CN107406511B - Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 Download PDF

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Abstract

提供一种PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途。提供包含所述PCSK9抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体以及包含PCSK9抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为降血脂药物的用途。特别地，涉及一种人源化的PCSK9抗体在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途。

Description

PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
技术领域
本发明涉及PCSK9抗体、PCSK9抗体的抗原结合片段、包含所述PCSK9抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含所述PCSK9抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为降血脂药物的用途。
背景技术
高胆固醇血症是一种以血清胆固醇水平升高为主要特征的脂类代谢异常疾病，其主要表现为血清胆固醇水平升高，导致胆固醇在血管聚集，形成动脉粥样硬化。大量的临床及实验研究结果都证实，脂质代谢异常和冠心病的发生、发展有着密切的关系。因此，降低血液中的胆固醇浓度成为了目前治疗和预防动脉粥样硬化的一个主要手段。
随着我国国民生活水平的快速提高，血脂异常也成为了危害我国城乡居民的主要因素。据2012年统计数据，我国每年死亡人数中约有40％死于心血管疾病。目前，我国成人血脂异常患病率为18.6％，估计全国血脂异常现患人数1.6亿。不同类型的血脂异常现患率分别为：高胆固醇血症2.9％，高甘油三酯血症11.9％，低高密度脂蛋白血症7.4％；另有3.9％的人血胆固醇边缘升高。2012年卫生部疾病预防控制专家委员会慢性病防治分委会达成的“慢性病防治中国专家共识”中提到，我国有3300万高胆固醇血症患者，而从局部地区看，我国血脂异常发病率情况远比上述数据要严重。
目前，临床上调脂药物主要以他汀类为主。立普妥(Liptor)作为全世界应用最广泛的降胆固醇药物，也是医药史上最畅销药物，通过阻断肝脏生产胆固醇的酶作用，减少胆固醇的生产，从而增加肝脏从血液中摄取更多的胆固醇，进而减低血液中胆固醇浓度。但是立普妥也有其不足之处，首先从数据看，立普妥可以降低30％-40％的低密度脂蛋白，但仍然有很多病人依然无法到达有效的降低血脂(低密度脂蛋白浓度＜50mg/dL)，其次病人对立普妥的响应率也有人种差异。这些原因，致使病人需要一个更为有效的降低血脂的药物。
家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia，FM)是一种常染色体单基因显性遗传性疾病，其临床特征为血总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein-cholesterol，LDL-c)显著升高、睑黄瘤、角膜弓以及早发的心血管疾病。低密度脂蛋白受体(LDL receptor，LDLR)基因突变致其缺陷或缺乏，LDL-c不能顺利转运到肝脏清除，以致血中LDL-c水平升高。目前已明确3种基因与FM的发生有关，它们分别是LDLR基因、载脂蛋白B100基因和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)基因。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种前蛋白转化酶，属于分泌的枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。该编码蛋白是作为可溶性酶原合成的，在内质网中经过自身催化分子内加工。实验结果显示，PCSK9促进LDL受体的降解从而增加血浆中LDL胆固醇含量，而LDL受体介导肝内的LDL胞吞过程，后者是从循环系统清除LDL的主要途径。研究发现，12.5％的高胆固醇血症(ADH)患者检测有 PCSK9基因突变。PCSK9突变形式多样，根据突变对PCSK9调节LDL-C水平的不同影响可分为两类：功能缺失型和功能获得型。其中功能缺失型突变与低血胆固醇水平有关，有预防冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的作用，非洲人群中低胆固醇的PCSK9突变率高于其他种族。PCSK9功能获得型突变体通过增加PCSK9 的功能、降低LDLR的表达而升高血浆胆固醇水平，可以导致严重高胆固醇血症和早发冠状动脉粥样硬化性心脏病，目前发现的PCSK9功能获得型突变包括： D374Y、S127R、F216L、N157K、R306S等。其中，与PCSK9野生型相比，D374Y 突变体细胞表面的LDLR减少了36％，S127R突变有相应减少了10％。
目前PCSK9作为一个极具潜力的，新的靶标已成为高胆固醇血症研究的热点，对于深入了解胆固醇代谢的机制和寻求新的治疗手段有重要意义。有多家跨国制药公司在研发针对PCSK9的单克隆抗体，它通过在血液中中和PCSK9，从而增加了肝脏表面LDL受体的浓度，进而达到降低血液中LDL浓度的目的。相关的专利有WO2011111007、WO2011072263、WO2013170367、WO2013169886、 WO2013148284、WO2013091103、WO2013039958、WO2013039969、 WO2013016648、WO2013008185、WO2012170607、WO2012168491、WO2012154999、WO2012109530、WO2012101251、WO2012088313、US8829165 B2、US8563698B2、US8859741B2、US8871913B2、US8871914B2、US8883983B2、 WO2012058137和WO2012054438。
本发明提供有着更高亲和力、更高选择性、更高生物活性的PCSK9抗体。
发明内容
本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的CDR：如序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的、或与 SEQ ID NO：12、SEQID NO：13或SEQ ID NO：14具有至少95％序列同一性的序列所示的HCDR；和如序列SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的、或与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：17具有至少95％序列同一性的序列所示的LCDR。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的 HCDR1、HCDR2和HCDR3，或包含分别与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和 SEQ ID NO：14具有至少95％序列同一性的序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3，或包含分别与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17具有至少95％序列同一性的序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
上述的具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，可以是通过亲和力成熟的技术手段，对本发明的CDR区进行突变获得的。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的轻链可变区进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链变体的轻链FR区、或者鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区；其中所述PCSK9抗体的重链可变区进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、或IgG2或其变体的重链 FR区、或IgG3或其变体的重链FR区。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的鼠源抗体包含SEQ ID NO：10的重链可变区序列和SEQ ID NO： 11的轻链可变区序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的轻链进一步包含鼠源κ链或其变体的轻链恒定区、或者鼠源λ链或其变体的轻链恒定区；其中所述PCSK9抗体重链进一步包含鼠源 IgG1或其变体的重链恒定区、或IgG2或其变体的重链恒定区、或IgG3或其变体的重链恒定区。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链，IGHV1-2*02和hjh2的组合序列及其突变序列；其包含人种系重链 IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3区和hjh2的FR4区及其突变序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体含有SEQ ID NO：18所示的重链可变区；或SEQ ID NO：18变体所示的重链可变区；其中所述SEQ ID NO：18变体是在SEQ ID NO：18 所示的重链可变区位置上具有0-10个氨基酸变化的序列。所述的氨基酸变化可以是用现有技术，为提高抗体如亲和性、半衰期等性能做的改进，如用亲和力成熟修改CDR区的氨基酸，或者用回复突变修改FR区的氨基酸。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体重链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为一个或多个选自T30N，R87T，R72A，T74K，M48I，V68A，M70L，R38K和R67K的氨基酸回复突变。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列所示的重链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链模板IGKV1-39*01和hjk2.1的组合序列及其突变序列；其包含人种系轻链 IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3区和hjk2.1的FR4区及其突变序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体进一步包含SEQ ID NO：24所示的、或SEQ ID NO：24 变体所示的轻链可变区；所述的SEQ ID NO：24变体是在SEQ ID NO：24所示的轻链可变区位置上具有0-10的氨基酸变化。所述的氨基酸变化可以是用现有技术，为提高抗体如亲和性、半衰期等性能做的改进，如用亲和力成熟修改CDR区的氨基酸，或者用回复突变修改FR区的氨基酸。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的SEQ ID NO：24变体是在SEQ ID NO：24所示的轻链可变区的FR 区位置上具有0-10个氨基酸的回复突变；优选的，所述回复突变选自T5S，S66D， Q3V和A49S的氨基酸回复突变；优选为A43S的氨基酸变化。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27的序列所示的轻链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含重链可变区序列和/或轻链可变区序列，所述重链可变区序列选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO： 22和SEQ ID NO：23所示的序列，或所述重链可变区序列选自与SEQ ID NO：19、 SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22和SEQ ID NO：23具有至少95％序列同一性的序列；所述轻链可变区序列选自SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26和 SEQ ID NO：27所示的序列，或所述轻链可变区序列选自选自与SEQID NO：25、 SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27具有至少95％序列同一性序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
1)SEQ ID NO：18的重链可变区和SEQ ID NO：25的轻链可变区，
2)SEQ ID NO：18的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区，
3)SEQ ID NO：18的重链可变区和SEQ ID NO：27的轻链可变区，
4)SEQ ID NO：19的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区，
5)SEQ ID NO：19的重链可变区和SEQ ID NO：25的轻链可变区，
6)SEQ ID NO：19的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区，
7)SEQ ID NO：19的重链可变区和SEQ ID NO：27的轻链可变区，
8)SEQ ID NO：20的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区，
9)SEQ ID NO：20的重链可变区和SEQ ID NO：25的轻链可变区，
10)SEQ ID NO：20的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区，
11)SEQ ID NO：20的重链可变区和SEQ ID NO：27的轻链可变区，
12)SEQ ID NO：21的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区，
13)SEQ ID NO：21的重链可变区和SEQ ID NO：25的轻链可变区，
14)SEQ ID NO：21的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区，
15)SEQ ID NO：21的重链可变区和SEQ ID NO：27的轻链可变区，
16)SEQ ID NO：22的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区，
17)SEQ ID NO：22的重链可变区和SEQ ID NO：25的轻链可变区，
18)SEQ ID NO：22的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区，
19)SEQ ID NO：22的重链可变区和SEQ ID NO：27的轻链可变区，
20)SEQ ID NO：23的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区，
21)SEQ ID NO：23的重链可变区和SEQ ID NO：25的轻链可变区，
22)SEQ ID NO：23的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区，
23)SEQ ID NO：23的重链可变区和SEQ ID NO：27的轻链可变区，和
24)SEQ ID NO：18的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 或其变体的重链恒定区，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4或使用氨基酸突变延长抗体在血清中的半衰期的 IgG1、IgG2或IgG4变体的重链恒定区，更优选包含引入YTE突变的IgG1、IgG2 或IgG4重链恒定区；
其中所述PCSK9抗体的轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自以下的重链和轻链：
1)SEQ ID NO：28的重链和SEQ ID NO：30的轻链，和
2)SEQ ID NO：32的重链和SEQ ID NO：30的轻链。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的PCSK9 抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供一种编码如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段的 DNA分子。
本发明进一步提供一种如上所述的DNA分子的表达载体。
本发明进一步提供一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
本发明进一步提供一种如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段或如上所述的药物组合物，在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症优选为胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”)；更优选为高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症；最优选高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性疾病包括胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”)，其包括以下的任何一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的极低密度脂蛋白(VLDL)和/或低的HDL)。
在一方面中，本发明提供治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状的方法：异常脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)或冠状动脉心脏病，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗PCSK9抗体。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环PCSK9的抗PCSK9抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防个体的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
附图说明
图1：本发明抗体载体构建中的引物设计示意图。
图2：本发明抗体载体构建示意图。
图3：不同h001-4-YTE抗PCSK9抗体浓度中HepG2细胞的LDL摄取变化。数据结果显示PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
图4：不同h001-4-WT抗PCSK9抗体浓度中HepG2细胞的LDL摄取变化。数据结果显示PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
图5：注射h001-4-WT抗PCSK9抗体的小鼠血清中LDL-c浓度随时间变化 (*：p＜0.05，vs IgG，**：p＜0.01，vs IgG)。数据结果显示PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
图6：注射h001-4-WT抗PCSK9抗体的小鼠血清中相对IgG组的LDL-c浓度变化。数据结果显示相对IgG组，PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中 LDL-c浓度。
图7：本发明抗体在食蟹猴体内药效及药代检测。附图显示h001-4-WT和 h001-4-YTE均能够明显降低食蟹猴体内LDL的含量，且h001-4-YTE的降低持续时间要优于h001-4-WT。
具体实施方式
术语定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv 区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(Fc区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR) 由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1， FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat 编号规则(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人PCSK9的单克隆抗体。制备时用PCSK9抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源PCSK9 抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PCSK9嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链Fc区。所述的PCSK9嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链Fc区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变) 后延长抗体在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体 (CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PCSK9 人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO：12，13，14，15，16或17；人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV1-39*01和hjk2.1的组合序列；其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-2*02和hjh2的组合序列。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及与人PCSK9结合的Fv片段ScFv片段；其包含选自SEQ ID NO：12至SEQ IDNO：17中的一个或多个本发明抗体的CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与 PCSK9结合”，指能与人PCSK9相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991 中所述。Fc区域是抗体的效应子功能所必需的。效应子功能包括启动补体依赖的细胞毒性(CDC)、启动吞噬作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)并通过胞转作用转运抗体通过细胞屏障。此外，Fc区域对维持IgG类抗体的血清半衰期至关重要(Ward和Ghetie，Ther.Immunol.2：77-94(1995))。研究发现IgG抗体的血清半衰期由Fc和新生Fc受体(FcRn)的结合来介导。FcRn是由跨膜α链和可溶性β链(β2-微球蛋白)组成的异源二聚体。美国专利号6，165,745公开了一种通过将突变引入编码抗体的DNA片段生产生物半衰期减少的抗体的方法。该突变包括在Fc-绞链结构域的位置253、310、311、433或434处的氨基酸取代。美国专利号6,277,375B1公开了含有突变型IgG分子的组合物，该分子相对野生型IgG 血清半衰期增加，其中该突变型IgG分子含有以下氨基酸取代：在252位苏氨酸取代亮氨酸，在254位苏氨酸取代丝氨酸，或在256位苏氨酸取代苯丙氨酸 (M252Y、S254T和T256E)。也公开了在位置433、435或436处具有氨基酸取代的突变型IgG。美国专利号6,528,624公开了含有IgG Fc区域的一种抗体的变体，该变体在人IgG Fc区域的一个或多个氨基酸位置(位置270、322、326、327、 329、331、333和334)具有氨基酸取代。PCT公开号WO 02/060919A2公开了修饰的IgG，该修饰的IgG包含的IgG恒定区相对于野生型IgG恒定区含有一个或多个氨基酸修饰，其中该修饰的IgG与含有野生型IgG恒定区的IgG相比增加了半衰期，并且其中一个或多个氨基酸修饰位于以下一个或多个位置：251、253、 255、285-290、308-314、385-389、和428-435。具体地，本文所述“YTE”或“YET 突变”指IgG1的Fc区的一个突变组合，用于促进Fc区与人FcRn的结合，延长抗体在人血清中的半衰期。YTE突变子包含三个“YTE突变子”的组合：M252Y、 S254T和T256E，残基编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat 等(参考U.S.专利No.7,658,921所述)对IgG重链进行编号。相较于野生型抗体， YTE突变抗体大大延长了抗体在血清中的半衰期，如e.g.，Dall’Acqua etal，J.Biol. Chem.281：23514-24(2006)和U.S.专利号No.7,083,784。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，老鼠可以用人PCSK9或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT 人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站 http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链(SEQ ID NO：28)和轻链(SEQ ID NO：30)的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PCSK9特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或GSepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和 Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如 Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA 分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数× 100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、 RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683，195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组 DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
实施例与测试例
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1、PCSK9抗原及检测用蛋白的制备
蛋白设计及表达
以UniProt Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(人PCSK9，Uniprot号： Q8MBP7)作为本发明PCSK9的模板，设计本发明涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，可选的在PCSK9蛋白基础上融合不同的标签如his标签或促进免疫的肽段如PADRE肽，分别克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#：102762)或pTargeT载体上 (promega，A1410)，在293细胞瞬转表达或CHO-S稳定表达，纯化，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。
带His标签的PCSK9：PCSK9-His6，用于免疫原免疫小鼠或检测试剂
Figure GPA0000246109790000141
Figure GPA0000246109790000151
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为His6-tag(6组氨酸标签)。
带PADRE肽和His标签的PCSK9：PCSK9-PADRE-His6，作为免疫原，所含PADRE 肽可以促进免疫；
Figure GPA0000246109790000152
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为linker，点划线部分为PADRE肽，斜体部分为His6-tag。
带TEV酶切位点的PCSK9与his标签融合蛋白：PCSK9-TEV-His6，可通过TEV 酶切获得N-PCSK9(N端pCSK9结构域)，作为免疫原；
Figure GPA0000246109790000153
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为TEV酶切位点，斜体部分为His6-tag。PCSK9-D374Y突变蛋白，带his标签：PCSK9-D374Y-His6，作为检测试剂；
Figure GPA0000246109790000161
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为His6-tag。
PCSK9：插入生物素接受肽BP15及his标签的PCSK9蛋白：PCSK9-BP15-His6，作为检测试剂，BP15肽位置在表达过程中能够进行生物素标记，免除体外生物素标记及可能导致的构象变化；
Figure GPA0000246109790000162
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为生物素接受肽，斜体部分为His6-tag。
PCSK9-Y：插入生物素接受肽及his标签的PCSK9 D374Y突变体蛋白： PCSK9-D374Y-BP15-His6，检测蛋白；
Figure GPA0000246109790000163
Figure GPA0000246109790000171
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为生物素接受肽，斜体部分为His6-tag。带Flag标签和His标签的pCSK9受体蛋白LDLR胞外域片段： LDLR-ECD-Flag-His6，检测试剂
Figure GPA0000246109790000172
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为Flag标签，斜体部分为His6-tag；
LDLR-Fc：缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与PCSK9 结合活性)：LDLR-sECD-Fc(hIgG1)作为检测试剂
Figure GPA0000246109790000173
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-sECD)，斜体部分为hIgG1-Fc部分；
更加缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与pCSK9结合活性)：LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)作为检测试剂
Figure GPA0000246109790000174
Figure GPA0000246109790000181
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为更加缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-ssECD)，斜体部分为hIgG1-Fc部分。
实施例2、PCSK9、LDLR相关重组蛋白的纯化重组蛋白以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
1、带His标签的重组蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上IMAC柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至 A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS。去聚体峰，收集洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。得到带His标签的PCSK9-His6(SEQ ID NO：1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)、PCSK9-TEV-His6(SEQ ID NO：3)PCSK9-D374Y-His6(SEQ ID NO： 4)、PCSK9-BP15-His6(SEQID NO：5)、PCSK9-D374Y-BP15-His6(SEQ ID NO： 6)用于本发明抗体的免疫原或检测试剂。其中PCSK9-TEV-His6纯化后通过TEV 酶进行酶切，酶切产物再利用IMAC柱结合去除TEV酶、未酶切完全的 PCSK9-TEV-His6或切除的带His标签的C端结构域片段，IMAC流出液中浓缩获得仅留N端结构域的PCSK9片段(缩写为N-PCSK9)，作为免疫原用于小鼠免疫。
2、带His标签和Flag标签的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO：7)重组蛋白的纯化步骤：
将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。利用0.5×PBS平衡flag亲和柱，冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用0.5×PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用含有0.3M NaCl的PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)洗脱目的蛋白，并收集，调节pH至中性。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS。去聚体峰，收集洗脱峰收集样品经电泳，肽图，LC-MS鉴定正确后分装备用。得到带 FLAG/His6标签的LDLR-ECD-Flag-His6(SEQ ID NO：7)，用于本发明抗体的性能测试。
3、LDLR的Fc融合蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，浓缩至适当体积后上ProteinA柱。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM sodium acetate pH3.0洗脱目的蛋白，用1MTris-HCl中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析 Superdex200(GE)进一步纯化，去聚体的峰收集好后分装备用。此方法用来纯化 LDLR-sECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO：8)和LDLR-ssECD-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO：9)。两者可用作PCSK9抗体功能性测试。
实施例3、抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的制备
1、免疫
抗人PCSK9单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号： SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周， 12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按两种方案免疫(A/B)，每组6-10只。免疫抗原为带His标签的人PCSK9-His6 (SEQ ID NO：1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)及N-PCSK9(SEQ ID NO：3)。
方案A用弗氏佐剂(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1∶1，100μg/ 只(首免)，50μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射100μg/只的乳化后抗原，首免后每两周一次，共6-8周。
方案B用Titermax(sigma Lot Num：T2684)与Alum(Thremo Lot Num：77161) 交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1∶1，抗原与佐剂(Alum)比例为3∶1， 10-20μg/只(首免)，5μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射20/10μg/只的乳化后抗原，首免后每周一次，Titermax和Alum交替使用，共6-11周。免疫四周后，根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。
2、细胞融合
选择血清中抗体滴度高(见后面的测试例1和2，结合PCSK9的ELISA方法) 并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，融合前72小时冲刺免疫所选小鼠， PCSK9-His6 10μg/只，腹腔注射。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure GPA0000246109790000191
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含20％FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640 培养基)重悬，分装于96孔细胞培养板中(1×105/150μl/孔)，37℃，5％CO2孵育。融合后的第5天加入HAT完全培养基，50μl/孔，37℃，5％CO2孵育。融合后第7天～8天，根据细胞生长密度，全换液，培养基为HT完全培养基(含20％FBS、 1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，200μl/孔，37℃，5％CO2孵育。
3、杂交瘤细胞筛选
融合后第10-11天，根据细胞生长密度，进行结合PCSK9或PCSK9-Y的 ELISA方法检测(见测试例1和2)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行PCSK9 或PCSK9-Y与LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例3和4)，阳性孔换液，并根据细胞密度及时扩大至24孔板中。移入24孔板的细胞株经过复测后进行保种和第一次亚克隆。第一次亚克隆筛选(见测试例1和2)为阳性的进行保种，并进行第二次亚克隆。第二次亚克隆为阳性(见测试例1和2)的进行保种和蛋白表达。多次融合获得有阻断PCSK9或PCSK9-Y与LDLR结合效果(见测试例3和4) 的杂交瘤细胞。
通过阻断实验和结合实验筛选得到杂交瘤克隆mAb-001，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。
其中测得杂交瘤克隆mAb-001的鼠抗可变区序列如下：
＞mAb-001 VH
Figure GPA0000246109790000201
＞mAb-001VL
Figure GPA0000246109790000202
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
表1各重链及轻链CDR区序列
Figure GPA0000246109790000203
实施例4、抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的人源化
1、杂交瘤克隆mAb-001人源化框架选择
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与mAb-001同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，将这两个鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
鼠源抗体mAb-001的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV1-2*02和hjh2，人源化后得到人源化抗体h001-1的可变区序列如下：＞h001-1 VH
Figure GPA0000246109790000211
＞h001-1 VL
Figure GPA0000246109790000212
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
2、杂交瘤克隆mAb-001的模板选择和回复突变设计，见下表2；杂交瘤克隆回复突变后的人源化序列组合见表4。
表2.杂交瘤克隆回复突变设计
Figure GPA0000246109790000213
注：如S66D表示依照Kabat编号系统，将66位S突变回D。
Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列，各突变可变区具体序列如下表3：
表3
Figure GPA0000246109790000221
注：序列中横线部分为CDR区。
表4：鼠抗mAb-001人源化序列组合
h001_VL.1 h001_VL.1A h001_VL.1B h001_VL.1C
h001_VH.1 h001-1 h001-2 h001-3 h001-4
h001_VH.1A h001-5 h001-6 h001-7 h001-8
h001_VH.1B h001-9 h001-10 h001-11 h001-12
h001_VH.1C h001-13 h001-14 h001-15 h001-16
h001_VH.1D h001-17 h001-18 h001-19 h001-20
h001_VH.1E h001-21 h001-22 h001-23 h001-24
注：该表表示各种序列及其突变序列组合所得的人源化抗体可变区部分的组合。如h001-1表示，人源化抗体h001-1的可变区由轻链h001_VL1、重链 h001_VH.1A组成。其它类推。
3、将以上的人源化序列组合进行抗体化，重链恒定区来自人IgG1，轻链恒定区来自人kappa链。得到相应的人源化抗体，进行结合pCSK9的ELISA方法检测(见测试例1)，和结合pCSK9-Y的ELISA方法检测(见测试例2)；并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行pCSK9/LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例4)，和进行
pCSK9-Y/LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例3)；结果见表5-8。
结果显示，本发明得到的PCSK9抗体与PCSK9和PCSK9-Y有较高的结合活性；并且能有效阻断PCSK9/PCSK9-Y与LDLR之间的结合。
实施例5、构建和表达抗人PCSK9人源化抗体IgG1及IgG1-YTE形式
本发明构建和表达抗人PCSK9人源化抗体的方法如下：
1、引物设计：利用在线软件DNAWorks(v3.2.2) (http：//helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计多条引物合成VH/VK含重组所需基因片段：5’-30bp Signal peptide+VH/VK+30bp CH1/CL-3’。引物设计原则：目的基因2与目的基因1有2个aa不一样，则另设突变位点所在引物，如图1所示。
2、片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作说明书，用上面设计的多条引物，分两步PCR扩增得到VH/VK含重组所需基因片段。
3、表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)构建及酶切
利用一些特殊的限制性内切酶，如BsmBI，识别序列与酶切位点不同的特性设计构建表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)，如图2所示。BsmBI 酶切载体，切胶回收备用。
4、重组构建表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr
VH/VK含重组所需基因片段与BsmBI酶切回收表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)按3∶1比例分别加入DH5α感受态细胞中，0℃冰浴 30min，42℃热击90秒，加入5倍体积LB medium，37℃孵育45min，涂布LB-Amp 平板，37℃培养过夜，挑取单克隆送测序得到各目的克隆。
本发明的抗体可以，但不限于以上设计构建方式。以h001-4为例进行抗体及其突变体设计，得到①h001-4-WT：h001-4的IgG1形式，即人源化序列组合h001-4，结合来自人IgG1的重链恒定区，与来自人kappa链的轻链恒定区；②h001-4-YTE： h001-4-IgG1-YTE形式，即人源化序列组合h001-4，结合突变的人IgG1(YTE突变) 的重链恒定区，与来自人kappa链的轻链恒定区。突变的人IgG1也可以是别种形式的突变。得到的抗体及突变的抗体用BIAcore检测其亲和力(测试例6)，结果见表9。
本发明构建和表达抗人PCSK9人源化抗体(IgG1及IgG1-YTE形式)序列如下：h001-4IgG1形式，重链恒定区来自人IgG1，轻链恒定区来自人kappa轻链：
重链氨基酸序列(人IgG1)：
Figure GPA0000246109790000241
重链DNA序列：
Figure GPA0000246109790000242
Figure GPA0000246109790000254
h001-4-kappa
轻链氨基酸序列：
Figure GPA0000246109790000251
轻链DNA序列：
Figure GPA0000246109790000252
h001-4-IgG1-YTE(轻链为h001-4-kappa：SEQ ID NO：30)
重链氨基酸序列：IgG1-YTE
Figure GPA0000246109790000253
重链DNA序列：
Figure GPA0000246109790000261
备注：下划线部分为信号肽DNA序列
以下用生化测试方法验证本发明性能及有益效果。
测试例1、PCSK9抗体结合野生型PCSK9蛋白的ELISA实验
本发明PCSK9抗体与PCSK9的结合力测试，通过抗体与固定在ELISA板上野生型PCSK9(WT-PCSK9，SEQ ID NO：5)的结合的量来检测。
用PBS稀释链霉亲和素(sigma，CAT#S4762)至2μg/ml，包被在96孔ELISA 板上，4℃放置过夜。洗板后，在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和5％脱脂奶粉)封闭2小时。洗板，加入内部生产的生物素标记的PCSK9 (bio-WT-PCSK9，用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入不同浓度稀释的抗PCSK9抗体样品，37℃孵育1小时。再洗板，加入辣根过氧化物酶-羊抗人(H+L)抗体(jackson， CAT#109-035-088)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其EC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体与PCSK9的结合力ELISA实验，结果见表 5。
表5.本发明PCSK9抗体与PCSK9的结合活性测试
克隆号 EC50(μg/ml)
h001-1 0.0084
h001-2 0.0123
h001-3 0.0113
h001-4 0.012
h001-5 0.0141
h001-6 0.01
h001-7 0.012
h001-8 0.009
h001-9 0.0136
h001-10 0.0176
h001-11 0.0129
h001-12 0.0103
h001-13 0.0071
h001-14 0.0084
h001-15 0.011
h001-16 0.0082
h001-17 0.0114
h001-18 0.0147
h001-19 0.0139
h001-20 0.0126
h001-21 0.0145
h001-22 0.0123
h001-23 0.0118
h001-24 0.0092
Ch-001 0.0084
结果显示，本发明PCSK9抗体与PCSK9有较高的结合活性。
测试例2、PCSK9抗体结合PCSK9-Y的ELISA实验
本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y的结合力测试，通过抗体与固定在ELISA板上PCSK9-Y(突变型PCSK9，SEQ ID NO：6)的结合的量来检测。
用PBS稀释链霉亲和素(sigma，CAT#S4762)至2μg/ml，包被在96孔ELISA 板上，4℃放置过夜。洗板后，在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和5％脱脂奶粉)封闭2小时。洗板，加入内部生产的生物素标记的PCSK9-Y (bio-PCSK9-Y，用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入不同浓度稀释的抗PCSK9抗体样品，37℃孵育1小时。再洗板，加入辣根过氧化物酶-羊抗人(H+L)抗体 (jackson，CAT#109-035-088)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其EC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体与突变型PCSK9的结合力ELISA实验，结果见表6。
表6.本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y的结合活性测试
克隆号 EC50(μg/ml)
h001-1 0.0132
h001-2 0.0157
h001-3 0.0152
h001-4 0.0179
h001-5 0.0152
h001-6 0.0144
h001-7 0.0137
h001-8 0.0165
h001-9 0.0194
h001-10 0.0209
h001-11 0.0170
h001-12 0.0124
h001-13 0.0096
h001-14 0.0112
h001-15 0.0178
h001-16 0.0111
h001-17 0.0161
h001-18 0.0191
h001-19 0.0204
h001-20 0.0170
h001-21 0.0119
h001-22 0.0111
h001-23 0.0125
h001-24 0.0170
Ch-001 0.0132
结果显示，本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y有较高的结合活性。
测试例3、PCSK9抗体对LDLR-FC/PCSK9-Y结合的阻断
抗PCSK9抗体对LDLR-FC(SEQ ID NO：8)和PCSK9-Y(突变型PCSK9，SEQ ID NO：6)结合的阻断能力测试，通过检测在抗体存在的条件下，PCSK9-Y与LDLR 结合的量来确定。
用磷酸缓冲液稀释LDLR-FC，至2μg/ml，包被在96孔ELISA板(Costar， CAT#3590)上，4℃放置过夜。洗板后，在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、 0.05％Tween 20和5％脱脂奶粉)封闭2小时。洗板，加入生物素标记的PCSK9-Y (bio-PCSK9-Y，用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释至终浓度1μg/ml)，和抗体样品(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20 和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)的混合液100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(sigma，CAT#S2438)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其IC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体对LDLR-FC/PCSK9-Y结合的阻断效果测试，结果见表7：
表7.本发明PCSK9抗体阻断PCSK9-Y与LDLR之间结合的效果测试
克隆号 IC50(μg/ml)
h001-1 0.5658
h001-2 0.4553
h001-3 0.4749
h001-4 0.5302
h001-5 0.4677
h001-6 0.4374
h001-7 0.5150
h001-8 0.4145
h001-9 0.5203
h001-10 0.5142
Ch-001 0.3915
结果显示，本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9-Y与LDLR之间的结合。
用上面所述方法，测试本发明PCSK9抗体对其它形式的LDLR-FC(内部生产的，序列见SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9)和PCSK9-Y(SEQ ID NO：5)结合的阻断能力，实验证明本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与缩短形式的LDLR 之间的结合。
测试例4、PCSK9抗体对LDLR-FC/PCSK9结合的阻断
本发明PCSK9抗体对LDLR-FC(内部生产的，序列为SEQ ID NO：8)和PCSK9 (SEQ IDNO：5)结合的阻断能力测试，通过检测在抗体存在的条件下，PCSK9 与LDLR结合的量来确定。
用磷酸缓冲液稀释LDLR-FC至5μg/ml，包被在96孔ELISA板上，4℃放置过夜。洗板后，在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和5％脱脂奶粉)封闭2小时。洗板，加入生物素标记的PCSK9(bio-WT-PCSK9，用含 0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释至终浓度 2μg/ml)和抗体样品(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween20和1％脱脂奶粉的Tris 缓冲液稀释)的混合液100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入辣根过氧化物酶- 链霉亲和素(sigma，CAT#S2438)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其IC50值。
本发明嵌合抗体、回复突变后抗体对LDLR-FC/PCSK9结合的阻断效果测试，结果见表8。
表8.本发明PCSK9抗体阻断PCSK9与LDLR之间结合的效果测试
克隆号 IC50(μg/ml)
h001-1 0.4997
h001-2 0.6750
h001-3 0.7021
h001-4 0.7597
h001-5 4.322
h001-6 0.6620
h001-7 0.6521
h001-8 0.7738
h001-9 0.9230
h001-10 0.8290
Ch-001 0.8363
结果显示，本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与LDLR之间的结合。
用上面所述方法，测试本发明PCSK9抗体对其它形式的LDLR-FC(内部生产的，序列见SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9)和PCSK9(SEQ ID NO：5)结合的阻断能力，实验证明本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与缩短形式的LDLR之间的结合。
测试例5、PCSK9抗体对LDL的摄取实验
HepG2细胞(中科院细胞库，#CAT，TCHu72)培养在DMEM培养基(Hyclone， #CATSH30243.01B)中(含10％胎牛血清，Gibco，#CAT 10099-141)。当细胞覆盖80-90％时，消化吹散后计数1.5*104cells/孔铺于96孔板。24小时后，更换培养基为DMEM，10％无脂蛋白血清(Millipore，CAT#LP4)。48小时后，用磷酸缓冲液洗2次，加入在4℃预孵育1小时的含PCSK9(SEQ ID NO：1，终浓度10μg/ml) 和抗体样品(用培养基稀释至不同浓度)的混合物，以及终浓度10μg/ml的BODIPY -
Figure GPA0000246109790000311
(Invitrogen，CAT#L3483)，37℃孵育。6小时后，用磷酸缓冲液洗板2 次，用酶标仪读取荧光值(EX485nm/EM535nm)。然后加入50μl/孔
Figure GPA0000246109790000312
细胞活性发光检测试剂(Promega，G7571)，读取化学发光值。LDL uptake结果如图3，图4所示，数据结果显示本发明PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
测试例6、BIAcore检测PCSK9抗体亲和力实验
按照人Fab捕获试剂盒(Cat.#28-9583-25，GE)说明书中所述的方法，将人 Fab捕获分子共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1000-12，GE)上，从而亲和捕获待测抗体，然后于芯片表面流经人PCSK9抗原(带His标签的人PCSK9： PCSK9-His6，SEQ ID NO：1)，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值，见表9。在实验中每个循环解离完成后，用人Fab捕获试剂盒(GE)里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。
表9：抗PCSK9抗体的亲和力
Figure GPA0000246109790000313
本发明PCSK9抗体与人PCSK9抗原有强亲和力。
用上面相似的方法，检测本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y(SEQ ID NO：4) 的亲和力，显示本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y抗原有较强亲和力。
测试例7、PCSK9抗体体内药效实验
本实验构建过表达人PCSK9的小鼠模型，进行尾静脉注射PCSK9抗体，来评价本发明PCSK9抗体在过表达人PCSK9的小鼠体内降低LDL-c的作用。人IgG (从混合的正常人血清中，利用传统的亲和层析方法如ProteinA纯化获得的人免疫球蛋白)作为空白对照。
C57Bl/6小鼠(购自上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司)实验室环境适应5天，通过尾静脉注射AAV-PCSK9病毒(北京本元正阳基因技术有限公司)，注射4 ×1011v.g.。注射病毒后于实验前一天禁食过夜，眼眶取血，用HDL and LDL/VLDL CholesterolQuantification Kit(购自BioVision公司，货号#K613-100)检测LDL-c，根据LDL-c浓度随机分组，每组6只小鼠(n＝6)，进行尾静脉注射给药，内部生产的人IgG、h001-4-WT抗体给药剂量为10mg/kg(人IgG、h001-4-WT抗体用PBS 配制，浓度为1mg/ml)。取血前禁食6小时，给药后第24、48、72、96小时眼眶取血，37℃放置1小时，3500rpm离心10分钟，取血清保存在-80℃。
最后一次取血清后，把冻存的血清在同一天检测。用HDL and LDL/VLDLCholesterol Quantification Kit检测血清中LDL-c浓度，按照试剂盒说明书操作。
实验结果如图5所示，正常小鼠血清LDL-c浓度约为12mg/dl。注射 AAV8-PCSK9病毒后，血清中LDL-c浓度达平均40mg/dl。分组后给药，给药24小时后，与人IgG组相比，h001-4-WT组LDL-c浓度下降50％；给药48小时后， h001-4-WT组LDL-c浓度下降49％；给药72小时后，h001-4-WT组LDL-c浓度下降 32％；给药96小时后，h001-4-WT组LDL-c浓度下降20％，如表10和图6所示。
综上，h001-4-WT能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度，且药效持续到72小时。
表10.各组小鼠血清中LDL-c浓度变化
Figure GPA0000246109790000321
测试例8、竞争性实验
在竞争性ELISA实验中，我们将一种抗体包板过夜，之后同时加入生物素化的pCSK9-his和50倍于包板浓度的竞争抗体，包板抗体和溶液中的抗体将竞争性结合抗原，之后检测板上抗原的信号。结果显示，h001-4和21B12(US8030457B2) 自身能够竞争性结合抗原外，h001-4和21B12之间无明显竞争结合，提示两者抗原表位的不同。
IR(％) h001-4 21B12
h001-4 95.97 0.42％
21B12 3.86 97.78
测试例9、食蟹猴体内药效及药代检测
为考察本发明的抗体在体内的作用效果及代谢情况，尝试了在食蟹猴体内给药实验，分别给药h001-4-WT及h001-4-YTE。采用静脉注射给药，剂量选择3mg/kg，每组3只雄性食蟹猴。约2～4mL/分钟，缓慢推注。通过不同时间点取血检测脂蛋白尤其是低密度脂蛋白(LDL)及血清中抗体浓度，其中脂蛋白检测点为给药前和给药后1、4、8、12、16、20、24、28天，PK采血点为给药前、给药后15分钟、30分钟、1小时、3小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72、96、120 小时、144小时、168小时、336小时、504小时、672小时。
试验结果显示(图7)h001-4-WT和h001-4-YTE均能够明显降低食蟹猴体内LDL的含量，且h001-4-YTE的降低持续时间要优于h001-4-WT。
药代取血点血清样品通过ELISA检测其中h001-4-WT和h001-4-YTE的含量，方法参考测试例1所述，结果显示h001-4-WT在食蟹猴体内半衰期为4天，而 h001-4-YTE在食蟹猴体内半衰期为7.3天，YTE相比WT具有明显延长的体内半衰期。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司、上海恒瑞医药有限公司
<120> PCSK9 抗体、其抗原结合片段及其医药用途
<130> 760083CPCT
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带 His 标签的 pCSK9 ： pCSK9-His6 ，用于免疫原免疫小鼠或检测试剂
<400> 1
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695
<210> 2
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带 PADRE 肽和 His 标签的 pCSK9 ：pCSK9-PADRE-His6 ，作为免疫原，所含 PADR
E 肽可以 促进免疫
<400> 2
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu
690 695 700
Lys Ala Ala Ala His His His His His His
705 710
<210> 3
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带 TEV 酶切位点的
pCSK9 与 his 标签融合蛋白： pCSK9-TEV-His6 ，可通过TEV 酶切获得 N-pCSK9 （
N 端 pCSK9 结构域），作为免疫原
<400> 3
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg
450 455 460
Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val
465 470 475 480
Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser
485 490 495
Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys
500 505 510
Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala
515 520 525
Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr
530 535 540
Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln
545 550 555 560
Gln Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp
565 570 575
Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn
580 585 590
Gln Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His
595 600 605
Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro
610 615 620
Gln Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly
625 630 635 640
Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val
645 650 655
Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser
660 665 670
Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg
675 680 685
His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695 700
<210> 4
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pCSK9-D374Y 突变蛋白，带 his 标签： pCSK9-D374Y-His6，作为检测试剂
<400> 4
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695
<210> 5
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 插入生物素接受肽及 his 标签的 pCSK9 蛋白：pCSK9-BP15-His6 ，作为检测试
剂， BP15 肽 位置在表达过程中能够进行生物素标记，免除体外生物素标记及
可能导致的构建变化
<400> 5
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690 695 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705 710 715
<210> 6
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 插入生物素接受肽及 his 标签的 pCSK9
D374Y 突变体蛋白： pCSK9-D374Y-BP15-His6 ，检测蛋白
<400> 6
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690 695 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705 710 715
<210> 7
<211> 802
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带 Flag 标签和 His 标签的 pCSK9 受体蛋白LDLR 胞 外域片段： LDLR-ECD-Flag-H
is6 ，检测试剂
<400> 7
Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly
35 40 45
Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu
50 55 60
Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65 70 75 80
Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp
85 90 95
Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
100 105 110
Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys
115 120 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
130 135 140
Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145 150 155 160
Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp
210 215 220
Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu
225 230 235 240
Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp
245 250 255
Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn
260 265 270
Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu
275 280 285
Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp
290 295 300
Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp
305 310 315 320
Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr
325 330 335
Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys
340 345 350
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys
355 360 365
Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln
370 375 380
Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr
385 390 395 400
Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg
405 410 415
Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu
420 425 430
Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser
450 455 460
Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala
465 470 475 480
Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly
485 490 495
Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe
500 505 510
Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His
515 520 525
Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile
545 550 555 560
Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr
565 570 575
Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly
580 585 590
Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile
610 615 620
Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn
625 630 635 640
Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His
645 650 655
Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu
660 665 670
Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn
675 680 685
Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu
690 695 700
Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala
705 710 715 720
Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val
725 730 735
Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu
740 745 750
Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser
755 760 765
His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro
770 775 780
Ser Ser Val Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His
785 790 795 800
His His
<210> 8
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缩短形式的 LDLR 胞 外域片段与 hIgG1-Fc 融合蛋白（具有与 pCSK9 结合活性）
： LDLR-sECD -Fc （ hIgG1 ）作为检测试剂
<400> 8
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20 25 30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35 40 45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys
50 55 60
Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys Val Asn Leu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln Leu Asp Pro His Thr Lys
85 90 95
Ala Cys Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
100 105 110
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
165 170 175
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
180 185 190
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
195 200 205
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
210 215 220
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
225 230 235 240
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
260 265 270
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290 295 300
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 9
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 更加缩短形式的 LDLR 胞 外域片段与 hIgG1-Fc融合蛋白（具有与 pCSK9 结合活
性）： LDLR-ssECD -Fc （ hIgG1 ）作为检测试剂
<400> 9
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20 25 30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35 40 45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Pro
50 55 60
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
65 70 75 80
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
100 105 110
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
115 120 125
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
130 135 140
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
145 150 155 160
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
165 170 175
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
180 185 190
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
195 200 205
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
210 215 220
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
225 230 235 240
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
245 250 255
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
260 265 270
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 10
Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 11
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 12
Asp Tyr Trp Met His
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 13
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 14
Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 15
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 16
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 17
Lys Gln Ser Phe Asn Leu Phe Thr
1 5
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ch-001
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1A
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1B
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1C
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1D
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VH.1E
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ch-001 hVL.1 (CDR 接枝 )
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VL.1A
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VL.1B
<400> 26
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-VL.1C
<400> 27
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 29
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1
<400> 29
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca 180
ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac 240
cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300
gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac 360
tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc 420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-kappa
<400> 30
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 31
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-kappa
<400> 31
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggctcg 60
cgatgcgaca tcgtgatgtc tcagagccca tctagcctga gcgccagcgt gggcgacagg 120
gtaaccatca cctgcaagag cagccaaagc ctgctgaaca gcaggacccg caagaacttc 180
ctggcttggt atcagcagaa gcccggcaag tctcccaagt tgctgatcta ctgggccagc 240
accagggaga gcggcgtgcc cgacaggttc agcggctccg gcagcggcac cgacttcacc 300
ctgaccatct ctagtctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgcaa gcagagcttc 360
aatctgttca ccttcggcca gggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggctgcacca 420
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720
tgttga 726
<210> 32
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1-YTE
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
245 250 255
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 33
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h001-4-IgG1-YTE
<400> 33
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca 180
ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac 240
cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300
gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac 360
tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc 420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tctacatcac ccgggagcct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

Claims (27)

1.一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含：
分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中所述的抗原结合片段为Fab、Fab’、F(ab’)2或ScFv。
2.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求2所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的轻链可变区进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链变体的轻链FR区、或者鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区；其中所述PCSK9抗体的重链可变区进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、或IgG2或其变体的重链FR区、或IgG3或其变体的重链FR区。
4.如权利要求3所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:10所示的重链可变区和SEQ ID NO:11所示的轻链可变区。
5.根据权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的轻链进一步包含鼠源κ链或其变体的轻链恒定区、或者鼠源λ链或其变体的轻链恒定区；其中所述PCSK9抗体重链进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链恒定区、或IgG2或其变体的重链恒定区、或IgG3或其变体的重链恒定区。
6.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求7所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链，IGHV1-2*02和hjh2的组合序列或其突变序列；所述人源化抗体包含人种系重链IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3区和hjh2的FR4区或其突变序列。
9.如权利要求8所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体含有SEQID NO:18所示的重链可变区；或SEQ ID NO:18变体所示的重链可变区；其中所述的SEQ IDNO:18变体是在SEQ ID NO:18所示的重链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变。
10.如权利要求9所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述回复突变选自T30N、R87T、R72A、T74K、M48I、V68A、M70L、R38K和R67K的氨基酸回复突变。
11.如权利要求8所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的序列所示的重链可变区。
12.如权利要求7所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链模板IGKV1-39*01和hjk2.1的组合序列或其突变序列；所述的人源化抗体包含人种系轻链IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3区和hjk2.1的FR4区或其突变序列。
13.如权利要求12所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体进一步包含SEQ ID NO:24所示的、或SEQ ID NO:24变体所示的轻链可变区；其中所述的SEQ ID NO:24变体是在SEQ ID NO:24所示的轻链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变。
14.如权利要求13所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述回复突变选自T5S、S66D、Q3V和A49S的氨基酸回复突变。
15.如权利要求12所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的序列所示的轻链可变区。
16.如权利要求7所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的序列；所述轻链可变区序列选自SEQID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的序列。
17.如权利要求7所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
1)SEQ ID NO:18的重链可变区和SEQ ID NO:25的轻链可变区，
2)SEQ ID NO:18的重链可变区和SEQ ID NO:26的轻链可变区，
3)SEQ ID NO:18的重链可变区和SEQ ID NO:27的轻链可变区，
4)SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区，
5)SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:25的轻链可变区，
6)SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:26的轻链可变区，
7)SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:27的轻链可变区，
8)SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区，
9)SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:25的轻链可变区，
10)SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:26的轻链可变区，
11)SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:27的轻链可变区，
12)SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区，
13)SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQ ID NO:25的轻链可变区，
14)SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQ ID NO:26的轻链可变区，
15)SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQ ID NO:27的轻链可变区，
16)SEQ ID NO:22的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区，
17)SEQ ID NO:22的重链可变区和SEQ ID NO:25的轻链可变区，
18)SEQ ID NO:22的重链可变区和SEQ ID NO:26的轻链可变区，
19)SEQ ID NO:22的重链可变区和SEQ ID NO:27的轻链可变区，
20)SEQ ID NO:23的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区，
21)SEQ ID NO:23的重链可变区和SEQ ID NO:25的轻链可变区，
22)SEQ ID NO:23的重链可变区和SEQ ID NO:26的轻链可变区，
23)SEQ ID NO:23的重链可变区和SEQ ID NO:27的轻链可变区，和
24)SEQ ID NO:18的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区。
18.如权利要求6所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区；
其中所述PCSK9抗体的轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区。
19.如权利要求18所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的重链包含人源IgG1、IgG2或IgG4或使用氨基酸突变延长抗体在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4变体的重链恒定区。
20.如权利要求18所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体的重链包含引入YTE突变的IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。
21.根据权利要求20所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自以下的重链和轻链：
1)SEQ ID NO:28的重链和SEQ ID NO:30的轻链，和
2)SEQ ID NO:32的重链和SEQ ID NO:30的轻链。
22.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至21任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
23.一种编码根据权利要求1至21任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
24.一种含有根据权利要求23所述的DNA分子的表达载体。
25.一种用根据权利要求24所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。
26.如权利要求25所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
27.如权利要求1至21任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段或如权利要求22所述的药物组合物在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的PCSK9介导的疾病或病症选自：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、异常脂血症和动脉粥样硬化。
CN201680013073.1A 2015-12-31 2016-12-20 Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 Active CN107406511B (zh)

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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3647325A4 (en) * 2017-06-30 2021-03-17 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF PCSK-9 ANTIBODIES AND USES THEREOF
CN110981962B (zh) * 2019-12-19 2022-07-12 中国药科大学 Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用
WO2021185344A1 (zh) 2020-03-19 2021-09-23 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种胆固醇相关疾病的治疗方法
CN114369164A (zh) * 2020-10-15 2022-04-19 苏州君盟生物医药科技有限公司 抗pcsk9单克隆抗体的生产工艺

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014150983A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
CN104583237A (zh) * 2012-05-08 2015-04-29 奥尔德生物控股有限责任公司 抗pcsk9抗体及其用途
CN105037554A (zh) * 2015-06-12 2015-11-11 成都贝爱特生物科技有限公司 抗人pcsk9抗体的制备及其用途

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP4336498B2 (ja) 2000-12-12 2009-09-30 メディミューン，エルエルシー 延長した半減期を有する分子ならびにその組成物および用途
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
CA2567253A1 (en) * 2004-05-18 2005-11-24 Silverbrook Research Pty Ltd Pharmaceutical product tracking
US7572618B2 (en) * 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
AR070315A1 (es) * 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
JO3672B1 (ar) * 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
AR079336A1 (es) 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
SA111320266B1 (ar) 2010-03-11 2015-06-21 رينات نيوروساينس كوربوريشن أجسام مضادة مع ارتباط مولد مضاد يعتمد على الأس الهيدروجيني
WO2012054438A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Schering Corporation Anti-pcsk9
WO2012058137A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for diversifying antibodies, antibodies derived therefrom and uses thereof
SG191219A1 (en) * 2010-12-22 2013-07-31 Genentech Inc Anti-pcsk9 antibodies and methods of use
MX347602B (es) 2011-01-28 2017-05-03 Sanofi Biotechnology Composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos humanos frente a pcsk9.
EP2673302A1 (en) 2011-02-11 2013-12-18 Irm Llc Pcsk9 antagonists
JOP20200043A1 (ar) * 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
WO2012170607A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
US20140161821A1 (en) 2011-07-14 2014-06-12 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
AR087715A1 (es) * 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
KR101964031B1 (ko) 2011-09-16 2019-04-02 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 전구단백질 전환효소 서브틸리신 켁신-9 (ＰＣＳＫ9)의 억제제를 투여함으로써 지질단백질(ａ)의 농도를 낮추는 방법
EP2794661B1 (en) 2011-12-20 2019-03-06 Adaerata, Limited Partnership Single domain antibodies as inhibitors of pcsk9
WO2013148284A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Genentech, Inc. Antibodies that bind to a pcsk9 cleavage site and methods of use
US20150140005A1 (en) 2012-05-17 2015-05-21 Cyon Therapeutics Inc. Methods and Uses for Proprotein Convertase Subtilisin Kexin 9 (PCSK9) Inhibitors
TW201410706A (zh) * 2012-06-15 2014-03-16 Genentech Inc 抗－ｐｃｓｋ９抗體、調配物、劑量及使用方法
CN105001336A (zh) * 2014-04-18 2015-10-28 上海复旦张江生物医药股份有限公司 Pcsk9拮抗剂
WO2015200438A1 (en) * 2014-06-24 2015-12-30 Eleven Biotherapeutics, Inc. High affinity antibodies against pcsk9
CN104861071B (zh) * 2015-04-27 2019-04-12 南京师范大学 针对pcsk9的全人源单克隆抗体的可变区基因及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104583237A (zh) * 2012-05-08 2015-04-29 奥尔德生物控股有限责任公司 抗pcsk9抗体及其用途
WO2014150983A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
CN105037554A (zh) * 2015-06-12 2015-11-11 成都贝爱特生物科技有限公司 抗人pcsk9抗体的制备及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
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