CN106661104A - 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

提供了一种特异性结合人硬骨素的人源化抗体和嵌合抗体，所述抗体可用于治疗人骨代谢相关疾病如骨质疏松症等。

Description

抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途 技术领域
本发明涉及特异性结合人硬骨素(SOST)的高亲和力抗体及其抗原结合片段，及所述抗体作为治疗剂，特别是作为用于SOST介导的骨性疾病或病症如骨质疏松症的治疗用途，所述受试者受益于骨量(bone mass)、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中至少一项的提高。
背景技术
骨质疏松症(Osteoporosis，OP)包括绝经后妇女骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)和老年性骨质疏松症，是一种以低骨量和骨微结构退化为特征，造成骨强度下降、骨脆性增加、易于发生骨折的全身性骨代谢障碍性疾病。据统计，全球约有2亿人骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。我国60岁以上老年女性骨质疏松症的患病率高达60％，男性患病率也在40-50％。
除了加强运动、服食钙片和维生素D、普及骨折预防知识等传统措施之外，现行的药物治疗主要局限于减少骨吸收以防止骨折。抗骨吸收类药物包括有降钙素、双磷酸盐、雌激素替代剂和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)等。这些以双磷酸盐为代表的骨吸收抑制剂尽管能够阻止进一步的骨质流失，却无法重建已经流失的骨质，并且在抑制骨吸收的同时，同样抑制骨生成。激素类药物更加有着引起静脉血栓和诱发心血管疾病的风险。更重要的是，真正意义上的骨合成代谢药不但可以提高骨量，还应该能够有效改善骨微结构并促进骨生成，而这一点恰恰是目前抗骨吸收类药物所不具备的。在过去的15年时间里，各种旨在降低骨折风险的医疗措施经系统化研究进入临床试验阶段，而实际可选用药依然十分匮乏。迄今为止，只有甲状旁腺激素(PTH)类药物被证明可以刺激骨生成，但是，其诸多缺点也是有目共睹的。譬如，它对于骨再造的作用并不持久、对于骨折修复作用不大、需要每天皮注给药一年以上，而且只能低剂量给药、价格昂贵、使用期不得超过两年以及其暴露的安全性问题遭到美国FDA的黑框警告等等。
硬骨素(Sclerostin)作为新的生物靶点用于药物开发，其原理是可以通过调节成骨细胞合成代谢治疗骨质疏松，该靶点填补通过调控骨代谢方式治疗骨质疏松领域空白。
硬骨素是SOST基因表达分泌的糖蛋白，其氨基酸序列的结构特征在于190个残基以及带有半胱氨酸的环状结构域。已证实其表达主要在骨细胞中进行，而在成骨细胞、软骨、肝、肾、骨髓、心脏、胰脏等位置只有很低程度的表达。
研究表明，硬骨素通过结合低密度脂蛋白受体LRP5/6抑制Wnt信号传导调控骨生成。目前有几家公司针对该靶点开发的单克隆抗体药物分别已经进入临床III，II期。这些抗体的适用症均为骨质疏松/骨质疏松症以及骨损伤/相关骨病治疗等。 相关的专利有：WO2008133722、WO2010130830、WO2013063095、WO2014006100、WO2014081955、WO2005014650、WO2006119062、WO2008115732。值得一提的是，有研究表明，抗硬骨素抗体与传统的双磷酸盐类药物治疗并不冲突，有联用的可能。
本发明提供针治疗骨质疏松等骨病的新靶点开发的新抗体，具有高亲和力、高药效、延长半衰期、可以减少给药次数的特性，此外，本发明新分子溶解度高、稳定性好，可以让生产制剂更加容易，从而降低生产成本。
发明内容
本发明抗体是嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体，其包含本文公开的特异性多肽序列，以高结合亲和力和特异性结合人硬骨素并可用于增加哺乳动物，优选人中的骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量和骨强度中的至少一项。
本发明提供一种SOST抗体或其抗原结合片段，其包含至少1个CDR区，所述CDR区选自以下序列或其突变序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：
抗体重链可变区HCDR区：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；和
抗体轻链可变区LCDR区：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如下的HCDR区序列或其突变序列：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如下的LCDR区序列或其突变序列：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含HCDR区序列SEQ ID NO:7(HCDR1)，SEQ ID NO:8(HCDR2)和SEQ ID NO:9(HCDR3)，或其突变序列，和LCDR区序列SEQ ID NO:10(LCDR1)，SEQ ID NO:11(LCDR2)和SEQ ID NO:12(LCDR3)，或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的CDR区突变序列为CDR区发生1-3个优化抗体活性的氨基酸突变，其中所述的HCDR2区突变序列优选为SEQ ID NO:13。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的鼠源抗体重链可变区序列为SEQ ID NO:5或与其具有至少 95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的鼠源抗体轻链可变区序列为SEQ ID NO:6或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的鼠源抗体重链可变区序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区序列为SEQ ID NO:6。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其抗体重链可变区进一步包含源自鼠源的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其进一步包含源自鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、或其变体的重链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其抗体轻链可变区进一步包含选自鼠源κ或λ链、或其变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其进一步包含选自鼠源κ或λ链、或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为嵌合抗体或人源化抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体重链可变区进一步包含人源IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4或其变体的重链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-18*01的FR1，FR2，FR3区和FR4区的框架序列或其突变序列，优选所述突变序列为0-10个氨基酸的回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:14-16所示的重链可变区序列或其变体或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV1-39*01和/或IGKV4-1*01的FR1，FR2，FR3区和FR4区的框架序列或其突变序列，优选所述突变序列为0-10个氨基酸的回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:17-19所示的轻链可变区序列或其变体或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或 其片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:14-16的重链可变区和选自SEQ ID NO:17-19的轻链可变区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体包含选自(a)至(c)任一的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合：
(a)SEQ ID NO:14的重链可变区序列和SEQ ID NO:17的轻链可变区序列；
(b)SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:18的轻链可变区序列；
(c)SEQ ID NO:16的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体的重链恒定区包含源自人源IgG1或其变体、人源IgG2或其变体、人源IgG3或其变体或人源IgG4或其变体的恒定区，优选包含人源IgG1或其变体或人源IgG4或其变体的恒定区，更优选人源IgG4或其变体的恒定区。恒定区也可以做一些如“YTE”之类改变性能的修饰。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:24-26或与其具有至少90％同源性的全长重链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链可变区进一步包含任选自人源κ或λ链或其变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其进一步包含选自人源κ或λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:27-29或与其具有至少90％序列同源性的全长轻链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:24-26的全长重链序列和选自SEQ ID NO:27-29的全长轻链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体具有选自以下任一的全长轻链序列和全长重链序列的组合：
Ab-10:SEQ ID NO:24的重链序列和SEQ ID NO:27的轻链序列
Ab-9:SEQ ID NO:25的重链序列和SEQ ID NO:28的轻链序列；或
Ab-5:SEQ ID NO:26的重链序列和SEQ ID NO:29的轻链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv或F(ab’)2。
本发明进一步提供一种编码如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段的表达 前体产物的DNA序列。
本发明进一步提供一种含有如上所述的DNA序列的表达载体。
本发明进一步提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的宿主细胞，其中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段和一种或多种可药用的赋形剂、稀释或载体。
本发明进一步提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段、或包含其的药物组合物，在制备用于增强骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中的至少一种的药物中的用途。
本发明进一步提供一种如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段、或包含其的药物组合物，在制备用于治疗SOST介导的骨性疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症选自骨质疏松症、骨质减少或骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病或障碍；优选为骨质疏松症。
本发明进一步提供一种治疗和预防SOST介导的骨性疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的如上所述的SOST抗体或其抗原结合片段、或包含其的药物组合物；其中所述的疾病或病症选自骨质疏松症、骨质减少或骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病或障碍；优选为骨质疏松症。
附图说明
图1，显示本发明人源化抗SOST抗体在食蟹猕猴体内的药物浓度-时间曲线图，该结果表明同剂量下，本发明人源化抗体的AUC0-t(mg/ml*day)为22.3，是阳性抗体Romosozumab(9.95)的2倍以上。
图2，显示本发明人源化抗SOST抗体对食蟹猕猴的体内腰椎骨密度(BMD)增加百分比。该结果表明本发明人源化抗SOST抗体在食蟹猕猴体内药效呈剂量依赖性。人源化抗SOST抗体Ab-5药效10mg/kg和阳性分子30mg/kg相当，即本发明分子猴体内药效是阳性分子Romosozumab的三倍。
具体实施方式
本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用具体化合物的活性、患者的年龄、患者的体重、患者的健康状况、患者的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合等；另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、本发明抗体或其组合物的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见 在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
术语
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
当在本文中使用时，术语“硬骨素”或“SOST”或“SOST蛋白”或“Sclerostin”指硬骨素(sclerostin or SOST)基因表达产物(蛋白质)，本发明中如非特指，比如鼠SOST(m-SOST)或食蟹猕猴SOST(cyno-SOST)，均指人的SOST(h-SOST)。本发明中所用的人、鼠、食蟹猕猴SOST均通过GenBank得到核苷酸序列，例如NP_079513.1提供人SOST蛋白质序列。
如本文中所用，意指本发明的抗硬骨素抗体(或简言之，“本发明抗体”)的术语“抗体”指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术，或其它现有技术的组合或本领域容易已知的其他技术进行重组得到。
“单克隆抗体”或“本发明抗体”或简单地“抗体”可以是完整的抗体(包含完整的或全长Fc区)，或包含抗原结合部分的抗体部分或片段，例如嵌合或人源化抗体的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。尤其优选地本发明抗体的抗原结合片段保留了体内或体外抑制或中和哺乳动物硬骨素的一种或更多种生物活性特征的能力。例如，在一个实施方案中，本发明抗体的抗原结合部分可以抑制人硬骨素与一个或更多个其配体的相互作用和/或可以抑制人硬骨素的一种或更多种受体介导功能。
此外，如本文所用，“单克隆抗体”或“本发明抗体”或简单地“抗体”可以是通过用接头序列连接编码LCVR和HCVR的DNA产生的单链Fv片段。(参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994)。应理解不管是否详细说明抗原结合片段或部分，如本文所用的术语“抗体”包括这种片段或部分及单链形式，除非另有说明，只要蛋白质保留了特异性结合硬骨素的能力，其就包括在术语“抗体”内。
本发明中术语“抗硬骨素抗体”、“特异性结合人硬骨素的抗体”、“抗SOST抗体”、“抗SOST”、“SOST抗体”或“结合SOST的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合SOST抗体以致所述抗体可以用作靶向SOST中的诊断剂和/或治疗剂。
如本文所用，术语“特异性结合”指如通过本领域可用的技术，例如竞争ELISA、测定或测定所测定的。该术语还适用于当例如本发明抗体的抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位特异的情况，在该情况下携 带抗原结合结构域的抗体能够特异性结合携带该表位的多种抗原。术语“表位”指在一个或更多个抗体的抗原结合区中能够被抗体识别并结合的分子部分。
对于本发明抗体，短语“生物活性”包括，但不限于表位或抗原结合亲和力、在体内或体外中和或拮抗硬骨素生物活性的能力、在硬骨素抗体体外结合人硬骨素和阻断人硬骨素和LRP-6结合实验(例如，本文测试例1，2中所述)或其他体外活性测定中的IC50、抗体的体内和/或体外稳定性。使用本领域认可的技术，包括但不限于ELISA、竞争性ELISA、表面等离振子共振分析、不受限的体外和体内中和测定、受体结合及来自不同来源(包括人、灵长类)或根据需要的任何其他来源的组织切片的免疫组织化学观察或测定上述性质或特性。
对于硬骨素，短语“生物活性”包括，但不限于硬骨素对另一蛋白质(例如受体或TGF-β家族成员)的特异性结合、人硬骨素的一种或更多种受体介导的功能、信号转导、免疫原性、体内或体外稳定性、在体内或体外影响另一蛋白质的水平或活性(参见例如测试例1-5)、硬骨素表达水平和组织分布。
如本文所用，对本发明抗体的生物活性所用的术语“抑制”或“中和”指基本上拮抗、阻止、妨碍、抑制、减缓、中断、消除、中止、减少或颠倒硬骨素生物活性的能力(例如，本文测试例2中所测定)。
如此处所用，术语“Kabat编号”是本领域所公认的并指对氨基酸残基进行编号的系统，所述氨基酸残基比抗体重链区和轻链区中的其他氨基酸残基更易变(即，高变的)(Kabat，等，Ann.NY，Acad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat，等，Sequences，of，Proteins，of，Immunological，Interest，第五版，U.S.Department，of，Health，and，Human，Services，NIH，Publication，No.91-3242(1991))。抗体可变区中的CDR位置遵循Kabat编号或简单地“Kabat”。
此处互换使用的术语“受试者”和“患者”指哺乳动物，优选人。在某一实施方案中，受试者进一步特征在于其患有将从硬骨素水平降低或硬骨素生物活性降低中受益的疾病或障碍或病症。
术语“载体”指能够转运另一核酸的核酸分子，该核酸分子与该另一核酸已经有效连接，该术语包括，但不限于质粒和病毒载体。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中进行自主复制，而其他载体可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导有效连接至其的基因的表达。此处将这种载体称作“重组表达载体”(或简单地“表达载体”)。示例性载体为本领域所熟知。
如此处所用，表述“细胞”、“宿主细胞”和“细胞培养物”可互换使用，并包括各种细胞或细胞培养物，其为本发明任何分离的多核苷酸或包含编码本发明HCVR或LCVR或抗体的核苷酸序列的任何重组载体的受体。宿主细胞包括用一个或更多个重组载体或表达本发明单克隆抗体或其轻链或重链的多核苷酸转化、转导或感染的细胞。
全长抗体的各重链包含N端重链可变区(此处为“HCVR”)和重链恒定区。全长抗体的各轻链包含N端轻链可变区(此处为“LCVR”)和轻链恒定区。可将HCVR和LCVR区进一步再分成高变区，称为互补决定区(“CDR”)，其中散布着称为框架区(“FR”)的更保守区。抗体结合特定抗原或表位的功能性能力很大程度上受抗体可变区中存在的六个CDR的影响。各HCVR和LCVR包含三个CDR(HCVR中的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCVR中的LCDR1、LCDR2和LCDR3)和四个FR，从氨基端到羧基端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大多数残基。可变区内的CDR排位遵循Kabat。
轻链分类为κ或λ，并且由本领域已知的特定恒定区表征。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，并且这些中的几个还可以进一步分成亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。各重链类型的特征在于具有本领域早已知序列的特定恒定区。轻链恒定区κ和重链恒定区IgG1、IgG2、IgG3、IgG4是本发明抗体中的优选恒定区。嵌合抗体可具有非人类来源，优选大鼠或鼠类来源的恒定区。
如此处所用，“抗原结合区”或“抗原结合部分”指抗体分子可变区内的一部分，其含有与抗原相互作用并赋予抗体对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。该抗体部分包括维持抗原结合残基正确构象所必需的框架氨基酸残基。
本发明的优选抗体包含具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12氨基酸序列的六个CDR。本发明更优选的抗体包含具有SEQ ID NO:19、27、28、32、36和40氨基酸序列的六个CDR。更优选地，本发明抗体中优化的CDR当与亲本抗体中存在的CDR相比时，包含至少一个氨基酸置换，包含具有SEQ ID NO:7、13、9、10、11和12氨基酸序列的六个CDR。这些优选抗体的CDR存在于下文表1中说明的位置。CDR根据Kabat位于可变区中。
本发明优选抗体包含具有SEQ ID NO:14、15和16氨基酸序列的HCVR。本发明其他优选的单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:17、18和19氨基酸序列的LCVR。更优选地，本发明的抗体包含SEQ ID NO:14的HCVR和SEQ ID NO:17的LCVR。本发明的可选抗体包含SEQ ID NO:15的HCVR和SEQ ID NO:18的LCVR。本发明更优选的抗体包含SEQ ID NO:16的HCVR和SEQ ID NO:19的LCVR。本发明抗体的HCVR优选连接重链恒定区，该重链恒定区优选为人来源的，优选为IgG1或IgG4的重链恒定区，更优选为IgG4的重链恒定区。这种LCVR优选连接轻链恒定区，该轻链恒定区优选为人来源的，优选为κ链的。
本发明的一个优选抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:24的重链多肽和具有氨基酸序列SEQ ID NO:27的轻链多肽。
本发明的另一优选抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的重链多肽和具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的轻链多肽。
本发明的另一优选抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的重链多肽和具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的轻链多肽。
在下文表1中列出了它们序列的SEQ ID NO。
表1、单克隆抗体可变区序列表
优选地，本发明的抗体进一步特征在于在对人硬骨素具有低于约10nM、3nM、1nM或0.3nM，更优选低于约0.1nM的KD值。此外，优选的是这种抗体进一步受限于对食蟹猕猴硬骨素具有低于约10nM、3nM、1nM或0.3nM，或更优选低于约0.1nM的KD值。
优选地，本发明的抗体进一步特征在于在使用人硬骨素和LRP-6结合阻断实验(参见，例如此处的测试例2)中具有低于100nM或更低，约50或30nM或更低，更优选约25nM，甚至更优选约20nM或更低的IC50(例如17.9nM)。
更优选地，本发明的抗体进一步特征在于对人硬骨素具有低于约10nM、3nM、1nM或0.3nM的KD值，更优选低于约0.1nM的KD值，并且进一步特征还在于在使用人硬骨素和LRP-6结合阻断实验中具有低于100nM或更低，约50或30nM或更低，更优选约25nM，甚至更优选约20nM或更低的IC50(例如17.9nM)，在所述抗体中所有六个CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重链、全部轻链，或全部重链和全部轻链受如此处SEQ ID NO所示的特定序列的限制。
甚至更优选地，本发明的抗体进一步特征在于对人硬骨素具有低于约10nM、3nM、1nM或0.3nM的KD值，更优选低于约0.1nM的KD值，并且进一步特征还在于在使用人硬骨素和LRP-6结合阻断实验中具有低于100nM或更低，约50或30nM或更低，更优选约25nM，甚至更优选约20nM或更低的IC50(例如17.9nM)；并且进一步特征还在于在使用食蟹猕猴硬骨素的硬骨素抗体体外ELISA结合实验中还具有低于约10nM、3nM、1nM或0.3nM，或更优选低于约0.1nM的KD值，在所述抗体中所有六个CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重链、全部轻链，或全部重链和全部轻链受如此处SEQ ID NO所示的特定序列的限制。
抗体表达
本发明也涉及表达本发明抗硬骨素抗体的宿主细胞。可使用本领域已知的标准技术来完成产生本发明抗体的宿主细胞系的建系及分离。
本领域已知的多种宿主表达系统可用于表达本发明的抗体，其包括原核(细菌)和真核表达系统(如酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其他动物细胞、转基因动物和杂交瘤细胞)，以及噬菌体展示表达系统。
可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备本发明的抗体。为了重组表达抗体，用一个或更多个携带编码抗体免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段的重组表达载体转化、转导或感染宿主细胞，使得轻链和/或重链在宿主细胞中表达。重链和轻链可从在一个载体中与其有效连接的不同启动子单独表达，或者，重链和轻链可从在两个载体(一个表达重链，一个表达轻链)中与其有效连接的不同启动子单独表达。任选地，重链和轻链可在不同的宿主细胞中进行表达。
此外，重组表达载体可编码信号肽，其促进抗硬骨素抗体轻链和/或重链从宿主细胞中的分泌。可将抗硬骨素抗体轻链和/或重链基因克隆至载体中，使得信号肽在框内有效连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。优选地，重组抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中，从所述培养基中可以回收或纯化抗体。
通过将编码HCVR的DNA有效连接到编码重链恒定区的另一DNA分子上，可以将编码HCVR区的分离DNA转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列为本领域所知。例如可通过标准的PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、任何种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或亚类恒定区及如Kabat(上文)中描述的其任何同种型变体。优选的重链恒定区包含IgG1或其变体或IgG4或其变体的恒定区。
通过将编码LCVR的DNA有效连接到编码轻链恒定区的另一DNA分子上，可以将编码LCVR区的分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列为本领域所知。例如可通过标准的PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
用于本发明的优选哺乳动物宿主细胞是CHO细胞(例如，ATCCCRL-9096)、HEK 293E细胞(例如，ATCC CRL-1573)、NS0细胞、SP2/0细胞和COS细胞(ATCC例如，CRL-1650、CRL-1651)。用于本发明的其他宿主细胞包括其他哺乳动物细胞、酵母细胞和原核细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间来产生抗体。可以使用标准的纯化方法从宿主细胞和/或培养基中回收抗体。
所表达产物可以根据本领域的标准方法，包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲和、反相、疏水性相互作用柱层析、凝胶电泳等来纯化本发明的完整抗体、各轻链和重链或其他免疫球蛋白形式。优选至少约90％、92％、94％或96％同质性的基本纯 的免疫球蛋白，并最优选98到99％或更高同质性的免疫球蛋白用于药物用途。一旦部分纯化或纯化至如期望的同质性，无菌抗体然后就可以在药学上使用，如此处所述。
人源化抗体
优选地，待用于治疗目的的本发明抗体具有来自哺乳动物的框架区和恒定区(在一定程度上其存在于抗体中)序列，在所述哺乳动物中其用作治疗剂，以减少哺乳动物针对治疗性抗体诱发免疫反应的可能性。人源化抗体特别重要，因为它们对治疗应用有价值并降低人抗小鼠抗体反应的可能性，当对人受试者施用时用鼠类来源抗体或包含鼠类来源部分的抗体时经常观察到该人抗小鼠抗体反应。优选注射的人源化抗体比例如鼠类抗体具有更像天然发生的人抗体的半衰期，由此允许待对受试者施用的剂量更少并更不频繁。
如此处所用，术语“人源化抗体”指其中至少一部分为人来源的抗体。例如，人源化抗体可包含来自非人来源(如小鼠)抗体的部分和来自人来源抗体的部分，两者例如通过常规技术(例如合成)化学连接在一起或使用遗传工程技术制备成毗连多肽。
优选地，“人源化抗体”具有起源于或来自亲本抗体(即非人抗体，优选小鼠单克隆抗体)的CDR，而在其存在的程度上框架区和恒定区(或其主要部分或基本部分，即至少约90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)由核酸序列信息编码，所述核酸序列信息出现在人类种系免疫球蛋白区(参见，例如the，International，ImMunoGeneTics，Database)或其重组或突变形式中，无论所述抗体是否在人类细胞中产生。优选地，从人源化抗体的非人亲本抗体来源的CDR优化人源化抗体的至少2、3、4、5或6个CDR，以产生期望的性质，例如改善的特异性、亲和力或中和作用，其可以通过筛选测定，例如ELISA测定来进行鉴定。优选地，本发明抗体中优化的CDR当与亲本抗体中存在的CDR相比时，包含至少一个氨基酸置换。与亲本抗体的CDRs相比，本发明人源化抗体的CDR中某些氨基酸置换(参见本文的实施例4)降低了抗体不稳定性的可能性(例如除去CDR中Asn残基)或当对人受试者施用时降低了抗体的免疫原性(例如，由IMMUNOFILTERTM，Technology预测的)。
人源化抗体优选含有来自非人抗体的最小序列。人源化抗体可包含既不在受体抗体中发现的残基，也不在从亲本抗体输入的CDR或框架序列中发现的残基。可使用本领域常规使用的方法使人源化抗体进行体外诱变，并因此，人源化重组抗体HCVR和LCVR区的框架区氨基酸序列是这样的序列，其当来自与人类种系HCVR和LCVR序列相关的那些序列时，可以不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分中。预期人源化重组抗体HCVR和LCVR框架区的这种氨基酸序列与人类种系序列至少90％、92％、94％、95％、96％、98％或更优选至少99％或最优选100％相同。
在优选实施方案中，本发明的人源化抗体包含人类种系重链框架序列和人类种系轻链框架序列。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本发明一个优选的实施方案中，所述的SOST人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO:7,8,9,10,11和12。人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV1-39*01和IGKV4-1*01的FR1，FR2，FR3区和FR4区；其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-18*01的FR1，FR2，FR3区和FR4区。
本领域中有可获得的多种方法来产生人源化抗体。例如，可通过获得编码特异性结合硬骨素，优选人硬骨素的亲本抗体(例如，鼠类抗体或由杂交瘤产生的抗体)HCVR和LCVR的核酸序列、在所述HCVR和LCVR(非人类)中鉴定CDR并将此类CDR编码核酸序列移植到所选的人框架编码核酸序列上来产生人源化抗体。任选地，可通过随机诱变或在特定位置诱变来优化CDR区，以在将CDR区移植到框架区中之前用不同的氨基酸置换CDR中的一个或更多个氨基酸。或者，可使用本领域技术人员可获得的方法在将CDR区插入人框架区后对其进行优化。
在CDR编码序列移植到所选人框架编码序列上之后，然后表达编码人源化可变重链和可变轻链序列的所得DNA序列，以产生结合硬骨素的人源化抗体。可将人源化HCVR和LCVR表达为整个抗硬骨素抗体分子的部分，即表达为与人恒定域序列的融合蛋白。然而，HCVR和LCVR序列也可在不存在恒定序列的情况下进行表达，以产生人源化抗硬骨素Fv。
进一步描述参与人源化可使用小鼠抗体的方法的文献包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
治疗用途
当对需要其的人类受试者施用有效量时，包含本发明抗硬骨素单克隆抗体的药物组合物可用于提高椎骨(vertebral，bone)或无椎骨(non-vertebral，bone)或两者中骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中的至少一种。当对需要其的人类受试者施用有效量时，包含本发明抗硬骨素单克隆抗体的药物组合物可用于降低椎骨和/或无椎骨骨折的发生率。降低骨折发生率包括相对于未处理对照人群，降低人类受试者骨折的可能性或实际发生率。
此外，本发明抗体可用于治疗病症、疾病或障碍，其中硬骨素的存在引起或促进不期望的病理学效应，或者硬骨素水平或硬骨素生物活性的降低在人类受试者中具有治疗益处。这种病症、疾病或障碍包括，但不限于骨质疏松症、骨质减 少、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛、牙周病或多发性骨髓瘤。受试者可以是男性或女性。优选地，人类受试者处于椎骨和/或无椎骨骨折的风险中，更优选地人类受试者处于骨质疏松的风险中或患有骨质疏松症。人类受试者优选为女性，并更优选为处于闭经后骨质疏松风险或患有闭经后骨质疏松的女性。预期本发明的方法可对骨质疏松症任何阶段的受试者有益。
此外，预期了本发明抗体在制备用于治疗至少一种上述障碍的药物中的用途。
术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”旨在指其中减缓、中断、阻止、控制或中止此处所述障碍进程的所有过程，但并不必定表示所有障碍症状的全部消除。如此处所用，“治疗”包括施用本发明化合物用于在哺乳动物，优选在人中治疗疾病或病症，并包括：(a)抑制疾病的进一步进展，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病或障碍的减退或减缓其症状或并发症。可调整给药方案，以提供最佳的预期反应(例如，治疗反应)。例如，可以快速浓注施用，可以随时间过去施用若干单独剂量或根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。
药物组合物
本发明抗体可掺入适合于对人类受试者施用的药物组合物中。可单独或与可药用载体和/或稀释剂以单剂量或多剂量对人类受试者施用本发明抗体。设计这种药物组合物，以适合于所选的施用方式，并且使用适当的可药用稀释剂、载体和/或赋形剂，如分散剂、缓冲液、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。可根据在例如提供执业医生通常已知的配方技术纲要的Remington，The，Science，and，Practice，of，Pharmacy，第19版，Gennaro编辑，Mack，Publishing，Co.，Easton，PA，1995中公开的常规技术来设计这种组合物。用于药物组合物的合适载体包括任何材料，当其与本发明单克隆抗体组合时保留了分子活性并不与受试者免疫系统反应。
使用标准施用技术，对受试者施用包含本发明抗硬骨素单克隆抗体的药物组合物，所述受试者处于如此处描述的病理学或显示病理学，例如骨质疏松症、骨关节炎或其他骨退化障碍。
本发明的药物组合物优选含有“有效量”的本发明抗体。有效量指达到期望治疗结果所必需(对剂量、时间段和施用方式而言)的量。有效量的抗体可根据如疾病状态、年龄、性别和个体体重及抗体或抗体部分在个体中诱发期望反应的能力这些因素而变化。有效量也是其中抗体的治疗有益作用胜于其任何毒性或有害作用的量。
有效量是向受试者传递治疗益处所必需的活性剂的至少最小剂量，但比中毒剂量少。用另一种方式叙述，本发明抗体的有效量或治疗有效量是这样的量，其在哺乳动物，优选人中，(i)增加至少一种骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度，或(ii)治疗病症、障碍或疾病，其中硬骨素的存在引起或促进不期望的病理学效应，或(iii)硬骨素水平或硬骨素生物活性的降低导致哺乳动物，优选人中有 益的治疗效果，该病症、障碍或疾病包括但不限于骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤。
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
实施例1：SOST克隆和表达
编码带His标签的人硬骨素(His-h-SOST)序列、编码带Flag标签的人硬骨素(h-SOST-Flag)序列、带Flag标签的小鼠硬骨素(m-SOST-Flag)序列和带Flag标签的食蟹猕猴硬骨素(cyno-SOST-Flag)序列由CRO公司上海旭冠生物科技发展有限公司合成(以上硬骨素重组蛋白均由本发明设计模版序列)，分别克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#:102762)。重组的SOST蛋白在293T细胞表达后，通过实施例2进行纯化。纯化的蛋白可用于下述各实施例实验中。
His-h-SOST的DNA序列
h-SOST-Flag的DNA序列：
m-SOST-Flag的DNA序列：
cyno-SOST-Flag的DNA序列：
实施例2：SOST重组蛋白纯化
1、带His标签的SOST重组蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。
收集的洗脱液用离子交换(SP柱)进一步纯化。配置A液：0.01M PB，pH8.0。配置B液：A液+1M NaCl。先将咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白置换到A液，并使用A液平衡SP柱，上样，B液浓度梯度0-100％，10倍柱体积洗脱，收集各洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。得到带His标签的人硬骨素(His-h-SOST)。
2、带Flag标签的SOST重组蛋白的纯化步骤：
将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。使用0.5×PBS平衡flag亲和柱，冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用0.5×PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用含有0.3M NaCl的PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)洗脱目的蛋白，并收集，调节pH至中性。收集样品经电泳，肽图，LC-MS鉴定正确后分装备用。
得到带Flag标签的人硬骨素(h-SOST-Flag)，带Flag标签的小鼠硬骨素(m-SOST-Flag)和带Flag标签的食蟹猕猴硬骨素(cyno-SOST-Flag)，用于本发明抗体的性能测试。
实施例3：抗人SOST单克隆抗体产生
抗人SOST单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠分成2组(A/B)，每组10只。
免疫抗原为带His标签的人SOST重组蛋白(His-h-SOST)。A组用弗氏佐剂(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1:1，200μl/200μg/只(首免)，200μl/100μg/只(加强免疫)。B组用Titermax(sigma Lot Num：T2684)与Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1:1，抗原与佐剂(Alum)比例为3:1，200μl/200μg/只(首免)，200μl/100μg/只(加强免疫)。抗原乳化后进行接种，时间为第0、14、28、42、56天。
第0天A/B组腹膜内(IP)注射50μg/只的乳化后抗原。第14天皮下(sc)多点(一般背部6-8点)注射25μg/只。第28，42天根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射200μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。
于第22，36，50，64天进行血检，用测试例1的ELISA方法检测小鼠血清和人硬骨素的结合活性，结果见表2。在第4次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。并通过测试例2检测小鼠血清中抗SOST抗体阻断人SOST和人LRP-6结合的活性，选出体外活性好的单克隆杂交瘤细胞株Ab-1，其活性检测结果见表2.
表2、鼠源抗体的体外活性
实施例4：鼠源抗人硬骨素抗体的人源化
挑选出体外活性好的单克隆杂交瘤细胞株Ab-1，克隆其中的单克隆抗体序列，再进行人源化，重组表达和活性评价。
从杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，反转录(PrimeScriptTMReverse Transcriptase，Takara,cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。得到的DNA序列对应的氨基酸序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示：
杂交瘤细胞获得重链可变区:
杂交瘤细胞获得轻链可变区:
鼠源抗人硬骨素单克隆抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列，进行人源化。本发明选择活性好的候选分子进行人源化，结果如下。
1、鼠源抗硬骨素抗体的CDR区
VH/VLCDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
本发明中鼠源Ab-1的CDR序列如表3所述：
表3、鼠源抗硬骨素抗体的CDR序列
抗体 Ab-1
重链CDR1 DYNLD(SEQ ID NO:7)
重链CDR2 DIDPNNGDILYNQKFRD(SEQ ID NO:8)
重链CDR3 RWAYYFDY(SEQ ID NO:9)
轻链CDR1 KASQSVSNDVA(SEQ ID NO:10)
轻链CDR2 YTSNRFT(SEQ ID NO:11)
轻链CDR3 QQDYSSPVT(SEQ ID NO:12)
2、选择人种系FR区序列
在所获得的鼠源抗体VH/VLCDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与抗体Germline数据库比较，获得同源性高的人种系模板。其中人类种系轻链框架区来自人κ轻链基因，本发明抗体优选人种系轻链模版IGKV1-39*01或IGKV4-1*01。人类种系重链框架区来自人重链，本发明抗体优选人种系重链模版IGHV1-18*01。将鼠源抗体Ab-1的CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人源化可变区，再与IgG恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化(对重链CDR2进行优化，得到新的重链CDR2序列：DIDPNDGDILYNQKFRD，SEQ ID NO:13)，得到最终的人源化分子。其重链可变区序列如SEQ ID NO:14-16所示，可与任选自SEQ ID NO:20-22所示的重链恒定区序列组合；轻链可变区序列如SEQ ID NO:17-19所示，分别与如SEQ ID NO:23所示的轻链恒定区序列组合。
1、重链可变区：
Ab-5的重链可变区：
Ab-9的重链可变区：
Ab-10的重链可变区：
2、各抗体的重链恒定区任选自以下序列：
人IgG4的重链恒定区(缺K)：
人IgG4的重链恒定区：
人IgG2的重链恒定区：
3、轻链可变区：
Ab-5的轻链可变区：
Ab-9的轻链可变区：
Ab-10的轻链可变区：
4、轻链恒定区，来自人源κ链：
用基因克隆、重组表达的方法分别克隆、表达、纯化上述抗体，经结合ELISA(测试例1和测试例3)、抗原受体结合阻断实验(测试例2)、Biacore(测试例4)、细胞活性检测(测试例5)等，最终选出活性保持最好的人源化抗体Ab-5，Ab-9，Ab-10，序列如下：
Ab-10人源化抗体：
重链：
轻链：
Ab-9人源化抗体：
重链：
轻链：
Ab-5人源化抗体：
重链：
轻链：
本发明人源化抗人SOST抗体和人硬骨素(h-SOST-Flag)的ELISA结合活性数据见表4。
测试例：
体外活性生物学评价
测试例1：ELISA结合实验
硬骨素抗体通过与硬骨素结合来阻断硬骨素与细胞膜上的硬骨素相关受体结合，从而阻断硬骨素下游信号通路。ELISA实验被用来检测硬骨素抗体的结合特性。用生物素标记试剂盒(东仁化学,LK03)标记的带flag标签的硬骨素(h-SOST-FLAG，SEQ ID NO：2编码)通过与包被在酶标板中的链霉亲和素结合，从而固定到96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断待测抗体和人硬骨素的结合活性。
用pH7.4的PBS(Sigma,P4417-100TAB)缓冲液将链霉亲和素(Sigma,S4762-5MG)稀释至5μg/ml浓度，以50μg/孔的体积加入96孔酶标板(Corning,CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5 小时或4℃放置过夜(16-18小时)后进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液(PH7.4PBS含1％BSA)稀释至0.5μg/ml的生物素标记的SOST-FLAG蛋白(R&DSYSTEM,1505-LR-025)，置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板6次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体，放于37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板6次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research,115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research,109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL,52-00-03)，于室温孵育10-15min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算本发明硬骨素抗体对人硬骨素的结合EC50值，结果见表4。
表4、本发明人源化抗SOST抗体和人硬骨素(h-SOST-Flag)的结合活性
待测抗体 EC50(nM)
Ab-1 0.701
Ab-5 0.63
Ab-9 0.4
Ab-10 0.54
结果表明本发明人源化抗人SOST抗体保留了人源化之前的结合活性。
测试例2：抗SOST抗体阻断硬骨素和LRP-6结合实验
硬骨素可与细胞表面wnt/β-catenin信号通路的共受体LRP5/LRP-6结合来抑制通路活性，从而导致骨形成受阻。本实验中，通过体外阻断实验，检测所筛选出来的抗人SOST抗体阻断人SOST/猴SOST和人LRP-6结合的活性。阳性对照为Romosozumab(参考文献WHO Drug Information,Vol.25,No.4,2011，413-465，P434制备)。
具体方法是将羊抗人Fc的抗体包被到96孔板后，加入人LRP-6-Fc融合蛋白进行孵育。随后将生物素化的硬骨素蛋白和抗硬骨素蛋白的抗体共孵育后加入96孔板中进行孵育。洗板后，检测生物素化的硬骨素与LRP-6的结合量，计算硬骨素抗体对硬骨素活性位点阻断的IC50值。
用pH7.4的PBS(Sigma,P4417-100TAB)缓冲液将羊抗人Fc抗体稀释为1μg/ml，以每孔100μl体积加入到96孔酶标板中，于37℃孵育2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，37℃孵育2.5小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50ul用样品稀释液(pH7.4PBS含1％BSA)稀释至1μg/ml的LRP-6-Fc融合蛋白(R&D SYSTEM,1505-LRP-025)，置37℃孵育2小时。然后同时在稀释板中以30μl/孔的体积加入浓度为1.12μg/ml的用生物素标记 试剂盒(东仁化学,LK03)标记的人硬骨素蛋白(R&D SYSTEM,1406-ST/CF)，及30μl/孔稀释至合适浓度的待测硬骨素抗体，混匀后置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液。用PBST洗板6次后，将稀释板中的抗原抗体混合液加入酶标板中，于4℃放置过夜(16-18小时)。将板中液体丢弃，用PBST洗板6次后，加入50μl/孔用样品稀释液以1:600浓度稀释的Streptavidin-Peroxidase Polymer(Sigma,S2438-250UG)于37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL,52-00-03)，于室温孵育3-10min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算硬骨素抗体对人硬骨素与LRP-6结合阻断的IC50值，结果见表5。
以上方法可用于检测本发明硬骨素抗体对猴硬骨素(由SEQ ID NO：4编码表达纯化所得)与LRP-6结合阻断的IC50值，结果见表5。
表5、本发明人源化SOST抗体对不同种属硬骨素与LRP-6结合的阻断活性
注：N/A表示未测。
结果表明，本发明人源化抗人SOST抗体对人/猴硬骨素与LRP-6结合的阻断活性与阳性抗体Romosozumab相当。
测试例3：Biacore测定
用Biacore，GE仪器测定待测人源化抗SOST抗体和人、猴和鼠SOST亲和力。
按照人抗捕获试剂盒(Cat.#BR-1008-39，GE)说明书中的方法，将人抗捕获抗体共价偶联于Biacore仪器(Biacore X100，GE)的生物传感芯片CM5(Cat.#BR-1000-12，GE)上，从而亲和捕获一定量的待测抗体。然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的SOST抗原：人源SOST，R&D SYSTEM，Cat.#1406-ST-025/CF，R&D；猴SOST，cyno-SOST-Flag，由实施例1的SEQ ID NO：4编码纯化而得；鼠源SOST，m-SOST-Flag，由实施例1的SEQ ID NO：3编码纯化而得。利用Biacore仪器(Biacore X100，GE)实时检测反应信号，从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液，将生物芯片洗净再生。实验中用到的氨基偶联试剂盒购自GE公司(Cat.#BR-1000-50，GE)，缓冲液为HBS-EP+10×缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)，用D.I.Water稀释至1×(pH 7.4)。
实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值，结果见表6。
表6、人源化抗体对不同种属硬骨素的体外活性
注：no表示未检测到亲和力。
本发明人源化抗体Ab-5与SOST和人，猴SOST的亲和力很高，与阳性分子相比，是阳性分子10倍以上。
测试例4：抗硬骨素抗体对细胞作用的活性实验
本实验通过检测细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性，根据EC50大小评价本发明SOST抗体作用于细胞的体外活性。
C2C12细胞(中科院细胞库，Catalog#GNM26)培养在含10％FBS的DMEM培养基中，一周传代2～3次，传代比列1:5或1:10。传代时，吸掉培养基，用5ml0.25％的胰酶冲洗细胞层，然后吸掉胰酶，将细胞放在培养箱中消化3～5分钟，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入100μL的细胞悬液，密度为5×104细胞/ml，培养基为10％FBS的DMEM，96孔板外围只加入100μl 10％FBS的DMEM培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO2)。细胞贴壁后，去掉培养基，每孔加入70μl 10％FBS的DMEM培养基。每孔分别加入10μl终浓度为100ng/ml的wnt3a(R&D,Catalog#5036-WN-010),和终浓度为5μg/ml SOST(R&D，Catalog#1406-ST-025)。将待测样品用PBS稀释成不同浓度梯度，向培养板中加入10μl配置的不同浓度的待测样品。将培养板在培养箱孵育3天(37℃，5％CO2)。去掉培养基，每孔加入150μl ALP底物溶液，将培养板在培养箱内孵育2小时。用酶标仪(PerkinElmer，Catalog#VICTOR3)测定在405nm处的吸光度。计算得EC50值见表7。
表7、本发明抗体作用于细胞的活性测试
待测SOST抗体 细胞活性EC50(nM)
Ab-5 84.7
Romosozumab 71.6
结果表明，本发明人源化SOST抗体Ab-5作用于细胞的活性与阳性抗体Romosozumab相当。
药代动力学评价
测试例5：人源化SOST抗体食蟹猕猴T1/2评价
实验用食蟹猕猴，雌性，3只，4-5岁，4公斤以下。购自广西桂东灵长类养殖开发有限公司。饲养环境：普通区房间。食蟹猕猴购进后，每笼1只猴，无限量获取饲料和水。实验室环境适应性饲养不小于14天，12/12小时光/暗周期调节， 温度23-29℃；相对湿度40-70％。实验开始前一天，对3只食蟹猕猴进行编号。实验当天，每只食蟹猕猴分别皮下注射受试药物或阳性分子(30mg/kg)，皮下注射8ml/只/次。
将猴子固定在猴椅上，通过肘前静脉或隐静脉采血成血清(每次约1.5mL血)，-20度保存。取血时间点为：第1天给药前12h，第1天给药后1h,2h,4h,8h,12h,24h(第2天)，第3天，第5天，第7天，第14天，第21天，第28天；等收集完血液样本后，用ELISA检测血清中的血药浓度，进行PK分析，结果见表8。
表8、人源化抗SOST抗体食蟹猕猴T1/2
受试药物 T1/2(天数)
Ab-5 8.66
Romosozumab 4.78
结果表明，本发明人源化候选分子食蟹猕猴体内半衰期长，约为阳性分子Romosozumab的2倍(Ab-5)。
体内活性生物学评价
测试例6：人源化抗SOST抗体食蟹猕猴体内药效评价
实验用食蟹猕猴，雌性，3只，4-5岁，4公斤以下。购自广西桂东灵长类养殖开发有限公司。饲养环境：普通区房间。食蟹猕猴购进后，每笼1只猴，无限量获取饲料和水。实验室环境适应性饲养不小于14天，12/12小时光/暗周期调节，温度23-29℃；相对湿度40-70％。实验开始前一天，对3只食蟹猕猴进行编号，然后经麻醉进行采血取血清及血浆并作腰椎和桡骨远端骨矿密度、骨矿物质含量测试，所得值用作基数。每只食蟹猕猴分别皮下注射受试药物(10,30,60mg/kg不同剂量)和阳性分子(30mg/kg),皮下注射8ml/只/次。每月1次,给药2次。实验期间，给药后的第四和第八周动物经麻醉后再各做腰椎和桡骨远端骨矿密度、骨矿物质含量测试。
实验期两个月后将所有动物麻醉后安乐死(以过剂量戊巴比妥钠)。之后，取第二到第五腰椎及桡骨远端做体外骨矿密度和骨矿物质含量的测试。
实验结果见表9、图1和图2。
表9、抗人SOST抗体在食蟹猴体药效结果
结果表明，本发明人源化抗SOST抗体在食蟹猕猴体内药效呈剂量依赖性。
人源化抗SOST抗体Ab-5药效10mg/kg和阳性分子30mg/kg相当(图2)，即本发明分子猴体内药效是阳性分子Romosozumab的三倍。同剂量下人源化抗体的AUC 0-t(mg/ml*day)为22.3，是阳性抗体Romosozumab(9.95)的2倍以上(见图1)。
溶解度测试
测试例7：人源化抗SOST抗体的溶解度
为了检测本发明人源化抗SOST抗体的溶解度，取本发明抗体Ab-5与阳性抗体Romosozumab在逐渐升高的浓度梯度下，检测可溶解的抗体单体、沉淀、聚体含量。此测定中，起始抗体为10mg/ml，溶解在pH7.4的PBS缓冲液中。用超滤浓缩管内(Millipore，Amicon Ultra-1550K)4度4000rpm离心,期间每隔5-10分钟终止离心并取样检测抗体浓度，直至抗体浓度达到30mg/ml,和90mg/ml。分别取各个浓度条件下的样品进行SEC-HPLC分析，结果表10所示：
表10、抗SOST抗体的溶解度
抗体 浓度(mg/ml) 单体(％) 沉淀观察
Romosozumab 10 95.8 无
Romosozumab 30 95.2 无
Romosozumab 90 92.0 大量沉淀，浑浊
Ab-5 10 96.5 无
Ab-5 30 96.6 无
Ab-5 90 96.1 无
上述结果表明，本发明抗体在高达90mg/ml时，仍然澄清，无沉淀，抗体单体量没有改变。而阳性分子在同样浓度下出现大量沉淀，单体量也随之减少，由95.8％下降到92％。
稳定性评价
测试例8：人源化抗SOST抗体的稳定性
为了检测本发明人源化抗SOST抗体的稳定性，将本发明抗体Ab-5与阳性抗体Romosozumab在pH7.4的PBS缓冲液中，4度条件下放置7天的稳定性。稳定性通过两种检测方法，一种是形成肉眼可见不可溶沉淀的多少，通过放置前后浓度变化来计算。另一种是用SEC-HPLC的方法来检测检样品中可溶抗体单体含量变化。起始抗体浓度为阳性抗体能达到的最高溶解浓度30mg/ml。结果如表11所示：
表11、抗SOST抗体的稳定性
上述结果表明，阳性抗即使在其的能达到的浓度(30mg/ml)无沉淀的情况 下，放置仅7天后，已经有19.3％沉淀析出，单体量也随之减少。而本发明抗体则非常稳定，没有任何沉淀，溶液澄清。
综合溶解度和稳定性结果，表明本发明抗体制剂方面的性能要比阳性抗体优越，可做成高浓度，如90mg/ml制剂，而且稳定。

Claims (28)

  1. 特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其包含至少1个选自以下序列，其突变序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：
    抗体重链可变区HCDR区序列：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；或
    抗体轻链可变区LCDR区序列：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
  2. 如权利要求1所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如下的HCDR区序列或其突变序列：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。
  3. 如权利要求1所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如下的LCDR区序列或其突变序列：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
  4. 如权利要求1所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含HCDR区序列SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，或其突变序列，和LCDR区序列SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，或其突变序列。
  5. 如权利要求1所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的CDR区突变序列为CDR区发生1-3个优化抗体活性的氨基酸突变，其中所述的HCDR2区突变序列优选为SEQ ID NO:13。
  6. 如权利要求1所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。
  7. 如权利要求6所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的鼠源抗体重链可变区序列为：SEQ ID NO:5，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
  8. 如权利要求6所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的鼠源抗体轻链可变区序列为：SEQ ID NO:6，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
  9. 如权利要求6-8任一项的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的鼠源抗体重链可变区序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区序列为SEQ ID NO:6。
  10. 如权利要求1所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体或人源化抗体或其片段。
  11. 如权利要求10所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含人种系重链IGHV1-18*01的FR1，FR2，FR3和FR4区的框架序列或其突变序列，优选所述突变序列为0-10个氨基酸的回复突变。
  12. 如权利要求11所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:14-16所示的重链可变区序列或其变体或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
  13. 如权利要求10所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含人种系轻链IGKV1-39*01或IGKV4-1*01的FR1，FR2，FR3和FR4区的框架序列或其突变序列，优选所述突变序列为0-10个氨基酸的回复突变。
  14. 如权利要求13所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:17-19所示的轻链可变区序列或其变体或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
  15. 如权利要求10-14任一项的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:14-16的重链可变区和选自SEQ ID NO:17-19的轻链可变区。
  16. 如权利要求15所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其包含选自a)至c)任一的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合：
    a)SEQ ID NO:14的重链可变区序列和SEQ ID NO:17的轻链可变区序列；
    b)SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:18的轻链可变区序列；或
    c)SEQ ID NO:16的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。
  17. 如权利要求10所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体的重链恒定区包含源自人源IgG1或其变体、人源IgG2或其变体、人源IgG3或其变体或人源IgG4或其变体的恒定区，优选包含人源IgG1或 其变体或人源IgG4或其变体的恒定区，更优选人源IgG4或其变体的恒定区。
  18. 如权利要求17所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO:24-26或与其具有至少90％同源性的全长重链序列。
  19. 如权利要求10所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其所述的人源化抗体的轻链恒定区包含选自人源κ或λ链或其变体的恒定区。
  20. 如权利要求19所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO:27-29或与其具有至少90％序列同源性的全长轻链序列。
  21. 如权利要求10-20任一项的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，所述的人源化抗体包含选自SEQ ID NO:24-26的全长重链序列和选自SEQ ID NO:27-29的全长轻链序列。
  22. 如权利要求21所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体选自以下任一的全长轻链序列和全长重链序列的组合：
    Ab-10:SEQ ID NO:24的重链序列和SEQ ID NO:27的轻链序列；
    Ab-9:SEQ ID NO:25的重链序列和SEQ ID NO:28的轻链序列；或
    Ab-5:SEQ ID NO:26的重链序列和SEQ ID NO:29的轻链序列。
  23. 一种编码如权利要求1-22任一项所述的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
  24. 一种含有如权利要求23所述的DNA分子的表达载体。
  25. 一种用如权利要求24所述的表达载体转化的宿主细胞，其中所述的宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为CHO细胞。
  26. 一种药物组合物，其包含权利要求1-22任一项的抗体或其抗原结合片段，和一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
  27. 如权利要求1-22中任一项的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求26所述的药物组合物在制备用于增强骨量、骨矿物质密度、骨矿物质含量或骨强度中的至少一种的药物中的用途。
  28. 如权利要求1-22中任一项的特异性结合人硬骨素的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求26所述的药物组合物在制备用于治疗SOST介导的骨性疾病或 病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症选自骨质疏松症、骨质减少或骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病或障碍；优选为骨质疏松症。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108101984A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 中国人民解放军总医院 骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途
WO2019154410A1 (zh) * 2018-02-12 2019-08-15 翼高生物科技有限公司 针对骨硬化蛋白的适体及其用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200034748A (ko) * 2017-07-27 2020-03-31 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 Sost 항체 약학적 조성물 및 그의 용도
CN113913463B (zh) * 2021-09-19 2023-08-18 郭保生 抑制sost基因表达的重组质粒及其骨靶向重组腺相关病毒与应用
TW202330032A (zh) * 2021-11-30 2023-08-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種抗ｓｏｓｔ抗體醫藥組成物及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101646457A (zh) * 2007-03-20 2010-02-10 伊莱利利公司 抗硬骨素抗体
CN101821291A (zh) * 2007-10-12 2010-09-01 诺瓦提斯公司 抗硬骨素抗体的组合物和应用方法
CN101896201A (zh) * 2007-12-14 2010-11-24 安进公司 使用抗硬骨素抗体治疗骨折的方法
CN103435698A (zh) * 2005-05-03 2013-12-11 Ucb医药有限公司 Sclerostin结合剂

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS20050934A (en) * 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
EP2460828A3 (en) 2006-11-10 2012-08-08 UCB Pharma, S.A. Antibodies and diagnostics
EP2119452B1 (en) * 2006-12-26 2020-03-04 Centro de Inmunologia Molecular Pharmaceutical composition, comprising an anti-cd6 monoclonal antibody used in the diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis
WO2010130830A2 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
MX2014004977A (es) 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.
JP6363954B2 (ja) * 2011-12-28 2018-07-25 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体の使用による歯槽骨消失の治療方法
EP3626267A1 (en) 2012-07-05 2020-03-25 UCB Pharma, S.A. Treatment for bone diseases
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103435698A (zh) * 2005-05-03 2013-12-11 Ucb医药有限公司 Sclerostin结合剂
CN101646457A (zh) * 2007-03-20 2010-02-10 伊莱利利公司 抗硬骨素抗体
CN101821291A (zh) * 2007-10-12 2010-09-01 诺瓦提斯公司 抗硬骨素抗体的组合物和应用方法
CN101896201A (zh) * 2007-12-14 2010-11-24 安进公司 使用抗硬骨素抗体治疗骨折的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JULIET MCCOLM ET AL.: "Single-and multiple-dose randomized studies of blosozumab, a monoclonal antibody against sclerostin, in healthy postmenopausal women", 《JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH》 *
MICHAEL R. MCCLUNG ET AL.: "Romosozumab in postmenopausal women with low bone mineral density", 《THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108101984A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 中国人民解放军总医院 骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途
WO2019154410A1 (zh) * 2018-02-12 2019-08-15 翼高生物科技有限公司 针对骨硬化蛋白的适体及其用途

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