TW202320847A - 一種抗ａｎｇｐｔｌ３抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供了一種抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物及其用途。具體地，本揭露的醫藥組成物包含抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段以及醋酸-醋酸鈉緩衝液；該醫藥組成物還可以包含糖和表面活性劑。本揭露的醫藥組成物具有良好的抗體穩定性。
Description
本揭露要求2021年07月21日提交的申請號為202110822526.8的中國專利申請的優先權。
本揭露關於藥物製劑領域，具體關於一種包含抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物及其醫藥用途。
血管生成素樣蛋白3(Angiopoietin-like protein 3，ANGPTL3)是一種分泌蛋白，作為血管生成素樣蛋白家族的成員，其主要在肝臟表達。ANGPTL3的胺基末端捲曲的區域與抑制脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)活性有關，調節甘油三酯(triglyceride，TG)羧基端纖維蛋白原樣區域主要與調節血管生成有關，因此，該蛋白具有調節脂質代謝和促進血管生成的功能。
ANGPTL3主要作用為調節脂蛋白代謝，藉由抑制LPL和內皮脂酶(EL)在調節脂質代謝中發揮作用。目前ANGPTL3抑制物分為2種，一種是ANGPTL3-ASO，另一種為ANGPTL3單株抗體如依維庫單抗(Evinacumab)，二
者機制與作用部位不同，ANGPTL3-ASO主要作用於肝細胞，而依維庫單抗在血液循環中起效。但無論是從表型還是基因水平上抑制ANGPTL3後均有突出且穩定的降脂效果。靶向ANGPTL3的IgG4亞型的單株抗體，能結合ANGPTL3，藉由阻斷ANGPTL3與LPL的結合，解除ANGPTL3對LPL酶活的抑制，促進血漿中甘油三酯的降解，從而達到治療高血脂症的目的。
WO2021147984A提供了一種降血脂效果更好也更為持久的抗ANGPTL3抗體及其抗原結合片段。抗體藥物分子量大，結構複雜，容易降解、聚合或發生不希望發生的化學修飾等而變得不穩定。為了使抗體適合於給藥，並且在儲存及隨後使用過程中能保持穩定性，發揮更好的治療效果，抗體藥物的穩定製劑研究顯得尤為重要。因此，對於抗ANGPTL3抗體及其抗原結合片段，需要研製較為穩定的製劑。本揭露提供一種足夠穩定、凍乾形態好且更適於給藥的包含抗ANGPTL3抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物。
本揭露提供一種醫藥組成物，其包含抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，以及緩衝劑。以及，本揭露提供該醫藥組成物用於治療、預防疾病的方法，及其醫藥用途。
在一些實施方案中，前述緩衝劑選自醋酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑和枸櫞酸緩衝劑中的任一種，例如醋酸鹽緩衝劑。
在一些實施方案中，前述緩衝劑選自醋酸-醋酸鈉、組胺酸-鹽酸鹽、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、琥珀酸-琥珀酸鈉和枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑中的任一種，例如醋酸-醋酸鈉緩衝劑。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：9所示胺基酸序列的重鏈可變區中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的輕鏈可變區中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。其中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，一些具體實施方案中，為Kabat編號系統定義的。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO：14所示的HCDR1，如LINPRDDSTSYAQKFQG(SEQ ID NO：23)所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：16所示的HCDR3；和/或該輕鏈可變區包含胺基酸序列如RSSQSLLHSNGYTYLD(SEQ ID NO：24)所示的LCDR1，如SEQ ID NO：12所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：13所示的HCDR3。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：17所示胺基酸序列的重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：18所示胺基酸序列的輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3。其中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，一些具體實施方案中，為Kabat編號系統定義的。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或該輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體；在一些具體實施方案中，為人源化抗體。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該人源化ANGPTL3抗體輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈的FR或其突變序列。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%以上序列同一性，和/或該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%以上序列同一性。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%及以上的序列同一性，和/或該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%及以上的序列同一性。
本揭露中，“至少90%及以上的序列同一性”涵蓋至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%及以上的序列同一性。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示，該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在一些實施方案中，該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段進一步包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區。在可選的實施方案中，該重鏈恆定區源自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區，該輕鏈恆定區源自人κ和λ鏈恆定區。
在一些實施方案中，該重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%及以上的序列同一性，和/或該輕鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%及以上的序列同一性。
在一些實施方案中，該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中，該重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%及以上的序列同一性，和/或該輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示或與之具有至少80%、至少85%、至少90%及以上的序列同一性。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈和輕鏈，其中，該重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示，且該輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
在一些實施方案中，本揭露所述的抗原結合片段選自：Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv、dsFv、scFv、Fab和雙特異性抗體。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該緩衝劑的pH值為4.0至7.0，例如4.0至6.9、4.0至6.8、4.0至6.7、4.0至6.6、4.0至6.5、4.0至6.4、4.0至6.3、4.0至6.2、4.0至6.1、4.0至6.0、4.0至5.9、4.0至5.8、4.0至5.7、4.0至5.6、4.0至5.5、4.5至6.5、4.5到6.0、4.5至5.5、5.0至7.0、5.0至6.5、5.0至6.0、5.0至5.5、4.6至6.6、4.6至6.5、4.6至6.4、4.6至6.3、4.6至6.2、4.6至6.1、4.6至6.0、4.6至5.9、4.6至5.8、4.6至5.7、4.6至5.6、4.6至5.5、4.6至5.4、4.8至6.6、4.8至6.5、4.8至6.4、4.8至6.3、4.8至6.2、4.8至6.1、4.8至6.0、4.8至5.9、4.8至5.8、4.8至5.7、4.8至5.6、4.8至5.5、4.8至5.4、4.9至5.4、5.0至5.4；在一些具體實施方案中，該緩衝劑的pH值為約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、或者約7.0，例如約5.2。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該緩衝劑濃度為5mM至40mM，例如5mM至30mM、5mM至20mM、5mM至15mM、5mM至10mM、10mM至15mM、8mM至12mM；一些具體實施方案中，該緩衝劑的濃度為約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約11mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約18mM、約20mM，例如約10mM。
在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段濃度為10mg/mL至200mg/mL，例如50mg/mL至200mg/mL、50mg/mL至150mg/mL、60mg/mL至150mg/mL、60mg/mL至120mg/mL、80mg/mL至150mg/mL、80mg/mL至120mg/mL、90mg/mL至120mg/mL、90mg/mL至110mg/mL；一些具體實施方案中，該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段濃度為約10mg/mL、約20mg/mL、約30mg/mL、約50mg/mL、約60mg/mL、約65mg/mL、約70mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約90mg/mL、約95mg/mL、約100mg/mL、約105mg/mL、約110mg/mL、約115mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL、約140mg/mL、約150mg/mL、約160mg/mL、約170mg/mL、約180mg/mL、約190mg/mL、約200mg/mL、或任意兩數值間任意值，例如約100mg/mL。
在一些實施方案中，醫藥組成物中包含的表面活性劑可選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆殼基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆殼基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。一些具體實施方案中，該表面活性劑是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，例如聚山梨醇酯80。
在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為0.05mg/mL至0.6mg/mL、例如0.1mg/mL至0.6mg/mL、0.1mg/mL至0.5mg/mL、0.1mg/mL至0.4mg/mL，例如0.1mg/mL至0.3mg/mL；一些具體實施方案中，該醫藥組成物中表面活性劑的濃度為約0.1mg/mL、約0.15mg/mL、約0.2mg/mL、約0.25mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL，例如約0.2mg/mL。
在一些實施方案中，醫藥組成物還包括穩定劑。在可選的實施方案中，其中該穩定劑選自糖或胺基酸。在可選的實施方案中，糖包含常規組成物(CH2O)n及其衍生物，包括單糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、還原性糖、非還原性糖等。在可選的實施方案中，糖可選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖、山梨糖醇、甘露醇、密裡二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳果糖、麥芽酮糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異-麥芽酮糖等。一些具體實施方案中，該糖是非還原性二糖，例如蔗糖。一些具體實施方案中，該胺基酸選自甘胺酸、甲硫胺酸和脯胺酸。
在一些實施方案中，醫藥組成物中糖的濃度為40mg/mL至110mg/mL，例如為40mg/mL至95mg/mL、60mg/mL至90mg/mL、60mg/mL至80mg/mL、70mg/mL至90mg/mL、70mg/mL至80mg/mL；一些具體實施方案中，該糖的濃度為約60mg/mL、約65mg/mL、約70mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約90mg/mL或任意兩數值間任意值，例如約75mg/mL。
本揭露提供一種醫藥組成物，其包含：
(a)10mg/mL至200mg/mL(例如，約50mg/mL)的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，和
(b)約10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液；
可選地，該醫藥組成物的pH為6.0至6.6(例如，約6.0、約6.6)。
本揭露提供一種醫藥組成物，其包含：
(a)10mg/mL至200mg/mL(例如，約50mg/mL)的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，和
(b)約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液；
可選地，該醫藥組成物的pH為4.6至5.0(例如，約4.6、約5.0)。
本揭露提供一種醫藥組成物，其包含：
(a)10mg/mL至200mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，和
(b)5mM至30mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)。
在一些實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)10mg/mL至200mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，
(b)5mM至30mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)，
(c)40mg/mL至90mg/mL的糖(例如，蔗糖)，和
(d)0.05mg/mL至0.6mg/mL的表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80或聚山梨醇醋20)；
可選地，該醫藥組成物的pH為4.5至6.5，例如5.0至5.4，例如約5.2。
本揭露提供一種醫藥組成物，其包含：
(a)10mg/mL至200mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，和
(b)5mM至20mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)；
可選地，該醫藥組成物的pH為5.0至5.5。
在一些實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)50mg/mL至150mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，
(b)5mM至15mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)，
(c)60mg/mL至90mg/mL的蔗糖，
(d)0.05mg/mL至0.5mg/mL的聚山梨醇醋80；
可選地，該醫藥組成物的pH為5.0至6.0。
在一些實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)40mg/mL至120mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，
(b)5mM至15mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)，
(c)60mg/mL至90mg/mL的蔗糖，
(d)0.1mg/mL至0.4mg/mL的聚山梨醇酯80；
可選地，該醫藥組成物的pH為5.0至5.8。
在一些實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)80mg/mL至120mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，
(b)5mM至15mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)，
(c)70mg/mL至90mg/mL的蔗糖，
(d)0.1mg/mL至0.3mg/mL的聚山梨醇酯80；
可選地，該醫藥組成物的pH為5.0至5.5。
在一些實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)80mg/mL至120mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，
(b)5mM至15mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)，
(c)70mg/mL至90mg/mL的蔗糖，
(d)0.1mg/mL至0.3mg/mL的聚山梨醇酯80；
可選地，該醫藥組成物的pH為5.0至5.5。
在一些實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)90mg/mL至110mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，
(b)8mM至12mM的醋酸鹽緩衝液(例如，醋酸-醋酸鈉緩衝液)，
(c)75mg/mL至85mg/mL的蔗糖，
(d)0.15mg/mL至0.25mg/mL的聚山梨醇酯80；
可選地，該醫藥組成物的pH為5.1至5.3。
在一些實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)約100mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，
(b)5mM至15mM的醋酸-醋酸鈉緩衝液，
(c)60mg/mL至90mg/mL的蔗糖，
(d)0.1mg/mL至0.4mg/mL的聚山梨醇酯80；
可選地，該醫藥組成物的pH為5.0至5.4。
在一些具體實施方案中，該醫藥組成物包含：
(1)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.1mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(2)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨醋80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(3)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.4mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(4)約80mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(5)約120mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(6)約150mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(7)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約60mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(8)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約65mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(9)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約70mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(10)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約80mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(11)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約90mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(12)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約5mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)；
(13)約100mg/mL抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，約75mg/mL蔗糖，約0.2mg/mL聚山梨酯80，和約15mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4(例如，約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4)。
上述實施方案中，該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段選自：
1)該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段含有重鏈可變區和輕鏈可變區，該輕鏈可變區含有胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和該重鏈可變區含有胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
2)該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示，該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示；
3)該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈和輕鏈，該重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示，且該輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示；
4)該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段含有重鏈可變區和輕鏈可變區，該輕鏈可變區含有胺基酸序列分別如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和該重鏈可變區含有胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
5)該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本揭露所述醫藥組成物已具有足夠成藥穩定性，可以長期穩定放置。本揭露的醫藥組成物至少具有穩定性好，凍乾形態好等優勢。
在一些實施方案中，該醫藥組成物於2-8℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，該醫藥組成物於25℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，該醫藥組成物於40℃穩定至少7天，至少14天或至少28天。
在一些實施方案中，該醫藥組成物於200rpm、室溫下震盪至少12h小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時、或者至少60小時後仍保持穩定。
在一些實施方案中，該醫藥組成物於-35℃/室溫下凍融至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次後仍保持穩定。
在一些實施方案中，該醫藥組成物於5000Lx、25℃下光照至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天後仍保持穩定。
本揭露還提供了製備前述醫藥組成物的方法，包括將抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段原液經緩衝劑置換的步驟，其中該緩衝劑可以為醋酸-醋酸鈉緩衝劑。
一些實施方案中，前述醫藥組成物為液體製劑。另一些實施方案中，前述醫藥組成物為凍乾製劑。
本揭露還提供一種製備含有抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑的方法，其中包括將前述醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。在可選的實施方案中，該冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。
本揭露還提供一種含有抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑，其是經前述製備凍乾製劑的方法製備獲得的。
本揭露還提供製備含有抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑的複溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑經複溶的步驟，其複溶所用溶液選自但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液。
本揭露還提供一種含抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的複溶溶液，其是經前述製備複溶溶液的方法製備獲得的。
本揭露提供一種製品、產品或試劑盒，其含有前述本揭露任意的含抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物、液體製劑、凍乾製劑、複
溶溶液。可選地，還含有一個或多個容器，該容器中裝有任意前述本揭露的醫藥組成物、液體製劑、凍乾製劑、複溶溶液的容器。在一些實施方案中，該容器為玻璃瓶，例如，為中性硼矽玻璃管製注射劑瓶。
本揭露還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液。
本揭露還提供醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液，其用於治療和預防疾病或病症的方法中。
本揭露還提供前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液在製備用於治療和/或預防疾病或病症的藥物中的用途。
本揭露還提供一種治療和/或預防疾病或病症的方法，包括給予有需要的受試者治療和/或預防有效量的前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液。一些實施方案中，該受試者為人類受試者。
在一些實施方案中，該疾病或病症為與ANGPTL3活性有關的任何疾病或病症，包括由ANGPTL3介導的疾病或病症。
在一些實施方案中，該疾病或病症的實例包括但不限於涉及脂質代謝的疾病或病症，例如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂異常。在一些實施方案中，該疾病或病症的實例包括但不限於動脈粥樣硬化性血脂異常、糖尿病性血脂異常、高甘油三酸酯血症(包括嚴重的甘油三酸酯血症，TG>1000mg/dL)、高膽固醇血症、乳糜微粒血症、混合血脂異常(例如肥胖、代謝綜合症、糖尿病等)、脂肪營養不良、脂肪萎縮等。在一些實施方案中，該疾病或病症的實例可以是由LPL活性降低、LPL缺乏、LDL受體(LDLR)活性降低、LDL受體缺乏症(例如，LDLR-/-純合子家族性高膽固醇血症)、改變的ApoC2/ApoE缺乏、ApoB增加、
極低密度脂蛋白(VLDL)的產生和/或消除減少、某些藥物治療(例如糖皮質激素治療引起的血脂異常)、任何遺傳易感性、飲食、生活方式等導致的血脂異常。
在一些實施方案中，該疾病或病症可以是與高脂血症、高脂蛋白血症和/或血脂異常相關或由其引起的疾病或病症，其包括但不限於心血管疾病或病症，例如動脈粥樣硬化、動脈瘤、高血壓、心絞痛、中風、腦血管疾病、充血性心衰竭、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、周圍血管疾病等；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；血糖異常，例如糖尿病、肥胖等。
在一些實施方案中，該疾病或病症的其他實例包括癌症/腫瘤以及與非腫瘤性血管生成相關的疾病或病症。在可選的實施方案中，該疾病或病症可以是眼血管生成相關疾病或病症，如年齡相關性黃斑變性、視網膜中央靜脈阻塞或視網膜分支靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病等。在可選的實施方案中，該疾病或病症可以是炎性疾病或病症，例如關節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬等。
圖1係P8BG抗體對SD(Sprague Dawley，斯潑累格．多雷)大鼠血清甘油三酯的影響圖；
圖2係抗ANGPTL3抗體對HFD(High-fat-diet，高脂飲食)小鼠血漿甘油三酯的影響圖；
圖3係抗ANGPTL3抗體對HFD小鼠血漿低密度脂蛋白膽固醇(Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C)的影響圖；
圖4係抗ANGPTL3抗體對HFD小鼠血漿總膽固醇的影響圖；
圖5係抗ANGPTL3抗體對APOE小鼠(載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除小鼠)血漿甘油三酯的影響圖；
圖6係抗ANGPTL3抗體對APOE小鼠血漿高密度脂蛋白膽固醇(High density liptein cholesterol，HDL-C)的影響圖；
圖7係抗ANGPTL3抗體在小鼠體內藥物代謝動力學實驗結果圖；
圖8係抗ANGPTL3抗體在食蟹猴體內的藥物代謝動力學實驗結果圖。
一、術語
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。
“組胺酸鹽緩衝劑”是包含組胺酸根離子的緩衝劑。組胺酸鹽緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸鹽，組胺酸-醋酸鹽，組胺酸-磷酸鹽，組胺酸-硫酸鹽等緩衝劑，例如組胺酸-醋酸鹽緩衝劑或組胺酸-鹽酸鹽緩衝劑，組胺酸-醋酸鹽緩衝劑是組胺酸與醋酸配製而成，組胺酸鹽緩衝劑是組胺酸與鹽酸配製而成。
“枸據酸鹽緩衝劑”是包括枸櫞酸根離子的緩衝劑。枸櫞酸鹽緩衝劑的實例包括枸櫞酸-枸櫞酸鈉、枸櫞酸-枸櫞酸鉀、枸櫞酸-枸構酸鈣、枸櫞酸-枸櫞酸鎂等。枸櫞酸鹽緩衝劑可以是枸櫞酸-枸機酸鈉。
“琥珀酸鹽緩衝劑”是包括琥珀酸根離子的緩衝劑。琥珀酸鹽緩衝劑的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。琥珀酸鹽緩衝劑可以是琥珀酸-琥珀酸鈉。
“磷酸鹽緩衝劑”是包括磷酸根離子的緩衝劑。磷酸鹽緩衝劑的實例包括磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-枸櫞酸等。磷酸鹽緩衝劑可以是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉。
“醋酸鹽緩衝劑”是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、醋酸組胺酸鹽、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。醋酸鹽緩衝劑可以是醋酸-醋酸鈉。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本文中，“醫藥組成物”和“製劑”可以互換使用。
本揭露中所述醫藥組成物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。
“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或溶液製劑經過真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。
本文所用術語“約”或“大約”是指數值在由所屬技術領域具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測
定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多±20%的範圍，例如，約5.5的pH意指pH5.5±1.1。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本揭露和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
本揭露所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性，例如醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。
穩定的藥物抗體製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、至少6個月、至少1年、最多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃保存包括1個月、3個月、6個月或在40℃保存1個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的可接受的標準如下：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、例如不超過約5%的抗體單體發生降解。藉由視覺分析，藥物抗體製劑是無色的，或澄清至稍微乳白色。該製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、例如不超過約5%的截短，通常形成不超過約10%、例如不超過約5%的聚集。
如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和
/或變性，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。
如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。
如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的生物活性”。抗體的生物活性可以例如藉由抗原結合測定來確定。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中該。
本揭露所述的“抗體”指免疫球蛋白，天然完整抗體是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可
分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本揭露所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。
本揭露的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，例如人源化抗體。
術語“鼠源抗體”在本揭露中為根據本領域知識和技能製備的針對人ANGPTL3的單株抗體。製備時用ANGPTL3抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本揭露一個可選的實施方案中，該鼠源抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將異源(例如，鼠源)性抗體的可變區與抗體(例如人抗體)的恆定區融合而成的抗體，可以減輕異源性抗體誘
發的免疫應答反應。例如人鼠嵌合抗體，建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中株可變區基因，再根據需要株人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本揭露一個可選的實施方案中，該抗ANGPTL3嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該ANGPTL3嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，例如包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變，和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將異源(例如，鼠源)的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或揭露的参考文献获得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本揭露的人源化抗體也包括進一步由酵母菌展示對CDR進行親和力成熟突變後的人源化抗體。
術語“人抗體”與“人源抗體”可以互換使用，是指有一或多個可變區和恆定區來源於人免疫球蛋白序列。其中一個可選的方式是所有的可變區和
恆定區均來自於人免疫球蛋白序列，即“完全人源抗體”或“全人抗體”。這些抗體可以藉由多種方式製備获得，包括藉由噬菌體展示技術，從人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，構建天然單鏈噬菌體人抗體庫，或者藉由免疫可表達人抗體輕重鏈的轉基因小鼠，篩選獲得的抗體。本揭露的人抗體還包括在人抗體基礎上經過一個或更多個胺基酸的突變獲得的仍結合目標抗原的抗體。
本揭露“抗體”除包括全長抗體外，還包括能結合抗原的抗原結合片段。
術語“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，ANGPTL3)的能力的一個或更多個片段。已显示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL經鏈間二硫鍵形成的穩定的抗原結合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的雙抗體、雙特異性抗體和多特異性抗體。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋
白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。
本揭露中該突變序列中的“突變”包括但不限於“回復突變”、“保守修飾”或“保守置換或取代”。本揭露中該“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、測鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。所屬技術領域具有通常知識者知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。
本揭露所述的“突變序列”是指對本揭露的核苷酸序列和/或胺基酸序列進行適當的替換、插入或缺失等突變修飾情況下，得到的與本揭露的核苷酸序列和/或胺基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和/或胺基酸序列。本揭露中該序列同一性可以至少為85%、90%或95%，例如至少為95%。非限制性實施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Institute网站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默認設置來進行。
“序列同一性”或“序列同源性”當用於胺基酸序列時，是指兩個蛋白或多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同胺基酸殘基佔據時，例如如果兩個多肽的一個位置都被同一個胺基酸殘基佔據時，那麼該分子在該位置是一致的。適於確定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的
實例是BLAST和BLAST2.0算法，它們分別描述於Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。用於執行BLAST分析的軟體可在美國國家生物技術信息中心公開獲取(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。本揭露述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人CD40特異性結合的抗體得到穩定的株。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種結合化合物的組成物，該受試者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“Tm值”是指蛋白質熱變性溫度，即一半蛋白去折疊時的溫度，此時蛋白的空間結構被破壞，所以Tm值越高，蛋白熱穩定性越高。
[實施例]
以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1、ANGPTL3抗原設計及表達
以人ANGPTL3蛋白(Uniprot號：Q9Y5C1)、小鼠ANGPTL3蛋白(Uniprot號：Q9R182)、食蟹猴ANGPTL3蛋白(Uniprot號：A0A2K5UDC5)、大鼠ANGPTL3蛋白(Uniprot號：F7FHP0)作為本披露ANGPTL3的模板，設計本披露涉及的抗原及檢測用蛋白，在ANGPTL3蛋白基礎上融合不同的標簽，分別選殖到pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)，在293細胞中瞬時轉染表達、然後純化，獲得編碼本披露抗原及檢測用蛋白。
1、人全長ANGPTL3：人-ANGPTL3(17-460)-His，可用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：1
註釋：單下劃線部分為信號肽序列，斜體字部分為His序列，粗體字部分為人ANGPTL3全長蛋白的第17至第460位胺基酸。
2、人ANGPTL3胞外區：人ANGPTL3(17-170)-Flag-His，可用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：2
註釋：單下劃線部分為信號肽，雙下劃線部分為連接肽，斜體部分為Flag和His，粗體字部分為人ANGPTL3全長蛋白的第17至第170位胺基酸。
3、人ANGPTL3胞外區(人ANGPTL3(17-170))與小鼠IgG2aFc段(縮寫：mFc)的融合蛋白：人ANGPTL3(17-170)-mFc，可用於檢測，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：3
註釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為小鼠IgG2aFc，粗體字部分為人ANGPTL3全長蛋白的第17至第170位胺基酸。
4、人ANGPTL3胞外區(人ANGPTL3(17-220))與小鼠IgG2aFc段的融合蛋白：人ANGPTL3(17-220)-mFc，用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：4
註釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為小鼠IgG2aFc，粗體字部分為人ANGPTL3全長蛋白的第17至第220位胺基酸。
5、小鼠全長ANGPTL3：小鼠ANGPTL3(17-455)-His，用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：5
註釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為His序列，粗體字部分為小鼠ANGPTL3全長蛋白的第17至第455位胺基酸。
6、小鼠ANGPTL3胞外區(mouse-ANGPTL3(17-220))與小鼠IgG2aFc段的融合蛋白：小鼠ANGPTL3(17-220)-mFc，用於免疫，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：6
註釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為小鼠IgG2aFc，粗體字部分為小鼠ANGPTL3全長蛋白的第17至第220位胺基酸。
7、食蟹猴全長ANGPTL3：食蟹猴ANGPTL3(17-460)-His，用於檢測，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：7
註釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為His序列，粗體字部分為食蟹猴ANGPTL3全長蛋白的第17至第460位胺基酸。
8、大鼠全長ANGPTL3：大鼠ANGPTL3(17-455)-His，用於檢測，其胺基酸序列如下：
SEQ ID NO：8
註釋：劃橫線部分為信號肽，斜體部分為His序列，粗體字部分為大鼠ANGPTL3全長蛋白的第17至第455位胺基酸。
實施例2、ANGPTL3抗原蛋白、融合瘤抗體、重組抗體的純化
2.1 帶His標簽的重組蛋白或帶Flag-his標簽的重組蛋白的純化
將細胞表達樣品高速離心去除細胞和不溶雜質，收集上清並加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將細胞上清上管柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱，至A280讀數降至基線。然後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流穿液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。
收集的沖提液用Superdex凝膠過濾管柱進行進一步精純，分管收集。所得到的樣品經過SDS-PAGE、肽圖、LC-MS鑑定為正確後，分裝備用。得到帶His標簽的重組蛋白或帶Flag-his標簽的重組蛋白。
2.2 融合瘤抗體或帶mFc標簽的重組蛋白的純化
將樣品高速離心去除細胞及不溶性雜質，留上清。使用1×PBS平衡Protein A親和管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將離心後的細胞表達上清樣品上管柱。用1×PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用1×PBS沖洗管柱。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)沖提目的蛋白，並收集，之後立即用1M Tris-HCl(pH 7.0)調節沖提蛋白pH至中性，最後透析或者濃縮換液至1×PBS緩衝液中。收集樣品，經電泳、肽圖、LC-MS鑑定正確後分裝備用。得到帶mFc標簽的重組蛋白或融合瘤抗體。
2.3 抗體、帶Fc標簽的重組蛋白的純化
將樣品高速離心去除細胞及不溶性雜質，留上清。使用1×PBS平衡Protein G親和管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將離心後的細胞表達上清樣品上管柱。用1×PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用1×PBS沖洗管柱。用乙酸(pH 3.0)沖提目的蛋白，並收集，之後立即用1M Tris-HCl(pH 7.0)調節沖提蛋白pH至中性，最後透析或者濃縮換液至1×PBS緩衝液中。收集樣品經電泳、肽圖、LC-MS鑑定正確後，分裝備用。得到抗體或者帶hFc標簽的重組蛋白。
實施例3、抗ANGPTL3抗體的製備
3.1 藉由噬菌體庫篩選抗ANGPTL3人源抗體
人源噬菌體單鏈抗體庫進行包裝濃縮，將噬菌體庫(1012~1013/pfu)懸浮於1mL 2% MPBS(含有2%脫脂奶粉的PBS)中，並加入100μl Dynabeads® M-280鏈黴親和素(Invitrogen Cat No.11206D)，置於轉檯上反復翻轉，室溫封閉1小時。將管子置於磁力架上2分鐘，去除Dynabeads，噬菌體庫轉移至新的管子中。向封閉後的噬菌體庫中加入2μg/mL生物素標記的人ANGPTL3(17-460)-His，置於轉檯上反復翻轉1小時。同時取100μl Dynabeads懸浮於1mL 2%MPBS中，置於轉檯上反復翻轉，室溫封閉1小時。將管子置於磁力架上2分鐘，吸去封閉液。將封閉後的Dynabeads加入到噬菌體庫和人ANGPTL3(17-460)-His混合液中，置於轉檯上反復翻轉15分鐘。將管子置於磁力架上2分鐘，吸去混合液。用1mL PBST(含0.1% Tween-20的PBS)洗Dynabeads 10次，再加入0.5mL 1mg/mL胰蛋白酶(Sigma Cat No.T1426-250MG)，置於轉檯上反復翻轉孵育15分鐘，進行沖提，將沖提下來的噬菌體感染大腸桿菌TG1塗平板，隨機挑取單株，用於噬菌體ELISA。
將株接種於96孔深孔板(Nunc Cat No.260251)37度培養16~18小時。取少量接種至另一個96孔深孔板，至OD600達到0.5左右，加入M13K07輔助噬菌體(NEB Cat No.N0315S)進行包裝。4000g離心10分鐘去除菌體，吸取培養液進行ANGPTL3結合ELISA檢測。陽性株菌種凍存保種並送測序公司測序。其中，測得陽性株P8對應的胺基酸序列如下：
>P8重鏈可變區序列：
SEQ ID NO：9
>P8輕鏈可變區序列：
SEQ ID NO：10
備註：序列中下劃線部分為根據Kabat編號系統確定的CDR序列，斜體為FR序列。
3.2 抗ANGPTL3抗體的突變
以P8抗體的三維結構為基礎，將P8重鏈可變區的第55位胺基酸殘基(自然順序編號)由D突變為E，將P8輕鏈可變區的第34位胺基酸殘基(自然順序編號)由G突變為V，得到新的抗體分子P8B，P8B的胺基酸序列如下：
>P8B重鏈可變區序列：
SEQ ID NO：17
>P8B輕鏈可變區序列：
SEQ ID NO：18
備註：序列中下劃線部分為根據Kabat編號系統確定的CDR序列，斜體為FR序列。
表1. P8B抗體分子的CDR序列
3.3 抗ANGPTL3抗體的構建和表達
設計引子PCR搭建抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。抗體的重鏈恆定區可選自人IgG1、IgG2、IgG4及其變體的恆定區，輕鏈恆定區可選自人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。示例性的，抗體重鏈恆定區選自序列如SEQ ID NO：19所示的人IgG4-YTE變體，輕鏈恆定區選自序列如SEQ ID NO：20所示的人κ鏈的恆定區。
>人IgG4-YTE變體重鏈恆定區序列：
SEQ ID NO：19
>人κ鏈輕鏈恆定區序列：
SEQ ID NO：20
示例性地，上述輕鏈/重鏈恆定區與前述P8B的可變區組合形成完整的抗ANGPTL3抗體：P8BG，抗體的輕鏈/重鏈序列如下：
>P8BG重鏈序列：
SEQ ID NO：21
>P8BG輕鏈序列：
SEQ ID NO：22
實施例4、抗ANGPTL3抗體的體外評價
4.1 抗ANGPTL3抗體結合ANGPTL3蛋白的ELISA實驗
抗ANGPTL3抗體藉由與ANGPTL3蛋白結合來抑制或者干擾ANGPTL3蛋白的至少一種活性。用ELISA實驗檢測抗ANGPTL3抗體與ANGPTL3抗原的結合活性。ANGPTL3蛋白(人ANGPTL3(17-170)-mFc)藉由與包被在酶標板中的羊抗鼠IgG結合從而固定到96孔酶標板中，根據抗體加入後信號的強弱判斷抗體和ANGPTL3的結合活性。同時用生物素標記試劑盒(東仁化學，LK03)標記的帶HIS標簽的ANGPTL3蛋白(小鼠ANGPTL3(17-455)-His、食蟹猴ANGPTL3(17-460)-His、大鼠ANGPTL3(17-455)-His)藉由與包被在酶標板中的鏈黴親和素結合從而固定到96孔酶標板中，根據抗體加入後信號的強弱判斷抗體和ANGPTL3的結合活性。
用pH7.4的PBS(上海源培，B320)緩衝液將羊抗鼠IgG(Sigma，M3534-1ML)稀釋至2μg/mL濃度，以50μL/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，CLS3590-100EA)中，於37℃孵育箱中放置3小時或4℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD，232100)封閉液250μL/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4PBS含0.05%吐溫-20)洗板3次後，加入50μL/孔用樣品稀釋液(pH7.4PBS含1%BSA)稀釋至0.5μg/mL人ANGPTL3(17-170)-mFc(序列如SEQ ID NO：3)置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板3次後，加入50μL/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加
入50μL/孔用樣品稀釋液稀釋的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入50μL/孔TMB顯色受質(KPL，52-00-03)，於室溫孵育2-5分鐘(min)，加入50μL/孔MH2SO4終止反應，用VersaMax酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗ANGPTL3抗體對ANGPTL3抗原蛋白的結合的EC50值。實驗結果見表3。
用pH7.4的PBS(上海源培，B320)緩衝液將鏈黴親和素(Sigma，S4762-5MG)稀釋至3μg/mL濃度，以50μL/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，CLS3590-100EA)中，於37℃孵育箱中放置3小時或4℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD，232100)封閉液250μL/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4 PBS含0.05%吐溫-20)洗板3次後，加入50μL/孔用樣品稀釋液(pH7.4PBS含1%BSA)稀釋至0.5μg/mL的生物素標記的小鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：5)、食蟹猴ANGPTL3(17-460)-His(序列如SEQ ID NO：7)、大鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：8)，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板3次後，加入50μL/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入50μL/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，115-035-003)或者是羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，109-035-003)或者小鼠HRP/抗M13偶聯的二抗(義翹神州，Cat No.11973-MM05-100，用於噬菌體篩選)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入50μL/孔TMB顯色受質(KPL，52-00-03)，於室溫孵育2-5分鐘(min)，加入50μL/孔MH2SO4終止反應，用VersaMax酶標儀在450nm處讀取
吸收值，計算抗ANGPTL3抗體對ANGPTL3抗原蛋白的結合的EC50值。實驗結果見表2，實驗結果顯示，本披露的抗ANGPTL3抗體能夠結合不同種屬的ANGPTL3蛋白。
表2. 抗ANGPTL3抗體與不同種屬ANGPTL3蛋白結合ELISA實驗
4.2 抗ANGPTL3抗體與ANGPTL3抗原蛋白的HTRF結合實驗
HTRF實驗同樣被用來檢測抗ANGPTL3抗體與抗原的結合活性。用生物素標記試劑盒(東仁化學，LK03)標記的帶HIS標簽的ANGPTL3(人ANGPTL3(17-460)-His，小鼠ANGPTL3(17-455)-His，食蟹猴ANGPTL3(17-460)-His，大鼠ANGPTL3(17-455)-His)與HTRF試劑Streptavidin-Tb cryptata(Cisbio，610SATLA)結合，抗體加入後，抗體會分別與HTRF試劑Pab抗小鼠IgG-XL665(Cisbio，61PAMXLA)以及血管生成素樣蛋白3結合，信號的強弱被用於判斷抗體和血管生成素樣蛋白3的結合活性。
用稀釋液(pH7.4 PBS含1%BSA)配置4μg/mL的生物素標記的人ANGPTL3(17-460)-His(序列如SEQ ID NO：1所示)，小鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：5所示)，食蟹猴ANGPTL3(17-460)-His(序列如SEQ ID NO：7所示)，大鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：8所示)，5μL/孔加入到384孔板中(PerkinElmer，optiplate-384)，然後加入5μL/孔的HTRF試劑Streptavidin-Tb cryptata以及Pab抗鼠IgG-XL665的混合液，最後加入10μL/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放在25℃孵育1小時。用PHERAstar
FS(BMG LabTECH)在HTRF模塊讀取數值，計算抗ANGPTL3抗體對血管生成素樣蛋白3的結合EC50值。實驗結果見表3，實施結果表明，本披露的抗體對人、小鼠、食蟹猴、大鼠等種屬的ANGPTL3抗原均具有良好的結合活性。
表3. 抗ANGPTL3抗體與ANGPTL3蛋白的HTRF結合實驗
4.3 抗ANGPTL3抗體抑制LPL的酶活實驗
LPL的酶活檢測實驗用來檢測抗ANGPTL3抗體阻斷ANGPTL3蛋白對LPL酶抑制作用的活性。
用稀釋緩衝液(pH7.4 PBS+2mg/mL BSA)稀釋牛LPL(Sigma，L2254-5KU)到12.5單位，25μL/孔加入到96孔板中(Corning，3603)，然後加入25μL/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，再加入25μL/孔濃度為27.6μg/mL的ANGPTL3蛋白(人ANGPTL3(17-170)-Flag-His(序列如SEQ ID NO：2)、小鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：5)、食蟹猴ANGPTL3(17-460)-His(序列如SEQ ID NO：7)、大鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：8)，將96孔板在振盪器上振盪混勻，37℃培養箱中孵育30min。最後加入25μL/孔用稀釋緩衝液稀釋的20μM的受質(Sigma，30058-10MG-F)，將96孔板在振盪器上振盪混勻，37℃培養箱中孵育30min。在Flexstation3酶標儀以Ex535/Em612讀數。用Graphpad Prism 5軟體處理濃度和對應螢光值數據，並計算IC50。實驗結果見表4，實施結果表明，本披露的抗體具有良好的LPL酶抑制作用。
表4. 抗ANGPTL3抗體阻斷不同種屬ANGPTL3抑制LPL的活性實驗結果
4.4 抗ANGPTL3抗體與ANGPTL3蛋白的Biacore檢測實驗
用Biacore測定待測抗ANGPTL3抗體和人、猴、大鼠及小鼠ANGPTL3的親和力。方法如下：
分別用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲一定量的待測抗體，然後於芯片表面流經一定濃度的人、猴、大鼠及小鼠的ANGPTL3抗原(人-ANGPTL3(R&D，3829-AN)、小鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：5)、食蟹猴ANGPTL3(17-460)-His(序列如SEQ ID NO：7)、大鼠ANGPTL3(17-455)-His(序列如SEQ ID NO：8))。利用Biacore T200儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，使用pH 1.5的甘胺酸-鹽酸再生溶液(Cat.#BR-1003-54，GE)將生物芯片洗淨再生。試驗運行緩衝液為1×HBS-EP緩衝溶液(Cat.# BR-1001-88，GE)。試驗得到的數據用GE Biacore T200評估軟體3.0版本以(1：1)Langmuir模型進行擬合，得出親和力數值。實驗結果見表5，實驗結果表明，本披露的抗ANGPTL3抗體能與人、食蟹猴、大鼠及小鼠的ANGPTL3抗原以高親和力結合。
表5. 抗ANGPTL3抗體與ANGPTL3蛋白的Biacore檢測實驗結果
實施例5、抗ANGPTL3抗體大鼠體內藥效評價
5.1 P8BG抗體在大鼠體內降脂實驗
實驗用SD大鼠於實驗室環境適應性飼養1週(4週齡SD大鼠，SPF，100g左右，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。合格證號：20170005013017，SCXK(滬)2017-0005)，給予12/12小時光/暗週期調節，溫度23±1℃，濕度40~50%，動物均給予標準滅菌鼠飼料，自由進食飲水。在實驗開始前7天，動物禁食4h後眼眶採血，3500RPM離心15min，取血清。利用ADVIA 2400化學系統(Siemens)測定血清脂質濃度(甘油三酯)。將大鼠按甘油三酯水平分6組(非相關同型人IgG蛋白(hIgG，以下同)作為陰性對照組、依維庫單抗(序列結構參見WHO Drug Information，Vol.29，No.3，2015中的依維庫單抗序列)3.5mpk組、依維庫單抗7mpk組、P8BG3.5mpk組、P8BG1.75mpk組、P8BG7mpk組)，每組6隻大鼠，皮下注射給藥一次，於注射後第1天、第5天、第9天、第13天和第16天將各組大鼠禁食4小時後採血分離血清，用ADVIA 2400化學系統(Siemens)測定血清脂質濃度(甘油三酯)。實驗數據表示為平均值±標準差(Mean±SEM)，並Graphpad Prism5軟體作圖，採用TTEST進行統計學分析。
實驗結果見圖1及表6所示，與陰性對照組相比，給藥1天後，各治療組甘油三酯均下降，除了依維庫單抗3.5mpk組，其餘各組均有統計差異，實驗過程中，P8BG 7mpk組的甘油三酯最大下降83.7%，P8BG 3.5mpk組甘油三酯最大下降81.8%，P8BG 1.75mpk組甘油三酯最大下降68.7%；給藥5天後，P8BG 3.5mpk組、P8BG 1.75mpk組、P8BG 7mpk組組甘油三酯下降仍有統計差異，而依維庫單抗3.5mpk組、依維庫單抗7mpk組無統計差異；給藥9天後，P8BG 7mpk組和P8BG 3.5mpk組仍有統計差異。這說明，同一劑量下P8BG比依維庫單抗的降甘油三酯效果更好也更為持久。而且實驗過程中各組動物體重正常。
表6. P8BG抗體對大鼠血清甘油三酯的影響
(註：Max Inh%表示相對於陰性對照組TG的最大降脂百分比，mpk表示mg/kg.)
5.2 在高脂高膽固醇餵養c57bl/6小鼠中測定抗ANGPTL3抗體對血漿脂質濃度的體內效應
c57bl/6小鼠按5隻/籠飼養(4週齡c57bl/6小鼠，SPF，16-18g左右，雄性，購自上海卡文斯實驗動物有限責任公司。合格證號：201913812，SCXK(蘇)2016-0010)，於實驗室環境適應性飼養4週，給予12/12小時光/暗週期調節，溫度23±1℃，濕度40~50%，動物均給予普通飼料餵養，自由進食飲水。預採血5天後將普通飼料換成高脂高膽固醇飼料(D12079B，購自：江蘇省協同醫藥生物
工程有限責任公司)餵養小鼠，直到實驗結束。在實驗開始前8天為動物禁食，禁食4小時後眼眶採血，8000RPM離心2min，收集血漿。利用ADVIA 2400化學系統(Siemens)測定血漿脂質濃度。將小鼠按甘油三酯水平分為4組(hIgG陰性對照組、依維庫單抗25mpk組、P8BG25mpk組、P8BG5mpk組)，每組11隻，皮下給藥，每週注射一次，共給藥8次。於實驗開始後第2週、3週、5週、7週、9週、10週和11週時，將各組小鼠禁食4小時後眼眶採血並收集血漿。利用ADVIA 2400化學系統(Siemens)測定血漿脂質濃度(甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)以及LDL膽固醇(LDL-C))。實驗數據表示為平均值±標準差(Mean±SEM)，並用Graphpad Prism5軟體作圖，採用TTEST進行統計學分析。
實驗結果見表7至表9和圖2-4所示，與hIgG陰性對照組相比，實驗第2週、3週、5週及7週後P8BG 25mpk組的TG、TC及LDL-C均顯著下降；依維庫單抗25mpk及P8BG5mpk組在實驗3週，5週及7週後TG、TC及LDL-C下降。實驗9週後，與hIgG陰性對照組相比，隻有P8BG25mpk和P8BG5mpk兩組甘油三酯顯著下降。與依維庫單抗25mpk組相比，實驗第2週，第3週，第9週，P8BG25mpk組的甘油三酯及總膽固醇均顯著下降；與依維庫單抗25mpk組相比，實驗第2週、第9週，P8BG25mpk組的LDL-C顯著下降。在第一至第11週的整個實驗週期中，依維庫單抗25mpk組TG最低降至40.5±2.3，與開始TG相比下降了32.60%；而P8BG25mpk組TG最低降至21.1±1.3，與開始TG相比下降了64.90%。這說明，P8BG抗體比依維庫單抗的降血脂效果更為有效且持久。
表7.抗ANGPTL3抗體對c57bl/6小鼠血漿TG的影響
(註：max Inh%表示相對於開始TG的最大降脂百分比)
表8.抗ANGPTL3抗體對c57bl/6小鼠血漿LDL的影響
(註：Max Inh%表示相對於陰性對照組LDL的最大降脂百分比)
表9.抗ANGPTL3抗體對c57bl/6小鼠血漿TC的影響
(註：Max Inh%表示相對於陰性對照組TC的最大降脂百分比)
5.3 在APOE小鼠中測定抗ANGPTL3抗體對血漿脂質濃度的體內效應
APOE小鼠按2隻/籠飼養(8週齡APOE小鼠，SPF，22g左右，雄性，購自上海卡文斯實驗動物有限責任公司。合格證號：201917260，SCXK(蘇)2016-0010)，於實驗室環境適應性飼養4週，給予12/12小時光/暗週期調節，溫度23±1℃，濕度40~50%，動物均給予高脂飼料(D12108C)餵養，自由進食飲水。在實驗開始前7天為動物禁食，禁食4小時(h)後眼眶採血，8000RPM離心2分
鐘(min)，收集血漿。利用ADVIA 2400化學系統(Siemens)測定血漿脂質濃度。將小鼠按甘油三酯水平分為5組(hIgG陰性對照組、依維庫單抗10mpk組、依維庫單抗5mpk組、P8BG10mpk組、P8BG5mpk組)，每組8隻，分別皮下注射給藥一次(各組給藥劑量見表6)，給藥後的第1天(d)、第7天及第11天分別將各組小鼠禁食4小時後眼眶採血，收集血漿，利用ADVIA 2400化學系統(Siemens)測定血漿脂質濃度(甘油三酯、HDL膽固醇)。實驗數據表示為平均值±標準差(Mean±SEM)，並用Graphpad Prism5軟體作圖，採用TTEST進行統計學分析。
本次實驗結果見圖5、6和表10所示，與hIgG陰性對照組相比，給藥1d後，各治療組甘油三酯均下降，依維庫單抗(10mpk)組甘油三酯最低降至65.6±5.4mg/dL，與開始TG值相比下降了46.2%，依維庫單抗(8mpk)組甘油三酯最低降至71.8±3.3mg/dL，與開始TG值相比下降了42.1%，P8BG(10mpk)組甘油三酯最低降至33.3±2.2mg/dL，與開始TG值相比下降了72.9%，P8BG(5mpk)組甘油三酯最低降至37.0±1.7mg/dL，與開始TG值相比下降了70.2%。另外，實驗結果顯示，給藥1天後P8BG10mpk組的血漿HDL-C有所升高，依維庫單抗10mpk組血漿HDL-C下降，而在降脂實驗中，通常並不希望降脂的同時引起HDL-C的下降。
表10. 抗ANGPTL3抗體對APOE小鼠血漿甘油三酯的影響
(註：max Inh%表示相對於開始TG的最大降脂百分比)
實施例6、抗ANGPTL3抗體藥物代謝動力學評價
6.1 抗ANGPTL3抗體小鼠體內藥物代謝動力學實驗
體重18-24g的C57BL/6小鼠(購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司)。實驗室環境適應性飼養不小於3天，12/12小時光/暗週期調節，溫度16-26℃，相對濕度40-70%，飼養期間自由攝取飼料和水。實驗開始前一天，對C57BL/6小鼠進行編號，隨機分組，每組3隻。實驗當天，每組小鼠分別靜脈注射受試藥物P8BG和依維庫單抗，給藥劑量為10mg/kg；註射體積均為5mL/kg。
給藥組於給藥前及給藥後5min、8h、1 d、2 d、4 d、7 d、10d、14 d、21 d、28d採集全血0.1mL，不加抗凝，取血後在4℃放置30min，1000g離心15min，取上清(血清)置於EP管中，於-80℃保存。
採用ELISA方法檢測血清中的抗體濃度，採用Winnolin軟體計算受試藥物的藥動學參數。所得主要藥動學結果見表11和圖7。實驗結果表明本披露的P8BG抗體在小鼠體內的半衰期高於陽性對照依維庫單抗。
表11. 抗ANGPTL3抗體在小鼠藥物代謝動力學
(註：AUC0-∞：藥時曲線下面積；t1/2(h)：半衰期(以小時為單位)；t1/2(d)：半衰期(以天為單位)；i.v.靜脈內註射。)
6.2 抗ANGPTL3抗體在食蟹猴體內的藥物代謝動力學評價
使用體重3-4kg的食蟹猴(購自廣東前沿生物科技有限公司)。動物轉入實驗前至少進行14天的檢疫馴養。動物飼養於不銹鋼籠具中，每組每籠不超過2隻。動物房的室溫控制在18℃~26℃，相對濕度在40%~70%，光照12小時明暗交替。實驗過程中動物自由攝水。根據生化指標將6隻食蟹猴中隨機分成2組，每組3隻動物。每組分別皮下注射受試藥物P8BG和依維庫單抗，給藥劑量為10mg/kg；注射體積均為2mL/kg。
分組後動物禁食過夜，分別於給藥前、給藥開始後1小時(h)、2 h、4 h、8 h、12 h、1天(d)、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21d、28 d、35 d、42 d、49 d和56 d於下肢靜脈取血2mL左右，置含分離膠的採血管中，取血後於室溫放置30分鐘(min)，1000g離心15min，取上清分裝於2個乾淨的EP管中，-70℃以下暫存(採血後2 h內完成)。採用ELISA方法檢測血清中的抗體濃度，採用Winnolin軟體計算受試藥物的藥動學參數。所得主要藥動學結果見表12和圖8。實驗結果表明本披露的P8BG抗體在食蟹猴體內的半衰期高於陽性對照依維庫單抗。
表12. 抗ANGPTL3抗體在食蟹猴藥物代謝動力學
(註：AUC0-∞：藥時曲線下面積；t1/2(h)：半衰期(以小時為單位)；t1/2(d)：半衰期(以天為單位)；sc.皮下注射。)
實施例7、示例性抗體醫藥組成物(製劑)製備工藝
第一步：抗ANGPTL3抗體與穩定劑配製成含抗ANGPTL3抗體的製劑原液，經過濾後中控取樣檢測無菌。將原液過0.22μm PVDF濾芯，收集濾液。
第二步：調節裝量進行灌裝(灌裝量和包材待定)，加塞，分別於灌裝開始、灌裝中間、灌裝結束時取樣中控檢測裝量差異。
第三步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。
第四步：目檢，確認產品無裝量不准等缺陷。打印、黏貼西林瓶標簽；打印紙盒標簽，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標簽。
實施例7-13中所用的抗ANGPTL3抗體是P8BG抗體，其重鏈序列如SEQ ID NO：21所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：22所示。
實施例8、抗ANGPTL3抗體製劑pH值的篩選
配製下列緩衝液，製備抗ANGPTL3抗體濃度為1.0mg/mL的抗體製劑，藉由測定樣品的熔解溫度(Tm)、熱分解起始溫度(Tonset)，考察抗ANGPTL3抗體在不同pH條件下的熱穩定性，藉由測定樣品的聚集溫度(Tagg)及粒徑(Radius)，考察抗ANGPTL3抗體在不同pH條件下的膠體穩定性。
1)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 4.2
2)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 4.6
3)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 5.0
4)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 5.4
5)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 5.8
6)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.2
7)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.6
8)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 7.0
9)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 7.4
10)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 7.8
11)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 8.2
12)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 8.6
表13. 抗ANGPTL3抗體pH值篩選結果
(註：%PD表示分散係數，值越小，表明粒徑分佈越均一；N/A表示不適用)
結果顯示：抗ANGPTL3抗體在pH值為5.0±0.4條件下，Tagg和Tonset值較高；在pH值為6.2±0.4條件下，粒徑較小，分佈更均一，且Tm1值較高，表明該抗體在pH值為5.0±0.4和6.2±0.4條件下熱穩定性和膠體穩定性較好。
實施例9、抗ANGPTL3抗體製劑緩衝體系的篩選和確認
9.1 pH 6.0緩衝體系篩選
選擇10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH 6.0、10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.0的緩衝體系，製備含50mg/mL抗ANGPTL3抗體的製劑，取樣品進行高溫(40℃)和室溫(25℃)穩定性研究：
1)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH 6.0
2)10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.0
表14. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.0)篩選穩定性結果1
(註：此表為抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.0)篩選0時樣品穩定性結果)
表15. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.0)篩選穩定性結果2
(註：1W表示1週；粒徑反映膠體穩定性；%PD表示分散係數)
表16. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.0)篩選穩定性結果3
(註：1W表示1週)
結果顯示：相同考察條件下，相比於10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH 6.0緩衝體系，抗ANGPTL3抗體在10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.0緩衝體系Tagg值更高，粒徑更小，聚體含量更低，表明抗ANGPTL3抗體在10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.0緩衝體系穩定性更好。
9.2 pH6.6緩衝體系的篩選
選擇10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH 6.6、10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.6的緩衝體系，製備含50mg/mL抗ANGPTL3抗體的製劑，取樣品進行高溫(40℃)和室溫(25℃)穩定性研究：
1)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH 6.6
2)10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.6
表17. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.6)篩選穩定性結果1
(註：此表為抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.6)篩選0時樣品穩定性結果)
表18. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.6)篩選穩定性結果2
(註：1W表示1週；粒徑反映膠體穩定性；%PD表示分散係數)
表19. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 6.6)篩選穩定性結果3
(註：1W表示1週)
結果顯示：相同考察條件下，相比於10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH 6.6緩衝體系，抗ANGPTL3抗體在10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.6緩衝體系Tonset值更低，Tagg值更高，粒徑相對更大，但聚體含量相對更低，單體和主峰含量相對更高，綜合考慮抗ANGPTL3抗體在10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH 6.6緩衝體系穩定性更好。
9.3 pH4.6緩衝體系的篩選
選擇10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH 4.6、10mM醋酸-醋酸鈉pH 4.6的緩衝體系，製備含50mg/mL蛋白的抗體製劑，取樣品進行高溫(40℃)和室溫(25℃)穩定性研究：
1)10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH 4.6
2)10mM醋酸-醋酸鈉pH 4.6
表20. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 4.6)篩選穩定性結果1
(註：此表為抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 4.6)篩選0時樣品穩定性結果；N/A表示不適用)
表21. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 4.6)篩選穩定性結果2
(註：1W表示1週；粒徑反映膠體穩定性；%PD表示分散係數；N/A表示不適用)
表22. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 4.6)篩選穩定性結果3
(註：1W表示1週)
結果顯示：相同考察條件下，相比於10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH 4.6緩衝體系，抗ANGPTL3抗體在10mM醋酸-醋酸鈉pH 4.6緩衝體系Tm1值更低，但Tonset值更高，粒徑更小，且聚體含量更低，表明抗ANGPTL3抗體在10mM醋酸-醋酸鈉pH 4.6緩衝體系穩定性更好。
9.4 pH5.0緩衝體系的篩選
選擇10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH 5.0、10mM醋酸-醋酸鈉pH 5.0的緩衝體系，製備含50mg/mL抗ANGPTL3抗體的製劑，取樣品進行高溫(40℃)和室溫(25℃)穩定性研究：
1)10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH 5.0
2)10mM醋酸-醋酸鈉pH 5.0
表23. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 5.0)篩選穩定性結果1
(註：此表為緩衝體系(pH 5.0)篩選0時樣品穩定性結果；N/A表示不適用)
表24. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 5.0)篩選穩定性結果2
(註：1W表示1週；粒徑反映膠體穩定性；%PD表示分散係數)
表25. 抗ANGPTL3抗體緩衝體系(pH 5.0)篩選穩定性結果3
(註：1W表示1週)
結果顯示：相同考察條件下，相比於10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH 5.0緩衝體系，抗ANGPTL3抗體在10mM醋酸-醋酸鈉pH 5.0緩衝體系Tm1值、Tonset值、Tagg值更高，且粒徑更小，聚體含量更低，單體和主峰含量更高，表明抗ANGPTL3抗體在10mM醋酸-醋酸鈉pH 5.0緩衝體系穩定性更好。
抗ANGPTL3抗體緩衝體系篩選結果顯示：抗ANGPTL3抗體在10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH4.6、10mM醋酸-醋酸鈉pH4.6、10mM醋酸-醋酸鈉pH5.0緩衝體系外觀較好，且Tm1、Tagg及Tonset值較高，但在高溫40℃條件下，聚體明顯增加；在10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH6.0緩衝體系外觀較差，Tm1、Tagg及Tonset值較高，高溫條件下，聚體無明顯增加。考慮到緩衝體系篩選所用樣品為混合樣品，為進一步確認最終pH和緩衝體系，用單株抗體樣品進行緩衝體系確認。
9.5 抗ANGPTL3抗體製劑緩衝體系的確認
選擇10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH6.0、10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH4.6、10mM醋酸-醋酸鈉pH4.6、10mM醋酸-醋酸鈉pH5.0的緩衝體系，製備含50mg/mL抗ANGPTL3抗體的製劑，取樣品進行高溫60℃和40℃穩定性研究：
1)10mM組胺酸-鹽酸組胺酸，pH6.0；
2)10mM琥珀酸-琥珀酸鈉，pH4.6；
3)10mM醋酸-醋酸鈉，pH4.6；
4)10mM醋酸-醋酸鈉，pH5.0；
表26. 抗ANGPTL3抗體製劑緩衝體系確認結果1
(註：h表示小時；d表示天；粒徑反映膠體穩定性；%PD表示分散係數；NT表示未檢測；Imcompleted表示樣品較差，導致儀器未能成功檢測)
表27. 抗ANGPTL3抗體製劑緩衝體系確認結果2
(註：h表示小時；d表示天；NT表示未檢測)
結果表明：相比於10mM琥珀酸-琥珀酸鈉pH4.6和10mM醋酸-醋酸鈉pH4.6緩衝體系，抗ANGPTL3抗體在10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH6.0、10mM醋酸-醋酸鈉pH5.0緩衝體系下穩定性更好；而在10mM組胺酸-鹽酸組胺酸pH6.0緩衝體系下，呈顯著乳光，且加聚山梨酯80後外觀無改善。
實施例10、抗ANGPTL3抗體製劑中糖濃度的篩選
選擇10mM醋酸-醋酸鈉pH5.0的緩衝體系，製備含不同糖濃度的緩衝體系或抗ANGPTL3抗體製劑：
1)10mM醋酸-醋酸鈉，pH 5.0；
2)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，60mg/mL蔗糖，pH5.0；
3)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，70mg/mL蔗糖，pH5.0；
4)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，75mg/mL蔗糖，pH5.0；
5)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，80mg/mL蔗糖，pH5.0；
6)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，90mg/mL蔗糖，pH5.0；
7)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，80mg/mL蔗糖，pH5.0；
以上1)至7)中，均含有100mg/mL的抗ANGPTL3抗體。
各樣品滲透壓結果見下表：
表28. 抗ANGPTL3抗體不同蔗糖濃度滲透壓結果
根據滲透壓結果，蔗糖的可用濃度為60-90mg/mL，例如蔗糖濃度為75mg/mL，用以製備等滲的抗ANGPTL3抗體製劑。
實施例11、抗ANGPTL3抗體製劑中表面活性劑濃度的篩選
選擇10mM醋酸-醋酸鈉，製備含100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，不同濃度聚山梨酯80的製劑，並考察震盪、凍融、光照、高溫條件下抗體穩定性。
1)10mM醋酸-醋酸鈉，0.1mg/mL聚山梨酯80，75mg/mL蔗糖，抗ANGPTL3抗體濃度100mg/mL，pH 5.0
2)10mM醋酸-醋酸鈉，0.4mg/mL聚山梨酯80，75mg/mL蔗糖，抗ANGPTL3抗體濃度100mg/mL，pH 5.0
表29. 不同濃度表面活性劑製劑穩定性結果1
(註：h表示小時；W表示週；RT表示室溫；粒徑反映膠體穩定性；%PD表示分散係數；NT表示未檢測)
表30. 不同濃度表面活性劑製劑穩定性結果2
(註：h表示小時；W表示週；RT表示室溫)
結果表明：含0.1mg/mL或0.4mg/mL聚山梨酯80的抗ANGPTL3抗體製劑，在震盪、凍融、光照、高溫條件下，穩定性無明顯差異，因此，抗ANGPTL3抗體製劑中聚山梨酯80可用的濃度範圍為0.1mg/mL~0.4mg/mL。
實施例12、製劑pH對穩定性的影響
選擇10mM醋酸-醋酸鈉，製備含75mg/mL蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，抗ANGPTL3抗體濃度100mg/mL，pH分別為5.0和5.4的製劑，考察震盪、凍融、光照、高溫條件下抗體製劑穩定性。
1)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，75mg/mL蔗糖，抗ANGPTL3抗體濃度100mg/mL，pH5.0
2)10mM醋酸-醋酸鈉，0.2mg/mL聚山梨酯80，75mg/mL蔗糖，抗ANGPTL3抗體濃度100mg/mL，pH5.4
表31. 製劑pH對穩定性影響考察結果1
(註：h表示小時；W表示週；RT表示室溫；粒徑反映膠體穩定性；%PD表示分散係數)
表32. 製劑pH對穩定性影響考察結果2
(註：h表示小時；W表示週；RT表示室溫)
結果表明：與0時相比，在震盪、凍融、光照、高溫條件下，pH5.0和5.4製劑的蛋白變化趨勢相近，因此，抗ANGPTL3抗體製劑pH的範圍定為5.0~5.4。
0.1mg/mL聚山梨酯80和0.4mg/mL聚山梨酯80，對抗體穩定性的影響不是很大，所以製劑可用的聚山梨酯80濃度範圍為0.1~0.4mg/mL；pH值5.0和5.4對抗體穩定性的影響不是很大，所以製劑可用pH範圍為5.0~5.4；抗ANGPTL3抗體濃度定為100mg/mL。
實施例13、可選擇的製劑配方
此外，本揭露還提供其它製劑配方的抗ANGPTL3抗體藥物製劑，包含但不限於：
(1)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.1mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.0；
(2)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.0；
(3)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.0；
(4)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.1mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.2；
(5)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.2；
(6)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.2；
(7)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.1mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.4；
(8)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.4；
(9)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液pH5.4；
(10)80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL或150mg/mL抗ANGPTL3抗體，75mg/mL蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4；
(11)100mg/mL抗ANGPTL3抗體，60mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL或90mg/mL蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH為5.0至5.4。
實驗結果表明，上述製劑配方的抗ANGPTL3抗體製劑均具有良好的穩定性，可應用於抗ANGPTL3抗體藥物的配製。
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Claims (19)
- 一種醫藥組成物，其包含抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，以及緩衝劑，其中該緩衝劑選自醋酸-醋酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鈉、組胺酸-鹽酸鹽和枸檢酸-枸櫞酸鈉緩衝劑中的任一種，較佳為醋酸-醋酸鈉或琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑；其中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的pH為4.0至7.0，較佳為5.0至5.4，最佳為約5.2。
- 如請求項1或2所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑濃度為5mM至40mM，較佳為5mM至20mM，最佳為約10mM。
- 如請求項1至3中任一項所述的醫藥組成物，其中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的濃度為10mg/mL至200mg/mL，較佳為80mg/mL至120mg，最佳為約100mg/mL。
- 如請求項1至4中任一項所述的醫藥組成物，其還包含表面活性劑；該表面活性劑較佳為聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更佳為聚山梨醇酯80。
- 如請求項5所述的醫藥組成物，其中該表面活性劑的濃度為0.05mg/mL至0.6mg/mL，較佳為0.1mg/mL至0.4mg/mL，更佳為約0.2mg/mL。
- 如請求項1至6中任一項所述的醫藥組成物，其還包括穩定劑，其中該穩定劑為糖；較佳地，該糖選自蔗糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇；更佳地，該糖為蔗糖。
- 如請求項7所述的醫藥組成物，其中該糖的濃度為60mg/mL至90mg/mL，較佳為70mg/mL至80mg/mL，最佳為約75mg/mL。
- 如請求項1至8中任一項所述的醫藥組成物，其包含：(a)10mg/mL至200mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的醋酸鹽緩衝液，(c)60mg/mL至90mg/mL的蔗糖，(d)0.05mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨醇酯80，該醫藥組成物的pH較佳為4.5至6.5，更佳為5.0至5.4。
- 如請求項1至9中任一項所述的醫藥組成物，其包含：(a)約100mg/mL的抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至15mM的醋酸-醋酸鈉緩衝液，(c)60mg/mL至90mg/mL的蔗糖，(d)0.1mg/mL至0.4mg/mL的聚山梨醇酯80，該醫藥組成物的pH較佳為5.0至5.4，更佳為約5.2。
- 如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物，其中該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體；較佳地，該人源抗體的輕鏈和重鏈FR序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈的FR。
- 如請求項1至11中任一項所述的醫藥組成物，其中該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示或與之具有至少90%序列同一性，和 該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示或與之具有至少90%序列同一性。
- 如請求項1至12中任一項所述的醫藥組成物，其中抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈和輕鏈，其中該重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示或與之至少90%序列同一性，且該輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示或與之具有至少90%序列同一性。
- 一種製備如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物的方法，包括將該抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段原液經緩衝劑置換的步驟，其中該緩衝劑較佳為醋酸-醋酸鈉緩衝劑。
- 一種含抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑，該凍乾製劑藉由將如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得；較佳地，該冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。
- 一種含有抗ANGPTL3抗體或其抗原結合片段的複溶溶液，其中該複溶溶液是藉由將如請求項15所述的凍乾製劑經複溶獲得。
- 一種製品，其包括容器，該容器中裝有如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物，或如請求項15所述的凍乾製劑，或如請求項16所述的複溶溶液。
- 一種如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物，或如請求項15所述的凍乾製劑、或如請求項16所述的複溶溶液在製備用於治療和/或預防疾病或病症的藥物中的用途；較佳地，該疾病或病症選自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂異常、心血管疾病或病症、癌症或腫瘤、非腫瘤性血管生成相關疾病或病症、以及炎性疾病或病症中的一種或多種；更佳地，該疾病或病症選自動脈粥樣硬化性血脂異常、糖尿病性血脂異常、高甘油三酸酯血症、高膽固醇血症、乳糜微粒血症、混合血脂異常、脂肪營養不良、脂肪萎縮、動脈粥樣硬化、動脈瘤、高血壓、心絞痛、中風、腦血管疾病、充血性心衰竭、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、周圍血管疾病、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血糖異常、年齡相關性黃斑變性、視網膜中央靜脈阻塞或視網膜分支靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、關節炎、類風濕性關節炎(RA)和牛皮癬中的一種或多種。
- 一種治療和/或預防疾病或病症的方法，包括向有需要的受試者施用如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物，或如請求項16所述的複溶溶液；較佳地，該疾病或病症選自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂異常、心血管疾病或病症、癌症或腫瘤、非腫瘤性血管生成相關疾病或病症、以及炎性疾病或病症中的一種或多種；更佳地，該疾病或病症選自動脈粥樣硬化性血脂異常、糖尿病性血脂異常、高甘油三酸酯血症、高膽固醇血症、乳糜微粒血症、混合血脂異常、脂肪營養不良、脂肪萎縮、動脈粥樣硬化、動脈瘤、高血壓、心絞痛、中風、腦血管疾病、充血性心衰竭、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、周圍血管疾病、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血糖異常、年齡相關性黃斑變性、視網膜中央靜脈阻塞 或視網膜分支靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、關節炎、類風濕性關節炎(RA)和牛皮癬中的一種或多種。
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