CN110431153B - 一种pcsk-9抗体药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种药物组合物，其包含在组氨酸缓冲液中的PCSK9抗体或其抗原结合片段。除此之外，该药物组合物还可含有糖和非离子型表面活性剂。

Description

一种PCSK-9抗体药物组合物及其用途
本申请要求申请日为2017年6月30日的中国专利申请CN201710519829.6的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种包含PCSK-9抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为药物的用途。
背景技术
高胆固醇血症是一种以血清胆固醇水平升高为主要特征的脂类代谢异常疾病，其主要表现为血清胆固醇水平升高，导致胆固醇在血管聚集，形成动脉粥样硬化。大量的临床及实验研究结果都证实，脂质代谢异常和冠心病的发生、发展有着密切的关系。因此，降低血液中的胆固醇浓度成为了目前治疗和预防动脉粥样硬化的一个主要手段。
随着我国国民生活水平的快速提高，血脂异常也成为了危害我国城乡居民的主要因素。据2012年统计数据，我国每年死亡人数中约有40％死于心血管疾病。目前，我国成人血脂异常患病率为18.6％，估计全国血脂异常现患人数1.6亿。不同类型的血脂异常现患率分别为：高胆固醇血症2.9％，高甘油三酯血症11.9％，低高密度脂蛋白血症7.4％；另有3.9％的人血胆固醇边缘升高。2012年卫生部疾病预防控制专家委员会慢性病防治分委会达成的“慢性病防治中国专家共识”中提到，我国有3300万高胆固醇血症患者，而从局部地区看，我国血脂异常发病率情况远比上述数据要严重。
目前，临床上调脂药物主要以他汀类为主。立普妥(Liptor)作为全世界应用最广泛的降胆固醇药物，也是医药史上最畅销药物，通过阻断肝脏生产胆固醇的酶作用，减少胆固醇的生产，从而增加肝脏从血液中摄取更多的胆固醇，进而减低血液中胆固醇浓度。但是立普妥也有其不足之处，首先从数据看，立普妥可以降低30％-40％的低密度脂蛋白，但仍然有很多病人依然无法到达有效的降低血脂(低密度脂蛋白浓度<50mg/dL)，其次病人对立普妥的响应率也有人种差异。这些原因，致使病人需要一个更为有效的降低血脂的药物。
家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FM)是一种常染色体单基因显性遗传性疾病，其临床特征为血总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein-cholesterol,LDL-c)显著升高、睑黄瘤、角膜弓以及早发的心血管疾病。低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)基因突变致其缺陷或缺乏，LDL-c不能顺利转运到肝脏清除，以致血中LDL-c水平升高。目前已明确3种基因与FM的发生有关，它们分别是LDLR基因、载脂蛋白B100基因和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type9)基因。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种前蛋白转化酶，属于分泌的枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。该编码蛋白是作为可溶性酶原合成的，在内质网中经过自身催化分子内加工。实验结果显示，PCSK9促进LDL受体的降解从而增加血浆中LDL胆固醇含量，而LDL受体介导肝内的LDL胞吞过程，后者是从循环系统清除LDL的主要途径。研究发现，12.5％的高胆固醇血症(ADH)患者检测有PCSK9基因突变。PCSK9突变形式多样，根据突变对PCSK9调节LDL-C水平的不同影响可分为两类：功能缺失型和功能获得型。其中功能缺失型突变与低血胆固醇水平有关，有预防冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的作用，非洲人群中低胆固醇的PCSK9突变率高于其他种族。PCSK9功能获得型突变体通过增加PCSK9的功能、降低LDLR的表达而升高血浆胆固醇水平，可以导致严重高胆固醇血症和早发冠状动脉粥样硬化性心脏病，目前发现的PCSK9功能获得型突变包括：D374Y、S127R、F216L、N157K、R306S等。其中，与PCSK9野生型相比，D374Y突变体细胞表面的LDLR减少了36％，S127R突变有相应减少了10％。
但是，抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定。为了使抗体适合于给药，并且在储存及随后使用过程中能保持稳定性，发挥更好的效果，抗体药物的稳定制剂研究显得尤为重要。
尽管，目前有多家公司在研发包含PCSK-9抗体及药物配制剂，如：CN103717237A、CN104364266A等。但对于新的PCSK-9抗体，仍需要研制更适于给药的包含PCSK-9的药物(制剂)组合物。
发明内容
本发明提供一种药物组合物，其包含PCSK-9抗体或其抗原结合片段，以及缓冲液，所述缓冲液优选为组氨酸或琥珀酸盐或磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液，更优选为组氨酸缓冲液，最优选为组氨酸-盐酸盐缓冲液。
在可选的实施方案中，药物组合物其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为大约1mg/ml至150mg/ml，优选为大约30mg/ml至100mg/ml，最优选为50-60mg/ml，更优选为50mg/ml。非限制性实施例包括45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml、60mg/ml。
在可选的实施方案中，缓冲液的浓度为约5mM至50mM，优选为大约5mM至30mM，非限制性实施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、26mM、28mM、30mM，更优选为10mM至15mM，最优选为10mM。
在可选的实施方案中，药物组合物中所述缓冲液的pH值约为5.5到6.5，优选为大约6.0至6.5，非限制性实施例包括约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5。
进一步的，在可选的实施方案中，药物组合物还包含糖。本发明的“糖”包含常规组合物(CH2O)n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原性糖、非还原性糖等等。可选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、sylitol、山梨糖醇、甘露醇、密里二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异-麦芽酮糖等等。优选的糖是非还原性二糖，更优选为海藻糖或蔗糖。
在可选的实施方案中，药物组合物中糖的浓度为约10mg/ml至约75mg/ml，优选为20mg/ml至约60mg/ml，更优选为20mg/ml至约40mg/ml，最优选为25mg/ml，非限制性实施例包括20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml。
在可选的实施方案中，药物组合物还包含表面活性剂。可选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、硬脂基-肌氨酸、亚油基-、肉豆蔻基-、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-、柯卡酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等等。优选的表面活性剂是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更优选为聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为约0.05mg/ml至1.0mg/ml，优选为0.1mg/ml至0.4mg/ml，非限制性实施例包括0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml，进一步优选为0.1mg/ml至0.3mg/ml，更优选为0.1mg/ml至0.2mg/ml，最优选为0.2mg/ml。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)1-150mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段，
(b)5-30mM的组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5，更优选为大约6.0-6.5
(c)10-75mg/ml的蔗糖，和
(d)0.05-0.6mg/ml的聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)50mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；
(b)5-20mM的组氨酸缓冲液；
(c)25mg/ml的蔗糖；和
(d)0.1-0.3mg/ml的聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)1-150mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段，和
(b)5-30mM的组氨酸缓冲液；
且所述药物组合物的pH约为6.0-6.5。
在可选的实施方案中，药物组合物包含：
(a)1-150mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；
(b)5-30mM的组氨酸缓冲液；
(c)10-75mg/ml的蔗糖；和
(d)0.05-0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，且所述药物组合物的pH约为6.0-6.5。组氨酸缓冲液优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。
在可选的实施方案中，药物组合物包含：
(a)50mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；
(b)5-20mM的组氨酸缓冲液；
(c)25mg/ml的蔗糖；和
(d)0.1-0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，且所述药物组合物的pH约为6.0-6.5。组氨酸缓冲液优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。
在可选的实施方案中，药物组合物包含：
(a)50mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；
(b)10mM的组氨酸缓冲液；
(c)25mg/ml的蔗糖；和
(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，且所述药物组合物的pH为6.3±0.1。组氨酸缓冲液优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)150mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；(b)30mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液；(c)75mg/ml的蔗糖；和(d)0.6mg/ml的聚山梨醇酯80；药物组合物的最终PH6.3。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)50mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；(b)10mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液，pH 6.0；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)150mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；(b)20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液，pH 6.5；和(c)70mg/ml的蔗糖。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)150mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；(b)20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液，pH 6.5；和(c)70mg/ml的α,α-二水合海藻糖。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)50mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；(b)20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液，pH 6.0；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)50mg/ml的PCSK-9抗体或其抗原结合片段；(b)20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液，pH 6.5；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，药物组合物中所述PCSK-9抗体或抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在可选的实施方案中，药物组合物中所述抗体或抗原结合片段可选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
在可选的实施方案中，药物组合物中所述PCSK-9抗体的轻链与h001-4-YTE的抗体轻链氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，所述PCSK-9抗体的重链氨基酸序列与h001-4-YTE的抗体重链具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，所述h001-4-YTE抗体轻链序列如SEQID NO：30所示，h001-4-YTE抗体重链序列如SEQ ID NO：32所示。
本发明还提供制备前述药物组合物的方法，其中包括：PCSK-9抗体或其抗原结合片段原液经缓冲液置换的步骤，所述缓冲液类型优选为组氨酸缓冲液，更优选为组氨酸-盐酸盐缓冲液，所述缓冲液浓度优选为大约5mM至30mM，非限制性实施例包括5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、26mM、28mM、30mM，更优选为10mM至15mM；所述缓冲液pH约为6.0至6.5，非限制性实施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。
原液进一步地，制备前述药物组合物的方法，还包括向置换步骤所得溶液中加入蔗糖和聚山梨醇80，再经缓冲液定容的步骤，其中缓冲液浓度优选为大约10mM至20mM，非限制性实施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM；所述缓冲液pH约为6.0至6.5，非限制性实施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。
本发明还提供一种制备含PCSK-9抗体的冻干制剂的方法，其中包括将前述药物组合物经冷冻干燥的步骤。
在可选的实施方案中，制备含PCSK-9抗体的冻干制剂的方法中所述冷冻干燥依次包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。所述的预冻为从5℃冻至-40℃至-50℃，最优为-45℃，对真空度不作要求。所述的一次干燥温度为-14℃至0℃，最优为-5℃；真空度0.1mBar-0.5mBar，最优为0.3mBar。二次干燥温度20℃-30℃，最优为25℃,真空度从0.1mBar-0.5mBar，最优为0.3mBar，降至真空度0.005mBar-0.02mBar，最优为0.01mBar。
本发明还提供一种经前述制备含PCSK-9抗体的冻干制剂的方法制备的含PCSK-9抗体的冻干制剂。
在一些实施方案中，该冻干制剂于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。
本发明还提供制备含有PCSK-9抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法，其中包括将前述冻干制剂经复溶的步骤，其复溶所用溶液选自但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液。
本发明还提供一种经前述含有PCSK-9抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法制备的含有PCSK-9抗体的冻干制剂的复溶溶液。
在可选的实施方案中，本发明所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其所含组分的浓度为冻干前药物组合物所含组分浓度的2-5倍，优选为3倍。
在可选的实施方案中，所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为大约120mg/ml至200mg/ml，最优选为150mg/ml。
在可选的实施方案中，所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述药物组合物的pH约为6.0-6.5，优选为6.4。该复溶溶液的PH与配制所用原液的缓冲液pH相关，当原液PH为6.0时，最终复溶溶液的PH为6.3±1。
在可选的实施方案中，所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述缓冲液浓度为大约15mM至45mM，优选为30mM。
在可选的实施方案中，所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中还包括二糖，所述二糖优选自海藻糖或蔗糖，最优选为蔗糖。
在可选的实施方案中，所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述糖浓度为大约55mg/ml至95mg/ml，优选为75mg/ml。
在可选的实施方案中，所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中还包括表面活性剂，所述表面活性剂优选为聚山梨醇酯，更优选为聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中表面活性剂的浓度从大约0.4mg/ml至0.8mg/ml，优选为0.6mg/ml。
本发明进一步提供一种制品或试剂盒，其包含装有本文所述任何稳定的药物组合物的容器。在一些实施方案中，该玻璃瓶为中性硼硅玻璃管制注射剂瓶。
本发明还提供前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液在制备用于治疗PCSK-9相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症优选胆固醇相关疾病，更优选为高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症，最优选高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
本发明还提供前一种治疗和预防PCSK-9相关的疾病或病症的方法，包括给予所需患者治疗有效量的前述药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液，其中所述的疾病优选胆固醇相关疾病，更优选为高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症，最优选高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
本发明还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液。
要理解，可以组合本文所述各个实施方案的一项、一些或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员会变得显然。本发明的这些和其它实施方案通过下面的详述进一步描述。
具体实施方式
一、术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲液。将pH控制在适当范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。
“组氨酸缓冲液”是包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲液，优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。组氨酸-盐酸盐缓冲液是组氨酸与盐酸或组氨酸与组氨酸盐酸盐配制而成。
“柠檬酸盐缓冲液”是包括柠檬酸根离子的缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的实例包括柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-柠檬酸钾、柠檬酸-柠檬酸钙、柠檬酸-柠檬酸镁等。优选的柠檬酸盐缓冲液是柠檬酸-柠檬酸钠。
“琥珀酸盐缓冲液”是包括琥珀酸离子的缓冲液。琥珀酸盐缓冲液的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。优选的琥珀酸盐缓冲液是琥珀酸-琥珀酸钠。
“磷酸盐缓冲液”是包括磷酸离子的缓冲液。磷酸盐缓冲液的实例包括磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钾等。优选的磷酸盐缓冲液是磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钠。
“醋酸盐缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的实例包括醋酸-醋酸钠、醋酸组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液是醋酸-醋酸钠。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持抗体活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
本发明的冷冻干燥包括预冻，一次干燥，二次干燥。预冻目的是冷冻产品，获得结晶固体。预冻温度和预冻速度是两个重要工艺参数，本发明中将预冻温度设定为-45℃，预冻速度设定为1℃/min。一次干燥也称为主干燥，是样品冷冻干燥的主要阶段。目的是移除产品里冰的同时，保持产品形状，最小程度的减少对产品的破坏。若一次干燥的温度和真空度选择不当，会导致制品的塌陷。较高的温度和真空度均会加快冻干效率，但同时也会增加制品塌陷的风险。本发明所述一次干燥的温度可为本领域常规的温度，例如-27℃-0℃，优选为-14℃至-5℃。二次干燥也称为解析干燥，是通过抽极限真空(0.01mbar)和升高温度(20-40℃)除去制品中结合水的主要步骤。由于大多数生物制品对温度比较敏感，所以二次干燥温度选择在温度范围的低点，即25℃。冷冻干燥的时间与冷冻机，冻干制剂剂量，冻干药剂的容器有关。这种时间的调整是在本领域技术人员所熟知的。
本发明所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地最多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃和40℃在内的温度保存包括1个月、3个月、6个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的抗体单体发生降解。通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的截短。通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。
如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。
如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。
如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人PCSK-9的单克隆抗体。制备时用PCSK-9抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PCSK-9嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的PCSK-9嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。
“PCSK-9抗体”为与PCSK-9特异性结合的抗体，包括但不限于PCT/CN2016/111053中的h001系列PCSK-9人源化抗体。其中，h001系列PCSK-9人源化抗体，是利用人PCSK-9免疫小鼠筛选，并经人源化改造获得。
本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人PCSK-9结合的ScFv片段及其他利用了能与人PCSK-9结合的抗体的VH和VL区形成的可结合人PCSK-9的片段；其包含本发明所述抗体的选自SEQ ID NO:1至SEQID NO:2中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与PCSK-9结合”，指能与人PCSK-9相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上连续或不连续的，由本PCSK-9抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PCSK-9特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
氨基酸序列“同一性”是指两个蛋白或多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同氨基酸残基占据时，例如如果两个多肽的一个位置都被同一个氨基酸残基占据时，那么所述分子在该位置是一致的。适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。用于执行BLAST分析的软件可在美国国家生物技术信息中心公开获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“Tm值”是指蛋白质热变性温度，即一半蛋白去折叠时的温度，此时蛋白的空间结构被破坏，所以Tm值越高，蛋白热稳定性越高。
“置换”是指溶解抗体蛋白的溶剂体系的置换，例如，使用稳定制剂的缓冲体系经物理操作方式将含抗体蛋白的高盐或高渗溶剂体系置换，从而使抗体蛋白存在于稳定制剂中。所称物理操作方式包括但不限于超滤、透析或离心后复溶。
二、实施例与测试例
通过以下实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于说明性目的，而并不用于限制本发明的范围。
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
PCSK-9抗原和抗体的制备
实施例1、PCSK9抗原及检测用蛋白的制备
蛋白设计及表达
以UniProt Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(人PCSK9，Uniprot号：Q8MBP7)作为本发明PCSK9的模板，设计本发明涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，可选的在PCSK9蛋白基础上融合不同的标签如his标签或促进免疫的肽段如PADRE肽，分别克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#:102762)或pTargeT载体上(promega,A1410)，在293细胞瞬转表达或CHO-S稳定表达，纯化，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。
带His标签的PCSK9：PCSK9-His6，用于免疫原免疫小鼠或检测试剂
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为His6-tag(6组氨酸标签)。
带PADRE肽和His标签的PCSK9：PCSK9-PADRE-His6，作为免疫原，所含PADRE肽可以促进免疫；
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为linker，点划线部分为PADRE肽，斜体部分为His6-tag。
带TEV酶切位点的PCSK9与his标签融合蛋白：PCSK9-TEV-His6，可通过TEV酶切获得N-PCSK9(N端pCSK9结构域)，作为免疫原；
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为TEV酶切位点，斜体部分为His6-tag。
PCSK9-D374Y突变蛋白，带his标签：PCSK9-D374Y-His6，作为检测试剂；
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为His6-tag。
PCSK9：插入生物素接受肽BP15及his标签的PCSK9蛋白：PCSK9-BP15-His6，作为检测试剂，BP15肽位置在表达过程中能够进行生物素标记，免除体外生物素标记及可能导致的构象变化；
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为生物素接受肽，斜体部分为His6-tag。
PCSK9-Y：插入生物素接受肽及his标签的PCSK9 D374Y突变体蛋白：PCSK9-D374Y-BP15-His6，检测蛋白；
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为生物素接受肽，斜体部分为His6-tag。
带Flag标签和His标签的pCSK9受体蛋白LDLR胞外域片段：LDLR-ECD-Flag-His6，检测试剂
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为Flag标签，斜体部分为His6-tag；
LDLR-Fc：缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与PCSK9结合活性)：LDLR-sECD–Fc(hIgG1)作为检测试剂
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-sECD)，斜体部分为hIgG1-Fc部分；
更加缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与pCSK9结合活性)：LDLR-ssECD–Fc(hIgG1)作为检测试剂
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为更加缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-ssECD)，斜体部分为hIgG1-Fc部分。
实施例2、PCSK9、LDLR相关重组蛋白的纯化重组蛋白以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
1、带His标签的重组蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上IMAC柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS。去聚体峰，收集洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。得到带His标签的PCSK9-His6(SEQ ID NO：1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)、PCSK9-TEV-His6(SEQ ID NO：3)PCSK9-D374Y-His6(SEQ ID NO：4)、PCSK9-BP15-His6(SEQID NO：5)、PCSK9-D374Y-BP15-His6(SEQ ID NO：6)用于本发明抗体的免疫原或检测试剂。其中PCSK9-TEV-His6纯化后通过TEV酶进行酶切，酶切产物再利用IMAC柱结合去除TEV酶、未酶切完全的PCSK9-TEV-His6或切除的带His标签的C端结构域片段，IMAC流出液中浓缩获得仅留N端结构域的PCSK9片段(缩写为N-PCSK9)，作为免疫原用于小鼠免疫。
2、带His标签和Flag标签的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO:7)重组蛋白的纯化步骤：
将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。利用0.5×PBS平衡flag亲和柱，冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用0.5×PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用含有0.3M NaCl的PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)洗脱目的蛋白，并收集，调节pH至中性。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS。去聚体峰，收集洗脱峰收集样品经电泳，肽图，LC-MS鉴定正确后分装备用。得到带FLAG/His6标签的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO:7)，用于本发明抗体的性能测试。
3、LDLR的Fc融合蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，浓缩至适当体积后上Protein A柱。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM醋酸钠pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，去聚体的峰收集好后分装备用。此方法用来纯化LDLR-sECD–Fc(hIgG1)(SEQ ID NO:8)和LDLR-ssECD–Fc(hIgG1)(SEQ ID NO:9)。两者可用作PCSK9抗体功能性测试。
实施例3、抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的制备
1、免疫
抗人PCSK9单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按两种方案免疫(A/B)，每组6-10只。免疫抗原为带His标签的人PCSK9-His6(SEQ ID NO:1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO:2)及N-PCSK9(SEQ ID NO:3)。
方案A用弗氏佐剂(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1:1，100μg/只(首免)，50μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射100μg/只的乳化后抗原，首免后每两周一次，共6-8周。
方案B用Titermax(sigma Lot Num：T2684)与Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1:1，抗原与佐剂(Alum)比例为3:1，10-20μg/只(首免)，5μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射20/10μg/只的乳化后抗原，首免后每周一次，Titermax和Alum交替使用，共6-11周。免疫四周后，根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。
2、细胞融合
选择血清中抗体滴度高(见后面的测试例1和2，结合PCSK9的ELISA方法)并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，融合前72小时冲刺免疫所选小鼠，PCSK9-His610μg/只，腹腔注射。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含20％FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培养基)重悬，分装于96孔细胞培养板中(1×105/150μl/孔)，37℃，5％CO2孵育。融合后的第5天加入HAT完全培养基，50μl/孔，37℃，5％CO2孵育。融合后第7天～8天，根据细胞生长密度，全换液，培养基为HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，200μl/孔，37℃，5％CO2孵育。
3、杂交瘤细胞筛选
融合后第10-11天，根据细胞生长密度，进行结合PCSK9或PCSK9-Y的ELISA方法检测(见测试例1和2)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行PCSK9或PCSK9-Y与LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例3和4)，阳性孔换液，并根据细胞密度及时扩大至24孔板中。移入24孔板的细胞株经过复测后进行保种和第一次亚克隆。第一次亚克隆筛选(见测试例1和2)为阳性的进行保种，并进行第二次亚克隆。第二次亚克隆为阳性(见测试例1和2)的进行保种和蛋白表达。多次融合获得有阻断PCSK9或PCSK9-Y与LDLR结合效果(见测试例3和4)的杂交瘤细胞。
通过阻断实验和结合实验筛选得到杂交瘤克隆mAb-001，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。
其中测得杂交瘤克隆mAb-001的鼠抗可变区序列如下：
>mAb-001 VH
>mAb-001VL
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
表1PCSK-9抗体mAb-001的重链及轻链CDR区序列
实施例4、抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的人源化
1、杂交瘤克隆mAb-001人源化框架选择
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与mAb-001同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，将这两个鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
鼠源抗体mAb-001的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV1-2*02和hjh2，人源化后得到人源化抗体h001-1的可变区序列如下：
>h001-1 VH
>h001-1 VL
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
2、杂交瘤克隆mAb-001的模板选择和回复突变设计，见下表2；杂交瘤克隆回复突变后的人源化序列组合见表4。
表2杂交瘤克隆回复突变设计
注：如S66D表示依照Kabat编号系统，将66位S突变回D。
Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列，各突变可变区具体序列如下表3：
表3各突变体可变区序列
注：序列中横线部分为CDR区。
表4鼠抗mAb-001人源化序列组合
h001_VL.1 h001_VL.1A h001_VL.1B h001_VL.1C
h001_VH.1 h001-1 h001-2 h001-3 h001-4
h001_VH.1A h001-5 h001-6 h001-7 h001-8
h001_VH.1B h001-9 h001-10 h001-11 h001-12
h001_VH.1C h001-13 h001-14 h001-15 h001-16
h001_VH.1D h001-17 h001-18 h001-19 h001-20
h001_VH.1E h001-21 h001-22 h001-23 h001-24
注：该表表示各种序列及其突变序列组合所得的人源化抗体可变区部分的组合。如h001-1表示，人源化抗体h001-1的可变区由轻链h001_VL1、重链h001_VH.1A组成。其它类推。
3、将以上的人源化序列组合进行抗体化，重链恒定区来自人IgG1，轻链恒定区来自人kappa链。得到相应的人源化抗体，经验证得到的PCSK9抗体与PCSK9和PCSK9-Y有较高的结合活性；并且能有效阻断PCSK9/PCSK9-Y与LDLR之间的结合。
实施例5、构建和表达抗人PCSK9人源化抗体IgG1及IgG1-YTE形式
本发明构建和表达抗人PCSK9人源化抗体的方法如下：
1、引物设计：利用在线软件DNAWorks(v3.2.2)(works/)设计多条引物合成VH/VK含重组所需基因片段：5’-30bp Signal peptide+VH/VK+30bp CH1/CL-3’。引物设计原则：目的基因2与目的基因1有2个aa不一样，则另设突变位点所在引物。
2、片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作说明书，用上面设计的多条引物，分两步PCR扩增得到VH/VK含重组所需基因片段。
3、表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)构建及酶切
利用一些特殊的限制性内切酶,如BsmBI，识别序列与酶切位点不同的特性设计构建表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)。BsmBI酶切载体，切胶回收备用。
4、重组构建表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr
VH/VK含重组所需基因片段与BsmBI酶切回收表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)按3:1比例分别加入DH5α感受态细胞中，0℃冰浴30min，42℃热击90秒，加入5倍体积LB medium，37℃孵育45min，涂布LB-Amp平板，37℃培养过夜，挑取单克隆送测序得到各目的克隆。
本发明的抗体可以，但不限于以上设计构建方式。以h001-4为例进行抗体及其突变体设计，得到①h001-4-WT：h001-4的IgG1形式，即人源化序列组合h001-4，结合来自人IgG1的重链恒定区，与来自人kappa链的轻链恒定区；②h001-4-YTE：h001-4-IgG1-YTE形式，即人源化序列组合h001-4，结合突变的人IgG1(YTE突变)的重链恒定区，与来自人kappa链的轻链恒定区。突变的人IgG1也可以是别种形式的突变。
构建和表达抗人PCSK9人源化抗体(IgG1及h001-4的IgG1-YTE形式)序列如下：
h001-4 IgG1形式，重链恒定区来自人IgG1，轻链恒定区来自人kappa轻链：
重链氨基酸序列(人IgG1)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：28
重链DNA序列：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：29
h001-4-kappa
轻链氨基酸序列：
DIVMSQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSFNLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：30
轻链DNA序列：
ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGACATCGTGATGTCTCAGAGCCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTAACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAAAGCCTGCTGAACAGCAGGACCCGCAAGAACTTCCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGTCTCCCAAGTTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCAAGCAGAGCTTCAATCTGTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID NO：31
h001-4-YTE轻链为h001-4-kappa:SEQ ID NO：30
h001-4-YTE重链氨基酸序列为：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：32
h001-4-YTE重链DNA序列：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：33
备注：下划线部分为信号肽DNA序列
示例性抗体药物组合物(制剂)制备工艺
第一步：取一定量的纯化的PCSK-9抗体(如h001-4-YTE)原液，用不含抗体的缓冲液(如10mM，pH 6.0组氨酸-盐酸盐缓冲液)进行溶剂置换(优选超滤)，经超滤膜6倍体积置换，蛋白浓缩到60mg/mL(±2mg/mL)。加入一定体积的蔗糖母液，混匀，使最终蔗糖浓度为25mg/mL。加入一定体积的吐温-80母液，混匀，使最终吐温-80浓度为0.2mg/mL。加10mM pH6.0组氨酸缓冲液定容，使蛋白浓度为50mg/mL(±5mg/mL)，最终产品pH约为6.3±0.1(其他待测试制剂或稳定性制剂参照相似步骤进行配制)。
产品经过滤后中控取样检测无菌。将原液过0.22μm PVDF滤芯，收集滤液。
第二步：调节装量至3.6ml，将滤液灌装于6ml西林瓶中，半加塞，分别于灌装开始、灌装中间、灌装结束时取样中控检测装量差异。
第三步：将灌装加塞后的药液装入冻干箱中，冻干。冻干程序为预冻、一次干燥和二次干燥。冻干程序结束后，真空加塞。
冻干所用的时间可随实际情况调整，冻干机的型号，冻干药剂的装载量，冻干药剂的容器，都会影响冻干时间。这种时间的调整是在本领域技术人员所熟知的。
第四步：开启轧盖机，加铝盖，进行轧盖。
第五步：目检，确认产品无塌陷、装量不准等缺陷。打印、粘贴西林瓶标签；打印纸盒标签，折叠纸盒，装盒，贴纸盒标签。
实施例6、缓冲体系的筛选
用下列缓冲液，配制蛋白浓度为1mg/ml的抗PCSK-9抗体h001-4-YTE制剂：
1)20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 4.0
2)20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 4.5
3)20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 5.0
4)20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 5.5
5)20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 6.0
6)20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 6.0
7)20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 6.5
8)20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 7.0
9)20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 7.5
10)20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.5
11)20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0
12)20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.5
用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)测量抗PCSK-9抗体在每种制剂中的热稳定性。药品的热变性中点温度(Tm)分析显示，抗PCSK-9抗体在pH≥6.0时热稳定性较好。结果如表5所示。因此选择pH6.0-6.5之间的缓冲液：组氨酸-盐酸盐、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、琥珀酸-琥珀酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠，进行后续研究。
表5H001-4-YTE缓冲体系-pH值DSC筛选结果
注：N/A表示未添加该成分。
用下列缓冲液，配制蛋白浓度为1mg/ml的抗PCSK-9抗体制剂：
1)20mM组氨酸-盐酸盐，pH 6.0
2)20mM组氨酸-盐酸盐，pH 6.5
3)20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 6.0
4)20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 6.5
5)20mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH 6.0
6)20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 6.0
7)20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 6.5
用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)测量抗PCSK-9抗体在每种制剂中的热稳定性。药品的热变性中点温度(Tm)分析显示(见表6)，抗PCSK-9抗体在组氨酸、磷酸盐和琥珀酸盐缓冲体系中的稳定性略优于柠檬酸盐缓冲体系。
表6H001-4-YTE缓冲体系-pH值DSC筛选结果
注：N/A表示未添加该成分。
实施例7、制剂中糖的筛选
用下列不同糖种类的缓冲液，制备PCSK-9抗体蛋白浓度为150mg/ml的抗PCSK-9抗体制剂：
1)20mM组氨酸-盐酸盐，70mg/ml蔗糖，pH 6.5
2)20mM组氨酸-盐酸盐，70mg/mlα,α-二水合海藻糖，pH 6.5
过滤每种制剂并以0.5mL/瓶填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，水针压塞轧盖封口。取样品分别进行40℃高温、低温光照以及冻融循环(样品置于-20℃条件下24h后取出置于室温使样品完全融化混匀为一个循环)实验，结果表明蔗糖与海藻糖对抗PCSK-9抗体的稳定性作用相似，我们选择蔗糖作为抗PCSK-9抗体的稳定剂，结果见表7。
表7H001-4-YTE不同糖种类加速实验结果
用下列不同蔗糖浓度的缓冲液，制备PCSK-9抗体蛋白浓度为150mg/ml的抗体制剂：
1)20mM组氨酸-盐酸盐，0mg/ml蔗糖，pH 6.5
2)20mM组氨酸-盐酸盐，10mg/ml蔗糖，pH 6.5
3)20mM组氨酸-盐酸盐，40mg/ml蔗糖，pH 6.5
4)20mM组氨酸-盐酸盐，70mg/ml蔗糖，pH 6.5
渗透压值表明，当蔗糖≥70mg/ml时渗透压符合最低皮下注射要求。本发明的PCSK-9抗体制剂采用稀冻浓溶(三倍体积原液进行冻干，一倍体积注射用水复溶，未经特别说明本发明均采用该比例冻溶)工艺制备，当终处方(复溶后制剂)中糖浓度定为75mg/ml时即满足注射的渗透压要求，又方便原液中糖浓度的设定，为25mg/ml，同时该25mg/ml的糖浓度易于冻干。因此制剂终处方中的糖浓度选择为75mg/ml，原液中糖浓度定为25mg/ml。
表8H001-4-YTE糖浓度渗透压测定结果
注：N/A表示未添加该成分。
实施例8、制剂中表面活性剂的筛选
用下列不同浓度表面活性剂的缓冲液，制备PCSK-9抗体蛋白浓度为150mg/ml的抗PCSK-9抗体制剂：
1)20mM组氨酸-盐酸盐，pH 6.5
2)20mM组氨酸-盐酸盐，0.2mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.5
3)20mM组氨酸-盐酸盐，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5
过滤每种制剂并以0.5mL/瓶填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，水针塞压塞轧盖封口。样品置于25℃恒温摇床上，以300rpm的速度振摇。外观结果表明，表面活性剂有效防止了抗PCSK-9抗体的聚集。而聚山梨醇酯20与聚山梨醇酯80对H001-4-YTE作用无明显差异，我们选择聚山梨醇酯80作为抗PCSK-9抗体的稳定剂。
表9表面活性剂对于25℃，300rpm振摇的H001-4-YTE聚集的影响
实施例9、制剂中缓冲体系的筛选与确认
用pH 6.0或6.5的含20mM组氨酸-盐酸盐或20mM琥珀酸-琥珀酸钠的缓冲液制备含25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，抗体蛋白浓度为50mg/ml的制剂。过滤每种制剂并以3.6mL/瓶填充入6mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中进行冻干，所述玻璃瓶用冷冻干燥无菌粉末用卤化丁基橡胶塞封口。将冻干品保存于2-8℃、25℃和40℃后，使用注射用水复溶，进行稳定性分析。结果显示抗PCSK-9抗体在2-8℃和25℃均非常稳定。但第0天复溶外观显示与His体系相比pH6.0琥珀酸缓冲液乳光明显(表中未显示)，因此选择组氨酸体系作为抗PCSK-9抗体的缓冲体系。
表10H001-4-YTE冻干粉在不同温度下的稳定性
实施例10、制剂成分的综合筛选
用含下列不同浓度表面活性剂、不同pH、不同离子强度的缓冲液中，制备PCSK-9抗体蛋白浓度为50mg/ml，含25mg/ml蔗糖的抗PCSK-9抗体制剂：
1)10mM组氨酸-盐酸盐，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5
2)10mM组氨酸-盐酸盐，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0
3)10mM组氨酸-盐酸盐，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5
4)15mM组氨酸-盐酸盐，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5
5)10mM组氨酸-盐酸盐，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0
6)15mM组氨酸-盐酸盐，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5
7)15mM组氨酸-盐酸盐，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0
8)5mM组氨酸-盐酸盐，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5
9)15mM组氨酸-盐酸盐，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5
10)5mM组氨酸-盐酸盐，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0
11)5mM组氨酸-盐酸盐，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5
过滤每种制剂并以3.6mL/瓶填充入6mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中进行冻干，所述玻璃瓶用冷冻干燥无菌粉末用卤化丁基橡胶塞封口。将样品保存于40℃条件下进行稳定性分析，以SEC单体的差值进行数据分析，结果显示在蛋白浓度为50mg/ml，含25mg/ml蔗糖条件下，使用离子强度为pH 6.0，10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，且含0.2mg/ml的聚山梨醇酯80配制PCSK-9抗体更利于PCSK-9抗体的稳定。冻干复溶后，经测定，其最终制剂中各组分浓度为冻干前原液的3倍(蛋白浓度为150mg/ml，75mg/ml蔗糖，30mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80)，pH为6.3±0.1。
表11H001-4-YTE高温实验结果
实施例11、一次干燥温度的优化
用pH 6.0的含10mM组氨酸-盐酸盐的缓冲液，制备PCSK-9抗体蛋白浓度为50mg/ml，含25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80的抗PCSK-9抗体制剂。将抗体以3.6mL/瓶填充入6mL西林瓶中，分别以-14℃和-5℃的一次干燥温度进行冻干，并用冻干胶塞封口。复溶样品进行冻干前后对比。结果表明，-5℃为冻干工艺较优的一次干燥温度。
表12H001-4-YTE用不同一次干燥工艺制备样品冻干前后对比
实施例12、制剂与不同材质容器的相容性测定
H001-4-YTE以50mg/ml配制在pH 6.0，10mM组氨酸-盐酸盐，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80中。将制剂分别填充在玻璃瓶、储液袋和316L不锈钢罐中，2-8℃放置24小时。蛋白含量和纯度分析表明，H001-4-YTE在24小时内是稳定的。该制剂与316L不锈钢罐，玻璃瓶和储液袋可以相容。
表13在不同接触材料中H001-4-YTE的稳定性
实施例13、制剂与不同滤膜的相容性测定
H001-4-YTE以50mg/ml配制在pH 6.0，10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80中。将制剂分别过0.22μm PES滤膜和PVDF滤膜并于30min和1h取样检测。蛋白含量、外观和纯度分析表明，H001-4-YTE在与滤膜接触的1小时内是稳定的。该制剂与PES和PVDF滤膜均可以相容。
表14在不同滤膜材质中H001-4-YTE的稳定性
实施例14、其它可选择制剂配方
本发明的药物组合物可以做为药物制剂原液，或直接做为注射液。当本发明的药物组合物做为药物制剂原液时，经冻干工艺，制备成冻干制剂，冻干制剂经复溶后成注射液，可供临床使用。本发明按照稀冻浓溶的工艺制备冻干制剂，即对低组分浓度的药物制剂原液进行冻干，得到冻干制剂，使用时将冻干制剂重新溶解成较高浓度的药物组合物供临床使用。冻干制剂的保存稳定性比液体制剂更长。冻干制剂所用的药物制剂原液，各组分浓度越高，冻干时间越长。综合冻干工艺的各项指标设置，通常药物制剂原液各组分浓度为复溶后注射液各组分浓度的2-5倍，本发明的优选实施例为3倍。
本发明提供的稳定的药物制剂包含：PCSK-9抗体蛋白(非限制性实施例如h001-4-YTE)和任选自以下的稳定缓冲液的组合：
(1)抗体h001-4-YTE 150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.4；
(2)抗体h001-4-YTE 150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.2；
(3)抗体h001-4-YTE 150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.3；
(4)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.4；
(5)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.3；
(6)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.2；
(7)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.1；
(8)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.0；
(9)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.5；
(10)抗体h001-4 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.3；
(11)抗体h001-4 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.2；
(12)抗体h001-4 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.4；
(13)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.1mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.3；
(14)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和15mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.2；
(15)抗体h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.4。
(16)抗体h001-4-YTE 30mg/ml，10mg/ml蔗糖，0.05mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.5的5mM组氨酸-盐酸盐缓冲液；
(17)抗体h001-4-YTE 70mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为6.5的30mM组氨酸-盐酸盐缓冲液；
(18)抗体h001-4-YTE 45mg/ml，20mg/ml蔗糖，0.1mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为6.0的8mM组氨酸-盐酸盐缓冲液；
(19)抗体h001-4-YTE 55mg/ml，40mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为6.2的15mM组氨酸-盐酸盐缓冲液。
本发明的药物组合物可经冻干工艺制备成相应的冻干制剂，该冻干制剂可用注射药水复溶，得到以下供临床使用的药物组和物：
(1)抗体PCSK-9抗体蛋白150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.3±0.1；
(2)抗体PCSK-9抗体蛋白120mg/ml，55mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.0；
(3)抗体PCSK-9抗体蛋白200mg/ml，95mg/ml蔗糖，0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM组氨酸-盐酸盐缓冲液，最终pH为6.5。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司
上海恒瑞医药有限公司
<120> 一种PCSK-9抗体药物组合物及其用途
<130> P19113708CP
<150> CN 201710519829.6
<151> 2017-06-30
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带His标签的pCSK9:pCSK9-PADRE-His6,用于免疫原免疫小鼠或检测试剂
<400> 1
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695
<210> 2
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带PADRE肽和His标签的pCSK9:pCSK9-PADRE-His6,作为免疫原,所含PADR
E肽可以促进免疫
<400> 2
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu
690 695 700
Lys Ala Ala Ala His His His His His His
705 710
<210> 3
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带TEV酶切位点的
pCSK9与his标签融合蛋白：pCSK9-TEV-His6，可通过TEV酶切获得N-pCSK9（
N端pCSK9结构域），作为免疫原
<400> 3
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg
450 455 460
Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val
465 470 475 480
Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser
485 490 495
Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys
500 505 510
Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala
515 520 525
Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr
530 535 540
Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln
545 550 555 560
Gln Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp
565 570 575
Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn
580 585 590
Gln Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His
595 600 605
Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro
610 615 620
Gln Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly
625 630 635 640
Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val
645 650 655
Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser
660 665 670
Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg
675 680 685
His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695 700
<210> 4
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pCSK9-D374Y突变蛋白，带his标签：pCSK9-D374Y-His6，作为检测试剂
<400> 4
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695
<210> 5
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 插入生物素接受肽及his标签的pCSK9蛋白：pCSK9-BP15-His6，作为检测试
剂，BP15肽位置在表达过程中能够进行生物素标记，免除体外生物素标记及
可能导致的构建变化
<400> 5
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690 695 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705 710 715
<210> 6
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 插入生物素接受肽及his标签的pCSK9
D374Y突变体蛋白：pCSK9-D374Y-BP15-His6，检测蛋白
<400> 6
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690 695 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705 710 715
<210> 7
<211> 802
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带Flag标签和His标签的pCSK9受体蛋白LDLR胞外域片段：LDLR-ECD-Flag-H
is6，检测试剂
<400> 7
Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly
35 40 45
Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu
50 55 60
Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65 70 75 80
Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp
85 90 95
Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
100 105 110
Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys
115 120 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
130 135 140
Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145 150 155 160
Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp
210 215 220
Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu
225 230 235 240
Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp
245 250 255
Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn
260 265 270
Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu
275 280 285
Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp
290 295 300
Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp
305 310 315 320
Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr
325 330 335
Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys
340 345 350
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys
355 360 365
Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln
370 375 380
Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr
385 390 395 400
Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg
405 410 415
Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu
420 425 430
Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser
450 455 460
Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala
465 470 475 480
Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly
485 490 495
Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe
500 505 510
Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His
515 520 525
Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile
545 550 555 560
Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr
565 570 575
Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly
580 585 590
Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile
610 615 620
Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn
625 630 635 640
Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His
645 650 655
Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu
660 665 670
Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn
675 680 685
Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu
690 695 700
Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala
705 710 715 720
Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val
725 730 735
Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu
740 745 750
Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser
755 760 765
His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro
770 775 780
Ser Ser Val Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His
785 790 795 800
His His
<210> 8
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白（具有与pCSK9结合活性）
：LDLR-sECD-Fc（hIgG1）作为检测试剂
<400> 8
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20 25 30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35 40 45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys
50 55 60
Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys Val Asn Leu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln Leu Asp Pro His Thr Lys
85 90 95
Ala Cys Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
100 105 110
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
165 170 175
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
180 185 190
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
195 200 205
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
210 215 220
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
225 230 235 240
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
260 265 270
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290 295 300
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 9
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 更加缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白（具有与pCSK9结合活
性）：LDLR-ssECD -Fc（hIgG1）作为检测试剂
<400> 9
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20 25 30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35 40 45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Pro
50 55 60
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
65 70 75 80
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
100 105 110
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
115 120 125
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
130 135 140
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
145 150 155 160
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
165 170 175
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
180 185 190
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
195 200 205
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
210 215 220
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
225 230 235 240
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
245 250 255
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
260 265 270
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
Asp Tyr Trp Met His
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 13
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 14
Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 15
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 16
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 17
Lys Gln Ser Phe Asn Leu Phe Thr
1 5
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ch-001
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VH.1A
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VH.1B
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VH.1C
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VH.1D
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VH.1E
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ch-001 hVL.1 (CDR接枝)
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VL.1A
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VL.1B
<400> 26
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-VL.1C
<400> 27
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-4-IgG1
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 29
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-4-IgG1
<400> 29
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca 180
ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac 240
cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300
gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac 360
tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc 420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-4-kappa
<400> 30
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 31
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-4-kappa
<400> 31
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggctcg 60
cgatgcgaca tcgtgatgtc tcagagccca tctagcctga gcgccagcgt gggcgacagg 120
gtaaccatca cctgcaagag cagccaaagc ctgctgaaca gcaggacccg caagaacttc 180
ctggcttggt atcagcagaa gcccggcaag tctcccaagt tgctgatcta ctgggccagc 240
accagggaga gcggcgtgcc cgacaggttc agcggctccg gcagcggcac cgacttcacc 300
ctgaccatct ctagtctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgcaa gcagagcttc 360
aatctgttca ccttcggcca gggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggctgcacca 420
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720
tgttga 726
<210> 32
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-4-IgG1-YTE重链
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
245 250 255
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 33
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> h001-4-IgG1-YTE重链
<400> 33
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca 180
ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac 240
cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300
gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac 360
tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc 420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tctacatcac ccgggagcct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

Claims (52)

1.一种药物组合物，其包含PCSK-9抗体或其抗原结合片段以及组氨酸缓冲液；其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为1mg/ml至150mg/ml。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为30mg/ml至100mg/ml。
4.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为45至55mg/ml。
5.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为50mg/ml。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为5.5至6.5。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为6.0至6.5。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为6.0。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述组氨酸缓冲液为组氨酸-盐酸盐缓冲液。
10.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述组氨酸缓冲液浓度为5mM至30mM。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述组氨酸缓冲液浓度为5mM至20mM。
12.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述组氨酸缓冲液浓度为5mM至15mM。
13.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述组氨酸缓冲液浓度为10mM。
14.如权利要求1所述的药物组合物，其中还包括二糖。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述二糖选自海藻糖或蔗糖。
16.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述二糖为蔗糖。
17.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述二糖浓度为10mg/ml至75mg/ml。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述二糖浓度为20mg/ml至40mg/ml。
19.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述二糖浓度为25mg/ml。
20.如权利要求1所述的药物组合物，其中还包括表面活性剂。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯。
22.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。
23.如权利要求20所述的药物组合物，其中表面活性剂的浓度为0.05mg/ml至0.6mg/ml。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为0.1mg/ml至0.4mg/ml。
25.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为0.1mg/ml至0.3mg/ml。
26.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为0.2mg/ml。
27.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段具有选自如SEQ ID NO:18-23所示的重链可变区，和选自如SEQ ID NO:24-27所示的轻链可变区。
28.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK-9抗体的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：30所示，所述PCSK-9抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：28或32所示。
29.制备权利要求1至28任一项所述的药物组合物的方法，包括：PCSK-9抗体或其抗原结合片段原液经缓冲液置换的步骤，所述缓冲液为组氨酸缓冲液，所述缓冲液浓度为5mM至30mM，所述缓冲液pH为6.0至6.5；
其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
30.如权利要求29所述的方法，其还包括向置换步骤所得溶液中加入蔗糖和聚山梨醇80，再经组氨酸缓冲液定容的步骤，所述组氨酸缓冲液浓度为10mM至20mM，所述组氨酸缓冲液pH为6.0至6.5。
31.制备含PCSK-9抗体的冻干制剂的方法，其中包括将权利要求1至28任一项所述的药物组合物经冷冻干燥的步骤；
其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
32.如权利要求31所述制备含PCSK-9抗体的冻干制剂的方法，其中所述冷冻干燥依次包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。
33.一种由权利要求31或32所述的方法制备的含PCSK-9抗体的冻干制剂。
34.制备含有PCSK-9抗体的复溶溶液的方法，其中包括将权利要求33所述的冻干制剂经复溶的步骤，其复溶所用溶剂为注射用水。
35.一种由权利要求34所述的方法制备的含有PCSK-9抗体的复溶溶液：其包含PCSK-9抗体或其抗原结合片段，以及组氨酸缓冲液；其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
36.如权利要求35所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为120mg/ml至200mg/ml。
37.如权利要求36所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述PCSK-9抗体或其抗原结合片段浓度为150mg/ml。
38.如权利要求35所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述复溶溶液的pH为6.0-6.5。
39.如权利要求38所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述复溶溶液的pH为6.3。
40.如权利要求35所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述组氨酸缓冲液浓度为15mM至45mM。
41.如权利要求40所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述组氨酸缓冲液浓度为30mM。
42.如权利要求35所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中还包括二糖。
43.如权利要求42所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述二糖选自海藻糖或蔗糖。
44.如权利要求42所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述二糖为蔗糖。
45.如权利要求42所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述二糖浓度为55mg/ml至95mg/ml。
46.如权利要求45所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述二糖浓度为75mg/ml。
47.如权利要求35所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中还包括表面活性剂。
48.如权利要求47所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯。
49.如权利要求47所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。
50.如权利要求47所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中表面活性剂的浓度为0.4mg/ml至0.8mg/ml。
51.如权利要求50所述的含有PCSK-9抗体的复溶溶液，其中表面活性剂的浓度为0.6mg/ml。
52.一种制品，其包括容器，该容器中装有权利要求1至28任一项所述的药物组合物或权利要求33所述的冻干制剂或权利要求35-51任一项所述的冻干制剂的复溶溶液。
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