TW202134271A - 抗硬骨素抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
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Abstract
本發明涉及抗硬骨素抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。具體地，本發明提供特異性結合人硬骨素的人源化抗體和嵌合抗體，並且該人源化抗體和嵌合抗體的特徵在於具有高親和力、高藥效、延長半衰期和高溶解度、穩定性好等特點。本發明的抗體可用於增加骨量、骨礦物質密度和骨強度，並可用於治療人骨代謝相關疾病如骨質疏鬆症等。
Description
本發明涉及特異性結合人硬骨素(SOST)的高親和力抗體及其抗原結合片段，及該抗體作為治療劑，特別是作為用於SOST介導的骨性疾病或病症如骨質疏鬆症的治療用途，該受試者受益於骨量(bone mass)、骨礦物質密度、骨礦物質含量或骨強度中至少一項的提高。
骨質疏鬆症(Osteoporosis，OP)包括絕經後婦女骨質疏鬆症(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)和老年性骨質疏鬆症，是一種以低骨量和骨微結構退化為特徵，造成骨強度下降、骨脆性增加、易於發生骨折的全身性骨代謝障礙性疾病。據統計，全球約有2億人骨質疏鬆，其發病率已躍居常見病、多發病的第七位。我國60歲以上老年女性骨質疏鬆症的患病率高達60%，男性患病率也在40-50%。
除了加強運動、服食鈣片和維生素D、普及骨折預防知識等傳統措施之外，現行的藥物治療主要侷限於減少骨吸收以防止骨折。抗骨吸收類藥物包括有降鈣素、雙磷酸鹽、雌激素替代劑和選擇性雌激素受體調節劑(SERMs)等。
這些以雙磷酸鹽為代表的骨吸收抑制劑儘管能夠阻止進一步的骨質流失，卻無法重建已經流失的骨質，並且在抑制骨吸收的同時，同樣抑制骨生成。激素類藥物更加有著引起靜脈血栓和誘發心血管疾病的風險。更重要的是，真正意義上的骨合成代謝藥不但可以提高骨量，還應該能夠有效改善骨微結構並促進骨生成，而這一點恰恰是目前抗骨吸收類藥物所不具備的。在過去的15年時間裏，各種旨在降低骨折風險的醫療措施經系統化研究進入臨床試驗階段，而實際可選用藥依然十分匱乏。迄今為止，只有甲狀旁腺激素(PTH)類藥物被證明可以刺激骨生成，但是，其諸多缺點也是有目共睹的。譬如，它對於骨再造的作用並不持久、對於骨折修復作用不大、需要每天皮注給藥一年以上，而且只能低劑量給藥、價格昂貴、使用期不得超過兩年以及其暴露的安全性問題遭到美國FDA的黑框警告等等。
硬骨素(Sclerostin)作為新的生物靶點用於藥物開發，其原理是可以藉由調節成骨細胞合成代謝治療骨質疏鬆，該靶點填補藉由調控骨代謝方式治療骨質疏鬆領域空白。
硬骨素是SOST基因表現分泌的糖蛋白，其胺基酸序列的結構特徵在於190個殘基以及帶有半胱胺酸的環狀結構域。已證實其表現主要在骨細胞中進行，而在成骨細胞、軟骨、肝、腎、骨髓、心臟、胰臟等位置只有很低程度的表現。
研究表明，硬骨素藉由結合低密度脂蛋白受體LRP5/6
抑制Wnt信號傳導調控骨生成。目前有幾家公司針對該靶點開發的單株抗體藥物分別已經進入臨床III，II期。這些抗體的適用症均為骨質疏鬆/骨質疏鬆症以及骨損傷/相關骨病治療等。相關的專利有：WO2008133722、WO2010130830、WO2013063095、WO2014006100、WO2014081955、WO2005014650、WO2006119062、WO2008115732。值得一提的是，有研究表明，抗硬骨素抗體與傳統的雙磷酸鹽類藥物治療並不衝突，有聯用的可能。
本發明提供針治療骨質疏鬆等骨病的新靶點開發的新抗體，具有高親和力、高藥效、延長半衰期、可以減少給藥次數的特性，此外，本發明新分子溶解度高、穩定性好，可以讓生產製劑更加容易，從而降低生產成本。
本發明抗體是嵌合單株抗體或人源化單株抗體，其包含本文公開的特異性多肽序列，以高結合親和力和特異性結合人硬骨素並可用於增加哺乳動物，較佳為人中的骨量、骨礦物質密度、骨礦物質含量和骨強度中的至少一項。
本發明提供一種SOST抗體或其抗原結合片段，其包含至少1個CDR區，該CDR區選自以下序列或其突變序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：
抗體重鏈可變區HCDR區：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；和
抗體輕鏈可變區LCDR區：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如下的HCDR區序列或其突變序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如下的LCDR區序列或其突變序列：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含HCDR區序列SEQ ID NO：7(HCDR1)，SEQ ID NO：8(HCDR2)和SEQ ID NO：9(HCDR3)，或其突變序列，和LCDR區序列SEQ ID NO：10(LCDR1)，SEQ ID NO：11(LCDR2)和SEQ ID NO：12(LCDR3)，或其突變序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該CDR區突變序列為CDR區發生1-3個優化抗體活性的胺基酸突變，其中該HCDR2區突變序列較佳為SEQ ID NO：13。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：5或與其具有至少95%序列同一
性的胺基酸序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：6或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：5，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：6。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的鼠源抗體或其片段，其抗體重鏈可變區進一步包含源自鼠源的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的鼠源抗體或其片段，其進一步包含源自鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、或其變體的重鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的鼠源抗體或其片段，其抗體輕鏈可變區進一步包含選自鼠源κ或λ鏈、或其變體的輕鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的鼠源抗體或其片段，其進一步包含選自鼠源κ或λ鏈、或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為嵌合抗體或人源化抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4或其變體的重鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGHV1-18*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區的框架序列或其突變序列，較佳該突變序列為0-10個胺基酸的回復突變。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：14-16所示的重鏈可變區序列或其變體或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於人種系輕鏈IGKV1-39*01和/或IGKV4-1*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區的框架序列或其突變序列，較佳該突變序列為0-10個胺基酸的回復突變。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：17-19所示的輕鏈可變區序列或其變體或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述
的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：14-16的重鏈可變區和選自SEQ ID NO：17-19的輕鏈可變區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體包含選自(a)至(c)任一的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的組合：
(a)SEQ ID NO：14的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：17的輕鏈可變區序列；
(b)SEQ ID NO：15的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：18的輕鏈可變區序列；
(c)SEQ ID NO：16的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：19的輕鏈可變區序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體的重鏈恆定區包含源自人源IgG1或其變體、人源IgG2或其變體、人源IgG3或其變體或人源IgG4或其變體的恆定區，較佳包含人源IgG1或其變體或人源IgG4或其變體的恆定區，更較佳人源IgG4或其變體的恆定區。恆定區也可以做一些如“YTE”之類改變性能的修飾。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：24-26或與其具有至少90%同源性的全長重鏈序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區進一步包含視需要自人源κ或λ鏈或其變體的輕鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其進一步包含選自人源κ或λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：27-29或與其具有至少90%序列同源性的全長輕鏈序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中所述的人源化抗體包含選自SEQ ID NO：24-26的全長重鏈序列和選自SEQ ID NO：27-29的全長輕鏈序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體具有選自以下任一的全長輕鏈序列和全長重鏈序列的組合：
Ab-10：SEQ ID NO：24的重鏈序列和SEQ ID NO：27的輕鏈序列
Ab-9：SEQ ID NO：25的重鏈序列和SEQ ID NO：28的輕鏈序列；或
Ab-5：SEQ ID NO：26的重鏈序列和SEQ ID NO：29的輕鏈序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab、Fv、sFv或F(ab’)2。
本發明進一步提供一種編碼如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段的表現前體產物的DNA序列。
本發明進一步提供一種含有如上所述的DNA序列的表現載體。
本發明進一步提供一種用如上所述的表現載體轉化的宿主細胞。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種如上所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為CHO細胞。
本發明進一步提供一種醫藥組成物，其含有如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
本發明進一步提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段、或包含其的醫藥組成物，在製備用於增強骨量、骨礦物質密度、骨礦物質含量或骨強度中的至少一種的藥物中的用途。
本發明進一步提供一種如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段、或包含其的醫藥組成物，在製備用於治療SOST介導的骨性疾病或病症的藥物中的用途，其中該疾病或病症選自骨質疏鬆症、骨質減少或骨關節炎、類風濕性關節炎、牙周病或多發性骨髓瘤的疾病或障礙；較佳為
骨質疏鬆症。
本發明進一步提供一種治療和預防SOST介導的骨性疾病或病症的方法，該方法包括給予所需患者治療有效量的如上所述的SOST抗體或其抗原結合片段、或包含其的醫藥組成物；其中該疾病或病症選自骨質疏鬆症、骨質減少或骨關節炎、類風濕性關節炎、牙周病或多發性骨髓瘤的疾病或障礙；較佳為骨質疏鬆症。
第1圖顯示本發明人源化抗SOST抗體在食蟹獼猴體內的藥物濃度-時間曲線圖，該結果表明同劑量下，本發明人源化抗體的AUC0-t(mg/ml*day)為22.3，是陽性抗體Romosozumab(9.95)的2倍以上。
第2圖顯示本發明人源化抗SOST抗體對食蟹獼猴的體內腰椎骨密度(BMD)增加百分比。該結果表明本發明人源化抗SOST抗體在食蟹獼猴體內藥效呈劑量依賴性。人源化抗SOST抗體Ab-5藥效10mg/kg和陽性分子30mg/kg相當，即本發明分子猴體內藥效是陽性分子Romosozumab的三倍。
本領域技術人員所熟知的，藥物的給藥劑量依賴於多種因素，包括但並非限定於以下因素：所用具體化合物的活性、患者的年齡、患者的體重、患者的健康狀況、患者的飲食、給藥時間、給藥方式、排泄的速率、藥物的組合等；另外，最佳的治療方式如治療的模式、本發明抗體或
其組合物的日用量或可藥用的鹽的種類可以根據傳統的治療方案來驗證。
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其他技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
術語
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
當在本文中使用時，術語“硬骨素”或“SOST”或“SOST蛋白”或“Sclerostin”指硬骨素(sclerostin or SOST)基因表現產物(蛋白質)，本發明中如非特指，比如鼠SOST(m-SOST)或食蟹獼猴SOST(cyno-SOST)，均指人的SOST(h-SOST)。本發明中所用的人、鼠、食蟹獼猴SOST均藉由GenBank得到核苷酸序列，例如NP_079513.1提供人SOST蛋白質序列。
如本文中所用，意指本發明的抗硬骨素抗體(或簡言之，“本發明抗體”)的術語“抗體”指單株抗體。本發明所述的單株抗體或mAb，指由單一的純系細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純系細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術，或其他現有技術的組合或本領域容易已知的其他技術進行重組得到。
“單朱抗體”或“本發明抗體”或簡單地“抗體”可以是完
整的抗體(包含完整的或全長Fc區)，或包含抗原結合部分的抗體部分或片段，例如嵌合或人源化抗體的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。尤其較佳地本發明抗體的抗原結合片段保留了體內或體外抑制或中和哺乳動物硬骨素的一種或更多種生物活性特徵的能力。例如，在一個實施方案中，本發明抗體的抗原結合部分可以抑制人硬骨素與一個或更多個其配體的相互作用和/或可以抑制人硬骨素的一種或更多種受體介導功能。
此外，如本文所用，“單株抗體”或“本發明抗體”或簡單地“抗體”可以是藉由用接頭序列連接編碼LCVR和HCVR的DNA產生的單鏈Fv片段。(參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag，New York，第269-315頁，1994)。應理解不管是否詳細說明抗原結合片段或部分，如本文所用的術語“抗體”包括這種片段或部分及單鏈形式，除非另有說明，只要蛋白質保留了特異性結合硬骨素的能力，其就包括在術語“抗體”內。
本發明中術語“抗硬骨素抗體”、“特異性結合人硬骨素的抗體”、“抗SOST抗體”、“抗SOST”、“SOST抗體”或“結合SOST的抗體”是指這樣的抗體，所述抗體能夠以足夠的親合力結合SOST抗體以致所述抗體可以用作靶向SOST中的診斷劑和/或治療劑。
如本文所用，術語“特異性結合”指如藉由本領域可用的技術，例如競爭ELISA、BIACORE®測定或KINEXA®測
定所測定的。該術語還適用於當例如本發明抗體的抗原結合結構域對許多抗原攜帶的特定表位特異的情況，在該情況下攜帶抗原結合結構域的抗體能夠特異性結合攜帶該表位的多種抗原。術語“表位”指在一個或更多個抗體的抗原結合區中能夠被抗體識別並結合的分子部分。
對於本發明抗體，短語“生物活性”包括，但不限於表位或抗原結合親和力、在體內或體外中和或拮抗硬骨素生物活性的能力、在硬骨素抗體體外結合人硬骨素和阻斷人硬骨素和LRP-6結合實驗(例如，本文測試例1，2中所述)或其他體外活性測定中的IC50、抗體的體內和/或體外穩定性。使用本領域認可的技術，包括但不限於ELISA、競爭性ELISA、表面等離振子共振分析、不受限的體外和體內中和測定、受體結合及來自不同來源(包括人、靈長類)或根據需要的任何其他來源的組織切片的免疫組織化學觀察或測定上述性質或特性。
對於硬骨素，短語“生物活性”包括，但不限於硬骨素對另一蛋白質(例如受體或TGF-β家族成員)的特異性結合、人硬骨素的一種或更多種受體介導的功能、信號轉導、免疫原性、體內或體外穩定性、在體內或體外影響另一蛋白質的水準或活性(參見例如測試例1-5)、硬骨素表現水準和組織分佈。
如本文所用，對本發明抗體的生物活性所用的術語“抑制”或“中和”指基本上拮抗、阻止、妨礙、抑制、減緩、中斷、消除、中止、減少或顛倒硬骨素生物活性的能力(例如，
本文測試例2中所測定)。
如此處所用，術語“Kabat編號”是本領域所公認的並指對胺基酸殘基進行編號的系統，所述胺基酸殘基比抗體重鏈區和輕鏈區中的其他胺基酸殘基更易變(即，高變的)(Kabat，等，Ann.NY，Acad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat，等，Sequences，of，Proteins，of，Immunological，Interest，第五版，U.S.Department，of，Health，and，Human，Services，NIH，Publication，No.91-3242(1991))。抗體可變區中的CDR位置遵循Kabat編號或簡單地“Kabat”。
此處互換使用的術語“受試者”和“患者”指哺乳動物，較佳為人。在某一實施方案中，受試者進一步特徵在於其患有將從硬骨素水準降低或硬骨素生物活性降低中受益的疾病或障礙或病症。
術語“載體”指能夠轉運另一核酸的核酸分子，該核酸分子與該另一核酸已經有效連接，該術語包括，但不限於質粒和病毒載體。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中進行自主複製，而其他載體可以在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，並由此隨宿主基因組一起進行複製。此外，某些載體能夠指導有效連接至其的基因的表現。此處將這種載體稱作“重組表現載體”(或簡單地“表現載體”)。示例性載體為本領域所熟知。
如此處所用，表述“細胞”、“宿主細胞”和“細胞培養物”可互換使用，並包括各種細胞或細胞培養物，其為本發明任何分離的多核苷酸或包含編碼本發明HCVR或LCVR或
抗體的核苷酸序列的任何重組載體的受體。宿主細胞包括用一個或更多個重組載體或表現本發明單株抗體或其輕鏈或重鏈的多核苷酸轉化、轉導或感染的細胞。
全長抗體的各重鏈包含N端重鏈可變區(此處為“HCVR”)和重鏈恆定區。全長抗體的各輕鏈包含N端輕鏈可變區(此處為“LCVR”)和輕鏈恆定區。可將HCVR和LCVR區進一步再分成高變區，稱為互補決定區(“CDR”)，其中散佈著稱為框架區(“FR”)的更保守區。抗體結合特定抗原或表位的功能性能力很大程度上受抗體可變區中存在的六個CDR的影響。各HCVR和LCVR包含三個CDR(HCVR中的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCVR中的LCDR1、LCDR2和LCDR3)和四個FR，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR含有與抗原形成特異性相互作用的大多數殘基。可變區內的CDR排位遵循Kabat。
輕鏈分類為κ或λ，並且由本領域已知的特定恆定區表徵。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，並將抗體同種型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，並且這些中的幾個還可以進一步分成亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。各重鏈類型的特徵在於具有本領域早已知序列的特定恆定區。輕鏈恆定區κ和重鏈恆定區IgG1、IgG2、IgG3、IgG4是本發明抗體中的較佳恆定區。嵌合抗體可具有非人類來源，較佳為大鼠或鼠類來源的恆定區。
如此處所用，“抗原結合區”或“抗原結合部分”指抗體
分子可變區內的一部分，其含有與抗原相互作用並賦予抗體對抗原的特異性和親和力的胺基酸殘基。該抗體部分包括維持抗原結合殘基正確構象所必需的框架胺基酸殘基。
本發明的較佳抗體包含具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12胺基酸序列的六個CDR。本發明更佳的抗體包含具有SEQ ID NO：19、27、28、32、36和40胺基酸序列的六個CDR。更佳地，本發明抗體中優化的CDR當與親本抗體中存在的CDR相比時，包含至少一個胺基酸置換，包含具有SEQ ID NO：7、13、9、10、11和12胺基酸序列的六個CDR。這些較佳抗體的CDR存在於下文表1中說明的位置。CDR根據Kabat位於可變區中。
本發明較佳抗體包含具有SEQ ID NO：14、15和16胺基酸序列的HCVR。本發明其他較佳的單株抗體包含具有SEQ ID NO：17、18和19胺基酸序列的LCVR。更佳地，本發明的抗體包含SEQ ID NO：14的HCVR和SEQ ID NO：17的LCVR。本發明的可選抗體包含SEQ ID NO：15的HCVR和SEQ ID NO：18的LCVR。本發明更佳的抗體包含SEQ ID NO：16的HCVR和SEQ ID NO：19的LCVR。本發明抗體的HCVR較佳連接重鏈恆定區，該重鏈恆定區較佳為人來源的，較佳為IgG1或IgG4的重鏈恆定區，更佳為IgG4的重鏈恆定區。這種LCVR較佳連接輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區較佳為人來源的，較佳為κ鏈的。
本發明的一個較佳抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：24的重鏈多肽和具有胺基酸序列SEQ ID NO：27的
輕鏈多肽。
本發明的另一較佳抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：25的重鏈多肽和具有胺基酸序列SEQ ID NO：28的輕鏈多肽。
本發明的另一較佳抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：26的重鏈多肽和具有胺基酸序列SEQ ID NO：29的輕鏈多肽。
在下文表1中列出了它們序列的SEQ ID NO。
較佳地，本發明的抗體進一步特徵在於在對人硬骨素具有低於約10nM、3nM、1nM或0.3nM，更較佳低於約0.1nM的KD值。此外，較佳的是這種抗體進一步受限於對食蟹獼猴硬骨素具有低於約10nM、3nM、1nM或0.3nM，或更佳低於約0.1nM的KD值。
較佳地，本發明的抗體進一步特徵在於在使用人硬骨素和LRP-6結合阻斷實驗(參見，例如此處的測試例2)中具有低於100nM或更低，約50或30nM或更低，更佳約25nM，甚至更佳約20nM或更低的IC50(例如17.9nM)。
更佳地，本發明的抗體進一步特徵在於對人硬骨素具
有低於約10nM、3nM、1nM或0.3nM的KD值，更佳低於約0.1nM的KD值，並且進一步特徵還在於在使用人硬骨素和LRP-6結合阻斷實驗中具有低於100nM或更低，約50或30nM或更低，更佳約25nM，甚至更佳約20nM或更低的IC50(例如17.9nM)，在所述抗體中所有六個CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重鏈、全部輕鏈，或全部重鏈和全部輕鏈受如此處SEQ ID NO所示的特定序列的限制。
甚至更佳地，本發明的抗體進一步特徵在於對人硬骨素具有低於約10nM、3nM、1nM或0.3nM的KD值，更佳低於約0.1nM的KD值，並且進一步特徵還在於在使用人硬骨素和LRP-6結合阻斷實驗中具有低於100nM或更低，約50或30nM或更低，更佳約25nM，甚至更佳約20nM或更低的IC50(例如17.9nM)；並且進一步特徵還在於在使用食蟹獼猴硬骨素的硬骨素抗體體外ELISA結合實驗中還具有低於約10nM、3nM、1nM或0.3nM，或更佳低於約0.1nM的KD值，在所述抗體中所有六個CDR、HCVR、LCVR、HCVR和LCVR、全部重鏈、全部輕鏈，或全部重鏈和全部輕鏈受如此處SEQ ID NO所示的特定序列的限制。
抗體表現
本發明也涉及表現本發明抗硬骨素抗體的宿主細胞。可使用本領域已知的標準技術來完成產生本發明抗體的宿主細胞系的建系及分離。
本領域已知的多種宿主表現系統可用於表現本發明的抗體，其包括原核(細菌)和真核表現系統(如酵母、杆狀病毒、植物、哺乳動物和其他動物細胞、轉基因動物和雜交瘤細胞)，以及噬菌體展示表現系統。
可藉由在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因來製備本發明的抗體。為了重組表現抗體，用一個或更多個攜帶編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈的DNA片段的重組表現載體轉化、轉導或感染宿主細胞，使得輕鏈和/或重鏈在宿主細胞中表現。重鏈和輕鏈可從在一個載體中與其有效連接的不同啟動子單獨表現，或者，重鏈和輕鏈可從在兩個載體(一個表現重鏈，一個表現輕鏈)中與其有效連接的不同啟動子單獨表現。視需要地，重鏈和輕鏈可在不同的宿主細胞中進行表現。
此外，重組表現載體可編碼信號肽，其促進抗硬骨素抗體輕鏈和/或重鏈從宿主細胞中的分泌。可將抗硬骨素抗體輕鏈和/或重鏈基因選殖至載體中，使得信號肽在框內有效連接到抗體鏈基因的胺基端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽。較佳地，重組抗體分泌到培養宿主細胞的培養基中，從所述培養基中可以回收或純化抗體。
藉由將編碼HCVR的DNA有效連接到編碼重鏈恆定區的另一DNA分子上，可以將編碼HCVR區的分離DNA轉化成全長重鏈基因。人以及其他哺乳動物重鏈恆定區基因的序列為本領域所知。例如可藉由標準的PCR擴增獲得包括這些區域的DNA片段。重鏈恆定區可以是任何類型
(例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、任何種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或亞類恆定區及如Kabat(上文)中描述的其任何同種型變體。較佳的重鏈恆定區包含IgG1或其變體或IgG4或其變體的恆定區。
藉由將編碼LCVR的DNA有效連接到編碼輕鏈恆定區的另一DNA分子上，可以將編碼LCVR區的分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人以及其他哺乳動物輕鏈恆定區基因的序列為本領域所知。例如可藉由標準的PCR擴增獲得包括這些區域的DNA片段。輕鏈恆定區可以是κ或λ恆定區。
用於本發明的較佳哺乳動物宿主細胞是CHO細胞(例如，ATCCCRL-9096)、HEK 293E細胞(例如，ATCC CRL-1573)、NS0細胞、SP2/0細胞和COS細胞(ATCC例如，CRL-1650、CRL-1651)。用於本發明的其他宿主細胞包括其他哺乳動物細胞、酵母細胞和原核細胞。當編碼抗體基因的重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以允許抗體在宿主細胞中表現的時間，或更佳地允許抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中的時間來產生抗體。可以使用標準的純化方法從宿主細胞和/或培養基中回收抗體。
所表現產物可以根據本領域的標準方法，包括硫酸銨沉澱、離子交換、親和、反相、疏水性相互作用柱層析、凝膠電泳等來純化本發明的完整抗體、各輕鏈和重鏈或其他免疫球蛋白形式。較佳至少約90%、92%、94%或96%同
質性的基本純的免疫球蛋白，並最佳98到99%或更高同質性的免疫球蛋白用於藥物用途。一旦部分純化或純化至如期望的同質性，無菌抗體然後就可以在藥學上使用，如此處所述。
人源化抗體
較佳地，待用於治療目的的本發明抗體具有來自哺乳動物的框架區和恆定區(在一定程度上其存在於抗體中)序列，在所述哺乳動物中其用作治療劑，以減少哺乳動物針對治療性抗體誘發免疫反應的可能性。人源化抗體特別重要，因為它們對治療應用有價值並降低人抗小鼠抗體反應的可能性，當對人受試者施用時用鼠類來源抗體或包含鼠類來源部分的抗體時經常觀察到該人抗小鼠抗體反應。較佳注射的人源化抗體比例如鼠類抗體具有更像天然發生的人抗體的半衰期，由此允許待對受試者施用的劑量更少並更不頻繁。
如此處所用，術語“人源化抗體”指其中至少一部分為人來源的抗體。例如，人源化抗體可包含來自非人來源(如小鼠)抗體的部分和來自人來源抗體的部分，兩者例如藉由常規技術(例如合成)化學連接在一起或使用遺傳工程技術製備成毗連多肽。
較佳地，“人源化抗體”具有起源於或來自親本抗體(即非人抗體，較佳為小鼠單株抗體)的CDR，而在其存在的程度上框架區和恆定區(或其主要部分或基本部分，即至少約90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)由核酸序
列資訊編碼，所述核酸序列資訊出現在人類種系免疫球蛋白區(參見，例如the，International，ImMunoGeneTics，Database)或其重組或突變形式中，無論所述抗體是否在人類細胞中產生。較佳地，從人源化抗體的非人親本抗體來源的CDR優化人源化抗體的至少2、3、4、5或6個CDR，以產生期望的性質，例如改善的特異性、親和力或中和作用，其可以藉由篩選測定，例如ELISA測定來進行鑒定。較佳地，本發明抗體中優化的CDR當與親本抗體中存在的CDR相比時，包含至少一個胺基酸置換。與親本抗體的CDRs相比，本發明人源化抗體的CDR中某些胺基酸置換(參見本文的實施例4)降低了抗體不穩定性的可能性(例如除去CDR中Asn殘基)或當對人受試者施用時降低了抗體的免疫原性(例如，由IMMUNOFILTERTM，Technology預測的)。
人源化抗體較佳含有來自非人抗體的最小序列。人源化抗體可包含既不在受體抗體中發現的殘基，也不在從親本抗體輸入的CDR或框架序列中發現的殘基。可使用本領域常規使用的方法使人源化抗體進行體外誘變，並因此，人源化重組抗體HCVR和LCVR區的框架區胺基酸序列是這樣的序列，其當來自與人類種系HCVR和LCVR序列相關的那些序列時，可以不天然存在於體內人抗體種系所有組成成分中。預期人源化重組抗體HCVR和LCVR框架區的這種胺基酸序列與人類種系序列至少90%、92%、94%、95%、96%、98%或更佳至少99%或最佳100%相同。
在較佳實施方案中，本發明的人源化抗體包含人類種系重鏈框架序列和人類種系輕鏈框架序列。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列資料庫(在網際網路www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本發明一個較佳的實施方案中，該SOST人源化抗體小鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：7,8,9,10,11和12。人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中該抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於人種系輕鏈IGKV1-39*01和IGKV4-1*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區；其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGHV1-18*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區。
本領域中有可獲得的多種方法來產生人源化抗體。例如，可藉由獲得編碼特異性結合硬骨素，較佳為人硬骨素的親本抗體(例如，鼠類抗體或由雜交瘤產生的抗體)HCVR和LCVR的核酸序列、在該HCVR和LCVR(非人類)中鑒定CDR並將此類CDR編碼核酸序列移植到所選的人框架編碼核酸序列上來產生人源化抗體。視需要地，可藉由隨機誘變或在特定位置誘變來優化CDR區，以在將CDR區移植到框架區中之前用不同的胺基酸置換CDR中的一個或更多個胺基酸。或者，可使用本領域技術人員可獲得的
方法在將CDR區插入人框架區後對其進行優化。
在CDR編碼序列移植到所選人框架編碼序列上之後，然後表現編碼人源化可變重鏈和可變輕鏈序列的所得DNA序列，以產生結合硬骨素的人源化抗體。可將人源化HCVR和LCVR表現為整個抗硬骨素抗體分子的部分，即表現為與人恆定域序列的融合蛋白。然而，HCVR和LCVR序列也可在不存在恆定序列的情況下進行表現，以產生人源化抗硬骨素Fv。
進一步描述參與人源化可使用小鼠抗體的方法的文獻包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
治療用途
當對需要其的人類受試者施用有效量時，包含本發明抗硬骨素單株抗體的醫藥組成物可用於提高椎骨(vertebral，bone)或無椎骨(non-vertebral，bone)或兩者中骨量、骨礦物質密度、骨礦物質含量或骨強度中的至少一種。當對需要其的人類受試者施用有效量時，包含本發明抗硬骨素單株抗體的醫藥組成物可用於降低椎骨和/或無椎骨骨折的發生率。降低骨折發生率包括相對於未處理對照人群，降低人類受試者骨折的可能性或實際發生率。
此外，本發明抗體可用於治療病症、疾病或障礙，其中硬骨素的存在引起或促進不期望的病理學效應，或者硬
骨素水準或硬骨素生物活性的降低在人類受試者中具有治療益處。這種病症、疾病或障礙包括，但不限於骨質疏鬆症、骨質減少、骨關節炎、與骨關節炎相關的疼痛、牙周病或多發性骨髓瘤。受試者可以是男性或女性。較佳地，人類受試者處於椎骨和/或無椎骨骨折的風險中，更佳地人類受試者處於骨質疏鬆的風險中或患有骨質疏鬆症。人類受試者較佳為女性，並更佳為處於閉經後骨質疏鬆風險或患有閉經後骨質疏鬆的女性。預期本發明的方法可對骨質疏鬆症任何階段的受試者有益。
此外，預期了本發明抗體在製備用於治療至少一種上述障礙的藥物中的用途。
術語“治療(treatment)”和“治療(treating)”旨在指其中減緩、中斷、阻止、控制或中止此處所述障礙進程的所有過程，但並不必定表示所有障礙症狀的全部消除。如此處所用，“治療”包括施用本發明化合物用於在哺乳動物，較佳在人中治療疾病或病症，並包括：(a)抑制疾病的進一步進展，即阻止其發展；和(b)減輕疾病，即引起疾病或障礙的減退或減緩其症狀或併發症。可調整給藥方案，以提供最佳的預期反應(例如，治療反應)。例如，可以快速濃注施用，可以隨時間過去施用若干單獨劑量或根據治療情況的緊急程度所示按比例減少或增加劑量。
醫藥組成物
本發明抗體可摻入適合於對人類受試者施用的醫藥組成物中。可單獨或與可藥用載體和/或稀釋劑以單劑量或多
劑量對人類受試者施用本發明抗體。設計這種醫藥組成物，以適合於所選的施用方式，並且使用適當的可藥用稀釋劑、載體和/或賦形劑，如分散劑、緩衝液、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩定劑等。可根據在例如提供執業醫生通常已知的配方技術綱要的Remington，The，Science，and，Practice，of，Pharmacy，第19版，Gennaro編輯，Mack，Publishing，Co.，Easton，PA，1995中公開的常規技術來設計這種組合物。用於醫藥組成物的合適載體包括任何材料，當其與本發明單株抗體組合時保留了分子活性並不與受試者免疫系統反應。
使用標準施用技術，對受試者施用包含本發明抗硬骨素單株抗體的醫藥組成物，所述受試者處於如此處描述的病理學或顯示病理學，例如骨質疏鬆症、骨關節炎或其他骨退化障礙。
本發明的醫藥組成物較佳含有“有效量”的本發明抗體。有效量指達到期望治療結果所必需(對劑量、時間段和施用方式而言)的量。有效量的抗體可根據如疾病狀態、年齡、性別和個體體重及抗體或抗體部分在個體中誘發期望反應的能力這些因素而變化。有效量也是其中抗體的治療有益作用勝於其任何毒性或有害作用的量。
有效量是向受試者傳遞治療益處所必需的活性劑的至少最小劑量，但比中毒劑量少。用另一種方式敍述，本發明抗體的有效量或治療有效量是這樣的量，其在哺乳動物，較佳人中，(i)增加至少一種骨量、骨礦物質密度、骨礦物
質含量或骨強度，或(ii)治療病症、障礙或疾病，其中硬骨素的存在引起或促進不期望的病理學效應，或(iii)硬骨素水準或硬骨素生物活性的降低導致哺乳動物，較佳為人中有益的治療效果，該病症、障礙或疾病包括但不限於骨質疏鬆症、骨質減少、骨關節炎、類風濕性關節炎、牙周病或多發性骨髓瘤。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制本發明的範圍。
本發明實施例或測試例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例
實施例1：SOST選殖和表現
編碼帶His標籤的人硬骨素(His-h-SOST)序列、編碼帶Flag標籤的人硬骨素(h-SOST-Flag)序列、帶Flag標籤的小鼠硬骨素(m-SOST-Flag)序列和帶Flag標籤的食蟹獼猴硬骨素(cyno-SOST-Flag)序列由CRO公司上海旭冠生物科技發展有限公司合成(以上硬骨素重組蛋白均由本發明設計模版序列)，分別選殖到pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)。重組的SOST蛋白在293T細胞表現後，藉由實施例2進行純化。純化的蛋白可用於下述各實施例
實驗中。
His-h-SOST的DNA序列
h-SOST-Flag的DNA序列：
m-SOST-Flag的DNA序列：
cyno-SOST-Flag的DNA序列：
實施例2：SOST重組蛋白純化
1、帶His標籤的SOST重組蛋白的純化步驟：
將細胞表現上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液換置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳柱，沖洗2-5倍柱體積。將置換後的上清樣品上柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗柱子，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。
收集的沖提液用離子交換(SP柱)進一步純化。配置A液：0.01M PB，pH8.0。配置B液：A液+1M NaCl。先將咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白置換到A液，並使用A液平衡SP柱，上樣，B液濃度梯度0-100%，10倍柱體積沖提，收集各沖提峰。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑒定為正確後分裝備用。得到帶His標籤的人硬骨素(His-h-SOST)。
2、帶Flag標籤的SOST重組蛋白的純化步驟：
將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。使用0.5×PBS平衡flag親和柱，沖洗2-5倍柱體積。將除雜後
的細胞表現上清樣品上柱。用0.5×PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用含有0.3M NaCl的PBS沖洗柱子，沖洗雜蛋白，並收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)沖提目的蛋白，並收集，調節pH至中性。收集樣品經電泳，肽圖，LC-MS鑒定正確後分裝備用。
得到帶Flag標籤的人硬骨素(h-SOST-Flag)，帶Flag標籤的小鼠硬骨素(m-SOST-Flag)和帶Flag標籤的食蟹獼猴硬骨素(cyno-SOST-Flag)，用於本發明抗體的性能測試。
實施例3：抗人SOST單株抗體產生
抗人SOST單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1周，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠分成2組(A/B)，每組10隻。
免疫抗原為帶His標籤的人SOST重組蛋白(His-h-SOST)。A組用弗氏佐劑(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐劑(CFA)，其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑(IFA)。抗原與佐劑比例為1：1，200μl/200μg/隻(首免)，200μl/100μg/隻(加強免疫)。B組用Titermax(sigma Lot Num：T2684)與Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原與佐劑(titermax)比例為1：1，抗原與佐劑(Alum)比例為3：1，200μl/200μg/隻(首免)，200μl/100μg/隻(加強免疫)。抗原乳化後進行接種，時間為第0、14、28、42、
56天。
第0天A/B組腹膜內(IP)注射50μg/隻的乳化後抗原。第14天皮下(sc)多點(一般背部6-8點)注射25μg/隻。第28，42天根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射200μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。
於第22，36，50，64天進行血檢，用測試例1的ELISA方法檢測小鼠血清和人硬骨素的結合活性，結果見表2。在第4次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合，採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287TM)進行融合得到雜交瘤細胞。並藉由測試例2檢測小鼠血清中抗SOST抗體阻斷人SOST和人LRP-6結合的活性，選出體外活性好的單株雜交瘤細胞株Ab-1，其活性檢測結果見表2。
實施例4：鼠源抗人硬骨素抗體的人源化
挑選出體外活性好的單株雜交瘤細胞株Ab-1，選殖其中的單株抗體序列，再進行人源化，重組表現和活性評價。
從雜交瘤中選殖序列過程如下。收集對數生長期雜交瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA(按照試劑盒說明書步驟)，反轉錄(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara,cat # 2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。得到的DNA序列對應的胺基酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示：
雜交瘤細胞獲得重鏈可變區：
雜交瘤細胞獲得輕鏈可變區：
鼠源抗人硬骨素單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，進行人源化。本發明選擇活性好的候選分子進行人源化，結果如下。
1、鼠源抗硬骨素抗體的CDR區
VH/VLCDR的胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。
本發明中鼠源Ab-1的CDR序列如表3所述：
2、選擇人種系FR區序列
在所獲得的鼠源抗體VH/VLCDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與抗體Germline資料庫比較，獲得同源性高的人種系範本。其中人類種系輕鏈框架區來自人κ輕鏈基因，本發明抗體較佳為人種系輕鏈模版IGKV1-39*01或IGKV4-1*01。人類種系重鏈框架區來自人重鏈，本發明抗體較佳為人種系重鏈模版IGHV1-18*01。將鼠源抗體Ab-1的CDR區移植到選擇的人源化範本上，替換人源化可變區，再與IgG恆定區重組。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化(對重鏈CDR2進行優化，得到新的重鏈CDR2序列：DIDPNDGDILYNQKFRD，SEQ ID NO：13)，得到最終的人
源化分子。其重鏈可變區序列如SEQ ID NO：14-16所示，可與視需要自SEQ ID NO：20-22所示的重鏈恆定區序列組合；輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：17-19所示，分別與如SEQ ID NO：23所示的輕鏈恆定區序列組合。
1、重鏈可變區：
Ab-5的重鏈可變區：
Ab-9的重鏈可變區：
Ab-10的重鏈可變區：
2、各抗體的重鏈恆定區視需要自以下序列：
人IgG4的重鏈恆定區(缺K)：
人IgG4的重鏈恆定區：
人IgG2的重鏈恆定區：
3、輕鏈可變區：
Ab-5的輕鏈可變區：
Ab-9的輕鏈可變區：
Ab-10的輕鏈可變區：
4、輕鏈恆定區，來自人源κ鏈：
用基因選殖、重組表現的方法分別選殖、表現、純化
上述抗體，經結合ELISA(測試例1和測試例3)、抗原受體結合阻斷實驗(測試例2)、Biacore(測試例4)、細胞活性檢測(測試例5)等，最終選出活性保持最好的人源化抗體Ab-5，Ab-9，Ab-10，序列如下：
Ab-10人源化抗體：
重鏈：
輕鏈：
Ab-9人源化抗體：
重鏈：
輕鏈：
Ab-5人源化抗體：
重鏈：
輕鏈：
本發明人源化抗人SOST抗體和人硬骨素(h-SOST-Flag)的ELISA結合活性資料見表4。
測試例：
體外活性生物學評價
測試例1：ELISA結合實驗
硬骨素抗體藉由與硬骨素結合來阻斷硬骨素與細胞膜上的硬骨素相關受體結合，從而阻斷硬骨素下游信號通路。ELISA實驗被用來檢測硬骨素抗體的結合特性。用生物素標記試劑盒(東仁化學，LK03)標記的帶flag標籤的硬骨素(h-SOST-FLAG，SEQ ID NO：2編碼)藉由與包被在酶標板中的鏈黴親和素結合，從而固定到96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷待測抗體和人硬骨素的結合活性。
用pH7.4的PBS(Sigma,P4417-100TAB)緩衝液將鏈黴親和素(Sigma,S4762-5MG)稀釋至5μg/ml濃度，以50μg/孔的體積加入96孔酶標板(Corning,CLS3590-100EA)中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)後進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4PBS含0.05%tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4PBS含1%BSA)稀釋至0.5μg/ml的生物素標記的SOST-FLAG蛋白(R&DSYSTEM,1505-LR-025)，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板6次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板6次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二次抗體(Jackson Immuno Research,115-035-003)或羊抗人二次抗體(Jackson Immuno
Research,109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板6次後，加入50μl/孔TMB顯色底物(KPL,52-00-03)，於室溫孵育10-15min，加入50μl/孔1MH2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算本發明硬骨素抗體對人硬骨素的結合EC50值，結果見表4。
結果表明本發明人源化抗人SOST抗體保留了人源化之前的結合活性。
測試例2：抗SOST抗體阻斷硬骨素和LRP-6結合實驗
硬骨素可與細胞表面wnt/β-catenin信號通路的共受體LRP5/LRP-6結合來抑制通路活性，從而導致骨形成受阻。本實驗中，藉由體外阻斷實驗，檢測所篩選出來的抗人SOST抗體阻斷人SOST/猴SOST和人LRP-6結合的活性。陽性對照為Romosozumab(參考文獻WHO Drug Information,Vol.25,No.4,2011，413-465，P434製備)。
具體方法是將羊抗人Fc的抗體包被到96孔板後，加
入人LRP-6-Fc融合蛋白進行孵育。隨後將生物素化的硬骨素蛋白和抗硬骨素蛋白的抗體共孵育後加入96孔板中進行孵育。洗板後，檢測生物素化的硬骨素與LRP-6的結合量，計算硬骨素抗體對硬骨素活性位點阻斷的IC50值。
用pH 7.4的PBS(Sigma,P4417-100TAB)緩衝液將羊抗人Fc抗體稀釋為1μg/ml，以每孔100μl體積加入到96孔酶標板中，於37℃孵育2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育2.5小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50ul用樣品稀釋液(pH 7.4 PBS含1% BSA)稀釋至1μg/ml的LRP-6-Fc融合蛋白(R&D SYSTEM,1505-LRP-025)，置37℃孵育2小時。然後同時在稀釋板中以30μl/孔的體積加入濃度為1.12μg/ml的用生物素標記試劑盒(東仁化學，LK03)標記的人硬骨素蛋白(R&D SYSTEM,1406-ST/CF)，及30μl/孔稀釋至合適濃度的待測硬骨素抗體，混勻後置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液。用PBST洗板6次後，將稀釋板中的抗原抗體混合液加入酶標板中，於4℃放置過夜(16-18小時)。將板中液體丟棄，用PBST洗板6次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液以1：600濃度稀釋的Streptavidin-Peroxidase Polymer(Sigma,S2438-250UG)於37℃孵育1小時。用PBST洗板6次後，加入50μl/孔TMB顯色底物(KPL,52-00-03)，於室溫孵育3-10min，加入50μl/孔1MH2SO4終止反應，用
NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算硬骨素抗體對人硬骨素與LRP-6結合阻斷的IC50值，結果見表5。
以上方法可用於檢測本發明硬骨素抗體對猴硬骨素(由SEQ ID NO：4編碼表現純化所得)與LRP-6結合阻斷的IC50值，結果見表5。
注：N/A表示未測。
結果表明，本發明人源化抗人SOST抗體對人/猴硬骨素與LRP-6結合的阻斷活性與陽性抗體Romosozumab相當。
測試例3：Biacore測定
用Biacore，GE儀器測定待測人源化抗SOST抗體和人、猴和鼠SOST親和力。
按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中的方法，將人抗捕獲抗體共價偶聯於Biacore儀器(Biacore X100，GE)的生物傳感晶片CM5(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲一定量的待測抗體。然後於晶片表面流經一系列濃度梯度下的SOST抗原：人源SOST，
R&D SYSTEM，Cat.# 1406-ST-025/CF，R&D；猴SOST，cyno-SOST-Flag，由實施例1的SEQ ID NO：4編碼純化而得；鼠源SOST，m-SOST-Flag，由實施例1的SEQ ID NO：3編碼純化而得。利用Biacore儀器(Biacore X100，GE)即時檢測反應信號，從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裏配置的再生溶液，將生物晶片洗淨再生。實驗中用到的胺基偶聯試劑盒購自GE公司(Cat.# BR-1000-50，GE)，緩衝液為HBS-EP+10×緩衝溶液(Cat.# BR-1006-69，GE)，用D.I.Water稀釋至1×(pH 7.4)。
實驗得到的資料用BIAevaluation version 4.1，GE軟體以(1：1)Langmuir模型進行擬合，得出親和力數值，結果見表6。
注：no表示未檢測到親和力。
本發明人源化抗體Ab-5與SOST和人，猴SOST的親和力很高，與陽性分子相比，是陽性分子10倍以上。
測試例4：抗硬骨素抗體對細胞作用的活性實驗
本實驗藉由檢測細胞中鹼性磷酸酶(alkaline
phosphatase，ALP)的活性，根據EC50大小評價本發明SOST抗體作用於細胞的體外活性。
C2C12細胞(中科院細胞庫，Catalog # GNM26)培養在含10%FBS的DMEM培養基中，一週繼代2~3次，繼代比例1：5或1：10。繼代時，吸掉培養基，用5ml 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入100μL的細胞懸液，密度為5×104細胞/ml，培養基為10%FBS的DMEM，96孔板週邊只加入100μl 10%FBS的DMEM培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO2)。細胞貼壁後，去掉培養基，每孔加入70μl 10%FBS的DMEM培養基。每孔分別加入10μl終濃度為100ng/ml的wnt3a(R&D,Catalog #5036-WN-010)，和終濃度為5μg/ml SOST(R&D，Catalog # 1406-ST-025)。將待測樣品用PBS稀釋成不同濃度梯度，向培養板中加入10μl配置的不同濃度的待測樣品。將培養板在培養箱孵育3天(37℃，5% CO2)。去掉培養基，每孔加入150μl ALP底物溶液，將培養板在培養箱內孵育2小時。用酶標儀(PerkinElmer，Catalog # VICTOR3)測定在405nm處的吸光度。計算得EC50值見表7。
結果表明，本發明人源化SOST抗體Ab-5作用於細胞的活性與陽性抗體Romosozumab相當。
藥物代謝動力學評價
測試例5：人源化SOST抗體食蟹獼猴T1/2評價
實驗用食蟹獼猴，雌性，3隻，4-5歲，4公斤以下。購自廣西桂東靈長類養殖開發有限公司。飼養環境：普通區房間。食蟹獼猴購進後，每籠1隻猴，無限量獲取飼料和水。實驗室環境適應性飼養不小於14天，12/12小時光/暗週期調節，溫度23-29℃；相對濕度40-70%。實驗開始前一天，對3隻食蟹獼猴進行編號。實驗當天，每隻食蟹獼猴分別皮下注射受試藥物或陽性分子(30mg/kg)，皮下注射8ml/隻/次。
將猴子固定在猴椅上，藉由肘前靜脈或隱靜脈採血成血清(每次約1.5mL血)，-20度保存。取血時間點為：第1天給藥前12h，第1天給藥後1h,2h,4h,8h,12h,24h(第2天)，第3天，第5天，第7天，第14天，第21天，第28天；等收集完血液樣本後，用ELISA檢測血清中的血藥濃度，進行PK分析，結果見表8。
結果表明，本發明人源化候選分子食蟹獼猴體內半衰
期長，約為陽性分子Romosozumab的2倍(Ab-5)。
體內活性生物學評價
測試例6：人源化抗SOST抗體食蟹獼猴體內藥效評價
實驗用食蟹獼猴，雌性，3隻，4-5歲，4公斤以下。購自廣西桂東靈長類養殖開發有限公司。飼養環境：普通區房間。食蟹獼猴購進後，每籠1隻猴，無限量獲取飼料和水。實驗室環境適應性飼養不小於14天，12/12小時光/暗週期調節，溫度23-29℃；相對濕度40-70%。實驗開始前一天，對3隻食蟹獼猴進行編號，然後經麻醉進行採血取血清及血漿並作腰椎和橈骨遠端骨礦密度、骨礦物質含量測試，所得值用作基數。每隻食蟹獼猴分別皮下注射受試藥物(10,30,60mg/kg不同劑量)和陽性分子(30mg/kg)，皮下注射8ml/隻/次。每月1次，給藥2次。實驗期間，給藥後的第四和第八週動物經麻醉後再各做腰椎和橈骨遠端骨礦密度、骨礦物質含量測試。
實驗期兩個月後將所有動物麻醉後安樂死(以過劑量戊巴比妥鈉)。之後，取第二到第五腰椎及橈骨遠端做體外骨礦密度和骨礦物質含量的測試。實驗結果見表9、第1圖和第2圖。
結果表明，本發明人源化抗SOST抗體在食蟹獼猴體內藥效呈劑量依賴性。人源化抗SOST抗體Ab-5藥效10mg/kg和陽性分子30mg/kg相當(第2圖)，即本發明分子猴體內藥效是陽性分子Romosozumab的三倍。同劑量下人源化抗體的AUC0-t(mg/ml*day)為22.3，是陽性抗體Romosozumab(9.95)的2倍以上(見第1圖)。
溶解度測試
測試例7：人源化抗SOST抗體的溶解度
為了檢測本發明人源化抗SOST抗體的溶解度，取本發明抗體Ab-5與陽性抗體Romosozumab在逐漸升高的濃度梯度下，檢測可溶解的抗體單體、沉澱、聚體含量。此測定中，起始抗體為10mg/ml，溶解在pH7.4的PBS緩衝液中。用超濾濃縮管內(Millipore，Amicon Ultra-15 50K)4度4000rpm離心，期間每隔5-10分鐘終止離心並取樣檢測抗體濃度，直至抗體濃度達到30mg/ml，和90mg/ml。分別取各個濃度條件下的樣品進行SEC-HPLC分析，結果表
10所示：
上述結果表明，本發明抗體在高達90mg/ml時，仍然澄清，無沉澱，抗體單體量沒有改變。而陽性分子在同樣濃度下出現大量沉澱，單體量也隨之減少，由95.8%下降到92%。
穩定性評價
測試例8：人源化抗SOST抗體的穩定性
為了檢測本發明人源化抗SOST抗體的穩定性，將本發明抗體Ab-5與陽性抗體Romosozumab在pH7.4的PBS緩衝液中，4度條件下放置7天的穩定性。穩定性藉由兩種檢測方法，一種是形成肉眼可見不可溶沉澱的多少，藉由放置前後濃度變化來計算。另一種是用SEC-HPLC的方法來檢測檢樣品中可溶抗體單體含量變化。起始抗體濃度為陽性抗體能達到的最高溶解濃度30mg/ml。結果如表11
所示：
上述結果表明，陽性抗即使在其的能達到的濃度(30mg/ml)無沉澱的情況下，放置僅7天後，已經有19.3%沉澱析出，單體量也隨之減少。而本發明抗體則非常穩定，沒有任何沉澱，溶液澄清。
綜合溶解度和穩定性結果，表明本發明抗體製劑方面的性能要比陽性抗體優越，可做成高濃度，如90mg/ml製劑，而且穩定。
<110> 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.)
大陸商上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)
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<160> 29
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼帶His標籤的人硬骨素(His-h-SOST)DNA序列
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<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼帶Flag標籤的人硬骨素(h-SOST-Flag)DNA序列
<400> 2
<210> 3
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶Flag標籤的小鼠硬骨素(m-SOST-Flag)DNA序列
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<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶Flag標籤的食蟹獼猴硬骨素(cyno-SOST-Flag)DNA序列
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<213> 鼠
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<213> 鼠
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<212> PRT
<213> 鼠
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<213> 鼠
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<212> PRT
<213> 鼠
<400> 9
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<212> PRT
<213> 鼠
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<213> 鼠
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<212> PRT
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-9的重鏈可變區
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<212> PRT
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<223> Ab-5的輕鏈可變區
<400> 17
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> Ab-9的輕鏈可變區
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<212> PRT
<213> 人
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<212> PRT
<213> 人
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<212> PRT
<213> 人
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-5人源化抗體重鏈
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<220>
<223> Ab-10人源化抗體輕鏈
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<220>
<223> Ab-9人源化抗體輕鏈
<400> 28
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-5人源化抗體輕鏈
<400> 29
Claims (31)
- 一種特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8或13所示的HCDR2和如SEQ ID NO：9所示的HCDR3，和該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：10所示的LCDR1，如SEQ ID NO：11所示的LCDR2和如SEQ ID NO：12所示的LCDR3。
- 如申請專利範圍第1項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
- 如申請專利範圍第2項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體重鏈可變區序列為：SEQ ID NO：5，或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第2項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體輕鏈可變區序列為：SEQ ID NO：6，或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第2至4項中任一項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：5，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：6。
- 如申請專利範圍第1項所述的特異性結合人硬骨素的 抗體或其抗原結合片段，其為嵌合抗體或人源化抗體或其片段。
- 如申請專利範圍第6項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含人種系重鏈IGHV1-18*01的FR1，FR2，FR3和FR4區的框架序列或其突變序列。
- 如申請專利範圍第7項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該突變序列為1-10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第7項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：14-16中任一所示的重鏈可變區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第6項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含人種系輕鏈IGKV1-39*01或IGKV4-1*01的FR1，FR2，FR3和FR4區的框架序列或其突變序列。
- 如申請專利範圍第10項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該突變序列為1-10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第10項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：17-19中任一所示的輕鏈可變區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第6項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：14-16中任一所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO：17-19中任一所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第13項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其包含選自a)至c)任一的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的組合：a)SEQ ID NO：14的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：17的輕鏈可變區序列；b)SEQ ID NO：15的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：18的輕鏈可變區序列；或c)SEQ ID NO：16的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：19的輕鏈可變區序列。
- 如申請專利範圍第6項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈恆定區包含源自人源IgG1或其變體、人源IgG2或其變體、人源IgG3或其變體或人源IgG4或其變體的恆定區。
- 如申請專利範圍第15項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈恆定區包含人源IgG1或其變體或人源IgG4或其變體的恆定區。
- 如申請專利範圍第16項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈恆 定區包含人源IgG4或其變體的恆定區。
- 如申請專利範圍第15項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其包含選自SEQ ID NO：24-26中任一所示或與其具有至少90%同源性的全長重鏈序列。
- 如申請專利範圍第6項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的輕鏈恆定區包含選自人源κ或λ鏈或其變體的恆定區。
- 如申請專利範圍第19項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其包含選自SEQ ID NO：27-29中任一所示或與其具有至少90%序列同源性的全長輕鏈序列。
- 如申請專利範圍第6項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：24-26中的任一全長重鏈序列和選自SEQ ID NO：27-29中的任一全長輕鏈序列。
- 如申請專利範圍第21項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體選自以下任一的全長輕鏈序列和全長重鏈序列的組合：SEQ ID NO：24的重鏈序列和SEQ ID NO：27的輕鏈序列；SEQ ID NO：25的重鏈序列和SEQ ID NO：28的輕鏈序列；或SEQ ID NO：26的重鏈序列和SEQ ID NO：29 的輕鏈序列。
- 一種編碼如申請專利範圍第1至22項中任一項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段的DNA分子。
- 一種含有如申請專利範圍第23項所述的DNA分子的表現載體。
- 一種使用如申請專利範圍第24項所述的表現載體轉化的宿主細胞。
- 如申請專利範圍第25項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
- 如申請專利範圍第26項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含申請專利範圍第1至22項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種申請專利範圍第1至22項中任一項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段或申請專利範圍第28項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於增強骨量、骨礦物質密度、骨礦物質含量或骨強度中的至少一種的藥物中。
- 一種申請專利範圍第1至22項中任一項所述的特異性結合人硬骨素的抗體或其抗原結合片段或申請專利範圍第28項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療SOST介導的骨性疾病或病症的藥物，其中該疾病 或病症選自骨質疏鬆症、骨質減少或骨關節炎、類風濕性關節炎、牙周病或多發性骨髓瘤的疾病或障礙。
- 如申請專利範圍第30項所述的用途，其中該疾病或病症為骨質疏鬆症。
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