ

V

τ

V

Д

6

3ΕΩ

ΙΡ ΝΟ:

:141

ЬсдасддаЬс дддадаЬсЬс ссдаВссссЬ аВддВдсасЪ с+садЬасаа ЬсЬдсЬсЬда 60 СдссдсаЬад НаадссадЪ аЬсЬдсЬссс ЬдсГЬдЕдЕд ЫддаддСсд сСдадЪадЬд 120 сдсдадсааа аШаадсба саасааддса аддсЫдасс дасааЪЬдса ЬдаадааЕсЕ 180 дсЫадддЬЬ аддсдЪЕЬЕд сдсЬдсЬЕсд сЬаддСддЪс ааЬаЬЪддсс аЪЬадсса^а 240 ЫсаЬЬсаеед д+ЪаЬабадс аЦаааесаае а+ЬддсЬаЫ ддсса+Ьдса ЬасдЬСдЬаЬ 300 ссаЬаЬсаЬа аЬаЪдЬасаЬ СЬаЬаЫддс ЬсаЬд1ссаа саЫассдсс аЬдЫдасаЬ 360 ЬдаЫа+Ьда сЬадДЪа+Ьа аЬадЬааЪса аЫасддддЬ саЬВад+Ьса ЬадсссаЬаб 420 а^ддадЬЬсс дсдЪДасаЬа асЫасддЬа ааЬддсссдс сбддсЬдасс дсссаасдас 480 ссссдсссаЬ ВдасдЪсааЪ ааЬдасдЬа! дЪЬсссабад Саасдссаа! адддасШс 54 0 са+Сдасд+с ааВдддСдда дЪаЫЬасдд ЪааасЪдссс асЫддсадЬ асаДсаадЬд 6 00 ЪаЬсаЕабдс саад-Ьасдсс сссЬаЪЬдас дЬсааЬдасд дЪааабддсс сдссСддса! 660 ЪаЬдсссадЪ асаСдассЫ аЕдддасСЕС ссЪасЫддс адЬасаесЬа сдЬаЪСад+с 720 а+сдс+аЬЬа ссаЬдд+даЬ дсддГЫЬдд садЬасаЬса аЪдддсдЪдд аЬадсддЬЫ 7 80 дасЪсасддд даЪЪЪссаад Ъс+ссасссс аССдасдЬса а+дддад'ЫЪ дЫЫддсас 840 саааа+саас дддас+Ысс ааааЬдЬсдЪ аасаасЬссд сссса£1:дас дсаааЬдддс 900 ддеаддсдбд ЪасддЪддда ддЪсЬаЪаЬа адсададсЬс дШадЪдаа ссд!сада1с 960 дсс^ддадас дсса+ссасд сЬдШЬдас сЬссабадаа дасассддда ссдаЬссадс 1020 сьссдсддсс дддаасддЬд саЬЕддаадс ЬддссЬддаЬ аГссСдасЬс ГсЪСаддСад 1080 ссЬЕдсадаа дИддСсдЕд аддсасЬддд саддЪаадЬа ЬсааддЕСас аадасаддЫ 114 0 ЬааддадаЬс ааЬадааас! дддсЫдЬсд адасададаа дасЬсЫдсд ЬбЬсВда+ад 1200 дсассЬаСЬд д£с1Ъас1да саЪссасШ дссШсЪсЬ ссасаддЬдЬ ссасЬсссад 1260 ЬбсааСЕаса дсбсдссасс аЬдддаЪдда дсЬд+аЪса! ссЪсЪЕсЬед дЪасЪдсЕдс 1320 Ьддсссадсс ддссад+дас сЫдассдд! дсассасШ ЪдаЬдаЪдЫ саадсЬссЪа 1380 аЫасасЬса асаЬасЬЬса Ьс+а+даддд дддШас1а ЬссЬда+даа аЫЫкадаЬ 1440 сддасасЬсЪ СЪаЬЪЬаасб саддаЫЬаЬ ЫссЫсссаДД ЪСаЪЬсВааЬ дЫзасадддЬ 15 0 0 еесаеасЬа! ЬааЬсаСасд ЬсЬддсаасс сСдЬсаЬасс ЫЫааддае ддбаСЫаье 1560

ЬЬдсЪдссас асаадксаса асЬЕЕдааЬЬ аЪасЪаедаЬ сдсЕЪдаЬдЪ аГааадаЕдд СассЕЪсЕдд сааа^ЪСЪад сЕдсадссЕа а^ддЕасааЕ сЕдЕЕаадад ссЕсаддада ЪЕааЪдсРас ЬЕдсЕдаЕЪа ЕЬЕсЕдссас Ъсаадддада аЪЪаЪаааЪЪ аЕдсЬасЕЕс ддсссЕЕЕда сасс^дсЪсЬ ЪЬддсЕасса сддЕССдГдд РРааСддасЕ аасааРССдд аааЪаЪРада аЕдсСРсаИс сааЬЕсаЕдс ГссадасЕса асаЬЬссЬаЪ сЬадссаааа асЕсЕаа^аа ЕдссХдР^Ъс сЕдааЕдЬдс ЬсксаддРаЬ аааЕдЬасаа сСдасссГсс сасСсдсЬда дадаЬсЪсаЪ аЕдаЬаЪдаЦ саЪЕЕддРдс аЬддсаЬСдд ЪЬаасааддс адсЕдсаада дсЕсЕааЕЕС ^сдаддсдда аЬдЬаасаса сЬааааЬдР-с ассассЬЬаР аЬдЕдссакс сакасЕЬссс ддаасЪЪсЬБ аЕдЪсдЬЬаЬ саЕЕсааада дсдаса'ЬЕЕс аЕдаддГсдс адсааЬаЬаЕ сЬдЕдддсса

РддЕдаЬсЕс ЕсаЪдсСЕЕд садсдЬдЪЬс с^дссЬддГд дассадсддс садсдЕддЬд ададаааеса дЬсддкдаЬЕ дСдЪдасаас аЪЬсдаПааЕ ЬЪсадаааад дЕЕЕсЕсЕаС £С1;Саасас1; адссаеесье еЪЕЪдЕЕддс сасадаЬдсЬ сЬЕЕдадаЕЪ ЪдЪЪдЪдада ЬаааССсссП сЕсЬдЪдсЕс ЕаадЬЕдааЕ ЬдаЬдЬаада дссадаЪдаЬ аасЕддЕааЬ дададасаЕа ГааССдСЬаС ассЬЕасада ассааааЕЬа сасЕддЕасЬ ссдЕдаИдПГ саЬЕЬсассЬ ГдаадбХдсе адаЕсаасЕс ддсаддсСдь ЬддадсЪддс аЬсеаЕЕдЦд сассаГСдсЕ ЪаЕддсЕааа ГааЬЕХдсЕЕ ЪдсЪдсЬдаа аассссаасЬ ааадссаасЬ ЪдсЦддсЪЪс ЬЬдЦдсдсад ЬдсСдссЕас СддсдсЕдсЪ ад1:Ьасссаа даЬЬадЬсаа сдЕЕдЪЬаас гддЕдсааЬЪ ддЪасааа!:!: асаасЬааЬс ГдадЕдЕдЪе дРссПСссса ссаддададд РсдГдааддк ЕЕсЕссасаа ЪддсаесаЬЬ ададсЬддас аддсаЬСаас ЬаааааЬЬЪа ЕаааЪддссЬ ддасасдсад адссаЕссЕд дсадаадаад ссссЕддссс ааддасЬасЬ дЪдсасассЁ ассдЪдссса ссасаадссс адсаасасса ссасассЪдс ссссссЬдсс сссссссаад ддьддасдед ддрдсасаас дадсдЬдсСс дадсаасаад ссдддадссс дЪсссЪсасс сссааддаса адссасдадд дссаадасса ассд^дсЕдс дсссЬдссЪд саддЬдГаса ЬдГсСддЬда саасддссад сСЕсЕЕссИд садсЬдсадс дадссссддс дссРРсЬадЬ аддЬдссасЕ ЪаддПдЪсае адасааъадс садсЪддддс ьдЕддЬддЕЬ сдсЬЬСсЬЬс ддддс(зссс1: ЪЬадддЬдаЬ д-ЬЪддадЪсс ЬаЬсЬсддСс аааЬдадсЕд дддЬдЬддаа ЕадЬсадсаа аЬдсаЬсЬса асбссдссса даддссдадд ддссЬаддсЪ дадасаддаЬ дссдсЪЬддд дардссдссд сЕдЪссддЬд асдддсд^Ьс сЪаРЬдддсд дЕаНссаЬса ЬЬсдассасс дЬсдаСсадд аддсЪсаадд ЕЕдссдааЬа ддЬдЬддсдд ддсддсдааЪ сдсаЬсдссб Едассдасса аЕдаааддЬС дддаЬсЬсае асаааЬааад дЬЬдЕддРЬе дсЬададсЬЬ сссдадааса Еасадсаадс дЬдаРдсасд аадЪдаЪааЬ ЬдссадссаС сссасЬдЬсс ЬсЬаЬЬсЦдд аддсаЪдсЪд СсЕадддддЕ асдсдсадсд ссЪРсс^ЬЬс ЬЬадддЪЪсс ддЪЬсасдЬа асдбСсЬЬЬа ЬаЬРсЬЬЬЪд аРРРаасааа адРссссадд ссаддЕдЬдд аЪЪадЬсадс дЬЬссдссса ссдссЬсЬдс ЪЬЪдсааааа даддаЬсдЬЬ ЪддададдсЬ ЬдЬЬссддсЬ сссЪдааЕда сЬГдсдсадс аадСдссддд ЬддсЬдаЬдс аадсдаааса аЬдаЬсЬдда сдсдсаЬдсс ЬсаЪддЬдда ассдсЬаЪса дддседассд СсЬаЬсдссЬ адсдасдссс дддсЕЕсдда дсЬддадЪЪс сааЬадсаСс дРссааасЪс ддсдЪаа^са ааЬдЬИдСсс аГЕаРЕааса ссЕЕЕсЬЬЬд дсаЬЬЬааЕЪ ЬсаддЕааЪЪ дССЕаЬаадд Ъ£дааассца асадссееы ЬаеЬЕааадс деедаПГдСС. дасаааддаа еесссЕааЬа ЪсЬдЬсЬаЪд ЬасаасЕсаа даЕсЕЕЬдсЬ саааЬадсдс ЬЬсаЪдддЪЪ ЪаЕааЫзаЪа РсЕааРдЕдс ПддссаЪЬаа дЪЪдЬадЬас ЬссасЬдасс ддрдрдрраа ЬсСдаЕЕЕса ЬдсЬсЕЕЕЕд дСЪсЕаЪаЕс асассадсСЬ сЪЪаЕаддад аЬеедЬдсЪа дсЪЦаЬасЪа аСассЕасЕа ассЬссдЬад сЬссааЕа!:д саддаЕсдса ЬЬдаааЕаЪЕ аададдЬсЕЕ аЪдаадсааЬ аадЬЬсааЪд асЬдсЬдсЬс сЕЕсаааГас ааЬдЪесЪсЕ аЫзсаадааЬ садааЕдсЕс РсаадЕдЪдс дасаддЪЪаа адддсЪдсЕд с^ЪддасааЦ саадсадссс аасЬЕсасса дЕЕЕЕЕдЕдЕ аЬааЪЕасеа аасаасасад аадЕасЫзса дсЕЕсЕдЕсд ааСдааСсас сЪсдасдаас даддГсаЕсд дсссЕддЕдд ссасдЪЪадд ссадсадсаа ессссдадсс ЪссссдссдЪ дсадсадссЬ аддрддасаа сЬдсссссда сссЕсаЕдаР ассссдаддС адссссддда ассаддасЕд сссссаЬсда сссЬдссссс адддсЬЕсЕа асЬасаадас ГсассдЕдда аддсссЬдса сЪададддсс сЬд^ЬдСЛЬд ССЪссСааЬа ддддьддддь дддаЪдсддР аЬссссасдс ЕдассдсЕас ЕсдссасдЕЕ даРЬЬадЬдс дРдддссаЬс аЬадЪддасЬ аЬРСаЪаадд ааЬРРаасдс сЬссссадса ааадЕсссса аассаЬадЬс ЬЬсЬссдссс сЬсЕдадсЬа дсЬсссддда ЕсдсаЬдаСЕ аИРсддсРаЬ дЕсадсдсад асрдсаддас ЕдЬдсЕсдас дсаддаЬсЪс ааЬдсддсдд ЪсдсаЪсдад сдаададсаЬ сдасддсдад ааа^ддссдс ддасаЬадсд сЪЬссЬсдЬд ЬсЫздасдад аассЬдссаЪ аЬсдЪЪЕЪсс РЬсдсссасс асаааеееса аЕсааЪдЪаЪ СддЬсаЬадс дЪддИЬдддЬ акксЬасЕаа сЬдСЬЬсСаа дсасЬЬСсда ЪЪааасасЬЬ дсЕаесаасс еееъьаадЕЕ сассЬдсЪса саасСасаЕЬ сЕсааааЪсс ЕЕЕассадас ЬЬасааасЕЕ саЪдддадад саЕЕЕПЕЕЕс ЕсЕссааЕдЬ саддасааас дЪдЪссЬРдс аа-ЬаЬаддЬа сЕЕЕсЕсссс аЬдаШаЪдд еьъсьеьъда СЕаеЪаадаа сЕссСЕсРЕс сЬдаЬЕссдС ддддЬдЬаад аада^дГЪаа ддсдсаЬаСа сбдадсаЪдС дГЬассаЬас Ьд'ЬсЬЬЬадд асЪСЦИсааЕ аЬЪдЪааЕаЕ дГадсЕЫзЕд асасасдЪда ЕЪддЬддЪЕЕ ЪЬаердадда аЬддсдааЬд дасЕЬасадЪ ЕадЕЕадЪдд сЕЕЕЬдсЕаЕ аЕдадаасса сасЬЬасаас аадсаЬЕааа ЕаааЕдаЕаЕ ЪЪасаддсад аааЕсадддс сааааададЬ сдсаПддедЕ садсдссадс ЕЕааЦддсас садасааЕас ЕЕЕаЕдаЕсс ааааЬсаЕас СсаасаЕЕса ЪсаЪЬдассЪ ааааасЪсаЬ ЕддЕдссаса ЕдсЕсассаЕ сддссдсЕсд дадсассадс сдЬдассдЪд дсрдсададс дддсасссад асдсдЬддад дсЬдсЬдддс садссддасс даадЬЬсаас ддадсадЬас дсЬдаасддс даадассаЕс садссдддад ссссадсдас сасссссссб саададссдд саассасЕас сдЬ6.еааасс ссссЬссссс аааЕдаддаа ддддсаддас дддсЬсРаЬд дсссЬдЕадс асррдссадс сдссддс^ЕЕ ЪИСасддсас дсссЬда^ад сЬЬдРЪссаа даЪЪСРдссд даа-ЬЪааСЬс ддсадаадЕа ддсЕссссад ссдссссЕаа саЬддсЬдас ЬЕссадаадС дсЬЁдЪаЬаЪ даасаадаЬд дасЬдддсас дддсдсссдд даддсадсдс дЕЬдЁсасЕд сЦдЬсаЪсЬс сЬдсаЬасдс сдадсасдЕа саддддсЬед даЕсЕсдЬсд ЬЬЫзсЬддаЬ ЪЬддсЪассс сЬЬЬасддЬа ЕЪсЬЪседад сасдадаЬЬ!: дддасдссдд ссаасЬЬдЬЪ саааеааадс сЬЪаЬсаЪдС ЕдРЪЬссЪдЪ

ЪЪРЬддеесЕ ЕдЪедЫгаЕа асссаЪдддЪ дЕасаЬаЬсЬ асдададЕСЪ ЬаЕадаЕдЬа дссЕсЪЬддЬ адасаЬЬЬдд ЕаЬдсЪсаад асЕЕдсГдаа сЕсЕааЕЕЪс дЕдЪссЕЪЪЬ аааааааа1:Ъ аассЬЪЬаад сЕаЕдсадаС ЕддЬдбЛаГ: ЬЪддааЪасЪ ЕсЕЕадасаЬ ЕдаЬддсааа ЕЪШЪасасс асЕЕЬ.Ьааа1: ссадСд(:д1:с ааададаЬРЬ ЦсдадаЬссР ЬдЬааЬЬаса сЪдсасЕдаЪ ЦрсСасЬдда сдасасЬЪсЪ адеььсеы:а ЦдсЬдаЪадЪ ЕадсаЬЪасР дИасаЪаЪдс сасасаасГа адЬдеесдсЪ ЕааЪЪЬЪЪса сЪедсЬсЕЬЦ ссЬаддЬдаЬ дЪЪдссассЬ ЬасЕдссасЕ дсаааЬддса аааасаааЬс аасаЬсаасЬ сасасЬЬдге ссИПЬсдсда асЬЪсааадс ЕЬсЪдс^ааЬ ЬдасееЪЪдР ЕдЬсеессГа ааЕЪЕдЕсаЬ ЬЕсЪЕддЕЕЕ аЪЫдесЪса БсЬдсаассЕ аЪсассадаЕ аааадааа1-£ ЪсаадаасЬд сЪсадаадад скссЬЬдссс саРсЕсссЕГ адъдсЕадса ддсддсасад адсЬддааса адсддссЬдЬ ассЬасаЕсЬ сссаададсЬ ддасссЪссд сссдаддЪда ЬддЦасдРдд аасадсасср ааддадбаса адсааддсса дадаЬдасса аЪсдссдГдд дЬдс^ддаса Еддсадсадд асссадаада сдсСдаЪсад дЕдссССссЬ аЬЬдсаЬсдс адсааддддд дсЪЪсСдадд ддсдсаЬСаа дсссЕадсдс ссссдЕсаад сЪсдасссса асддРЬРСЬс аседдаасаа аЪЬЬсддссЪ СдЪддааЬдЪ ЬдсааадсаЪ саддсада.ад сЕссдсссаЬ Еааьрььсее адЬдаддадд ссаЬЪЕЬсдд даРГдсасдс аасадаса.аЬ ЪРсЬГГЬСдЬ ддсЪаЪсдЪд аадсддда.ад ассЬРдсР.сс ЕЕдаЪссддс сЪсддаЪдда сдссадссда ЕдасссаЪдд ЕсаЪсдасЪд дЕдаЪаЬЬдс ЬсдссдсЬ.сс сдддасЬсЬд сдаЪЬсса.сс сЪддаЬда.Ес ЕаСЕдсадсЪ аЪЬЬЬЕСЕса сЕдЬаЬассд дкдаааЪЪдЬ ассаЪдааса сдадсаЬдСа асасадасас даедссыхь дЪдеераааа дЕЬсдЕдаЬс аЬЕаасаЕЕа ддсасдЬсад ЬаЪдаЪдааа сЬсаааЪдсЕ адддЕЕдЪЕс ддададдЬЕЬ Ьс^ааеЪдЪд ЬдсЬаЬддсд ЕсЕЕЕЕдЕад дсЬдаЪРаЁа аддаасаЪЪд ддсаадсЬЕа сс^Едсассс асПасРддса дсассддсса ааЕЪСГааЬС саассаЕЪЕс аааасаСсЪд ссЦддаасаа дЪЪЪсЬасад аасааЕдЕаЬ ЪаЪдадЪдсд ЬЬасдЬадЬа ЬсааЬРдсЬЬ асадаадЕаа ддадаЪЕсЪа ааЪсдЕдсас саадЕсааас саааЪаЪЬас ааЕааддЬда аЬЬааЬдсЬа сЬдсЬсасЬд дсЪддаЬдда ЪаЬаддЕЕса дссаассааГ дсаЬЬдддса ааасаасЕЕа сЬПдаЕааад сЬ-ЬсааассГ сЦЬдсЬдсЪа ддааадддсЦ са!:дЪсасдЬ дааддсааад аНЬасасада ддаааЕЪдЕд дадсЬЕдасЕ дЕЕдаЕРСЕд дассдссЕса ддааааЬаЬд даГсЬдааЪд ЕЕЪааддЬдд аксаЕссЕса ссаадддссс ссдсссЬддд дсддсдссрх асадссЬдад дсаасдЕдаа дсдасаадас ЪдЪРссЬдРЬ ссЕдсдЕддГ асддсдЬдда ассдддЕддЪ адЬдсааддЬ адддссадсс адаассаддЕ адЬдддадад дсдасддсад дсаасдЦдеь дссЪдадссС ссЬсдасЬде Ъдассс^дда а'ЬЬдЪсЬдад аддаЬЬддда сддааадаас дсдсддсддд ссдсЕссЬЪЕ сБсЕаааЬсд ааааасЫзда дсссРЬЬдас сасЬсаассс аЪЪддЬЬааа дЪдесадЫза дсаесЬсааГ: ЕаЕдсааадс сссдссссЕа ЬаЕЬСаЬдса сЪРРРЬЬдда аЪсЬдаЬсаа аддЪЕсЕссд сддсЪдсЪсР саадассдас дсЪддссасд ддасЬддсСд Цдссдадааа ЬассЦдссса адссддЪсЬЪ асЪдЪЬсдсс сдаСдссЕдс ЪддссддсЬд ЕдаададсЪЬ сдаЬЬсдсад дддСЬсдааа дссдссЬЬсЬ сессадсдсд СаЬааЬддЬЪ сЬдсаЬЬсСа ЬсдассЪсЪа ЕаЪссдсЕса

1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400

- 47 017203 сааЬЬссаса саасаЕасда дссддаадса ЬааадЬдЬаа адссбддддб дссбааЕдад 8460 ЪдадсЕаасЕ сасаЕРааЕЬ дсд1ХдсдсХ сасЕдсссдс ШХссадксд ддааассХдЪ 8520 сдЕдссадсЬ дсаЪЕаабда аЪсддссаас дсдсддддад аддсдд1ХГд сдРаРкдддс 8580 дсбсббссдс ССссСсдсбс асбдасЬсдс ЕдсдсХсддЪ сдРЬсддсОд сддсдадсдд . 8640 Ьабсадсбса сЬсаааддсд дкааРасддЕ кабссасада аСсаддддаЬ аасдсаддаа 8700 адаасаьдкд адсааааддс садсаааадд ссаддаассд Гаааааддсс дсдккдсХдд 8760 сдЪ1Х1Хсса СаддсСссдс сссссбдаад адсаЕсасаа аааЕсдасдс СсаадЕсада 8820 ддГддсдааа сссдасадда скаЕааадаГ ассаддсд(Х РсссссХдда адсХсссХсд 8880 Ьдсдсксбсс Едккссдасс сСдссдсбка ссддаЕассЬ дкссдсс!Хй сксссСЬсдд 8940 даадсдрддс дсЯГЕсСсак адсСсасдсБ дСаддЕаБсЕ садЬРсддЬд ЪаддксдЬХс 9000 дсХссаадсХ дддсХдСдкд сасдаасссс ссдССсадсс сдассдсЪдс дссРбаЬссд 9060 дЬааскаксд ЬсХЪдадйсс аасссддЕаа дасасдас!Х аксдссасЬд дсадсадсса 9120 сЕддбаасад даГХадсада дсдаддРаЪд ЪаддсддЬдс СасададЬкс ЪЕдаадЬддЕ 9180 ддссЬаасСа сддсСасасС адаадаасад еаЪЬРддкаЬ сЕдсдсЕсЕд сЪдаадссад 9240 ЬЪассХксдд ааааададкЬ ддРадсЬсХЪ даЬссддсаа асааассасс дсХддЪадсд 9300 д!Х1Х1ХЬд11 ЪЬдсаадсад садаЕЕасдс дсадаааааа аддаЪсХсаа даадаЪссЪЪ 9360 кда£с!Х!Хс ЬасддддЪсХ дасдсРсадр ддаасдаааа сЬсасдЬЪаа ддда!Х1Хдд 9420 ЬсаЬдадаЫ: аЬсааааадд а + сХгсассХ адакссХРХЬ аааЬХааааа ЕдаадЕЕЬЬа 9480 аа+сааБсЕа аадЬаЬаРаЬ дадРааасЬБ ддГсХдасад ЩассааЬдс ЕЪааисадСд 954 0 аддсассХаЕ сХсадсдаЪс ЬдЬсХаЬЪЪс дРЪсаЪссаЬ адЬЬдссХда сХссссдбсд 9600 ЕдЬадаЕаас ЬасдаЕасдд дадддсХЪас саГсХддссс садЬдсХдса аЕдаЪассдс 9660 дадасссасд (ХсассддсХ ссада1ХЪаР садсааЪааа ссадссадсс ддаадддссд 9720 адсдсадаад СддСссХдса асХЬЬакссд ссХссаксса дбсХа(ХааЪ £д!Хдссддд 9780 аадсхададЕ аад£ад!Хсд ссад1Хааха дбббдсдсаа сдССдЬЬдсс аГХдсХасад 9840 дсаксдСддС дБсасдсХсд Ъсдб1ХддРа СддсХЕсаТХ садсХссддЕ ЕсссаасдаЕ 9900 сааддсдадС ЕасакдаСсс сссаСдЕЪдк дсаааааадс дд!ХадсХсс !ХсддСссХс 9960 сдаксд!ХдЕ садаадЕаад 1Хддссдсад Ед!ХаЕсасХ са£дд!ХаСд дсадсасХдс 10020 аГааЬЬсХсХ СасХдЕсаСд ссаРссдЕаа даЕдсЫХЕс ЪдЪдасЬддЬ дадбасХсаа 10080 ссаадЪсаЬЪ сХдадаакад ЕдРаЕдсддс дассдадЕЪд сЬсХЕдсссд дсдЬсааЬас 10140 дддакааЬас сдсдссасаС адсадаасСХ РаааадРдсХ саЪса!Хдда ааасд1Хс*Х 10200 сддддсдааа асХсХсаадд аРсХСассдс Сд!ХдадаЬс сад!ХсдаСд СаасссасХс 10260 дкдсасссаа сХдаРсХкса дсаГсХЕГХа сХГХсассад сдЩХскддд Сдадсааааа 10320 саддааддса аааЪдссдса ааааадддаа Ьаадддсдас асддаааЬдЬ ЪдааЬасХса 10380 ЬасЬсЪ-ЬссЬ ЕЫХсааЪаЬ ЕаЕЕдаадса МХаБсаддд (Ха^ХдЕсХс аЪдадсддаЪ 1044 0 асаЬаЫХда акдеаЫХад аааааЬааас аааЬаддддк Ьссдсдсаса ЩХссссдаа 10500 аадЬдссасс Едасд 10515

5Е0 ΙΡ N0:142

ЕсдасддаРс дддадаЪсХс ссдаЪссссХ аЪддЪдсасХ сЪсадЕасаа ЪсХдсХсХда Цдссдсакад ЬЕаадссадЪ аГсХдсХссс ЪдсГХдРдСд 1Хддадд£сд сХдадГадед сдсдадсааа аЬЪХаадсХа саасааддса аддсХРдасс дасаа!Хд!Х ааСЬаасаЬд аадааксХдс !Хаддд1Хад дад£Х!Хдсд сХдсХГсдсБ аддЪддЪсаа Ра!ХддссаЁ. ЬадссакакХ а£Хса(ХддС ЪаЕаЪадсаС аааРсааРак СддсХа!Хдд сса!ХдсаЪа сдРХдЬаРсс аРаЪсаЬааЕ аЪдкасаЪГХ аЬаРЬддсХс акдЪссааса ЬРассдссаС дЕЪдасаЬЬд а!Ха1ХдасХ ад!Ха1ХааЪ адРааЬсааЕ ЪасддддЬса !Хад!ХсаЕа дсссаЪаБаС ддадСЪссдс дЪЪасабаас ЬСасддЪааа ЕддсссдссС ддсХдассдс ссаасдассс ссдссса1Хд асдгсааьаа РдасдПаГдЕ ЕсссаЬадЬа асдссааРад ддасЫХсса !Хдасд£саа ЬдддСддад-е аМХасддба аасХдсссас СРддсадеас абсаадЪдРа ЬсаГаРдсса адЬасдсссс сХаЪрдасдС сааСдасддЬ аааЬддсссд ссХддса!Ха кдсссадСас абдассХСа-Ь дддасХ!Хсс СасХЪддсад РасаксХасд еаГХадРсаБ сдсХа(Хасс акддСдардс ддЫХРддса дГасаСсааЬ дддсдЬддак адсддШХда сХсасдддда РЬЬссаадЪс ЬссассссаЬ ЬдасдЬсааЬ дддадЫХдЬ СГХддсасса аааЬсаасдд дасЫХссаа ааРдРсдбаа саасХссдсс ссаСЪдасдс аааСдддсдд ЬаддсдРдЪа сддкдддадд СсХаЬаРаад сададсХсдС £ХадЪдаасс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 дЬсадаЪсдс сХддадасдс саГссасдсХ д!ХГХдассХ ссаЪадаада сассдддасс1020 дабссадссХ ссдсддссдд даасддЬдса {ХддааЕсда РдасХсЕс!Х аддЬадссХб1080 дсадаадкРд дРсдСдаддс асХдддсадд Раадраксаа ддЬСасаада саддЬХЬаад1140 дадаЬсааРа дааасХдддс ИЬдЪсдадас ададаадасХ сХСдсдГХЬс ЬдаСаддсас1200 сЬаСРддЬсЬ ЦасХдасаЪс сасЫХдссЪ ЬЬсХсХссас аддРдЬссас ЬсссадЬЬса1260 а!ХасадсХс дссассаСдс ддсХдсссдс ссадсХдсХд ддссХЪсбса ГдсЬдЪдддЬ1320 дсссдссХсд адаЬсХаСсд аЪдсаРдсса ЬддЬассаад сХСдссасса Сдадсадсад1380 сЕсХЪддсЬд «ХдсХдадсс ЬддЪддссдЬ дасадссдсс сададсасса Ьсдаддадса1440 ддссаадасс ЬЬссЬддаса адЬЪсаасса сдаддссдад дассХд1ХсХ ассададсад1500 сс+ддссадс ЪддаасХаса асассаасаЬ сассдаддад аасд+дсада асаЬдаасаа1560 сдссддсдас аадЬддадсд ссЪЪссХдаа ддадсададс асасХддссс адаЬдЬассс1620 ссЪдсаддад абссадаасс ЬдассдГдаа дсЬдсадсЬд саддссседс адсадаасдд1680 садсадсд+д сХдадсдадд асаададсаа дсддсХдаас ассабссХда асассаЬдЬс1740 сассаЬсХас адсассддса аадЪдСдсаа ссссдасаас ссссаддадб дссХдсХдсХ1800 ддадсссддс сЬдаасдада СсаЪддссаа садссХддас Насаасда.дс ддсХдСдддс1860 сХдддададс Ьддсддадсд аадЪдддсаа дсадсЪдсдд ссссХдЪасд аддадЪасдЬ1920 ддкдсХдаад аасдадаЬдд ссадддссаа ссасХасдад дасЬасддсд асХасХддад1980 аддсдасХас даадЪдаасд дсдЪддасдд сЬасдасХас адсададдсс адсЬдаЪсда2040 ддасдбддад сасасс!Хсд аддадаЬсаа дссЬсХдЬас дадсассСдс асдссЪасдЬ2100 дсдддссаад сбдаЬдаасд ссХассссад сХаса^садс сссаЬсддсХ дссХдсссдс2160 ссассХдсЪд ддсдасаЬдЪ ддддссддЪЬ сХддассаас сХдЬасадсс ЪдассдЬдсс2220 сХЬсддссад аадсссааса Ьсдасд^дас сдасдссаРд д+ддассадд ссЪдддасдс2280 ссадсддаЬс Ызсааддадд ссдадаад!Х сХСсдбдадс дбдддссбдс ссаасаЪдас2340 ссадддсЫХ Ьдддадааса дсаЬдсЬдас сдассссддс ааЪдЬдсада аддссд+дЬд2400 ссассссасс дссХдддасс едддсааддд сдас+Сссдд а+ссХда+дЬ дсассаааде2460 дассаЬддас дасХЬссХда ссдсссасса сдадаЬдддс саса+ссадС асдасабддс2520 сЬасдссдсс садсссХЪсс СдсЬдсддаа сддсдссаас дадддсшхс асдаддссдС2580 дддсдадаЬс: аСдадссСда дсдссдссас ссссаадсас сЪдаададса ЬсддссЬдсЬ2640 дадссссдас Сбссаддадд асаасдадас сдадаЬсаас ЪЬссХдсЬда адсаддсссХ2700 дассаЬсдЬд ддсасссСдс сс^ХсассЪа сабдсХддад аадЬддсдд-Ь ддабддЪдЪЪ2760

Ьаадддсдад аЬссссаадд ассад+ддаЪ даадаадбдд Ьдддадаеда адсдддадае2820 сдЬдддсдЬд дЬддадсссд Ьдссссасда сдадассЪас Ьдсдассссд ссадссХд<Х2880 ссасдЪдадс аасдасХасХ ссХЬсаЬссд дСасЪасасс сддассс+дЪ ассадЪЬсса2940 дЬЬссаддад дсссбдСдсс аддссдссаа дсасдадддс ссссбдсг1са адбдсдасаС3000 садсаасадс ассдаддссд дасадааасХ дЪЬсаасаЬд сХдсддсЪдд дсаададсда3060 дсссХддасс сХддсссХдд адаабдЬддЬ дддсдссаад аасаЁдааРд ЪдсдсссссХ3120 дсХдаасХас <Хсдадсссс Ьд!ХсассЪд дсХдааддас садаасаада асадсХбсдЬ3180 дддсХддадс ассдасХдда дссссХасдс сдассададс аЬсааадрдс ддаЬсадссЬ3240 даададсдсс сХдддсдаса аддссХасда дЬддаасдас аасдадасдЪ ассХдГХссд3300 дадсадсд+д дссХаЪдсса ЪдсддсадЪа с!ХссХдааа дЬдаадаасс адаЪдаЪссЬ3360 дгхсддсдад даддасдСда дадЪддссаа ссСдаадссс сддаесадсЬ ЪсаассссЪб3420 сдЬдассдсс сссаадаасд ЬдадсдасаЬ саЬсссссдд ассдаад+дд адааддссаЪ3480 ссддаЬдадс сддадссдда Ссаасдасдс с4ХссддсЬд аасдасаасЬ ссс+ддадеь3540 ссХдддсабс садсссассс СдддсссЪсс саассадссс сссдЬдадса ЬсбддсСдаС3600 сдЬдЪХддс дЪддЬдаЪдд дсдЬда+сдЪ ддЪдддаабс дЬдаЬсс+да ЪсЬТсассдд3660 саЬссдддас сддаадаада адаасааддс ссддадсддс дадаассссХ асдссадсаЬ3720 сдаЬаЪсадс аадддсдада асаассссдд сЪЪссадаас ассдасдасд Сдсадассад3780 сХЪсХдаЪаа ЬсХадаасда дсЪсдааЬбс даадс!ХсХд садасдсдЪс дасдЪсаЪаЪ3840 ддаЪссдаЬа ЪсдссдЪддс ддссдсассс адсдЬдЬЬса ЬсХсссссс сЬссдасдад3900 садсЬдаада дсддсассдс садсдЬддбд ЪдссЬдсХда асаасГХсХа сссссдддад3960 дссааддЬдс адбддааддЬ ддасаасдсс с+дсададсд дсаасадсса ддададсдЬд4020 ассдадсадд асадсаадда сЬссассХас адссЬдадса дсасссХсас ссХдадсаад4080 дссдасХасд адаадсасаа ддЪдРасдсс БдсдаддЬда сссассаддд ссХдадсадс4140 сссдЪдасса ададс(Хсаа ссддддсдад Ъд(Хаа£ада сЪЬаадЫХа аассдсХдаб42 00 садссХсдас Ъд£дсс1ХсХ адПЬдссадс сабсХдЬЬдЬ ЪЬдссссХсс сссдедссХЬ4260 ссХЬдасссХ ддааддЬдсс асХсссасЪд ЪссХХссХа аЬаааа+дад даааЬЬдсаЬ4320 сдсаЬЬдбсЪ дадЬаддЬдЪ саЬЪс-ЬаЬЬс ЬддддддЪдд ддЬддддсад дасадсаадд4380 дддаддаХд ддаадасааЬ адсаддсаЪд сХддддаЬдс ддЬдддсХсХ а£ддс1ХсХд444 0 аддсддааад аассадсХдд ддсХсХаддд ддЬаЪсссса сдсдсссЪдС адсддсдсаЬ4500

Ьаадсдсддс дддбдРддСд дЫзасдсдса дсдбдассдс ЬасасГХдсс адсдсссХад4560

- 48 017203 сдсссдсБсс аадсЬсЬааа ссаааааасС ССсдсссСЫз саасасСсаа ссЪаЫзддЪС СдСдСдСсад саСдсаСсСс аадСаЬдсаа саСсссдссс ССЫзаСЫзаС аддсССЬССЬ сддаСсСдаС СсСдаСсдаа ЪсдСдсСЬСс сдаСддЫзСс СссддаадСд СдсасадддС ддСсдсддад сссаССсдда ЬдсСдаЬссс сдсдсаддсЪ сдЬдсасдсд саСЬдасГдд сСддаддссд ддадсССдса сСаСсададс сдсааСсдСс ддссдСсЪдд сасСсдСссд сЪаЬдааадд сддддаСсСс СБасаааЬаа СадСЬдСддС ЪадсЬададс сасааЫзсса адСдадсСаа дЪсдЬдссад дсдсЬсССсс ддСаСсадсС ааадаасаЬд ддсдСЬЫзСс даддЬддсда сдСдсдсБсБ дддаадсдСд СсдсСссаад сддБаасСаС сасСддСаас дСддссСаас адССассССс сддЫзССЫзБ СССдаЬсЬСЬ ддЪсаБдада СаааСсааСс СдаддсассЪ сдСдСадаСа дсдадассса

ЫХсдсБЫзс ЬсдддддсЕс ЬдаБГзадддЬ дасдЫзддад сссЕаЬсЬсд аааааайдад ЪСадддЕдЪд ааБЪадБсад адсаЬдсаБс сЕаасСссдс дсададдссд ддаддссЬад садсасдБда аадЫзсдаса адсЪЬсдаЪд СасааадаСс сЕЬдасаСЬд дСсасдЫздс дссаЬддаЬд ссасааддаа саЬдЪдЬаЬс сБсдаБдадс даСЪЪсддсЬ адсдаддсда еддеЬддсБЕ ддаБсдссдс ЬСддБЕдасд сдаЪссддад ассдаЕддсБ адддсааадд ЫздддсЕБсд аЕдсБддадС адсааЪадса БЬдЬссааас ЪЪддсдсааЪ сасаасайас сБсасаЫзаа сЕдсаЬЬааЬ дсСЬссБсдс сасЪсааадд Едадсаааад сагаддсесс аасссдасад ссБдЫзссда дсдсЬЫзсЕс сБдддсЬдСд сдЬсЬЬдад-Ь аддаЬЬадса СасддсСаса ддааааадад дЪЫздсаадс БсЪасддддЬ ЫзаЪсааааа БааадЬаЪаЕ аБсксадсда асЬасдаЪас сдсЬсассдд

СддаЬаЪдСс СсддсасСЫз сдададссСд Сдааассдаа

ЪБсссБЬссБ ЫзсЬсдссас ссБЬБадддГ ЪссдаББЬад даЬддЬЬсас дЬадЕдддсс ессасдЬЪсЪ ЫзааЪадСдд дЬсЕаЕБсЬЪ ЪЪдаСБЕаСа сЬдаББЪаас аааааЬЕеаа дааадСсссс аддсСсссса саассаддСд СддааадСсс ЬсааБЬадсс адсаассаБа ссадССссдс ссаССсЬссд аддссдссБс ЬдссБсЬдад дсЬБЬБдсаа ааадсСсссд Сдааааадсс ЪдаасГзсасс дсдТзсЬссда ссСдаСдсад Еаддадддсд дЕЬаЬдЫзЬа дддааЕЬсад аадассБдсс сдаЪсдсЕдс ддссдаЕсЬЬ ЪсддЬсааСа сасЬасаЬдд асЪддсааас БдЬдаЬддас ЬдаЕдсИзБд ддссдаддас ссаасааБдБ ссБдасддас БдСБсдддда ЫзсссааСас дЬаЬддадса дсадасдсдс ддсЬссдддс дЪаЬаСдсЬс дсааССЬсда СдаСдсадсС ссдддасБдЬ сдддсдЬаса дБдкадаадЪ асБсдссдак ааСадсасдЬ дсБасдадаС дааЬсдПЫЬ ссдддасдсс ЕсЕБсдссса ссссаасССд ЬсасаааЬЪЬ сасаааЪааа ЕсаЕсааЬдС аЕсЕЬаЪсаЬ саЬддЪсаЬа дсЪдЬЫзссБ дадссддаад саБааадСдЪ ББдсдСТздсд сЪсасЬдссс дааЪсддсса асдсдсдддд СсасЕдасСс дсЪдсдсСсд сддЪааБасд дББаЬссаса дссадсаааа ддссаддаас дссссссБда сдадсаЬсас дасйаБааад аСассаддсд сссБдссдсБ БассддаБас аБадсЬсасд сБдЬаддЪай Сдсасдаасс ссссдБЕсад ссаасссддЪ аадасасдас дадсдаддСа ЪдБаддсддЬ сСадаадаас адСаЬЕЬддЬ ЫзддСадсЬс БЬдаБссддс адсадаЫзас дсдсадаааа сЬдасдсЕса дкддаасдаа ддаБсБЛсас сЬадаЪссЬЬ акдадБааас ЪЬддБсБдас БсБдесБаББ ЪсдБЪсаБсс дддадддсББ ассаЪсБддс сБссадаЫзБ аБсадсааЪа дЪЪсдссддс БдскХЕасдд аБсдсссЪда асЪсЫздЪЪс адддаЪЫзЕд сдсдааЬЪаа дсаддсадаа ссаддсХссс дЬсссдсссс ссссаСддсЬ сБаББссада ддадсБЬдСа дсдасдБсБд сСсЪсддадд сЪдсдддкаа дсаСсддссд ассЬа±Г:дса сЬдсссдсЕд адссадасда сдСдаЬЬСса дасассдСса Бдссссдаад ааЪддссдса даддСсдсса СасЪСсдадс сдсаБЬддЪс Ьдддсдсадд саааЪсдссс адЬддааасс ССсдаБСсса ддсЕддасда ЬСЕаСЬдсад дсаее±м:±с дЪсЬдЬаЬас дЪдсдааагс ааадссЬддд дсЬЫзссадЬ ададдсддЪЬ дЪсдССсддс дааСсадддд сдСааааадд аааааБсдас Б-ЬЬсссссЬд сБдБссдссЬ сЪсадЬБсдд сссдассдсе ЫзаЕсдссас дсСасададЪ аЕсЬдсдсСс ааасааасса аааддаесЬс аасБсасдЬЬ ЫзаааЬБааа адСЬассаае аБадЪЬдссБ сссадСдсБд аассадссад

БББссссдЕс	4620
сассксдасс	4680
ЬадасддЪББ	4740
сааасБддаа	4800
дссаЪЕЬсдд	4860
ЬЪсЪдЕддаа	4920
дСаСдсааад	4980
садсаддсад	5040
СаасСссдсс	5100
дасСааЬЕББ	5160
адБадЬдадд	5220
еаьссаеееь	5280
ЬсдадаадБС	5340
дсдаадааЬс	5400
аБадсЬдсдс	5460
сдсЪсссдаС	5520
ЬсЪсссдссд	5580
ЫзсЬдсадсс	5640
дсдддЕБсдд	5700
ЬаЪдсдсдаЪ	5760
дСдсдЬссдС	5820
ЬссддсассБ	5880
БаасадсддС	5940
асаГсББсББ	6000
ддаддсаЬсс	6060
БЬдассаасС	6120
дБсдаСдсда	6180
дсадаадсдс	6240
дасдссссад	6300
ссдссдссБС	6360
ЬссЕссадсд	6420
сЬСаБааЕдд	6480
сасБдсаСХс	6540
сдЪсдассЪс	6600
дЬЪасссдсЪ	6660
дЪдссСааЪд	6720
сдддааассЬ	6780
ЬдсдБаЪЬдд	6840
Ьдсддсдадс	6900
аЬаасдсадд	6960
ссдсдЪСдсЬ	7020
дсБсаадСса	7080
даадсЬсссЪ	7140
ССсСсссББс	7200
СдСаддБсдЬ	7260
дсдссЬСаСс	7320
Сддсадсадс	7380
ЬсБСдаадСд	7440
СдсСдаадсс	7500
ссдсСддСад	7560
аадаадаБсс	7620
аадддаСЬЬС	7680
ааС.даадСЬС	7740
дсББааСсад	7800
дасСссссдк	7860
сааСдаСасс	7920
ссддаадддс	7980

сдадсдсада ддаадсСада аддсаСсдбд абсааддсда СссдаСсдСС дсабааЕЪсС аассаадСса асдддабааЬ (зЪсддддсда бсдбдсассс аасаддаадд сабасЬсССс аЪасаЬаЕЕЬ аааадЪдсса адСддСссСд дбаадСадЫз дСдЬсасдсС дЫзасаЬдаС дЬсадаадСа сЫзасЬдСса ЫзсЬдадааС ассдсдссас ааас(зс1зсаа аасЬдаСсСС сааааЬдссд с(зС(зС(зсааС дааЬдСаСЫз ссСдасд саасСССаЪс сдссЬссаЬс сдссадССаа СадСССдсдс сдЬсдСЬЬдд СаСддсССса сссссаЬдГ.Ь дбдсаааааа адЬЬддссдс адСдЪСаСса СдссаСссдС аадаСдсССС адЬдЪаСдсд дсдассдадб аСадсадаас СССаааадЬд ддаСсССасс дсСдСЬдада садсаСсСЫ: ЬасСССсасс сааааааддд ааСаадддсд аССаССдаад саСЫзаСсад адаааааЬаа асаааЬаддд садСсСаССа аасдССдССд ССсадсСссд дсддССадсЬ сСсаСддССа СсСдЬдасСд СдсСсССдсс сЪсабсаССд СссадССсда адсдЪЪЬсЕд асасддаагЛ ддССаССдСс дССссдсдса аЪЪдЫздссд ссаЬбдсЬас дЫзсссаасд ссЫзсддбсс ЬддсадсасЬ дЬдадЪасЬс сддсдЪсааб даааасдЬЬс Ъдбаасссас ддЬдадсааа дЬЬдааЪасЬ СсаСдадсдд саЫзЬссссд

8040

810 0

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8777

5Е0 ΙΡ N0:143

ЬсдасддаЬс ЬдссдсаСад сдсдадсааа аадааЬсбдс СадссаСаЫз сдССдЬаСсс дССдасаССд дсссаСаСаС ссаасдассс ддасЬЫзсса аЬсаадСдЬа ссСддсаССа СаССадСсаС адсддСЫзда Ыз(зддсасса аааСдддсдд дЬсадаЬсдс дабссадссС дсадаадССд дадаЬсааСа сСаССддСсС аССасадсСс СсссддсдСс садсСсЬСдд дсаддссаад садссСддсс саасдссддс сссссЬдсад сддсадсадс д(зссасса(зс дсСддадссс ддссЬдддад сдЬддСдсСд дададдсдас сдаддасдЪд сдСдсдддсс сдсссассСд дсссССсддс сдсссадсдд дасссадддс дСдссасссс дддадаСсЬс ССаадссадС аЬЬСаадсСа ССадддССад аССсаССддС аСаСсаСааС аССаССдасЬ ддадЪЬссдс ссдсссаССд ЬЬдасдСсаа СсаСаСдсса СдсссадСас сдсЬаССасс сСсасдддда аааСсаасдд СаддсдЬдЬа сЪддадасдс ссдсддссдд дЬсдСдаддс дааасСдддс СасСдасаСс дссассаСдс СсдадаСсСа сбдсЬдсСда ассССссЬдд адсСддаасС дасаадЬдда дадаЬссада дСдсСдадсд Сасадсассд ддссСдаасд адсСддсдда аадаасдада СасдаадСда дадсасассС аадсбдаСда сСдддсдаса садаадссса аСсССсаадд ССССдддада ассдссСддд ссдаСссссЬ аСддСдсасЬ аСсСдсСссс СдсЬСдСдСд саасааддса аддсССдасс дсдЪСССдсд сСдсССсдсС СаСаСадсаС ааабсааСаЪ абдСасаССС аСаССддсСс адСЪаССааС адСааСсааС дССасаСаас ССасддСааа асдСсаабаа СдасдСаСдС ЬдддЬддадС аЬЪЬасддСа адЬасдсссс сСаССдасдС аСдассССаС дддасСССсс аСддСдаСдс ддЬСССддса СССссаадСс ЬссассссаС дасСССссаа ааСдбсдСаа сддЬдддадд СсЬаСаЬаад сабссасдсС дССССдассС даасддЬдса ЬСддааЬсда асСдддсадд СаадСаСсаа ССдЪсдадас ададаадасС сасСЬСдссЬ ССсЬсСссас ддССсСссдс СсадсСдсСд СсдаСдсаСд ссаСддбасс дссЪддСддс сдСдасадсс асаадЫзсаа ссасдаддсс асаасассаа саЬсассдад дсдссСЬссЪ дааддадсад ассЬдассдС даадсСдсад аддасаадад саадсддсЬд дсааадСдСд саассссдас адаСсаСддс саасадссСд дсдаадЬддд саадсадсЪд Сддссадддс саассасСас асддсдЬдда сддсЬасдас СсдаддадаЬ саадссСсСд асдссЬассс садсСасаЬс СдСддддссд дССсСддасс асаСсдасдЬ дассдасдсс аддссдадаа дССсСЬсдСд асадсаСдсб дассдасссс ассСдддсаа дддсдасССс сСсадЕасг1а ЫзддаддСсд дасааЪЪдСЬ аддЬддЬсаа ЪддсСаЬСдд аЬдЬссааса ЬасддддСса ЬддсссдссЪ ЬсссаЬадСа аасЬдсссас сааЪдасдде ЬасЬеддсс1д дЬасаСсааЬ ЪдасдЬсааб саасЬссдсс сададсбсдЬ ссаЪадаада ЬдасЬсбсСЪ ддЪЪасаада сЫздсдЫзЪс аддбдбссас ддссЬЬсбдд аадсЬСдсса дсссададса даддассЬдЪ дадаасдЬдс адсасасЪдд сЪдсаддссс аасассаЬсс аасссссадд дасЬасаасд сддссссбдС даддасСасд Еасадсадад Ъасдадсасс адссссаЪсд аассСдСаса аСддЬддасс адсдЪдддсс ддсааСдСдс сддаЬссЪда

СсСдсСсЬда сСдадЬадСд ааЪЪаасаЬд СаССддссаЬ ссаССдсаСа ССассдссаС ЬЬадСЬсаЬа ддсСдассдс асдссааСад СЬддсадСас аааЬддсссд СасаСсСасд дддсдЪддаЬ дддадСССдС ссаЬЬдасдс ЬСадСдаасс сассдддасс аддЬадссСС саддСССаад ЬдаСаддсас СсссадЬЪса СдсСдСддаС ссаЬдадсад ссаЬсдадда СсСассадад адаасаЪдаа сссадаСдСа Ъдсадсадаа ЬдаасассаС адСдссСдсС адсддсСдЬд асдаддадЬа дсдасЬасЬд дссадсЬдаЬ СдсасдссСа дсЬдссСдсс дссбдассдС. аддссСддда СдсссаасаЪ адааддссдС ЬдСдсассаа

120

180

240

300

360

420

480

540 600 660 720 780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460

- 49 017203 адСдассаЕд дасдасЬСсс Едассдссса ссасдадаЕд ддссасаСсс адСасдасаЕ 2520 ддссЕасдсс дсссадсссЬ ЕссЕдсЕдсд даасддсдсс аасдадддсЕ СЕсасдаддс 2580 сдЬдддсдад аксакдадсс Ьдадсдссдс сасссссаад сассЪдаада дсаЕсддссЕ 2640 дскдадсссс дасЬЕссадд аддасаасда дассдадакс аасЕЕссЬдс Едаадсаддс 2700 ссЕдассаЕс дкдддсассс ЬдсссЕЕсас сЬасаЬдсЬд дадаадЕддс ддЬддаЬддЬ 2760 дЬЕЕаадддс дадаксссса аддассадкд даЬдаадаад ЕддЕдддада Едаадсддда 2820 даксдЬдддс дЕддЬддадс ссдЕдсссса сдасдадасс ЕасЕдсдасс ссдссадссЕ 2880 дСЪссасдЕд адсаасдасЬ асСссЕЬсаЕ ссддЬаскас асссддассс ЬдкассадЪЕ 2940 ссадЪЕссад даддсссЬдЬ дссаддссдс саадсасдад ддсссссЪдс асаадЪдсда 3000 саксадсаас адсассдадд ссддасадаа асЕдЪЕсаас акдсСдсддс Едддсаадад 3060 сдадсссЕдд ассскддссс ЬддадааЕдЕ ддсдддсдсс аадаасаЕда аЕдЬдсдссс 3120 ссЬдсЬдаас ЬасССсдадс сссЕдЬЬсас сРддсЕдаад дассадааса адаасадсЬЬ 3180 сдЕдддсЬдд адсассдасЬ ддадссссЕа сдссдассад адсаЕсааад ЬдсддаЬсад 3240 ссСдаададс дссскдддсд асааддссЬа сдадСддаас дасаасдада ГдЕасскдЫ: 3300 ссддадсадс дЬддссЕаЕд ссаЬдсддса дЪасЬЬссЬд ааадСдаада ассадаЬдаЬ 3360 ссЕдЫхсддс даддаддасд ЕдададЕддс саассЬдаад ссссддаЕса дсССсаасСЛ 3420 сЪЕсдЕдасс дсссссаада асдЕдадсда сабсаГсссс сддассдаад Еддадааддс 3480 сакссддаЬд адссддадсс ддаЕсаасда сдссСЬссдд сЬдаасдаса асЕсссЕдда 3540 дЬСссЬдддс аЕссадссса сссЕдддссс Есссаассад ссссссдЕда дсаГсЕддсЕ 3600 дабсдЕдЕЕЬ ддсдСддЪда ЕдддсдЕдаЬ сдбддЪддда аСсдЕдгЛсс ЕдаЕсЕЕсас 3660 сддсаЕссдд дассддаада адаадаасаа ддсссддадс ддсдадаасс ссЪасдссад 3720 саЕсдаЬаЕс адсаадддсд адаасаассс сддсХЬссад аасассдасд асдЬдсадас 3780 садсГЕсЕда ЪааЬсЕадаа сдадсбсдаа ССсдаадсЕЕ сЕдсадасдс дЕсдасдСса 3840 СаЪддаЬссд аЕаЬсдссдС ддсддссдса ддссадссса аддссдсСсс садсдЕдасс 3900 сЕдЕЬссссс ссЪссЕссда ддадсЕдсад дссаасаадд ссасссЕддц дЦдссЕсаСс 3960 адсдасЕСсЕ асссЬддсдс сдЕдассдСд дссСддаадд ссдасадсад ссссдЕдаад 4020 дссддсдСдд адассассас ссссадсаад сададсааса асаадЕасдс сдссадсадс 4080 СассСдадсс Ьсасссссда дсадЕддаад адссассдда дсЬасадсЕд ссаддЬдасс 4140 сасдадддса дсассдЪдда даадассдкд дсссссассд адЬдсадсЕа акадасЕЕаа 4200 дЪЕЬааассд сЕдаЕсадсс ЕсдасЕдЬдс сЕЕсЪадЕЬд ссадссаЬсЕ дЕЬдЬЬЬдсс 4260 ссЕсссссдЕ дссЬЬссЕЕд ассскддаад дкдссасЕсс сасЕдЬссЕЕ ЬссЕааЕааа 4320 акдаддаааЬ ЕдсаЬсдсаЬ ЕдЬсЕдадЪа ддЕдЬсаЕЬс ЪаЪСсРдддд ддкддддЬдд 4380 ддсаддасад саадддддад даЬЕдддаад асааЬадсад дсаЬдскддд даЬдсддЬдд 4440 дсЕсЕаЬддс ЕЕсЕдаддсд дааадаасса дскддддсЕс ЕадддддЕа!: ссссасдсдс 4500 ссЕдЬадсдд сдсаСЕаадс дсддсдддЕд ЕддЕддЬЕас дсдсадсдЕд ассдскасас 4560 ЬЬдссадсдс сскадсдссс дсЕссЕЪЬсд сЬЬЬсЕЕссс ЬЬссЕЕЕсЕс дссасдЪЕсд 4620 ссддсЕЕЕсс ссдЬсаадсЕ сЬаааЕсддд ддсЕсссЬЕЕ адддСЕссда ЕЬЕадЕдсЕЬ 4680 ЬасддсассЬ сдассссааа ааасЬСдаЕЬ адддкдаЪдд ЬЪсасдЕадЕ дддссаксдс 4740 ссЬдаЕадас ддЪСЕЕЕсдс сссыздасде ЕддадЕссас дЕСсЬСЕааъ адЬддасЪсЬ 4800 ЕдЕЕссааас Еддаасааса сЕсаасссЬа ЕсксддЬсЕа ЬЬсСХЬЕдаЕ ЪЕаЕааддда 4860 еьссддссаЬ ЬЬсддссСаС ЕддЬСааааа аСдадсЬдае ССаасааааа ССХаасдсда 4920 аЕЬааЪЬсЬд ЕддааЬдЕдЕ дЪсадЕЪадд дЕдЕддааад ЬссссаддсЕ ссссадсадд 4980 садаадЬаЕд сааадсаЕдс аЬсЬсааЕЬа дЬсадсаасс аддЬдЬддаа адЬссссадд 5040 сСссссадса ддсадаадЕа СдсааадсаЬ дсаЪсЕсааЬ ЕадЬсадсаа ссаЕадЕссс 5100 дссссЕаасЕ ссдсссаЕсс сдссссЬаас ЕссдсссадЪ ЕссдсссаЕЕ сЕссдсссса 5160 ЕддсЕдасЕа аЕСЕГХГХЕа ЕЬЬаЬдсада ддссдаддсс дссесПдссЬ сЕдадсЕаЕЪ 5220 ссадаадЬад СдаддаддсГ ЬЬИГХддадд ссГаддсЬЕЕ Едсааааадс Ьсссдддадс 5280 ЕЕдЬаЪаЬсс аЕГХЬсддаЬ сЕдаЕсадса сдбдаЦдааа аадссЕдаас Ьсассдсдас 5340 дЕсЕдСсдад аадСЕЕсСда ЬсдаааадЫ; сдасадсдЕс ЪссдассЕда ЕдсадсЕсЕс 5400 ддадддсдаа дааЬсЬсдЬд сЬЕЬсадсЬЕ сдаЕдЬадда дддсдЪддаЕ аЕдЬссЕдсд 5460 ддЕаааЬадс ЕдсдссдаЬд дЪЕЪсЬасаа адаЬсдЬЕаЪ дЪЬЕаЬсддс асЕЬЕдсаЕс 5520 ддссдсдсЕс ссдаЬЬссдд аадЬдсЕЬда саЕЬддддаа ЬЬсадсдада дссЕдасска 5580 ЕЕдсаЕсЬсс сдссдЕдсас адддЪдЕсас дРЪдсаадас сЬдссЪдааа ссдааскдсс 5640 сдсЬдЕЪсЕд садссддбсд сддаддссае ддаСдсдаЬс дсЕдсддссд аЕсЕСадсса 5700 дасдадсддд ексддсссаР Рсддассдса аддааЕсддР сааСасасЕа саЬддсдЬда 5760 ЬЬСсаЕаСдс дсдаЬЬдсСд аЬссссаСдЬ дЪаксасЬдд сааасЪдЕда Еддасдасас 5820 сдЕсадСдсд ЬссдЬсдсдс аддсЕсЬсда СдадсЬдаЬд сЕСЕдддссд аддасЕдссс 5880 сдаадЕссдд ссдсаСааса сдссаасаЕс сдадсддадд ЬддЕсЕЪдас дсадддЕсда сдсссдсада ааассдасдс ЪЪссассдсс даСдаЕссЕс ЪдсадсЬЕаЕ ЕСЕСЬсасЕд СаЕассдЬсд аааГХдЪЕае сЕддддЕдсс ссадьсддда сддЕЬЬдсдс ЕсддсЕдсдд аддддаЬаас аааддссдсд ЕсдасдсСса сссЕддаадс сдссЬЕЪсЕс ГСсддЕдСад ссдсЕдсдсс дссасЕддса ададСЕсЕЕд сдсЕсЕдсЕд аассассдсЕ абсЕсаадаа асдбЬааддд ЕСаааааЕда ссаасдсСЕа СдссЕдасЕс сдсЬдсааЕд дссадссдда ЪаЬСааЬЪде ЪдЕЪдссаЕе сЕссддеесс ЕадсЬссЕЛс ддЕЕаСддса дасЕддЕдад ЕЕдсссддсд саЕЕддаааа ЪЬсдаЪдЬаа ЕЕсЕдддЕда даааЕдЕЕда СЕдЕсбсаЦд дсдсасаЕЕЬ сассСсдЕдс дсддСсаЬЦд ЕЕсЕЕсЕдда саЕссддадс саасЕсЕаЬс Едсдасдсаа адсдсддссд сссадсасцс дссЫхсСаСд садсдсдддд ааСддЕЕаса саЕСсЕадЕЕ ассЕсЕадсЕ ссдсЕсасаа ЕааСдадЪда аассЕдЬсдЕ аЬЕдддсдсЬ сдадсддЕаС дсаддааада ССдсЕддсдЬ адЪсададдЕ ЬсссСсдЬдс ссСЕсдддаа дСсдЕСсдсС ЬЪаЕссддЕа дсадссасЕд аадЬддбддс аадссадЕЬа ддЦадсддЪЕ даЕссССЕда аЕСССддСса адЕЕЕЕаааЪ аЕсадЕдадд сссдПсдЕдЕ аЕассдсдад адддссдадс едссдддаад дсЕасаддса саасдаЪсаа ддСссЕссда дсасЕдсаЕа ЬасЬсаасса ЕсааЕасддд сдЬЕсЕЕсдд сссасЕсдЦд дсааааасад аЪасЕсаЕас адсддаЬаса ссссдаааад асдсддаЕСЕ асЕддадсда ддссдЕддЬЕ ЪСдсаддаЕс ададсЕЕддЬ СсдЬссда-Ьс ЬсСддассда дЬссдадддс аааддЕСддд аЕсЕсаЕдсЕ ааЕааадсаа дЕддЕЕЕдЕс ададсЬЕддс ЕЕссасасаа дсЕаасСсас дссадсЬдса сбЬссдсЬЕс садсЕсасЕс асаЕдЕдадс ЕСЕСссаЕад ддсдааассс дсЬсСссСдЦ дсдЬддсдсЕ ссаадсЕддд асЕаЬсдбсЬ дбаасаддаЬ сЕаасЬасдд ссЕЕсддааа СбЦЦЬдЪБЕд есСЬЕЕсЕас ЬдадаЕСаЬс сааЕсПааад сассбаЬсЕс адаЪаасЕас асссасдсЕс дсадаадЕдд сСададЕаад ЕсдЪддЕдЕс ддсдадЕЕас ЕсдЪЕдЕсад аЕЪсЕсЕЕас адЕсаЕС-сЕд аЕааЪассдс ддсдаааасЕ сасссаасЕд дааддсаааа ЕсСХссСЕЕС ЬабЪЕдааЪд ЬдссассЬда сддсбссаас ддсдаЕдЪЕс ддсЕЕдЕаЬд дссдсддсЕс ЕдасддсааЕ сддадссддд СддсБдбдЬа аааддаабад сЕЕсддааЕс ддадСЕсЕЕс ЕадсаЕсаса сааасЬсаЕс дЕааГсаЬдд саЕасдадсс аЪСааЪЬдсд ЬЬааСдааЕс сСсдсбсасС аааддсддЬа ааааддссад дсЕссдсссс дасаддасЕа СссдасссЕд ЬГсЕсаЕадс сЕдЕдЕдсас ЬдадЬссаас Ьадсададсд сЬасасЕада аададЬЕддЕ саадсадсад ддддСсЕдас аааааддаЕс ГаЕаЕаСдад адсдаЪсЕде дабасдддад ассддсЕсса ЬссЕдсаасЕ ЕадЕСсдсса асдсЕсдЕсд аЕдаЬссссс аадбаадЪЕд ЕдЬсаЕдсса адааЕадЕдЕ дссасаЬадс сЕсааддаЬс аЕсЬЬсадса Едссдсаааа СсааГаЬЕаС баСЫзадааа сд ааЕдЕссСда ддддаЕЬссс дадсадсада сдддсдЕаЪа ЕЕсдаЬдаСд асЕдЕсдддс даадЪасбсд сасдЬдсЬас дЕЕЕЕссддд дсссасссса ааСЬСсасаа ааЕдСаСсЕЕ ЕсаСадсЬдС ддаадсаЕаа ЕЕдсдсЬсас ддссаасдсд дасЕсдсЪдс аЪасддЕЕаЕ сааааддсса ссЬдасдадс ЬааадаЕасс ссдсЬЕассд ЕсасдсЪдба даассссссд ссддЕаадас аддЪаЕдЕад адаасадбаЬ адсЕсЕЕдаЬ аЬЕасдсдса дсЕсадЬдда СЕсассЕада ЕааасССддС сЬаЕЕЕсдЕЕ ддсЬЕассаЬ даЬЕЕаЕсад СЕаЕссдссЪ дЕЕааЬадЕЕ ЕЬЕддЕаЬдд аЬдЬЬдбдса дссдсадЕдЬ ЕссдЬаадаС аЬдсддсдас адаасЦЦЦаа СЕассдсСдЬ ЕсЕЕЕЕасЕЕ аадддаабаа Ьдаадсасхс ааьаааса.аа сддасаабдд ааЬасдаддЕ сдсдсЕасЕЕ ЕдсЪссдсаЕ садсЕЬдддс дЪасасаааЕ ссдаЪадбдд дадаЕЪЕсда асдссддсЪд асЕЕдЪСЬаЬ аЕааадсаЪЕ аЬсаЕдЕсЕд ЦбссСдЕдЬд адЕдЪааадс ЕдсссдсЬЫ: сддддададд дсЕсддЕсдЪ ссасадааЕс ддаассдЕаа аСсасааааа аддсдЕСЕсс даЕассЕдГс ддбаЦсЬсад БЪсадсссда асдасСЪаЕс дсддЕдсЪас ЕЕддЕаЕсЕд ссддсаааса дааааааадд асдаааасСс ЕссЕЬЕЬааа сЕдасадЬСа саЬссаЕадЕ сЦддссссад сааЕааасса ссаЕссадЕс ЬдсдсаасдС сЪЪсаЕСсад ааааадсддЬ ЕаЕсасЬсаЕ дсГЛЪЪсЬдЬ сдадЬЬдсбс аадЕдсЕсаЬ ЕдадаЕссад ЕсассадсдЕ дддсдасасд аЬсадддССа ЪаддддЕЕсс

5940

6000

6060

6120

6180

6240

6300

6360

6420

6480

6540

6600

6660

6720

6780

6840

6900

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8792

5Е0 ΙΡ N0:212 даддЕссадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсСдад дЪдаадаадс сЕддддссЕс адЕдааддЪс ЪссЬдсаадд сЕСсЕддд1:а сассЕЕсасс ддсЬасСаЪд ЕдЕас1:дддЬ дсдасаддсс ссСддасаад ддсЕЕдадСд даЕдддаГдд аСсадсдсЕЕ асааЪддЪаа сасааасЕаС дсасадаадЬ Ессадддсад адБсасдаББ ассдсддаса ааСссасдад сасадссЬас аЪддадсЕда дсадссЬдад аЕсСдаадас асддсЬдЬдЕ аЪЪасЬдСдс дадаадСада

120

180

240

300

- 50 017203

- 51 017203

- 52 017203

- 53 017203

- 54 017203

Т Μ V Т V £	3 5 А 3 Т К	6 Р 3 V Р 1	? Ь А Р 5 3	К 3 Т 3 <3 (	3 Т А А Ь Θ	С	р	V К	Э
Υ Р Р Е Р 1	Ζ Т V 5 И N	3 <3 А Ь Т £	3 (3 V Н Т Р	Р А V Ь 0 £	3 3 0 Ь Υ 3	Ь	3	3 V	V
ТУРЗЗЗЬСТОТ	ΥΙΟΝΥΝΗΚΡΒΝ	ТКУРККУЕРКЗ	С	Р	К Т	Н
Т С Р Р С I	? А Р Е Ь Ь	С С Р 3 V I	? Ь Р Р Р К	ΡΚΡΤΣΜΙ3ΚΤΡ	Е	V	т С	V
УУРУЗНЕРРЕУ	κΡΝΜγνρονεν	Η N А К Т 1	< Р К Е Е 0	Υ	N	3 т	Υ
К V V 3 V I	3 Т V ь н 0	Р Н Ь N <3 I	< Е Υ К С К	V 3 N К А I	Р А Р I Е	К	Т	I 3	к
ΑΚαΟΡΚΕΡΟνΥ	ТЬРРЗКЕЕМТК	Н<2У5ЪТСЬУК<3	Р	Υ	Р 8	Ό
ХАУЕИЕЗИСОР	ΕΝΝΥΚΤΤΡΡΥΕ	Р 3 Р С 3 I	? Р Ь Υ 8 К	ь	т	V Р	К
3ΚΗ00ΘΝνΡ50	5 V Μ Η Е 1	1 Ь Η Ν Η Υ	Т 0 К 3 Ь £	3 Ь 3 Р 0 К
ЗЕО ΙΡ N0:326
даааЬЬдЬда	едасдсадЬс	Гссаддсасс	сЬдЪсЪЬЬдЬ	сЬссадддда	аададссасс			60
сЬсЬссЪдса	дддссадЪса	дадбдЬЪадс	адсадсбасб	ГадссЪддЬа	ссадсадааа			120
ссбддссадд	сЬсссаддсЬ	ссбсабсЪаЪ	даСдсаЬсса	дсадддссас:	Ьдасабссса			180
дасаддЬЬса	дГддсадбдд	дГсГдддаса	дасЬГсасЬс	ЬсассаГсад	садасбддад			240
ссбдаадаЬЪ	ЪЬдсад-Ьдба	ЪЪасЬдбсад	садЦаЪддба	дсЬсасЬЬЬд	дасдЬСсддс			300
саадддасса	аддГддадаЬ	сааасдбдсд	дссдсассса	дсдЬдЪбса!:	сЪЪссссссс			360
Ьссдасдадс	адсЕдаадад	сддсассдсс	адсдбддбдС	дссбдсбдаа	саасЬбсЬас			420
ссссдддадд	ссааддбдса	дЬддааддЬд	дасаасдссс	бдсададсдд	саасадссад			480
дададсдЬда	ссдадсадда	садсааддас	ЪссассЬаса	дссЬдадсад	сасссЪсасс			540
с^дадсаадд	ссдасЪасда	даадсасаад	дЪдбасдссЪ	дсдаддЪдас:	ссассадддс			600
сСдадсадсс	ссдбдассаа	дадсъъсаас	сддддсдадб	дь				642
ЗЕО Ю N0:327
Е1УМТ03РОТЬ	ЗЬЗРОЕКАТЬЗ	С К А 3 ΰ £	3 V 3 3 3 Υ	ь	А	И Υ	0
0 К Р С 0 1	1 Р К. Ь Ь I	ΥΡΑ38ΚΑΤΡΙΡ	Р К Р 3 С £	3 <3 3 Θ Т Р	Р	Т	Ь Т	I
3 К Ь Е Р I	3 Р Р А V Υ	усооУбззьит	Р <3 0 (5 Т 1	< V Е I К К	А	А	А ₽	3
ν Р I Р Р ΐ	? 3 Р Е 0 Ь	КЗОТА;	3 V УСЫ	N N Р У Р I	ϊ Е А К V у	и	К	V Р	N
Ά10δ<3Ν30Ε3Υ	ΤΕ0Ρ8ΚΡ3ΤΥ3	Ь 8 3 Т Ь	Г Ь 3 К А Р	Υ	Е	К Н	К
V Υ А С Е Ί	7 Т Н О С Ъ	3 3 Р V Т !	< 3 Р N К 0	Е С
ЗЕО ΙΡ N0:328
даддбдсадс	ЬддЬададбс	ьдддддаддс	ЬбддЪасадс	сЬддддддРс	ссЬдадасЕс			60
Ьссбдбдсад	ссГсбддаСЬ	сасссГсадс	абсбаЬдсса	ЬдадсЬдддЬ	ссдссаддса			120
ссадддаадд	ддсЪддад'Ьд	ддбсбсадсб	аЬбадбадба	дЪддбдаЪад	сасабасбас			180
дсадасЬссд	бдаадддссд	дЬЪсассаЪс	Ьссададаса	асдссаддаа	сасдсГдЪаГ			240
сГдсааабда	асадЬсЬдад	адссдаддас	асддсЪдбд'Г	аГЬасГдЬдс	дададсдСаб			300
ддсЬасасдЬ	ГсдассссЬд	дддссаддда	асссЪддЬса	ссдЬсЪсдад	ЬдсЪадсасс			360
аадддсссса	дсдбдЕЬссс	ссбддссссс	адсадсаада	дсассадсдд	сддсасадсс			420
дсссЬдддсб	дссбддбдаа	ддасбасЬбс	сссдадсссд	ЬдассдЪдад	сЬддаасадс			480
ддсдссЬЬда	ссадсддсдб	дсасассЬЬс	сссдссдСдс	Ьдсададсад	сддссЬдЬас			540
адссГдадса	дсдбддЬдас	сдЬдсссадс	адсадссЬдд	дсасссадас	сЬасаЪсбдс			600
аасдбдаасс	асаадсссад	саасассаад	дбддасааас	дсдбддадсс	саададсГдс			660
дасаадассс	асассГдссс	ссссбдсссЬ	дсссссдадс	ГдсЬдддсдд	асссЪссдЬд			720
ЬЪссбдЬбсс	сссссаадсс	сааддасасс	сЪсаЪдаЬса	дссддасссс	сдаддЕдасс			780
ЬдсдГддбдд	ЬддасдЬдад	ссасдаддас	сссдаддЬда	адЪЬсаасГд	дЪасдбддас			840
ддсдЬддадд	бдсасаасдс	саадассаад	ссссдддадд	адсадбасаа	садсассЪас			900
сдддЬддЪда	дсдЬдсбсас	сдГдсбдсас	саддасЬддс	Ъдаасддсаа	ддадбасаад			960
ЪдсааддЬда	дсаасааддс	ссГдссЬдсс	сссабсдада	адассаЬсад	сааддссаад		1020
ддссадсссс	дддадсссса	ддЬдбасасс	сЬдсссссса	дссдддадда	даСдассаад		1080
аассаддбдЬ	сссЬсассбд	ГсЬддГдаад	ддсГЬсЬасс	ссадсдасаГ	сдссдбддад		1140
Сдддададса	асддссадсс	сдадаасаас	Ьасаадасса	сссссссбдЬ	дсГддасадс		1200
дасддсадсб	ЪсГбссЬдЬа	садсаадсСс	ассдЪддаса	ададссддбд	дсадсадддс		1260
аасдЬдГЬса	дсЬдсадсдЬ	даЬдсасдад	дсссГдсаса	ассасбасас	ссадаададс		1320
сЬдадссбда	дссссддсаа	9					1341

Е

V

0 ь

V

Е

8 Θ С С

ЬУОРССЗЬКЬЗСААЗСРТРЗТУАМЗИУК

0

А

Р

<3

К

<3

Ь

Е

И

V

3

А

I

3

5

С

ϋ

3

т

Υ

А

Р

Б

V

К

с

к

Р

т

I

3

к

Р

N

А

к

N

Т

ь

Υ

Ь

0

М

N

5

ь

К

А

Е

Р

т

А

V

Υ

с

А

к

А

Υ

С

Υ

т

Р

ϋ

Р

и

е

0

с

т

ь

V

т

V

3

А

3

т

К

Θ

Р

3

V

Р

ь

А

Р

3

к

3

т

3

(3

т

А

ь

Θ

с

ь

V

к

ϋ

Υ

Р

Е

Р

V

т

V

3

и

N

3

(3

А

ь

Т

3

с

V

Н

Т

Р

А

V

ь

0

Б

С

Ь

Υ

Б

ь

Б

3

V

т

V

Р

3

5

ь

С

т

0

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

т

К

V

Р

К

V

Е

1?

к

3

с

Р

к

т

н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

Ь

С

<3

Р

3

V

Р

ь

Р

К

Р

К

Ό

т

Ь

М

I

3

к

т

Р

Е

V

т

с

V

ϋ

V

3

Н

Ξ

Р

Е

V

К

Р

N

И

Υ

V

Ό

с

V

Е

V

и

N

А

к

т

К

Р

К

Е

0

Υ

N

3

т

Υ

к

V

3

V

ь

Т

V

ь

н

0

Р

и

Ь

N

6

к

Е

Υ

к

С

К

V

3

N

к

А

ь

Р

А

]?

I

Е

К

Т

I

3

к

А

к

с

0

Р

к

Е

Р

С

V

Υ

Т

ь

Р

3

к

Е

м

т

К

N

0

V

3

ь

т

с

Ь

V

к

(3

Р

Υ

Р

3

Р

I

А

V

Е

и

Е

5

N

с

0

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

ь

Ό

3

Р

с

Б

Р

ь

Υ

5

К

ь

т

V

Р

к

5

К

и

0

С

N

V

Р

Б

с

5

V

М

Н

Е

А

ь

н

N

н

Υ

т

0

К

Б

Ь

Б

ь

Б

]?

С

к

ЗЕО

ΙΡ N0:

:330

3Ε0 ΙΡ N0:331

Е

I

V

ь

Т

О

3

Р

ь

3

Ь

Р

V

т

Р

с

Е

Р

А

3

I

3

С

к

Б

8

<2

8

ь

И

Б

N

<3

Υ

N

Υ

Р

И

Υ

ь

0

К

Р

С

0

3

Р

0

ъ

ь

I

Υ

ь

<3

Б

N

к

А

3

с

V

Р

К

Р

3

(3

Б

(3

8

С

Т

Р

Т

ь

к

I

8

К

V

Е

А

Е

Р

V

с

V

Υ

с

м

0

А

ь

0

т

Р

ь

т

Р

С

с

т

К

V

Е

I

К

к

А

Р

3

V

Р

I

Р

3

Ώ

Е

0

ь

к

3

6

т

А

Б

V

с

ь

N

Р

Ύ

Р

к

Е

А

к

V

0

И

К

V

Р

N

А

Ь

0

3

<3

N

5

0

Е

3

V

т

Е

0

Р

Б

К

Р

5

т

Υ

Б

ь

5

3

Т

ь

т

Ь

3

к

А

Р

Υ

Е

К

н

К

V

Υ

А

с

Е

V

Т

н

Ω

с

ь

5

3

Р

V

Т

К

Б

Р

N

к

а

Е

С

БЕО

ΙΡ N0:

: 332

даддИдсадс ЬддЬддадас сддддсЬдад дЬдаадаадс сЕдддЕсс'Ьс ддЬдааддСс 60 ЕссГдсаадд ссбсЪддадд сассГЪсадд асссаЪдсГа ЬсадбЬдддЬ дсдасаддсс 120 ссбддасаад ддсЬГдадГд даЪдддаддд аЬсабсдсьа бсЬЬсддаас адсааасбас 180 дсасадаадб Рссадддсад аабсасдабб ассдсддасд ааЬссасдад ЬасадссГас 240 абддадсбда дсадссбдад абсрдаддас асддссдбдЪ абЪГсЪдбдс дададдсадб 300 ддббайсаЕа ЬаБсдасасс сБЪЪдасаас Гддддссадд даасссЪддЪ сассдЬсбсд 360 адЬдсЬадса ссаадддссс садсдЪдГЬс ссссГддссс ссадсадсаа дадсассадс 420 ддсддсасад ссдсссЬддд сЬдссЬддЬд ааддасЬасЬ Ьссссдадсс сдЬдассдЬд 480 адсСддааса дсддсдссЬЪ дассадсддс дСдсасассЕ СссссдссдЕ дсСдсададс 540 адсддссЬдб асадссЬдад садсдЪддЬд ассдЬдссса дсадсадссЪ дддсасссад 600 ассЬасаЬсЪ дсаасдЬдаа ссасаадссс адсаасасса аддрддасаа асдсдЪддад 660 сссаададсС дсдасаадас ссасассЬдс ссссссЬдсс сйдсссссда дсЬдсЬдддс 720 ддасссйссд ЬдЬйсскдЬЪ сссссссаад сссааддаса сссйсайдак садссддасс 780 сссдаддбда ссЕдсдЬддЕ ддбддасдЪд адссасдадд ассссдаддГ даадбЬсаас 840 ЪддЬасдбдд асддсдСдда ддйдсасаас дссаадасса адссссддда ддадсадЪас 900 аасадсассЪ ассдддЬддЬ дадсдЪдсЪс ассдбдсЬдс ассаддас1:д дсЬдаасддс 960 ааддадйаса адйдсааддй дадсаасаад дсссЕдссйд сссссайсда даадассаСс 1020 адсааддсса адддссадсс ссдддадссс саддЬдЬаса сссЬдссссс садссдддад 1080 дадаЬдасса адаассаддГ дбсссЕсасс ЪдЪсГддбда адддсЬЬсЬа ссссадсдас 1140 аЬсдссдЬдд адЕдддадад саасддссад сссдадааса асЬасаадас сасссссссЬ 1200 дЪдсЪддаса дсдасддсад сЬбсГСссЕд Ьасадсаадс ЬсассдЪдда саададссдд 1260

- 55 017203

Е

V

0

ь

V

Е

Т

С

А

Е

V

к

К

Р

а

3

V

к

V

3

С

к

А

3

С

6

Т

Р

к

т

н

А

I

3

и

V

К

0

А

Р

<3

0

с

Ь

Е

И

М

с

б

I

А

I

р

6

т

А

N

Υ

А

0

К

Е

0

б

К

I

т

I

т

А

О

Е

5

Т

8

Т

А

Υ

м

Е

Ь

3

ь

к

3

Е

η

Т

А

V

Υ

Р

С

А

К

б

3

б

Υ

н

I

3

т

Р

Е

ϋ

N

VI

а

0

С

Т

ь

V

т

V

3

А

5

т

к

б

Р

3

V

Е

Р

Ь

А

Р

3

5

К

3

т

5

а

б

Т

А

Ь

о

С

ь

V

к

σ

Υ

Р

Е

Р

V

т

V

3

и

N

3

С

А

ь

Т

3

б

V

Н

Т

Р

А

V

Е

0

3

б

Е

Υ

3

ь

3

V

т

V

Р

5

3

ъ

(3

Т

0

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

5

N

т

К

V

О

к

V

Е

Р

К

3

с

Ώ

к

т

н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

Ь

б

с

Р

3

V

Р

ь

Е

Р

К

Р

К

ϋ

т

ь

м

I

3

К

Т

Р

Е

V

т

с

V

Ό

V

3

н

Е

Ώ

Р

Е

V

к

г

N

К

Υ

V

ϋ

0

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

К

Е

0

Υ

N

3

т

Υ

к

V

3

V

ь

Т

V

ь

Н

0

о

и

Ь

N

б

К

Е

Υ

к

С

к

V

3

N

к

А

Е

Р

А

Р

I

Е

К

т

I

8

к

А

к

С

0

Р

к

Е

Р

0

V

Υ

т

ь

Р

3

К

Е

м

Т

к

N

б

V

3

Е

т

с

Ь

V

к

С

Г

Υ

Р

5

Ό

I

А

V

Е

и

Е

3

N

(3

Ώ

Р

Е

N

Υ

К

т

Т

Р

V

Е

ϋ

3

0

б

5

г

Е

ь

Υ

3

К

ь

т

V

Ό

К

3

К

И

0

С

N

V

Р

3

с

3

V

М

Н

Е

А

ь

н

N

Н

Υ

т

0

К

3

Е

5

ь

3

Р

б

к

5Е0

ТО N0:

:334

- 56 017203

Е

V

о б

V

0

3

САЕУККРСЗ

3 V

КУ5СКАЗе<3 1

ΡΚ8Ν3Χ8ΝνΚ

ΰ

А

Р

С

0

с

б

Е

и

М

Θ

(3

I

Г

А

Б

Р

С

т

В

Υ

А

О

к

Р

0

<3

К

V

т

X

т

А

Б

Е

8

т

Т

V

Υ

ь

Е

ь

5

3

Б

Т

3

Е

в

Т

А

V

Υ

с

А

к

В

3

в

Υ

т

Т

К

N

Υ

Р

Б

Υ

И

С

0

Θ

т

Б

V

т

V

3

А

3

Т

К

а

Р

3

V

Р

Б

А

Р

3

К

3

т

3

в

<3

Т

А

Б

6

С

Б

V

К

Б

Υ

К

Р

Е

Р

V

т

V

3

И

N

3

<3

А

Б

Т

3

В

V

н

т

Р

А

V

Б

0

3

В

Б

Υ

3

Б

3

V

т

V

Р

3

Б

в

т

О

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

к

Р

3

N

т

К

V

В

к

X

V

Е

Р

к

5

С

Б

К

т

Н

т

С

Р

с

Р

А

Р

Е

Б

(3

с

Р

3

V

Р

Б

Р

К

Р

К

О

Т

Б

I

3

В.

т

Р

Е

V

Т

с

V

в

V

3

н

Е

в

Р

Е

V

к

г

N

И

Υ

V

Б

с

V

Е

V

н

N

А

К

Т

к

Р

К

Е

О

Υ

N

3

т

У

к

V

3

V

б

Т

V

Б

Н

О

о

и

Ь

N

о

К

Е

Υ

к

С

к

V

3

N

К

А

Б

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

К

А

к

<3

0

Р

к

Е

Р

ΰ

V

Υ

т

Б

Р

3

К

Е

м

Т

к

N

0

V

3

Б

т

с

Ь

V

к

В

Р

Υ

Р

8

В

I

А

V

Е

и

Е

3

N

С

О

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

Б

Ώ

3

Б

в

3

Р

ь

Υ

3

К

Б

Т

V

В

К

3

К

и

0

С

N

V

Р

5

с

3

V

М

н

Е

А

Б

н

N

н

Υ

Т

0

К

3

Б

5

Б

3

Р

с

К

БЕО

1Б ΝΟ:

: 342

0

V

0

Б

V

0

3

В

А

Е

V

к

К

Р

6

3

5

V

К

V

3

С

К

А

5

в

<3

Р

к

N

Р

А

I

N

и

V

к

0

А

Р

6

0

в

Б

Е

М

в

с

I

А

V

Р

3

т

к

У

А

н

К

Р

Ό

в

к

V

т

I

Т

А

Б

ϋ

5

т

N

Т

А

Υ

м

Е

Б

В

3

Б

к

8

Е

Б

т

А

V

Υ

с

А

к

С

Р

н

У

3

Υ

м

в

V

И

С

Е

В

т

V

т

V

5

3

А

8

т

К

с

Р

3

V

Р

ь

А

Р

3

к

8

т

3

с

в

т

А

Б

с

С

Ь

V

К

В

Υ

Р

Е

Р

V

т

V

3

к

N

3

с

А

Б

т

3

с

V

н

т

Р

А

V

ь

0

3

В

Б

Υ

5

Ь

3

V

т

V

Р

3

Б

С

Т

0

Т

Υ

I

С

N

V

N

н

К

Р

8

N

т

К

V

в

к

V

Е

Р

к

5

С

в

к

т

н

т

С

Р

с

Р

А

Р

Е

Б

В

в

Р

8

V

Р

Б

Р

К

Р

К

Б

т

Б

м

I

3

Н

т

Р

Е

V

т

с

V

В

V

3

н

Е

Б

Р

Е

V

к

Р

N

И

Υ

V

В

в

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

]?

К

Е

0

Υ

N

3

т

У

к

V

3

V

Б

Т

V

Б

Н

0

Б

н

Ь

N

в

к

Ξ

Υ

к

С

К

V

5

N

к

А

Б

]?

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

к

А

к

О

0

Р

К

Е

Р

ΰ

V

Υ

т

ь

Р

3

к

Ξ

Е

м

т

К

N

0

V

3

Б

т

с

Б

V

К

О

Р

Υ

Р

3

в

I

А

V

Е

и

Е

8

N

В

0

Р

Е

N

Υ

к

т

Т

Р

V

Б

Е

3

В

в

5

Р

1?

Ь

Υ

5

К

Б

т

V

в

к

3

К

и

0

С

N

V

Р

3

с

3

V

М

н

Е

А

Ь

Н

N

н

Υ

Т

0

К

3

Ь

3

Б

3

Р

6

К

3Ξ0

1Б N0

:346

- 57 017203

Ъддаасадсд дсдссВСдас садсддсдВд сасассССсс ссдссдбдсЬ дсададсадс ддссЬдЬаса дсскдадсад сдЕдд+дасс дЪдсссадса дсадссЕддд сасссадасс ВасаЬсЬдса асдСдаасса саадсссадс аасассаадд Ьддасааасд сдЬддадссс аададсЬдсд асаадассса сассбдсссс сссЬдсссЪд сссссдадсЬ дсЬдддсдда сссЪссдЪдЬ ЬссЪдбСссс ссссаадссс ааддасассс Ъса+даЪсад ссддассссс даддЪдассЪ дсдбддбддС ддасдВдадс сасдаддасс ссдаддЪдаа дЪЪсаасСдд Ъасдбддасд дсдЬддаддЬ дсасаасдсс аадассаадс сссдддадда дсадСасаас адсассбасс дддбддСдад сдВдсЬсасс дЬдсСдсасс аддасЬддсЬ даасддсаад дадВасаадЪ дсааддЬдад саасааддсс сбдссЬдссс ссабсдадаа дассаЪсадс ааддссаадд дссадссссд ддадссссад дЬдбасассс Ьдссссссад ссдддаддад абдассаада ассаддбдВс ссЪсассЪдВ сбддЪдаадд дсЬЬсбассс садсдасабс дссдбддадВ дддададсаа сддссадссс дадаасаасЬ асаадассас ссссссЬдбд сЬддасадсд асддсадсЬЬ сПЬссЬдЬас адсаадсбса ссдбддасаа дадссддЬдд садсадддса асдЬдЫсад сбдсадсдЪд аЬдсасдадд сссВдсасаа ссасбасасс садаададсс ЪдадссЬдад ссссддсаад

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1350

ЗЕО ΙΡ N0:	349
Е V О Ь V	Е Т С А Е V	К К Р <3 3 3	V К V Р С	К 3 3 С 3 Р	Р В 3 N А	V	3	И V	К
О А Ρ В 0	0 Ь Е И V (3	С I Ь <3 V Р	В 8 Р 3 Υ	А 0 К Р 0 <3	В V Т I Т	А	в	Е 5	т
Ν Т V Η М	Е В В В В В	3 Е В Т А V	' Υ Υ С А к	В Ρ Т Υ Υ Υ	3 Υ М В V	И	в	К й	т
Т V Т V 3	3 А 5 Т К <3	Р 3 V Р Р Ь	А Р 3 3 К	3 Т 3 6 В Т	А А В 6 С	Ь	V	К в	Υ
Ρ Ρ Е Ρ V	Т V 3 И N 5	С А Ь Т 3 6	V Н Т Р Р	А V Ъ 0 3 3	С В Υ 3 В	3	3	V V	т
V ₽ 5 3 3	В В Τ 0 Т Υ	I С Ν V N Н	К Р 3 N Т	К V В К К V	Е Р К 5 С	в	К	т н	т
С Р Р С Р	А Ρ Е Ь В В	С Р 5 V Р В	Р Р Р К Р	К В Т Ь Μ I	ВЕТРЕ	V	т	С V	V
V Ρ V 5 И	Е В Ρ Е V К	Ρ N И Υ V В	В V Е V Н	N А К Т К Р	К Е Е 0 Υ	N	3	Т Υ	в
V V 3 V Ь	Т V В Η ΰ В	И В N В К Е	Υ К С К V	3 N К А В Р	А Ρ I Е К	Т	I	3 К	А
К Θ 0 Р В	Е Ρ 0 V Υ Т	В Ρ Р 3 В Е	Е Μ Т К N	0 V 3 В Т С	В V К В Р	Υ	Р	3 в	I
А V Е N Е	3 N С 0 Ρ Е	Ν Ν Υ К Т Т	Р Р V ь в	3 В й 3 Р Р	В Υ 3 К в	т	V	в к	3
й Н 0 0 С	Ν V Р 3 С 3	V Μ Η Е А Ь	Η Ν Η Υ Т	α к з в з ь	3 Р й К
ЗЕО ΙΡ N0:	350
СссбаЬдЬдс	ЪдасЬсадсс	асссЬсддад	ВсадСддссс	саддасадас	ддссаддаСС			60
асседбдддд	даааЬаасаб	ЬддаадаааЪ	адЬдбдсасЬ	ддбаЬсадса	даадссаддс			120
саддссссВд	Ьдс+ддСсдВ	дСаВдабдаб	адсдассддс	ссЬсадддаЬ	ссс+дадсда			180
СбЫсЬддсЬ	ссаадЬсСдд	даасасддсс	асссСдаЬЬа	ЬсадсадддЪ	сдаадЪсддд			240
дабдаддссд	асбасбасбд	СсаддЬдЬдд	сабадЬадЬа	дбдабсаЬЪа	+дВсЫ;сдда			300
асЪдддасса	аддСсассдб	ссбаддбдсд	дссдсаддсс	адсссааддс	сдсСсссадс			360
дВдасссВдЬ	бсссссссЪс	сВссдаддад	сВдсаддсса	асааддссас	ссбддбд+дс			420
сСсаСсадсд	асббсбассс	ЪддсдссдЬд	ассдСддссв	ддааддссда	садсадсссс			480
дВдааддссд	дсдЬддадас	сассассссс	адсаадсада	дсаасаасаа	дЬасдссдсс			540
адсадсЪасс	Ьдадссбсас	ссссдадсад	Сддаададсс	ассддадсСа	садсСдссад			600
дбдасссасд	адддсадсас	сдЬддадаад	ассдЬддссс	ссассдадЪд	саде			654

5Е<2 ΙΡ N0:351

8ΥνβΤ0ΡΡ3Ε3νΆΡ60ΤΑΚΙΤΟθσΝΝΙΰΚΝ3νΗΗΥ00Κ

ΡΒ0ΑΡνΒννΥΒΒ8ΟΒΡ8ΒΙΡΕΒΡ5Β3Κ8ΒΝΤΑΤΒΙΙ5Κ νΕνθΒΕΑΒΥΥΒςνΝΗ333ΒΗΥνΡΒΤΒΤΚντνΒΒΑΑΆΒ0

ΡΚΑΑΡ3νΤβΕΡΡ35ΕΕβζ2ΑΝΚΑΤβνθ1.Ι3ΟΕΥΡ(3ΑνΤν

ΑΗΚΑβ33ΡνΚΑθνΕΤΤΤΡ3Κ03ΝΝΚΥΑΑ33Υβ3βΤΡΕ0 ΝΚ3ΗΒ3Υ300νΤΗΕ63ΤνΕΚΤνΑΡΤΕ03

5Ε0 ΙΡ N0:352 садабдсадс ЪддВасааЪс бддадсЬдад дВдаадаадс сЬдддЬссЕс ддЬдааддЬс 60 ЬссЪдсаадд сЬбсбддадд сассб+садс адсбаЪдсба ЪсадсЬдддЬ дсдасаддсс 120 ссбддасаад ддсЬЬдадбд даЬдддаддд абсВЪсддСа бдЪЕЬдддас адсааасСас 180 дсдсадаадЪ Ьссадддсад адбсасдаЬС ассдсддасд ааСЬсасдад сдсддссЬас 240 абддадсГда дсадссЪддд абсИдаддас асддссаЪдЬ аССасЬдСдс даддЬсЬадЪ 300 ддЬЪаЪВасс сссааЪасЬб ссаддасЬдд ддссадддса ссс+ддЬсас сд+сЬсдадЬ 360 дсЬадсасса адддссссад сдСдЬЪсссс сВддссссса дсадсаадад сассадсддс 420 ддсасадссд сссЬдддсСд ссВддЬдаад дасВасВЬсс ссдадсссдЪ дассдВдадс 480 Ьддаасадсд дсдссВВдас садсддсд^д сасассЬЬсс ссдссдЕдсЕ дсададсадс 540 ддссЬдЬаса дсс+дадсад сдЬддбдасс д+дсссадса дсадссЬддд сасссадасс 600 ЬасаЬсЪдса асдВдаасса саадсссадс аасассаадд Сддасааасд сдЬддадссс 660 аададсСдсд асаадассса сассВдсссс сссЬдсссЬд сссссдадсЬ дсбдддсдда 720 сссЬссдЪдб ЬссЬдЬВссс ссссаадссс ааддасассс СсаЬдаЬсад ссддассссс 780 даддЪдассЬ дсдЪддЬддЪ ддасдЬдадс сасдаддасс ссдаддСдаа д+ГсаасЪдд 840 СасдЪддасд дсдЬддаддб дсасаасдсс аадассаадс сссдддадда дсадЬасаас 900 адсассСасс дддИддСдад сдСдсбсасс дСдсбдсасс аддасЕддсЬ даасддсаад 960 дадбасаадЬ дсааддЬдад саасааддсс скдссЬдссс ссаЪсдадаа дассаЬсадс 1020 ааддссаадд дссадссссд ддадссссад дЬдбасассс Ъдссссссад ссдддаддад 1080 аЬдассаада ассаддЕдЪс ссПсассВдЪ сВддбдаадд дсЫсВассс садсдасаВс 1140 дссдбддадЕ дддададсаа сддссадссс дадаасаасЬ асаадассас ссссссЬдСд 1200 сЬддасадсд асддсадсЬГ еЬХссЪдЬас адсаадсЬса ссдЬддасаа дадссддЪдд 1260 садсадддса асдЕдВЬсад сЬдсадсдЪд аВдсасдадд ссс+дсасаа ссасЬасасс 1320 садаададсс ЬдадссВдад ссссддсаад 1350

0

М

0

ь

V

0

5

С

А

Е

V

К

Р

й

3

V

К

V

Ξ

с

К

А

Б

О

в

т

Р

5

3

Υ

А

I

3

и

V

К

0

А

Р

о

0

О

В

Е

М

о

С

I

Р

й

м

Р

О

т

А

N

Υ

А

О

К

Р

О

Θ

в

V

т

I

Т

А

в

Е

Р

т

3

А

Υ

м

Е

В

Б

3

В

й

3

Е

в

Т

А

м

Υ

С

А

К

Б

3

в

Υ

Р

0

Υ

Р

0

В

И

в

0

с

т

ь

V

Т

V

3

А

Б

Т

К

й

Р

5

V

Р

ь

А

Р

8

Б

К

5

т

Б

в

т

А

в

с

Ь

V

К

в

Υ

Р

Е

Р

V

Т

V

3

и

N

Б

й

А

ь

т

3

с

V

н

Т

Р

А

V

ь

О

3

5

С

В

Υ

3

в

3

V

т

V

Р

5

Б

5

В

й

Т

О

Т

Υ

1

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

т

К

V

в

К

в

V

Е

Р

К

3

с

В

К

т

н

т

с

Р

С

Р

А

Р

Е

ь

В

й

Р

3

V

Р

в

Р

К

Р

К

в

т

ъ

м

I

3

в

т

Р

Е

V

т

с

V

в

V

Б

н

Е

В

₽

Е

V

К

N

и

Υ

V

в

В

V

Е

V

н

N

А

К

т

К

Р

В

Е

0

Ύ

N

3

т

Υ

в

V

3

V

в

Т

V

Ь

Н

Ό

Ώ

К

Ь

N

о

К

Е

Υ

К

С

К

V

Б

N

К

А

в

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

5

К

А

К

й

Ω

Р

в

Е

Р

О

V

у

Т

в

Р

3

в

Е

м

т

К

N

Ω

V

3

Ь

т

с

В

V

К

В

Р

Υ

Р

3

в

I

А

V

Е

И

Е

3

N

й

о

Р

Е

N

Υ

К

т

Т

Р

V

в

ϋ

Б

В

с

3

Р

ъ

Υ

3

К

ь

т

V

В

К

Б

В

и

0

О

й

N

V

Р

3

с

3

V

М

Н

Е

А

В

н

N

н

Υ

т

<2

К

Б

в

Б

ь

3

₽

в

К

ЗЕ<2

Ιϋ ΝΟ:

: 354

- 58 017203

0

V

0

Β

V

0

3

А

Ξ

V

κ

Κ

Ρ

3

V

Κ

V

3

С

Κ

А

3

Ρ

3

Υ

А

I

3

И

V

κ

Ω

Ά

Ρ

3

0

3

Β

Ε

Μ

3

V

I

Ρ

I

Ρ

Β

τ

А

Μ-

Υ

А

Ω

Ν

Ρ

Ω

3

Β

V

τ

I

Τ

А

Β

Ε

Ρ

τ

5

Υ

Μ

Ε

ь

3

Б

Ε

3

ϋ

υ

τ

А

V

Υ

С

А

Β

Ε

Ν

Υ

Η

Β

3

τ

Υ

Ν

А

Ρ

Β

3

И

Ρ

Β

Ρ

Μ

С

0

Θ

τ

ъ

V

Τ

V

5

3

Ά

8

τ

κ

3

Ρ

3

V

Ρ

Β

А

Ρ

3

5

κ

3

τ

3

Τ

А

в

3

С

Β

V

κ

Β

Υ

Ρ

Ξ

Ρ

V

τ

V

3

и

Ν

3

А

Β

Τ

3

V

Η

τ

Ρ

А

V

Β

Ω

3

8

3

В

Υ

3

в

3

V

τ

V

Ρ

3

ь

3

Τ

Ω

Τ

Υ

I

С

Ν

V

Ν

Η

Κ

Ρ

3

Ν

τ

κ

V

Β

κ

Β

V

Ε

Ρ

κ

3

с

Ό

κ

τ

Η

τ

С

Ρ

С

Ρ

А

Ρ

Ξ

ь

Β

3

Ρ

5

V

Ρ

Β

Ρ

Κ

Ρ

κ

Ό

τ

Β

Μ

I

8

в

τ

Ρ

Ε

V

τ

С

V

π

V

3

Η

Ξ

Β

Ρ

Ε

V

κ

Ρ

Ν

И

Υ

V

Β

3

V

Ε

V

Η

Ν

А

κ

τ

κ

Ρ

Β

Ε

0

Υ

Ν

3

τ

Υ

κ

V

3

V

Β

Τ

V

Ь

Η

Ω

Ό

и

Ь

Ν

3

κ

Ε

Υ

κ

С

Κ

V

3

Ν

κ

А

Β

Ρ

А

Ρ

I

Ε

κ

Τ

I

3

Κ

Α

κ

3

Ω

Ρ

κ

Ε

Ρ

Ω

V

Υ

τ

Β

Ρ

3

Β

Ε

Μ

τ

Κ

Ν

Ω

V

3

ь

τ

С

Β

V

κ

3

Ρ

Υ

Ρ

3

ϋ

I

А

V

Ε

и

Ε

3

Ν

3

Ω

Ρ

Ε

Ν

Υ

κ

τ

Τ

Ρ

V

ь

υ

3

Β

3

Ξ

Ρ

Б

Υ

5

κ

в

Τ

V

Ό

Κ

3

Κ

и

Ω

3

Ν

V

Ρ

3

С

3

V

Μ

Η

Ε

А

Β

Η

Ν

Η

Υ

τ

Ω

κ

3

Ь

8

ь

3

Ρ

3

κ

3ΕΩ

ΙΒ ΝΟ.

:362

- 59 017203

ΝΚνΡΝΑΙ.058Ν3<2Ε5νΤΕ0Β3ΚΡ5ΤΥ8Β33ΤΒΤΒ5ΚΑΒ

УЕКНКУУАСЕУТНООЬЗЗРУТКЗЕНКСЕС

3Εΰ ΙΒ N0:364 саддЬссадс БссЬдсаадд ссЬддасаад дсасадаадЪ аЬддаддЬда ааЬСасЬаСд дсЬадсасса ддсасадссд Ьддаасадсд ддссБдЬаса СасаСсЬдса аададсЬдсд сссСссдЬдь даддБдассЪ ЬасдЬддасд адсассЬасс дадСасаадБ ааддссаадд аСдассаада дссдСддадЪ сСддасадсд садсадддса садаададсс

СддЬдсадБс сБЬсЬддадЬ ддсСЪдадЪд Ьссадддсад ддадссЪдад аБадБдеаЪа адддссссад сссБдддсСд дсдссБЪдас дссЬдадсад асдБдаасса асаадассса ЪссЁдЬЬссс дсдСддЬддБ дсдеддадде дддЬддЬдад дсааддБдад дссадссссд ассадд^дИс дддададсаа асддсадсЬЬ асдЬдБЬсад ЬдадссБдад

ЬддадсЪдад сассЬБсадС даБдддадда адЬсасдаБЬ аЬсЪдаддас ЪдасЬасЬдд сдЬдЬЬсссс ссСддЬдаад садсддсдБд сдЪддБдасс саадсссадс сассЬдсссс ссссаадссс ддасдЬдадс дсасаасдсс сдЬдсБсасс саасааддсс ддадссссад ссЪсассЬдЪ сддссадссс сЪБссЪдЬас сЪдсадсдБд ссссддсаад д-Сдаадаадс ЬасЪаЪдсЪа аЪсадсссЬа асЬдсддасд асддссдЬдЪ ддссадддаа сЬддссссса дасБасССсс сасассБЬсс дЪдсссадса аасассаадд сссЪдсссЪд ааддасассс сасдаддасс аадассаадс дЬдсЬдсасс сБдссЬдссс дЪдСасассс сБддЬдаадд дадаасаасЬ адсаадсЬса аЬдсасдадд сЬдддБссЬс: ЬдадсЪдддБ ЬдЬЬЪдддас асЪссасдад аБЬасЬдЪдс сссЬддЬсас: дсадсаадад ссдадсссд!; ссдссдЬдсе дсадссЬддд Ъддасааасд сссссдадсГ: СсаЪдаЬсад ссдаддСдаа сссдддадда аддасБддс1: ссаЪсдадаа Ъдссссссад дсЪЪсБассс асаадассас ссдЬддасаа сссЪдсасаа ддЪдааддСс дсдасаддсс аасаассСас ЪасадссСас дадаЬсЬЬсд сдЪсЪсдадЪ сассадсддс дассдЪдадс дсададсадс сасссадасс сдЬддадссс дсЪдддсдда ссддассссс дСЬсаасЬдд дсадЪасаас даасддсаад дассаЪсадс ссдддаддад садсдасаЬс ссссссСдЪд дадссддБдд ссасЬасасс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1350

5Е0 ΙΡ N0:365

О

V

О ь

V о

3 О А

Ε V

ΚΚΡΘ33νΚν30ΚΑ38νΤΕ3ΥΥΑΜ3ΝνΕ

О

А

Р

8

Ω

8

Ь

Е

И

М

О

С

I

3

Р

м

Р

О

т

у

А

0

к

Р

0

8

к

V

т

I

т

А

Ώ

3

т

3

Т

А

У

м

Е

V

К

Б

Ь

к

3

Е

Ώ

т

А

V

У

с

А

е

3

N

У

Υ

В

3

V

У

Р

Υ

И

С

0

6

т

ь

V

Т

V

3

А

3

Т

К

8

Р

Б

V

Р

в

А

Р

5

3

к

3

т

3

О

8

т

А

в

8

с

В

V

к

В

Υ

Е

Р

Е

Р

V

т

V

3

И

N

3

8

А

в

т

3

О

V

н

т

Р

А

V

В

0

3

8

в

У

Б

в

3

V

т

V

Р

3

в

С

т

0

Т

У

I

С

N

V

N

н

К

Р

3

N

т

К

V

В

к

V

Е

Р

к

3

с

Ό

к

т

н

т

с

Р

с

Р

А

Р

Е

ь

В

8

Р

3

V

Р

в

Р

К

Р

К

В

т

ь

м

I

3

к

т

Р

Е

V

т

с

V

Ώ

V

3

н

Е

В

Р

Е

V

К

Р

N

И

У

V

Ώ

8

V

Е

V

н

N

А

к

т

к

Р

К

Е

0

Υ

N

3

т

Υ

к

V

3

V

в

Т

V

в

Н

0

υ

И

В

N

О

К

Е

У

к

С

к

V

3

N

к

А

ъ

Р

А

Р

I

Е

К

Т

I

3

к

А

к

С

0

Р

к

Е

Р

0

V

У

т

в

Р

3

К

Е

м

т

к

N

<2

V

3

ь

т

с

в

V

К

О

Р

Υ

Р

3

Р

I

А

V

Е

и

Е

3

N

8

0

Р

Е

N

У

к

т

Т

Р

V

ь

Ώ

3

В

8

3

Р

ь

Υ

3

К

в

т

V

В

к

Б

К

и

0

с

N

V

Р

Б

с

3

V

М

н

Е

А

В

н

N

н

Υ

т

О

к

3

В

3

в

3

Р

8

К

5Е<2

ΙΒ N0:

: 3 66

садЬсЬдЪсд	Ьдасдсадсс	дсссБсддад	ЬсадБддссс	саддасадас	ддссаддаЬР	60
ассЪдЪдддд	дасаЬаасаЬ	ЬддаадБааЬ	адЬдЬдсасЬ	ддБассадса	даадссаддс	120
саддссссБд	ЬдсЬддБсдЬ	дЬаЪдаБааЬ	адсдассддс	ссСсадддаБ	сссЬдадсда	180
•ЬСсЬсЪддсЬ	ссаасЬсЬдд	даасасддсс	асссЬдасса	ЬсадсадддЪ	сдаадссддд	240
даСдаддссд	асЬаЮ:ас1:д	ЬсаддЬдЪдд	ддЬадРадЬа	дЪдассаЬЬа	ЬдЪсРРсдда	300
асЬдддасса	аддЬсассдЬ	ссЪаддСдсд	дссдсаддсс	адсссааддс	сдсесссадс	360
дСдасссЬдБ	СсссссссЬс	сЬссдаддад	сЬдсаддсса	асааддссас	ссЬддЬдЬдс	420
сЬсаЪсадсд	асЬСсЪассс	Бддсдссдрд	ассдСддссЬ	ддааддссда	садсадсссс	480
дедааддссд	дсдЪддадас	сассассссс	адсаадсада	дсаасаасаа	дЬасдссдсс	540
адсадсЪасс	РдадссЬсас	ссссдадсад	^ддаададсс	ассддадсЪа	садсЬдссад	600
дЬдасссасд	адддсадсас	сдЬддадаад	ассдЬддссс	ссассдадЪд	саде	654

БЕО

ΙΒ ΝΟ:

:367

Ό

3

V

т

0

Р

3

Е

3

V

А

Р

8

0

т

А

Е

I

Т

С

8

6

Н

N

I

6

3

N

3

V

н

N

У

0

К

Р

О

0

А

Р

V

в

V

У

в

N

3

в

Е

Р

3

8

I

Р

Е

Р

3

С

3

N

3

8

N

т

А

т

Ь

т

I

3

Е

V

Е

А

8

В

Е

А

В

У

с

0

V

и

С

3

в

н

У

V

Р

8

Т

8

Т

к

V

Т

V

ь

8

А

С

Р

К

А

Р

3

V

т

в

Р

3

Е

в

0

А

N

К

А

т

Ь

V

С

I,

I

5

В

Р

У

Р

8

А

V

т

V

А

И

К

А

Ό

3

Р

V

к

А

8

V

Е

Т

т

р

5

К

Ω

3

N

К

У

Ά

А

3

У

в

3

В

Т

Р

Е

О

И

к

3

Н

К

3

У

3

с

Ω

V

Т

н

Е

8

3

т

V

Е

К

т

V

А

Р

т

Е

С

3

- 60 017203

Таблица 1

Первый цикл амплификации V-области к-цепи, V-области λ-цепи и VΗ-области

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера	ЗЕО Ιϋ N0:
οκι (Ηυ,νκίΒ)	САС АТС САО НТО АСС САО ТСТ СС	144
ОК2 (НиУК2)	САТ ОТТ СТС АТС АСТ САО ТСТ СС	145
ОКЗ (НиУК2В2)	ОАТ АТТ СТО АТО АСС САО АСТ СС	146
ОК4 (НиУКЗВ)	САА АТТ ОТО ИТО АСК САО ТСТ СС	147
ОКБ (НиУК5)	САА АСС АСА СТС АСС САО ТСТ СС	148
ОК6 (НиУКб)	САА АТТ СТО СТО АСТ САО ТСТ СС	149
ОСК (НиСК)	АСА СТС ТСС ССТ ОТТ ОАА ОСТ СТТ	150
ОЬ1 (НиУЫА) *	САО ТСТ ОТС СТС АСТ САО ССА СС	151
ОЬ1 (НиУЫВ) *	САО ТСТ СТС УТС АСС САС ССС СС	152
ОЬ1 (НиУЫС) *	САС ТСТ СТС СТС АСС САО ССС СС	153
ОЬ2 (НиУЪ2В)	САС ТСТ ССС СТС АСТ САС СС	154
ОЬЗ (НиУЬЗА)	ТСС ТАТ ОНО СТС АСТ САС ССА СС	155
ОЬ4 (НиУЪЗВ)	ТСТ ТСТ САС СТС АСТ САС САС СС	156
0115 (НиУЬ4В)	САС СУТ СТС СТС АСТ САА ТС	157
ОЬб (НиУЬ5)	САС ССТ СТС СТС АСТ САС ССС ТС	158
01,7 (НиУЬб)	ААТ ТТТ АТС СТС АСТ САС ССС СА	159
ОЬ8 (НиУЬ7/8)	САС ЕСТ СТО СТС АСУ САС САС СС	160
0119 (НиУЬ9)#	СИС ССТ СТС СТС АСТ САС ССМ СС	161
0Ц9 (НиУЫО)#	САС ССА ССС СТС АСТ САС	162
ОСЬ (НиСЬ2)Х	ТСА АСА ТТС ТСТ АСС ССС САС ТС	163
ОСЬ (НиСЬ7)Х	АСА ССА ТТС ТСС АСС ССС САС ТС	164
ОН1(НиУН1В7А)+	САС КТС САС СТС СТС САК ТСТ СС	165
ОН1 (НиУН1С)+	ЗАО СТС САС СТС ΘΤΚ САС ТСТ СС	166
ОН2 (НиУН2В)	САС КТС АСС ТТС ААС САС ТСТ СС	167
ОНЗ (НиУНЗА)	САС СТС САС СТО СТС САС	168
ОН4 (НиУНЗС)	САС СТС САС СТС СТС САС ИСУ СС	169
ОН5 (НиУН4В)	САС СТС САС СТА САС САС ТСС ОС	170
ОН6 (НиУН4С)	САС ЗТС САС СТС САС САС ТСЗ СС	171
ОН7 (НиУНбА)	САС СТА САС СТС САО САС ТСА СС	172
ОСИ (НиС1дМ)	ТСС ААС АСС САС СТТ СТТ ТТС ТТТ	173

* Смешивание в отношении 1:1:1 # Смешивание в отношении 1:1 X Смешивание в отношении 1:1 + Смешивание в отношении 1:1

- 61 017203

Таблица 2

Второй цикл амплификации У-области к-цепи, У-области λ-цепи и УИ-области

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера	8Е0 ГО N0
ОК15 (НиУК1В-ЗАЬ)	ТСА ОСА САС АСС ТСС АСС САС АТС САС ИТС АСС САС ТСТ СС	174
ОК28 (НиУК2-8АЬ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САТ СТТ СТС АТС АСТ САС ТСТ СС	175
ОК38 (ΗιινΚ2Β2-8Ά1>)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САТ АТТ СТС АТС АСС САС АСТ СС	176
ОК48 (НиУКЗВ-ЗАЬ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САА АТТ СТС ИТС АСК САС ТСТ СС	177
ОК53 (Ни\ГК5 ~8АЬ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САА АСС АСА СТС АСС САС ТСТ СС	178
ОК68 (НиУКб-БАЬ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САА АТТ СТС СТС АСТ САС ТСТ СС	179
одкх (Нила-ыот)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ОСС ССС АСС ТТТ САТ ТТС САС СТТ ССТ ССС	180
ОДК2 (НиДК2-ИОТ)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС АСС ТТТ САТ СТС САС СТТ ССТ ССС	181
одкз (ниякз-кот)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС АСС ТТТ САТ АТС САС ТТТ ССТ ССС	182
οσκ4 (Ηπσκ4-Νοτ)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС АСС ТТТ САТ СТС САС СТТ ССТ ССС	183
οσκ5 (ниакБ-мот)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС АСС ТТТ ААТ СТС САС ТСС ТСТ ССС	184
ОЫЗ (НиУША-ЗАЬ) *	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС ТСТ СТС СТС АСТ САС ССА СС	185
ОЫЗ (НиУЫВ-ЗАЬ)*	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС ТСТ СТС УТС АСС САС ССС СС	186
ОШ (НиУЫС-БАЕ) *	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС ТСТ СТС СТС АСС САС ССС СС	187
ОЬ25 (НъЛЪ2В-ЗАЬ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС ТСТ ССС СТС АСТ САС СС	188
ОЬЗЯ (Ни^ЗА-ЗАЪ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС ТСС ТАТ СИС СТС АСТ САС ССА СС	189
ОЬ48 (НиЗТЬЗВ-ЗАЕ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС ТСТ ТСТ САС СТС АСТ САС САС СС	190
ОЬ53 (НиУЬ4В-ЗАЪ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС СУТ СТС СТС АСТ САА ТС	191
ОЬ68 (Ни5Л,5-ЗАЬ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС ССТ СТС СТС АСТ САС ССС ТС	192
ОЬ78 (НиУЬ6-8АЬ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС ААТ ТТТ АТС СТС АСТ САС ССС СА	193
ОЬ88 (НиУЬ7/8-8АЪ)	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС ЕСТ СТС СТС АСУ САС САС СС	194
ОВ98 (НиУЪ9-ЗАЬ)#	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС СИС ССТ СТС СТС АСТ САС ССМ СС	195
ОБ98 (НиУЫ0-8АЪ)#	ТСА ССА САС АСС ТСС АСС САС ССА ССС СТС АСТ САС	196
ОДЫ (НиДЫ-ΝΟΤ)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС АСС ТАС САС ССТ САС СТТ ОСТ ССС	197
0ДЬ2 (НиДЬ2/3-ΝΟΤ)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС АСС ТАС САС ССТ САС СТТ ССТ ССС	198
ОДЬЗ (НиДЬ7-ХОТ)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС АСС САС САС ССТ САС СТС ССТ ССС	199

ОН18 (НиУН1В-8Е1)+	СТС СТС ОСА АСТ ССС ССС САС ССС ССС АТС ССС САС КТС САС СТС СТС САН ТСТ СС	200
ОН13 (НиУН1С-ЗР1)+	СТС СТС ССА АСТ ССС ССС САС ССС ССС АТС ССС 8АС СТС САС СТС СТК САС ТСТ СС	201
ОН23 (НиУН2В-8Р1)	СТС СТС ССА АСТ ССС ССС САС ССС ССС АТС ССС САС КТС АСС ТТС ААС САС ТСТ СС	202
ОН38 (НиУНЗА-ЗР1)	СТС СТС ССА АСТ ССС ССС САС СС'С ССС АТС ССС САС СТС САС СТС СТС САС	203
0Н43 (НиУНЗС-ЗЫ)	СТС СТС ССА АСТ ССС ССС САС ССС ССС АТС ССС САС СТС САС СТС СТС САС ИСУ сс	204
ОН53 (НиУН4В-ЗР1)	СТС СТС ССА АСТ ССС ССС САС ССС ССС АТС ССС САС СТС САС СТА САС САС ТСС СС	205
ОНбБ (НиУН4С-5Р1)	СТС СТС ССА АСТ ССС ССС САС СС<3 ССС АТС ССС САС ЗТС САС СТС САС САС ТС8 СС	206
ОН78 (НиУН6А-8Р1)	СТС СТС ССА АСТ ССС ССС САС ССС ССС АТС ССС САС СТА САС СТС САС САС ТСА СС	207
ОДН1 (НиДН1/2-ХНО)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ССА САС КСТ САС САС ССТ ССС	208
ОДН2 (НиДНЗ-ХНО)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ССА САС ССТ САС САТ ТСТ ССС	209
ОДНЗ (НиДН4/5-ХНО)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ССА САС ССТ САС САС ССТ ТСС	210
ОДН4 (НиДНб-ХНО)	САС ТСА ТТС ТСС АСТ ССА САС ССТ САС ССТ ССТ ССС	211

* Смешивание в отношении 1:1:1 # Смешивание в отношении 1:1

Смешивание в отношении 1:1

- 62 017203

Таблица 3

Обзор второго цикла амплификации УЬ-областей

Матрица	5’- праймер	3’- праймер	Продукт	Доля в ΡΚ/Ρί (%)	Пул	Доля в VI (%)
К1	0К13	οσκι	κισι	25	ΡΚ1	30
ОК13	οσκ2	κισ2	25
ОК13	οσκ3	κισ3	10
ОК13	ол<4	κισ4	25
ОК13	οσκ5	κισ5	15
К2	ОК23	οσκι	Κ2σι	25	ΡΚ2	4
ОК23	ΟΟΚ2	Κ2σ2	25
ОК23	οσκ3	Κ2σ3	10
ОК2 3	οσκ4	Κ2σ4	25
ОК23	θσΚ5	Κ2Ο5	15
КЗ	ОК35	οσκι	Κ3σι	25	РКЗ	1
ОКЗЗ	οσκ2	Κ3σ2	25
ОКЗЗ	ΟΟΚ3	Κ3σ3	10
ОКЗЗ	οσκ4	Κ3σ4	25
ОКЗЗ	οσκ5	Κ3σ5	15
К4	ОК43	οσκι	Κ4σι	25	ΡΚ4	19
ОК43	οσκ2	Κ4σ2	25
ОК4 3	οσκ3	Κ4σ3	10
ОК43	οσκ4	Κ4σ4	25
ОК43	οσκ5	Κ4σ5	15
К5	ОК53	οσκι	Κ5σι	25	ΡΚ5	1
ОК53	οσκ2	Κ5σ2	25
ОК53	οσκ3	Κ5σ3	10
ОК53	οσκ4	Κ5σ4	25
0К53	οσκδ	Κ5σ5	15
Кб	ОК63	οσκι	Κ6σι	25	РКб	5
ОК63	οσκ2	Κ6σ2	25
ОК63	οσκ3	Κ6σ3	10
ОК63	οσκ4	Κ6σ4	25
ОК63	οσκδ	Κ6σ5	15
Ы	ОЫЗ	οσι,ι	ЫЛ	30	РЬ1	14
ОЫЗ	οσι,2	шг	60
ОЫЗ	οσι,3	Σΐσ3	10
Ь2	0Ь25	οσι,ι	ι,2σι	30	РЬ2	10
ОЬ25	Οσΐ.2	ί2ΰ2	60
01,23	ол,з	ι,2σ3	10
ЬЗ	ОЬЗЗ	οσι,ι	Σ3σι	30	РЬЗ	10
оьзз	οσι,2	ьз σ2	60
оъзз	οσι,3	ι,3σ3	10
1,4	01,45	οσι,ι	1,4 σι	30	Р1>4	1
01,45	οσι,2	1,4 σ2	60
ОЬ45	οσι,3	1,4 σ3	10
Ь5	ОЬ55	οσι,ι	ι,5σι	30	РЬ5	1
01,55	οσι,2	Б5О2	60
01,55	οσι,3	ι,5σ3	10
Ь6	01,65	οσι,ι	ι,εσι	30	РЬ6	1
01,65	οσι,2	ι,6σ2	60
01,65	οσι,3	ьб σ3	10

Ь7	01,75	οσι,ι	Ь7О1	30	РЬ7	1
01,75	οσι,2	Ώ7σ2	60
01,73	οσι,3	^7σз	10
1,8	01,85	οσι,ι	Βδσι	30	РЬ8	1
01,85	οσι>2	1,8σ2	60
01,83	οσ^з	Ь8ОЗ	10
1,9	ОЬЭЗ	ООЬ1	Ь9О1	30	РЬЭ	1
01,93	οσι,2	Ь9О2	60
ОЬЭЗ	ооьз	Ώ9σ3	10
					УЬ 100%

- 63 017203

Таблица 4

Обзор второго цикла амплификации νΗ-областей

Матрица	5’- праймер	3’- праймер	Продукт	Доля в РК/РЬ(%)	Пул	Доля в νκ (%)
Н1	ОН13	ОЙН1	Н1Л	10	РН1	25
ΟΗ13	ОЙН2	НИ2	10
ОН13	ОЙНЗ	низ	60
ОН13	0СГН4	Н1Л	20
Н2	ОН23	οσΗΐ	Н2Л	10	РН2	2
ОН23	ОЙН2	Н2Л	10
ОН23	олнз	Н2Л	60
ОН23	ОЛИ	Н2Л	20
нз	ОНЗЗ	ОЙН1	НЗЛ	10	РНЗ	25
ОНЗЗ	ОЛ12	нзл	10
ОНЗЗ	олп	НЗЛ	60
ОНЗЗ	0СГН4	нзл	20
Н4	ОН43	оли	Н4Л	10	РН4	25
ОН43	ОЙН2	Н4Л	10
ОН43	ОЙНЗ	Н4ДЗ	60
ОН43	0СГН4	Н4Л	20
Н5	ОН58	οσκι	Н5Л	10	РН5	2
ОН5Э	ОЙН2	Н5Л	10
ОН58	ОЙНЗ	Н5йЗ	60
ОН53	ОЛИ	Н5Л	20
Н6	ОН63	оли	НбЛ	10	РН6	20
ОН63	ОДН2	Н6Д2	10
ОН63	ОЛП	Н6Л	60
ОН63	ОЛИ	Н6Л	20
Н7	ОН73	ООН1	Н7Л	10	РН7	1
ОН73	ОЛ12	Н7Л	10
ОН73	огнз	Н7Л	60
ОН78	ОЛИ	Н7Л	20
					УН 100%

Таблица 5

Характеристики отдельных библиотек В-клеток памяти 1дМ

Библиотеки В-клеток памяти 1дМ
Донор	Клетки	Библиотеки
	Общее число РВЪ (*10⁶)	% В- клеток памяти	Размер (хЮ⁶)	% частоты вставок	% ОВЕ	% однозначности
Субъект 1			3	96	74	98
Субъект 2	72,5	1,7	5	98	79	98

Субъект 3	67,5	1,4	3	96	79	98
Субъект 4	132,5	2,3	6	98	69	99

- 64 017203

Таблица 6

Данные НА-специфических одноцепочечных Γν-фрагментов

Название зсР-ν	5Е0 ГО N0: (нуклеотидная последовательность)	ЗЕ<Э Ю N0 (аминокислотная последовательность)*	νΗ- локус	νβ- локус
8С06-141	212	213 (νΗ 1-115; VI 132-245)	νΗΙ (1-18)	νκιν (Β3)
ЗС06-255	115	116 (νΗ 1-121; VI 138-248)	νΗΙ (1-69)	νβΐ (VI-16)
8С06-257	117	118 (νΗ 1-121; VI 138-248)	УН1 (1-69)	\Ъ2 (νΐ-4)
ЗС06-260	119	120 (νη 1-121; VI 138-248)	νΗΙ (1-69)	νβΐ (νΐ-17)
5С06-261	121	122 (νΗ 1-121; VI 138-249)	νΗΙ 11-69)	νΗΙ (νΐ-19)
8С06-262	123	124 (νΗ 1-120; VI 137-245)	νΗΙ (1-69)	νΚΙ (Α20)
8С06-268	125	126 (νΗ 1-120; VI 137-243)	νΗΙ (1-69)	УЬЗ (У2-1)
ЗС06-272	214	215 (νΗ 1-120; VI 137-247)	νΗΙ (1-69)	νβ2 (νΐ-3)
ЗС06-2Э6	216	217 (νΗ 1-121; VI 138-246)	УН1 (1-2)	νΚΙΙΙ (Α27)
5С06-301	218	219 (νΗ 1-117; VI 134-246)	νΗΙ (3-23)	νκΐΐ (Α3)
5С06-307	127	128 (νΗ 1-122; VI 139-246)	νΗ3 (3-21)	νκΐΐΐ (Α27)
ЗС06-ЗЮ	129	130 (νΗ 1-121; VI 138-246)	νΗΙ (1-69)	νβ3 (ν2-14)
5С06-314	131	132 (νΗ 1-121; VI 138-248)	νΗΙ (1-69)	Ш (νΐ-17)
8С06-323	133	134 (νΗ 1-120; VI 137-245)	νΗΙ (1-69)	νΚΙΙΙ (Α27)
5С06-325	135	136 (νΗ 1-121; VI 138-248)	νΗΙ (1-69)	νΐι2 (VI-4)
5С06-327	220	221 (νΗ 1-121; VI 138-246)	νΗΙ (1-69)	νΐ.3 (У2-14)
ЗСОб-328	222	223 (νΗ 1-128; VI 145-252)	νΗΙ (1-69)	νΚΙΙΙ (Α27)

ЗС06-329	224	225 (νΗ 1-121; VI 138-246)	νΗΙ (1-69)	νΚΙΙΙ (Α27)
8С06-331	137	138 (νΗ 1-120; VI 137-245)	νΗΙ (1-69)	VI® (У2-14)
5С06-332	226	227 (νΗ 1-120; VI 137-243)	νΗΙ (1-69)	νΚΙ (Α20)
8С06-334	228	229 (νΗ 1-120; VI 137-245)	νΗΙ (1-69)	Л/ЪЗ (У2-14)
5С06-336	230	231 (νΗ 1-120; VI 137-245)	νΗΙ (1-69)	νΚΙΙΙ (Α27)
8С06-339	232	233 (νΗ 1-121; VI 138-246)	νΗΙ (1-69)	УЪЗ (У2-14)
ЗС06-342	234	235 (νΗ 1-126; VI 143-256)	УН1 (1-69)	νκιν (Β3)
8С06-343	236	237 (νΗ 1-120; VI 137-245)	νΗΙ (1-69)	VI® (У2-14)
ЗС06-344	139	140 (νΗ 1-123; VI 140-250)	νΗΙ (1-69)	УЫ (VI-13)

* в скобках указаны аминокислоты, образующие вариабельную область тяжелой цепи (УН) и вариабельную область легкой цепи (Ук)

- 65 017203

Таблица 7

Данные областей СЭК НА-специфических иммуноглобулинов

В скобках указаны номера последовательностей (8ЕР ΙΌ ΝΟ)

Название	НСОК1	НСОК2	НСПКЗ	ΕΟΌΚ1	БСОК2	БСОКЗ
ЗС06-141	ΟΥΥΥΥ (238)	ΗΙ3ΑΥΝ0ΝΤΝΥ ΑΟΚΡΟΟ (239)	ЗКЗЫЭУ (240)	КЗЗОЗУЪУЗЗЙ ΝΚΝΥΕΑ (241)	ИАЗТЕЕЗ (242)	□0ΥΥ3ΤΡΕΤ (243)
ЗС06-255	3ΥΑΙ3 (1)	ΒΙΙΡΙΡΒΤΤΚΥ АРКРОВ (2)	ΗΜΒγςνκΕΤ МОУ (3)	8Β3ΤΡΝΙΒ3ΝΑ νο (4)	5ΝΝζ)ΚΡ5 (5)	ААШЖИЛУ РУ (6)
ЗС06-257	3ΥΑΙ3 ¢1)	ΘΙΙΡΙΡΒΤΤΚΥ АРКРОС (2)	ΗΜΒΎΟνΚΕΤ Μϋν (3)	ΤΒΤ83ϋν0ΒΥΝ УУЗ (7)	ЕУБЯКРЗ (8)	33ΥΤΞ35ΤΥ V (9)
ЗС06-260	3ΥΑΙ3 (1)	ΒΙΙΡΙΡΒΤΤΚΥ АРКРОС (2)	ΗΜΟΥΟνΚΕΤ М0У (3)	8Β5Κ8ΝνΒΕΝ£ νγ (10)	ΚΝΤ0ΚΡ5 (11)	УАУГООЗУЛВ Υν (12)
ЗС06-261	5ΥΑΙ3 (1)	ΒΙΙΡΙΡΒΤΤΚΎ АРКРОВ (2)	ΗΜΟΥΟνΚΕΤ МОУ (3)	5Β353ΝΙΒΝΌΥ УЗ (13)	ΟΝΝΚΚΡ3 (14)	АТТОКЕРТА Υνν (15)
ЗС06-262	Ε3ΑΙ3 (16)	ΒΙΒΡΕΡΒΤΤΝΥ ΑζΙΚΡΟΒ (17)	ΒΡΚΥΥ5ΕΥΜ υν (18)	НА30С153УБА (19)	ОАЗТБКЗ (20)	0ΚΥΝ3ΑΡΡΙ Т (21)
5С06-268	3ΥΑΙ3 (1)	ΒΙΜΒΜΡΒΤΤΝΥ АОКРОВ (22)	33ΒΥΥΡΕΥΡ <2Ώ (23)	ЗВНКБВОКУУЗ (24)	0ΟΝΚΚΡ3 (25)	0АНО53ТАУ (26)
ЗС06-272	3ΥΑΙΤ (244)	ΒΙΙΒΜΡΒ3ΤΝΥ ΑΟΝΡΟΒ (245)	δΤΒΥΥΡΑΥΙι ΗΗ (246)	ТВТЗЗОУВСУМ УУЗ (247)	ОУЗКЯРЗ (248)	33ΥΤ333ΤΗ V (249)
3006-296	3ΥΥΜΗ (250)	ΜΙΝΡΝ3ΒΒΤΜΥ АОКРОС (251)	ЕСКИВР0АА ΡΏΙ (252)	КАЗОЗУЗЗЗУБ Α (253)	ОАЗЗКАТ (254)	00ΥΒ88ΙΛΪ (255)
ЗС06-301	ΙΥΑΜΞ (256)	ΆΙ883(3ϋ5ΤΥΥ АОЗУКВ (257)	ΑΥΒΥΤΡΒΡ (258)	Κ3303ΕΕΗ£ΙΝΒ ΥΝΥΙ,Ο (259)	БСЗЙКАЗ (260)	МОАЬСТРЬ (261)
3006-307	3Υ3ΜΝ (27)	3Ι33333ΥΙΥΥ УОЗУКВ (28)	ΒΒΒ5ΥΒΑΥΕ ΟΡΟΥ (29)	КАЗОКУЗЗУБА (30)	САЗТКАА (31)	ООУСКТРБТ (32)
3006-310	3ΥΑΙ3 (1)	ΒΙΙΡΙΡΒΤΤΚΥ АРКРОВ (2)	НМВУОУКЕТ МОУ (3)	ΒΒΝΝΙΘ5Κ3νΗ (33)	БОЗОКРЗ (34)	ОУТОЗЗЗОН АУ (35)
3006-314	3ΥΑΙ3 (1)	ΒΙΙΡΙΡΒΤΤΚΥ ΆΡΚΡΟΟ (2)	ΗΜΒΥΟνΚΕΤ МОУ (3)	3Β333ΝΙΒ3ΝΥ νΥ (36)	КО60В.Р8 (37)	АТШЮЙБЗВ РУ (38)
5С06-323	3ΥΒΙ5 (39)	ΏΙΙ(3ΜΡΒ3ΤΝΥ ΑΟΝΡΟΒ (40)	35ΒΥΥΡΑΥΕ ΡΗ (41)	КАЗОЗУЗЗЗУБ А (42)	ВАЗ3КАТ (43)	ΟΟΥΒ33ΡΚΤ (44)

8С06-325	ΡΥ3Μ3 (45)	ΒΙΙΡΜΡΒΤΤΝΥ АОКРОВ (46)	3ΌΚΒΙΥΥΥΥ МОУ (47)	ΤΒτεεονοΒΥΝ γνε (7)	ЕУЗЫНРЗ (8)	ЗЗУТЗЗЗТБ V (48)
3006-327	ΤΗΑΙ3 (262)	ΘΙΙΑΙΡΒΤΑΝΥ АОКРОВ (263)	Β8ΒΥΗΙ8ΤΡ ΡΏΝ ¢264)	ΒΒΝΝΙΒΒΚΒνΗ (265)	ΟΟ3ΟΚΡ3 (266)	0УИОЗЗЗОН УУ (267)
8С06-328	ΒΥΑΙ5 (268)	6ΙΙΡΙΡΘΤΤΝΥ АОКРОВ (269)	УКОСУСТБТ БСРУВИУРБ Б (270)	КАБОЗУЗЗЗУБ А (271)	ΒΑ38ΚΑΤ (272)	<2<ЭУВБЗЬТ (273)
5С06-329	3Ν5Ι3 (274)	ΒΙΡΆΕΡΘΤΤΟΥ АОКРОВ (275)	Θ3ΒΥΤΤΚΝΥ ΡϋΥ (276)	КАЗОБУЗБИУБ Β (277)	ВА88КАЯ (278)	00УСЗЗРБТ (279)
5С06-331	3ΥΑΙ3 (1)	6ΙΙΒΜΡΒΤΑΝΥ АОКРОВ (49)	ΒΝΥΥΥΕδδΕ ΏΥ (50)	ΟΒΝΝΙΒ3Κ3νΗ (33)	ΟΟ3ΟΚΡ3 (34)	0УИО383ОН Υν (51)
8С06-332	ΝΡΑΙΝ (280)	ΒΙΙΑνΡΒΤΤΚΥ АНКР<2О (281)	ΒΡΗΥΥ33ΥΜ ϋν (282)	ΚΑ30ΘΙ3ΤΥΤΑ (283)	ААБТБ05 ¢284)	ΰΚΥΝ3ΑΡ3 (285)
8С06-334	ЗЫАУЗ (286)	ΒΙΙΧ3νΡΘ8Ρ8Υ АОКРОВ (287)	6ΡΤΥΥΥ3ΥΜ Ον (288)	ΒΒΝΝΙΒΚΝδνΗ (289)	ΟΟ3ΟΚΡ3 (290)	0УИН833ОН γν (291)
8С06-336	3ΥΑΙ3 (292)	ΘΙΡΒΜΡΒΤΑΝΥ АОКРОС (293)	38ΒΥΥΡ0ΥΡ ΟΟ (294)	КАЗОЗУЭЗЗУБ А (295)	ВАБЗЙАТ (296)	ООУСБЗЗБТ (297)
8С06-339	3ΥΑΙ3 (298)	ΒΙΙΑΙΡΗΤΡΚΥ Α0ΚΡ0Θ (299)	Β3ΤΥΟΡ33Θ ΕϋΥ (300)	СС1Ш165КБУН (301)	ΏΟ3ΟΚΡ3 (302)	0УТО885ОН νν (303)
8С06-342	5ΥΑΙ8 (304)	ΒνίΡΙΡΚΤΑΝΥ Α0ΝΡ0Β ¢305)	ΕΝΥΗΟΒΒΤΥ ΥΝΑΡΚΘΝΡΟ Ρ (306)	Κ3303ΙΙιΝ33Ν ΝΚΝΥΙχΑ (307)	ΗΑ8ΤΚΕ3 (308)	00ΥΥ33ΡΡΤ (309)
8С06-343	ΥΥΑΜ3 (310)	ΘΙ8ΡΜΡΘΤΤΤΥ АОКРОС (311)	88ΝΥΥΟ8νΥ ϋΥ (312)	ΟΟΗΝΙΒ3Ν3νΗ (313)	ΟΝ3ΟΚΡ3 (314)	ОУИВБЗЗОН Υν (315)
8С06-344	ΝΥΑΜ3 (52)	ΒΙΙΑΙΡΒΤΡΚΥ АОКРОВ (53)	ΙΡΗΥΝΡ63Β 3ΥΡΟΥ (54)	ΤΒ385ΝΙΒΑΒΥ ΟΥΗ (55)	ΒΝ3ΝΚΡ3 (56)	ВТИОЗББЗА ΥΥ (57)

Таблица 8

Данные НА-специфических

Название 1д<3	3ΕΩ Ю N0 тяжелой цепи нуклеотидной последовательности	δΕΩΙϋΝΟ тяжелой цепи аминокислотной последовательности*	3ΕΩ Ю N0 легкой цепи нуклеотидной последовательности	5ΕΩ Ю N0 легкой цепи аминокислотной последовательности*
СК6141	316	317 (УЬ 1-115)	318	319 (VI 1-114)
СК6255	58	59 (УЬ 1-121)	84	85 (VI 1-111)
СК6257	60	61 (УЬ 1-121)	86	87 (VI 1-111)
СВ.6260	62	63 (\7Ъ 1-121)	88	89 (VI 1-111)
СВ6261	64	65 (УЬ 1-121)	90	91 (VI 1-112)
СВ6262	66	67 (УЬ 1-120)	92	93 (VI 1-109)
СК6268	68	69 (УЬ 1-120)	94	95 (VI 1-107)
СК6272	320	321 (УЬ 1-120)	322	323 (VI 1-111)
СК6296	324	325 (УЬ 1-121)	326	327 (VI 1-109)
СК6301	328	329 (УЬ 1-117)	330	331 (VI 1-113)
СК6307	70	71 (УЬ 1-122)	96	97 (VI 1-108)
СК6310	72	73 (УЬ 1-121)	98	99 (VI 1-109)
СК6314	74	75 (УЬ 1-121)	100	101 (VI 1-111)
СК6323	76	77 (УЬ 1-120)	102	103 (VI 1-109)
СК6325	78	79 (УЬ 1-121)	104	105 (VI 1-111)
СК6327	332	333 (УЬ 1-121)	334	335 (VI 1-109)
СК.6328	336	337 (УЬ 1-128)	338	339 (VI 1-108)
СК6329	340	341 (УЬ 1-121)	342	343 (VI 1-109)
СК6331	80	81 (УЬ 1-120)	106	107 (VI 1-109)
СК6332	344	345 (УЬ 1-120)	346	347 (VI 1-107)
СК6334	348	349 (УЬ 1-120)	350	351 (VI 1-109)
СК6336	352	353 (УЬ 1-120)	354	355 (VI 1-109)
СК.6339	356	357 (УЬ 1-121)	358	359 (VI 1-109)
СВ6342	360	361 (УЬ 1-126)	362	363 (VI 1-114)

СК6343	364	365 (УЬ 1-120)	366	367 (VI 1-109)
СК6344	82	83 (УЬ 1-123)	108	109 (VI 1-111)

* в скобках указаны аминокислоты, образующие вариабельную область тяжелой цепи (УН) и вариабельную область легкой цепи (УЬ)

Таблица 9

Связывание с НА (Н5N1ΤV)-экспрессирующими клетками РЕК.С6

	НА (Н51М1Т\/)-экспрессирующие клетки РЕР.С6	Контрольные клетки РЕК.С6
Антитело	10 мкг/мл	1 мкг/мл	0,1 нкг/мл	10 нкг/вл	1 и кг/мл	0,1 мкг/мл
СН6255	414,18	257,13	60,43	3,16	2,64	2,48
СК6257	365,17	283,87	62,08	2 ,59	2,44	2,53
СК6260	323,42	168,49	31,06	5,42	3,34	2,57
СК6261	330,77	278,81	85,82	29, 43	13, 22	3,89
СК6262	84,29	20,91	8,06	2,71	2,53	2,48
СК.6268	421,70	218,70	43,71	3,82	2,74	2,50
СК6307	484,78	266,55	82,42	4,87	3,02	2,48
СК6314	399,54	166,98	44,51	5,99	3,49	2,64
СК6323	445,08	116,52	33,38	5,05	2,92	2,71
СК6325	478,29	239,28	64,36	4 ,00	3,11	2,57
СК.6344	768,25	328,16	106,65	80, 90	26, 33	10,17
СИЗ014	13,10	10,00	6, 21	3,11	2,69	2,55

СК6310*	597,04	290,93	86,91	14,92	6,05	4 ,42
СК.6331*	421 ,14	165,43	41,04	7,87	4,59	4,55
СИЗО14*	9,15	7,95	10,51	4,74	4,12	4,57

* Означает анализы РЛС8, выполненные в отдельном эксперименте

- 67 017203

Таблица 10

Активность антител против НА при выполнении анализа титра нейтрализующих антител

Антитело ,	Концентрация (мкг/мл)
СК6255	25
СК6257	12,5
СВ6260	12,5
СК6261	12,5
СК62 62	100
СВ6268	50
СК6307	50
СК6314	12,5
СК6323	50
СК6325	12,5
СК6344	25
СК6310	25

СВ6331	100
СК4098

* При концентрации 50 мкг/мл нейтрализация не была обнаружена

Таблица 11

Антитело	Концентрация (мкг/мл)
СК6255	3, 12
СВ6257	1,56
СК6260	3,12
СК6261	0,78
СК6262	25
СК6268	6,25
СК.6272	-
СВ.6307	25
СК6310	6,25
СК6314	3,12
СВ.6323	6,25
СК.6325	6,25
СК6327	6,25
СК6328	25
СК6329	3,12
СК6331	25
СК6332	12,5
СК6334	6,25
СК6336	25
СК6339	-
СВ6342	6,25
СК6343	50
СВ6344	25

- означает, что при концентрации 100 мкг/мл нейтрализация не была обнаружена

- 68 017203

Таблица 12 Перекрестная реактивность Ιη6 против 115X1 в отношении молекул НА разных подтипов НА, измеренная методом ЕЫ8А (ΘΌ 492 нм). N0: не определена

	Н1	НЗ	Н5	Н7	Н9	ВРВинактивированный вирус Ά/ΝΟ/20/99 (Η1Ν1)	ВРАинактивированный вирус ΝΙΒΚΌ14 (Η5Ν1)
СК6255	1, 91	0,08	1,44	0,22	1,97	1,38	1,18
СК6257	1, 93	0,08	1,37	0,16	2,06	1,34	1,21
СК6260	1, 88	0,08	1, 45	0,19	2,00	1,34	1,17
СК6261	2,04	0,07	1, 44	0, 31	2,32	1,46	1, 41
СК.6262	1,48	0,09	1, 02	0, 17	1, 93	0,51	0,35
СК6268	1,78	0, 08	1,30	0,15	2,16	1,39	1,13
СК6272	0,81	0, 07	0,58	0,15	0, 96	0, 92	0,79
СВ.6307	0,22	0,11	0, 99	0,22	0,17	0,23	0,50
СВ6310	1,92	0, 08	1,37	0,18	2,17	1,31	1, 00
СК6314	1,93	0, 07	1, 48	0,25	2,21	1,37	1,42
СВ6323	2,32	0,07	1, 89	0,15	2,27	1,40	0, 93
СК6325	1,42	0,07	1,30	0,17	2,04	1,09	1,20
СК6327	1,75	0,08	1,11	0,14	1, 93	1,16	0,73
СК6328	2,43	0,07	1,78	0,16	2,38	1,39	0, 98
СК6329	1, 98	0,08	1,43	0,17	2,16	1,04	1, 01
СК6331	1,75	0, 06	1,32	0,16	2,02	1,25	0, 92
СК6332	2,20	0,15	1, 65	0,26	2,11	1,20	1,11
СК6334	2,04	0, 07	1,19	0, 15	1,82	1,13	0, 91
СН6336	1, 92	0,10	1, 41	0, 18	2,02	1, 09	0, 94
СН6339	1,25	0, 07	0, 81	0,14	1, 96	0,94	0,50
СВ.6342	1, 99	0,09	1,25	0,17	2,13	1,32	0, 90
СВ.6343	1,28	0,07	0,76	0,15	1,88	0, 91	0, 64
СВ6344	1, 80	0,09	1,31	0,18	2,15	1,31	0, 96
СК5111	0, 08	0, 07	1,57	0,15	0,17	0, 09	0, 81
СК3014	0,08	0,07	0,09	0,17	0,16	0,09	0,11
Нет 1дС	0,13	0,08	0,09	0,15	0,16	0,09	0,14
Антитело овцы против Н5	Νϋ	ΝΌ	Νϋ	0, 90	2,07	2,62	2,93

Таблица 13

Картирование эпитопов антител человека против НА

	НА1	НА2	СК5111	СК6342 С17 9	СВ6307 СВ.6323	СВ6261 СК6325 СК6329
Η5Ν1Τν	ΤΟΒΚΝ	6νΤΝΚνΝ3ΙΙϋΚ	+	+	+	+
Мутант I	к----	—	+	-	+	+
Мутант II	—	-----_Е------	+	-	+	-
Мутант III	—м—	—	+	+	+	+
Мутант IV	—	-------К----	+	-	+	+
Мутант V	—	----------Ν-	+	+	+	+

- 69 017203

Таблица 14

Клинические оценки мышей, которым предварительно вводили антитело и затем смертельную дозу вируса гриппа №N1

№ Доза	Число мышей, имеющих клинические признаки³
группы антитела								День исследования
(мг/кг)	-1	0	1	2	3	4	5 6	Ί 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

1	СК6261-15	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/9	0/9	0/9	0/9	0/9.	0/9	0/9	0/9	0/9
2	СК6261-5	0	0	0	0	0	0	.·	2/у	/ У	1/8	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7
3	СК6261-2	0	0	0	2	ΙΙΪΙΙ	5	4/9	3/8	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	0/7	’ -	0/7	0/7
4	СК6261- 0.7 СК6323-15	0	0	1111	10	8/8	7/7	7/7	6/6	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	1/4	1/4	1/4	1/4
5	0	0	111	1111	1111	\|\|1	0/9	0/9	0/9	0/9	-/г	0/9	0/9	0/9	:	0/9	0/9	0/9	0/9’
6	СВ6325-15	0	0	о'	.........0.........	0	0	.·	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
7	Κ3Η5Ν3	0	0	5	\|\|\|(	10	6/6	1/1	1/1	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0
8	СК3014-15	10	10	10	10	9/9	5/5	1/1	1/1	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0	0/0

из 10 мышей, за исключением особо оговоренных случаев

Таблица 15 Расстройство дыхания у мышей, которым предварительно вводили антитело и затем смертельную дозу вируса гриппа №N1

№ Доза							Число	мышей с	расстройством	дыхания³
группы антитела								День	исследования
(мг/кг)	-1	0	1	2	3	4	5 6	7 8	9 10 11 12	13 14 15 16 17 18 19 20 21

1	СК6261-15	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
2	СК6261-5	0	0	0	(	0 ,	ИМИ	ИИ	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3	СК6261-2	0	0		ΙΙΙΒΙΙΙ!	\|\|\|\|\|\|	0			0			0	0	0	0	0
4	СК6261- 0.7	0	II··	ΜΙΜΙΙΙΙ	ШЛ	IIIII	11111	И111	4	4	4	1И11	0	0	0	0	0
5	СК6323-15	0		“Т“	0	.....“о“	0	'ПГ““	0		0	“Т	0	0	0	0	0
6	СН6325-15	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
7	КаНбИЗ	0	10	иди	\|\|\|\|\|	\|ИИ\|
8	СК3014-15	10	им	ΙΙΙΙΙ	II	Ι\|·\|Ι

Таблица 16

Клинические оценки мышей, инфицированных вирусом И5М1, которым вводили антитело в разные периоды времени после инфицирования

№	Интервал	Число мышей,	- имеющих клинические признаки³
группы	времени										День	исследования
	ρ.ΐ.	-1	0	1	.1:	.·	·.				8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
1	4 часа	0	0	0	4	··	2		2	0	0	0	0/9		0/9	:> ·.	0/9	0/9	0/9	0/9	0/9	0/9	0/9	0/9
2	1 день	0	0	0	\|[\|1	10	ю.	10	1.0	.·	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3	2 дня	0	0	0	з :	10	10	10	То	ΒΙΙΙΙΙί	9 ?	9	8 '	5	' 4	2	0	0	0	0	0	0	0	0
4	3 дня	0	0	0	ΙΙΙΙΙ	1III	10	10	10	10	10	10	\|Ι!\|·Ι·	10	3	И	ΙΙΙΙΙ	0	0	0	0	0	0	0
5	СК2006	0	0	0	ΙΙΙΙΙ	7	10'	10	10	6/6	1/1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

^а по 14 мышей в группах 2 и 6 до 6-го дня после инфицирования (ρ.ΐ.)

- 70 017203

Таблица 17

Расстройство дыхания у мышей, инфицированных вирусом Η5Ν1, которым вводили антитело в разные периоды времени после инфицирования

№	Интервал							Число	мышей с	расстройством	дыхания⁷
группы	времени										День	исследования
	р. ί.	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
1	4 часа	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
2	1 день	0	0	0	0	0	0	2	2	0		0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3	2 дня	0	0	0	0	0	0	10	10	2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
4	3 дня	0	0	0	0	0	0	10	10	5		7	\|\|\|\|\|\|	4		0	0	0	0	0	0	0	0	0
5	СК2006	0	0	0	0	0	0	10	10	111		0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

оценка 3

Таблица 18 Смертность мышей, инфицированных вирусом Η5Ν1, которым вводили антитело в разные периоды времени после инфицирования

Число живых мышей в каждый день исследования

№ группы	Интервал времени ρ.ί.	День исследования
-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
1	4ч	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9
2	1 Д	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
3	2Д	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
4	ЗД	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
5	СК2006	10	10	10	10	10	10	10	10	6	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

Таблица 19

Смертность мышей, инфицированных вирусом Η1Ν1, которым вводили антитело в разные периоды времени до и после инфицирования

Интервал времени . после инфицирования	Число живых мышей в каждый день исследования День исследования
-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
-1 Д	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
1 Д	10	10	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9	9
2 Д	10	10	9	9	9	9	9	9	9	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8
З.д	10	10	10	10	10	10	10	9	9	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8
контрольная группа	10	10	10	10	10	10	10	10	5	2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

Таблица 20

Клинические оценки мышей, инфицированных вирусом Η1Ν1, которым вводили антитело в разные периоды времени до и после инфицирования

№ Интервал					Число мышей, имеющих клинические признаки®
группы времени					День исследования
р.1. -1	0	1	2	3	4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

6	День -1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
10	1 день	• э	9	9	9	9		0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
9	2 дня	9	9	9	9	9	9'	8/8	8/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8
8	3 дня	10	10	10	10	9/9	9/9	С'.-	8/8	8/8	8/8	0. 8	4/8	3/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8
7	контрольная	10	10	10	10	10	5/5	2/2

группа по 9 мышей в группах, которым вводили антитело, в 1-й и 2-й день после инфицирования (ρ.ΐ.)

- 71 017203

Таблица 21

Расстройство дыхания у мышей, инфицированных вирусом НШ1, которым вводили антитело в разные периоды времени до и после инфицирования

Интервал	Число	мышей с	расстройством	дыхания³
Времени после										День	исследования
инфицирования	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
День -1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
1 день	0	0	0	\|\|Д	ΙΙΙΙΙ	10	2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
2 дня	0	0	0	ЛИ	8	10	9	з ;	II·	2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3 дня	0	0	0	4	10	9	10	9 ...	ΙΙΙΙΙ	8 ·	8	8	8	6	0	0	0	0	0	0	0	0	0
контрольная группа	0	0	0	1	9	ΙΙΙΙΙ	10	10	5	II·'

а оценка 2 или 3

Таблица 22

Последовательность эпитопа НА2 в разных подтипах вируса гриппа. Подчеркнутые аминокислоты означают замену валин (У) глутаминовая кислота (Е) в необнаруживаемом мутанте IΙ2Ν2 (мутант II; табл. 13)

	НА 2	8Ε<2 Ю ΝΟ:
Η5Ν1: А/Вьетнам/1203/2004	ΘντΝκνκδίιοκ	368
Η5Ν1: А/Гонконг/15 6/97	ΟνΤΝΚνΝδΙΙΝΚ	369
Η5Ν2 : А/Малд/РА/84	ΟνΤΝΚνΝΞ I ЮК	368
Η1Ν1:
А/РР/8/34 А/Южная Каролина/1/1918 Α/ΪΪ3Ν/33 А/Новая Каледония/20/99 А/Бангкок/10/83 А/Ямагата/12 0/8 6	ΟΙΤΝΚνΝδνίΕΚ	372
Η2Ν2 : А/Окуда/57 А/Кумамото/1/65 А/Корея/42 6/68 А/Изуми/5/65	ΟΙΤΝΚνΝΒνίΕΚ	372
Η2Ν2 : А/Изуми/5/65 (К)	ΟΙΤΝΚΕΝδνίΕΚ	373
Η6Ν2: А/Маллард/Нидерланды/16/99	ΟΙΤΝΚνΝδΙΙϋΚ	374
Η9Ν2 : А/Гонконг/1073/99	ΚΙΤδΚνΜΝίνϋΚ	375
Η3Ν2 : А/Аичи/2/68	ΟΙΝεΚΙΪΝΚνίΕΚ	376
Η3Ν2 : А/Фукуока/С2 9/8 5	ΟΙΝΟΚΕΝίαΐΕΚ	377

- 72 017203

Ссылки

Вое1 Е е! а1. (2000), Рипсйопа! Ьитап топос1опа1 апНЬоШез о£ аП 1зо1урез сопз1гис1ек &от рЬа§е сйзр1ау НЬгагу-кепуекзт§1е-сЬат Ρν апкЬоку йа§теп1з. 1.1ттипо1.

МеШокз 239:153-166

Випоп ОК апс! ВагЬаз СР (1994), Нитап апНЪосИез йот сотЬта1опа1 НЬгапез. Αάν.

1ттипо1. 57:191-280

Спои ТС апк Р Та1а1ау (1984) риапшапуе апа1уз1з о!козе-епес! ге1аиопзшрз: те сотЫпек е£1ес1з оГтиШрк кги§з ог епгуте тЫЬйогз. Αάν Епгуте Ке§и1 22:27-55

Ое КгшГ 1 е1 а1. (1995а), Кар1к зекскоп о£ сеП зиЬрори1а11оп-зрес1йс Ьитап топос1опа1 апйЬосНез йот а зупШейс рЬа§е апНЬоку НЬгагу. Ргос Ма11 Асак δοΐ Ы8А 92:3938

Ое Кгш£ I е! а1. (1995Ь) 8е1ес1юп апк аррНсакоп ок Ьитап зтцк-сЬат Ρν апкЬоку

Йа§теп1з йот а 8егт-зуп1Ье1к рЬа§е апкЬоку к!зр1ау НЬгагу \уйЬ кезщпек СОКЗ ге§1опз. I Μοί. Βίοί. 248:97-105.

Ни1з О е! а1. (1999) АпкШтог 1ттипе ейес!ог тесЬатзтз гесгайек Ьу рЬа§е к1зр1аукепуек £и11у Ьитап 1§О1 апк 1§А1 топоскпа! ап11Ьок1ез. Сапсег Кез 59:5778-5784

Окипо Υ е! а! (1993) А соттоп пеи1га1!гт§ ерйоре сопзегуек Βεΐννεεη 1Ье Ьета§81и1штз оПпЙиепга Α νϊηΐ3 Н1 апк Н2 з1гатз. I. νίτοί. 67:2552-2558.

81оо1зйа IV/ е! а1. (1996) 81гис!ига1 азрес!з οί апйЬоку-ап11§еп Мегаскоп геуеакк 1Ьгои§Ь зтаП гапкот реркке НЬгапез. Μοί. ΟίνβΓβ. 1:87-96.

δπιίπιον ΥΑ е! а! (1999) Ап ерйоре зЬагек Ьу 1Ье Ьета£§1и1ттз о£Н1, Н2, Н5 апк Н6 зиЫурез οί тйиепга Α у1газ. Ас1а νΐτοί. 43:237-244.

Тке Ψογ14 НеаИЬ Огеашгакоп 61оЬа11пЯиепга Рго§гат ЗигуеШапсе Ке1ууогк (2005),

Ενοίυΐϊοη οί Η5Ν1 Ау1ап 1пДиепга Уйизез ίη Аз1а. Етег§ 1п£ес1 Οϊβ 11:1515-1521

Claims

1) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2

- 74 017203 тяжелой цепи 8ЕО ΙΌ N0: 22, область СЭК3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 23, область СЭК1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 24, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 25 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 26;

д) связывающей молекулы, включающей область СГОЕ1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 1, область СЭК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2, область СЭК3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 3, область СЭК1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 33, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 34 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 35;

к) связывающей молекулы, включающей область СГОЕ1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 1, область СГОЕ2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2, область СЭК3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 3, область СЭК1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 36, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 37 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 38;

ί) связывающей молекулы, включающей область СЭК! тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 39, область СЭК.2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 40, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 41, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 42, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 43 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 44;

_)) связывающей молекулы, включающей область СЭК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 45, область СЭК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 46, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 47, область СЭК 1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 7, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 8 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 48;

k) связывающей молекулы, включающей область СГОЕ1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 1, область СЭК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 49, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 50, область СЭК 1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 33, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 34 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 51;

l) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 52, область СЭК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 53, область СГОК3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 54, область СГОК1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 55, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 56 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 57;

т) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 262, область СГОК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 263, область СЭК3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 264, область СГОК1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 265, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 266 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 267;

п) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 268, область СГОК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 269, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 270, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 271, область СГОК2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 272 и область СГОК3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 273;

о) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 274, область СГОЕ2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 275, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 276, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 277, область СГОК2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 278 и область СГОК3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 279;

р) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 280, область СГОК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 281, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 282, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 283, область СГОК2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 284 и область СГОК3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 285;

с.|) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 286, область СГОЕ2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 287, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 288, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 289, область СГОК2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 290 и область СГОК3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 291;

г) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 292, область СГОК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 293, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 294, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 295, область СГОК2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 296 и область СГОК3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 297;

§) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 304, область СГОЕ2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 305, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 306, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 307, область СГОК2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 308 и область СГОК3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 309; и

ΐ) связывающей молекулы, включающей область СГОК1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 310, область СГОК2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 311, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 312, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 313, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 314 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 315.

1) ΟνΤΝΚνΝδΙΙϋΚ (8Ер ГО ΝΟ: 368),

1. Выделенная связывающая молекула человека, способная узнавать и связываться с эпитопом в субъединице НА2 белка гемагглютинина (НА) вируса гриппа, отличающаяся тем, что указанная связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Н5, такого как Η5Ν1, Η5Ν2, Η5Ν8 и Η5Ν9, и тем, что указанная связывающая молекула включает νΗ1-69 νΗ-области гена зародышевой линии клеток.

2) ΟνΤΝΚνΝδΙΙΝΚ (вЕр ГО ΝΟ: 369),

2. Выделенная связывающая молекула, способная узнавать и связываться с эпитопом в субъединице НА2 белка гемагглютинина (НА) вируса гриппа, отличающаяся тем, что указанная связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Н5, и нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Η1, где связывающая молекула содержит область СОК1 тяжелой цепи вЕр ГО ΝΟ: 1, область СОК2 тяжелой цепи вЕр ГО ΝΟ: 2, СОК3 тяжелой цепи вЕр ГО ΝΟ: 3 и область СОК1 легкой цепи вЕр ГО ΝΟ: 13, область СОК2 легкой цепи вЕр ГО ΝΟ: 14, область СОК3 легкой цепи вЕр ГО ΝΟ: 15.

3) ΟνΊΝΚΈΝδΙΙΟΚ (вЕО ГО ΝΟ: 370),

3. Связывающая молекула по п.1 или 2, где указанная связывающая молекула обладает также нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Η1, такого как Η1Ν1, и указанная связывающая молекула предпочтительно обладает также нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Н2, Н6 и/или Н9.

4) ΟVΤNΚVNКIГОΚ (вЕр ГО ΝΟ: 371),

4. Связывающая молекула по п.1, где указанный эпитоп в субъединице НА2 выбран из группы, включающей аминокислотную последовательность:

5. Связывающая молекула по п.1, где указанная связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из:

a) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 2 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 3;

b) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 16, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 17 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 18;

c) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 22 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 23;

ά) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 39, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 40 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 41;

е) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 45, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 46 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 47;

Б) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 49 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 50;

ί) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 52, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 53 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 54;

_)) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 262, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 263 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 264;

k) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 268, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 269 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 270;

l) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 274, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 275 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 276;

т) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 280, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 281 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 282;

п) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 286, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 287 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 288;

о) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 292, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 293 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 294;

р) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 304, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 305 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 306; и

с.|) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 310, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 311 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 312.

5) ΟΙΤΝΚνΝδνΕΚ (вЕр ГО ΝΟ: 372),

6. Связывающая молекула по п.5, где указанная связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 2 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 3; и связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 39, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 40 и область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 41.

6) ΟIΤNΚЕNδVIЕΚ (вЕр ГО ΝΟ: 373),

7. Связывающая молекула по п.6, где указанная связывающая молекула содержит область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 2 и область СОК3 тяжелой цепи 8ЕО ΙΌ N0: 3.

7) ΟIΤNΚVNδIГОΚ (вЕО ГО ΝΟ: 374) и

- 73 017203

8. Связывающая молекула по пп.1-3, где указанная связывающая молекула содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислоты 1-121 последовательности 8Е6 ΙΌ N0: 65.

8) ΚΙΤ^ΚΥΝΝΙΥΌΚ (НЕС) ΙΌ N0: 375).

9. Связывающая молекула по п.1, где указанная связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из:

a) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 2, область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 3, область СОК1 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 4, область СОК2 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 5 и область СОК3 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 6;

b) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 2, область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 3, область СОК1 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 7, область СОК2 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 8 и область СОК3 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 9;

с) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 2, область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 3, область СОК1 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 10, область СОК2 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 11 и область СОК3 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 12;

ά) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 1, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 2, область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 3, область СОК1 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 13, область СОК2 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 14 и область СОК3 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 15;

е) связывающей молекулы, включающей область СОК1 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 16, область СОК2 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 17, область СОК3 тяжелой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 18, область СОК1 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 19, область СОК2 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 20 и область СОК3 легкой цепи 8Е6 ΙΌ N0: 21;

10. Связывающая молекула по п.8, где указанная связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из связывающей молекулы, включающей область СГОЕ1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 1, область СГОЕ2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 3, область СГОЕ1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 13, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 14 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 15; и связывающей молекулы, включающей область СГОЕ1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 39, область СГОЕ2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 40, область СГОЕ3 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 41, область СЭК1 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 42, область СГОЕ2 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 43 и область СГОЕ3 легкой цепи 8Е0 ГО N0: 44.

11. Связывающая молекула по п.10, где указанная связывающая молекула содержит область СГОЕ1 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 1, область СГОЕ2 тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2 и область СГОЕ3 тяжелой цепи

- 75 017203

8Е^ ΙΌ N0: 3, область СЭК1 легкой цепи 8Е^ ΙΌ N0: 13, область СОК2 легкой цепи 8Е^ ΙΌ N0: 14 и область СОК3 легкой цепи 8Е^ ΙΌ N0: 15.

12. Связывающая молекула по пп.1-3, где указанная связывающая молекула содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислоты 1-121 последовательности 8Е^ ΙΌ N0: 65, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислоты 1-112 последовательности 8Е^ ΙΌ N0: 91.

13. Связывающая молекула по любому из пп.1-12, где указанная связывающая молекула является моноклональным антителом человека.

14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающую молекулу по любому из пп.1-13.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу по любому из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

16. Применение связывающей молекулы по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа.

17. Способ диагностики инфекции, вызванной вирусом гриппа, предусматривающий стадии (а) приведения в контакт образца с диагностически эффективным количеством связывающей молекулы по любому из пп.1-13 и (Ь) определения факта специфического связывания связывающей молекулы и молекулы образца.

СК6307 СК6323 1 2 3 4 1 2 3 а; СК5111 12 3 4 НАО -> £ НА1 НАГ а Фиг. 1