CN108101984B - 骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途 - Google Patents

骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途，本发明专利制备方法如下：提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA，用RT‑PCR方法扩增抗体轻链可变区基因和重链可变区基因通过重叠延伸拼接PCR方法，在VL和VH基因之间引入Linker3，连接成单链抗体SOST‑scFv。将测序正确的scFv基因克隆至表达载体PET‑22b(+)后转入E.coliBL21进行可溶性表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS‑PAGE鉴定表达产物，ELISA和West‑blot检测表达蛋白的反应活性。本发明专利具有分子量小、渗透性高、抗原结合活性高、显著的促进骨生成抑制骨流失的优点。

Description

骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途
技术领域
本发明专利属于骨硬化蛋白单链抗体，主要用于骨质疏松和骨质疏松相关骨折的治疗。
背景技术
骨质疏松是以低骨量、骨组织显微结构退化为特点的骨骼系统紊乱，可引起骨脆性和骨折风险增加。目前，骨质疏松已成为一种世界性老年慢性常见病，且骨质疏松相关骨折治疗困难。骨质疏松在中国老年人中的平均患病率约为15.7％，随着年龄的增加患病率还会逐渐上升，2013年底，60岁以上的老年人预计可达2.0243亿，中国需要为骨质疏松承担巨大的财政负担，骨质疏松相关骨折在女性和男性中的发病风险分别是40％、13％。骨质疏松在年龄大于50岁的韩国女性和男性中的患病率分别是34.9％和7.8％，比美国所报道的骨质疏松患病率高3倍，但是，骨质疏松的诊断率只有24.7％，有3/4的骨质疏松病人不知道自己患有骨质疏松，只有10.8％的骨质疏松病人接受治疗，诊断和治疗现状尚不能使人满意。骨质疏松最主要的临床结果是骨折风险增加，骨质疏松所致骨折可产生剧痛、残疾甚至会造成死亡并且产生巨额的经济负担，欧盟27国对骨质疏松流行病学、治疗情况展开调查，结果显示共有女性骨质疏松患者2200万人、男性患者550万人；新发骨质疏松相关骨折350万例，相当于每天9556例新发骨折，造成经济损失370 亿欧元，骨质疏松骨折患者的人数还在不断增加，此次调查结果显示骨质疏松骨折会增加死亡率。巴西绝经后女性骨质疏松的患病率为15％-33％。2016年荷兰发表的一项调查显示，32％的骨折可诊断为骨质疏松骨折，男女患者的比例分别为21％、36％，女性中超过50％的髋骨骨折和脊柱骨折是由骨质疏松引起，到2030 年骨质疏松相关骨折预计增加40％。近年来，椎体成形术(PVP)被广泛应用于骨质疏松相关椎体骨折的治疗，椎体成形术虽安全、有效，但是，PVP后的一个月内很容易发生相邻椎体的压缩骨折。目前，普遍认为骨密度降低、高龄是PVP术后再骨折的主要原因，PVP术后再发椎体骨折是临床亟需解决的难题。Chen 等人研究192例椎体骨折患者，平均年龄74.4岁，行PVP并抗骨质疏松治疗，结果显示，PVP术后临近椎体压缩骨折不可避免，但是在接受抗骨质疏松治疗增加骨密度后可以减少临近未治疗椎体骨折发生率。有症状的脊柱骨折可以增加死亡率高达15％，部分患者因剧痛丧失活动可持续2-3个月，PVP用于急性脊柱骨折患者可减轻患者痛苦，如果骨质疏松的治疗对预防邻近椎体压缩骨折有效，将会降低PVP术后再发骨折风险，对骨质疏松相关脊柱骨折患者产生重大作用。年龄超过50岁之后，大约有1/3的女性和1/5的男性经历过骨质疏松骨折。
促进骨生成和抑制骨吸收是骨质疏松治疗的两种途径，抑制骨吸收虽能改善和维持骨强度，却无法使已经被吸收的骨再生成，通过促进骨生成来治疗骨质疏松，降低相关骨折的发生率，是最好的治疗方式。特立帕肽是最有效的预防非椎体新发骨折的药物，是目前唯一能促进骨生成治疗骨质疏松的药物，但特立帕肽的临床使用存在诸多限制：1.特立帕肽需要患者每天自己注射且需冷冻保存；2.美国限制特立帕肽使用不能超过2年，欧盟建议18-24个月；3.特立帕肽有增加骨肉瘤的风险；4.随着使用时间延长，特立帕肽会逐渐增加骨吸收的程度。目前，通过促进骨生成治疗骨质疏松的合成代谢类药物在临床的应用并不理想。一种人源化的骨硬化蛋白单克隆抗体(AMG785)应用于临床随机对照试验，被证实能有效增加绝经后妇女骨密度，然而骨硬化蛋白单克隆抗体存在分子质量过大、免疫原性强等缺点。
发明内容
本发明提供一种骨硬化蛋白单链抗体的氨基酸序列，SEQ-1
DHMLTQSASL VSAAVRSIVT INSQASQSVY KNNYLAWFQQ KPGQPPKRLI SSASTLASAV 60
SSGFNGSRSG TQITLIISDV QCDDAGTYYC LDSYVCSSAD CLAFGGGTEL EILSSGGGGS 120
GGGGGGSSRS SQSVEESGGR LVTPGTPLTL TCTASGFDIS RYAMVWVRQA PVKGLEWIAY 180
INPRNSPYYA TLAKGRFTIS RTSTTVDLII TSRTTQDMGT YCCGRSTGEL SGLGSLVTVF 240
S 241
本发明提供一种疗效更优、更安全、稳定性更强的骨硬化蛋白单链抗体.
本发明提供一种使用该单链抗体组合形成的药物组合物。
本发明提供一种含有所述的骨硬化蛋白单链抗体与多肽类药物形成药物组合物的方法。
本发明提供一种骨硬化蛋白单链抗体，其包含轻链可变区基因(VL)SEQ-2
GACCATATGC TGACCCAGAG TGCATCGCTC GTGTCTGCCG CTGTGCGAAG CATAGTCACC 60
ATCAATAGCC AGGCCAGTCA GAGTGTTTAT AAGAACAACT ACTTAGCCTG GTTTCAGCAG 120
AAACCAGGGC AGCCTCCCAA GCGCCTGATC TCATCTGCAT CGACTCTGGC TTCTGCGGTC 180
TCGTCGGGGT TCAACGGCAG TCGATCCGGG ACACAGATCA CTCTCATCAT CAGCGACGTG 240
CAGTGTGACG ATGCTGGCAC TTACTACTGT CTGGACAGTT ATGTTTGTAG TAGTGCTGAT 300
TGTCTTGCTT TCGGCGGAGG GACCGAGCTG GAGATCCTA 339
和重链可变区基因(VH)SEQ-3
CAGTCGGTGG AGGAGTCCGG GGGTCGCCTG GTCACGCCTG GGACACCCCT GACACTCACC 60
TGCACAGCCT CTGGATTCGA CATCAGTAGA TATGCAATGG TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA 120
GTGAAGGGGT TGGAATGGAT CGCATACATT AATCCTCGTA ATAGCCCATA CTACGCGACC 180
TTAGCAAAGG GCCGTTTCAC CATCTCCAGA ACCTCGACCA CGGTGGATCT GATAATCACC 240
AGTCGGACAA CCCAGGACAT GGGCACCTAT TGCTGTGGCA GAAGCACTGG TGAATTGTCG 300
GGCCTAGGCA GCCTGGTCAC CGTCTTCTCA 330
本发明提供一种骨硬化蛋白单链抗体
其包含重链可变区基因(VH)区域，它的互补决定区CDR具有选自氨基酸序列：SEQ-4
QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFDISR YAMVWVRQAP VKGLEWIAYI NPRNSPYYAT 60
LAKGRFTISR TSTTVDLIIT SRTTQDMGTY CCGRSTGELS GLGSLVTVFS 110
本发明提供一种骨硬化蛋白单链抗体，其包含轻链可变区基因(VL)区域，它的互补决定区CDR具有选自下组CDR的氨基酸序列：SEQ-5
DHMLTQSASL VSAAVRSIVT INSQASQSVY KNNYLAWFQQ KPGQPPKRLI SSASTLASAV 60
SSGFNGSRSG TQITLIISDV QCDDAGTYYC LDSYVCSSAD CLAFGGGTEL EIL 113
本发明提供一种骨硬化蛋白单链抗体，其包含轻链可变区基因(VL)区域，
轻链可变区上游引物VL-F：5’TTCGGATCCG ACSCTATGCT ACCCWGACT 3’，
轻链可变区下游引物VL-R：5’TGGCTACCGG AGCCACTACC TAGGATCTCC AGCTCGGTCC3’。
本发明提供一种骨硬化蛋白单链抗体，其包含重链可变区基因(VH)区域，
重链可变区上游引物VH-F：5’TAGTGGCTCC GGTAGCCAGT CGGTGGAGGA GTCCGG 3’；
重链可变区下游引物VH-R：5’ATAAGAATGC GGCCGCTGAG AGYCGGTGAM CAGSGTGCC3’。
本发明涉及一种骨硬化蛋白单链抗体，其特征在于：制备方法：
提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA，用RT-PC R方法扩增抗体轻链可变区基因 (VL)和重链可变区基因(VH)并通过重叠延伸拼接(SOE)PC R方法，在VL和VH基因之间引入 Linker(Gly4Ser)3，连接成单链抗体SOST-scFv(VL-Linker-VH)；
将scFv基因克隆至表达载体PET-22b(+)后转入HEK293细胞进行分泌表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定表达产物，ELISA和West-blot检测表达蛋白的反应活性，茜素红结节染色法评估单链抗体对体外培养骨髓间充质干细胞成骨矿化的影响。
本发明涉及一种骨硬化蛋白单链抗体，其特征在于：只有抗体的可变区，无恒定区。
本发明涉及一种骨硬化蛋白单链抗体，用于制备治疗或预防骨质疏松和骨质疏松相关骨折的组合物。
本发明涉及一种骨硬化蛋白单链抗体，用于制备治疗或预防骨质疏松和骨质疏松相关骨折的药物、试剂盒。
本发明专利针对目前骨质疏松、骨质疏松相关骨折治疗的不足和骨硬化蛋白单克隆抗体的局限性，设计出骨硬化蛋白单链抗体具有如下特点，抗体特异性强，抗原结合活性高、免疫原性弱，能显著的促进骨生成、抑制骨流失，具有分子量小、渗透性高、水溶性好、发酵方式生产，产物均一性的优点。
附图说明
图1：从单克隆抗体杂交瘤细胞5H3D1中提取的总R NA经电泳检测。
图2：可变区PC R扩增scFv基因的鉴定结果。
图3：经纯化后的电泳鉴定结果。
图4：SOST-scFv(抗骨硬化蛋白单链抗体)重组质粒鉴定结果。
图5：SDS-PAGE分析纯化后scfv蛋白的结果。
图6：2μg/ml的SOST-scFv表达蛋白可以和SOST抗原特异结合。
图7：scFv表达的Western-bolt的分析。
图8：体外诱导分化检测结果(茜素红染色，×100)。
图9：Scl-scFv作用BMSCs第7天不同基因表达
图10：Scl-scFv对BMSCs增殖的影响
进一步解释
图1：从单克隆抗体杂交瘤细胞5H3D1中提取的总R NA经电泳检测。
图2：可变区PC R扩增scFv基因的鉴定结果，M：DL DNA标记.1 2：scFv基因片断。
图3：经纯化后的电泳鉴定结果。M：DNA标记1：VH基因2：VL基因
图4：SOST-scFv重组质粒鉴定结果。M.DL DNA标记；1、2.SOST-scFv目的条带
图5：SDS-PAGE分析纯化后scfv蛋白的结果，M.DNA标记1.纯化后的总蛋白
图6：2μg/ml的sost-scFv表达蛋白可以和SOST抗原特异结合
图7：scFv表达的Western-bolt的分析，M.蛋白梯；1.SOST(1μg)还原条件；2.SOST(1 μg)非还原条件
图8：体外诱导分化检测结果(茜素红染色，×100)，A.实验组；B.对照组；C.空白组
具体实施方式
实施例1制备骨硬化蛋白单链抗体：
骨硬化蛋白单链抗体需要提前制备，之后用于骨质疏松和骨质疏松相关骨折的治疗和实验研究。
骨硬化蛋白单链抗体的制备方法：
收集生长状态良好的SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总R NA，采用T R Izo1试剂破碎细胞后，氯仿抽取、异丙醇沉淀后用75％乙醇洗涤，干燥后用焦碳酸二乙酯处理过的水溶解R NA。以提取的R NA为模板，按照R T-PC R试剂盒操作流程要求进行合成cDNA。
依据兔单克隆抗体的可变区设计VL和VH引物，并采用简并密码子适应轻重链的多样性(S＝G，C； M＝A，C；R＝A，G；W＝A，T；Y＝C，T)；
将Linker设计在VL下游引物和VH上游引物，两端设有Not I和BamHI酶切点及保护性碱基。
轻链可变区上游引物VL-F：5’TTCGGATCCG ACSCTATGCT ACCCWGACT 3’，
5’端画线处引入了BamH I酶切位点，
轻链可变区下游引物VL-R：5’TGGCTACCGG AGCCACTACC TAGGATCTCC AGCTCGGTCC3’。
重链可变区上游引物VH-F：5’TAGTGGCTCC GGTAGCCAGT CGGTGGAGGA GTCCGG 3’；
重链可变区下游引物VH-R：5’ATAAGAATGC GGCCGCTGAG AGYCGGTGAM CAGSGTGCC3’，
5’端画线处引入了Not I酶切位点。
以合成的cDNA为模板，以VL-F/VL-R，VH-F/VH-R为引物，分别扩增VL、VH基因，采用DNA回收纯化试剂盒回收纯化扩增产物。反应体系为：加入1L浓度均为20mol的引物，并加入1 L cDNA模板、12.75L ddH2O、0.25L PrimeStarDNA酶，总体积20L。以VL-F和VH-R为引物，以纯化回收的VL和VH基因片段为模板，通过SOE PCR扩增获得VL-liner-VH结构基因片段。反应体系：加入2L浓度为20mol的引物，加入3L VL和VH基因片段、29.5L ddH2O、0.5 LPrimeStarDNA聚合酶，总体积50L。反应条件：经过95℃5min，95℃12s，49℃15s，72℃ 60s，5个循环后再进行95℃5min，95℃12s，67℃15s，72℃60s，25个循环后再72℃延伸10min，PC R产物经琼脂糖电泳后切胶，采用康为世纪公司凝胶回收试剂盒回收DNA片段。
采用DNA纯化试剂盒回收纯化SOST-scFv基因，引入PMD18-T载体，并转入HEK293细胞，经TA连接及PC R鉴定阳性克隆菌(命名为pMD18-SOST-scFv)送公司测序，测序结果经NCBI blast 分析。
通过将SOST-scFv定向克隆到表达载体PET-22b(+)Not I及BamH I酶切位点之间，构建重组pET-SOST-scFv质粒，经鉴定(酶切及PCR)为阳性克隆后，将重组质粒pET-SOST-scFv 转入表达宿主HEK293细胞中，挑取其中3个克隆进行PCR鉴定，将鉴定结果正确的克隆进行可溶性蛋白表达。
将鉴定正确的重组克隆子接种2YTG培养液，30℃过夜培养，次日按1∶100接种培养液2YTA， 30℃培养，待A600值达1.0左右时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，30℃诱导培养。
293EBNA细胞传代用1L的摇瓶，工作体积200ml，在37℃，5％CO2摇床中培养。取对数生长期细胞，用新鲜培养液直接稀释到要转染的密度。转染后的细胞在摇瓶中放摇床上培养，根据不同培养体积选择不同大小的摇瓶或反应器。培养过程加料使得细胞高表达，然后培养3～6d后，收集上清液去纯化，浓缩，SDS-PAGE检测后，-20℃冷冻保存。
分别采用2μg/ml、10μg/ml重组蛋白SOST包被ELISA板4℃过夜后20g/L BSA 37℃条件下封闭。分别加入上清、破碎上清、破碎沉淀，阴性对照组采用未诱导菌液，37℃孵育1h，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，37℃孵育1h，TMB显色分析。纯化后scFv经SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，封闭液4℃封闭过夜，PBST洗涤，一抗加入scFv，二抗采用鼠抗SOST单克隆抗体，三抗羊抗鼠特异性抗体，最后选用二氨基联苯胺(DAB)底物显色液显色，边摇动边观察，至条带清晰后加入双蒸水终止其反应，观察结果。
实施例2骨硬化蛋白单链抗体的编码序列的分析：
将实施例1中产生的细胞利用DNA提取试剂盒将细胞株中的质粒纯化，通过限制性内切酶剪切和2％的琼脂凝胶电泳纯化分离，获得重链可变区编码序列，同法获得轻链可变区编码序列，用人源抗体可变区通用引物进行聚合酶链反应扩增，
其中骨硬化蛋白单链抗体的轻链区域
SEQGACCATA TGCTGACCCA GAGTGCATCG CTCGTGTCTG CCGCTGTGCG AAGCATAGTC 60
ACCATCAATA GCCAGGCCAG TCAGAGTGTT TATAAGAACA ACTACTTAGC CTGGTTTCAG 120
CAGAAACCAG GGCAGCCTCC CAAGCGCCTG ATCTCATCTG CATCGACTCT GGCTTCTGCG 180
GTCTCGTCGG GGTTCAACGG CAGTCGATCC GGGACACAGA TCACTCTCAT CATCAGCGAC 240
GTGCAGTGTG ACGATGCTGG CACTTACTAC TGTCTGGACA GTTATGTTTG TAGTAGTGCT 300
GATTGTCTTG CTTTCGGCGG AGGGACCGAG CTGGAGATCC TA 342
及其可变区序列
SEQQSVEESG GRLVTPGTPL TLTCTASGFD ISRYAMVWVR QAPVKGLEWI AYINPRNSPY 60
YATLAKGRFT ISRTSTTVDL IITSRTTQDM GTYCCGRSTG ELSGLGSLVT VFS 113
骨硬化蛋白单链抗体的重链区域
SEQCAGTCGG TGGAGGAGTC CGGGGGTCGC CTGGTCACGC CTGGGACACC CCTGACACTC 60
ACCTGCACAG CCTCTGGATT CGACATCAGT AGATATGCAA TGGTCTGGGT CCGCCAGGCT 120
CCAGTGAAGG GGTTGGAATG GATCGCATAC ATTAATCCTC GTAATAGCCC ATACTACGCG 180
ACCTTAGCAA AGGGCCGTTT CACCATCTCC AGAACCTCGA CCACGGTGGA TCTGATAATC 240
ACCAGTCGGA CAACCCAGGA CATGGGCACC TATTGCTGTG GCAGAAGCAC TGGTGAATTG 300
TCGGGCCTAG GCAGCCTGGT CACCGTCTTC TCA 333
及其可变区序列
SEQQSVEESG GRLVTPGTPL TLTCTASGFD ISRYAMVWVR QAPVKGLEWI AYINPRNSPY 60
YATLAKGRFT ISRTSTTVDL IITSRTTQDM GTYCCGRSTG ELSGLGSLVT VFS 113
实施例3骨硬化蛋白单链抗体的用途：
1.检测骨硬化蛋白单链抗体(Scl-scFv)对BMSCs的增殖和分化能力；骨硬化蛋白单链抗体(Scl-scFv) 与鼠骨髓间充质干细胞共培养，用MTT法检测细胞的增殖能力；BMSCs成骨诱导2天后与骨硬化蛋白单链抗体共培养，第7天Real-Time PCR检测I型胶原(COL-1)、碱性磷酸酶(ALP)、RUNX2、骨桥蛋白OPN、骨钙素(OCN)mRNA的表达；第4、7、10天Westernblot检测I型胶原蛋白、ELISA检测骨钙素的表达。结果Scl-scFv组MTT的OD值与空白对照组无统计学差异；BMSCs成骨诱导2天后Scl-scFv作用的实验组 I型胶原、碱性磷酸酶、RUNX2、OPN、OCN mRNA的表达都高于无Scl-scFv作用空白对照组，有统计学差异 (P＜0.05)。骨硬化蛋白单链抗体对BMSCs的增殖无明显作用，可以促进其向成骨分化。考察了：Scl-scFv 作用BMSCs第7天不同基因表达；Scl-scFv对BMSCs增殖的影响。
2.研究骨硬化素单链抗体对去卵巢模型大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响。方法：取24只大鼠，手术切除卵巢后1周，用开放手术建立左下肢股骨中段横行骨折模型，随机分为模型组和治疗组，每组12只，模型组大鼠鞘内注射磷酸盐缓冲液0.2ml，治疗组大鼠鞘内注射骨硬化素单链抗体2.5mg/kg，每周2次，连续给药12周后，检测各组大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素含量，左侧股骨的骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨体积分数(BVF)、结构模型指数(SMI)和形态学变化。
表1 组大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶和骨钙素含量结果
Figure BSA0000155940300000071
Figure BSA0000155940300000072
与模型组比较：*P＜0.05
表2 大鼠左侧股骨的Micro-CT扫描结果
Figure BSA0000155940300000073
Figure BSA0000155940300000074
与模型组比较：*P＜0.05
实施例4 抗体纯化方法
1、培养上清处理：收取瞬时转染表达的HEK293细胞培养液进行离心，离心条件：转速4000rpm， 20min，离心后上清用0.45um滤膜过滤
2、亲和层析：
平衡缓冲液：20mM Tris，500mM NaCl，pH7.4
洗脱缓冲液1：20mM Tris，500mM NaCl，5mM imidazole，pH7.4
洗脱缓冲液2：20mM Tris，500mM NaCl，500mM imidazole，pH7.4
a、Ni excel亲和层析柱，超纯水冲洗5个柱体积(CV)，平衡缓冲液平衡5CV，流速2ml/min；
b、用步骤1中获得的样品进行上样，流速1.5ml/min；
c、平衡缓冲液平衡至少5CV直到基线平稳；
d、根据核酸蛋白检测仪的UV检测值变化收取洗脱峰
3、层析柱再生
a、平衡缓冲液平衡3-5CV
b、1M NaOH洗层析柱5CV，平衡缓冲液冲洗至中性；
c、超纯水冲洗5CV；
d、25％乙醇保存
4、洗脱样品置换Buffer至PBS，pH7.4
实施例5 骨硬化蛋白单链抗体的HPLC检测分析
1)色谱柱：Waters XBridgeTM C18column(5μm，4.6mm×150mm)
Agilent 1100高效液相色谱仪，PL-ELS 1000蒸发光散射检测器；
ELSD参数：漂移管温度为95℃；N2流速2.5L min-1；
柱温：38℃；流速：1ml min-1；进样量15μl(用流动相A溶解)；
流动相：A：乙腈；B：1.0％的乙酸甲醇溶液
梯度条件：
分钟 A的比例％
0 10
10 35
20 45
30 55
40 80
实施例6骨硬化蛋白单链抗体的LC-MS分析
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18column(1.7μm，100mm×2.1mm)；
预柱：Acquity UPLC BEH C18Van Guard pre-column(1.7μm，5mm×2.1mm)；
柱温：35℃；样品槽：5℃；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；
流动相：A：乙腈；B：1.0％的乙酸甲醇溶液
梯度条件：
Figure BSA0000155940300000082
Figure BSA0000155940300000091
样品用：流动相A(80％)、流动相B(20％)(体积比)的混合溶液溶解。
MS分析选用负离子模式，在以下条件下进行：
离子源温度(Source temp)：150℃；
脱溶剂温度(Desolvation temp)：380度；
脱溶剂(N2)流速Desolvation(L/Hr)700；
锥孔气(N2)流速Cone(L/Hr)60；
毛细管电压Capillary(Kv)2.75；
锥孔电压Cone(V)60；
全扫描质谱范围母离子为m/z 50～10000，
子离子为m/z 50～1000。
LC-MS数据分析采用仪器随带的Finnigan Xcalibur 1.3软件进行。
实施例7：骨硬化蛋白单链抗体组合物的制备
0.5ug骨硬化蛋白单链抗体加入5.0g精氨酸，加5.0g海藻糖，加入注射用水，溶解，稀释至1000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。
上述冷冻干燥分为四个阶段：
(1)预冻3小时，温度在-30℃；
(2)减压干燥14小时，温度在-30℃；
(3)升温干燥4小时，温度在-15℃
(4)二次升温干燥4小时，温度在30℃。
实施例8：骨硬化蛋白单链抗体组合物的制备
0.5ug骨硬化蛋白单链抗体加入5.0g精氨酸，5.0g天门冬氨酸，加入注射用水，溶解，稀释至1000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。
上述冷冻干燥分为四个阶段：
(1)预冻3小时，温度在-30℃；
(2)减压干燥14小时，温度在-30℃；
(3)升温干燥4小时，温度在-15℃
(4)二次升温干燥4小时，温度在30℃。
实施例9 骨硬化蛋白单链抗体的组合物的LC-MS分析
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18column(1.7μm，100mm×2.1mm)；
预柱：Acquity UPLC BEH C18Van Guard pre-column(1.7μm，5mm×2.1mm)；
柱温：35℃；样品槽：5℃；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；
流动相：A：乙腈；B：1.0％的乙酸甲醇溶液
梯度条件：
分钟 A的比例％
0 80
10 75
15 50
20 40
取实施例8的样品用：流动相A(80％)、流动相B(20％)(体积比)的混合溶液溶解。
MS分析选用负离子模式，在以下条件下进行：
离子源温度(Source temp)：150℃；
脱溶剂温度(Desolvation temp)：380度；
脱溶剂(N2)流速Desolvation(L/Hr)700；
锥孔气(N2)流速Cone(L/Hr)60；
毛细管电压Capillary(Kv)2.75；
锥孔电压Cone(V)60；
全扫描质谱范围母离子为m/z 50～10000，
子离子为m/z 50～1000。
LC-MS数据分析采用仪器随带的Finnigan Xcalibur 1.3软件进行。
Figure BSA0000155940300000121
Figure BSA0000155940300000131
Figure ISA0000155940320000011
Figure ISA0000155940320000021

Claims (1)

1.一种骨硬化蛋白单链抗体组合物的制备和LC-MS分析方法，其特征在于包括以下步骤：
0.5ug骨硬化蛋白单链抗体加入5.0g精氨酸，5.0g天门冬氨酸，加入注射用水，溶解，稀释至1000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖；
上述冷冻干燥分为四个阶段：
(1)预冻3小时，温度在-30℃；
(2)减压干燥14小时，温度在-30℃；
(3)升温干燥4小时，温度在-15℃；
(4)二次升温干燥4小时，温度在30℃；
骨硬化蛋白单链抗体，序列为：SEQ-1；
骨硬化蛋白单链抗体的组合物的LC-MS分析
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18column(1.7μm，100mm×2.1mm)；
预柱：Acquity UPLC BEH C18 Van Guard pre-column(1.7μm，5mm×2.1mm)；
柱温：35℃；样品槽：5℃；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；
流动相：A：乙腈；B：1.0％的乙酸甲醇溶液
梯度条件：
取骨硬化蛋白单链抗体组合物的样品用：流动相A(80％)、流动相B(20％)(体积比)的混合溶液溶解；MS分析选用负离子模式，在以下条件下进行：
离子源温度：150℃；脱溶剂温度：380度；脱溶剂(N2)流速(L/Hr)700；锥孔气(N2)流速(L/Hr)60；毛细管电压(Kv)2.75；锥孔电压(V)60；全扫描质谱范围母离子为m/z 50～10000，子离子为m/z 50～1000；LC-MS数据分析采用仪器随带的Finnigan Xcalibur 1.3软件进行。
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