KR20170126971A - 항 스클레로스틴 항체, 이의 항원 결합 단편 및 의학적 용도 - Google Patents

Abstract

인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 및 카메라 항체가 제공된다. 상기 항체는 인간 골 대사 관련 질환, 예를 들어 골다공증(OP)을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

Description

항 스클레로스틴 항체, 이의 항원 결합 단편 및 의학적 용도

본 발명은 인간 스클레로스틴(SOST)에 고 친화성으로 특이 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 그리고 치료제, 특히 SOST-매개 골 질환 또는 장애, 예를 들어 골다공증 치료제로서의 항체에 관한 것인데, 이때 대상체는 골 량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나의 증가로부터 이익을 얻는다.

본 발명의 배경

폐경기 후 골다공증(PMO) 및 노인성 골다공증을 비롯한 골다공증(OP)은, 적은 골 량과 골 미세구조의 붕괴로 말미암아 골 강도 감소, 골 취약성 증가, 그리고 골절 경향의 증가를 초래하는 것을 특징으로 하는 골 대사의 전신 장애이다. 통계에 따르면, 전 세계 약 2억 명의 사람들이 골다공증을 앓고 있으며, 그 발생률도 증가하여, 가장 흔하고 빈번히 발생하는 질환들 중 상위 7순위 안에 들 정도라고 한다. 60세 이상 중국 여성들에 있어서 골다공증 유병률은 60%로 높고, 남성들의 경우에도 골다공증 유병률은 40% ~ 50%에 이른다.

골절 예방을 위한 것으로 널리 알려져 있는 강화 운동, 칼슘 및 비타민 D 섭취뿐만 아니라, 기타 통상의 수단들 이외에, 현재 행하여지고 있는 의학적 치료는 주로 골절 예방을 위해 골 흡수를 감소시키는 것에 제한되어 있다. 골 흡수 억제 약물로서는 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐 대체제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM) 등을 포함한다. 이처럼 비스포스포네이트로 대표되는 골 흡수 억제제는 추가의 골 손실을 예방할 수는 있지만 손실된 골을 재구성할 수 없고, 또한 이러한 골 흡수 억제제는 골 흡수를 억제하면서 골 형성을 억제하지는 못한다. 호르몬 약물은 정맥 혈전증 및 심혈관 질환과 연관되어 그 위험성이 더 크다. 더욱 중요한 점은, 골 동화성 약물(bone anabolic drug)은 진정한 의미에서 골 량을 증가시킬 뿐만 아니라, 골 미세구조를 효과적으로 개선하고, 골 형성을 촉진한다는 점이다. 그러나 이는, 엄밀히 말하자면 현존하는 골 흡수 억제 약물이 할 수 없는 일이다. 지난 15년간 골절 위험을 감소시키는 것을 목표로 하는 다양한 의학적 수단들이 임상 실험들을 통해 체계적으로 연구되어 왔지만, 실제로 이용 가능한 약물들은 여전히 매우 제한적이다. 지금까지로는, 부갑상선 호르몬(PTH) 약물만이 골 형성을 자극하는 것으로 입증되었다. 그러나 다수의 단점들이 드러났다. 예를 들어 상기 약물은 골을 재형성시키는 역할을 지속적으로 하지 못하고, 골절 회복에 미미한 효과만을 보일 뿐만 아니라, 1년을 넘게 매일 경피 투여되되, 소량으로만 투여되어야 하며; 비용이 많이 드는 관계로 2년 넘게는 지속적으로 사용될 수 없고; 또한 US FDA로부터 블랙박스 경고 등의 안전성 문제 노출 등이 단점들이다.

스클레로스틴은 약물 개발을 위한 신규 생체 표적으로서 사용되고 있는데; 이는, 골다공증이 조골세포의 동화를 조절함으로써 치료될 수 있었음을 바탕으로 한다. 이러한 표적은 골 대사를 조절함으로써 골다공증을 치료하는 분야에서 치료 틈을 메꿔준다.

스클레로스틴은 SOST 유전자에 의해 발현되는 분비 당 단백으로서, 이의 아미노산 서열은, 190개의 잔기들과, 시스테인을 함유하는 후프형 도메인을 가지는 것을 특징으로 한다. 이 스클레로스틴은 골 세포에서 주로 발현되고, 조골세포, 연골, 간, 신장, 골수, 심장, 췌장 및 기타 부위에서는 매우 드물게 발현된다.

연구는, 스클레로틴이 저 밀도 지 단백 수용체 LRP5/6에 결합하여 Wnt 신호전달 경로를 억제함으로써 골 형성을 조절할 수 있음을 보였다. 현재 몇몇 회사에 의해 개발된, 표적에 대한 모노클로날 항체 약물들이 각각 제III기 또는 제II기 임상 실험에 들어갔다. 이러한 항체들의 대상 징후들로서는 골다공증, 골 손상/관련 골병증 등이 있다. 관련 특허들은 다음과 같다: WO2008133722, WO2010130830, WO2013063095, WO2014006100, WO2014081955, WO2005014650, WO2006119062, WO2008115732. 몇몇 연구는 항 스클레로스틴 항체가, 통상의 비스포스포네이트가 사용되는 치료와 모순되지 않음을 보였으며, 이들 두 약물은 함께 사용될 수 있음은 언급될 가치가 있다.

본 발명은 신규 표적에 대해 개발된, 고 친화성, 고 효능, 연장된 반감기 및 감소한 투여 횟수를 특징으로 하는, 골다공증과 같은 골 질환을 치료하기 위한 신규 항체를 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 신규 분자는 용해도가 크고 안정성이 우수하여 제제로 제조되기에 더욱 용이하고, 이로 말미암아 제조 비용이 감소하게 된다.

본 발명의 개요

본 발명의 항체는 본원에 개시된 특이적 폴리펩티드 서열을 포함하고, 인간 스클레로스틴에 고 친화성으로 특이 결합하며, 포유동물, 바람직하게는 인간의 골 량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 및 골 강도로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 적어도 하나를 증가시키는 데에 사용될 수 있는 키메라 모노클로날 항체 또는 인간화된 모노클로날 항체이다.

본 발명은 하기 서열들이나 이의 돌연변이체, 또는 하기 서열들과의 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열로부터 선택되는 CDR 영역 적어도 하나를 포함하는 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:

중쇄 가변 영역 HCDR 서열: 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9; 및

경쇄 가변 영역 LCDR 서열: 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 이 항체의 중쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열들, 즉 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9, 또는 이의 돌연변이체로부터 선택되는 HCDR 영역 서열 적어도 하나를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 이 항체의 경쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열들, 즉 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12, 또는 이의 돌연변이체로부터 선택되는 LCDR 영역 서열 적어도 하나를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 이 항체는 HCDR 영역 서열들, 즉 서열 번호 7(HCDR1), 서열 번호 8(HCDR2) 및 서열 번호 9(HCDR3), 또는 이의 돌연변이체와, LCDR 영역 서열들, 즉 서열 번호 10(LCDR1), 서열 번호 11(LCDR2) 및 서열 번호 12(LCDR3), 또는 이의 돌연변이체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, CDR 영역의 돌연변이체는 항체 활성을 최적화하는(최적화시키는) 아미노산 돌연변이(들) 1개 내지 3개를 가지는 CDR 영역이고, HCDR2 영역의 돌연변이체는 바람직하게 서열 번호 13에 보인 바와 같다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 항체 또는 이의 단편이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 5의 서열, 또는 서열 번호 5의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 마우스 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 6의 서열과 같거나 또는 서열 번호 6의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 5에 보이고, 마우스 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 6에 보인다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 마우스 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 항체 중쇄 가변 영역은 마우스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체로부터 유래하는 중쇄 FR 영역을 추가로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 마우스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체로부터 유래하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 전술된 바와 같은 마우스 항체 또는 이의 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 마우스 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 항체의 경쇄 가변 영역은 마우스 κ 또는 λ 사슬, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 경쇄 FR 영역을 추가로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 마우스 κ 또는 λ 사슬, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 전술된 바와 같은 마우스 항체 또는 이의 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체 또는 이것들의 단편이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체로부터 유래하는 중쇄 FR 영역을 추가로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체 중쇄 가변 영역 상 중쇄 FR 영역 서열은 인간 생식계열 중쇄 IGHV1-18*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 골격 서열 또는 이의 돌연변이체로부터 유래하고, 바람직하게 돌연변이체 서열은 0개 내지 10개의 아미노산의 역 돌연변이(들)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 서열 번호 14~16의 서열과 같거나 또는 이의 돌연변이체, 또는 이 서열 번호 14~16의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체 경쇄 가변 영역 상 경쇄 FR 영역 서열은 인간 생식계열 경쇄 IGKV1-39*01 및/또는 IGKV4-1*01 중 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 골격 서열 또는 이의 돌연변이체로부터 유래하고, 바람직하게 돌연변이체는 0개 내지 10개의 아미노산 역 돌연변이(들)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 서열 번호 17~19의 서열들 또는 이것들의 돌연변이체, 또는 이 서열 번호 17~19의 서열들과의 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 서열 번호 14~16의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 17~19의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 하기 (a) 내지 (c) 중 임의의 하나로부터 선택되는, 중쇄 가변 영역 서열과 경쇄 가변 영역 서열의 조합을 포함한다:

(a) 서열 번호 14의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 17의 경쇄 가변 영역 서열;

(b) 서열 번호 15의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 18의 경쇄 가변 영역 서열; 또는

(c) 서열 번호 16의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 19의 경쇄 가변 영역 서열.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2 또는 이의 변이체, 인간 IgG3 또는 이의 변이체, 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래하는 불변 영역, 바람직하게는 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래하는 불변 영역, 가장 바람직하게는 인간 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래하는 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 또한 성능 변화를 도모하기 위해 "YTE"와 같은 변경을 몇 개 수반할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 서열 번호 24~26의 서열들, 또는 이 서열 번호 24~26의 서열들과의 동일성이 적어도 90%인 서열들로부터 선택되는 전장 중쇄 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체의 경쇄 가변 영역은 선택적으로 인간 κ 또는 λ 사슬, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 경쇄 FR 영역을 추가로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 인간 κ 또는 λ 사슬, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 서열 번호 27~29의 서열들, 또는 이 서열 번호 27~29의 서열들과의 동일성이 적어도 90%인 서열들로부터 선택되는 전장 경쇄 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 서열 번호 24~26의 서열들로부터 선택되는 전장 중쇄 서열과, 서열 번호 27~29의 서열들로부터 선택되는 전장 경쇄 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 인간화된 SOST 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 인간화된 항체는 하기의 것들 중 임의의 하나로부터 선택되는, 전장 경쇄 서열 및 전장 중쇄 서열의 조합을 포함한다:

Ab-10: 서열 번호 24의 중쇄 및 서열 번호 27의 경쇄;

Ab-9: 서열 번호 25의 중쇄 및 서열 번호 28의 경쇄; 또는

Ab-5: 서열 번호 26의 중쇄 및 서열 번호 29의 경쇄.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 항원 결합 단편은 Fab, Fv, sFv 또는 F(ab')₂이다.

본 발명은 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 항원 결합 단편의 발현 전구체 생성물을 암호화하는 DNA 서열을 추가로 제공한다.

본 발명은 전술된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다.

본 발명은 전술된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 추가로 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에는 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포인, 전술된 바와 같은 숙주 세포가 제공된다.

본 발명은 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 함유하는 약학 조성물의, 골 량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 향상시키기 위한 의약품 제조에 있어서의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 함유하는 약학 조성물의, SOST 매개 골 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약품 제조에 있어서의 용도를 추가로 제공하는데, 이때 상기 질환 또는 장애는 골다공증, 골 감소증, 골관절염, 류머티즘성 관절염, 치주질환 또는 다발성 골수종 질환 또는 장애로부터 선택되고; 바람직하게는 골다공증이다.

본 발명은, SOST 매개 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 전술된 바와 같은 SOST 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학 조성물 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, SOST 매개 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 추가로 제공하는데; 여기서 상기 질환 또는 장애는 골다공증, 골 감소증, 골관절염, 류머티즘성 관절염, 치주질환 또는 다발성 골수종 질환 또는 장애로부터 선택되고; 바람직하게는 골다공증이다.

도면의 간단한 기술
도 1은, 본 발명의 인간화된 항 SOST 항체의 사이노몰거스 원숭이에 있어서의 약물 농도-시간 곡선을 보여준다. 결과들은, 본 발명의 인간화된 항체가 동일한 용량으로 사용되어 구하여진 AUC _0-t(㎎/㎖*일)는 22.3이었고, 이는 양성 항체(positive antibody) 로모소주맙의 AUC _0-t(㎎/㎖*일)(9.95)의 2배를 초과함을 보여준다.
도 2는, 본 발명의 인간화된 항 SOST 항체가 사용되어 달성된 요추 골 무기질 밀도(BMD)의 증가%를 보여준다. 결과들은, 본 발명의 인간화된 항 SOST 항체의 효능은 사이노몰거스 원숭이에서 용량 의존적이었음을 보여준다. 인간화된 항 SOST 항체 Ab-5는 10 ㎎/㎏에서 효능을 보였는데, 이는 양성 분자 30 ㎎/㎏의 효능에 맞먹는 것이다. 이는, 원숭이에 있어서 본 발명의 분자의 효능은 원숭이에 있어서 양성 분자 로모소주맙 효능의 3배였음을 의미한다.

약물의 투여량은 다음과 같은 다양한 인자들, 즉 사용된 특정 화합물의 활성, 환자 연령, 환자 체중, 환자 건강 상태, 환자 식습관, 투여 시간, 투여 방식, 배설 속도, 약물의 조합 등(이에 한정되는 것은 아님)에 의존한다는 것은 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 더욱이, 최적 치료 양상, 예를 들어 치료 방식, 항체 또는 이를 포함하는 조성물의 1일 용량, 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 유형도 통상의 치료 계획에 따라서 입증될 수 있다.

본 발명을 더욱 이해하기 쉽게 만들기 위해, 임의의 기술 용어 및 과학 용어가 이하에 구체적으로 정의되어 있다. 본원의 다른 곳에 달리 정의되어 있지않은 한, 본원에 사용된 기타 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속한 업계에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 용어와 동일한 의미를 갖는다.

용어

본원에 사용된 바와 같이, 아미노산에 대한 1 문자 코드 및 3 문자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)]에 기술되어 있다.

용어 "스클레로스틴" 또는 "SOST" 또는 "SOST 단백질"이 본원에 사용될 때, 이 용어는 스클레로스틴(SOST) 유전자 발현 생성물(단백질)을 지칭한다. 달리 지정되지 않은 한, 마우스 SOST(m-SOST) 또는 사이노몰거스 원숭이 SOST(cyno-SOST)와 같은 용어는 본 발명에 있어서 인간 SOST(h-SOST)를 지칭한다. 본 발명에 사용된 인간, 마우스 및 사이노몰거스 원숭이 SOST의 뉴클레오티드 서열은 유전자 은행으로부터 얻어지는데, 예를 들어 NP_079513.1은 인간 SOST 단백질 서열을 제공한다.

본 발명의 항 스클레로스틴 항체와 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"(또는 간단히 "본 발명의 항체")는 모노클로날 항체를 지칭한다. 본 발명에 의한 모노클로날 항체 또는 mAb는 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클로닝된 세포주에 제한되지 않는 단일 클로날 세포주로부터 수득된 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편은 재조합, 예를 들어 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 전시 기술, 합성 기술, 또는 선행 기술들이나 당 업계에 널리 알려진 기타 기술들의 기타 조합에 의해 수득될 수 있다.

"모노클로날 항체" 또는 "본 발명의 항체" 또는 간단히 "항체"는 (비변형 또는 전장 Fc 영역을 포함하는) 비변형 항체이거나, 또는 키메라 항체나 인간화된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')₂ 단편을 포함하는 항체의 부분 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 항체의 특히 바람직한 항원 결합 단편은, 포유동물 스클레로스틴의 생물활성특성 하나 이상을 체내 또는 체외에서 억제 또는 중화하는 능력을 보유한다. 예를 들어 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 항원 결합 부분은 인간 스클레로스틴과, 이의 하나 이상의 리간드와의 상호 작용을 억제할 수 있으며/있거나 인간 스클레로스틴의 수용체 매개 기능 하나 이상을 억제할 수 있다.

더욱이, 본원에 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체" 또는 "본 발명의 항체" 또는 간단히 "항체"는 LCVR과 HCVR을 암호화하는 DNA가 링커 서열과 연결되어 제조될 수 있는 단일 사슬 Fv 단편일 수 있다[문헌(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994) 참조]. 항원 결합 단편이나 부분이 지정되었는지 여부와 상관없이, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 이러한 단편 또는 부분뿐만 아니라, 단일 사슬 형태도 포함함이 이해된다. 달리 지정되지 않는다면, 단백질이 스클레로스틴과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 한 해당 단백질은 용어 "항체"에 포함된다.

본 발명에 있어서 용어 "항 스클레로스틴 항체", "인간 스클레로스틴과의 결합에 특이적인 항체", "항 SOST 항체", "항 SOST", "SOST 항체" 또는 "SOST에 결합하는 항체"는, 충분한 친화성으로 SOST에 결합할 수 있어서, SOST를 표적화하기 위한 치료제 및/또는 진단 제제로서 사용될 수 있는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적 결합"은, 당 업계에서 이용 가능한 기술들, 예를 들어 경쟁적 ELISA, BIACORE® 분석, 또는 KINEXA® 분석에 의해 확인된다. 예를 들어 상기 용어는 또한 본 발명의 항체의 항원 결합 도메인이 다수의 항원에 의해 운반되는 특정 에피토프에 특이적일 때에도 적용 가능한데, 이 경우 항원 결합 도메인을 운반하는 항체는 이러한 에피토프를 운반하는 항원 다수에 특이적으로 결합할 수 있다. 용어 "에피토프"는, 하나 이상의 항체 중 항원 결합 영역 내에 있는 것으로서, 항체에 의해 인지될 수 있고 항체와 결합할 수 있는 분자 부를 지칭한다.

본 발명의 항체와 관련하여, 어구 "생물활성"은, 에피토프 또는 항원 결합 친화성, 스클레로스틴의 생물활성을 체내 또는 체외에서 중화 또는 길항시키는 능력, 스클레로스틴 항체가 인간 스클레로스틴 및 LRP-6과 체외 결합하여 이를 차단하는지에 대한 결합 분석(예를 들어 본원의 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같음), 또는 기타 체외 활성 분석에서 측정된 IC50, 항체의 체내 및/또는 체외 안정성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전술된 특성들 또는 특징들은 당 업계에서 인지된 기술, 예를 들어 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라스몬 공명 분석, 체외 및 체내 비 제한적 중화 분석, 필요에 따라서 상이한 공급원(인간, 영장류 포함) 또는 기타 임의의 공급원으로부터 유래하는 조직 검편들이 사용되는 면역조직화학기술 및 수용체 결합기술이 사용되어 관찰 또는 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

스클레로스틴과 관련하여, 어구 "생물활성"은, 스클레로스틴과 다른 단백질(예를 들어 수용체 또는 TGF-β과 일원)의 특이적 결합, 인간 스클레로스틴의 수용체 매개 기능(들) 하나 이상, 신호전달, 면역원성, 체내 또는 체외 안정성, 다른 단백질의 체내 또는 체외 수준 또는 활성에의 영향력(예를 들어 실시예 1~5 참조), 스클레로스틴 발현 수준 및 조직 분포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체의 생물활성과 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "억제하다" 또는 "중화하다"는, 스클레로스틴의 생물활성을 (예를 들어 본원의 실시예 2에서 측정된 바와 같이) 실질적으로 길항, 억제, 방지, 저지, 지연, 방해, 제거, 중지, 감소 또는 역전시키는 능력을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "캐벗 번호 매김(Kabat numbering)"은, 당 업계에 인지되어 있는 것으로서, 항체의 중쇄 및 경쇄 영역들 중 다른 아미노산 잔기들보다는 더욱 가변적인(즉 초 가변적인) 아미노산 잔기들의 번호 매김 체계를 지칭한다[Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]. 항체 중 가변 영역 내 CDR들의 위치 결정은 캐벗 번호 매김(또는 간단히 "캐벗")을 따른다.

본원에서 호환되어 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는, 포유동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 임의의 구현예에서, 대상체는 스클레로스틴의 수준이나 생물활성이 감소되는 것이 이로운 질환 또는 장애 또는 병태를 앓고 있는 것을 추가의 특징으로 한다.

용어 "벡터"는, 다른 핵산과 작동 가능하도록 연결되어 있으면서 이 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 용어는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 어떤 벡터는 이 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있는 반면, 다른 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 해당 숙주 세포의 게놈에 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제할 수 있다. 더욱이, 어떤 벡터는 해당 벡터와 작동 가능하도록 연결되어 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단하게 "발현 벡터")라고 지칭된다. 예시적 벡터는 당 업계에 널리 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "숙주 세포" 및 "세포 배양액"은 호환되어 사용되고 있는데, 이는 본 발명의 분리된 임의의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 항체, LCVR 또는 HCVR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 재조합 벡터(들)를 수용하는 다양한 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 본 발명의 모노클로날 항체, 또는 이의 경쇄나 중쇄를 발현하는 재조합 벡터(들) 또는 폴리뉴클레오티드 하나 이상으로 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포를 포함한다.

전장 항체의 중쇄 각각은 N-말단 중쇄 가변 영역(본원에서는 "HCVR") 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 전장 항체의 경쇄 각각은 N-말단 경쇄 가변 영역(본원에서는 "LCVR") 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. HCVR 영역 및 LCVR 영역은 상보성 결정 영역("CDR"; Complementarity Determining Region)이라고 칭하여지는 초 가변성 영역으로 추가로 세분된다. CDR 내에 배치된, 더욱 많이 보존된 영역은 골격 영역("FR"; Framework Region)이라고 칭하여진다. 항체가 특정 항원 또는 에피토프와 결합하는 기능상의 능력은 대게 항체의 가변 영역 내에 존재하는 6개의 CDR에 의해 영향을 받는다. HCVR 및 LCVR 각각은 3개의 CDR(HCVR 내 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과, LCVR 내 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)과 4개의 FR을, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서(아미노 말단→카복시 말단으로 배열)로 포함한다. CDR은 항원과의 특이적 상호작용을 이루는 잔기 대부분을 함유한다. 가변 영역 내 CDR 위치 결정은 캐벗을 따른다.

경쇄는 카파 또는 람다로 분류되고, 당 업계에 공지된 바와 같은 특정 불변 영역에 의해 특징지어진다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 각각 정의된다. 이들 아이소타입 중 몇몇은 차례로 하위 군, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 추가 분류될 수 있다. 각각의 중쇄 류는 당 업계에 널리 공지된 서열을 포함하는 특정 불변 영역에 의해 특징지어진다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역 카파는 본 발명의 항체에 있어서 바람직한 불변 영역이다. 키메라 항체는 인간 이외의 기원, 바람직하게는 래트나 마우스로부터 유래하는 불변 영역을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 부분"이란, 항체 분자의 가변 영역 내 부분으로서, 항원과 상호작용하고, 항원에 대한 특이성과 친화성을 항체에 부여하는 아미노산 잔기들을 함유하는 부분을 지칭한다. 이러한 항체 부분은 항원 결합 잔기들의 적당한 형태를 유지하는 데에 필요한 골격 아미노산 잔기들을 포함한다.

본 발명의 바람직한 항체는, 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 가지는 6개의 CDR을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 항체는 서열 번호 19, 27, 28, 32, 36 및 40의 아미노산 서열을 가지는 6개의 CDR을 포함한다. 더욱 바람직하게 본 발명의 항체 중 최적화된 CDR들은, 모 항체 중에 존재하는 CDR들과 비교되었을 때 아미노산 치환을 적어도 하나 포함하고, 본 발명의 항체 중 최적화된 CDR들은 서열 번호 7, 13, 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 가지는 6개의 CDR을 포함한다. 이와 같은 바람직한 항체의 CDR은 이하 표 1에 제시된 바와 같은 위치에 존재한다. CDR은 캐벗에 따라서 가변 영역 내에 위치한다.

본 발명의 바람직한 항체는 서열 번호 14, 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 HCVR을 포함한다. 본 발명의 기타 바람직한 모노클로날 항체는 서열 번호 17, 18 및 19의 아미노산 서열을 가지는 LCVR을 포함한다. 더욱 바람직하게 본 발명의 항체는 서열 번호 17의 LCVR과 서열 번호 14의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 대안적 항체는 서열 번호 18의 LCVR과 서열 번호 15의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 항체는 서열 번호 16의 HCVR과 서열 번호 19의 LCVR을 포함한다. 이러한 본 발명의 HCVR들은 바람직하게 중쇄 불변 영역, 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 불변 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역, 가장 바람직하게 IgG4의 중쇄 불변 영역에 결합되어 있다. 상기 LCVR은 바람직하게 인간 기원의 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 카파 사슬에 결합되어 있다.

본 발명에서 바람직한 일 항체는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드와 서열 번호 27의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명에서 바람직한 또 다른 항체는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드와 서열 번호 28의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명에서 바람직한 또 다른 항체는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드와 서열 번호 29의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

항체 CDR 서열의 서열 번호는 이하 표 1에 나열된 바와 같다.

바람직하게 본 발명에서 항체는, 인간 스클레로스틴에 대한 K_D가 약 10 nM, 3 nM, 1 nM 또는 0.3 nM 미만, 더욱 바람직하게 약 0.1 nM 미만인 것을 추가의 특징으로 한다. 부가적으로, 이러한 항체는 사이노몰거스 원숭이 스클레로스틴에 대한 K_D가 약 10 nM, 3 nM, 1 nM 또는 0.3 nM 미만, 더욱 바람직하게 약 0.1 nM 미만인 것에 의해 추가로 정의된다.

바람직하게 본 발명에서 항체는, 인간 스클레로스틴과 LRP-6 사이의 결합을 차단하는 실험(예를 들어 본원의 실시예 2 참조)에서 측정된 바와 같이, IC50이 100 nM 이하, 약 50 nM 이하 또는 30 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 25 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 약 20 nM 이하(예를 들어 17.9 nM)인 것을 추가의 특징으로 한다.

더욱 바람직하게 본 발명에서 항체는, 인간 스클레로스틴에 대한 K_D가 약 10 nM, 3 nM, 1 nM 또는 0.3 nM 미만, 더욱 바람직하게 약 0.1 nM 미만인 것을 추가의 특징으로 하고, 또한 인간 스클레로스틴과 LRP-6 사이의 결합을 차단하는 실험에서 측정된 바와 같이, IC50이 100 nM 이하, 약 50 nM 이하 또는 30 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 25 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 약 20 nM 이하(예를 들어 17.9 nM)인 것도 또한 특징으로 한다. 상기 항체 내 6개의 CDR, HCVR, LCVR, HCVR 및 LCVR, 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄와 전체 경쇄는 본원의 서열 번호에 보인 바와 같은 특정 서열에 의해 정의된다.

더욱더 바람직하게 본 발명에서 항체는, 인간 스클레로스틴에 대한 K_D가 약 10 nM, 3 nM, 1 nM 또는 0.3 nM 미만, 더욱 바람직하게 약 0.1 nM 미만인 것을 추가의 특징으로 하고, 또한 인간 스클레로스틴과 LRP-6 사이의 결합을 차단하는 실험에서 측정된 바와 같이, IC50이 100 nM 이하, 약 50 nM 이하 또는 30 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 25 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 약 20 nM 이하(예를 들어 17.9 nM)인 것도 또한 특징으로 하고; 또한 사이노 스클레로스틴이 사용되는, 스클레로스틴 항체의 체외 ELISA 결합 실험에서 측정되는 바와 같이, K_D가 10 nM, 3 nM, 1 nM 또는 0.3 nM 미만, 더욱 바람직하게 약 0.1 nM 미만인 것도 특징으로 한다. 상기 항체 내 6개의 CDR, HCVR, LCVR, HCVR 및 LCVR, 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄와 전체 경쇄는 본원의 서열 번호에 보인 바와 같은 특정 서열에 의해 정의된다.

항체의 발현

본 발명은 또한 본 발명의 항 스클레로스틴 항체를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포주의 정립 및 분리는 당 업계에 공지된 표준 기술이 사용되어 달성될 수 있다.

당 업계에 공지된 다양한 숙주 발현 계, 예를 들어 원핵생물(박테리아) 및 진핵생물 발현 계(예를 들어 효모, 바큘로바이러스, 식물, 포유동물 및 기타 동물 세포, 유전자 이식 동물 및 하이브리도마 세포), 그리고 파지 전시 발현 계가 본 발명의 항체를 발현하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는, 숙주 세포 내 면역글로불린 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자의 재조합체 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체가 재조합에 의해 발현되기 위해서, 숙주 세포는 항체의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질전환, 형질도입 또는 감염되어, 상기 경쇄 및/또는 중쇄는 숙주 세포 내에서 발현된다. 상기 중쇄 및 경쇄는 하나의 벡터 내에 작동 가능하도록 결합하고 있는 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 대안적으로 상기 중쇄 및 경쇄는 2개의 벡터(중쇄를 발현하는 하나의 벡터와, 경쇄를 발현하는 다른 하나의 벡터) 내에 작동 가능하도록 결합하고 있는 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 선택적으로 상기 중쇄 및 경쇄는 상이한 숙주 세포 내에서 발현될 수도 있다.

부가적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항 스클레로스틴 항체 경쇄 및/또는 중쇄가 분비되는 것을 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항 스클레로스틴 항체 경쇄 유전자 및/또는 중쇄 유전자는 벡터에 클로닝될 수 있으며, 이때 신호 펩티드는 인-프레임(in-frame) 방식으로 항체 사슬 유전자의 아미노 말단과 작동 가능하도록 결합하게 된다. 신호 펩티드는 면역 글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드일 수 있다. 바람직하게 재조합 항체는 숙주 세포가 배양되고 있는 배지에 분비되고, 이로부터 항체가 회수 또는 정제될 수 있다.

HCVR 영역을 암호화하는, 분리된 DNA는 HCVR 암호화 DNA를 중쇄 불변 영역을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하도록 결합시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편은, 예를 들어 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 캐벗(상동)에 기술된 바와 같이, 임의의 유형(예를 들어 IgG, IgA, IgE, IgM 또는 IgD), 임의의 군(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 하위 군의 불변 영역과, 이것들의 임의의 동종 이인자형 변이체일 수 있다. 바람직한 중쇄 불변 영역은 IgG1 또는 이의 변이체의 불변 영역이나, IgG4 또는 이의 변이체의 불변 영역을 포함한다.

LCVR 영역을 암호화하는, 분리된 DNA는 LCVR 암호화 DNA를 경쇄 불변 영역을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하도록 결합시킴으로써 전장 경쇄 유전자(그리고 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편들은, 예를 들어 표준적 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.

본 발명에 사용하기 바람직한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포(예를 들어 ATCC CRL-9096), HEK 293E 세포(예를 들어 ATCC CRL-1573), NS0 세포, SP2/0 세포 및 COS 세포(ATCC, 예를 들어 CRL-1650, CRL-1651)이다. 본 발명에 사용되는 추가의 숙주 세포는 다른 포유동물 세포, 효모 세포 및 원핵생물 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는, 숙주 세포 내에서 항체 발현이 허용되기 충분한 시간의 기간, 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장한 배양 배지에 항체가 분비되는 것이 허용되기 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양시킴으로써 생산된다. 표준 정제 방법을 사용하여 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다.

발현 생성물(전 항체의 형태, 항체의 경쇄 및 중쇄의 형태, 또는 면역글로불린의 다른 형태)은 당 업계의 표준 방법, 예를 들어 황산 암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 및 겔 전기영동 등에 따라서 정제될 수 있다. 동질성이 적어도 약 90%, 92%, 94% 또는 96%인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 약학적 용도로서 바람직하고, 동질성이 98% ~ 99% 또는 이 이상인 것이 가장 바람직하다. 일단 항체가 정제, 부분 정제 또는 원하는 동질성으로 정제되면, 멸균 항체는 이후 본원에 지도된 바와 같이 치료용으로 사용될 수 있다.

인간화된 항체

바람직하게 치료의 목적으로 사용될 본 발명의 항체는 포유동물로부터 유래하는 골격 서열 및 불변 영역 서열을 (그것이 항체 내에 존재하는 한) 가지는데, 상기 항체는, 치료용 항체가 포유동물 내에서 이 치료용 항체 자체에 대한 면역 반응을 유도할 가능성을 감소시키는 치료제로서 사용될 것이다. 인간화된 항체는 치료적 응용에 매우 가치가 크고, 마우스 기원의 항체 또는 마우스 기원 부분을 포함하는 항체가 인간 대상체에 투여될 때 흔히 관찰되는 인간 항 마우스 항체 반응의 가능성을 감소시키기 때문에, 인간화된 항체가 특히 관심의 대상이다. 바람직하게 주사된 인간화 항체는, 예를 들어 마우스 항체와 비교되었을 때, 자연 발생 인간 항체의 반감기와 더욱 유사한 반감기를 가질 수 있으므로, 이 인간화 항체는 대상체에 덜 자주 투여될 수 있거나 또는 더욱 적은 용량으로 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간화된 항체"는, 적어도 일부분이 인간에서 기원한 항체를 지칭한다. 예를 들어 인간화된 항체에는, 비인간(예를 들어 마우스) 기원의 항체로부터 유래하는 부분들과, 인간 기원의 항체로부터 유래하는 부분들이, 예를 들어 종래의 기술(예를 들어 합성)에 의해 화학적으로 서로 결합하여 포함되거나, 유전자 조작 기술이 사용되어 연속 폴리펩티드로서 제조되어 포함될 수 있다.

바람직하게 "인간화된 항체"는 모 항체(즉 비인간 항체, 바람직하게는 마우스 모노클로날 항체)로부터 기원하거나 이로부터 유래하는 CDR을 가지는 한편, 골격 영역과 불변 영역(또는 이의 유의미한 부분 또는 상당한 부분, 즉 적어도 약 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%만큼의 부분)은, 그것이 존재하는 한, 상기 항체가 인간 세포 내에서 생산되었는지 아닌지 여부와는 상관없이, 인간 생식계열 면역글로불린 영역에 나타나거나(예를 들어 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스 참조), 이의 재조합 또는 돌연변이된 형태에 나타나는 핵산 서열 정보에 의해 암호화된다. 바람직하게 인간화된 항체의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR은, 이 인간화된 항체의 기원이 된 비인간 모 항체의 CDR에 의해 최적화되고, 그 결과 스크리닝 분석, 예를 들어 ELISA 분석에 의해 동정될 수 있는 원하는 특성, 예를 들어 개선된 특이성, 친화성 또는 중화 특성이 달성된다. 바람직하게 본 발명의 항체 중 최적화된 CDR은, 모 항체 중에 존재하는 CDR과 비교되었을 때 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 인간화된 항체의 CDR의 일부 아미노산 치환은 모 항체의 CDR들(본원의 실시예 4 참조)과 비교시 (예를 들어 CDR 중 Asn 잔기들의 제거를 통해) 항체의 불안정 가능성을 감소시키거나, 인간 대상체에 투여될 때 (예를 들어 IMMUNOFILTER™ 기술에 의해 예상되는 바와 같이) 항체의 면역원성을 감소시킨다.

인간화된 항체는 바람직하게 비인간 항체로부터 유래하는 최소의 서열을 함유한다. 인간화된 항체는 수용 항체, 또는 모 항체로부터 유입된 CDR 서열 또는 골격 서열 그 어느 곳에서도 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 당 업계의 통상의 방법들이 사용되는 체외 돌연변이유발의 대상이 될 수 있으므로, 인간화된 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 영역의 골격 영역 아미노산 서열은, 인간 생식계열 HCVR 및 LCVR 서열과 관련된 것들로부터 유래하되, 자연에서는 체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 실존할 수 없는 서열이다. 이와 같이 인간화된 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 골격 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 서열과의 동일성이 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%이거나, 또는 더욱 바람직하게 적어도 99%이거나, 또는 가장 바람직하게 100%인 것으로 생각된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 인간 생식계열 중쇄 골격 서열과 인간 생식계열 경쇄 골격 서열을 포함한다. 이러한 골격 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 아우르는 공공 DNA 데이터베이스, 또는 공개된 참고문헌으로부터 입수될 수 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(웹 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase 상에서 이용 가능)에서 발견될 수 있을 뿐만 아니라, 문헌[Kabat, EA, et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.]에서도 발견될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, SOST 인간화 항체 중 마우스 CDR 서열은 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12의 서열로부터 선택된다. 인간 항체 가변 영역 골격은, 항체의 경쇄 가변 영역 상 경쇄 FR 영역 서열들이 인간 생식계열 경쇄 IGKV1-39*01 및 IGKV4-1*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역으로부터 유래하고; 항체의 중쇄 가변 영역 상 중쇄 FR 영역 서열들이 인간 생식계열 중쇄 IGHV1-18*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역으로부터 유래하도록 디자인 및 선택되었다.

인간화된 항체를 제조하기 위하여 당 업계에서 사용될 수 있는 방법이 다수 존재한다. 예를 들어 인간화된 항체는 스클레로스틴, 바람직하게 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 모 항체(예를 들어 마우스 항체 또는 하이브리도마에 의해 제조된 항체)의 HCVR 및 LCVR을 암호화하는 핵산 서열을 수득한 후, 상기 (비인간) HCVR 및 LCVR 중 CDR들을 동정하여, 이러한 CDR 암호화 핵산 서열을 선택된 인간의 골격 암호화 핵산 서열상에 그래프팅(grafting) 함으로써 제조될 수 있다. 선택적으로 CDR 영역은 무작위 돌연변이유발에 의해 최적화될 수 있거나, 또는 CDR 영역을 골격 영역에 그래프팅하기 전 CDR 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하기 위해 특정 위치에서 돌연변이유발시켜 최적화될 수 있다. 또는 CDR 영역은 당 업계의 숙련자에 의해 이용 가능한 방법들이 사용되어 인간 골격 영역으로 삽입된 후 최적화될 수 있다.

CDR 암호화 서열이, 선택된 인간 골격 암호화 서열에 그래프팅된 후, 이로부터 제조된, 인간화 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 암호화하는 DNA 서열은 스클레로스틴과 결합하는 인간화 항체가 생산되도록 발현된다. 인간화된 HCVR 및 LCVR은 전 항 스클레로스틴 항체 분자의 일부로서, 즉 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 그러나, HCVR 및 LCVR 서열들은 또한 인간화된 항 스클레로스틴 Fv가 제조되도록 불변 서열의 부재 하에서 발현될 수도 있다.

사용될 수 있는 마우스 항체의 인간화를 수반하는 방법들을 추가로 기술하고 있는 참고문헌들은, 예를 들어 문헌들[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991; Winter 및 공동 연구자들(Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988))]을 포함한다.

치료적 용도

본 발명의 항 스클레로스틴 모노클로날 항체를 포함하는 약학 조성물은, 이 약학 조성물 유효량만큼이 골 량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에 투여될 때, 척추 또는 비척추 중 어느 하나, 또는 이 둘 다의 골 량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 항 스클레로스틴 모노클로날 항체를 포함하는 약학 조성물은, 이 약학 조성물 유효량만큼이 척추 및/또는 비척추 골절 발생률의 감소를 필요로 하는 인간 대상체에 투여될 때, 척추 및/또는 비척추 골절 발생률을 감소시키는 데에 사용될 수 있다. 골절 발생률의 감소는 미처리 대조군 군집과 비교시 인간 대상체에서 골절 발생 가능성을 감소시키는 것과 실제 골절 발생률을 감소시키는 것을 포함한다.

더욱이, 본 발명의 항체는, 스클레로스틴의 존재가 원치않는 병리학적 효과를 유발하거나 이에 기여하는 병태, 질환 또는 장애의 치료에 유용할 수 있으며; 스클레로스틴 수준 또는 스클레로스틴 생물활성의 감소는 인간 대상체에서 치료 효과를 발휘한다. 이러한 병태, 질환 또는 장애는 골다공증, 골 감소증, 골관절염, 골 관절염 연관 통증, 치주질환 또는 다발성 골수종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 바람직하게 인간 대상체는 척추 및/또는 비척추 골절의 위험이 있는 대상체이거나, 더욱 바람직하게 인간 대상체는 골다공증의 발병 위험이 있거나 이를 앓고 있는 대상체이다. 인간 대상체는 바람직하게 여성이고, 더욱 바람직하게 폐경 후 골다공증의 발병 위험이 있거나 이를 앓고 있는 여성이다. 골다공증의 임의의 병기에 있는 대상체는 본 발명의 방법으로부터 도움을 받을 수 있는 것으로 생각된다.

또한, 전술된 질환들 중 적어도 하나의 치료를 위한 의약품 제조에 있어서 본 발명의 항체의 용도도 고려된다.

용어 "치료" 및 "치료하는 것"은, 본원에 기술된 장애들의 진행을 지연시키거나, 중단시키거나, 방지하거나, 통제하거나 중지시킬 수 있는 모든 과정을 지칭하는 것으로 의도되지만, 반드시 모든 장애의 증상을 완전히 없애는 것을 지칭하지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환이나 병태를 치료하기 위해 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하고, (a) 질환의 추가 진행을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 방지하는 것; 그리고 (b) 질환을 완화하는 것, 즉 질환이나 장애의 퇴행을 유도하는 것, 또는 질환이나 장애의 증상들이나 합병증들을 완화하는 것을 포함한다. 투여량의 투여 계획은 최적의 원하는 반응(예를 들어 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어 단회 투여(single bolus)되거나, 수 회로 나누어진 용량들이 시간에 따라서 독립적으로 투여되거나, 또는 상기 용량이 치료 상황의 위급성에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다.

약학 조성물

본 발명의 항체는 인간 대상체에의 투여에 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 본 발명의 항체는 인간 대상체에 단독으로 투여될 수 있거나, 아니면 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 단일 용량 또는 다수 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 선택된 투여 방식에 적당하도록 디자인되고, 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제, 예를 들어 분산제, 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장제 및 안정화제 등이 적당히 사용된다. 상기 조성물은, 예를 들어 실무자들에게 일반적으로 공지된 바와 같은 제제화 기술의 개요를 제공하는 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]에 개시된 종래 기술에 따라서 디자인될 수 있다. 약학 조성물에 적합한 담체로서는, 본 발명의 모노클로날 항체와 합하여질 때 분자의 활성을 유지하고 대상체의 면역 계와는 반응을 하지 않는 임의의 물질을 포함한다.

본 발명의 항 스클레로스틴 모노클로날 항체를 포함하는 약학 조성물은, 본원에 기술된 병상, 예를 들어 골다공증, 골 관절염 또는 기타 퇴행성 골 장애가 발생할 위험이 있거나 이 병상을 보이는 대상체에 표준 투여 기술이 사용되어 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 바람직하게 본 발명의 항체 "유효량"을 함유한다. "유효량"이란, (특정 투여량으로 특정 시간의 기간 동안 특정 투여 수단에 의해) 원하는 치료 결과를 달성하는 데에 필요한 양을 지칭한다. 항체의 유효량은 개체의 병태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 개체 내에서 원하는 반응을 끌어내는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 인자들에 따라서 달라질 수 있다. 유효량은 또한 항체의 치료학적으로 유리한 효과가 항체의 임의의 독성 효과 또는 유해 효과를 압도할 때의 양이기도 하다.

유효량은, 대상체에 치료 효과를 나타내는 데에 필요한 활성 제제의 최소량(minimal dose) 이상이지만, 중독량(toxic dose)에는 못 미치는 양이다. 다시 말하면, 본 발명의 항체의 유효량 또는 치료학적 유효량은, 포유 동물, 바람직하게는 인간에서 (i) 골 량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키거나, 또는 (ii) 스클레로스틴의 존재가 원치않는 병리학적 효과를 유발하거나 이에 기여하는 병태, 장애 또는 질환을 치료하거나, 또는 (iii) 스클레로스틴 수준 또는 스클레로스틴 생물활성 감소가 포유동물, 바람직하게 인간에서 유리한 치료 효과를 보일 때의 양으로서; 다만 상기 병태, 장애 또는 질환은 골다공증, 골 감소증, 골 관절염, 류머티즘성 관절염, 치주질환 또는 다발성 골수종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명은 실시예들이 참고되어 추가로 기술된다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되지 않는다.

구체적인 조건이 기술되어 있지 않은 본 발명의 실시예들 또는 시험 실시예들에 있어서, 실험들은 일반적으로 통상의 조건 하에서 수행되거나, 원재료 또는 생성물의 제조자에 의해 제안된 조건에 따라서 수행된다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Contemporary Molecular Biology Approach, written by Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NY]을 참조한다. 시약 공급원이 구체적으로 제시되지 않은 경우, 해당 시약은 시판중인 종래의 시약이다.

실시예

실시예 1. SOST 클로닝 및 발현

His 태그를 가지는 인간 스클레로스틴의 암호화 서열(His-h-SOST), Flag 태그를 가지는 인간 스클레로스틴의 암호화 서열(h-SOST-Flag), Flag 태그를 가지는 마우스 스클레로스틴의 암호화 서열(m-SOST-Flag), 그리고 Flag 태그를 가지는 사이노몰거스 원숭이 스클레로스틴의 암호화 서열(cyno-SOST-Flag)이 CRO Shanghai Xuguan Biotechnology Development Co., Ltd(상기 스클레로스틴 재조합 단백질의 주형 서열은 본 발명에 의해 디자인됨)에 의해 합성된 후, pTT5 벡터(Biovector, Cat #: 102762)에 각각 클로닝되었다. 재조합 SOST 단백질을 293 세포에서 발현시켰으며, 실시예 2에 의해 정제하였다. 정제된 단백질은 그 다음 실시예의 실험들에서 사용될 수 있다.

His-h-SOST의 DNA 서열:

h-SOST-Flag의 DNA 서열:

m-SOST-Flag의 DNA 서열:

cyno-SOST-Flag의 DNA 서열:

실시예 2. SOST 재조합 단백질의 정제

1. His 태그를 가지는 SOST 재조합 단백질의 정제 단계

세포 발현의 상청액을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거한 후, 완충액을 PBS로 교체하고 나서, 여기에 이미다졸을 최종 농도 5 mM이 되도록 첨가되었다. 니켈 컬럼을, 5 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 평형화한 다음, 2 ~ 5 컬럼 부피로 세정하였다. 그 다음, 상청액을 컬럼 상에 로딩(loading)하였다. A₂₈₀ 판독치가 기준치로 떨어질 때까지 컬럼을, 5 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 세정하였다. 그 다음, 크로마토그래피 컬럼을 PBS 및 10 mM 이미다졸로 세정하여, 비특이적으로 결합하였던 단백질을 제거하였으며, 이때 용출액을 수집하였다. 표적 단백질을, 300 mM 이미다졸을 함유하는 PBS와 함께 용리한 다음, 용리 피크를 수집하였다.

수집된 유출물을 이온 교환(SP 컬럼)에 의해 추가로 정제하였다. 제조 용액 A: 0.01M PB, pH8.0. 제조 용액 B: 용액 A + 1M NaCl. 이미다졸을 함유하는 PBS 용액에 의해 용리되었던 표적 단백질을 처음에 용액 A에 대해 투석한 다음, SP 컬럼을 용액 A로 평형화한 후, 시료를 로딩하였는데; 이때 용액 B의 농도 구배는 0%→100%였으며; 표적 단백질을 10 컬럼 부피와 용리하고 나서, 용리 피크를 수집하였다. 수득된 단백질을 전기영동, 펩티드 맵핑(peptide mapping) 및 LC-MS에 의해 동정하였고, 딱 들어맞는 시료를 분취하여 사용하였다. His 태그를 가지는 인간 스클레로스틴(His-h-SOST)이 수득되었다.

2. Flag 태그를 가지는 SOST 재조합 단백질의 정제 단계

시료를 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거한 후, 적당한 부피로 농축하였다. 플래그 친화성 컬럼을 0.5×PBS로 평형화한 다음, 2 ~ 5 컬럼 부피로 세정하였다. 그 다음, 불순물을 제거한 후 상청액 시료를 컬럼 상에 로딩하였다. A₂₈₀ 판독치가 기준치로 떨어질 때까지 컬럼을 0.5×PBS로 세정하였다. 그 다음, 컬럼을 0.3M NaCl을 함유하는 PBS로 세정한 다음, 불순물 단백질을 세정하고 나서 수집하였다. 표적 단백질을 0.1M 아세트산(pH 3.5 ~ 4.0)과 함께 용리한 다음, 수집하고 나서, pH를 중성으로 조정하였다. 수집된 시료를 전기영동, 펩티드 맵핑 및 LC-MS에 의해 동정하였고, 올바른 시료를 분취하여 사용하였다.

Flag 태그를 가지는 인간 스클레로스틴(h-SOST-Flag), Flag 태그를 가지는 마우스 스클레로스틴(m-SOST-Flag) 및 Flag 태그를 가지는 사이노몰거스 원숭이 스클레로스틴(cyno-SOST-Flag)이 수득되었으며, 이를 본 발명의 항체에 대한 성능 시험을 위해 사용하였다.

실시예 3. 모노클로날 항체 항 인간 SOST 의 제조

마우스를 면역화하여 항 인간 SOST 모노클로날 항체를 제조하였다. 실험용 SJL 흰색 마우스(암컷, 6주령)(Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., 동물 생산 허가 번호: SCXK (Beijing) 2012-0001).

사육 환경: SPF 수준. 마우스를 구입한 후, 이 동물을 실험실에 1주일 간 방치하였다(명기/암기 12시간/12시간, 온도 20℃ ~ 25℃, 습도 40% ~ 60%). 환경에 순응시킨 마우스를 2개의 군으로 나누었다(A군 및 B군, 각 군당 마우스 10마리).

His 태그를 가지는 인간 SOST 재조합 단백질(His-h-tag)을 면역원으로 사용하였다. A군에서는 프룬트 보조제(Freund's adjuvant)(sigma Lot Num: F5881/F5506)를 유화를 위해 사용하였는데: 1차 면역화는 프룬트 완전 보조제(CFA)가 사용되어 수행되었고, 증강 면역화(booster immunization)는 프룬트 불완전 보조제(IFA)가 사용되어 수행되었다. 항원 대 보조제의 비율은 1:1이었고, 200 ㎕/200 ㎍/마우스(1차 면역화), 200 ㎕/100 ㎍/마우스(증강 면역화)였다. B군에서는 Titermax(sigma Lot Num: T2684) 및 Alum(Thremo Lot Num: 77161)이 사용되어 교차 면역화가 수행되었다. 항원 대 보조제(Titermax)의 비율은 1:1이었고, 항원 대 보조제(Alum)의 비율은 3:1이었으며, 200 ㎕/200 ㎍/마우스(1차 면역화), 200 ㎕/100 ㎍/마우스(증강 면역화)였다. 항원을 유화하고 나서, 0, 14, 28, 42, 56일 경과 시에 접종하였다.

제0일에, A/B 군 마우스의 복막 내에 유화된 항원 50 ㎍/마우스를 주사하였다. 제14일에, 마우스의 다수의 부위(보통은 등쪽 6개 ~ 8개 부위)에 항원 25 ㎍/마우스를 피하(s.c.) 주사하였다. 제28일과 제42일에, 등 쪽 덩어리와 복부 종창의 상태에 따라서 등 또는 복막 내 중 어느 하나의 부위를 선택하여 항원을 주사하였다. 비장 세포 융합 3일 전, 염수와 함께 제제화된 항원 용액을 마우스당 200 ㎍씩 복막 내(IP) 주사하여 증강 면역화를 수행하였다.

혈액 역가(blood titer) 검사를 22, 36, 50 및 64일 경과시에 수행하였으며, 마우스 혈청의 인간 스클레로스틴에 대한 결합 활성을 시험 실시예 1의 ELISA 방법에 의해 측정하였고, 그 결과를 표 2에 보였다. 4차 면역화 이후, 고 혈액 역가를 일정하게 유지하는 경향을 보이는 마우스를 비장 세포 융합을 위해 선택하였다. 최적화된 PEG 매개 융합 방법을 사용하여 비장 세포를 골수종 Sp2/0 세포(ATCC® CRL-8287^TM)와 융합함으로써 하이브리도마 세포를 제조하였다. 마우스 혈청 중 항 인간 SOST 항체에 의해 인간 SOST와 LRP-6 간 결합을 차단하는 활성을 시험 실시예 2에서와 같이 확인하였고, 체외 결합 및 차단 활성이 우수한 모노클로날 하이브리도마 세포주 Ab-1을 선택하였으며, 그 결과를 표 2에 보였다.

실시예 4. 마우스 항 인간 스클레로스틴 항체의 인간화

우수한 체외 생물활성을 보이는 모노클로날 하이브리도마 세포주 Ab-1을 선택한 다음, 이 하이브리도마를 서열결정하고 나서, 인간화, 재조합체 발현 및 활성 평가를 더 수행하였다.

하이브리도마 서열결정 방법은 다음과 같이 수행하였다. 지수 성장기에 하이브리도마 세포를 수집한 다음, Trizol(Invitrogen 15596-018, 키트 지침에 따름), 중에서 RNA를 분리한 후, 지침대로 RNA 역 전사(PrimeScript™ 역 전사효소, Takara, cat # 2680A)를 수행하였다. 역 전사에 의해 수득된 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev.B 0503)가 사용되는 PCR에 의해 증폭하고 나서, 서열결정 회사에 의뢰하여 서열결정을 실시하였다. 수득된 DNA 서열에 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로서 보였다:

하이브리도마 세포로부터 수득된 중쇄 가변 영역:

하이브리도마 세포로부터 수득된 경쇄 가변 영역:

마우스 항 인간 SOST 모노클로날 항체의 인간화 방법은 당 업계의 다수의 문헌에 개시된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 모 항체(마우스 항체)의 불변 영역 도메인을 인간 불변 영역 도메인으로 바꾼 다음, 마우스 항체와 인간 항체 사이의 상동성에 따라서 인간 항체 생식계열을 선택하였다. 본 발명에서 우수한 활성을 보이는 후보 분자를 인간화하였는데, 그 결과들은 하기와 같았다.

1. 마우스 항 스클레로스틴 항체의 CDR 영역

VH/VL CDR의 아미노산 잔기들을 동정한 다음, 캐벗 번호 매김 체계에 의해 주석을 달았다.

본 발명에 있어서 마우스 Ab-1의 CDR 서열을 표 3에 기술하였다:

2. 인간 생식계열 FR 영역 서열의 선택

마우스 항체의 VH/VL CDR의 통상적 구조를 바탕으로 하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 항체 생식계열 데이터베이스와 비교하였는데, 이때 고 상동성을 보이는 인간 생식계열 주형을 선택하였다. 인간 생식계열 경쇄의 골격 영역은 인간 카파 경쇄 유전자로부터 유래하였고, 본 발명에서는 바람직하게 인간 생식계열 경쇄 주형의 IGKV1-39*01 또는 IGKV4-1*01을 선택하였다. 인간 생식계열 중쇄의 골격 영역은 인간 중쇄로부터 유래하였고, 본 발명에서는 바람직하게 인간 생식계열 중쇄 주형의 IGHV1-18*01을 선택하였다. 마우스 항체 Ab-1의 CDR 영역을, 인간화된 가변 영역을 대체하도록 선택된 인간화 주형에 이식한 다음, IgG 불변 영역과 재조합하였다. 마우스 항체의 3차원 구조를 바탕으로, 구속 잔기(entrapped residue), CDR 영역과 직접적인 상호작용을 하는 잔기, 그리고 VL 및 VH의 형태에 중요한 영향을 미치는 잔기에 역 돌연변이를 일으켜, 화학적 불안정성을 보이는 CDR 영역 중 잔기들을 최적화하여(신규 중쇄 CDR2 서열 DIDPNDGDILYNQKFRD(서열 번호 13)를 수득하기 위해 중쇄 CDR2를 최적화하여), 인간화된 최종 분자를 수득하였다. 인간화된 최종 분자의 중쇄 가변 영역 서열을 서열 번호 14 ~ 16에 보였고, 이 서열들은 서열 번호 20 ~ 22의 중쇄 불변 영역 중 임의의 것과 합하여질 수 있었다. 인간화된 최종 분자의 경쇄 가변 영역 서열을 서열 번호 17 ~ 19에 보였으며, 이 서열들은 서열 번호 23의 경쇄 불변 영역 서열들과 각각 합하여질 수 있었다.

1. 중쇄 가변 영역:

Ab-5의 중쇄 가변 영역:

Ab-9의 중쇄 가변 영역:

Ab-10의 중쇄 가변 영역:

2. 각각의 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 서열들 중 임의의 하나일 수 있었다:

인간 IgG4의 중쇄 불변 영역(K 아미노산 잔기는 삭제):

인간 IgG4의 중쇄 불변 영역:

인간 IgG2의 중쇄 불변 영역:

3. 경쇄 가변 영역:

Ab-5의 경쇄 가변 영역:

Ab-9의 경쇄 가변 영역:

Ab-10의 경쇄 가변 영역:

4. 인간 κ 사슬로부터 유래하는 경쇄 불변 영역:

유전자 클로닝 및 재조합체 발현에 의해 항체들을 클로닝한 다음, 발현 및 정제하고 나서, 결합 ELISA 분석(시험 실시예 1 및 시험 실시예 3), 항원과 수용체 간 결합의 차단 분석(시험 실시예 2), Biacore(시험 실시예 4), 세포 활성 검출(시험 실시예 5) 등에 의해 검출한 다음, 마지막으로 최고의 활성을 보이는 인간화된 항체 Ab-5, Ab-9, Ab-10을 선택하였고, 그 서열을 하기와 같이 보였다:

인간화된 항체 Ab-10:

중쇄:

경쇄:

인간화된 항체 Ab-9:

중쇄:

경쇄:

인간화된 항체 Ab-5:

중쇄:

경쇄:

본 발명에 있어서 인간화된 항 인간 SOST 항체와 인간 스클레로스틴(h-SOST-Flag) 사이의 결합 활성 데이터를 표 4에 보였다.

시험 실시예 :

체외 생물활성 평가

시험 실시예 1: 결합 ELISA 분석

스클레로스틴 항체는 세포막 상 스클레로스틴의 수용체와 스클레로스틴의 결합을 차단하여, 스클레로스틴의 하류 신호전달 경로도 차단한다. ELISA 실험을 이용하여, 스클레로스틴 항체의 결합 특성을 확인하였다. Flag 태그를 가지는 스클레로스틴(h-SOST-FLAG, 서열 번호 2의 서열에 의해 암호화됨)을 바이오틴 표지화 키트(Dojido Chem, LK03)로 바이오틴화하고 나서, 스트렙타비딘이 코팅된 96 웰 EIA/RIA 평판과의 결합을 통해 이 평판 상에 고정하였다. 여기에 항체를 첨가한 후, 신호 강도를 이용하여, 항체와 인간 스클레로스틴 사이의 결합 활성을 측정하였다.

스트렙타비딘(Sigma, S4762-5MG)을 PBS 완충액(pH 7.4)(Sigma, P4417-100TAB)으로 농도 5 ㎍/㎖로 희석하고 나서, 이 희석액을 96 웰 EIA/RIA 평판(Corning,CLS3590-100EA)에 웰 당 부피 50 ㎕로 첨가한 다음, 이 평판을 항온처리기에서 항온처리하였다(37℃, 2시간). 액체를 폐기하고 나서, PBS 중 5% 탈지유(Guangming 탈지유)를 함유하는 차단 용액 200 ㎕(웰 당)로 평판을 차단한 후, 37℃에서 2.5 시간 동안 또는 4℃에서 밤새도록(16 시간 ~ 18 시간) 항온 처리기 내에서 항온처리하였다. 차단 후, 차단 용액을 폐기하고 나서, 평판을 PBST 완충액(0.05% tween-20 함유 PBS(pH 7.4))으로 5회 세정하였다. 바이오틴화된 SOST-FLAG 단백질(R&D SYSTEM, 1505-LR-025)을 시료 희석 완충액(1% BSA 함유 PBS(pH 7.4))으로 희석하여 0.5 ㎍/㎖로 만들고 나서, 각각의 웰에, 웰 당 50 ㎕로 첨가한 다음, 평판을 37℃에서 2 시간 동안 항온처리기 내에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 평판 중 반응 용액을 폐기한 다음, 이 평판을 PBST로 6회 세정하고 나서, 시료 희석 완충액으로 구배 희석된 항체를 웰 당 50 ㎕ 첨가한 후, 평판을 37℃에서 2 시간 동안 항온처리기 내에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 평판을 PBST로 6회 세정한 다음, 여기에 HRP-표지화된 염소 항 마우스 2차 항체(Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003) 또는 HRP-표지화된 염소 항 인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003)(시료 희석에서 희석됨)를 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 나서, 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 평판을 PBST로 6회 세정한 후, TMB 기질(KPL, Cat No. 52-00-03)을 각각의 웰에 웰 당 50 ㎕씩 첨가한 다음, 실온에서 10분 ~ 15분 동안 항온처리하였으며, 각각의 웰에 1M H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450 ㎚에서의 OD 값을 NOVOStar 미세 평판 판독기 상에서 판독한 다음, 본 발명의 스클레로스틴 항체와 인간 스클레로스틴 사이의 결합에 관한 EC50 값을 산정하여, 그 결과를 표 4에 보였다.

결과들은, 본 발명에서 인간화된 항 인간 SOST 항체가 자체의 모 항체 결합 활성과 동일한 결합 활성을 유지함을 보여주었다.

시험 실시예 2: LRP -6과 스클레로스틴의 결합을 차단하는 항 SOST 항체의 분석

스클레로스틴은, 세포막 상 wnt/β-카테닌 신호 경로의 보조 수용체 LRP5/LRP-6과의 결합을 통해 wnt/β-카테닌 신호전달 경로의 활성을 억제하여 골 형성을 차단할 수 있다. 본 실험에서, 스크리닝된 항 인간 SOST 항체가 인간 SOST/원숭이 SOST와 인간 LRP-6 사이의 결합을 차단하는 활성을, 체외 차단 분석을 이용하여 검출하였다. 양성 대조군은 로모소주맙이었다(제조 방법은 참고문헌(WHO Drug Information, Vol. 25, No. 4, 2011, 413-465, P434)을 참고로 기술된 바와 같음).

본 방법은, 염소 항 인간 Fc 항체를 96 웰 EIA/RIA 평판 상에 코팅한 다음, 항온처리를 위해 여기에 LRP-6-Fc 융합 단백질을 첨가하는 것이다. 바이오틴화된 스클레로스틴 단백질과 항 스클레로스틴 항체를 함께 항온처리한 다음, 항온처리를 위해 평판에 첨가하였다. 평판을 세정한 후, 바이오틴화된 스클레로스틴과 LRP-6 사이의 결합량을 측정하였으며, 스클레로스틴 항체의 차단 활성에 대한 IC50 값을 산정하였다.

염소 항 인간 Fc 항체를, PBS 완충액(pH 7.4)(Sigma, P4417-100TAB)으로 농도 1 ㎍/㎖로 희석하고 나서, 웰당 100 ㎕의 부피로 96 웰 EIA/RIA 평판에 참가한 다음, 평판을 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 액체를 폐기한 후, 평판을 웰 당 200 ㎕ 차단 용액(PBS 중 5% 탈지유(Guangming 탈지유) 함유)으로 차단한 다음, 37℃에서 2.5 시간 동안 항온처리하였다. 차단 후, 차단 용액을 폐기하고 나서, 평판을 PBST 완충액(0.05% tween-20 함유 PBS(pH 7.4))으로 5회 세정하였다. LPR-6-Fc 융합 단백질(R&D SYSTEM, 1505-LRP-025)을 시료 희석 완충액(1% BSA 함유 PBS(pH 7.4))으로 희석하여 1 ㎍/㎖로 만든 후, 웰 당 50 ㎕씩 첨가한 다음, 평판을 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 바이오틴 표지화 키트(Dojido Chemical, LK03)를 사용하여 농도 1.12 ㎍/㎖의 인간 스클레로스틴 단백질(R&D SYSTEM, 1406-ST/CF)을 표지화한 다음, 웰 당 30 ㎕의 부피로 희석 평판에 첨가하고 나서, 각각의 웰에 시험 스클레로스틴 항체(적당한 농도로 희석됨)를 웰당 30 ㎕씩 첨가한 후, 평판을 혼합하여 37℃에서 2 시간 동안 항온처리기 내에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 평판 중 반응 용액을 폐기하였다. 평판을 PBST로 6회 세정한 후, 희석 평판 중 항원 및 항체 혼합물을 이 평판에 첨가한 다음, 4℃에서 밤새도록(16 시간 ~ 18 시간) 항온처리하였다. 평판 중 용액을 폐기하고 나서, 이 평판을 PBST로 6회 세정한 후, 각각의 웰에 웰 당 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 중합체(Sigma, S2438-250UG)(시료 희석 완충액으로 1:600의 비율로 희석됨) 50 ㎕씩을 첨가하였으며, 이후 평판을 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 평판을 PBST로 6회 세정한 후, 각각의 웰에 TMB 기질(KPL, Cat No. 52-00-03)을 웰 당 50 ㎕씩 첨가한 다음, 실온에서 3 분 ~ 10 분 동안 항온처리하였고, 각각의 웰에 1M H₂SO₄ 50 ㎕씩을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450 ㎚에서의 OD 값을 NOVOStar 미세 평판 판독기 상에서 판독한 다음, 스클레로스틴 항체가, 인간 스클레로스틴 및 LRP-6 사이의 결합을 차단할 때의 IC50 값을 산정하여, 그 결과를 표 5에 보였다.

상기 방법은 본 발명에서 원숭이 스클레로스틴(서열 번호 4의 서열에 의해 암호화 및 발현된 후 정제된 것) 및 LRP-6 사이의 결합을 차단하기 위한, 스클레로스틴의 IC50 값을 측정하는 데에 사용될 수 있었고, 그 결과를 표 5에 보였다.

결과들은, 본 발명에서 인간화된 항 인간 SOST 항체가 인간/원숭이 스클레로스틴과 LRP-6 사이의 결합을 차단하는 차단 활성이, 양성 항체인 로모소주맙의 차단 활성과 거의 동일함을 보여주었다.

시험 실시예 3: Biacore 측정

Biacore(GE)를 사용하여, 인간화된 항 SOST 항체와 인간, 원숭이, 마우스 SOST의 친화성을 측정하였다.

상당량의 시험 항체의 친화성 포획을 위해, 항 인간 포획 항체를 인간 항체 포획 키트(GE, Cat.# BR-1008-39)의 지침에 기술된 방법에 따라서 Biacore 장치(Biacore X100, GE)의 CM5 바이오센서 칩(Cat. # BR-1000 -12, GE)에 공유 결합시켰다. 그 다음, SOST 항원(인간 SOST, R&D SYSTEM, Cat.#1406-ST-025/CF, R&D; 원숭이 SOST, cyno-SOST-Flag(정제에 의해 수득된 것으로서, 실시예 1의 서열 번호 4에 의해 암호화된 것); 마우스 SOST, m-SOST-Flag(정제에 의해 수득된 것으로서, 실시예 1의 서열 번호 3에 의해 암호화된 것)에 농도 구배를 걸어주어 바이오칩 표면을 흘러가게 하였다. Biacore 장치(GE, BiacoreX100)를 사용하여 반응 신호를 실시간으로 검출하여, 결합 및 해리 곡선들을 작성하였다. 실험에서 해리의 각 주기를 마친 후에는, 인간 항체 포획 키트 내 바이오칩을 재생 용액으로 세정 및 재생하였다. 본 실험들에서 사용된 아미노 커플링된 키트를 GE(Cat. # BR-1000-50, GE)로부터 구입하였으며, 이때 완충액은 HBS-EP + 10× 완충 용액(Cat. # BR-1006-69, GE)이었고, 탈이온수로 완충액을 1×(pH 7.4) 희석하였다.

이로부터 구하여진 데이터를 GE BIAevaluation 4.1 버전 소프트웨어(1:1 Langmuir 모델 적용)로 피팅(fitting)하여, 친화성 값을 구한 다음, 그 결과들을 표 6에 보였다.

본 발명에서, 인간화된 항체 Ab-5는 인간 SOST 및 원숭이 SOST와의 친화성이 컸고, 이러한 친화성은 양성 분자와 비교되었을 때 10배 초과하여 컸다.

시험 실시예 4: 항 스클레로스틴 항체의 세포에 대한 활성 시험

본 연구에서, 본 발명의 SOST 항체의 세포에 대한 체외 활성은 세포 내 알칼리성 포스파타아제(ALP)의 활성을 검출함으로써 EC50 값에 따라 평가하였다.

C2C12 세포(Chinese Academy of Sciences, 세포 은행, Catalog # GNM26)를, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 중에서 배양한 다음, 1:5 또는 1:10의 비율로 1주일에 2회 내지 3회 계대 배양하였다. 계대 배양 중 배양 배지를 폐기한 다음, 0.25% 트립신 5 ㎖를 사용하여 세포 층을 세정한 후, 트립신을 제거하였다. 세포를 항온처리기 내에서 3 분 ~ 5 분 동안 분해한 다음, 신선한 배지 중에 재현탁하였다. 세포 현탁액 100 ㎕를 5×10⁴ 세포/㎖의 밀도로 96 웰 세포 배양 평판에 첨가하였는데, 이때 배지는 10% FBS를 함유하는 DMEM였고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 100 ㎕만을 96 웰 편판 외측에 첨가하였다. 그 다음, 배양 평판들을 항온처리기 내에서 24 시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO₂). 일단 세포 부착이 관찰되면, 배지를 폐기하였고; 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 70 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 최종 농도 100 ng/㎖의 wnt3a(R&D, Catalog #5036-WN-010) 10 ㎕와, 최종 농도 5 ㎍/㎖의 SOST(R&D，Catalog # 1406-ST-025) 10 ㎕를 각각의 웰에 각각 첨가하였다. 시험 시료들을 PBS로 희석하여 상이한 농도 구배를 형성하고, 상이한 농도의 시험 시료 10 ㎕를 배양 평판에 첨가하였다. 그 다음, 배양 평판을 항온처리기 내에서 3일 동안 항온처리하였다(37℃, 5% CO₂). 배지를 폐기한 다음, 각각의 웰에 ALP 기질 150 ㎕를 첨가한 후, 배양 평판을 항온처리기 내에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 파장 450 ㎚에서의 OD 값을 미세 평판 판독기(PerkinElmer, Catalog# VICTOR³) 상에서 판독한 후, EC50 값을 산정하였으며, 그 결과를 표 7에 보였다.

결과들은, 세포에 작용하는 본 발명의 인간화된 SOST 항체 Ab-5의 활성이 양성 항체인 로모소주맙의 활성과 거의 동일함을 보여주었다.

약동학적 평가

시험 실시예 5: 사이노몰거스 원숭이에 있어서, 인간화된 항 SOST 항체의 T1/2 평가

본 실험에 사용된 사이노몰거스 원숭이 3마리는 체중 4 ㎏ 미만의 4 ~ 5세 암컷으로서, Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd로부터 구입하였다. 사육 환경: 보통의 방. 사이노콜거스 원숭이를 구입한 후, 각각의 원숭이들을 별도의 우리에 넣어두고, 원숭이들에게 물과 먹이를 임의 공급 접근 방식으로 공급하였다. 실험실 환경 적응을 위한 기간은 14일 미만으로 하였고, 이때 명기/암기는 12시간/12시간으로 조절하였으며, 온도는 23℃ ~ 29℃였고, 상대 습도는 40% ~ 70%였다. 사이노몰거스 원숭이 3마리에 번호를 매긴 다음, 실험을 시작하였다. 실험 당일, 각각의 사이노몰거스 원숭이에게 시험 약물 또는 양성 분자를 피하 주사하였다(30 ㎎/㎏, 1회 투여 당 8 ㎖/원숭이).

원숭이를 몽키 의자(monkey chair)에 고정한 다음, 팔꿈치 정맥이나 복재 정맥으로부터 채혈을 실시하여(혈액 시료 채취당 약 1.5 ㎖씩 채혈) 혈청을 수득하였고, 이를 -20℃에 보존하여 두었다. 혈액 시료 채취 시점은 다음과 같았다: 투여 12 시간 전, 투여 당일(제1일) 투여 1 시간 후, 2 시간 후, 4 시간 후, 8 시간 후, 12 시간 후, 24 시간 후(즉, 제2일), 제3일, 제5일, 제7일, 제14일, 제21일 및 제28일. 혈액 시료를 수집한 후, 약물의 혈청중 농도를 ELISA로 측정한 다음, PK 분석을 수행하였으며, 그 결과들을 표 8에 보였다.

상기 결과들은, 인간화된 후보 분자(Ab-5)가 사이노몰거스 원숭이 내 체내 반감기가 더 길다는 것(양성 분자 로모소주맙 반감기의 약 2배)을 보여주었다.

체내 생물 활성의 평가

시험 실시예 6: 사이노몰거스 원숭이 내 인간화된 항 SOST 항체의 체내 효능 평가

실험에 사용된 사이노몰거스 원숭이 3마리는 4 ㎏ 미만의 암컷 4세~5세 개체들이었으며, Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd.로부터 구입하였다. 사육 환경: 보통의 방. 사이노몰거스 원숭이를 구입한 후, 각각의 원숭이들을 별도의 우리에 넣어두고, 원숭이들에게 물과 먹이를 임의 공급 접근 방식으로 공급하였다. 실험실 환경 적응을 위한 기간은 14일 미만으로 하였고, 이때 명기/암기는 12시간/12시간으로 조절하였으며, 온도는 23℃ ~ 29℃였고, 상대 습도는 40% ~ 70%였다. 사이노몰거스 원숭이 3마리에 번호를 매긴 다음, 실험을 시작하였는데, 이후 혈청과 혈장을 수득하기 위해 마취 후 채혈을 하였으며, 요추 및 원위 요골의 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량을 실험한 후 이로부터 얻어진 값을 기본 값으로 사용하였다. 각각의 사이노몰거스 원숭이에게 시험 약물(상이한 용량, 즉 10 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏)및 양성 분자(30 ㎎/㎏)를 피하 주사하였다(1회 투여 당 8 ㎖/원숭이). 약물들은 한달에 한번 총 22회 투여하였다. 실험 동안, 투여 후 4주차 및 8주차에 동물들을 대상으로 요추 및 원위 요골의 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량 각각에 대해 실험하였다.

실험 2개월 후 모든 동물을 (과량의 펜토바비탈 나트륨으로) 마취시킨 다음 안락사시켰다. 그 다음, 2번 내지 5번 요추 및 원위 요골의 골 무기질 밀도와 골 무기질 함량을 테스트하였다.

그 결과들을 표 9, 도 1 및 도 2에 보였다.

결과들은, 본 발명에 있어서 인간화된 항 SOST 항체의 체내 효능은 사이노몰거스 원숭이에서 용량 의존적이었음을 보였다. 10 ㎎/㎏의 인간화된 항 SOST 항체 Ab-5의 효능은 30 ㎎/㎏의 양성 분자의 효능과 동일하였다(도 2). 이는, 본 발명에 있어서 인간화된 항 SOST 항체의 원숭이 내 효능이, 양성 분자인 로모소주맙의 원숭이 내 효능보다 약 3배 크다는 것을 의미한다. 동일 용량이 투여되었을 때, 인간화된 항체의 AUC _0-t(㎎/㎖*일)는 22.3이었는데, 이는 양성 항체인 로모소주맙 AUC _0-t(㎎/㎖*일)(9.95)의 2배를 초과하는 수준이다(도 1 참조).

용해도 실험

시험 실시예 7: 인간화된 항 SOST 항체의 용해도

인간화된 항 SOST 항체의 용해도를 확인하기 위해, 항체 Ab-5 및 양성 항체인 로모소주맙을 대상으로, 이것들의 농도를 점진적으로 증가시키면서 가용성 항체의 단량체 함량, 침전 여부, 그리고 중합체 함량 확인을 수행하였다. 시험에서, PBS 완충액(pH 7.4)에 용해된 항체의 출발 농도는 10 ㎎/㎖였다. 시료들을 한외여과 농축기(Millipore, Amicon Ultra-15 50K)에서 원심분리하였다(4℃, 4000 rpm). 원심분리 동안, 시료들을 5 분 ~ 10 분 간격으로 취하면서, 항체 농도가 30 ㎎/㎖ 및 90 ㎎/㎖가 될 때까지 항체 농도를 확인하였다. 상이한 농도 조건의 시료들을 취하여, 이를 대상으로 각각 SEC-HPLC 분석을 수행하였고, 그 결과들을 표 10에 보였다.

상기 결과들은, 본 발명의 항체 농도가 90 ㎎/㎖에 이를 때까지 시료는 침전이 일어나지 않은 채 여전히 투명하였고, 항체 단량체의 양도 바뀌지 않았음을 보였다. 그러나, 동일 농도의 양성 분자는 덩어리져 침전되었고, 이때 항체 단량체의 양은 95.8%에서 92%로 감소하였다.

안정성 평가

시험 실시예 8: 인간화된 항 SOST 항체의 안정성

본 발명의 인간화된 항 SOST 항체의 안정성을 시험하기 위해, 항체 Ab-5와 양성 항체인 로모소주맙을 pH 7.4의 PBS 완충액 중에 7일 동안 넣어 두었다(4℃). 안정성 확인을 위해서 2개의 방법이 사용되었는데; 하나의 방법은, 나안으로 확인 가능한 불용성 침전물이 생성된 양을 평가하는 것으로서, 항체를 완충액에 넣기 전과 넣은 후 불용성 침전물 농도 변화를 산정하는 방법이고; 다른 하나의 방법은, 시료 중 가용성 항체 단량체의 함량 변화를 SEC-HPLC에 의해 시험하는 것이다. 초기 항체 농도는 30 ㎎/㎖이었는데, 이는 양성 항체가 도달할 수 있었던 최고의 가용 농도(soluble concentration)였다. 결과들을 표 11에 보였다.

상기 결과들은, 양성 항체가 달성 가능한 농도(30 ㎎/㎖)에 이르기 시작할 때 침전되지 않았더라도, 이 양성 항체를 완충액에 넣고 나서 7일 경과 후 양성 항체 19.3%가 침전되었고, 이때 상기 양성 항체 단량체 양의 감소가 관찰되었음을 보여주었다. 이와는 반대로, 본 발명의 항체는 침전이 전혀 일어나지 않고 매우 안정적이었고, 그 용액도 투명하였다.

용해도 및 안정성 결과들을 고려하였을 때, 본 발명의 항체는 항체 제제의 관점에서 양성 항체보다 더욱 우수한 성능을 가진다. 이는, 고 농도(예를 들어 90 ㎎/㎖)일 때에도 달성될 수 있어서, 여전히 안정적이라고 볼 수 있다.

<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD. <120> ANTI-SCLEROSTIN ANTIBODY, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT AND MEDICAL USE THEREOF <130> <160> 29 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 657 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding human sclerostin with Histag (His-h-SOST) <400> 1 atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc 60 aggtgccatc atcaccacca tcatcagggc tggcaggcct tcaagaacga cgcaaccgag 120 attatccccg aactgggcga atatcccgag ccccctccag agctggagaa taacaagacc 180 atgaacaggg ccgagaacgg cggcagaccc ccccatcatc ccttcgagac taaagacgtg 240 agcgagtaca gctgcaggga gctgcatttc accaggtacg tgaccgatgg cccctgtagg 300 agcgccaagc ccgtgactga actggtgtgc agcggccagt gcggtccggc cagactgctg 360 ccgaacgcta tcggcagggg caagtggtgg aggccctctg gacccgactt caggtgcata 420 cccgacaggt accgcgctca gagagtgcaa ctgttgtgtc ctgggggcga ggctccgagg 480 gcgcgaaagg tgaggctggt ggccagttgt aagtgcaaga ggctgaccag gttccacaac 540 cagagcgagc tgaaggactt cggcaccgaa gcagccaggc cgcagaaggg caggaagccc 600 aggccacgag cacgatccgc caaagccaat caggcagagc tcgagaatgc ctactga 657 <210> 2 <211> 663 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding human sclerostin with Flagtag (h-SOST-Flag) <400> 2 atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc 60 aggtgccagg gctggcaggc cttcaagaac gacgcaaccg agattatccc cgaactgggc 120 gaatatcccg agccccctcc agagctggag aataacaaga ccatgaacag ggccgagaac 180 ggcggcagac ccccccatca tcccttcgag actaaagacg tgagcgagta cagctgcagg 240 gagctgcatt tcaccaggta cgtgaccgat ggcccctgta ggagcgccaa gcccgtgact 300 gaactggtgt gcagcggcca gtgcggtccg gccagactgc tgccgaacgc tatcggcagg 360 ggcaagtggt ggaggccctc tggacccgac ttcaggtgca tacccgacag gtaccgcgct 420 cagagagtgc aactgttgtg tcctgggggc gaggctccga gggcgcgaaa ggtgaggctg 480 gtggccagtt gtaagtgcaa gaggctgacc aggttccaca accagagcga gctgaaggac 540 ttcggcaccg aagcagccag gccgcagaag ggcaggaagc ccaggccacg agcacgatcc 600 gccaaagcca atcaggcaga gctcgagaat gcctacgact acaaggatga cgacgacaag 660 tga 663 <210> 3 <211> 657 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding mouse sclerostin with Flagtag (m-SOST-Flag) <400> 3 atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc 60 aggtgccagg gctggcaggc cttcaggaac gacgcaaccg aggtgatccc cggactgggc 120 gaatatcccg agccccctcc agagaataac cagaccatga acagggccga gaacggcggc 180 agaccccccc atcatcccta cgacgctaaa ggcgtgagcg agtacagctg cagggagctg 240 cattacacca ggttcctgac cgatggcccc tgtaggagcg ccaagcccgt gactgaactg 300 gtgtgcagcg gccagtgcgg tccggccaga ctgctgccga acgctatcgg cagggtcaag 360 tggtggaggc ccaacggacc cgacttcagg tgcatacccg acaggtaccg cgctcagaga 420 gtgcaactgt tgtgtcctgg gggcgccgct ccgaggagcc gaaaggtgag gctggtggcc 480 agttgtaagt gcaagaggct gaccaggttc cacaaccaga gcgagctgaa ggacttcggc 540 cccgaaacag ccaggccgca gaagggcagg aagcccaggc caggagcacg aggagccaaa 600 gccaatcagg cagagctcga gaatgcctac gactacaagg atgacgacga caagtga 657 <210> 4 <211> 663 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding cyno sclerostin with Flagtag(cyno-SOST-Flag) <400> 4 atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc 60 aggtgccagg gctggcaggc cttcaagaac gacgcaaccg agattatccc cgaactgggc 120 gaatatcccg agccccctcc agagctggag aataacaaga ccatgaacag ggccgagaac 180 ggcggcagac ccccccatca tcccttcgag actaaagacg tgagcgagta cagctgcagg 240 gagctgcatt tcaccaggta cgtgaccgat ggccagtgta ggagcgccaa gcccgtgact 300 gaactggtgt gcagcggcca gtgcggtccg gccagactgc tgccgaacgc tatcggcagg 360 ggcaagtggt ggaggccctc tggacccgac ttcaggtgca tacccgacag gtaccgcgct 420 cagagagtgc aactgttgtg tcctgggggc gccgctccga gggcgcgaaa ggtgaggctg 480 gtggccagtt gtaagtgcaa gaggctgacc aggttccaca accagagcga gctgaaggac 540 ttcggccccg aagcagccag gccgcagaag ggcaggaagc ccaggccacg agcacgagga 600 gccaaagcca atcaggcaga gctcgagaat gcctacgact acaaggatga cgacgacaag 660 tga 663 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> murine <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Pro Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Ser Ser 115 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Murine <400> 6 Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Leu Leu Phe Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 7 Asp Tyr Asn Leu Asp 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 8 Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <400> 9 Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Murine <400> 10 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 11 Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 12 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val Thr 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HCDR2 Mutant <400> 13 Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 14 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of Ab-5 <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of Ab-9 <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of Ab-10 <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of Ab-5 <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of Ab-9 <400> 18 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of Ab-10 <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 21 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 22 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 24 <211> 447 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Humanized antibody heavy chain of Ab-10 <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 25 <211> 444 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Humanized antibody heavy chain of Ab-9 <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 26 <211> 443 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Humanized antibody heavy chain of Ab-5 <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 27 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Humanized antibody light chain of Ab-10 <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 28 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Humanized antibody light chain of Ab-9 <400> 28 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Humanized antibody light chain of Ab-5 <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (28)

1. 하기 서열들이나 이의 돌연변이체 서열, 또는 하기 서열들과의 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 적어도 하나를 포함하고, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
   중쇄 가변 영역 HCDR 서열: 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9; 및
   경쇄 가변 영역 LCDR 서열: 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12.
2. 제1항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열들, 즉 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9, 또는 이의 돌연변이체 서열로부터 선택되는 HCDR 영역 서열 적어도 하나를 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 제1항에 있어서, 항체의 경쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열들, 즉 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12, 또는 이의 돌연변이체 서열로부터 선택되는 LCDR 영역 적어도 하나를 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 제1항에 있어서, 항체는 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9, 또는 이의 돌연변이체 서열인 HCDR 영역 서열과, 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12, 또는 이의 돌연변이체 서열인 LCDR 영역 서열을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 제1항에 있어서, CDR 영역의 돌연변이체 서열은 항체 활성을 최적화하는 아미노산 돌연변이 1개 내지 3개를 가지고, HCDR2 영역의 돌연변이체 서열은 바람직하게 서열 번호 13의 서열인, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 항체 또는 이의 단편인, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 제6항에 있어서, 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 5의 서열과 같거나 또는 서열 번호 5의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열인, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 제6항에 있어서, 마우스 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 6의 서열과 같거나 또는 서열 번호 6의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열인, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 5에 보이고, 마우스 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 6인, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
10. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 인간화된 항체 또는 이것들의 단편인, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 제10항에 있어서, 인간화된 항체는 인간 생식계열 중쇄 IGHV1-18*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 골격 영역 서열 또는 이의 돌연변이체 서열을 포함하고, 바람직하게 돌연변이체 서열은 0개 내지 10개의 아미노산 역 돌연변이(들)를 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. 제11항에 있어서, 인간화된 항체는 서열 번호 14~16의 서열과 같거나 또는 이의 돌연변이체 서열, 또는 이 서열 번호 14~16의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 제10항에 있어서, 인간화된 항체는 인간 생식계열 경쇄 IGKV1-39*01 또는 IGKV4-1*01 중 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 골격 영역 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함하고, 바람직하게 돌연변이체 서열은 0개 내지 10개의 아미노산 역 돌연변이(들)를 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. 제13항에 있어서, 인간화된 항체는 서열 번호 17~19의 서열들, 또는 이의 돌연변이체 서열, 또는 이 서열 번호 17~19의 서열들과의 동일성이 적어도 95%인 서열로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 제10항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간화된 항체는 서열 번호 14~16의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열과, 서열 번호 17~19의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
16. 제15항에 있어서,
    (a) 서열 번호 14의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 17의 경쇄 가변 영역 서열;
    (b) 서열 번호 15의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 18의 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (c) 서열 번호 16의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 19의 경쇄 가변 영역 서열
    중 임의의 하나로부터 선택되는, 중쇄 가변 영역 서열과 경쇄 가변 영역 서열의 조합을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
17. 제10항에 있어서, 인간화된 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2 또는 이의 변이체, 인간 IgG3 또는 이의 변이체, 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래하는 불변 영역, 바람직하게는 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래하는 불변 영역, 가장 바람직하게는 인간 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래하는 불변 영역을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
18. 제17항에 있어서, 서열 번호 24~26의 서열들, 또는 이 서열 번호 24~26의 서열들과의 동일성이 적어도 90%인 서열들로부터 선택되는 전장 중쇄 서열을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
19. 제10항에 있어서, 인간화된 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 κ 또는 λ 사슬, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 불변 영역을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
20. 제19항에 있어서, 서열 번호 27~29의 서열들, 또는 이 서열 번호 27~29의 서열들과의 동일성이 적어도 90%인 서열들로부터 선택되는 전장 경쇄 서열을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
21. 제10항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 24~26의 서열들로부터 선택되는 전장 중쇄 서열과, 서열 번호 27~29의 서열들로부터 선택되는 전장 경쇄 서열을 포함하는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
22. 제21항에 있어서, 인간화된 항체는 전장 경쇄 서열 및 전장 중쇄 서열의 하기의 조합들, 즉
    Ab-10: 서열 번호 24의 중쇄 서열 및 서열 번호 27의 경쇄 서열;
    Ab-9: 서열 번호 25의 중쇄 서열 및 서열 번호 28의 경쇄 서열; 또는
    Ab-5: 서열 번호 26의 중쇄 서열 및 서열 번호 29의 경쇄 서열
    중 임의의 하나로부터 선택되는, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 의한, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 DNA 분자.
24. 제23항에 의한 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
25. 제24항에 의한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포로서, 바람직하게 포유동물 세포로부터 선택되고, 더욱 바람직하게 CHO 세포인 숙주 세포.
26. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
27. 골 량, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량 또는 골 강도 중 적어도 하나를 증가시키기 위한 의약품 제조에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 의한, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제26항에 의한 약학 조성물의 용도.
28. SOST 매개 골 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약품 제조에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 의한, 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제26항에 의한 약학 조성물의 용도로서, 상기 질환 또는 장애는 골다공증, 골 감소증, 골 관절염, 류머티즘성 관절염, 치주질환, 다발성 골수종 질환 또는 장애로부터 선택되고; 바람직하게는 골다공증인 용도.

Images