TWI720325B

TWI720325B - 一種pcsk-9抗體醫藥組成物及其用途

Info

Publication number: TWI720325B
Application number: TW107122552A
Authority: TW
Inventors: 田晨敏; 李皓; 劉洵
Original assignee: 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恒瑞醫藥有限公司
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2021-03-01
Also published as: EP3647325A4; WO2019001560A1; TW201904609A; CN110431153A; EP3647325A1; CA3067953A1; US20200223941A1; CN110431153B; AU2018291702A1; JP2020532491A; RU2020102952A; RU2020102952A3

Abstract

本發明涉及一種醫藥組成物，其包含在組胺酸緩衝液中的PCSK9抗體或其抗原結合片段。除此之外，醫藥組成物還可含有糖和非離子型表面活性劑。本發明之醫藥組成物在儲存數月之後展現了很高的抗體穩定性。

Description

一種PCSK-9抗體醫藥組成物及其用途

本發明屬於藥物製劑領域，具體涉及一種包含PCSK-9抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。

高膽固醇血症是一種以血清膽固醇水平升高為主要特徵的脂類代謝異常疾病，其主要表現為血清膽固醇水平升高，導致膽固醇在血管聚集，形成動脈粥狀硬化。大量的臨床及實驗研究結果都證實，脂質代謝異常和冠心病的發生、發展有著密切的關係。因此，降低血液中的膽固醇濃度成為了目前治療和預防動脈粥狀硬化的一個主要手段。

隨著中國大陸的國民生活水平的快速提高，血脂異常也成為了危害中國大陸的城鄉居民的主要因素。據2012年統計數據，中國大陸每年死亡人數中約有40%死於心血管疾病。目前，中國大陸的成人血脂異常患病率為18.6%，估計全國血脂異常現患人數1.6億。不同類型的血脂異常現患率分別為：高膽固醇血症2.9%，高三酸甘油酯血症11.9%，低高密度脂蛋白血症7.4%；另有3.9%的人血膽固醇邊緣升高。2012年中國大陸的衛生部疾病預防控制專家委員會慢性病防治分委會達成的「慢性病防治中國專家共識」中提到，中國大陸有3300萬高膽固醇血症患者，而從局部地區看，中國大陸的血脂異常發病率情況遠比上述數據要嚴重。

目前，臨床上調脂藥物主要以他汀類(statins)為主。立普妥(Liptor)作為全世界應用最廣泛的降膽固醇藥物，也是醫藥史上最暢銷藥物，藉由阻斷肝臟生產膽固醇的酶作用，減少膽固醇的生產，從而增加肝臟從血液中攝取更多的膽固醇，進而減低血液中膽固醇濃度。但是立普妥也有其不足之處，首先從數據看，立普妥可以降低30%-40%的低密度脂蛋白，但仍然有很多病人依然無法到達有效的降低血脂(低密度脂蛋白濃度<50mg/dL)，其次病人對立普妥的響應率也有人種差異。這些原因，致使病人需要一個更為有效的降低血脂的藥物。

家族性高膽固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FM)是一種體染色體單基因顯性遺傳性疾病，其臨床特徵為血總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-c)顯著升高、瞼黃瘤、角膜弓以及早發的心血管疾病。低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLR)基因突變致其缺陷或缺乏，LDL-c不能順利轉運到肝臟清除，以致血中LDL-c水平升高。目前已明確3種基因與FM的發生有關，它們分別是LDLR基因、載脂蛋白B100基因和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)基因。

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一種前蛋白轉化酶，屬於分泌的枯草桿菌酶家族的蛋白酶K亞族。該編碼蛋白是作為可溶性酶原合成的，在內質網中經過自身催化分子內加工。實驗結果顯示，PCSK9促進LDL受體的降解從而增加血漿中LDL膽固醇含量，而LDL受體介導肝內的LDL胞吞過程，後者是從循環系統清除LDL的主要途徑。研究發現，12.5%的高膽固醇血症(ADH)患者檢測有PCSK9基因突變。PCSK9突變形式多樣，根據突變對PCSK9調節LDL-C水平的不同影響可分為兩類：功能缺失型和功能獲得型。其中功能缺失型突變與低血膽固醇水平有關，有預防冠狀動脈粥狀硬化性心臟病發生的作用，非洲人群中低膽固醇的PCSK9突變率高於其他種族。PCSK9功能獲得型突變體藉由增加PCSK9的功能、降低LDLR的表達而升高血漿膽固醇水平，可以導致嚴重高膽固醇血症和早發冠狀動脈粥狀硬化性心髒病，目前發現的PCSK9功能獲得型突變包括：D374Y、S127R、F216L、N157K、R306S等。其中，與PCSK9野生型相比，D374Y突變體細胞表面的LDLR減少了36%，S127R突變有相應減少了10%。

但是，抗體藥物其分子量大，結構複雜，容易降解、聚合或發生不希望發生的化學修飾等而變得不穩定。為了使抗體適合於給藥，並且在儲存及隨後使用過程中能保持穩定性，發揮更好的效果，抗體藥物的穩定製劑研究顯得尤為重要。

儘管，目前有多家公司在研發包含PCSK-9抗體及藥物配製劑，如：CN103717237A、CN104364266A等。但對於新的PCSK-9抗體，仍需要研製更適於給藥的包含PCSK-9的藥物(製劑)組合物。

本發明提供一種醫藥組成物，其包含PCSK-9抗體或其抗原結合片段，以及緩衝液，所述緩衝液優選為組胺酸或琥珀酸鹽或磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液，更優選為組胺酸緩衝液，最優選為組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。

在可選的實施方案中，醫藥組成物其中所述PCSK-9抗體或其抗原結合片段濃度為大約1mg/ml至150mg/ml，優選為大約30mg/ml至100mg/ml，最優選為50-60mg/ml，更優選為50mg/ml。非限制性實施例包括45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml、60mg/ml。

在可選的實施方案中，緩衝液的濃度為約5mM至50mM，優選為大約5mM至30mM，非限制性實施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、26mM、28mM、30mM，更優選為10mM至15mM，最優選為10mM。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中所述緩衝液的pH值約為5.5到6.5，優選為大約6.0至6.5，非限制性實施例包括約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5。

進一步的，在可選的實施方案中，醫藥組成物還包含糖。本發明的「糖」包含常規組合物(CH2O)n及其衍生物，包括單醣、二糖、三糖、多醣、糖醇、還原性糖、非還原性糖等等。可選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、sylitol、山梨糖醇、甘露醇、蜜二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳果糖、麥芽酮糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異-麥芽酮糖等等。優選的糖是非還原性二糖，更優選為海藻糖或蔗糖。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中糖的濃度為約10mg/ml至約75mg/ml，優選為20mg/ml至約60mg/ml，更優選為20mg/ml至約40mg/ml，最優選為25mg/ml，非限制性實施例包括20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml。

在可選的實施方案中，醫藥組成物還包含表面活性劑。可選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖苷鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉荳蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉荳蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉荳蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉荳蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉荳蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。優選的表面活性劑是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更優選為聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為約0.05mg/ml至1.0mg/ml，優選為0.1mg/ml至0.4mg/ml，非限制性實施例包括0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml，進一步優選為0.1mg/ml至0.3mg/ml，更優選為0.1mg/ml至0.2mg/ml，最優選為0.2mg/ml。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)1-150mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段，(b)5-30mM的組胺酸緩衝液，pH約為5.5-6.5，更優選為大約6.0-6.5(c)10-75mg/ml的蔗糖，和(d)0.05-0.6mg/ml的聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)50mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)5-20mM的組胺酸緩衝液；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.1-0.3mg/ml的聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)1-150mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段，和 (b)5-30mM的組胺酸緩衝液；且所述醫藥組成物的pH約為6.0-6.5。

在可選的實施方案中，醫藥組成物包含：(a)1-150mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)5-30mM的組胺酸緩衝液；(c)10-75mg/ml的蔗糖；和(d)0.05-0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，且所述醫藥組成物的pH約為6.0-6.5。組胺酸緩衝液優選組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。

在可選的實施方案中，醫藥組成物包含：(a)50mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)5-20mM的組胺酸緩衝液；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.1-0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，且所述醫藥組成物的pH約為6.0-6.5。組胺酸緩衝液優選組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。

在可選的實施方案中，醫藥組成物包含：(a)50mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)10mM的組胺酸緩衝液；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，且所述醫藥組成物的pH為6.3±0.1。組胺酸緩衝液優選組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)150mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)30mM的組胺酸-鹽酸鹽緩衝液；(c)75mg/ml的蔗糖；和(d)0.6mg/ml的聚山梨醇酯80；醫藥組成物的最終PH6.3。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)50mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)10mM的組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.0；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)150mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)20mM的組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.5；和(c)70mg/ml的蔗糖。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)150mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)20mM的組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.5；和(c)70mg/ml的α,α-二水合海藻糖。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)50mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)20mM的組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.0；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，所述醫藥組成物包含：(a)50mg/ml的PCSK-9抗體或其抗原結合片段；(b)20mM的組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.5；(c)25mg/ml的蔗糖；和(d)0.2mg/ml的聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中所述PCSK-9抗體或抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中所述抗體或抗原結合片段可選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，優選人源化抗體。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中所述PCSK-9抗體的輕鏈與h001-4-YTE的抗體輕鏈胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，所述PCSK-9抗體的重鏈胺基酸序列與h001-4-YTE的抗體重鏈具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，所述h001-4-YTE抗體輕鏈序列如SEQ ID NO：30所示，h001-4-YTE抗體重鏈序列如SEQ ID NO：32所示。

本發明還提供製備前述醫藥組成物的方法，其中包括：PCSK-9抗體或其抗原結合片段原液經緩衝液置換的步驟，所述緩衝液類型優選為組胺酸緩衝液，更優選為組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，所述緩衝液濃度優選為大約5mM至30mM，非限制性實施例包括5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、26mM、28mM、30mM，更優選為10mM至15mM；所述緩衝液pH約為6.0至6.5，非限制性實施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。

原液進一步地，製備前述醫藥組成物的方法，還包括向置換步驟所得溶液中加入蔗糖和聚山梨醇80，再經緩衝液定容的步驟，其中緩衝液濃度優選為大約10mM至20mM，非限制性實施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM；所述緩衝液pH約為6.0至6.5，非限制性實施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。

本發明還提供一種製備含PCSK-9抗體的凍乾製劑的方法，其中包括將前述醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。

在可選的實施方案中，製備含PCSK-9抗體的凍乾製劑的方法中所述冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。所述的預凍為從5℃凍至-40℃至-50℃，最優為-45℃，對真空度不作要求。所述的一次乾燥溫度為-14℃至0℃，最優為-5℃；真空度0.1mBar-0.5mBar，最優為 0.3mBar。二次乾燥溫度20℃-30℃，最優為25℃，真空度從0.1mBar-0.5mBar，最優為0.3mBar，降至真空度0.005mBar-0.02mBar，最優為0.01mBar。本發明還提供一種經前述製備含PCSK-9抗體的凍乾製劑的方法製備的含PCSK-9抗體的凍乾製劑。

在一些實施方案中，該凍乾製劑於2-8℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，該凍乾製劑於40℃穩定至少7天，至少14天或至少28天。

本發明還提供製備含有PCSK-9抗體的凍乾製劑的復溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑經復溶的步驟，其復溶所用溶液選自但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液。

本發明還提供一種經前述含有PCSK-9抗體的凍乾製劑的復溶溶液的方法製備的含有PCSK-9抗體的凍乾製劑的復溶溶液。

在可選的實施方案中，本發明所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其所含組分的濃度為凍乾前醫藥組成物所含組分濃度的2-5倍，優選為3倍。

在可選的實施方案中，所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述PCSK-9抗體或其抗原結合片段濃度為大約120mg/ml至200mg/ml，最優選為150mg/ml。

在可選的實施方案中，所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述醫藥組成物的pH約為6.0-6.5，優選為6.4。該复溶溶液的PH與配製所用原液的緩衝液pH相關，當原液PH為6.0時，最終复溶溶液的PH為6.3±1。

在可選的實施方案中，所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述緩衝液濃度為大約15mM至45mM，優選為30mM。

在可選的實施方案中，所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中還包括二糖，所述二糖優選自海藻糖或蔗糖，最優選為蔗糖。

在可選的實施方案中，所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述糖濃度為大約55mg/ml至95mg/ml，優選為75mg/ml。

在可選的實施方案中，所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中還包括表面活性劑，所述表面活性劑優選為聚山梨醇酯，更優選為聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中表面活性劑的濃度從大約0.4mg/ml至0.8mg/ml，優選為0.6mg/ml。

本發明進一步提供一種製品或試劑盒，其包含裝有本文所述任何穩定的醫藥組成物的容器。在一些實施方案中，該玻璃瓶為中性硼矽玻璃管制注射劑瓶。

本發明還提供前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的復溶溶液在製備用於治療PCSK-9相關的疾病或病症的藥物中的用途，其中所述的疾病或病症優選膽固醇相關疾病，更優選為高膽固醇血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠狀動脈心臟病、中風、心血管疾病、阿茲海默症和一般性的異常脂血症，最優選高膽固醇血症、異常脂血症、動脈粥狀硬化、心血管疾病或冠狀動脈心臟病。

本發明還提供前一種治療和預防PCSK-9相關的疾病或病症的方法，包括給予所需患者治療有效量的前述醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的復溶溶液，其中所述的疾病優選膽固醇相關疾病，更優選為高膽固醇血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠狀動脈心臟病、中風、心血管疾病、阿茲海默症和一般性的異常脂血症，最優選高膽固醇血症、異常脂血症、動脈粥狀硬化、心血管疾病或冠狀動脈心臟病。

本發明還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的復溶溶液。

要理解，可以組合本文所述各個實施方案的一項、一些或所有特性以形成本發明的其它實施方案。本發明的這些和其它方面對於本領域技術人員會變得顯然。本發明的這些和其它實施方案藉由下面的詳述進一步描述。

一、術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

「緩衝液」指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝液。將pH控制在適當範圍中的緩衝液的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝液。

「組胺酸緩衝液」是包含組胺酸離子的緩衝液。組胺酸緩衝液的實例包括組胺酸-鹽酸鹽，組胺酸-醋酸鹽，組胺酸-磷酸鹽，組胺酸-硫酸鹽等緩衝液，優選組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。組胺酸-鹽酸鹽緩衝液是組胺酸與鹽酸或組胺酸與組胺酸鹽酸鹽配製而成。

「檸檬酸鹽緩衝液」是包括檸檬酸根離子的緩衝液。檸檬酸鹽緩衝液的實例包括檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鉀、檸檬酸-檸檬酸鈣、檸檬酸-檸檬酸鎂等。優選的檸檬酸鹽緩衝液是檸檬酸-檸檬酸鈉。

「琥珀酸鹽緩衝液」是包括琥珀酸離子的緩衝液。琥珀酸鹽緩衝液的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。優選的琥珀酸鹽緩衝液是琥珀酸-琥珀酸鈉。

「磷酸鹽緩衝液」是包括磷酸離子的緩衝液。磷酸鹽緩衝液的實例包括磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鉀等。優選的磷酸鹽緩衝液是磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鈉。

「醋酸鹽緩衝液」是包括醋酸根離子的緩衝液。醋酸鹽緩衝液的實例包括醋酸-醋酸鈉、醋酸組胺酸鹽、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。優選的醋酸鹽緩衝液是醋酸-醋酸鈉。

「醫藥組成物」表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前驅藥物與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是保持抗體活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本文中，「醫藥組成物」和「製劑」並不互相排斥。

「凍乾製劑」表示液體或溶液形式的醫藥組成物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。

本發明的冷凍乾燥包括預凍，一次乾燥，二次乾燥。預凍目的是冷凍產品，獲得結晶固體。預凍溫度和預凍速度是兩個重要流程參數，本發明中將預凍溫度設定為-45℃，預凍速度設定為1℃/min。一次乾燥也稱為主乾燥，是樣品冷凍乾燥的主要階段。目的是移除產品裡冰的同時，保持產品形狀，最小程度的減少對產品的破壞。若一次乾燥的溫度和真空度選擇不當，會導致製品的塌陷。較高的溫度和真空度均會加快凍乾效率，但同時也會增加製品塌陷的風險。本發明所述一次乾燥的溫度可為本領域常規的溫度，例如-27℃-0℃，優選為-14℃至-5℃。二次乾燥也稱為解析乾燥，是藉由抽極限真空(0.01mbar)和升高溫度(20-40℃)除去製品中結合水的主要步驟。由於大多數生物製品對溫度比較敏感，所以二次乾燥溫度選擇在溫度範圍的低點，即25℃。冷凍乾燥的時間與冷凍機，凍乾製劑劑量，凍乾藥劑的容器有關。這種時間的調整是在本領域技術人員所熟知的。

本發明所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的醫藥組成物，優選地，醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。

穩定的藥物抗體製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、優選6個月、更優選1年，且甚至更優選地最多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃和40℃在內的溫度保存包括1個月、3個月、6個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的可接受的標準如下：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、優選不超過約5%的抗體單體發生降解。藉由視覺分析，藥物抗體製劑是無色的，或澄清至稍微乳白色。所述製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、優選不超過約5%的截短。通常形成不超過約10%、優選不超過約5%的聚集。

如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、粒徑排阻層析法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼所述抗體在藥物製劑中「保留它的物理穩定性」。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。

如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼所述抗體在藥物製劑中「保留它的化學穩定性」。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如粒徑排阻層析法和SDS-PAGE等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。

如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼所述抗體在藥物製劑中「保留它的生物活性」。抗體的生物活性可以例如藉由抗原結合測定來確定。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本發明所述的「抗體」指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。

在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，優選人源化抗體。

術語「鼠源抗體」在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人PCSK-9的單株抗體。製備時用PCSK-9抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。

術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中複製可變區基因，再根據需要複製人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。在本發明一個優選的實施方案中，所述的PCSK-9嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。所述的PCSK-9嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，優選包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody -dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4。

術語「人源化抗體(humanized antibody)」，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在「VBase」人種系序列數據庫(在www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，EA等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。

「PCSK-9抗體」為與PCSK-9特異性結合的抗體，包括但不限於PCT/CN2016/111053中的h001系列PCSK-9人源化抗體。其中，h001系列PCSK-9人源化抗體，是利用人PCSK-9免疫小鼠篩選，並經人源化改造獲得。

本發明中所述的「抗原結合片段」，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，以及與人PCSK-9結合的ScFv片段及其他利用了能與人PCSK-9結合的抗體的VH和VL區形成的可結合人PCSK-9的片段；其包含本發明所述抗體的選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2中的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。本發明的術語「與PCSK-9結合」，指能與人PCSK-9相互作用。本發明的術語「抗原結合位點」指抗原上連續或不連續的，由本PCSK-9抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以複製並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人PCSK-9特異性結合的抗體得到穩定的複製。陽性的複製在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

「保守修飾」或「保守置換或取代」是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。

胺基酸序列「同一性」是指兩個蛋白或多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同胺基酸殘基佔據時，例如如果兩個多肽的一個位置都被同一個胺基酸殘基佔據時，那麼所述分子在該位置是一致的。適於確定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的實例是BLAST和BLAST2.0算法，它們分別描述於Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。用於執行BLAST分析的軟體可在美國國家生物技術信息中心公開獲取(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

「給予」和「處理」當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。「給予」和「處理」可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。「給予」和「處理」還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。「處理」當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

「治療」意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，所述患者俱有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作「治療有效量」)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

「有效量」包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

「Tm值」是指蛋白質熱變性溫度，即一半蛋白去折疊時的溫度，此時蛋白的空間結構被破壞，所以Tm值越高，蛋白熱穩定性越高。

「置換」是指溶解抗體蛋白的溶劑體系的置換，例如，使用穩定製劑的緩衝體係經物理操作方式將含抗體蛋白的高鹽或高滲溶劑體系置換，從而使抗體蛋白存在於穩定製劑中。所稱物理操作方式包括但不限於超濾、透析或離心後復溶。

二、實施例與測試例

藉由以下實施例進一步詳細說明本發明。這些實施例僅用於說明性目的，而並不用於限製本發明的範圍。

本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

[實施例]

PCSK-9抗原和抗體的製備

實施例1、PCSK9抗原及檢測用蛋白的製備

蛋白設計及表達

以UniPfot Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(人PCSK9，Uniprot號：Q8MBP7)作為本發明PCSK9的模板，設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在PCSK9蛋白基礎上融合不同的標籤如his標籤或促進免疫的肽段如PADRE肽，分別克隆到pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)或pTargeT載體上(promega,A1410)，在293細胞瞬轉表達或CHO-S穩定表達，純化，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。

帶His標籤的PCSK9：PCSK9-His6，用於免疫原免疫小鼠或檢測試劑

SEQ ID NO：1註釋：劃橫線部分為信號肽，斜體部分為His6-tag(6組氨酸標籤)。

帶PADRE肽和His標籤的PCSK9：PCSK9-PADRE-His6，作為免疫原，所含PADRE肽可以促進免疫；

SEQ ID NO：2註釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為linker，點劃線部分為PADRE肽，斜體部分為His6-tag。

帶TEV酶切位點的PCSK9與his標籤融合蛋白：PCSK9-TEV-His6，可藉由TEV酶切獲得N-PCSK9(N端pCSK9結構域)，作為免疫原；

SEQ ID NO：3 註釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為TEV酶切位點，斜體部分為His6-tag。

PCSK9-D374Y突變蛋白，帶his標籤：PCSK9-D374Y-His6，作為檢測試劑；

SEQ ID NO：4註釋：劃橫線部分為信號肽，斜體部分為His6-tag。

PCSK9：插入生物素接受肽BP15及his標籤的PCSK9蛋白：PCSK9-BP15-His6，作為檢測試劑，BP15肽位置在表達過程中能夠進行生物素標記，免除體外生物素標記及可能導致的構象變化；

SEQ ID NO：5註釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為生物素接受肽，斜體部分為His6-tag。

PCSK9-Y：插入生物素接受肽及his標籤的PCSK9 D374Y突變體蛋白：PCSK9-D374Y-BP15-His6，檢測蛋白；

SEQ ID NO：6註釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為生物素接受肽，斜體部分為His6-tag。

帶Flag標籤和His標籤的pCSK9受體蛋白LDLR胞外域片段：LDLR-ECD-Flag-His6，檢測試劑

SEQ ID NO：7註釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為Flag標籤，斜體部分為His6-tag。

LDLR-Fc：縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與PCSK9結合活性)：LDLR-sECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑

SEQ ID NO：8註釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為縮短形式的具有與PCSK9結合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-sECD)，斜體部分為hIgG1-Fc部分。

更加縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與pCSK9結合活性)：LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑

SEQ ID NO：9註釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為更加縮短形式的具有與PCSK9結合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-ssECD)，斜體部分為hIgG1-Fc部分。

實施例2、PCSK9、LDLR相關重組蛋白的純化重組蛋白以及雜交瘤抗體、重組抗體的純化

1、帶His標籤的重組蛋白的純化步驟：

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液換置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳柱，沖洗2-5倍柱體積。將置換後的上清樣品上IMAC柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗柱子，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。收集的洗脫液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，流動相為PBS。去聚體峰，收集洗脫峰。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑑定為正確後分裝備用。得到帶His標籤的PCSK9-His6(SEQ ID NO：1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)、PCSK9-TEV-His6(SEQ ID NO：3)PCSK9-D374Y-His6(SEQ ID NO： 4)、PCSK9-BP15-His6(SEQ ID NO：5)、PCSK9-D374Y-BP15-His6(SEQ ID NO：6)用於本發明抗體的免疫原或檢測試劑。其中PCSK9-TEV-His6純化後藉由TEV酶進行酶切，酶切產物再利用IMAC柱結合去除TEV酶、未酶切完全的PCSK9-TEV-His6或切除的帶His標籤的C端結構域片段，IMAC流出液中濃縮獲得僅留N端結構域的PCSK9片段(縮寫為N-PCSK9)，作為免疫原用於小鼠免疫。

2、帶His標籤和Flag標籤的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO：7)重組蛋白的純化步驟：

將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。利用0.5×PBS平衡flag親和柱，沖洗2-5倍柱體積。將除雜後的細胞表達上清樣品上柱。用0.5×PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用含有0.3M NaCl的PBS沖洗柱子，沖洗雜蛋白，並收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)洗脫目的蛋白，並收集，調節pH至中性。收集的洗脫液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，流動相為PBS。去聚體峰，收集洗脫峰收集樣品經電泳，肽圖，LC-MS鑑定正確後分裝備用。得到帶FLAG/His6標籤的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO：7)，用於本發明抗體的性能測試。

3、LDLR的Fc融合蛋白的純化步驟：

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，濃縮至適當體積後上Protein A柱。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用100mM醋酸鈉pH3.0洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl(三羥甲基胺基甲烷-鹽酸)中和。洗脫樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，去聚體的峰收集好後分裝備用。此方法用來純化LDLR-sECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO：8)和LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO：9)。兩者可用作PCSK9抗體功能性測試。

實施例3、抗人PCSK9雜交瘤單株抗體的製備

1、免疫

抗人PCSK9單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按兩種方案免疫(A/B)，每組6-10隻。免疫抗原為帶His標籤的人PCSK9-His6(SEQ ID NO：1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)及N-PCSK9(SEQ ID NO：3)。

方案A用弗氏佐劑(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐劑(CFA)，其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑(IFA)。抗原與佐劑比例為1：1，100μg/隻(首免)，50μg/隻(加強免疫)。第0天腹膜內(IP)注射100μg/隻的乳化後抗原，首免後每兩週一次，共6-8週。

方案B用Titermax(sigma Lot Num：T2684)與Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原與佐劑(titermax)比例為1：1，抗原與佐劑(Alum)比例為3：1，10-20μg/隻(首免)，5μg/隻(加強免疫)。第0天腹膜內(IP)注射20/10μg/隻的乳化後抗原，首免後每週一次，Titermax和Alum交替使用，共6-11週。免疫四周後，根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。

2、細胞融合

選擇血清中抗體滴度高(見後面的測試例1和2，結合PCSK9的ELISA方法)並且滴度趨於平台的小鼠進行脾細胞融合，融合前72小時衝刺免疫所選小鼠，PCSK9-His6 10μg/隻，腹腔注射。採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到雜交瘤細胞。融合好的雜交瘤細胞用HAT完全培養基(含20%FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培養基)重懸，分裝於96孔細胞培養板中(1×105/150μl/孔)，37℃，5%CO2孵育。融合後的第5天加入HAT完全培養基，50μl/孔，37℃，5%CO2孵育。融合後第7天~8天，根據細胞生長密度，全換液，培養基為HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，200μl/孔，37℃，5%CO2孵育。

3、雜交瘤細胞篩選

融合後第10-11天，根據細胞生長密度，進行結合PCSK9或PCSK9-Y的ELISA方法檢測(見測試例1和2)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行PCSK9或PCSK9-Y與LDLR結合的阻斷ELISA檢測(見測試例3和4)，陽性孔換液，並根據細胞密度及時擴大至24孔板中。移入24孔板的細胞株經過複測後進行保種和第一次亞複製。第一次亞複製篩選(見測試例1和2)為陽性的進行保種，並進行第二次亞複製。第二次亞複製為陽性(見測試例1和2)的進行保種和蛋白表達。多次融合獲得有阻斷PCSK9或PCSK9-Y與LDLR結合效果(見測試例3和4)的雜交瘤細胞。

藉由阻斷實驗和結合實驗篩選得到雜交瘤複製mAb-001，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。

其中測得雜交瘤複製mAb-001的鼠抗可變區序列如下：

>mAb-001 VH

SEQ ID NO：10

>mAb-001VL

SEQ ID NO：11註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

實施例4、抗人PCSK9雜交瘤單株抗體的人源化

1、雜交瘤複製mAb-001人源化框架選擇

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟體，分別挑選與mAb-001同源性高的重輕鏈可變區種系基因作為模板，將這兩個鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋。

鼠源抗體mAb-001的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk2.1，人源化重鏈模板為IGHV1-2*02和hjh2，人源化後得到人源化抗體h001-1的可變區序列如下：

>h001-1 VH

SEQ ID NO：18

>h001-1 VL

SEQ ID NO：24註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

2、雜交瘤複製mAb-001的模板選擇和回復突變設計，見下表2；雜交瘤複製回復突變後的人源化序列組合見表4。

Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列，各突變可變區具體序列如下表3：

3、將以上的人源化序列組合進行抗體化，重鏈恆定區來自人IgG1，輕鏈恆定區來自人kappa鏈。得到相應的人源化抗體，經驗證得到的PCSK9抗體與PCSK9和PCSK9-Y有較高的結合活性；並且能有效阻斷PCSK9/PCSK9-Y與LDLR之間的結合。

實施例5、構建和表達抗人PCSK9人源化抗體IgG1及IgG1-YTE形式

本發明構建和表達抗人PCSK9人源化抗體的方法如下：

1、引子設計：利用在線軟體DNAWorks(v3.2.2)(works/)設計多條引子合成VH/VK含重組所需基因片段：5'-30bp Signal peptide+VH/VK+30bp CH1/CL-3'。引子設計原則：目的基因2與目的基因1有2個aa不一樣，則另設突變位點所在引子，如圖1所示。

2、片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作說明書，用上面設計的多條引子，分兩步PCR擴增得到VH/VK含重組所需基因片段。

3、表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)構建及酶切

利用一些特殊的限制性內切酶，如BsmBI，識別序列與酶切位點不同的特性設計構建表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)，如圖2所示。BsmBI酶切載體，切膠回收備用。

4、重組構建表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr

VH/VK含重組所需基因片段與BsmBI酶切回收表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)按3：1比例分別加入DH5α感受態細胞中，0℃冰浴30min，42℃熱擊90秒，加入5倍體積LB medium，37℃孵育45min，塗佈LB-Amp平板，37℃培養過夜，挑取單株送測序得到各目的複製。

本發明的抗體可以，但不限於以上設計構建方式。以h001-4為例進行抗體及其突變體設計，得到

h001-4-WT：h001-4的IgG1形式，即人源化序列組合h001-4，結合來自人IgG1的重鏈恆定區，與來自人kappa鏈的輕鏈恆定區；

h001-4-YTE：h001-4-IgG1-YTE形式，即人源化序列組合h001-4，結合突變的人IgG1(YTE突變)的重鏈恆定區，與來自人kappa鏈的輕鏈恆定區。突變的人IgG1也可以是別種形式的突變。

構建和表達抗人PCSK9人源化抗體(IgG1及h001-4的IgG1-YTE形式)序列如下：

h001-4 IgG1形式，重鏈恆定區來自人IgG1，輕鏈恆定區來自人kappa輕鏈：

重鏈胺基酸序列(人IgG1)：

SEQ ID NO：28

重鏈DNA序列：

SEQ ID NO：29

h001-4-kappa

輕鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：30

輕鏈DNA序列：

SEQ ID NO：31

h001-4-YTE輕鏈為h001-4-kappa：SEQ ID NO：30

h001-4-YTE重鏈胺基酸序列為：

SEQ ID NO：32

h001-4-YTE重鏈DNA序列：

SEQ ID NO：33備註：下劃線部分為信號肽DNA序列

示例性抗體醫藥組成物(製劑)製備流程

第一步：取一定量的純化的PCSK-9抗體(如h001-4-YTE)原液，用不含抗體的緩衝液(如10mM，pH 6.0組胺酸-鹽酸鹽緩衝液)進行溶劑置換(優選超濾)，經超濾膜6倍體積置換，蛋白濃縮到60mg/mL(±2mg/mL)。加入一定體積的蔗糖母液，混勻，使最終蔗糖濃度為25mg/mL。加入一定體積的吐溫-80母液，混勻，使最終吐溫-80濃度為0.2mg/mL。加10mM pH 6.0組胺酸緩衝液定容，使蛋白濃度為50mg/mL(±5mg/mL)，最終產品pH約為6.3±0.1(其他待測試製劑或穩定性製劑參照相似步驟進行配製)。

產品經過濾後中控取樣檢測無菌。將原液過0.22μm PVDF濾芯，收集濾液。

第二步：調節裝量至3.6ml，將濾液灌裝於6ml西林瓶中，半加塞，分別於灌裝開始、灌裝中間、灌裝結束時取樣中控檢測裝量差異。

第三步：將灌裝加塞後的藥液裝入凍乾箱中，凍乾。凍乾程序為預凍、一次乾燥和二次乾燥。凍乾程序結束後，真空加塞。

凍乾所用的時間可隨實際情況調整，凍乾機的型號，凍乾藥劑的裝載量，凍乾藥劑的容器，都會影響凍乾時間。這種時間的調整是在本領域技術人員所熟知的。

第四步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。

第五步：目檢，確認產品無塌陷、裝量不準等缺陷。列印、黏貼西林瓶標籤；列印紙盒標籤，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標籤。

實施例6、緩衝體系的篩選

用下列緩衝液，配製蛋白濃度為1mg/ml的抗PCSK-9抗體 h001-4-YTE製劑：

1)20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 4.0

2)20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 4.5

3)20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 5.0

4)20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 5.5

5)20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 6.0

6)20mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.0

7)20mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.5

8)20mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 7.0

9)20mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 7.5

10)20mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸，pH 7.5

11)20mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸，pH 8.0

12)20mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸，pH 8.5

用示差掃描熱析法(differential scanning calorimetry,DSC)測量抗PCSK-9抗體在每種製劑中的熱穩定性。藥品的熱變性中點溫度(Tm)分析顯示，抗PCSK-9抗體在pH

6.0時熱穩定性較好。結果如表5所示。因此選擇pH6.0-6.5之間的緩衝液：組胺酸-鹽酸鹽、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、琥珀酸-琥珀酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉，進行後續研究。

用下列緩衝液，配製蛋白濃度為1mg/ml的抗PCSK-9抗體製劑：

1)20mM組胺酸-鹽酸鹽，pH 6.0

2)20mM組胺酸-鹽酸鹽，pH 6.5

3)20mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.0

4)20mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.5

5)20mM琥珀酸-琥珀酸鈉，pH 6.0

6)20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 6.0

7)20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 6.5

用示差掃描熱析法(differential scanning calorimetry,DSC)測量抗PCSK-9抗體在每種製劑中的熱穩定性。藥品的熱變性中點溫度(Tm)分析顯示(見表6)，抗PCSK-9抗體在組胺酸、磷酸鹽和琥珀酸鹽緩衝體系中的穩定性略優於檸檬酸鹽緩衝體系。

實施例7、製劑中糖的篩選

用下列不同糖種類的緩衝液，製備PCSK-9抗體蛋白濃度為150mg/ml的抗PCSK-9抗體製劑：

1)20mM組胺酸-鹽酸鹽，70mg/ml蔗糖，pH 6.5

2)20mM組胺酸-鹽酸鹽，70mg/ml α,α-二水合海藻糖，pH 6.5

過濾每種製劑並以0.5mL/瓶填充入2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中，水針壓塞軋蓋封口。取樣品分別進行40℃高溫、低溫光照以及凍融循環(樣品置於-20℃條件下24h後取出置於室溫使樣品完全融化混勻為一個循環)實驗，結果表明蔗糖與海藻糖對抗PCSK-9抗體的穩定性作用相似，我們選擇蔗糖作為抗PCSK-9抗體的穩定劑，結果見表7。

用下列不同蔗糖濃度的緩衝液，製備PCSK-9抗體蛋白濃度為150mg/ml的抗體製劑：

1)20mM組胺酸-鹽酸鹽，0mg/ml蔗糖，pH 6.5

2)20mM組胺酸-鹽酸鹽，10mg/ml蔗糖，pH 6.5

3)20mM組胺酸-鹽酸鹽，40mg/ml蔗糖，pH 6.5

4)20mM組胺酸-鹽酸鹽，70mg/ml蔗糖，pH 6.5

滲透壓值表明，當蔗糖

70mg/ml時滲透壓符合最低皮下注射要求。本發明的PCSK-9抗體製劑採用稀凍濃溶(三倍體積原液進行凍乾，一倍體積注射用水復溶，未經特別說明本發明均採用該比例凍溶)流程製備，當終處方(復溶後製劑)中糖濃度定為75mg/ml時即滿足注射的滲透壓要求，又方便原液中糖濃度的設定，為25mg/ml，同時該25mg/ml的糖濃度易於凍乾。因此製劑終處方中的糖濃度選擇為75mg/ml，原液中糖濃度定為25mg/ml。

實施例8、製劑中表面活性劑的篩選

用下列不同濃度表面活性劑的緩衝液，製備PCSK-9抗體蛋白濃度為150mg/ml的抗PCSK-9抗體製劑：

1)20mM組胺酸-鹽酸鹽，pH 6.5

2)20mM組胺酸-鹽酸鹽，0.2mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.5

3)20mM組胺酸-鹽酸鹽，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5

過濾每種製劑並以0.5mL/瓶填充入2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中，水針塞壓塞軋蓋封口。樣品置於25℃恆溫搖床上，以300rpm的速度振搖。外觀結果表明，表面活性劑有效防止了抗PCSK-9抗體的聚集。而聚山梨醇酯20與聚山梨醇酯80對H001-4-YTE作用無明顯差異，我們選擇聚山梨醇酯80作為抗PCSK-9抗體的穩定劑。

實施例9、製劑中緩衝體系的篩選與確認

用pH 6.0或6.5的含20mM組胺酸-鹽酸鹽或20mM琥珀酸-琥珀酸鈉的緩衝液製備含25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，抗體蛋白濃度為50mg/ml的製劑。過濾每種製劑並以3.6mL/瓶填充入6mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中進行凍乾，所述玻璃瓶用冷凍乾燥無菌粉末用鹵化丁基橡膠塞封口。將凍乾品保存於2-8℃、25℃和40℃後，使用注射用水復溶，進行穩定性分析。結果顯示抗PCSK-9抗體在2-8℃和25℃均非常穩定。但第0天復溶外觀顯示與His體系相比pH6.0琥珀酸緩衝液乳光明顯(表中未顯示)，因此選擇組胺酸體係作為抗PCSK-9抗體的緩衝體系。

實施例10、製劑成分的綜合篩選

用含下列不同濃度表面活性劑、不同pH、不同離子強度的緩衝液中，製備PCSK-9抗體蛋白濃度為50mg/ml，含25mg/ml蔗糖的抗PCSK-9抗體製劑：

1)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5

2)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0

3)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5

4)15mM組胺酸-鹽酸鹽，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5

5)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0

6)15mM組胺酸-鹽酸鹽，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5

7)15mM組胺酸-鹽酸鹽，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0

8)5mM組胺酸-鹽酸鹽，0.3mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5

9)15mM組胺酸-鹽酸鹽，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 5.5

10)5mM組胺酸-鹽酸鹽，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.0

11)5mM組胺酸-鹽酸鹽，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.5

過濾每種製劑並以3.6mL/瓶填充入6mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中進行凍乾，所述玻璃瓶用冷凍乾燥無菌粉末用鹵化丁基橡膠塞封口。將樣品保存於40℃條件下進行穩定性分析，以SEC單體的差值進行數據分析，結果顯示在蛋白濃度為50mg/ml，含25mg/ml蔗糖條件下，使用離子強度為pH 6.0，10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，且含0.2mg/ml的聚山梨醇酯80配製PCSK-9抗體更利於PCSK-9抗體的穩定。凍乾復溶後，經測定，其最終製劑中各組分濃度為凍乾前原液的3倍(蛋白濃度為150mg/ml，75mg/ml蔗糖，30mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80)，pH為6.3±01。

實施例11、一次乾燥溫度的優化

用pH 6.0的含10mM組胺酸-鹽酸鹽的緩衝液，製備PCSK-9抗體蛋白濃度為50mg/ml，含25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80的抗PCSK-9抗體製劑。將抗體以3.6mL/瓶填充入6mL西林瓶中，分別以-14℃和-5℃的一次乾燥溫度進行凍乾，並用凍乾膠塞封口。復溶樣品進行凍乾前後對比。結果表明，-5℃為凍乾流程較優的一次乾燥溫度。

實施例12、製劑與不同材質容器的相容性測定

H001-4-YTE以50mg/ml配製在pH 6.0，10mM組胺酸-鹽酸鹽，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80中。將製劑分別填充在玻璃瓶、儲液袋和316L不銹鋼罐中，2-8℃放置24小時。蛋白含量和純度分析表明，H001-4-YTE在24小時內是穩定的。該製劑與316L不銹鋼罐，玻璃瓶和儲液袋可以相容。

實施例13、製劑與不同濾膜的相容性測定

H001-4-YTE以50mg/ml配製在pH 6.0，10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯80中。將製劑分別過0.22μm PES濾膜和PVDF濾膜並於30min和1h取樣檢測。蛋白含量、外觀和純度分析表明，H001-4-YTE在與濾膜接觸的1小時內是穩定的。該製劑與PES和PVDF濾膜均可以相容。

實施例14、其它可選擇製劑配方

本發明的醫藥組成物可以做為藥物製劑原液，或直接做為注射液。當本發明的醫藥組成物做為藥物製劑原液時，經凍乾流程，製備成凍乾製劑，凍乾製劑經復溶後成注射液，可供臨床使用。本發明按照稀凍濃溶的流程製備凍乾製劑，即對低組分濃度的藥物製劑原液進行凍乾，得到凍乾製劑，使用時將凍乾製劑重新溶解成較高濃度的醫藥組成物供臨床使用。凍乾製劑的保存穩定性比液體製劑更長。凍乾製劑所用的藥物製劑原液，各組分濃度越高，凍乾時間越長。綜合凍乾流程的各項指標設置，通常藥物製劑原液各組分濃度為復溶後注射液各組分濃度的2-5倍，本發明的優選實施例為3倍。

本發明提供的穩定的藥物製劑包含：PCSK-9抗體蛋白(非限制性實施例如h001-4-YTE)和任選自以下的穩定緩衝液的組合：

(1)抗體h001-4-YTE 150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.4；

(2)抗體h001-4-YTE 150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.2；

(3)抗體h001-4-YTE 150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.3；

(4)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.4；

(5)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.3；

(6)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.2；

(7)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.1；

(8)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.0；

(9)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.5；

(10)抗體h001-4 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.3；

(11)抗體h001-450mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.2；

(12)抗體h001-450mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.4；

(13)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.1mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.3；

(14)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和15mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.2；

(15)抗體h001-4-YTE 50mg/ml，25mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.4。

(16)抗體h001-4-YTE 30mg/ml，10mg/ml蔗糖，0.05mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH為5.5的5mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液；

(17)抗體h001-4-YTE 70mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH為6.5的30mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液；

(18)抗體h001-4-YTE 45mg/ml，20mg/ml蔗糖，0.1mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH為6.0的8mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液；

(19)抗體h001-4-YTE 55mg/ml，40mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH為6.2的15mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。

本發明的醫藥組成物可經凍乾流程製備成相應的凍乾製劑，該凍乾製劑可用注射藥水復溶，得到以下供臨床使用的醫藥組成物：(1)抗體PCSK-9抗體蛋白150mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.3±0.1；(2)抗體PCSK-9抗體蛋白120mg/ml，55mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.0；(3)抗體PCSK-9抗體蛋白200mg/ml，95mg/ml蔗糖，0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，最終pH為6.5。

雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.)、上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)

<120> 一種PCSK-9抗體醫藥組成物及其用途

<150> CN201710519829.6

<151> 2017-06-30

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 698

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帶His標籤的pCSK9：pCSK9-His6，用於免疫原免疫小鼠或檢測試劑

<400> 1

<210> 2

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帶PADRE肽和His標籤的pCSK9：pCSK9-PADRE-His6，作為免疫原，所含PADRE肽可以促進免疫

<400> 2

<210> 3

<211> 704

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帶TEV酶切位點的pCSK9與his標籤融合蛋白：pCSK9-TEV-His6，可經由TEV酶切獲得N-pCSK9(N端pCSK9結構域)，作為免疫原

<400> 3

<210> 4

<211> 698

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pCSK9-D374Y突變蛋白，帶his標籤：pCSK9-D374Y-His6，作為檢測試劑

<400> 4

<210> 5

<211> 719

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入生物素接受肽及his標籤的pCSK9蛋白：pCSK9-BP15-His6，作為檢測試劑，BP15肽位置在表達過程中能夠進行生物素標記，免除體外生物素標記及可能導致的構建變化

<400> 5

<210> 6

<211> 719

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入生物素接受肽及his標籤的pCSK9 D374Y突變體蛋白：pCSK9-D374Y-BP15-His6，檢測蛋白

<400> 6

<210> 7

<211> 802

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帶Flag標籤和His標籤的pCSK9受體蛋白LDLR胞外域片段：LDLR-ECD-Flag-His6，檢測試劑

<400> 7

<210> 8

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與pCSK9結合活性)：LDLR-sECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑

<400> 8

<210> 9

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更加縮短形式的LDLR胞外域片段與hIgG1-Fc融合蛋白(具有與pCSK9結合活性)：LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)作為檢測試劑

<400> 9

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 10

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 13

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 16

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 17

<210> 18

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ch-001

<400> 18

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VH.1A

<400> 19

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VH.1B

<400> 20

<210> 21

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VH.1C

<400> 21

<210> 22

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VH.1D

<400> 22

<210> 23

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VH.1E

<400> 23

<210> 24

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ch-001 hVL.1(CDR接枝)

<400> 24

<210> 25

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VL.1A

<400> 25

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VL.1B

<400> 26

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-VL.1C

<400> 27

<210> 28

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-4-IgG1

<400> 28

<210> 29

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-4-IgG1

<400> 29

<210> 30

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-4-kappa

<400> 30

<210> 31

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-4-kappa

<400> 31

<210> 32

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-4-IgG1-YTE重鏈

<400> 32

<210> 33

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h001-4-IgG1-YTE重鏈

<400> 33

Claims

一種醫藥組成物，其包含PCSK-9抗體或其抗原結合片段，以及緩衝液，所述緩衝液為組胺酸或琥珀酸鹽或磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液，其中，所述PCSK-9抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述抗原結合片段為具有抗原結合活性的Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，以及與人PCSK-9結合的ScFv片段及利用了能與人PCSK-9結合的抗體的VH和VL區形成的可結合人PCSK-9的片段。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中所述PCSK-9抗體或其抗原結合片段濃度為1mg/ml至150mg/ml。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中所述醫藥組成物的pH為5.5至6.5。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中所述緩衝液濃度為5mM至30mM。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中還包括二糖。
如請求項5所述的醫藥組成物，其中所述二糖濃度為10mg/ml至75mg/ml。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中還包括表面活性劑。
如請求項7所述的醫藥組成物，其中所述表面活性劑為聚山梨醇酯。
如請求項8所述的醫藥組成物，其中表面活性劑的濃度為0.05mg/ml至0.6mg/ml。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中所述的醫藥組成物包含：(a)45mg/ml至55mg/ml PCSK9抗體；(b)5mM至15mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.0-6.5；(c)20mg/ml至40mg/ml蔗糖；和(d)0.1mg/ml至0.4mg/ml聚山梨醇酯80。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中所述PCSK-9抗體或其抗原結合片段具有選自如SEQ ID NO：18-23所示的重鏈可變區，和選自如SEQ ID NO：24-27所示的輕鏈可變區。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中所述PCSK-9抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示，所述PCSK-9抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：28或32所示。
如請求項12所述的醫藥組成物，其中所述的醫藥組成物包含：(a)50mg/ml PCSK9抗體，其中所述的PCSK9抗體包含如SEQ ID NO：30所示的抗體輕鏈和如SEQ ID NO：28或32所示的抗體重鏈；(b)10mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.0；(c)25mg/ml蔗糖；和(d)0.2mg/ml聚山梨醇酯80。
一種製備如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物的方法，包括：PCSK-9抗體或其抗原結合片段原液經緩衝液置換的步驟，所述緩衝液pH為6.0至6.5。
如請求項14所述的方法，其還包括向置換步驟所得溶液中加入蔗糖和聚山梨醇80，再經緩衝液定容的步驟，所述緩衝液pH為6.0至6.5。
一種製備含PCSK-9抗體的凍乾製劑的方法，其中包括將如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。
如請求項16所述的方法，其中所述冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。
一種由如請求項16或17所述的方法製備的含PCSK-9抗體的凍乾製劑。
一種製備含有PCSK-9抗體的復溶溶液的方法，其中包括將如請求項18所述的凍乾製劑經復溶的步驟。
一種由如請求項19所述的方法製備的含有PCSK-9抗體的復溶溶液。
如請求項20所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述PCSK-9抗體濃度為120mg/ml至200mg/ml。
如請求項20所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述含有PCSK-9抗體的復溶溶液的pH為6.0-6.5。
如請求項20所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述含有PCSK-9抗體的復溶溶液包括緩衝液，所述緩衝液濃度為15mM至45mM。
如請求項20所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中還包括二糖。
如請求項24所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中所述二糖濃度為55mg/ml至95mg/ml。
如請求項20所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中還包括表面活性劑。
如請求項26所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其中表面活性劑的濃度為0.4mg/ml至0.8mg/ml。
如請求項20至27任一項所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液，其包含： (a)150mg/ml PCSK9抗體，其中所述的抗體包含如SEQ ID NO：30所示的抗體輕鏈和如SEQ ID NO：28或32所示的抗體重鏈；(b)30mM組胺酸-鹽酸鹽緩衝液，pH 6.3；(c)75mg/ml蔗糖；和(d)0.6mg/ml聚山梨醇酯80。
一種如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物或如請求項18所述的凍乾製劑或如請求項20至28中任一項所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液在製備用於治療PCSK-9相關的疾病或病症的藥物中的用途。
如請求項29所述的用途，其中所述的疾病或病症為膽固醇相關疾病，其包括高膽固醇血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠狀動脈心臟病、中風、心血管疾病、阿茲海默症和一般性的異常脂血症。
一種製品，其包括容器，該容器中裝有如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物或如請求項18所述的凍乾製劑或如請求項20至28中任一項所述的含有PCSK-9抗體的復溶溶液。