CN100480388C - HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用 - Google Patents
HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100480388C CN100480388C CNB2004100788586A CN200410078858A CN100480388C CN 100480388 C CN100480388 C CN 100480388C CN B2004100788586 A CNB2004100788586 A CN B2004100788586A CN 200410078858 A CN200410078858 A CN 200410078858A CN 100480388 C CN100480388 C CN 100480388C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- antibody
- chain variable
- gene
- heavy chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 102100032412 Basigin Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 101000798441 Homo sapiens Basigin Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 10
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 abstract description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 6
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 4
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 4
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 2
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 2
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000721 basilar membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000012639 Balance disease Diseases 0.000 description 1
- 102000015279 Basigin Human genes 0.000 description 1
- 108010064528 Basigin Proteins 0.000 description 1
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 1
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229940118365 Endothelin receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030411 Neutrophil collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710118230 Neutrophil collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000004079 Prolyl Hydroxylases Human genes 0.000 description 1
- 108010043005 Prolyl Hydroxylases Proteins 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 239000013575 birch pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000024835 cytogamy Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002308 endothelin receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000003684 theca cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体单抗和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用。本发明以HAb18G/CD147胞外区蛋白免疫小鼠后所制备的特异性的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1，得到HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体，该单抗可与人肝纤维化组织中高表达的抗原HAb18G/CD147及肝星状细胞特异性结合。其具有促进MMPs分泌，降解细胞外基质的功能。应用该抗体制备用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。本发明成功地克隆了该抗体的轻、重链可变区基因。基于上述基因，采用基因工程方法，构建和表达成多种形式的小分子基因工程抗体，制备用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。基于上述基因所编码的多肽，交联上多种效应分子，制备用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及细胞工程领域，特别是HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体及其重链、轻链可变区基因、由所述基因编码的多肽和上述单抗及轻、重链可变区基因、多肽的应用。
背景技术
肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径。慢性肝病主要包括各型病毒性肝炎，尤其是丙型肝炎和乙型肝炎。全球HbsAg携带者超过2.8亿。我国为乙肝高流行区，其HbsAg携带者1.3亿，乙型肝炎患者超过3000万，有25-40％的乙肝患者导致肝硬化、肝癌，其死亡人数为40万人/年，已成为我国严重的社会问题。因此控制和逆转肝纤维化成为降低肝病患者死亡率的关键环节。各种慢性肝病首先导致肝纤维化，然后演变成肝硬化。基于近年肝脏超微结构的研究和分子生物技术的应用，人类发生的肝纤维化乃至肝硬化是完全可以逆转的。已故国际肝病专家Hans Popper曾经断言“谁能阻止肝纤维化，谁就能治愈大多数肝病”。
肝癌相关抗原HAb18G是一种高度糖基化的膜蛋白分子。通过我室自己???制备的抗人单克隆抗体HAb18从肝癌cDNA文库中筛选得到了其cDNA序列，查询Genbank证实其与CD147分子cDNA序列开放阅读框完全一致，与基质金属蛋白酶诱导剂EMMPRIN(Extrcellular Matrix metalloproteinase Inducer)、Basigin等为同一类分子。功能研究表明，HAb18G/CD147可刺激人成纤维细胞分泌三种蛋白酶，降解基底膜和细胞间质。已知，HAb18G/CD147在纤维化组织中高表达，尤以肝纤维化组织表达最为显著，其定位于肝细胞和肝脏纤维化基质中增殖的胆管上皮细胞，在HCV(丙型肝炎病毒)、AIH(自身免疫性肝炎)、HBV(乙型肝炎病毒)、PBC(原发性胆汁性肝硬化)引起的肝纤维化病变中HAb18G/CD147均高表达。这一特点显示出该分子在肝纤维化的病变进程中扮演了重要的角色，其可能与刺激肝实质细胞、肝星状细胞分泌MMPs有关。
MMPs具有降解各型胶原、蛋白聚糖等ECM成分的作用，TIMPs为MMPs特异性组织抑制因子，体内TIMPs和MMPs的转录和活性可受到多因素和多水平的调节，如果出现平衡紊乱则会出现相应的病理状态。许多学者发现，在人类的慢性肝病及鼠的肝纤维化的模型中都已观察到MMPs的表达量和活性下降，而TIMPs的表达却显著增加，并在肝纤维化发展的整个过程中持续存在，提示肝基质的过度沉积是肝纤维化进展的主要病理特征。而在肝纤维化的恢复期，以纤维状基质的降解和正常肝组织的恢复为特征。
当前肝纤维化的治疗进展是：减轻纤维化的程度，延缓发展，逆转病理进程，但是针对肝纤维化本身尚无特异性的治疗手段。如转化生长因子β1(TGF-β1)的肽类受体拮抗剂，由于其受体广泛存在于各类细胞中，使用后可导致自身免疫性疾病和细胞的退化等不良作用。其他的如内皮素受体拮抗剂、脯氨酰羟化酶抑制剂等均在研究之中，尚未有明确的药效学结果。
发明内容
本发明的一个目的在于制备高特异性的针对HAb18G/CD147胞外区的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体，并提供该抗体的重链和轻链可变区基因及其所编码的多肽产物。
本发明的另一个目的在于以上述的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体、或其重链和轻链可变区基因、或所编码的多肽，或者重组成多种形式的基因工程抗体、抗体融合蛋白或蛋白交联物、衍生物等，用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。
根据本发明的一个方面，涉及HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的制备、鉴定、纯化。本发明以肝纤维化组织中高表达的HAb18G/CD147的胞外区蛋白为免疫原，采用杂交瘤技术制备并筛选出稳定分泌鼠抗人HAb18G/CD147的胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab-1(2004年5月31日中国典型培养物保藏中心登记编号：CCTCC-C200408)。将其接种同系小鼠腹腔后收集腹水。采用流式细胞术、免疫组化等方法对细胞培养上清及腹水中分泌的特异性抗体进行亲和性鉴定，其结果显示HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体与人星形细胞(HSCs)及人肝纤维化组织均有结合。所得腹水经离子交换层析纯化获得一定纯度的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体。
根据本发明的另一个方面，涉及HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆。本发明应用一套设计的PCR引物，从杂交瘤细胞株HAb18Gedomab-1中成功地克隆了该抗体的轻、重链可变区基因。其中所述的重链可变区基因全长为336bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。所述的轻链可变区基因全长为324bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，经分析证实所得到的重链和轻链可变区基因均可编码正确的小鼠抗体可变区。
附图说明
图1为杂交瘤细胞株HAb18Gedomab-1的染色体组型图。
图2为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的SDS-PAGE纯度鉴定图。
图3为RT-PCR扩增的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的重链可变区基因的测序图谱。
图5为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的轻链可变区基因的测序图谱。
图6为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的明胶酶谱图。
图7为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的I型胶原酶谱图。
图8为重组基底膜降解实验的穿膜细胞图。
具体实施方式
1、HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的制备与鉴定。
免疫方法：取8～10周龄重18g左右雌性BALB/C小鼠(本校动物中心提供)，以HAb18G/CD147胞外区蛋白为免疫源，进行常规免疫，采用皮下多点注射，100μg/只，每隔2周以相同剂量抗原加不完全福氏佐剂加强免疫，腹腔注射，细胞融合前检测小鼠血清多抗的效价，效价高者尾静脉再追加免疫1次，剂量同上。3天后将HAb18G/CD147胞外区蛋白免疫的小鼠脾细胞与体内传代获得的骨髓瘤细胞系SP2/0以5:1的比例在PEG-1000作用下融合，融合细胞在HAT选择性培养基中培养。
杂交瘤细胞株的建立：以HAb18G/CD147胞外区蛋白抗原，间接ELISA方法筛选阳性克隆，将阳性孔连续有限稀释2～3次后.大量扩增并液氮冻存；同时给同系小鼠腹腔注射接种筛选的杂交瘤细胞，10～14d后收集腹水。所述的HAb18Gedomab-1杂交瘤细胞株染色体在58-126，众数104-126，参见附图1，其分泌特异性HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体。
单克隆抗体鉴定：用流式细胞术FACS进一步检测杂交瘤细胞培养上清及腹水与人星形细胞(HSCs-T6)膜表面抗原的结合情况；SP免疫组织化学方法检测含HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体腹水与人肝纤维化组织的特异性结合；杂交瘤细胞株HAb18Gedomab-1培养上清和小鼠腹水抗体滴度的测定。亚型鉴定为小鼠IgG1。
HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的纯化方法：采用阳离子交换层析法，即FPLC系统SP Sepharose FF离子交换层析对含HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的腹水的粗提物进行纯化。洗脱液A液：0.02mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.4)，B液：0.02mol/L柠檬酸缓冲液，1mol/L氯化钠(pH5.4)。流速1ml/min。
纯化后目的蛋白的鉴定：采用ELISA法和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度10％，电泳缓冲液为PH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，参见附图2，图中1为200KD Marker，2为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体腹水，3为穿过峰，4为洗脱峰(即纯化的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体)。
2、HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的轻、重链可变区基因的克隆、分析与重组。
所用细胞株为稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab-1，其分泌的抗体分子亚型为IgG1。
HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的可变区基因的克隆
取处于对数生长期的HAb18Gedomab-1杂交瘤细胞(5×106)，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。随后以Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链。然后，利用上述配对引物扩增产物Fd(约736bp)和全长轻链(约731bp)经低溶点琼脂糖凝胶(1.5％)电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(promega Inc)回收纯化后，凝胶电泳鉴定，参见附图3，图中M为DL-2000Marker，1为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的重链可变区基因，2为HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的轻链可变区基因。之后将目的片段克隆至T载体，测序分析参见附图4，5。
Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物的反转录方案如下：20μL反应体系中依次加入1μg总RNA(2μL)，0.5ug随机引物Oligo(dT)15(1μL)，4ulMgCL2(25mM)2μL 5×dNTPs，2μL 10×缓冲液，0.5μL RNase抑制剂，加入反转录酶AMV 15U(0.75μL)，用水补至20μL，混匀，42℃水浴1h，煮沸3min，反应产物置于-20℃备用。
PCR扩增反映按常规方法进行：以上述产物为模板，分别用1对重链引物和1对轻链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。反应体系为：模板cDNA2.5ul，dNTP(各0.4mM)，10×Buffer 5ul，Ex Taq DNA聚合酶1.25u，5’端和3’端引物各5ul(约30pmol)，加水至50ul，混匀，瞬时离心后，加入1-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件：94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。
目的片段T载体克隆测序方案如下：将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液5ul，混匀后4℃过夜，转化大肠杆菌JM109，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。
设计的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的可变区基因PCR扩增引物序列如下：
小鼠重链V区5’端引物5’
-GGGGATATCCACCATGTACTTGGGACTGAACTGTGT-3’
小鼠重链V区3’端引物
5’-AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT-3’
小鼠轻链V区5’端引
5’-GGGGATATCCACCATGGACACACAGACTCAGGTCTTTATA-3’
小鼠轻链V区3’端引物
5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3
序列分析表明，其VH基因与IG胚系基因HV6家族IGHV6S1*01基因同源性最高，其Fd基因与抗birch pollen allergen的小鼠单克隆抗体基因MMMABIP1H(NCBI：Y08908)及抗dsRNA的小鼠单克隆抗体基因VH10G1同源性最高(NCBI：AB050074)。其VL基因与IG胚系基因KV6家族的IGKV6-20*01基因同源性最高。其Lc基因与抗foot-and-mouth disease virus的小鼠单链抗体基因(NCBI：MMU68543)及抗anti-YGNNV的小鼠单克隆抗体基因同源性最高(NCBI：AF466699)。这说明，所得到的重链和轻链可变区基因均为可编码正确的小鼠抗体可变区的基因。
基于上述已克隆到的抗肝纤维化由HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的轻、重链可变区基因或多肽产物，采用基因工程方法，可以构建成多种形式的基因工程抗体药物，也可以重构成多种形式的融合或重组蛋白药物，可以交联上调节细胞外基质改变的活性酶原或生物反应调节剂等作为前药，以用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的实验研究及临床应用。
从本发明所述的轻、重链可变区基因出发，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式：(1)嵌合抗体。是用鼠MAb的V区与人Ig的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。其完整地保留了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应。(2)人源化抗体。针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基镶饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)2、Fl ex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)2、F(ab’)、(ScFv)等。(5)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。(7)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出所需的特异性抗体。
以上述抗体或由其基因编码的多肽衍生的抗体为载体，交联上各种抗基质沉积的效应物质而形成的免疫偶联物或导向前药主要有下列几种形式：(1)抗体-基质调节剂偶联物。基质调节剂能单独调节细胞外的基质的沉积与降解已取得较好的疗效。但由于其输入体内后仅有部分到达作用靶部位，其调节作用得不到充分发挥且有毒副作用。将基质调节剂与单克隆抗体偶联，通过单克隆抗体携带其到达靶部位而充分发挥其降解基质的作用，使这些因子的作用更强，且更加专一。(2)抗体导向酶解前药。将抗体与药物专一性活化酶的偶联物注入体内，间隔一定时间后注入前药，使其在纤维化部位转化成高浓度有降解活性的药物，从而快速有效地降解细胞外沉积的基质。(3)免疫脂质体。将MAb偶联到脂质体的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一体，再包埋上有关药物，则可提高药物靶向性和疗效。
3、HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的体外生物学功能实验。
明胶酶谱实验：人星形细胞(HSCs-T6)培养至对数期，用0.25％胰酶消化，以105/孔的密度接种于96孔板中，培养24h。弃去培养上清，换无血清培养液。加入终浓度为100μg/ml的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体。并设立阴性对照孔。分别在10，20h收集无血清培养细胞上清。以明胶为底物配制一定体积的8％分离胶和5％浓缩胶，取培养上清与样品缓冲液混合物，上样开始电泳。电泳停止后，将胶放入Triton X-100溶液中复性，在明胶酶孵育缓冲液中孵育。染色、脱色、观察、拍片。实验结果，参见附图6，图中1为阴性对照(10h)，2为加入HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体(10h)，3为阴性对照(20h)，4为加入HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体(20h)。
I型胶原酶谱实验：方法同上，仅改变底物为I型胶原。实验结果参见附图7，图中1为阴性对照(10h)，2为加入HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体(10h)，3为阴性对照(20h)，4为加入HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体(20h)。
重组基底膜降解实验：在Millicell小室内膜上加入Matrigel胶，放至胶干。用2.5g/L胰酶消化HSC细胞，离心洗涤。用含0.1％BSA的RPIM-1640悬起，加入上室，同时在上室加入终浓度为100μg/ml的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体。在小室的下室24孔板内加入500μl趋化剂。将24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中培养20h。取出小室，弃去培养液，95％乙醇固定25min，滤膜HE染色，梯度酒精脱水，用棉签擦去上室中的Matrigel胶及细胞，切下滤膜；透明后封片。在40×光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，随机计数膜上4个视野，每细胞计数3份，求出其平均值，测验重复3次。实验结果参见附图8，图中1为阴性对照，2为加入HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体。
综上，明胶酶谱实验结果表明，HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体可促进MMP-2、MMP-9的生成；I型胶原酶谱实验结果表明，HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体可促进MMP-1、MMP-8的生成；重组基底膜降解实验检测表明，HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体作用于HSC后可促进基底膜的降解。这些结果说明，HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体具有逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的潜力。
序列表
<110>陈志南
<120>HAb18Gedomab1分泌的单克隆抗体和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用
<160>4
<210>1
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>V_region
<222>(1)...(336)
SEQ ID NO：1
<210>2
<211>324
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>V_region
<222>(1)...(324)
SEQ ID NO：2
<210>3
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>V_segment
SEQ ID NO：3
<210>4
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>V_segment
SEQ ID NO：4
Claims (8)
1、一种抗HAb18G/CD147胞外区蛋白的单克隆抗体，其特征在于：该抗体由保藏号为CCTCC-C200408的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1产生，该抗体亚型为IgG1。
2、如权利要求1所述的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的重链可变区基因，其基因序列为序列表SEQ ID NO：1的序列。
3、如权利要求2的基因所编码的多肽产物，其基因序列为序列表SEQ IDNO：3的序列。
4、如权利要求1所述的单克隆抗体的轻链可变区基因，其基因序列为序列表SEQ ID NO：2的序列。
5、如权利要求4的基因所编码的多肽产物，其基因序列为序列表SEQ IDNO：4的序列。
6、如权利要求1所述的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体或其重组蛋白作为制备逆转肝纤维化治疗剂的应用。
7、如权利要求2或3所述的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的重链可变区基因或其编码的多肽产物出发，重组成各种形式的基因工程抗体，作为制备逆转肝纤维化治疗剂的应用。
8、如权利要求4或5所述的HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体的轻链可变区基因或其编码的多肽产物出发，重组成各种形式的基因工程抗体，作为制备逆转肝纤维化治疗剂的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100788586A CN100480388C (zh) | 2004-06-14 | 2004-09-09 | HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200410026231 | 2004-06-14 | ||
| CN200410026231.6 | 2004-06-14 | ||
| CN20041002631.6 | 2004-06-14 | ||
| CNB2004100788586A CN100480388C (zh) | 2004-06-14 | 2004-09-09 | HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1782077A CN1782077A (zh) | 2006-06-07 |
| CN100480388C true CN100480388C (zh) | 2009-04-22 |
Family
ID=36772690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100788586A Expired - Lifetime CN100480388C (zh) | 2004-06-14 | 2004-09-09 | HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100480388C (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100586960C (zh) * | 2006-06-23 | 2010-02-03 | 陈志南 | HAb18GC2单抗和其轻、重链可变区基因及应用 |
| CN103204939A (zh) * | 2013-01-05 | 2013-07-17 | 陈志南 | CD147-HAb18MAb复合物晶体结构及应用 |
| CN117586397A (zh) * | 2019-08-27 | 2024-02-23 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗人cd147的单克隆抗体、表达载体、细胞株及其应用 |
| CN113549152B (zh) * | 2021-07-22 | 2023-06-20 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种抗basigin人源化抗体及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1166989A (zh) * | 1997-07-11 | 1997-12-10 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗人肝癌单克隆抗体HAb18放射免疫治疗剂 |
-
2004
- 2004-09-09 CN CNB2004100788586A patent/CN100480388C/zh not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1166989A (zh) * | 1997-07-11 | 1997-12-10 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗人肝癌单克隆抗体HAb18放射免疫治疗剂 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fd及轻链基因的克隆与鉴定. 陈志南，邢金良.中国肿瘤生物治疗杂志，第10卷第2期. 2003 |
| 抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fd及轻链基因的克隆与鉴定. 陈志南，邢金良.中国肿瘤生物治疗杂志，第10卷第2期. 2003 * |
| 肝癌相关抗原Hab18G胞外区片段的原核表达与免疫学活性分析. 陈志南，邢金良.第四军医大学学报，第24卷第10期. 2003 |
| 肝癌相关抗原Hab18G胞外区片段的原核表达与免疫学活性分析. 陈志南，邢金良.第四军医大学学报，第24卷第10期. 2003 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1782077A (zh) | 2006-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11291720B2 (en) | Anti-CTLA4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses | |
| JP7262597B2 (ja) | 二重特異性抗体及びその作製方法と使用 | |
| WO2018068652A1 (zh) | 抗egfr和抗cd3双特异抗体及其应用 | |
| EP0617126B1 (en) | Polypeptide capable of inhibiting the binding between human IL-6 and its receptor | |
| CN109206514B (zh) | Tslp单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN100586960C (zh) | HAb18GC2单抗和其轻、重链可变区基因及应用 | |
| CN107217042A (zh) | 一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法 | |
| CN102321173B (zh) | 人源化巨噬细胞抑制因子1单克隆抗体及其应用 | |
| JP2016520614A (ja) | タンパク質薬物の不活性化のための抗体ロッカー | |
| CN111712521B (zh) | Cd38蛋白抗体及其应用 | |
| CN107207608A (zh) | 双特异性抗体、其制备方法和用途 | |
| CN109071673A (zh) | 抗pcsk9抗体及其应用 | |
| CN102532316B (zh) | 一种抗vWF单克隆抗体及其应用 | |
| CN105916883B (zh) | 双功能融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN100480388C (zh) | HAb18Gedomab1所分泌的单克隆抗体和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用 | |
| CN111848806B (zh) | Egfr-cd3双功能抗体及其应用 | |
| CN102559636A (zh) | 用于白血病和自身免疫疾病的抗体融合蛋白及其制备方法 | |
| CN101619305B (zh) | 抗人cd52单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途 | |
| CN104558181A (zh) | 靶向b淋巴瘤细胞的人源单链抗体 | |
| CA2597754A1 (en) | Methods and uses of antibodies in the purification of interferon | |
| CN114685668B (zh) | 一种人gpc3单克隆抗体及其缀合物 | |
| CN115160433A (zh) | 人源化hbv b和c基因型前s1蛋白抗体及其应用 | |
| CN107880131A (zh) | 一种抗IL‑13Rα2和CD3双特异抗体及其应用 | |
| CN103130894A (zh) | 抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv及其编码基因与应用 | |
| KR102090160B1 (ko) | 특정 항원 정제 방법 및 이를 이용한 단일클론 항체 제조 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160204 Address after: 710032 Changle West Road, Shaanxi, China, No. 169, No. Patentee after: THE FOURTH MILITARY MEDICAL University Address before: 710032 center of cell engineering, The Fourth Military Medical University, 17 West Changle Road, Xi'an, Shaanxi Patentee before: Chen Zhinan |
|
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20090422 |
|
| CX01 | Expiry of patent term |