CN109952093B

CN109952093B - 一种sost抗体药物组合物及其用途

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Publication number: CN109952093B
Application number: CN201880004380.2A
Authority: CN
Inventors: 方晶晶; 颜贞; 刘洵
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: MX2020000582A; UA127219C2; RU2020100596A3; EP3659586A1; CN109952093A; CA3069392A1; US11498961B2; JP2020528411A; EP3659586A4; ZA202000238B; EP3659586B1; AU2018305613A1; KR20200034748A; RU2020100596A; BR112020001203A2; TW201909913A; WO2019020069A1; US20200199209A1

Abstract

一种药物组合物，其包含在醋酸‑醋酸钠缓冲液中的SOST抗体或其抗原结合片段。除此之外，该药物组合物还可含有糖、非离子型表面活性剂和其他辅料。所述药物组合物在储存数月之后展现了良好的抗体稳定性。

Description

一种SOST抗体药物组合物及其用途

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种包含SOST抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为药物的用途。

背景技术

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)包括绝经后妇女骨质疏松症(PostmenopausalOsteoporosis，PMO)和老年性骨质疏松症，是一种以低骨量和骨微结构退化为特征，造成骨强度下降、骨脆性增加、易于发生骨折的全身性骨代谢障碍性疾病。据统计，全球约有2亿人骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。我国60岁以上老年女性骨质疏松症的患病率高达60％，男性患病率也在40-50％。

除了加强运动、服食钙片和维生素D、普及骨折预防知识等传统措施之外，现行的药物治疗主要局限于减少骨吸收以防止骨折。抗骨吸收类药物包括有降钙素、双磷酸盐、雌激素替代剂和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)等。这些以双磷酸盐为代表的骨吸收抑制剂尽管能够阻止进一步的骨质流失，却无法重建已经流失的骨质，并且在抑制骨吸收的同时，同样抑制骨生成。激素类药物更加有着引起静脉血栓和诱发心血管疾病的风险。更重要的是，真正意义上的骨合成代谢药不但可以提高骨量，还应该能够有效改善骨微结构并促进骨生成，而这一点恰恰是目前抗骨吸收类药物所不具备的。在过去的15年时间里，各种旨在降低骨折风险的医疗措施经系统化研究进入临床试验阶段，而实际可选用药依然十分匮乏。迄今为止，只有甲状旁腺激素(PTH)类药物被证明可以刺激骨生成，但是，其诸多缺点也是有目共睹的。譬如，它对于骨再造的作用并不持久、对于骨折修复作用不大、需要每天皮注给药一年以上，而且只能低剂量给药、价格昂贵、使用期不得超过两年以及其暴露的安全性问题遭到美国FDA的黑框警告等等。

硬骨素(Sclerostin)作为新的生物靶点用于药物开发，其原理是可以通过调节成骨细胞合成代谢治疗骨质疏松，该靶点填补通过调控骨代谢方式治疗骨质疏松领域空白。

硬骨素是SOST基因表达分泌的糖蛋白，其氨基酸序列的结构特征在于190个残基以及带有半胱氨酸的环状结构域。已证实其表达主要在骨细胞中进行，而在成骨细胞、软骨、肝、肾、骨髓、心脏、胰脏等位置只有很低程度的表达。

研究表明，硬骨素通过结合低密度脂蛋白受体LRP5/6抑制Wnt信号传导调控骨生成。目前有几家公司针对该靶点开发的单克隆抗体药物分别已经进入临床III，II期。三个公司的临床数据均证明该靶点通过调控骨代谢治疗骨质疏松的作用机理以及其安全性和显著药效。其中，Amgen和UCB公司联合推出的抗硬骨素抗体Romosozumab的临床报告显示其安全性和耐受性良好，受试体骨密度较空白组显著提高。该药已经推进到临床三期阶段。Lilly和Novartis公司分别推出的两个单抗药已处于临床二期阶段。这些抗体的适用症均为骨质疏松/骨质疏松症以及骨损伤/相关骨病治疗等。值得一提的是，有研究表明，抗硬骨素抗体与传统的双磷酸盐类药物治疗并不冲突，有联用的可能。

但是，抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定。为了使抗体适合于给药，并且在储存及随后使用过程中能保持稳定性，发挥更好的效果，抗体药物的稳定制剂研究显得尤为重要。

尽管，目前有多家公司在研发包含SOST抗体及药物制剂，如：WO2016145961、WO2012028683、WO2012135035等。但对于新的SOST抗体，仍需要研制更适于给药的包含SOST的药物(制剂)组合物。

发明内容

本发明提供一种药物组合物，其包含SOST抗体或其抗原结合片段，以及缓冲液，所述缓冲液选自醋酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液，优选为醋酸盐缓冲液，更优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。

在可选的实施方案中，在药物组合物中，所述SOST抗体或其抗原结合片段浓度(即，配制于缓冲液中SOST抗体或其抗原结合片段的浓度)为约1mg/ml至120mg/ml，优选约为60mg/ml至120mg/ml，还优选约为80至120mg/ml，更优选约为90至110mg/ml，进一步优选为80-100mg/ml。非限制性实施例包括90mg/ml、91mg/ml、92mg/ml、93mg/ml、94mg/ml、95mg/ml、96mg/ml、97mg/ml、98mg/ml、99mg/ml、100mg/ml、101mg/ml、102mg/ml、103mg/ml、104mg/ml、105mg/ml、106mg/ml、107mg/ml、108mg/ml、109mg/ml、110mg/ml，最优选约为100mg/ml。

在可选的实施方案中，缓冲液的浓度约为5mM至30mM，优选约为10mM至20mM，非限制性实施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM，最优选约为10mM。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述缓冲液的pH值约为4.8到5.5，优选约为5.0至5.5，在非限制性实施例中还可以是约为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5，最优选约为5.0。本发明的缓冲液配制药物组合物后，所得的药物组合物的最终PH值大约比缓冲液PH值高0.2-0.3。因此，在可选的实施方案中，本发明药物组合物的pH值约为4.8到5.5，优选约为5.0至5.5，在非限制性实施例中还可选约为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5，最优选约为5.2，5.3。

进一步地，在可选的实施方案中，药物组合物还包含糖。本发明的“糖”包含常规组合物(CH₂O)_n及其衍生物，包括单糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，还原性糖，非还原性糖等。可选自葡萄糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，果糖，麦芽糖，右旋糖苷，甘油，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇，sylitol，山梨糖醇，甘露醇，密里二糖，松三糖，蜜三糖，甘露三糖，水苏糖，麦芽糖，乳果糖，麦芽酮糖，山梨醇，麦芽糖醇，乳糖醇，异-麦芽酮糖等。优选的糖为非还原性二糖，更优选为海藻糖或蔗糖。

在可选的实施方案中，药物组合物中糖的浓度约为40mg/ml至95mg/ml，优选约为60mg/ml至90mg/ml，非限制性实施例包括60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml，更优选约为80mg/ml。

在可选的实施方案中，药物组合物还包含表面活性剂。可选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、硬脂基-肌氨酸、亚油基-、肉豆蔻基-、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-、柯卡酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等等。优选的表面活性剂为聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更优选为聚山梨醇酯80。

在可选的实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度约为0.02mg/ml至0.8mg/ml，优选约为0.3mg/ml至0.6mg/ml，非限制性实施例包括0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml，更优选约为0.4mg/ml。

在可选的实施方案中，药物组合物还包含粘度调节剂。所述粘度调节剂可选自钙盐、氯化钠、氯化镁、精氨酸盐酸，优选为氯化钙、醋酸钙。

在可选的实施方案中，药物组合物中钙盐的浓度优选约为4.5mM至20mM，优选约为4.5mM至10mM，非限制性实施例包括4.5mM、5mM、5.5mM、6.0mM、6.5mM、7.0mM、7.5mM、8.0mM、8.5mM、9.0mM、9.5mM、10mM，更优选约为4.5mM。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)1至120mg/ml的SOST抗体或其抗原结合片段，

(b)5至30mM的醋酸盐缓冲液，

(c)40至95mg/ml的海藻糖，

(d)0.02至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，

(e)4.5至20mM的钙盐，优选所述药物组合物的pH约为4.8至5.5，更优选约为5.0至5.2。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)90至110mg/ml的SOST抗体或其抗原结合片段，

(b)10至20mM的醋酸盐缓冲液，

(c)60至90mg/ml的海藻糖，

(d)0.3至0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，

(e)4.5至10mM的钙盐，优选所述药物组合物的pH为5.0至5.2。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)100mg/ml的SOST抗体或其抗原结合片段，

(b)10mM的醋酸钠缓冲液，

(c)80mg/ml的海藻糖，

(d)0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，

(e)4.5mM的钙盐，优选所述药物组合物的pH为5.0，所述醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)80至100mg/ml的SOST抗体或其抗原结合片段，和

(b)10至20mM的醋酸盐缓冲液，且所述药物组合物的pH为5.0至5.2。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)100mg/ml的SOST抗体或其抗原结合片段，

(b)10mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5.0

(c)80mg/ml的海藻糖，

(d)0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，

(e)4.5mM的氯化钙。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述SOST抗体或抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在可选的实施方案中，所述SOST抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：10所示的重链可变区，和如SEQ ID NO：13所示的轻链可变区。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述抗体或抗原结合片段可选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述SOST抗体的轻链与Ab-5的抗体轻链氨基酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性，所述SOST抗体的重链氨基酸序列与Ab-5的抗体重链具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性，所述Ab-5抗体轻链序列如SEQ ID NO：25所示，Ab-5抗体重链序列如SEQ ID NO：22所示。

本发明还提供一种制备含SOST抗体的冻干制剂的方法，其中包括将前述药物组合物经冷冻干燥的步骤。

在可选的实施方案中，制备含SOST抗体的冻干制剂的方法中所述冷冻干燥包括依次的预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。所述的预冻为从5℃冻至-40℃至-50℃，最优为-45℃，对真空度不作要求。所述的一次干燥温度为-30℃至0℃，最优为-27℃；真空度0.05mBar-0.2mBar，最优为0.1mBar。二次干燥温度20℃-30℃，最优为25℃，真空度从0.05mBar-0.2mBar，最优为0.1mBar，降至真空度0.005mBar-0.02mBar，最优为0.01mBar。

本发明还提供一种经前述制备含SOST抗体的冻干制剂的方法制备所得的含SOST抗体的冻干制剂。

在一些实施方案中，该冻干制剂于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。

本发明还提供制备含有SOST抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法，其中包括将前述冻干制剂经复溶的步骤，其复溶所用溶液选自但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液。本发明所述的复溶是指将低压冻干的蛋白制剂溶解在稀释剂(选自但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液)中，使得所述蛋白分散在重构的制剂中，即可得到相应的复溶溶液。

本发明还提供一种经前述含有SOST抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法制备所得含有SOST抗体的冻干制剂的复溶溶液。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中所述SOST抗体或其抗原结合片段浓度为80mg/ml至100mg/ml；最优选为100mg/ml。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中所述复溶溶液的pH为4.8至5.5，优选为5.3。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中还包括醋酸-醋酸钠缓冲液，所述醋酸-醋酸钠缓冲液浓度为10mM至30mM，优选为10mM。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中还包括二糖，所述二糖选自海藻糖或蔗糖。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中所述二糖浓度为45mg/ml至90mg/ml，优选为75mg/ml至80mg/ml，最优选为80mg/ml。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中还包括表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨醇酯，优选为聚山梨醇酯80。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中表面活性剂的浓度为0.3mg/ml至0.6mg/ml，优选为0.4mg/ml。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中还包括粘度调节剂，其中所述粘度调节剂选自钙盐、氯化钠、氯化镁或精氨酸盐酸盐，优选地，所述钙盐选自氯化钙或醋酸钙。

在可选的实施方案中，所述的含有SOST抗体的复溶溶液，其中所述的钙盐的浓度为4.5mM至20mM，优选4.5mM至10mM，最优选为4.5mM。

本发明还涉及一种含SOST抗体的冻干制剂，所述的冻干制剂复溶后可形成前述的药物组合物。

本发明进一步提供一种制品或试剂盒，其包含装有本文所述任何稳定的药物组合物的容器。在一些实施方案中，该玻璃瓶为中性硼硅玻璃管制注射剂瓶。

本发明还提供前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液在制备用于治疗治疗SOST相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症选自骨质疏松症、骨质减少或骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病或障碍，优选为骨质疏松症。

本发明还提供一种治疗和预防SOST相关的疾病或病症的方法，包括给予所需患者治疗有效量的前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液，其中所述的疾病或病症选自骨质疏松症、骨质减少或骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病或障碍，优选为骨质疏松症。

本发明还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液。

要理解，可以组合本文所述各个实施方案的一项、一些或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员是显而易见的。本发明的这些和其它实施方案通过下面的详述进一步描述。

具体实施方式

一、术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲液。将pH控制在适当范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。

“组氨酸缓冲液”是包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲液，优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。组氨酸-盐酸盐缓冲液是组氨酸与盐酸或组氨酸与组氨酸盐酸盐配制而成。

“柠檬酸盐缓冲液”是包括柠檬酸根离子的缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的实例包括柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-柠檬酸钾、柠檬酸-柠檬酸钙、柠檬酸-柠檬酸镁等。优选的柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

“琥珀酸盐缓冲液”是包括琥珀酸离子的缓冲液。琥珀酸盐缓冲液的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。优选的琥珀酸盐缓冲液为琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液。

“磷酸盐缓冲液”是包括磷酸离子的缓冲液。磷酸盐缓冲液的实例包括磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钾等。优选的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钠缓冲液。

“醋酸盐缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的实例包括醋酸-醋酸钠、醋酸-组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸-醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。

“粘度调节剂”是为调节制剂的粘度而加入的常规药用物料，此处所指的粘度调节剂主要是指无机盐和氨基酸盐，优选地，无机盐选自氯化钠、氯化钙、氯化镁或醋酸钙，优选地，所述氨基酸盐选自精氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、甘氨酸盐酸盐、组氨酸醋酸盐等。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。

本发明中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。

“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或溶液制剂经过真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。

本发明的冷冻干燥包括预冻，一次干燥，二次干燥。预冻目的是冷冻产品，获得结晶固体。预冻温度和预冻速度是两个重要工艺参数，本发明中将预冻温度设定为-45℃，预冻速度设定为1℃/min。一次干燥也称为主干燥，是样品冷冻干燥的主要阶段。目的是移除产品里冰的同时，保持产品形状，最小程度的减少对产品的破坏。若一次干燥的温度和真空度选择不当，会导致制品的塌陷。较高的温度和真空度均会加快冻干效率，但同时也会增加制品塌陷的风险。本发明所述一次干燥的温度可为本领域常规的温度，例如-30℃-0℃。二次干燥也称为解析干燥，是通过抽极限真空(0.01mbar)和升高温度(20-40℃)除去制品中结合水的主要步骤。由于大多数生物制品对温度比较敏感，所以二次干燥温度选择在温度范围的低点，即25℃。冷冻干燥的时间与冷冻机，冻干制剂剂量，冻干药剂的容器有关。这种时间的调整是在本领域技术人员所熟知的。

本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

本发明所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。

稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地最多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃保存包括1个月、3个月、6个月或在40℃保存1个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的抗体单体发生降解。通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的截短，通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。

如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。

如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。

如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。

在本发明中，术语“硬骨素”或“SOST”或“SOST蛋白”或“Sclerostin”指硬骨素(sclerostin or SOST)基因表达产物(蛋白质)，本发明中如非特指，比如鼠SOST(m-SOST)或食蟹猕猴SOST(cyno-SOST)，均指人的SOST(h-SOST)。本发明中所用的人、鼠、食蟹猕猴SOST均通过GenBank得到核苷酸序列，例如NP_079513.1提供人SOST蛋白质序列。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。

在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。

本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人SOST的单克隆抗体。制备时用SOST抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的SOST嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的SOST嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。

本发明中术语“抗硬骨素抗体”、“特异性结合人硬骨素的抗体”、“抗SOST抗体”、“抗SOST”、“SOST抗体”或“结合SOST的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合SOST抗体以致所述抗体可以用作靶向SOST中的诊断剂和/或治疗剂。

本发明中术语“与SOST结合”，指能与人SOST相互作用。

术语“特异性结合”指如通过本领域可用的技术，例如竞争ELISA、

测定或

测定所测定的。该术语还适用于当例如本发明抗体的抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位特异的情况，在该情况下携带抗原结合结构域的抗体能够特异性结合携带该表位的多种抗原。

本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人SOST结合的scFv片段及其他利用了能与人SOST结合的抗体的VH和VL区形成的可结合人SOST的片段；其包含本发明所述抗体的选自SEQ ID NO：3-9中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。

术语“表位”指在一个或更多个抗体的抗原结合区中能够被抗体识别并结合的分子部分。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

氨基酸序列“同一性”是指两个蛋白或多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同氨基酸残基占据时，例如如果两个多肽的一个位置都被同一个氨基酸残基占据时，那么所述分子在该位置是一致的。适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。用于执行BLAST分析的软件可在美国国家生物技术信息中心公开获取(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人SOST特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“Tm值”是指蛋白质热变性温度，即一半蛋白去折叠时的温度，此时蛋白的空间结构被破坏，所以Tm值越高，蛋白热稳定性越高。

二、实施例与测试例

通过以下实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于说明性目的，而并不用于限制本发明的范围。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例

本申请中SOST抗原及抗体的制备、纯化方法已在申请日为2016年2月16日，申请号为PCT/CN2016/073857，公开号为WO2016145961专利文件中记载，前述申请文件的全部内容均可引入本发明。

实施例1：抗人SOST单克隆抗体产生

抗人SOST单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠分成2组(A/B)，每组10只。

免疫抗原为带His标签的SOST重组蛋白(His-h-SOST)。A组用组用弗氏佐剂(sigmaLot Num：F5881/F5506)乳化：首次免疫用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1∶1，200μl/200μg/只(首次免疫)，200μl/100μg/只(加强免疫)。B组用Titermax(sigma Lot Num：T2684)与Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1∶1，抗原与佐剂(Alum)比例为3∶1，200μl/200μg/只(首次免疫)，200μl/100μg/只(加强免疫)。抗原乳化后进行接种，时间为第0、14、28、42、56天。

第0天A/B组腹膜内(IP)注射50μg/只的乳化后抗原。第14天皮下(sc)多点(一般背部6-8点)注射25μg/只。第28，42天根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射200μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。

于第22，36，50，64天进行血检，用测试例1的ELISA方法检测小鼠血清和人硬骨素的结合活性，结果见表1。在第4次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(

CRL-8287^TM)进行融合得到杂交瘤细胞。并通过测试例2检测小鼠血清中抗SOST抗体阻断人SOST和人LRP-6结合的活性，选出体外活性好的单克隆杂交瘤细胞株Ab-1，其活性检测结果见表1：

表1.鼠源抗体的体外活性

候选抗体	测试例1-EC50(nM)	测试例2-IC50(nM)
			Ab-1	0.701	9.91

实施例2：鼠源抗人硬骨素抗体的人源化

挑选出体外活性好的单克隆杂交瘤细胞株Ab-1，克隆其中的单克隆抗体序列，再进行人源化，重组表达和活性评价。

从杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，反转录(PrimeScript^TMReverse Transcriptase，Takara，cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-PrimerSet(Novagen，TB326 Rev.B0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。得到的DNA序列对应的氨基酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示：

杂交瘤细胞获得重链可变区：

杂交瘤细胞获得轻链可变区：

鼠源抗人硬骨素单克隆抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列，进行人源化。本发明选择活性好的候选分子进行人源化，结果如下。

1、鼠源抗硬骨素抗体的CDR区

VH/VLCDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。

本发明中鼠源Ab-1的CDR序列如表2所述：

表2.鼠源抗硬骨素抗体的CDR序列

抗体	Ab-1
		重链CDR1	DYNLD(SEQ ID NO：3)
重链CDR2	DIDPNNGDILYNQKFRD(SEQ ID NO：4)
		重链CDR3	RWAYYFDY(SEQ ID NO：5)
轻链CDR1	KASQSVSNDVA(SEQ ID NO：6)
		轻链CDR2	YTSNRFT(SEQ ID NO：7)
轻链CDR3	QQDYSSPVT(SEQ ID NO：8)

2、选择人种系FR区序列

在所获得的鼠源抗体VH/VLCDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与抗体Germline数据库比较，获得同源性高的人种系模板。其中人类种系轻链框架区来自人κ轻链基因，本发明抗体优选人种系轻链模版IGKV1-39*01或IGKV4-1*01。人类种系重链框架区来自人重链，本发明抗体优选人种系重链模版IGHV1-18*01。将鼠源抗体Ab-1的CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人源化可变区，再与IgG恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化(对重链CDR2进行优化，得到新的重链CDR2序列：DIDPNDGDILYNQKFRD，SEQ ID NO：9)，得到最终的人源化分子。其重链可变区序列如SEQ ID NO：10-12所示，可与任选自SEQ ID NO：16-18所示的重链恒定区序列组合；轻链可变区序列如SEQ ID NO：13-15所示，分别与如SEQ ID NO：19所示的轻链恒定区序列组合。

1)重链可变区：

Ab-5的重链可变区：

Ab-9的重链可变区：

Ab-10的重链可变区：

2)各抗体的重链恒定区任选自以下序列：

人IgG4的重链恒定区(缺K)：

人IgG4的重链恒定区：

人IgG2的重链恒定区：

3)轻链可变区：

Ab-5的轻链可变区：

Ab-9的轻链可变区：

Ab-10的轻链可变区：

4)轻链恒定区，来自人源κ链：

用基因克隆、重组表达的方法分别克隆、表达、纯化上述抗体，经结合ELISA、抗原受体结合阻断实验、Biacore、细胞活性检测等方法，最终选出活性保持最好的人源化抗体Ab-5，Ab-9，Ab-10，序列如下：

Ab-10人源化抗体：

重链：

轻链：

Ab-9人源化抗体：

重链：

轻链：

Ab-5人源化抗体：

重链：

备注：Ab-5人源化抗体重链序列末端的K在抗体表达过程中有可能被切除，因此最终产品中的重链末端可以有K，也可以没有K，但这并不影响产品本身的性能。

轻链：

示例性抗体药物组合物(制剂)制备工艺

第一步：SOST抗体(如Ab-5)与稳定制剂配制成含SOST抗体的制剂原液，经过滤后中控取样检测无菌。将原液过0.22μm PVDF滤芯，收集滤液。

第二步：调节装量至1.1ml，将滤液灌装于2ml西林瓶中，加塞，分别于灌装开始、灌装中间、灌装结束时取样中控检测装量差异。

第三步：开启轧盖机，加铝盖，进行轧盖。

第四步：目检，确认产品无装量不准等缺陷。打印、粘贴西林瓶标签；打印纸盒标签，折叠纸盒，装盒，贴纸盒标签。

实施例3：缓冲体系的筛选

使用下列缓冲液，配制蛋白浓度为80mg/mL的SOST抗体Ab-5制剂：

1)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.0

2)10mM组氨酸-醋酸，pH5.0

3)10mM组氨酸-醋酸，pH5.5

4)10mM磷酸氢二钠-柠檬酸，pH5.5

5)10mM磷酸氢二钠-柠檬酸，pH7.0

6)10mM磷酸氢二钠-柠檬酸，pH7.5

当SOST抗体Ab-5置换至pH7.0和7.5缓冲液中，蛋白发生完全沉淀。结合其等电点范围，表明缓冲液pH应不大于5.5。

置换成功的制剂以1.5mL/瓶填充入2mL西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后进行振摇(25℃，300rpm)稳定性监测。在振摇3天后，磷酸氢二钠-柠檬酸(pH5.5)体系也完全混浊。组氨酸-醋酸体系在振摇后外观呈现乳白色，醋酸体系出现少量沉淀，两者SEC纯度均无显著变化。故SOST抗体制剂缓冲体系可以是组氨酸-醋酸体系或醋酸-醋酸钠体系，pH范围应为5.0-5.5。其中，醋酸-醋酸钠(pH5.0)是相对更好的缓冲体系。见表3：

表3.Ab-5在不同pH及缓冲体系中振摇3天稳定性

使用下列缓冲液中，配制蛋白浓度为85mg/mL的SOST抗体制剂：

1)10mM醋酸-醋酸钠，pH4.8

2)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.0

3)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.2

4)30mM醋酸-醋酸钠，pH5.0

5)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0

将制剂以1.5mL/瓶填充入2mL西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后进行振摇(25℃，300rpm)稳定性和光照(4500Lx)稳定性监测。在振摇3天后，10mM醋酸-醋酸钠(pH4.8)体系和10mM琥珀酸-琥珀酸钠(pH5.0)体系发生完全混浊。10mM醋酸-醋酸钠(pH5.0)和30mM醋酸-醋酸钠(pH5.0)体系在振摇后稳定性相对较好，两者无显著差别。在光照10天后，SOST抗体在10mM醋酸-醋酸钠(pH5.0)和10mM醋酸-醋酸钠(pH5.2)体系中，IEC主峰纯度较另外三组下降更少。因此，SOST抗体制剂最优缓冲体系为醋酸-醋酸钠体系，浓度可以为10-30mM，优选10mM，pH应大于4.8。

表4.Ab-5在不同pH、离子强度及缓冲体系中振摇3天稳定性

表5.Ab-5在不同pH、离子强度及缓冲体系中光照10天稳定性

实施例4：制剂中糖的筛选

在10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5缓冲液中，制备Ab-5蛋白浓度为1mg/ml，分别含的4.5％、6％、7.5％、9％α，α-二水合海藻糖或6％蔗糖的SOST抗体溶液。用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)测量SOST抗体在不同处方中的热稳定性。结果显示，随着糖浓度的增加，SOST抗体Ab-5的起始变性温度(Tm_onset)逐渐上升；且海藻糖中的Tm_onset明显高于蔗糖。预示着SOST抗体在相对高的海藻糖浓度中的热稳定性较好。

考虑到注射剂对渗透压的要求，选择8％α，α-二水合海藻糖应为最优选条件。

表6.Ab-5在不同糖种类及浓度中的热稳定性

注：本发明中糖浓度6％为60mg/ml；9％为90mg/ml。其它单位换算以此类推。

实施例5：制剂中粘度调节剂的筛选

为了降低制剂粘度，在含有30mg/ml SOST抗体，10mM醋酸-醋酸钠，pH5.0溶液中，分别加入以下粘度调节剂，考察能否降低粘度，改善超滤效率：

1)90mg/ml α，α-二水合海藻糖

2)70mg/ml α，α-二水合海藻糖+40mM氯化钠

3)90mg/ml α，α-二水合海藻糖+10mM氯化钙

4)90mg/ml α，α-二水合海藻糖+10mM氯化镁

5)150mM氯化钠

6)140mM精氨酸盐酸盐

7)10mM醋酸钙

8)20mM氯化钙

9)4.5mM氯化钙

实验结果表明，糖对于改善超滤效率没有帮助，氯化钠、精氨酸盐酸盐可以适度增加超滤效率，而钙盐和镁盐对于超滤效率均有极大的改善。其中，钙盐的浓度范围可以为4.5-20mM，该范围内超滤效率无显著差别。

实施例6：制剂中表面活性剂的筛选

在含不同浓度及种类的表面活性剂的缓冲液中，制备不同蛋白浓度，含10mM醋酸-醋酸钠(pH5.0)，4.5mM氯化钙，80mg/mL α，α-二水合海藻糖的SOST抗体制剂。通过DoE进行试验设计和分析，范围如下：

1)蛋白浓度：80～100mg/ml

2)表面活性剂种类：聚山梨酯20(PS20)、聚山梨酯80(PS80)

3)聚山梨酯浓度：0.02～0.8mg/ml

将制剂以1.2ml/支，置于1mlBD给药注射器中，进行25℃/300rpm/12天的振摇。结果显示，所有处方在振摇12天后的SEC、非还原CE-SDS及IEC检测纯度均无显著变化。说明了SOST抗体制剂与给药装置的良好相容性。同时，MFI检测大于2μm以上的亚可见颗粒数及其变化情况，显示各处方间有显著差异。根据DoE拟合结果(模型拟合有效)，采用聚山梨酯80，蛋白浓度高于96mg/ml，可将颗粒数增加量控制在500个以内。在此基础上，聚山梨酯80浓度在约0.3～0.6mg/ml时，可使处方中颗粒在0点时最少。

表7.不同浓度的Ab-5在不同吐温种类及浓度中的振摇稳定性(纯度)

表8.不同浓度的Ab-5在不同吐温种类及浓度中的振摇稳定性(SVP)

实施例7：制剂成分的稳定性研究

Ab-5以100mg/mL配制在10mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)，4.5mM氯化钙，80mg/mLα，α-二水合海藻糖或蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯20或80中。将制剂以1.5mL/瓶填充入2mL西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，分别放置于25℃和2～8℃进行稳定性监测。结果表明，聚山梨酯20的处方在2～8℃放置6个月后出现大量小颗粒，不宜用于SOST抗体Ab-5制剂。聚山梨酯80的处方中，海藻糖和蔗糖无显著差异，在25℃放置3个月或2～8℃放置6个月均显示了良好的稳定性。

表9.Ab-5不同糖和吐温处方放置25℃稳定性

表10.Ab-5不同糖和吐温处方放置2～8℃稳定性

实施例8：制剂的冻干

用pH5.0的含10mM醋酸-醋酸钠的缓冲液，制备SOST抗体蛋白浓度为100mg/ml，含80mg/ml海藻糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，4.5mM氯化钙的抗SOST抗体制剂。将抗体以1.1mL/瓶填充入2mL西林瓶中，装入冻干箱中，冻干。冻干程序为预冻、一次干燥和二次干燥。冻干程序结束后，真空加塞。复溶样品进行冻干前后对比。结果表明，复溶溶液可保持液体制剂良好的性能。

表11.制剂的冻干步骤

实施例9：其它可选择制剂配方

本发明提供的稳定的药物制剂还可以是任选自以下的稳定组合：

(1)SOST抗体Ab-5 120mg/ml，95mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，5mM醋酸-醋酸钠缓冲液和15mM的氯化钙，最终pH为5.5；

(2)SOST抗体Ab-5 120mg/ml，95mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，5mM醋酸-醋酸钠缓冲液和15mM的氯化钙，最终pH为5.4；

(3)SOST抗体Ab-5 120mg/ml，95mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，5mM醋酸-醋酸钠缓冲液和15mM的氯化钙，最终pH为5.3；

(4)SOST抗体Ab-5 120mg/ml，95mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，5mM醋酸-醋酸钠缓冲液和15mM的氯化钙，最终pH为5.1；

(5)SOST抗体Ab-5 120mg/ml，95mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，5mM醋酸-醋酸钠缓冲液和15mM的氯化钙，最终pH为4.9；

(6)SOST抗体Ab-5 120mg/ml，95mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，5mM醋酸-醋酸钠缓冲液和15mM的氯化钙，最终pH为4.8；

(7)SOST抗体Ab-5 110mg/ml，40mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和7.5mM的氯化钙，最终pH为5.4；

(8)SOST抗体Ab-5 110mg/ml，40mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和7.5mM的氯化钙，最终pH为5.3；

(9)SOST抗体Ab-5 110mg/ml，40mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和7.5mM的氯化钙，最终pH为5.1；

(10)SOST抗体Ab-5 110mg/ml，40mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和7.5mM的氯化钙，最终pH为4.9；

(11)SOST抗体Ab-5 100mg/ml，50mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和6.0mM的氯化钙，最终pH为4.9；

(12)SOST抗体Ab-5 100mg/ml，50mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和6.0mM的氯化钙，最终pH为5.1；

(13)SOST抗体Ab-5 100mg/ml，50mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和6.0mM的氯化钙，最终pH为5.3；

(14)SOST抗体Ab-5 100mg/ml，50mg/ml海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液和6.0mM的氯化钙，最终pH为5.4。

(15)SOST抗体Ab-5 90mg/ml，40mg/ml海藻糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，5mM醋酸-醋酸钠缓冲液(其pH为4.8)和15mM的氯化钙；

(16)SOST抗体Ab-5 110mg/ml，95mg/ml海藻糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，20mM醋酸-醋酸钠缓冲液(其pH为5.5)和20mM的氯化钙；

(17)SOST抗体Ab-5 100mg/ml，80mg/ml海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，10mM醋酸-醋酸钠缓冲液(其pH为5.0)和4.5mM的氯化钙。

Claims

1.一种药物组合物，其包含SOST抗体，以及缓冲液，

所述缓冲液选自醋酸盐缓冲液，所述缓冲液的浓度为10mM至30mM；

所述药物组合物还包含二糖，所述二糖选自海藻糖或蔗糖，所述二糖的浓度为45mg/ml至90mg/ml；

所述药物组合物还包含聚山梨醇酯80，所述聚山梨醇酯80的浓度为0.3mg/ml至0.6mg/ml；

所述药物组合物还包含粘度调节剂，所述粘度调节剂选自钙盐，所述钙盐的浓度为4.5mM至20mM；

其中，所述SOST抗体浓度为80mg/ml至120mg/ml，所述SOST抗体的重链如

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWLRQAPGEGLEWIGDIDPNDGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG或

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所述SOST抗体的轻链如SEQ ID NO:25所示；

所述药物组合物的pH为5.0至5.2。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SOST抗体浓度为90mg/ml至120mg/ml。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述SOST抗体浓度为100mg/ml。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为5.0。

6.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为10mM至20mM。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为10mM。

8.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲液的pH为5.0至5.2。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述缓冲液的pH为5.0。

10.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述二糖浓度为60mg/ml至90mg/ml。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述二糖浓度为80mg/ml。

12.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述聚山梨醇酯80的浓度为0.4mg/ml。

13.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述钙盐为氯化钙或醋酸钙。

14.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的钙盐的浓度为4.5mM至10mM。

15.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的钙盐的浓度为4.5mM。

16.一种药物组合物，其中包含：

(a)100mg/ml的SOST抗体，所述SOST抗体的重链如

所述SOST抗体的轻链如SEQ ID NO:25所示；

(b)10mM至20mM的醋酸盐缓冲液，其pH为5.0至5.2，

(c)70至80mg/ml的海藻糖或蔗糖，

(d)0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和

(e)4.5mM至10mM的钙盐。

17.如权利要求16所述的药物组合物，其包含：

(a)100mg/ml的SOST抗体，所述SOST抗体的重链如

所述SOST抗体的轻链如SEQ ID NO:25所示；

(b)10mM醋酸-醋酸钠缓冲液，其pH为5.0，

(c)80mg/ml的海藻糖或蔗糖，

(d)0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和

(e)4.5mM的氯化钙。

18.制备含SOST抗体的冻干制剂的方法，其包括将权利要求1至17中任一项所述的药物组合物经冷冻干燥的步骤。

19.如权利要求18所述制备含SOST抗体的冻干制剂的方法，其中所述冷冻干燥包括依次的预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。

20.一种由权利要求18或19所述的方法制备所得的含SOST抗体的冻干制剂。

21.制备含有SOST抗体的复溶溶液的方法，其中包括将权利要求20所述的冻干制剂经复溶的步骤。

22.一种由权利要求21所述的方法制备所得的含有SOST抗体的复溶溶液。

23.一种含SOST抗体的冻干制剂，其特征在于所述的冻干制剂复溶后可形成权利要求1至17中任一项所述的药物组合物。

24.权利要求1至17中任一项所述的药物组合物或权利要求20或23所述的冻干制剂或权利要求22所述的复溶溶液在制备用于治疗SOST相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的SOST相关的疾病或病症选自骨质疏松症、骨质减少或骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周病或多发性骨髓瘤的疾病。

25.如权利要求24所述的用途，其中所述的SOST相关的疾病或病症为骨质疏松症。

26.一种制品，其包括容器，该容器中装有权利要求1至17中任一项所述的药物组合物或权利要求20或23所述的冻干制剂或权利要求22所述的复溶溶液。