ES2835923T3 - Anticuerpo antiesclerostina, fragmento de unión a antígeno y uso médico del mismo - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 26 y una cadena liviana de SEQ ID NO: 29.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo antiesclerostina, fragmento de unión a antígeno y uso médico del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana (SOST) con alta afinidad, y a un fragmento de unión a antígeno de la misma, así como al anticuerpo como agente terapéutico, especialmente para enfermedades o trastornos óseos mediados por SOST como osteoporosis, en donde el sujeto se beneficia de un aumento en al menos uno de la masa ósea, la densidad mineral ósea, el contenido mineral óseo o la resistencia ósea.

Antecedentes de la invención

La osteoporosis (OP), incluida la osteoporosis posmenopáusica (PMO) y la osteoporosis senil, es un trastorno sistémico del metabolismo óseo, que se caracteriza por una masa ósea baja y degradación de la microestructura ósea, lo que da como resultado una disminución de la resistencia ósea, un aumento de la fragilidad ósea y propenso a fracturarse. De acuerdo con las estadísticas, alrededor de 200 millones de personas sufren de osteoporosis en el mundo, y la incidencia se elevó a siete de las enfermedades más comunes y enfermedades frecuentes. La tasa de prevalencia de osteoporosis en mujeres chinas mayores de 60 años es tan alta como 60%, y la tasa de prevalencia para hombres también es 40-50%.

Además de los ejercicios de fortalecimiento, la ingesta de calcio y vitamina D, la difusión de conocimientos para la prevención de fracturas y otras medidas tradicionales, el tratamiento médico actual se limita principalmente a reducir la absorción ósea para prevenir la fractura. Los fármacos antiabsorción ósea incluyen calcitonina, bifosfonatos, agentes de reemplazo de estrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM), etc. Estos inhibidores de la absorción ósea, que están representados por bifosfonatos, aunque pueden prevenir una mayor pérdida ósea, no logran reconstruir el hueso perdido, y también estos inhibidores de la absorción ósea no inhiben la osteogénesis mientras inhiben la absorción ósea. Los fármacos hormonales tienen más riesgo asociado con la trombosis venosa y la enfermedad cardiovascular. Más importante aún, los fármacos anabólicos óseos, en su verdadero sentido, no solo mejoran la masa ósea, sino que también mejoran eficazmente la microestructura ósea y promueven la osteogénesis. Sin embargo, esto es precisamente lo que no pueden hacer los fármacos antiabsorción ósea existentes. En los últimos 15 años, se han investigado sistemáticamente en ensayos clínicos diversas medidas médicas destinadas a reducir el riesgo de fracturas, mientras que los medicamentos disponibles actualmente son bastante limitados. Hasta ahora, se ha demostrado que solo los fármacos de hormona paratiroidea (PTH) estimulan la osteogénesis. Sin embargo, son obvias muchas desventajas. Por ejemplo, no son duraderos para el papel de remodelación ósea y tienen poco efecto sobre la reparación de fracturas, también debe administrarse por vía percutánea todos los días durante más de un año y solo administrarse en dosis bajas; alto coste y no se puede utilizar de forma continua durante más de dos años; así como su seguridad de exposición conduce a una advertencia de recuadro negro de la FDA de los Estados Unidos, etc.

La esclerostina sirve como una nueva diana biológica para el desarrollo de fármacos; su principio es que la osteoporosis podría tratarse regulando el anabolismo de los osteoblastos. Tal diana llena el vacío en el campo del tratamiento de la osteoporosis regulando el metabolismo óseo.

La esclerostina es una glicoproteína secretora expresada por el gen SOST, y su secuencia de aminoácidos se caracteriza por 190 residuos y un dominio de aro que contiene cisteína. Se ha comprobado que se expresa principalmente en células óseas, pero muy baja expresión en osteoblastos, cartílago, hígado, riñón, médula ósea, corazón, páncreas y otras localizaciones.

Los estudios han demostrado que la esclerostina puede regular la osteogénesis mediante la inhibición de la vía de señalización de Wnt uniéndose al receptor de lipoproteínas de baja densidad LRP5/6. En la actualidad, los fármacos de anticuerpos monoclonales contra la diana desarrollados por varias compañías han entrado en ensayos clínicos de fase III o II, respectivamente. Las indicaciones de estos anticuerpos son osteoporosis, daño óseo/osteopatía relacionada, etc. Las patentes relacionadas son: WO2008133722, WO2010130830, WO2013063095, WO2014006100, WO2014081955, WO2005014650, WO2006119062, WO2008115732. Vale la pena mencionar que algunos estudios han demostrado que los anticuerpos antiesclerostina no están en conflicto con el tratamiento con bisfosfonatos tradicionales, y estos dos fármacos pueden usarse en combinación.

La presente invención proporciona nuevos anticuerpos desarrollados contra una nueva diana para el tratamiento de enfermedades óseas como la osteoporosis, dicho anticuerpo se caracteriza por una alta afinidad, alta eficacia, vida media prolongada y número reducido de administración. Además, las moléculas novedosas de la presente invención tienen alta solubilidad y buena estabilidad, lo que facilita la producción de la preparación y, por lo tanto, reduce el coste de producción.

Resumen de la invención

El objeto de la descripción está definido por las reivindicaciones 1 a 9.

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 26 y una cadena liviana de SEQ ID NO: 29.

La presente invención se refiere además a una molécula de ADN que codifica el anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana como se definió anteriormente.

La presente invención se refiere además a un vector de expresión que comprende la molécula de ADN como se definió anteriormente.

La presente invención se refiere además a una célula huésped, que se transforma con el vector de expresión como se definió anteriormente.

La presente invención se refiere además a la célula huésped como se define anteriormente, en donde la célula huésped es una célula de mamífero.

La presente invención se refiere además a la célula huésped como se define anteriormente, en donde la célula huésped es una célula CHO.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo como se definió anteriormente, y uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.

La presente invención se refiere además al anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana como se definió anteriormente o la composición farmacéutica como se definió anteriormente, para uso en el aumento de al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo o resistencia ósea.

La presente invención se refiere además al anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana como se definió anteriormente o la composición farmacéutica como se define anteriormente, para su uso en el tratamiento de enfermedad ósea mediada por SOST o trastorno seleccionado de osteoporosis, osteopenia, osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal y mieloma múltiple.

Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales quiméricos o anticuerpos monoclonales humanizados, que comprenden una secuencia polipeptídica específica descrita en este documento, cuya especificidad se une a la esclerostina humana con alta afinidad y se puede usar para aumentar al menos uno seleccionado del grupo que consiste en masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo y resistencia ósea de mamífero, preferiblemente de un humano.

La presente descripción proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende al menos una región CDR, en donde dicha región CDR se selecciona de las siguientes secuencias o mutantes de las mismas, o secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 95% de identidad con las siguientes: secuencia HCDR de la región variable de la cadena pesada: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9; y

secuencia de LCDR de la región variable de la cadena liviana: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende al menos una región HCDR seleccionada de las siguientes secuencias o mutante de la misma: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde la región variable de la cadena liviana del anticuerpo comprende al menos una región LCDR seleccionada de las siguientes secuencias o mutante de la misma: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo comprende las secuencias de la región HCDR SEQ ID NO: 7 (HCDR1), SEQ ID NO: 8 (HCDR2) y SEQ ID NO: 9 (HCDR3), o mutante del mismo, y secuencias de la región LCDR SEQ ID NO: 10 (LCDR1), SEQ ID NO: 11 (LCDR2) y SEQ ID NO: 12 (LCDR3), o mutante de las mismas.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde el mutante de la región CDR es una región CDR que tiene 1-3 mutaciones de aminoácidos que optimizan la actividad de anticuerpos, en donde el mutante de la región HCDR2 se muestra preferiblemente como SEQ ID NO: 13.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo murino o su fragmento.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo murino se muestra como SEQ ID NO: 5, o secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 5.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde la secuencia de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo murino se muestra como SEQ ID NO: 6, o secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 95% de identidad con SEQ ID NO: 6.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo murino se muestra como SEQ ID NO: 5, y la secuencia de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo murino se muestra como SEQ ID NO: 6.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo murino o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende además una región FR de la cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 murina o una variante del mismo.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona aquí un anticuerpo murino o un fragmento del mismo como se describió anteriormente que comprende además una región constante de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 murina o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo murino o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde la región variable de la cadena liviana del anticuerpo comprende además una región FR de la cadena liviana seleccionada de la cadena k o A murina o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona aquí un anticuerpo murino o un fragmento del mismo como se describió anteriormente que además comprende una región constante de cadena liviana seleccionada de la cadena k o A murina, o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado o el fragmento del mismo.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende además una región FR de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o una variante de las mismas.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde la secuencia de la región FR de la cadena pesada en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado se deriva de la secuencia marco de la región FR1, FR2, FR3 y región FR4 de la cadena pesada de la línea germinal humana IGHV1-18*01, o un mutante del mismo, preferiblemente la secuencia mutante comprende 0-10 mutación(es) inversa(es) de aminoácidos.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describe anteriormente, en donde el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 14-16 o un mutante del mismo o secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 14-16.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde la secuencia de la región FR de la cadena liviana en la región variable de la cadena liviana del anticuerpo humanizado se deriva de la secuencia marco de la región FR1, FR2, FR3 y región FR4 de la cadena liviana de la línea germinal humana IGKV139*01 y/o IGKV4-1*01 o un mutante de los mismos, preferiblemente el mutante comprende 0-10 retromutaciones de aminoácidos.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de región variable de cadena liviana seleccionada de SEQ ID NO: 17-19 o un mutante del mismo o secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 17-19.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 14-16 y una región variable de cadena liviana seleccionada de SEQ ID NO: 17-19.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo humanizado comprende una combinación de una secuencia de región variable de cadena pesada y una secuencia de región variable de cadena liviana seleccionada de cualquier uno de (a) a (c):

(a) región variable de cadena pesada de la secuencia Ab-5 de SEQ ID NO: 14, y región variable de cadena liviana de la secuencia Ab-5 de SEQ ID NO: 17;

(b) región variable de cadena pesada de la secuencia de Ab-9 de SEQ ID NO: 15, y región variable de cadena liviana de la secuencia de Ab-9 de SEQ ID NO: 18; o

(c) región variable de cadena pesada de la secuencia Ab-10 de SEQ ID NO: 16, y región variable de cadena liviana de la secuencia Ab-10 de SEQ ID NO: 19.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende una región constante derivada de IgG1 humana, una variante de la misma, IgG2 humana o una variante de la misma, IgG3 humana o una variante de la misma, o IgG4 humana o una variante de la misma, preferiblemente una región constante derivada de IgG1 humana o una variante de la misma o IgG4 humana o una variante de la misma, más preferiblemente una región constante derivada de IgG4 o una variante del mismo. La región constante también puede implicar algunas modificaciones como "YTE" para cambiar el rendimiento.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de cadena pesada de longitud completa seleccionada de SEQ ID NO: 24-26 o secuencias que tienen al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 24-26.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde la región variable de cadena liviana del anticuerpo humanizado comprende además una región FR de cadena liviana seleccionada opcionalmente de cadena k o A humana o una variante del mismo.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente que comprende además una región constante de cadena liviana seleccionada entre k o A humanas o una variante de las mismas.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describe anteriormente, en donde el anticuerpo humanizado comprende una secuencia de cadena liviana de longitud completa seleccionada de SEQ ID NO: 27-29 o secuencias que tienen al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 27-29.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada de longitud completa seleccionada de SEQ ID NO: 24-26 y una longitud completea de cadena liviana seleccionada de SEQ ID No : 27-29.

En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST humanizado o un fragmento del mismo como se describe anteriormente, en donde los anticuerpos humanizados comprenden una combinación de una secuencia de cadena liviana de longitud completa y una secuencia de cadena pesada de longitud completa seleccionada de cualquiera de los siguientes:

Ab-10: la cadena pesada mostrada como SEQ ID NO: 24 y la cadena liviana mostrada como SEQ ID NO: 27; Ab-9: la cadena pesada mostrada como SEQ ID NO: 25 y la cadena liviana mostrada como SEQ ID NO: 28; o Ab-5: la cadena pesada mostrada como SEQ ID NO: 26 y la cadena liviana mostrada como SEQ ID NO: 29. En una realización preferida de la presente descripción, aquí se proporciona un anticuerpo SOST o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, en donde el fragmento de unión a antígeno es Fab, Fv, sFv o F(ab')2.

La presente descripción proporciona además una secuencia de ADN que codifica un producto precursor de expresión del anticuerpo SOST o el fragmento de unión al antígeno descrito anteriormente.

La presente descripción proporciona además un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN como se describió anteriormente.

La presente descripción proporciona además una célula huésped transformada con el vector de expresión como se describió anteriormente.

En una realización preferida de la presente descripción, se proporciona en el presente documento una célula huésped como se describió anteriormente, en donde la célula huésped son células de mamífero, preferiblemente células CHO.

La presente descripción proporciona además una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo SOST o su fragmento de unión a antígeno como se describió anteriormente, así como uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.

La presente descripción proporciona además el uso de anticuerpo SOST o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, o la composición farmacéutica que lo contiene, en la preparación de un medicamento para mejorar al menos uno de entre masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral o resistencia ósea.

La presente descripción proporciona además el uso de anticuerpo SOST o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describió anteriormente, o la composición farmacéutica que lo contiene, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad o trastorno óseo mediado por SOST, en donde la enfermedad o el trastorno se selecciona de osteoporosis, osteopenia u osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal o enfermedad o trastorno de mieloma múltiple; preferiblemente osteoporosis.

La presente descripción proporciona además un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno mediado por SOST, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo SOST o su fragmento de unión al antígeno como se describe anteriormente, o el composición farmacéutica que lo comprende; en donde la enfermedad o trastorno se selecciona de osteoporosis, osteopenia u osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal o enfermedad o trastorno de mieloma múltiple; preferiblemente osteoporosis.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la curva de concentración de fármaco-tiempo del anticuerpo anti-SOST humanizado de la presente invención en el mono cynomolgus. Los resultados muestran que, a la misma dosis, el AUCü-t (mg/ml*día) obtenido mediante el uso del anticuerpo humanizado de la presente invención fue 22.3, que fue más de 2 veces mayor que el del anticuerpo positivo Romosozumab (9.95).

La Figura 2 muestra el porcentaje de aumento en la densidad mineral ósea (DMO) de las vértebras lumbares obtenido usando el anticuerpo anti-SOST humanizado de la presente invención. Los resultados muestran que la eficacia del anticuerpo anti-SOST humanizado de la presente invención fue dependiente de la dosis en el mono cynomolgus. El anticuerpo anti-SOST humanizado Ab-5 tiene una eficacia de 10 mg/kg que es comparable a 30 mg/kg de molécula positiva. Esto significa que la eficacia en mono de la molécula de la presente invención fue tres veces mayor que la de la molécula positiva Romosozumab.

Descripción detallada de la invención

Es bien sabido por los expertos en la técnica que la dosis del fármaco depende de una variedad de factores que incluyen, entre otros, los siguientes: la actividad de los compuestos específicos utilizados, la edad del paciente, el peso del paciente, el estado de salud del paciente, la dieta del paciente, el momento de administración, el modo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, etc. Además, las modalidades de tratamiento óptimas, como el modo de tratamiento, la dosis diaria del anticuerpo o su composición, o el tipo de sal farmacéuticamente aceptable, se puede validar de acuerdo con los regímenes de tratamiento tradicionales.

Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación, se definen específicamente determinados términos técnicos y científicos. A menos que se defina específicamente en otra parte del presente documento, todos los demás términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que los comúnmente entendidos por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Condiciones

Como se usa en este documento, el código de una sola letra y el código de tres letras para los aminoácidos se describen en J. Biol. Chem, 243, pág. 3558 (1968).

Cuando se usa en el presente documento, el término "esclerostina" o "SOST" o "proteína SOST" se refiere al producto de expresión del gen de esclerostina (SOST) (proteína). A menos que se especifique lo contrario, como el SOST murino (m-SOST) o el mono cynomolgus SOST (cyno-SOST), este término se refiere al SOST humano (h-SOST) en la presente invención. Las secuencias de nucleótidos de SOST humana, murina y de mono cynomolgus utilizadas en la presente invención se obtienen de GenBank, por ejemplo, NP_079513.1 proporciona una secuencia de proteína SOST humana.

El término "anticuerpo" en referencia a un anticuerpo antiesclerostina de la invención (o simplemente, "anticuerpo de la invención"), como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal o mAb de acuerdo con la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una única cepa celular clonal que no se limita a una línea celular eucariota, procariota o clonada en fagos. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno por recombinación, por ejemplo, técnicas de hibridoma, técnicas de recombinación, técnicas de presentación de fagos, técnicas de síntesis u otras combinaciones de técnicas anteriores u otras técnicas fácilmente conocidas en la técnica.

Un "anticuerpo monoclonal" o "anticuerpo de la invención" o simplemente "anticuerpo" puede ser un anticuerpo intacto (que comprende una región Fc intacta o de longitud completa), o una porción o fragmento de un anticuerpo que comprende un antígeno de unión porción, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')² de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los fragmentos de unión a antígeno particularmente preferidos de un anticuerpo de la invención conservan la capacidad de inhibir o neutralizar una o más características de bioactividad de una esclerostina de mamífero in vivo o in vitro. Por ejemplo, en una realización, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención puede inhibir la interacción de la esclerostina humana con uno o más de sus ligandos y/o puede inhibir una o más funciones de la esclerostina humana mediadas por receptores.

Además, un "anticuerpo monoclonal" o "anticuerpo de la invención" o simplemente "anticuerpo" como se usa en este documento puede ser un fragmento Fv de cadena sencilla que se puede producir uniendo el ADN que codifica el LCVR y el HCVR con una secuencia enlazadora (Véase Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315, 1994). Se entiende que independientemente de si se especifican fragmentos o porciones de unión a antígeno, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye tales fragmentos o porciones, así como formas de cadena sencilla. A menos que se indique lo contrario, se incluye una proteína dentro del término "anticuerpo", siempre que la proteína conserve la capacidad de unirse específicamente a la esclerostina.

El término "anticuerpo antiesclerostina", "anticuerpo específico para unirse a la esclerostina humana", "anticuerpo anti-SOST", "anti-SOST", "anticuerpo SOST" o "anticuerpo que se une a SOST" en la presente invención se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a un SOST con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo puede usarse como un agente de diagnóstico y/o un agente terapéutico para dirigirse a SOST.

Como se usa en este documento, el término "unión específica" se determina mediante técnicas disponibles en la técnica, tales como ELISA competitivo, ensayo BIACORE^® o ensayo KINEXA^® . Por ejemplo, el término también es aplicable, cuando el dominio de unión al antígeno del anticuerpo de la invención es específico para un epítopo particular portado por muchos antígenos, en cuyo caso, el anticuerpo que lleva el dominio de unión al antígeno puede unirse específicamente a una variedad de antígenos que llevan tal epítopo. El término "epítopo" se refiere a un resto molecular que puede ser reconocido y unido por un anticuerpo en la región de unión al antígeno de uno o más anticuerpos.

La frase "bioactividad" en referencia a un anticuerpo de la invención, incluye, pero no se limita a, epítopo o afinidad de unión a antígeno, capacidad para neutralizar o antagonizar una bioactividad de esclerostina in vivo o in vitro, IC50 medida en ensayo de unión de anticuerpos de esclerostina in vitro que se une y bloquea la esclerostina humana y LRP-6 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1, 2 en este documento) o se mide en otro ensayo de actividad in vitro, la estabilidad in vivo y/o in vitro del anticuerpo. Las propiedades o características mencionadas anteriormente se pueden observar o medir mediante el uso de técnicas reconocidas en la técnica que incluyen, entre otras, ELISA, ELISA competitivo, análisis de resonancia de plasmón superficial, ensayos de neutralización in vitro e in vivo sin límite, unión al receptor e inmunohistoquímica con secciones de tejido de diferentes fuentes (incluidos humanos, primates) o cualquier otra fuente según sea necesario.

La frase "bioactividad" en referencia a la esclerostina, incluye, pero no se limita a, unión específica de la esclerostina a otra proteína (por ejemplo, un receptor o miembro de la familia TGF-p), una o más funciones mediadas por receptor(s) de esclerostina humana, transducción de señales, propiedades inmunogénicas, estabilidad in vivo o in vitro, que afectan al nivel o actividad de otra proteína in vivo o in vitro (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1-5), nivel de expresión de esclerostina y distribución tisular.

El término "inhibir" o "neutralizar" como se usa en este documento, con respecto a una bioactividad de un anticuerpo de la invención, significa la capacidad de antagonizar sustancialmente, prohibir, prevenir, restringir, ralentizar, interrumpir, eliminar, detener, reducir o revertir la bioactividad de la esclerostina (por ejemplo, como se mide en el ejemplo 2 de este documento).

El término "numeración de Kabat", como se usa en el presente documento, se reconoce en la técnica y se refiere a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones de cadena pesada y liviana de un anticuerpo. (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de los NIH No 91-3242 (1991)). El posicionamiento de las CDR en la región variable de un anticuerpo sigue la numeración de Kabat o simplemente "Kabat".

Los términos "sujeto" y "paciente" usados indistintamente en este documento, se refieren a un mamífero, preferiblemente un ser humano. En una determinada realización, el sujeto se caracteriza además por padecer una enfermedad o trastorno o afección que se beneficiaría de un nivel reducido de esclerostina o de una bioactividad reducida de la esclerostina.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido operativamente. Dicho término incluye, pero no se limita a, plásmidos y vectores virales. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula huésped en donde se introducen, mientras que otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y, por lo tanto, los vectores se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). Los ejemplos de vectores son bien conocidos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "célula huésped" y "cultivo celular" se usan indistintamente e incluyen varios cultivos celulares o celulares que son receptores de cualquier polinucleótido aislado de la invención o de cualquier vector recombinante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica un HCVR, LCVR o anticuerpo de la invención. Una célula huésped incluye células transformadas, transducidas o infectadas con uno o más vectores recombinantes o un polinucleótido que expresa un anticuerpo monoclonal de la invención o una cadena liviana o pesada del mismo.

Cada cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa comprende una región variable de cadena pesada N-terminal (en el presente documento "HCVR") y una región constante de cadena pesada. Cada cadena liviana de un anticuerpo de longitud completa comprende una región variable de cadena liviana N-terminal (en el presente documento "LCVR") y una región constante de cadena liviana. La región de HCVR y LCVR se puede subdividir además en región de hipervariabilidad, denominada región determinante de complementariedad ("CDR"). Intercaladas dentro de CDR, las regiones que están más conservadas se denominan región marco ("FR"). La capacidad funcional de un anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo particular está influenciada en gran medida por las seis CDR presentes en la región variable del anticuerpo. Cada HCVR y LCVR comprende tres CDR (HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en el HCVR y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en el LCVR) y cuatro FR, ordenados desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, c DR2, FR3, CDR3, FR4. Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. El posicionamiento de CDR dentro de la región variable sigue a Kabat.

Las cadenas livianas se clasifican como kappa o lambda y se caracterizan por una región constante particular como se conoce en la técnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Algunos de esos isotipos, a su vez, se pueden dividir en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante particular con una secuencia fácilmente conocida en la técnica. La región constante de cadena liviana kappa y las regiones constantes de cadena pesada IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 son regiones constantes preferidas en los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos quiméricos pueden tener regiones constantes de origen no humano, preferiblemente de rata o murino.

Como se usa en este documento, la "región de unión a antígeno" o "parte de unión a antígeno" se refiere a una parte dentro de la región variable de una molécula de anticuerpo, que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y confieren al anticuerpo con especificidad y afinidad por el antígeno. Esta porción de anticuerpo incluye los residuos de aminoácidos del marco necesarios para mantener la conformación adecuada de los residuos de unión al antígeno.

Un anticuerpo preferido de la presente descripción comprende seis CDR que tienen secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12. Un anticuerpo más preferido de la presente descripción comprende seis CDR que tienen secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19, 27, 28, 32, 36 y 40. Más preferiblemente, las CDR optimizadas en los anticuerpos de la descripción comprenden al menos una sustitución de aminoácido en comparación con las CDR presentes en el anticuerpo original, las CDR optimizadas en los anticuerpos de la descripción comprenden seis CDR que tienen secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 13, 9, 10, 11 y 12. Las CDR de estos anticuerpos preferidos existen en la posición indicada en la Tabla 1 a continuación. Las CDR se colocan en la región variable según Kabat.

Un anticuerpo preferido de la descripción comprende un HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 14, 15 y 16. Otros anticuerpos monoclonales preferidos de la descripción comprenden un LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 18 y 19. Más preferiblemente, un anticuerpo de la descripción comprende un LCVR de SEQ ID NO: 17 y un HCVR de SEQ ID NO: 14. Un anticuerpo alternativo de la descripción comprende un LCVR de SEQ ID NO: 18 y un HCVR de SEQ ID NO: 15. Un anticuerpo más preferido de la descripción comprende un HCVR de SEQ ID NO: 16 y un LCVR de SEQ ID NO: 19. Dichos HCVR de la descripción están preferiblemente unidos a una región constante de cadena pesada, preferiblemente de origen humano, preferiblemente región constante de cadena pesada de IgG1 o IgG4, lo más preferiblemente región constante de cadena pesada de IgG4. Dichos LCVR están preferiblemente unidos a una región constante de cadena liviana, preferiblemente de origen humano, preferiblemente una cadena kappa.

Un anticuerpo preferido en la presente descripción comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y un polipéptido de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

Otro anticuerpo preferido en la presente descripción comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un polipéptido de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

Otro anticuerpo preferido en la presente invención comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y un polipéptido de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

Las SEQ ID NO de sus secuencias se enumeran en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1 Listado de secuencias de la re ión variable de mAb

Preferiblemente, un anticuerpo en la presente invención se caracteriza además por tener una K^d para la esclerostina humana de menos de aproximadamente 10 nM, 3 nM, 1 nM o 0.3 nM, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.1 nM. Además, se prefiere que dicho anticuerpo se defina adicionalmente por tener una Kd para la esclerostina de mono cynomologous de menos de aproximadamente 10 nM, 3 nM, 1 nM o 0.3 nM, o más preferiblemente menos de aproximadamente 0.1 nM.

Preferiblemente, un anticuerpo en la presente invención se caracteriza además por tener una IC50 de menos de 100 nM o menos, aproximadamente 50 o 30 nM o menos, más preferiblemente aproximadamente 25 nM, incluso más preferiblemente aproximadamente 20 nM (por ejemplo, 17.9 nM) o menos, medido en el experimento de bloqueo de la unión entre la esclerostina humana y LRP-6 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2 de la presente).

Más preferiblemente, un anticuerpo en la presente invención se caracteriza además por tener una K^d para la esclerostina humana de menos de aproximadamente 10 nM, 3 nM, 1 nM o 0.3 nM, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.1 nM, y también se caracteriza por tener una IC50 de menos de 100 nM o menos, aproximadamente 50 o 30 nM o menos, más preferiblemente aproximadamente 25 nM, incluso más preferiblemente aproximadamente 20 nM (por ejemplo, 17.9 nM) o menos, medida en el experimento de bloqueo de la unión entre esclerostina humana y LRP-6. Las seis CDR, HCVR, LCVR, HCVR y LCVR, la cadena pesada completa, la cadena liviana completa o la cadena pesada completa y la cadena liviana completa dentro de dicho anticuerpo se definen por una secuencia particular como se muestra en la SEQ ID NO en este documento.

Incluso más preferiblemente, un anticuerpo en la presente invención se caracteriza además por tener una K^d para la esclerostina humana de menos de aproximadamente 10 nM, 3 nM, 1 nM o 0.3 nM, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.1 nM, y también se caracteriza por que tiene una IC50 de menos de 100 nM o menos, aproximadamente 50 o 30 nM o menos, más preferiblemente aproximadamente 25 nM, incluso más preferiblemente aproximadamente 20 nM (por ejemplo, 17.9 nM) o menos, medido en el experimento de bloqueo de la unión entre humanos esclerostina y LRP-6; y también se caracteriza por tener una Kd de menos de 10 nM, 3 nM, 1 nM o 0.3 nM, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.1 nM, medida en el experimento de unión ELISA in vitro de anticuerpo de esclerostina usando cinoesclerostina. Las seis CDR, HCVR, LCVR, HCVR y LCVR, la cadena pesada completa, la cadena liviana completa o la cadena pesada completa y la cadena liviana completa dentro de dicho anticuerpo se definen por una secuencia particular como se muestra en la SEQ ID NO en este documento.

Expresión de anticuerpo

La presente invención también está dirigida a células huésped que expresan un anticuerpo antiesclerostina de la invención. El establecimiento y aislamiento de líneas de células hospedadoras que producen un anticuerpo de la invención se puede lograr utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica.

Se puede usar una amplia variedad de sistemas de expresión del huésped conocidos en la técnica para expresar un anticuerpo de la presente invención, incluidos los sistemas de expresión procarióticos (bacterianos) y eucarióticos (tales como levaduras, baculovirus, plantas, mamíferos y otras células animales, animales transgénicos y células de hibridoma), así como sistemas de expresión de presentación de fagos.

Se puede preparar un anticuerpo de la invención mediante la expresión recombinante de genes de cadena liviana y pesada de inmunoglobulina en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula huésped se transforma, transduce o infecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas livianas y/o cadenas pesadas del anticuerpo, de modo que las cadenas livianas y/o pesadas se expresan en la célula huésped. La cadena pesada y la cadena liviana pueden expresarse independientemente de diferentes promotores a los que están unidas operativamente en un vector o, alternativamente, la cadena pesada y la cadena liviana pueden expresarse independientemente de diferentes promotores a los que están operativamente enlazadas en dos vectores (uno que expresa la cadena pesada y otro que expresa la cadena liviana). Opcionalmente, la cadena pesada y la cadena liviana pueden expresarse en diferentes células huésped.

Además, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena liviana y/o pesada del anticuerpo antiesclerostina de una célula huésped. El gen de la cadena liviana y/o pesada del anticuerpo antiesclerostina se puede clonar en el vector, de modo que el péptido señal esté operativamente unido en marco al extremo amino terminal del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo. Preferiblemente, los anticuerpos recombinantes se secretan en el medio en donde se cultivan las células huésped, a partir del cual se pueden recuperar o purificar los anticuerpos. Un ADN aislado que codifica una región de HCVR puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica para HCVR a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena pesada. Las secuencias de genes de la región constante de la cadena pesada de seres humanos, así como de otros mamíferos se conocen en la técnica. Los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener, por ejemplo, mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM o IgD), cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) o región constante de subclase y cualquier variante alotípica de la misma como se describe en Kabat (supra). Una región constante de cadena pesada preferida comprende una región constante de IgG1 o una variante de la misma o IgG4 o una variante de la misma.

Un ADN aislado que codifica una región LCVR puede convertirse en un gen de cadena liviana de longitud completa (así como en un gen de cadena liviana Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica LCVR a otra molécula de ADN que codifica una región constante de cadena liviana. Las secuencias de genes de la región constante de la cadena liviana de seres humanos, así como de otros mamíferos se conocen en la técnica. Los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena liviana puede ser una región constante kappa o lambda.

Las células huésped de mamíferos preferidas para su uso en la invención son células CHO (por ejemplo, ATCC CRL-9096), células HEK 293E (por ejemplo, ATCC CRL-1573), células NS0, células SP2/0 y células COS (ATCC, por ejemplo, CRL -1650, CRL-1651). Las células huésped adicionales para usar en la invención incluyen otras células de mamífero, células de levadura y células procariotas. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, durante un período de tiempo suficiente para permitir la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde se cultivan las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar de la célula huésped y/o el medio de cultivo usando métodos de purificación estándar.

El producto expresado (en forma de anticuerpo completo, cadena liviana y cadena pesada u otras formas de inmunoglobulina) se puede purificar de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, intercambio iónico, afinidad, fase inversa, cromatografía en columna de interacción hidrofóbica, electroforesis en gel y similares. Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90%, 92%, 94% o 96% de homogeneidad, y lo más preferido es una homogeneidad de 98 a 99% o superior, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente purificados o purificados hasta homogeneidad según se desee, los anticuerpos estériles se pueden usar terapéuticamente, como se indica en el presente documento.

Anticuerpo humanizado

Preferiblemente, un anticuerpo de la invención que se usará con fines terapéuticos, tiene la secuencia del marco y la región constante (en la medida en que exista en el anticuerpo) derivada del mamífero, dicho anticuerpo se usaría como agente terapéutico para disminuir la posibilidad de que un anticuerpo terapéutico induzca una respuesta inmune contra el anticuerpo terapéutico en un mamífero. Los anticuerpos humanizados son de particular interés, ya que son valiosos para la aplicación terapéutica y disminuyen la probabilidad de una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón que se observa con frecuencia cuando se administran anticuerpos de origen murino o anticuerpos que comprenden porciones de origen murino a un sujeto humano. Preferiblemente, los anticuerpos humanizados inyectados pueden tener una vida media más parecida a la de los anticuerpos humanos de origen natural en comparación con, por ejemplo, anticuerpos murinos, lo que permite una administración menos frecuente o que se administre menos dosis a un sujeto.

El término "anticuerpo humanizado" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo en donde al menos una porción es de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender porciones derivadas de un anticuerpo de origen no humano (como un ratón) y porciones derivadas de un anticuerpo de origen humano, unidas, por ejemplo, químicamente mediante técnicas convencionales (por ejemplo, síntesis) o preparadas como un polipéptido contiguo usando técnicas de ingeniería genética.

Preferiblemente, un "anticuerpo humanizado" tiene CDR que se originan o se derivan de un anticuerpo original (es decir, un anticuerpo no humano, preferiblemente un anticuerpo monoclonal de ratón), mientras que el marco y la región constante, en la medida en que esté presente, (o una parte significativa o sustancial de los mismos, es decir, al menos aproximadamente 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) están codificados por información de secuencia de ácidos nucleicos que se produce en la región de inmunoglobulina de línea germinal humana (véase, por ejemplo, la base de datos internacional ImMunoGeneTics) o en formas recombinadas o mutadas de la misma, independientemente de si dichos anticuerpos se producen o no en una célula humana. Preferiblemente, al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de un anticuerpo humanizado se optimizan mediante CDR de un anticuerpo parental no humano del que se derivó el anticuerpo humanizado, para generar una propiedad deseada, por ejemplo, especificidad, afinidad o neutralización, que puede identificarse mediante un ensayo de selección, por ejemplo, un ensayo ELISA. Preferiblemente, una CDR optimizada en un anticuerpo de la invención comprende al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con la presente en el anticuerpo original. Ciertas sustituciones de aminoácidos en las CDR de los anticuerpos humanizados de la invención, cuando se comparan con las de los anticuerpos parentales (ver ejemplo 4 en este documento), disminuyen la probabilidad de inestabilidad del anticuerpo (por ejemplo, eliminación de residuos de Asn en CDR) o disminuyen la inmunogenicidad del anticuerpo cuando se administra a un sujeto humano (por ejemplo, como predice la tecnología IMMUNOFILTER™).

Los anticuerpos humanizados contienen preferiblemente una secuencia mínima derivada de un anticuerpo no humano. Los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR o secuencias marco importadas del anticuerpo original. Los anticuerpos humanizados pueden someterse a mutagénesis in vitro usando métodos de rutina en la técnica y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de la región marco de las regiones HCVR y LCVR de los anticuerpos recombinantes humanizados son secuencias que, aunque derivan de aquellas relacionadas con la línea germinal humana HCVR y las secuencias de LCVR pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Se contempla que tales secuencias de aminoácidos de las regiones marco de HCVR y LCVR de los anticuerpos recombinantes humanizados sean al menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% o más preferiblemente al menos 99% o lo más preferiblemente 100% idéntico a una secuencia de línea germinal humana.

En una realización preferida, el anticuerpo humanizado de la invención comprende una secuencia marco de cadena pesada de línea germinal humana y una secuencia marco de cadena liviana de línea germinal humana. Dichas secuencias marco se pueden obtener de una base de datos pública de ADN que cubre las secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal o de referencias publicadas. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal de los genes de la región variable de la cadena liviana y pesada humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en la web www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), así como en Kabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. En una realización preferida de la invención, en donde las secuencias de CDR murinas del anticuerpo humanizado SOST se seleccionan de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12. Se diseñaron y seleccionaron los marcos de la región variable del anticuerpo humano, en donde la secuencia de la región FR de la cadena liviana en la variable de la cadena liviana la región del anticuerpo deriva de FR1, FR2, región FR3 y región FR4 de la cadena liviana de la línea germinal humana IGKV1-39 * 01 e IGKV4-1 * 01; en donde la secuencia de la región FR de la cadena pesada en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se deriva de la región FR1, FR2, FR3 y la región FR4 de la cadena germinal humana IGHV1-18*01.

Existen múltiples métodos disponibles en la técnica para generar anticuerpos humanizados. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos humanizados mediante la obtención de secuencias de ácido nucleico que codifican e1HCVR y el LCVR de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo murino o un anticuerpo producido por un hibridoma) que se une específicamente a la esclerostina, preferiblemente esclerostina humana, identificando las CDR en dicho HCVR y LCVR (no humano), e injertar tales secuencias de ácidos nucleicos que codifican CDR en secuencias de ácidos nucleicos que codifican estructuras humanas seleccionadas. Opcionalmente, una región CDR puede optimizarse mediante mutagénesis aleatoria o en ubicaciones particulares para sustituir uno o más aminoácidos en la CDR con un aminoácido diferente antes de injertar la región CDR en la región marco. Alternativamente, una región CDR puede optimizarse después de la inserción en la región marco humana usando métodos disponibles para un experto en la técnica.

Después de que las secuencias codificantes de CDR se injertan en las secuencias codificantes del marco humano seleccionado, las secuencias de ADN resultantes que codifican las secuencias de cadena liviana variable y pesada variable humanizadas se expresan para producir un anticuerpo humanizado que se une a esclerostina. HCVR y LCVR humanizados se pueden expresar como parte de una molécula de anticuerpo antiesclerostina completa, es decir, como una proteína de fusión con secuencias de dominio constante humano. Sin embargo, las secuencias de HCVR y LCVR también se pueden expresar para producir un Fv antiesclerostina humanizado, en ausencia de secuencias constantes.

Las referencias que describen además métodos que implican la humanización de un anticuerpo de ratón que puede usarse, incluyen, por ejemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869, 1991 y el método de Winter et al [Jones et al., Nature, 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988)].

Usos terapéuticos

Se puede usar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal antiesclerostina de la invención para aumentar al menos uno de la masa ósea, la densidad mineral ósea, el contenido mineral óseo o la resistencia ósea en el hueso vertebral o no vertebral, o ambos, cuando se administra una cantidad eficaz a un sujeto humano que lo necesite. Puede usarse una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal antiesclerostina de la invención para reducir la incidencia de fractura de hueso vertebral y/o no vertebral, cuando se administra una cantidad eficaz a un sujeto humano que lo necesite. La reducción de la incidencia de fracturas incluye la reducción de la probabilidad o la incidencia real de fracturas para un sujeto humano en comparación con una población de control no tratada.

Además, un anticuerpo de la invención puede ser útil para el tratamiento de afecciones, enfermedades o trastornos en los que la presencia de esclerostina causa o contribuye a efectos patológicos indeseables; o una disminución de los niveles de esclerostina o la bioactividad de la esclerostina tiene un beneficio terapéutico en sujetos humanos. Tales afecciones, enfermedades o trastornos incluyen, pero no se limitan a, osteoporosis, osteopenia, osteoartritis, dolor asociado con osteoartritis, enfermedad periodontal o mieloma múltiple. Los sujetos pueden ser hombres o mujeres. Preferiblemente, un sujeto humano tiene riesgo de fractura de hueso vertebral y/o no vertebral, más preferiblemente un sujeto humano tiene riesgo de, o padece, osteoporosis. El sujeto humano es preferiblemente una mujer y más preferiblemente una mujer con riesgo de o tener osteoporosis posmenopáusica. Se contempla que un sujeto en cualquier etapa de la osteoporosis pueda beneficiarse del método de la invención.

Además, se contempla el uso de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente.

Los términos "tratamiento" y "tratar" están destinados a referirse a todos los procesos en los que puede haber una ralentización, interrupción, suspensión, control o detención de la progresión de los trastornos descritos en este documento, pero no necesariamente indican una total eliminación de todos los síntomas del trastorno. "Tratamiento", como se usa aquí, incluye la administración de un compuesto de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o afección en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) inhibir la progresión adicional de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o trastorno o aliviar los síntomas o complicaciones de los mismos. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas de forma independiente a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

Composición farmacéutica

Se puede incorporar un anticuerpo de la invención en una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto humano. Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un sujeto humano solo o en combinación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable en dosis únicas o múltiples. Tales composiciones farmacéuticas están diseñadas para ser apropiadas para el modo de administración seleccionado, y se usan diluyentes, portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes dispersantes, reguladores, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares según sea apropiado. Dichas composiciones pueden diseñarse de acuerdo con técnicas convencionales descritas en, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, que proporciona un compendio de técnicas de formulación como son conocidas en general por los médicos. Los vehículos adecuados para composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material que, cuando se combina con un anticuerpo monoclonal de la invención, retiene la actividad de la molécula y no es reactivo con el sistema inmunológico del sujeto.

Se puede administrar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal antiesclerostina de la presente invención a un sujeto en riesgo de padecer o que presente patologías como se describe en el presente documento, por ejemplo, osteoporosis, osteoartritis u otros trastornos degenerativos óseos, usando técnicas de administración estándar.

Una composición farmacéutica de la invención contiene preferiblemente una "cantidad eficaz" de un anticuerpo de la invención. Una cantidad eficaz se refiere a una cantidad necesaria (en las dosis y por períodos de tiempo y por los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz del anticuerpo puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o la porción del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también una cantidad en donde cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Una cantidad eficaz es al menos la dosis mínima, pero menor que una dosis tóxica, de un agente activo que es necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. En otras palabras, una cantidad efectiva o una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención es una cantidad que en mamíferos, preferiblemente humanos, (i) aumenta al menos uno entre la masa ósea, la densidad mineral ósea, el contenido mineral óseo o la resistencia ósea, o (ii) trata una afección, trastorno o enfermedad en donde la presencia de esclerostina causa o contribuye a un efecto patológico indeseable, o (iii) una disminución en el nivel de esclerostina o la bioactividad de la esclerostina da como resultado un efecto terapéutico beneficioso en un mamífero, preferiblemente un ser humano; dicha afección, trastorno o enfermedad incluye, pero no se limita a, osteoporosis, osteopenia, osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal o mieloma múltiple.

A continuación, la presente invención se describe adicionalmente con referencia a ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no se limita a los mismos.

En los ejemplos o ejemplos de prueba de la presente invención, cuando no se describen condiciones específicas, los experimentos se llevan a cabo generalmente en condiciones convencionales o de acuerdo con las condiciones sugeridas por el fabricante de la materia prima o del producto. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Contemporary Molecular Biology Approach, escrito por Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NY. Cuando no se proporciona específicamente la fuente de los reactivos, los reactivos son reactivos convencionales disponibles comercialmente.

Ejemplo

Ejemplo 1. Clonación y expresión SOST

La secuencia codificante de esclerostina humana con etiqueta His (His-h-SOST), la secuencia codificante de esclerostina humana con etiqueta Flag (h-SOST-Flag), la secuencia codificante de esclerostina de ratón con etiqueta Flag (m-SOST -Flag), y la secuencia codificante de la esclerostina de mono cynomolgus con etiqueta Flag (cyno-SOST-Flag) fueron sintetizadas por CRO Shanghai Xuguan Biotechnology Development Co., Ltd (Las secuencias de plantilla de la proteína recombinante de esclerostina anterior fueron diseñadas por la presente invención) y clonadas en el vector pTT5 (Biovector, Cat #: 102762) respectivamente. La proteína SOST recombinante se expresó en células 293 y se purificó mediante el ejemplo 2. La proteína purificada se puede usar en los siguientes experimentos de ejemplos.

Secuencia de ADN que codifica la esclerostina humana con Histag (His-h-SOST):

ATGGACATGAGGGTGCCTGCCCAACTGCTGGGCCTGTTGTTGCTTTGGTTCC CCGGAAGCAGGTGCCATCATCACCACCATCATCAGGGCTGGCAGGCCTTCAA GAACGACGCAACCGAGATTATCCCCGAACTGGGCGAATATCCCGAGCCCCCT CCAGAGCTGGAGAATAACAAGACCATGAACAGGGCCGAGAACGGCGGCAG ACCCCCCCATCATCCCTTCGAGACTAAAGACGTGAGCGAGTACAGCTGCAGG GAGCTGCATTTCACCAGGTACGTGACCGATGGCCCCTGTAGGAGCGCCAAGC CCGTGACTGAACTGGTGTGCAGCGGCCAGTGCGGTCCGGCCAGACTGCTGC CGAACGCTATCGGCAGGGGCAAGTGGTGGAGGCCCTCTGGACCCGACTTCA GGTGCATACCCGACAGGTACCGCGCTCAGAGAGTGCAACTGTTGTGTCCTGG GGGCGAGGCTCCGAGGGCGCGAAAGGTGAGGCTGGTGGCCAGTTGTAAGTG CAAGAGGCTGACCAGGTTCCACAACCAGAGCGAGCTGAAGGACTTCGGCAC CGAAGCAGCCAGGCCGCAGAAGGGCAGGAAGCCCAGGCCACGAGCACGAT CCGCCAAAGCCAATCAGGCAGAGCTCGAGAATGGCTACTGA (SEQ ID NO: 1)

Secuencia de ADN que codifica la esclerostina humana con Flagtag (h-SOST-Flag) :

ATGGACATGAGGGTGCCTGCCCAACTGCTGGGCCTGTTGTTGCTTTGGTTCC CCGGAAGCAGGTGCCAGGGCTGGCAGGCCT1CAAGAACGACGCAACCGAG AT1ATCCCCGAACTGGGCGAATATCCCGAGCCCCCTCCAGAGCTGGAGAATA ACAAGACCATGAACAGGGCCGAGAACGGCGGCAGACCCCCCCATCATCCCT TCGAGACTAAAGACGTGAGCGAGTACAGCTGCAGGGAGCTGCATTTCACCA

GGTACGTGACCGATGGCCCCTGTAGGAGCGGCAAGCCCGTGACTGAACTGG TGTGCAGCGGCCAGTGCGGTCCGGCCAGACTGCTGCCGAACGCTATCGGCA GGGGCAAGTGGTGGAGGCCCTCTGGACCCGACTTCAGGTGCATACCCGACA GGTACCGCGCT C AGAGAGTGC AACTGTT GT GTCCT GGGGGCGAGGCTC CGA GGGCGCGAAAGGTGAGGCTGGTGGCCAGTTGTAAGTGCAAGAGGCTGACCA GGTTCCACAACCAGAGCGAGCTGAAGGACTTCGGCACCGAAGCAGCCAGGC CGCAGAAGGGCAGGAAGCCCAGGCCACGAGCACGATCCGCCAAAGCCAATC AGGCAGAGCTCGAGAATGCCTACGACTACAAGGATGACGACGACAAGTGA

(SEQ ID NO: 2)

Secuencia de ADN que codifica la esclerostina de ratón con Flagtag (m-SOST-Flag): ATGGACATGAGGGTGCCTGCCCAACTGCTGGGCCTGTTGTTGCTTTGGTTCC CC GGA AGC AGGT GCC AGGGCTGGC AGGCC TTC A GGA A € G ACGC AACCGAG GTGATCCCCGGACTGGGCGAATATCCCGAGCCCCCTCCAGAGAATAACCAGA CCATGAACAGGGCCGAGAACGGCGGCAGACCCCCCCATCATCCCTACGACG CTAAAGGGGTGAGCGAGTACAGGTGCAGGGAGCTGCATTACACCAGGTTCCT GACCGAT GGCCCCTGTAGGA GCGCC A AGCCCGTGACT G A ACTGGT GT GC AG CGGCCAGTGCGGTCCGGCCAGACTGCTGCCGAACGCTATCGGCAGGGTCAA GTGGTGGAGGCCCAACGGACCCGACTTCAGGTGCATACCCGACAGGTACCG CGCTCAGAGAGTGCAACTGTTGTGTCCTGGGGGCGCCGCTCCGAGGAGCCG AAAGGTGAGGCTGGTGGCCAGTTGTAAGTGCAAGAGGCTGACCAGGTTCCA C AACC AGAGC GAGCTGAAGGACTTCGGCCCCGAAAC AGC C AGGC CGC AGA

a g g g c a g g a a g c c c a g g c c a g g a g c a c g a g g a g c c a a a g c c a a t c a g g c a GAGCTCGAGAAIGCCTACGACTACAAGGATGACGACGACAAGTGA

(SEQ ID NO: 3)

Secuencia de ADN que codifica la cinoesclerostina con Flagtag (cyno-SOST-Flag):

ATGGACATGAGGGTGCCTGCCCAACTGCTGGGCCTGTTGTTGCTTTGGTTCC CCGGAAGCAGGTGCGAGGGCTGGCAGGCCTTCAAGAACGACGCAACCGAG ATTATCCCCGAACTGGGCGAATATCCCGAGCCCCCTCCAGAGCTGGAGAATA ACAAGACCATGAACAGGGCCGAGAACGGCGGCAGACCCCCCCATCATCCCT TCGAGACTAAAGACGTGAGCGAGTACAGCTGCAGGGAGCTGCATTTCACCA GGTACGTGACCGATGGCCAGTGTAGGAGCGCCAAGCCCGTGACTGAACTGG

t g t g c a g c g g c c a g t g c g g t c c g g c c a g a c t g c t g c c g a a c g c t a t c g g c a g g g g c a a g t g g t g g a g g c c c t c t g g a c c c g a c t t c a g g t g c a t a c c c g a c a g g t a c c g c g c t c a g a g a g t g c a a c t g t t g t g t c c t g g g g g c g c c g c t c c g a

g g t t c c a c a a c c a g a g c g a g c t g a a g g a c t t c g g c c c c g a a g c a g c c a g g c c g c a g a a g g g c a g g a a g c c c a g g c c a g g a g c a c g a g g a g c c a a a g c c a a t c a g g c a g a g c t c g a g a a t g c c t a c g a c t a c a a g g a t g a c g a c g a c a a g t g a (SEO ID NO: 4)

Ejemplo 2. Purificación de proteína recombinante SOST

1. Pasos de purificación de la proteína recombinante SOST con etiqueta His

El sobrenadante de expresión celular se centrifugó a alta velocidad para eliminar las impurezas, y el regulador se cambió a PBS, se añadió imidazol hasta una concentración final de 5 mM. La columna de níquel se equilibró con una solución de PBS que contenía imidazol 5 mM y se lavó con 2-5 volúmenes de columna. Posteriormente, se cargó el sobrenadante en la columna. La columna se lavó con una solución de PBS que contenía imidazol 5 mM hasta que la lectura de A280 se redujo al valor inicial. Y luego, la columna de cromatografía se lavó con PBS más imidazol 10 mM para eliminar las proteínas unidas inespecíficas y se recolectó el efluente. La proteína diana se eluyó con una solución de PBS que contenía imidazol 300 mM y se recolectó el pico de elución.

El efluente recogido se purificó adicionalmente mediante intercambio iónico (columna SP). Prepárese la solución A: PB 0.01 M, pH 8.0. Prepárese la solución B: solución A NaCl 1M. La proteína diana que se eluyó con una solución de PBS que contenía imidazol se dializó primero contra la solución A y la columna SP se equilibró con la solución A; se cargó la muestra; el gradiente de concentración de la solución B es 0-100%; la proteína diana se eluyó con 10 volúmenes de columna y se recolectó el pico de elución. La proteína obtenida se identificó mediante electroforesis, mapeo de péptidos y LC-MS, y se tomó alícuotas de la muestra correcta para su uso. Se obtuvo la esclerostina humana con etiqueta His (His-h-SOST).

2. Pasos de purificación de la proteína recombinante SOST con etiqueta Flag

La muestra se centrifugó a alta velocidad para eliminar las impurezas y se concentró hasta un volumen apropiado. La columna de afinidad Flag se equilibró con 0.5 x PBS y se lavó con 2-5 volúmenes de columna. Las muestras de sobrenadante se cargaron luego en la columna después de eliminar la impureza. La columna se lavó con 0.5 x PBS hasta que la lectura de A280 se redujo a la línea base. Luego, la columna se lavó con PBS que contenía NaCl 0.3 M y la proteína con impurezas se lavó y se recolectó. La proteína diana se eluyó con ácido acético 0.1 M (pH 3.5-4.0) y se recolectó, el pH se ajustó a neutro. La muestra recolectada se identificó mediante electroforesis, mapeo de péptidos, LC-MS, y se tomó alícuotas de la muestra correcta para su uso.

La esclerostina humana con etiqueta Flag (h-SOST-Flag), la esclerostina de ratón con etiqueta Flag (m-SOST-Flag) y la esclerostina de mono cynomolgus con etiqueta Flag (cyno-SOST-Flag) se obtuvieron y utilizaron para la prueba de rendimiento del anticuerpos en la presente invención.

Ejemplo 3. Producción de anticuerpo monoclonal anti-SOST humano

El anticuerpo monoclonal anti-SOST humano se produjo inmunizando ratones. Ratones blancos SJL experimentales, hembra, de 6 semanas de edad (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., número de licencia de producción animal: SCXK (Beijing) 2012-0001).

Entorno de alimentación: nivel de SPF. Una vez adquiridos los ratones, los animales se mantuvieron en el laboratorio durante 1 semana, con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, a una temperatura de 20-25°C, una humedad del 40-60%. Los ratones que se habían aclimatado al medio ambiente se dividieron en dos grupos (A/B), 10 ratones para cada grupo.

Se usó como inmunógeno proteína recombinante SOST humana con etiqueta His (etiqueta His-h). En el grupo A, se utilizó adyuvante de Freund (sigma Lot Num: F5881/F5506) para la emulsificación: La primera inmunización se realizó con adyuvante completo de Freund (CFA) y las inmunizaciones de refuerzo se realizaron con adyuvante incompleto de Freund (IFA). La relación de antígeno a adyuvante fue 1:1, 200 pl/200 pg/ratón (primera inmunización), 200 pl/100 pg/ratón (refuerzo). En el grupo B, la inmunización cruzada se realizó con Titermax (sigma Lot Num: T2684) y Alum (Thremo Lot Num: 77161). La relación de antígeno a adyuvante (titermax) fue 1:1 y la relación de antígeno a adyuvante (Alum) fue 3:1, 200 pl/200 pg/ratón (primera inmunización), 200 pl/100 pg/ratón (refuerzo). El antígeno se emulsionó e inoculó a los 0, 14, 28, 42, 56 días.

El día 0, el ratón del grupo A/B se inyectó por vía intraperitoneal (IP) con 50 pg/ratón del antígeno emulsionado. El día 14, los ratones se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) con 25 pg/ratón en múltiples sitios (normalmente 6-8 sitios en la espalda). En los días 28 y 42, se seleccionó la inyección de antígeno por la espalda o intraperitoneal de acuerdo con los bultos en la espalda y las condiciones de hinchazón en el abdomen. Se realizó una inmunización de refuerzo mediante inyección intraperitoneal (IP) de solución de antígeno formulada con solución salina a 200 pg/ratón 3 días antes de la fusión de esplenocitos.

Se realizó la prueba del título en sangre los días 22, 36, 50 y 64, y se midió la actividad de unión del suero de ratón a la esclerostina humana mediante el método ELISA del Ejemplo de prueba 1. El resultado se muestra en la Tabla 2. En la cuarta inmunización, se seleccionaron ratones con títulos sanguíneos elevados que tendían a la plataforma para la fusión de esplenocitos. Las células de hibridoma se obtuvieron fusionando esplenocitos con células Sp2/0 de mieloma (ATCC® ^c RL-8287™) utilizando un procedimiento de fusión optimizado mediado por PEG. La actividad de bloquear la unión entre SOST humano y LRP-6 por el anticuerpo anti-SOST humano en suero de ratón se detectó como Ejemplo de prueba 2, y se seleccionó la cepa de células de hibridoma monoclonal Ab-1 con buena actividad de unión y bloqueo in vitro. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. La actividad de los anticuer os murinos in vitro.

Ejemplo 4. Humanización de anticuerpo murino antiesclerostina humana

Se seleccionó una cepa de células de hibridoma monoclonal Ab-1 con buena bioactividad in vitro, se secuenció el hibridoma y se realizaron además la humanización, la expresión recombinante y la evaluación de la actividad.

El proceso de secuenciación de hibridomas se realizó como sigue. Las células de hibridoma se recolectaron en la fase de crecimiento logarítmico y el ARN se aisló en Trizol (Invitrogen 15596-018, de acuerdo con las instrucciones del kit), y luego se realizó la transcripción inversa (PrimeScript ™ Reverse Transcriptase, Takara, cat # 2680A) del ARN como instrucción. Los ADNc obtenidos por transcripción inversa se amplificaron mediante PCR utilizando el Ig-Primer Set de ratón (Novagen, TB326 Rev.B 0503) y se secuenciaron en una compañía de secuenciación. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a la secuencia de ADN obtenida se muestran como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6:

La región variable de cadena pesada obtenida de células de hibridoma:

EVQLQQSGPELVKPGTSVKIPCQTSGYTFTDYNLDWLKQRPGESLEWIGDI

DPNNGDTLYNQKFRDKATETVDTSSNTAYLELRSLTSEDTAVYYCARRWAYYFD YWGQGTTLTISS (SEQ ID NO: 5)

La región variable de cadena liviana obtenida de células de hibridoma:

El método de humanización del anticuerpo monoclonal anti-SOST humano murino se realizó como se describe en muchas publicaciones en la técnica. En resumen, el dominio de la región constante del parental (anticuerpo murino) se reemplazó por un dominio de la región constante humana, y la línea germinal del anticuerpo humano se seleccionó de acuerdo con la homología entre el anticuerpo murino y humano. Las moléculas candidatas que muestran una buena actividad en la presente descripción se humanizaron y los resultados fueron los siguientes. 1. La región CDR del anticuerpo antiesclerostina murino

Los residuos de aminoácidos de VH/VL CDR se identificaron y anotaron mediante el sistema de numeración de Kabat.

Las secuencias de CDR de Ab-1 murino en la presente invención se describen en la Tabla 3:

Tabla 3. Secuencias de CDR del anticuer o antiesclerostina murino

Selección de la secuencia de la región FR de la línea germinal humana

Sobre la base de la estructura típica de VH/VL CDR del anticuerpo murino, las secuencias de la región variable de la cadena pesada y liviana se compararon con la base de datos de la línea germinal del anticuerpo, se seleccionó el molde de la línea germinal humana con alta homología. En donde la región marco de la cadena liviana de la línea germinal humana procedía del gen de la cadena liviana kappa humana, y preferiblemente, se seleccionó IGKV1-39*01 o IGKV4-1*01 de las plantillas de cadena liviana de la línea germinal humana en la presente invención. La región marco de la cadena pesada de la línea germinal humana procedía de la cadena pesada humana y, preferiblemente, se seleccionó IGHV1-18*01 de las plantillas de la cadena pesada de la línea germinal humana en la presente invención. La región CDR del anticuerpo murino Ab-1 se trasplantó en la plantilla humanizada seleccionada, reemplazando la región variable humanizada, y luego se recombinó con la región constante de IgG. Basándose en la estructura tridimensional del anticuerpo murino, las retromutaciones se realizaron en los residuos atrapados, en los residuos que tienen interacciones directas con las regiones CDR, así como en los residuos que tienen efectos importantes sobre las conformaciones de VL. y VH, y los residuos en la región CDR que exhiben inestabilidad química (la CDR2 de cadena pesada se optimizó para obtener una nueva secuencia de CDR2 de cadena pesada DIDPNDGDILYNQKFRD, SEQ ID NO: 13) se optimizaron y se obtuvo la molécula humanizada final. Las secuencias de la región variable de la cadena pesada de la molécula humanizada final se mostraron como SEQ ID NO: 14-16, y estas secuencias se pueden combinar con cualquiera de las regiones constantes de la cadena pesada mostradas como SEQ ID NO: 20-22. Las secuencias de la región variable de la cadena liviana de la molécula humanizada final se mostraron como SEQ ID NO: 17-19, y estas secuencias se pueden combinar con las secuencias de la región constante de la cadena liviana mostradas como SEQ ID NO: 23, respectivamente.

1. Región variable de cadena pesada:

Región variable de cadena pesada de Ab-5:

E VQL V Q SGAEVKKP GA S VK VSCK A SGY TFTDYNLDWLRQ APGEGLE WI GDIDP NDGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFD YWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: i 4)

Región variable de cadena pesada de Ab-9:

E VQLVQ SGAEVKKPG AS VK V SCKA SGYTFTD YNLDWLRQ APGEGLE WÍGDIDP N NC^jDI LY XQKFRDRVT.VÍTTDT S TSTAY MELRSLR SDDTAV Y Y C ARRWAY YE D Y WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 15)

Región variable de cadena pesada de Ab-10:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDW VRQAPGQGLEW MGDI DPNNGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYF DYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16)

2. La región constante de la cadena pesada de cada anticuerpo puede ser cualquiera de las siguientes secuencias:

La región constante de la cadena pesada de la IgG4 humana (se eliminaron los residuos de aminoácidos K):

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVEQSSGLYSESSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CP APEFLGGPS V FLFPPKPKDTLMISRTPEVTC V V VD V SQEDPE VQF N W YVDG V EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT

[SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSETCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLG (SEQ ID NO: 20)

La región constante de la cadena pesada de la IgG4 humana:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFF AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV E VHN AKTKPREEQFN STYR W S VLTVLHQD WLN GKE YKCK VSNK GLPS STEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO: 21)

La región constante de la cadena pesada de la IgG2 humana:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYÍCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREF.QYNSTYRVVSVITVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEK’nSKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 22)

3. Región variable de cadena liviana:

La región variable de cadena liviana de Ab-5:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTiTCKASQSVSNDVAWYQQKPGKSPKLUYYTSNRF TGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPVTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 17)

La región variable de cadena liviana de Ab-9:

N1VMTQSP S SLS AS VGDRVT1TCK ASQ S VSND VAW YQQKPGKSPKLLIY YTSNRF TGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPVTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO 18)

La región variable de cadena liviana de Ab-10:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSNR FTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPVTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 19) 4. La región constante de la cadena liviana proviene de la cadena k humana:

RTVAAPSWIFPPSDF.QLKSGTASVVCLENNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 23)

Los anticuerpos se clonaron, expresaron y purificaron mediante clonación de genes y expresión recombinante, y luego se detectaron mediante ensayo ELISA de unión (Ejemplo de prueba 1 y Ejemplo de prueba 3), ensayo de bloqueo de la unión entre antígeno y receptor (Ejemplo de prueba 2), Biacore (Ejemplo de prueba 4), detección de actividad celular (Ejemplo de prueba 5) etc., finalmente, se seleccionaron los anticuerpos humanizados Ab-5, Ab-9, Ab-10 con mejor actividad, y las secuencias se muestran como sigue:

Anticuerpo humanizado Ab-10:

Cadena pesada:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWVRQAPGQGLEWMGD1 DPNNGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYF DYWGQGTTVTVS S A STKGPS V FPL A PSSKSTSGGTA ALGCLVK D YFPF.PVT VS W NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDK K VEPE S CD K i T i l C P P C PAPE LL GGP S VF L FP PKPKDTL Mí 5 RTP E VT C Y VVDV S H EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO. 24)

Cadena liviana:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCK ASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKL1JYYTSNR F'TGVPSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCQQDYSSPVTFGGGi’KVEÍKRTV

EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTFIQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 27) Anticuerpo humanizado Ab-9:

Cadena pesada:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWLRQAPGEGLEWIGDIDP NNGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSF.STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV'rVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKR VESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE VQFN WYVDGV EVHNA KTKPR EEQFNST Y RV VS VLT V LHQD WLNGKE Y KCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 25)

Cadena liviana:

NIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKSPKLLIYYTSNRF T G V PDR F SG SGSGTDFTLTIS SLQPEDF AI YF C QQD Y S SP VTFGGGTK. VE1KRT VA APSYFÍFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 28)

Anticuerpo humanizado Ab-5:

Cadena pesada:

EV Q LVQ SG AEV K KPG A SVKVSCKASGYTFTDYNLDW LRQAPGEGLEW IGDIDP

NDGDILYNQKFRDRVTM ITDTSTSTAYM ELRSLRSDDTAVYYCARRW AYYFDY

W GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NS

GAITSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK.VDKR

VESKY GPPCPPCPAPEF LGGPS VTLFPPKPKDTLM ISRT PE VTC V V VDVSQEDPE

VQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKV

SNKGLPSSfEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

EW ESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVF SCSVM HEAL

H N H Y TQ K SLSLSLG (SEQ ID NO: 26)

Cadena liviana:

D I VM TQSP S SLS AS V GDRVT IT CK ASQ S V SND VAW Y QQKPGKSPKLLIY YTSNRF

TGVPDRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYFCQQD YSSPVTF GGGTK VEÍKRT VA

APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 29)

Los datos de la actividad de unión entre el anticuerpo anti-SOST humano humanizado y la esclerostina humana (h-SOST-Flag) en la presente invención se muestran en la Tabla 4.

Ejemplos de prueba:

Evaluación de la bioactividad in vitro

Ejemplo de prueba 1: Ensayo ELISA de unión

El anticuerpo de esclerostina bloquea la unión de la esclerostina con su receptor en la membrana celular, por lo que bloquea la vía de señalización corriente abajo de la esclerostina. Se utilizaron experimentos de ELISA para detectar las propiedades de unión de los anticuerpos de esclerostina. La esclerostina con etiqueta Flag (h-SOST-FLAG, que codifica por SEQ ID NO: 2) se biotiniló mediante un kit de marcaje con biotina (Dojido Chem, LK03) y se inmovilizó en la placa EIA/RIA de 96 pozos mediante la unión a la estreptavidina recubierta sobre ella. Después de que se añadió el anticuerpo, se usó la fuerza de la señal para determinar la actividad de unión entre el anticuerpo y la esclerostina humana.

La estreptavidina (Sigma, S4762-5MG) se diluyó a una concentración de 5 pg/ml con regulador PBS a pH 7.4 (Sigma, P4417-100TAB) y se añadió a una placa EIA/RIA de 96 pozos (Corning, CLS3590 -100EA) a un volumen de 5 pl/pozo y luego, la placa se incubó en una incubadora a 37°C durante 2 horas. Desechando el líquido, las placas se bloquearon con 200pl/pozo de solución de bloqueo que contenía leche desnatada al 5% (leche desnatada Guangming) en PBS y se incubaron en una incubadora a 37°C durante 2.5 horas o durante la noche a 4°C (16-18 horas). Después del bloqueo, la solución de bloqueo se descartó y la placa se lavó 5 veces con regulador PBST (PH7.4 PBS que contenía 0.05% de Tween-20). La proteína SOST-FLAG biotinilada (R&D SYSTEM, 1505-LR-025) se diluyó con regulador de dilución de muestra (PH7.4 PBS que contiene 1% de BSA) a 0.5 pg/ml y se añadió a cada pozo a 50 pl/pozo, luego la placa se incubó en la incubadora a 37°C durante 2 h. Después de la incubación, la solución de reacción en la placa se descartó y la placa se lavó con PBST 6 veces, y luego se agregaron 50 pl/pozo de anticuerpo de dilución en gradiente con regulador de dilución de muestra, y la placa se incubó en una incubadora a 37°C por 2 h. La placa se lavó 6 veces con PBST después de la incubación y se le añadió 100 pl/pozo de anti­ ratón de cabra marcado con HRP (Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003) o anticuerpo secundario anti­ humano de cabra marcado con HRP. (Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003) diluido a la dilución de la muestra y se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de lavar las placas con PBST 6 veces, se añadieron 50 pl/pozo de sustrato TMB (KPL, Cat No. 52-00-03) a cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 min, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de H2SO41M a cada pozo. El valor de DO a una longitud de onda de 450 nm se leyó en el lector de microplacas NOVOStar, y luego se calcularon los valores de EC50 de la unión entre el anticuerpo de esclerostina de la presente invención y la esclerostina humana; los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. La actividad de unión entre el anticuerpo anti-SOST humanizado y la esclerostina humana (h-SOST-Flag)

Los resultados mostraron que los anticuerpos anti-SOST humana humanizados en la presente invención mantienen la misma actividad de unión que su anticuerpo parental.

Ejemplo de prueba 2: Un ensayo de anticuerpo anti-SOST que bloquea la unión de esclerostina con LRP-6

La esclerostina puede inhibir la actividad de la ruta de señalización de wnt/p-catenina mediante la unión con el correceptor LRP5/LRP-6 de la ruta de señal de wnt/p-catenina en la membrana celular, para bloquear la osteogénesis. En este experimento, se detectó la actividad del anticuerpo anti-SOST humano cribado para bloquear la unión entre SOST humano/SOST de mono y LRP-6 humano usando un ensayo de bloqueo in vitro. El control positivo fue Romosozumab (el método de preparación es como los descritos en la referencia OMS sobre medicamentos, Vol. 25, No. 4, 2011, 413-465, P434).

El método es que el anticuerpo de cabra anti-Fc humano se revistió sobre una placa EIA/RIA de 96 pozos, y luego se añadió la proteína de fusión LRP-6-Fc para la incubación. La proteína esclerostina biotinilada y el anticuerpo antiesclerostina se incubaron conjuntamente y luego se añadieron a la placa para la incubación. Después de lavar la placa, se midió la cantidad de unión entre la esclerostina biotinilada y LRP-6, y se calculó el valor IC50 de la actividad bloqueante del anticuerpo de esclerostina.

El anticuerpo de cabra anti-Fc humano se diluyó a una concentración de 1 pg/ml con regulador PBS a pH 7.4 (Sigma, P4417-100TAB), y se añadió a una placa EIA/RIA de 96 pozos a un volumen de 100 pl/pozo y luego, la placa se incubó a 37°C durante 2 horas. Después de desechar el líquido, las placas se bloquearon con 200 pl/pozo de solución de bloqueo que contenía leche desnatada al 5% (leche desnatada de Guangming) en PBS y se incubaron a 37°C durante 2.5 horas. Después del bloqueo, la solución de bloqueo se descartó y la placa se lavó 5 veces con regulador PBST (PH 7.4 PBS que contenía 0.05% de Tween-20). La proteína de fusión L^p R-6-F^c (R&D SYSTEM, 1505-LRP-025) se diluyó con regulador de dilución de muestra (^p H 7.4 PBS que contiene 1% de B^sA) a 1 pg/ml y se añadió 50 pl/pozo, luego la placa se incubó a 37°C durante 2 h. La proteína esclerostina humana (R&D SYSTEM, 1406-ST/^c F) a una concentración de 1.12 pg/ml se marcó usando un kit de marcaje de biotina (Dojido Chemical, LK03) y se añadió a la placa de dilución a un volumen de 30 pl/pozo y se añadieron a cada pozo 30 pl/pozo de anticuerpo de esclerostina de prueba diluido a la concentración apropiada, luego se mezcló la placa y se incubó en la incubadora a 37°C durante 2 h. Después de la incubación, se descartó la solución de reacción en la placa. La placa se lavó con PBST 6 veces, y luego se añadió la mezcla de antígeno y anticuerpo en la placa de dilución a la placa y se incubó a 4°C durante la noche (16-18 h). La solución de la placa se descartó y la placa se lavó 6 veces con PBST; luego se añadieron 50 pl/pozo de polímero de estreptavidina-peroxidasa (Sigma, S2438-250UG), que se había diluido con regulador de dilución de muestra en una proporción de 1:600, a cada pozo, y la placa se incubó a 37°C durante 1 h. Después de lavar las placas 6 veces con PBST, se añadieron 50 pl/pozo de sustrato TMB (KPL, Cat No. 52-00-03) a cada pozo, y se incubó a temperatura ambiente durante 3-10 min, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de H2SO41M a cada pozo. El valor de DO a una longitud de onda de 450 nm se leyó en el lector de microplacas NOVOStar, y luego se calcularon los valores IC50 del anticuerpo esclerostina para bloquear la unión entre la esclerostina humana y LRP-6; los resultados se muestran en la Tabla 5.

El método anterior se puede usar para detectar los valores de IC50 del anticuerpo de esclerostina en la presente invención para bloquear la unión entre la esclerostina de mono (codificada y expresada por SEQ ID NO: 4 y luego purificada) y LRP-6, los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. La actividad del anticuerpo SOST humanizado en la presente invención para bloquear la unión entre la esclerostina de diferentes especies y LRP-6

continuación

Los resultados mostraron que la actividad de bloqueo del anticuerpo anti-SOST humano humanizado en la presente invención para bloquear la unión entre la esclerostina humana/de mono y LRP-6 es comparable a la del anticuerpo positivo Romosozumab.

Ejemplo de prueba 3: Determinación de Biacore

Se usó Biacore (GE) para determinar la afinidad del anticuerpo anti-SOST humanizado con SOST humano, de mono, murino.

El anticuerpo de captura antihumano se unió covalentemente al chip biosensor CM5 (Cat. # BR-1000-12, GE) del instrumento Biacore (Biacore X100, GE) de acuerdo con el método descrito en las instrucciones del kit de atrapamiento antihumano (GE, Cat. # BR-1008-39) para capturar por afinidad una cantidad de anticuerpo de prueba. Luego, un gradiente de concentraciones de antígeno SOST (SOsT humano, R&D SYSTEM, Cat. # 1406-ST-025/CF, R&D; mono SOST, cyno-SOST-Flag, obtenido por purificación, codificado por SEQ ID NO: 4 de Ejemplo 1; SOST murino, m-SOST-Flag, obtenido por purificación, codificado por SEQ ID NO: 3 del Ejemplo 1) se hicieron fluir a través de la superficie del biochip. La señal de reacción se detectó en tiempo real utilizando un instrumento Biacore (GE, BiacoreX100) para obtener las curvas de asociación y disociación. Una vez finalizado cada ciclo de disociación en el experimento, el biochip se lavó y se regeneró con solución de regeneración en el kit de captura antihumana. El kit de amino acoplado utilizado en los experimentos se adquirió de GE (Cat. # BR-1000-50, g E), y el regulador fue HBS-EP solución reguladora 10x (Cat. # BR-1006-69, Ge ), y el regulador se diluyó a 1 * (pH 7.4) con DI Agua. Los datos obtenidos se ajustaron mediante el software GE BIAevaluation versión 4.1 utilizando el modelo Langmuir 1:1, y se generó el valor de afinidad, los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Actividad in vitro de anticuerpos humanizados contra esclerostina de diferentes especies

El anticuerpo humanizado Ab-5 de la presente invención tiene una alta afinidad con SOST humano y SOST de mono, y dicha afinidad es más de 10 veces mayor en comparación con la molécula positiva.

Ejemplo de prueba 4: Prueba de actividad del anticuerpo antiesclerostina en la célula

En este estudio, se evaluó la actividad in vitro del anticuerpo SOST en las células de la presente invención de acuerdo con el valor de EC50 detectando la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) en las células.

Se cultivaron células C2C12 (Chinese Academy of Sciences, Banco de Células, Catálogo No. GNM26) en medio DMEM que contenía FBS al 10% y se pasaron de 2 a 3 veces por semana en una proporción de 1:5 o 1:10. Durante el pase, se descartó el medio de cultivo y se utilizaron 5 ml de tripsina al 0.25% para lavar la capa celular, y luego se eliminó la tripsina. Las células se digirieron en una incubadora durante 3-5 minutos y se resuspendieron en medio fresco. Se agregaron 100 pl de suspensión celular a una placa de cultivo celular de 96 pozos a una densidad de 5 x 10⁴ células/ml, el medio era DMEM que contenía FBS al 10% y solo se agregaron al exterior 100 pl de medio DMEM que contenía FBS al 10% de la placa de 96 pozos. Luego, las placas de cultivo se cultivaron en una incubadora durante 24 horas (37°C, CO² al 5%). Una vez observada la adherencia celular, se descartó el medio; y se añadieron a cada pozo 70 pl de medio DMEM que contenía FBS al 10%. Se añadieron a cada pozo 10 pl de wnt3a (R&D, catálogo No. 5036-WN-010) a una concentración final de 100 ng/ml y SOST (R&D, Catálogo No. 1406-ST-025) a una concentración final de 5 pg/ml, respectivamente. Las muestras de prueba se diluyeron con PBS en diferentes gradientes de concentración y se agregaron 10 pl de diferentes concentraciones de la muestra de prueba a la placa de cultivo. Luego, la placa de cultivo se incubó en una incubadora durante tres días (37°C, CO² al 5%). Se descartó el medio y se añadieron 150 pl de sustrato de ALP a cada pozo y la placa de cultivo se incubó en una incubadora durante 2 h. El valor de DO a una longitud de onda de 450 nm se leyó en un lector de microplacas (PerkinElmer, Catálogo # VICTOR3), y luego se calcularon los valores de EC50; los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Prueba de actividad del anticuerpo en la presente invención en células

Los resultados mostraron que la actividad del anticuerpo SOST humanizado Ab-5 en la presente invención que actúa sobre las células es comparable a la del anticuerpo positivo Romosozumab.

Evaluación farmacocinética

Ejemplo de prueba 5: Evaluación del T1/2 del anticuerpo anti-SOST humanizado en mono cynomolgus

Tres monos cynomolgus usados en el experimento eran hembras, de 4 a 5 años, de menos de 4 kg, y se compraron en Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd. Entorno de alimentación: sala común. Después de comprar los monos cynomolgus, cada mono se mantuvo en una jaula separada y se les dio acceso ad libitum al agua y la dieta. La duración de la adaptación en el entorno de laboratorio no es inferior a 14 días, con regulación del ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, a una temperatura de 23-29°C y una humedad relativa del 40-70%. Se numeraron tres monos cynomolgus antes de comenzar el experimento. El día del experimento, a cada mono cynomolgus se le inyectó por vía subcutánea el fármaco de prueba o la molécula positiva (30 mg/kg) a 8 ml/mono/administración.

Los monos se fijaron en una silla para monos y la sangre se extrajo a través de la vena del codo o la vena safena (aproximadamente 1.5 ml de sangre en cada muestreo) para obtener suero y se conservó a -20 grados. El momento del muestreo de sangre fue: 12 h antes de la administración, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h (segundo día) después de la administración el primer día, el tercer día, quinto día, séptimo día, decimocuarto día, vigésimo primer día y vigésimo octavo día. Después de que se recolectaron las muestras de sangre, se detectó la concentración sérica del fármaco mediante ELISA y se realizó el análisis de PK; los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. El T1/2 del anticuerpo anti-SOST humanizado en mono cynomolgus

Los resultados mostraron que las moléculas candidatas humanizadas tienen una vida media más larga en el mono cynomolgus in vivo, que es aproximadamente dos veces (Ab-5) tanto como la de la molécula positiva Romosozumab.

Evaluación de la actividad biológica in vivo

Ejemplo de prueba 6: Evaluación de la eficacia in vivo del anticuerpo anti-SOST humanizado en mono cynomolgus Tres monos cynomolgus usados en el experimento eran hembras, de 4 a 5 años, de menos de 4 kg, se compraron en Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd. Entorno de alimentación: sala común. Después de la compra de los monos cynomolgus, cada mono se mantuvo en una jaula separada y se les dio acceso ad libitum al agua y la dieta. La duración de la adaptación en el entorno de laboratorio no es inferior a 14 días, con regulación del ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, a una temperatura de 23-29°C y una humedad relativa del 40-70%. Se numeraron tres monos cynomolgus un día antes de comenzar el experimento, y luego se tomó la sangre después de la anestesia para obtener suero y plasma, y se evaluó la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo del radio lumbar y distal, el valor resultante se utilizó como base valor. A cada mono cynomolgus se le inyectó por vía subcutánea el fármaco de prueba (10, 30, 60 mg/kg, diferentes dosis) y moléculas positivas (30 mg/kg) a 8 ml/mono/administración. Los fármacos se administraron una vez al mes por un total de 2 veces. Durante el experimento, en la cuarta y octava semana después de la administración, los animales fueron evaluados para determinar la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo de las vértebras lumbares y el radio distal, respectivamente.

Dos meses después del experimento, todos los animales fueron anestesiados y sacrificados (con una dosis excesiva de pentobarbital sódico). Después de eso, se probaron la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo del segundo al quinto radio lumbar y distal.

Los resultados se muestran en la Tabla 9, Figura 1 y Figura 2.

Tabla 9. Eficacia del anticuerpo anti-SOST humano en mono cynomolgus

Los resultados mostraron que la eficacia in vivo del anticuerpo anti-SOST humanizado en la presente invención era dependiente de la dosis en el mono cynomolgus. La eficacia del anticuerpo anti-SOST humanizado Ab-5 a 10 mg/kg fue igual a la molécula positiva a 30 mg/kg (Figura 2). Esto significa que la eficacia del anticuerpo anti-SOST humanizado en la presente invención es dos veces mayor que la de la molécula positiva Romosozumab en mono. Cuando se administra con la misma dosis, el AUCü-t (mg/ml*día) del anticuerpo humanizado fue 22.3, que es más de 2 veces mayor que el del anticuerpo positivo Romosozumab (9.95) (ver Figura 1).

Prueba de solubilidad

Ejemplo de prueba 7: Solubilidad del anticuerpo anti-SOST humanizado

Para detectar la solubilidad del anticuerpo anti-SOST humanizado, se detectaron el anticuerpo Ab-5 y el anticuerpo positivo Romosozumab con un gradiente de concentraciones crecientes por su contenido de monómeros de anticuerpos solubles, precipitación y contenido de polímero. En la prueba, la concentración inicial de anticuerpo fue de 10 mg/ml que se disolvió en regulador PBS de PH 7.4. Las muestras se centrifugaron en un concentrador de ultrafiltración (Millipore, Amicon Ultra-15 50K) a 4 grados, a 4000 rpm. Durante la centrifugación, se tomaron muestras en un intervalo de 5-10 minutos y se detectó la concentración de anticuerpo hasta alcanzar 30 mg/ml y 90 mg/ml. Se tomaron muestras en diferentes condiciones de concentración y se sometieron a análisis SEC-HPLC respectivamente, los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10. La solubilidad del anticuerpo anti-SOST

Los resultados anteriores mostraron que, cuando la concentración de anticuerpo de la invención era de hasta 90 mg/ml, todavía era transparente sin precipitación y la cantidad de monómero de anticuerpo no cambió. Sin embargo, las moléculas positivas a la misma concentración tuvieron precipitación en masa y la cantidad de monómero de anticuerpo se redujo del 95.8% al 92%.

Evaluación de estabilidad

Ejemplo de prueba 8: La estabilidad del anticuerpo anti-SOST humanizado

Para probar la estabilidad del anticuerpo anti-SOST humanizado de la presente invención, el anticuerpo Ab-5 y el anticuerpo positivo Romosozumab se colocaron en el regulador PBS de pH 7.4 a 4 grados durante 7 días. Se utilizaron dos métodos para detectar la estabilidad: uno es evaluar la cantidad de formación de precipitado insoluble

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 26 y una cadena liviana de SEQ ID NO: 29.

2. Una molécula de ADN, que codifica el anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Una célula huésped, que se transforma con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.

5. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la célula huésped es una célula de mamífero.

6. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la célula huésped es una célula CHO.

7. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, y uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

8. El anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para uso como medicamento, aumentando al menos uno de masa ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo o resistencia ósea.

9. El anticuerpo que se une específicamente a la esclerostina humana de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para su uso en el tratamiento de una enfermedad ósea mediada por esclerostina o un trastorno seleccionado entre osteoporosis, osteopenia, osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad periodontal y mieloma múltiple.