CN103130894A - 抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体及其编码基因与应用。所述抗人γδTCR单抗的重组单链抗体的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列。实验结果表明，重组单链抗体G5-4ScFv能与γδTCR特异结合；固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖，2周时其纯度可达90％；扩增得到的γδT细胞在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α，并能有效杀伤肿瘤细胞系daudi细胞，说明其具有较好的细胞毒作用，可以用于临床上肿瘤的过继免疫治疗。此外，重组单链抗体G5-4ScFv在应用上有以下优势：1、降低免疫原性，提高了临床应用的安全性；2、分子量小，穿透力强，容易进入实体瘤周围的微环境；3、可大批量生产，提高了产量，降低了成本。本发明将在医学领域特别是γδT细胞的增殖及肿瘤治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体及其编码基因与应用，特别是涉及抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv(文中也简称“G5-4ScFv”)及其编码基因与应用。

背景技术

T细胞可依据表面受体(TCR)的不同表达而分成两类：TCRαβ细胞和TCRγδ细胞。γδT细胞是T淋巴细胞库中一个数量较小的亚群，约占正常人外周血T淋巴细胞总数的1％-5％，但在表皮及粘膜等上皮组织中相对富集。在肿瘤免疫中γδT细胞对肿瘤抗原的识别不具MHC限制性及不需特异的抗原呈递作用，且对多种肿瘤细胞具细胞毒活性，从而具有用于肿瘤过继免疫治疗的潜能。抗体固相化体外扩增是获得γδT细胞的一个重要手段，但是由于目前的抗γδTCR单克隆抗体为鼠源性，会产生人抗鼠抗体反应(HAMA)，因而在临床治疗上受到较大限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体。

本发明所提供的抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体，命名为G5-4ScFv，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，G5-4ScFv的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列。

序列表中的SEQ ID No：1由120个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID No：2由108个氨基酸残基组成。

编码重组单链抗体G5-4ScFv的基因(G5-4ScFv)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No：3由360个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID No：4由324个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

所述重组单链抗体G5-4ScFv的重链可变区和轻链可变区可通过柔性连接肽连接，所述柔性连接肽的氨基酸残基序列的通式为(Gly₄Ser)n，n为1-5的整数，优选为3，其中n为3时的重组单链抗体G5-4ScFv的氨基酸残基序列如序列表中序列5所示。

序列表中的SEQ ID No：5由249个氨基酸残基组成。

编码上述具有(Gly₄Ser)₃柔性连接肽的重组单链抗体G5-4ScFv的基因的核苷酸序列可如序列表中SEQ ID No：6所示。

序列表中的SEQ ID No：6由750个碱基组成。

含有本发明基因G5-4ScFv的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增G5-4ScFv中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种表达抗人γδTCR单克隆抗体重组单链抗体G5-4ScFv的方法。

本发明所提供的表达重组单链抗体G5-4ScFv的方法，是将编码重组单链抗体的重组基因G5-4ScFv插入表达载体中，再将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经表达、纯化得到高活性的重组单链抗体G5-4ScFv。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌具体可为E.coli BL2l(DE3)、E.coli BL2l(DE3，plysS)、E.coliJM109、E.coli HB101或E.coli Topl0等，优选为E.coli BL2l(DE3)。

当所述宿主为大肠杆菌时，用于构建所述重组表达载体的出发载体可为现有的在上述大肠杆菌中表达外源基因的表达载体。

所述重组表达载体具体可为将重组基因G5-4ScFv插入pET-22b(+)的多克隆位点得到的重组表达载体G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)。

具体来讲，转化有G5-4ScFv-PET22b(+)-sp或G5-4ScFv-PET22b(+)的重组大肠杆菌分别为G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-transB。其中G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB已于2011年6月24日在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.4983，G5-4SCFV-PET22b(+)-transB已于2011年6月24日在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.4984。这些菌株也属于本发明的保护内容。

上述重组表达载体和工程菌均可按照常规方法构建。

培养含有本发明抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv基因编码序列的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度优选为200μmol/L，诱导温度为16-37℃，优选为20℃。

本发明还提供了所述的抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体在制备扩增γδT细胞制剂中的应用。

本发明还提供了一种刺激γδT细胞增殖的方法。是用5μg/mL的本发明中的重组单链抗体G5-4ScFv包被培养板，加入2×10⁶个新鲜分离的人PBMC，用含IL-2(200U/mL)的1640完全培养基培养2周，得到γδT细胞。该刺激γδT细胞增殖的方法可用于体外或体内。

本发明中，可以按照本领域已知的常规方法制备的抗人γδTCR单克隆抗体(如参见以下文献中记载的方法制备：Kohler and Milrtein，Nature 256：495-96，1975；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。必要时，也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗人γδTCR单克隆抗体。

具体来讲，本发明抗人γδTCR单克隆抗体的制备方法，可包括以下步骤：

1)用γ9δ2(OT3)-Fc(《昆虫杆状病毒表达系统表达TCR γ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定》《基础医学与临床》Dec.2009.Vol.29No.12)作为免疫原免疫动物；

2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；

3)筛选并培养杂交瘤细胞；

4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化出抗人γδTCR单克隆抗体。

在上述抗人γδTCR单克隆抗体的制备方法中，步骤1)中的免疫原应选择具有强免疫原性的生物学材料如细胞，并且希望该细胞所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。

步骤1)中用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。

步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。

步骤3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。

步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌抗人γδTCR单克隆抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出抗人γδTCR单克隆抗体。

本发明提供了抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv及其编码基因。本发明制备了分泌能刺激γδT细胞增殖的抗体的杂交瘤细胞株，并获得相应抗体的可变区序列，构建了含重组单链抗体基因的重组质粒，并在工程菌中进行表达，得到重组单链抗体G5-4ScFv。实验结果表明，重组单链抗体G5-4ScFv能与γδTCR特异结合；固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖，2周时其纯度可达90％；扩增得到的γδT细胞在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α，并能有效杀伤肿瘤细胞系daudi细胞，说明其具有较好的细胞毒作用，可以用于临床上肿瘤的过继免疫治疗。此外，重组单链抗体G5-4ScFv在应用上有以下优势：1、降低免疫原性，提高了临床应用的安全性(鼠源完整单抗与重组单链抗体的区别：临床上鼠单抗用于患者的治疗有很多限制。一方面其做为异源物质，会使患者产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，这部分反应主要是针对鼠抗体恒定区的免疫原性产生的；另一方面鼠源完整抗体一般是通过小鼠腹水制备的，可能混有鼠源病毒，在肿瘤的细胞过继免疫治疗中需要不断检测是否含有鼠源病毒等。而本发明的重组单链抗体只包括具有抗原识别功能的可变区部分，分子量小，无恒定区，大大减少HAMA反应的产生。另一方面，重组单链抗体是用原核表达体系表达的，可以大规模表达，降低成本，保证产品的一致性，而且不存在携带鼠源病毒的可能性。这样在肿瘤的细胞过继治疗应用更具有优势。)；2、分子量小，穿透力强，容易进入实体瘤周围的微环境；3、可大批量生产，提高了产量，降低了成本。本发明将在医学领域特别是γδT细胞的增殖及肿瘤治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

生物材料说明：

本发明中用到的的重组大肠杆菌分别为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)名称为G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-transB。其中G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB已于2011年6月24日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4983；G5-4SCFV-PET22b(+)-transB已于2011年6月24日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4984。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为致敏小鼠血清抗体效价检测结果

图2为流式细胞术检测杂交瘤细胞株G5-4分泌的单克隆抗体与γδT细胞的结合及与IMMU510竞争抑制的结果

图3为杂交瘤细胞株G5-4分泌的单克隆抗体固相化刺激γδT细胞增殖的细胞纯度检测结果

图4A和图4B为PCR扩增抗人γδTCR单克隆抗体G5-4轻、重链可变区编码序列的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图5为搭桥PCR扩增的重组单链抗体G5-4ScFv基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图6为重组表达载体G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)的双酶切鉴定结果

图7为不同浓度的IPTG诱导重组单链抗体G5-4ScFv的表达情况检测结果

图8为G5-4ScFv的表达形式检测结果

图9为G5-4ScFv蛋白分子量的质谱分析结果

图10为G5-4ScFv的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果

图11为G5-4ScFv与γδT细胞结合情况的流式细胞术检测结果

图12为G5-4ScFv和IMMU510与γδT细胞竞争结合情况的流式细胞术检测结果

图13为G5-4ScFv刺激PBMC中γδT细胞增殖的检测结果

图14为G5-4ScFv扩增的γδT细胞分泌细胞因子功能的检测结果

图15为G5-4ScFv扩增的γδT细胞的肿瘤细胞毒功能检测结果

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv及其编码基因的获得

(一)抗人γδTCR单克隆抗体的获得

可以按照本领域已知的常规方法制备本发明的抗人γδTCR单克隆抗体(如参见以下文献中记载的方法制备：Kohler and Milrtein，Nature 256：495-96，1975；Harlowand Lane，Aatibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)；也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗人γδTCR单克隆抗体。以下描述只为公开目的给出一种具体操作，不作为对本发明的限制。

一、动物免疫

1、初次免疫

100μg重组γ9δ2(OT3)-Fc(《昆虫杆状病毒表达系统表达TCR γ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定》《基础医学与临床》Dec.2009.Vol.29No.12)与等体积完全弗氏佐剂(CFA)混合，于1.5mL离心管内充分搅拌直至成为白色乳液，腹部皮下多点注射免疫4-6周雌性BalB/C小鼠。

2、加强免疫

于初次免疫后第15、29、44天分别用50μg重组γ9δ2(OT3)-Fc与等体积不完全弗氏佐剂(IFA)按上述方法充分混匀，皮下多点注射免疫小鼠。第四次加强免疫后一周，小鼠断尾取血，离心取血清，以γ9δ2(OT3)-Fc为一抗，以Enzyme labeledGoat Anti-Mouse IgG(Fab Specific)(购自Sigma公司)为二抗，用ELISA法测定血清抗体效价。致敏小鼠血清抗体效价检测结果如图1所示(1为正常对照；2、3、4为致敏小鼠)，致敏小鼠1、2和3产生的抗体滴度均超过1∶15000，均可用于后续冲击免疫。

3、冲击免疫

挑选产生最高抗体效价的致敏小鼠，尾静脉注射100μg重组γ9δ2(OT3)-Fc。

二、细胞融合与接种

1、骨髓瘤细胞悬液的制备

复苏HGPRT缺陷的SP2/0细胞，用含10％FCS(胎牛血清)的DMEM培养基(Invitrogen公司)培养，培养至对数生长期，收集细胞，离心并计数，备细胞融合用。

2、致敏小鼠脾细胞悬液的制备

冲击免疫后3天，将免疫小鼠摘眼球取血，分离血清，留作阳性对照；然后，小鼠颈椎脱臼处死，置于0.2％新洁尔灭溶液中浸泡5-10分钟，无菌操作取脾脏，无血清IMEM培养基(Invitrogen公司)清洗，剪碎并轻微研磨，100目细胞筛过滤，1000r/min离心5分钟，弃上清，IMEM培养基悬浮，制备脾细胞悬液，计数，备细胞融合用。

3、细胞融合

将SP2/0骨髓瘤细胞(1-2×10⁷)与免疫小鼠脾细胞(1×10⁸)混合，1000r/min离心5分钟，吸尽上清，轻弹管底，制成团松散呈糊状的细胞混合液，置于37℃水浴中。用吸管吸取1mL 50％PEG(MW4000)缓慢加入细胞混合液中，边加边搅拌，于1分钟内加完，再静置1分钟。然后加IMDM培养基，前2分钟内缓慢加入2mL，后2分钟内再加入8mL。800r/min离心5分钟，混匀，离心后弃上清，加入HAT选择性培养基(购自Sigma公司)15mL重悬细胞沉淀，再加入2％甲基纤维素半固体培养基(购自Sigma公司)25mL，充分混匀。

4、融合细胞培养

将混匀的细胞倒入直径35mm平皿中，每皿约2mL，37℃、5％CO₂培养箱中培养。7-10天后，肉眼可见培养基中有许多白色杂交细胞形成的克隆，直径约0.5-1mm，可供克隆挑选。

三、杂交瘤细胞克隆的挑选，转移及亚克隆：

取96孔培养板，每孔中加入含15％胎牛血清、10⁶个/mL胸腺细胞和HT的DMEM200ul。在镜下，用加样器小心吸取细胞克隆，移入96孔板中再培养，每孔仅移入一个细胞克隆，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

四、阳性克隆筛选

杂交瘤细胞克隆于96孔培养板中培养两天后，吸取细胞生长旺盛的培养孔的上清，以重组δ2单链蛋白(将δ2胞外段连入表达载体pAcGP67-A(构建方法参见……文献，请提供购买处或构建方法或记载有构建方法的参考文献的出处，不能为馈赠的)中，转染昆虫细胞Sf9，经鉴定有目的蛋白表达，用GE HisTrap HP镍柱亲和层析法纯化得到的目的蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中序列8所示)为检测抗原(一抗)，以Enzyme labeled Goat Anti-Mouse IgG(Fab Specific)(购自Sigma公司)为二抗，用ELISA方法检测培养上清中的抗体，连续测5-7天，将阳性克隆移至24孔培养板中继续培养，并用流式细胞术检测各上清是否含有能与γδT细胞结合的抗体，保留稳定分泌抗体的杂交瘤细胞克隆并编号。同时，用稳定分泌抗体的杂交瘤细胞培养上清包板刺激新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC，2×10⁶个)，用含IL-2(200U/mL)的RP1640完全培养基(购自Invitrogen公司)培养2周后检测γδT细胞纯度，选择具有刺激γδT细胞增殖作用的杂交瘤细胞克隆，冻存。

五、扩增与冻存阳性杂交瘤细胞克隆

将步骤四筛选的阳性杂交瘤细胞克隆在24孔板中继续培养，细胞大量扩增后，离心收集细胞，加入约1mL冻存液(10％DMSO、90％小牛血清)，冻存于-196℃液氮中，每个阳性克隆冻存5管。

六、抗体性质分析

大规模培养能分泌刺激γδT细胞增殖的单克隆抗体的杂交瘤细胞株G5-4，收集上清，用Protein G亲和层析柱(购自GE公司)进行抗体纯化，将纯化的单克隆抗体命名为G5-4，继而用下述方法对纯化的单克隆抗体的特性进行检测。

1、抗体的类型及亚类分析

用Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒)并按其说明书检测单克隆抗体类型及亚型。

检测结果表明上述杂交瘤细胞株G5-4分泌的单克隆抗体为IgG2a亚型，κ亚类。

2、流式细胞术检测杂交瘤细胞株G5-4分泌的单克隆抗体与γδT细胞的结合及与IMMU510竞争抑制作用

流式细胞术检测G5-4与γδT细胞的结合情况及其与IMMU510竞争抑制的情况，结果如图2所示(A、Isotype Control(mouse IgG2a Isotype，同型对照，购自Biolegend公司)；B、IMMU510(购自Immunotech公司)；C、G5-4；D、G5-4+IMMU510-FITC)，与阳性对照(B)相比，杂交瘤细胞株G5-4分泌的单克隆抗体与γδT细胞的结合率几近一致，而且，杂交瘤细胞株G5-4分泌的单克隆抗体可完全抑制市售抗体IMMU510与γδT细胞的结合，提示杂交瘤细胞株G5-4分泌的单克隆抗体识别的表位与IMMU510识别的表位相近或相同，是特异识别γδTCR的抗体。

3、抗体固相化刺激γδT细胞增殖

抗体固相化刺激γδT细胞增殖，具体方法为：用浓度为5ug/mL的杂交瘤细胞G5-4分泌的单克隆抗体包板刺激新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC，2×10⁶个)，以IMMU510为对照，以鼠IgG2a(购自Biolegend公司)为同型对照，用含IL-2(200U/mL)的RP1640完全培养基(购自Invitrogen公司)培养2周后检测γδT细胞纯度。结果如图3所示(A、Isotype Control(同型对照)组；B、IMMU510组；C、G5-4组)，同型对照不能刺激PBMC中γδT细胞增殖，而杂交瘤细胞G5-4分泌的单克隆抗体与IMMU510均能有效刺激γδT细胞增殖，2周时纯度能达80％以上，提示杂交瘤细胞G5-4分泌的单克隆抗体是一种功能性抗γδTCR抗体。

(二)重组单链抗体G5-4ScFv的编码基因G5-4ScFv的获得

一、复苏G5-4杂交瘤细胞克隆

用含10％FCS的DMEM培养G5-4杂交瘤细胞至对数生长期，收集细胞。用RNeasy MiniKit(QIGEN)并按试剂盒说明书提供的方法提取RNA。取提取的RNA样品12μl加入Oligo(dT)₁₅(500μg/mL)1μl，70℃加热变性5分钟，取出后立即置于冰上，待冷却后依次加入5×Buffer 5μl、dNTP(10mmol/L)5μl、RNA酶抑制剂1μl，MMLV逆转录酶1μl，总体积为25μl，42℃孵育60分钟，逆转录获得cDNA。

二、PCR扩增抗γδTCR单克隆抗体轻、重链可变区

1、引物设计

根据互补配对的原则设计PCR扩增抗人γδTCR单克隆抗体G5-4轻、重链可变区编码序列的上、下游引物，引物序列见表1和表2。

表1PCR扩增抗人γδTCR单克隆抗体G5-4轻链可变区编码序列的上、下游引物

MKV1	ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG
		MKV2	ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG
MKV3	ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG
		MKV4	ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG
MKV5	ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC
		MKV6	ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG
MKV7	ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG
		MKV8	ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATG
MKV9	ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG
		MKV10	ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT
MKV11	ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC
		MKC	ACTGGATGGTGGGAAGATGG

表2PCR扩增抗人γδTCR单克隆抗体G5-4重链可变区编码序列的上、下游引物

MHV1	ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC
		MHV2	ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT
MHV3	ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT
		MHV4	ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT
MHV5	ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT
		MHV6	ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC
MHV7	ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT
		MHV8	ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG
MHV9	ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG
		MHV10	ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG
MHV11	ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG
		MHV12	ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG
MHC2A	CAGTGGATAGACCGATGGGGC

2、PCR扩增抗人γδTCR单克隆抗体G5-4的轻、重链可变区编码序列

以步骤一所得的cDNA为模板，分别在表1和表2所列引物对MKV(1-11)与MKC、MHV(1-12)与MHC2A，经PCR扩增出抗人γδTCR单克隆抗体G5-4的轻链可变区DNA片断G5-4VL和重链可变区DNA片断G5-4VH。

PCR反应条件为：先94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。产物于4℃保存。

PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4A(G5-4VH：1、Marker；2-13、MHV1-12与MHC2A分别配对的PCR扩增产物；14、阴性对照)和图4B(G5-4VL：1、Marker；2-11、MKV1-11与MKC分别配对的PCR扩增产物；13、阴性对照)所示，经扩增获得了350bp左右的G5-4ScFv轻链可变区DNA片段和330bp左右的G5-4ScFv重链可变区DNA片段，其大小与预期相符。

回收并纯化PCR扩增的G5-4轻链可变区片段G5-4VL和重链可变区片段G5-4VH，将两个DNA片段分别插入克隆载体pEASY-Blunt simple(购自北京全式金生物技术有限公司)中进行测序分析，测序结果表明G5-4重链可变区编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：3所示，由360个碱基组成，编码序列表中SEQ ID No：1所示的氨基酸残基序列，G5-4轻链可变区编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：4所示，由324个碱基组成，编码序列表中SEQ ID No：2所示的氨基酸残基序列。经blast比对，确认为有意义的抗体可变区序列。

3、重组单链抗体G5-4ScFv基因G5-4ScFv的获得

通过搭桥PCR(OverlapPCR)，将步骤2中PCR扩增的G5-4轻链可变区DNA片段G5-4VL和重链可变区DNA片段G5-4VH用柔性连接肽(Gly₄Ser)₃(编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：7所示，柔性连接肽的结构通式为(Gly₄Ser)n，n为1-5的整数，优选为3，连接起来得到重组单链抗体G5-4ScFv的编码基因G5-4ScFv，具体方法为(引物序列见表3)：先通过PCR，分别在G5-4VL 3’端和G5-4VH 5’端连入搭桥片段获得G5-4VL-linker和G5-4VH-linker，G5-4VH-linker的PCR反应体系为：

G5-4VH模板1μl，

G5-4BamH I up for VH或G5-4NdeI up for VH(重链可变区上游引物)1μl，

G5-4VH-linker back(重链可变区搭桥引物)1μl，

dNTP        5μl，

10×Buffer    5μl，

pfu高保真酶    1μl，

去离子水    36μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。

G5-4VL-linker的PCR反应体系为：

G5-4VL模板    1μl，

G5-4VL-linker for(轻链可变区搭桥引物)1μl，

G5-4EcoR I back for VL(轻链可变区下游引物)1μl，

dNTP        5μl，

10×Buffer    5μl，

pfu高保真酶    1μl，

去离子水        36μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。

将上述PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见大小为350-400bp左右的片段，即G5-4VH-linker和G5-4VL-linker，切胶回收。再将G5-4VH-linker和G5-4VL-linker通过OverlapPCR的方法连接起来，Overlap PCR反应体系为：

G5-4BamH I up for VH或G5-4NdeI up for VH(重链可变区上游引物)1μl，

G5-4EcoR I back for VL(轻链可变区下游引物)1μl，

G5-4VH-linker    1μl，

G5-4VL-linker    1μl，

dNTP    5μl，

10×Buffer    5μl，

pfu高保真酶1μl，

去离子水35μl。

OverlapPCR(搭桥PCR)反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示[1、Marker；2、G5-4VL-linker；3、G5-4VH-linker(BamH I)；4、G5-4VH-linker(Nde I)；5、Marker；6、G5-4VH-linker-VL(BamH I)；7、G5-4VH-linker-VL(Nde I)]，经扩增获得了380bp的G5-4VL-linker、399bp的G5-4VH-l inker和750bp的G5-4VH-linker-VL，与预期结果相符。

将G5-4VH-linker-VL的DNA片段插入克隆载体pEASY-Blunt simple(购自北京全式金生物技术有限公司)中进行测序分析，测序结果表明750bp的G5-4VH-linker-VL即为编码重组单链抗体G5-4ScFv的重组G5-4ScFv基因。重组基因G5-4ScFv的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：6所示，由750个碱基组成，编码序列表中SEQ ID No：5所示的氨基酸残基序列。产物于4℃保存。

表3搭桥PCR扩增G5-4ScFv基因的引物序列

G5-4BamH I upforVH	CGCGGATCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGT
		G5-4NdeI up for VH	GGAATTCCATATGATGGAGGTTCAGCTGCAGCAGTC
G5-4VH-linker back	AGAGCCACCGCCACCGCTACCGCCACCGCCGGCTGAGGAGACGGTGAC
		G5-4VL-linker for	CGGTGGCGGTGGCTCTGGTGGTGGTGGCAGCGACATCCAGATGAACCAG
G5-4EcoR I back for VL	GGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCGTTTGATTTCCAGCT

实施例2、重组单链抗体G5-4ScFv的表达及纯化

一、重组单链抗体G5-4ScFv的表达载体及工程菌的构建

取实施例1构建的插入重组基因G5-4ScFv片段且序列正确的重组质粒，分别用BamH I/EcoR I或NdeI/EcoR I进行双酶切，回收750bp的双酶切产物，将回收片段分别与经BamH I/EcoR I或NdeI/EcoR I双酶切的pET22b(+)载体连接，得到重组单链抗体G5-4ScFv的表达载体，分别命名为G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)，双酶切鉴定结果如图6所示(1、Marker；2、BamH I/EcoR I双酶切前；3、BamH I/EcoR I双酶切后；4、Nde I/EcoR I双酶切后；5、Nde I/EcoRI双酶切前)，经酶切获得750bp和约4000bp的DNA片段，与预期结果相符，再经测序无误后，转化TransB(DE3)感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到的阳性克隆即为重组单链抗体G5-4ScFv的表达工程菌，命名为G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB(已于2011年6月24日在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.4983)和G5-4SCFV-PET22b(+)-transB(已于2011年6月24日在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.4984)(其中G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB保留载体信号肽，表达量高，为包涵体形式表达；G5-4SCFV-PET22b(+)-transB去除载体信号肽表达量低，部分以可溶性形式表达)。

二、重组单链抗体G5-4ScFv的表达和纯化

1.G5-4ScFv的诱导表达

1.1G5-4ScFv的小量诱导表达

挑取单克隆工程菌G5-4SCFV-PET22b(+)-transB或

G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB菌落，分别接种于5mL含有氨苄青霉素Amp(浓度为1000mg/L)的LB培养基，37℃摇菌约8h至OD600值达0.4-0.6时，按1∶100的比例接种到另4支含新鲜5mL含有氨苄青霉素Amp(浓度为1000mg/L)的LB培养基的培养管中，37℃继续振荡培养3h至OD600值达到0.4-0.6时，加入不同浓度(200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、1mmol/L)的IPTG进行诱导表达，20℃继续培养16h。培养结束后，离心收集菌体，菌体总蛋白、菌裂解上清和沉淀分别进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，确定目的蛋白是否表达，表达形式及最佳IPTG诱导浓度。

不同浓度IPTG诱导G5-4ScFv的表达情况如图7(1、Marker；2、诱导前；3、200μmol/L IPTG诱导表达产物；4、400μmol/L IPTG诱导表达产物；5、600μmol/LIPTG诱导表达产物；6、1mmol/L IPTG诱导表达产物)所示，菌体总蛋白、菌裂解上清和沉淀的检测结果如图8(1、Marker；2、未诱导菌；3、菌液总蛋白；4、超声上清；5、超声沉淀)所示，200μmol/L IPTG即可有效诱导重组单链抗体G5-4ScFv表达，主要存在于细菌裂解物的沉淀中，裂解上清只能检出少量重组单链抗体G5-4ScFv，提示其主要以包涵体形式表达，少量以可溶性形式表达。

1.2重组单链抗体G5-4ScFv的制备

挑取单克隆工程菌G5-4SCFV-PET22b(+)-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB，分别接种于5mL含有氨苄青霉素Amp(浓度为1000mg/L)的LB培养基，37℃摇菌8h，然后将培养物按1∶100的比例接种至500mL含有氨苄青霉素Amp(浓度为1000mg/L)的LB培养基中，继续37℃摇菌至OD600值达到0.4-0.6时，加入200μmol/L IPTG进行诱导表达，继续20℃培养16h，然后离心收集菌体。

2.重组单链抗体G5-4ScFv的纯化

2.1菌体的超声破碎

工程菌诱导表达后，离心收集菌体，重悬于10倍体积的超声缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂(购自Merck公司)，冰浴条件下超声破碎，工作5秒，间隔10秒，工作99次。菌体裂解物于4℃、12,000g离心20min，分别取上清和沉淀200μl，备后续进行鉴定，其余用于纯化。

2.2包涵体的洗涤

重悬上述沉淀于10倍体积的包涵体洗涤液A[50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，5mmol/L EDTA(pH8.0)，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100]中，冰浴下搅拌30min后，于4℃、12,000g离心20min，取沉淀。重悬于10倍体积的包涵体洗涤液B(500mmol/L NaCl，10mmol/L NaH₂PO₄，10mmol/L Na₂HPO₄，2mol/L尿素，pH7.4)，冰浴下搅拌30min后，于4℃、12,000g离心20min，取沉淀。洗涤后的包涵体用溶液C(500mmol/L NaCl，10mmol/L NaH₂PO₄，10mmol/L，Na₂HP_O4，8mol/L尿素，pH7.4)溶解过夜，于4℃、12,000g离心20min，收集上清。SDS-PAGE分析包涵体纯度。

2.3重组单链抗体G5-4ScFv的亲和柱层析纯化

上述超声后上清或者包涵体溶解液分别进行GE HisTrap HP镍柱层析纯化，具体方法包括以下步骤：

2.3.1GE HisTrap HP镍柱亲和层析：GE HisTrap HP镍柱(购自GE公司)，柱床体积为1mL。

2.3.2超声上清纯化：用10mL蒸馏水清洗柱子；用10mL结合缓冲液(pH7.2的20mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑)平衡柱子，流速为1mL/min；将包涵体溶解液缓慢上样，流速为0.3mL/min；用10-15mL洗涤缓冲液(pH7.2的20mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含40mM咪唑)洗柱子，流速为1mL/min；用10mL洗脱缓冲液(pH7.2的20mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑)洗脱，流速为0.3mL/min，收集洗脱液，4℃保存。

2.3.3层析完成后，用5mL结合缓冲液洗柱子；然后用10mL蒸馏水清洗柱子；再用5mL 20％的乙醇清洗柱子，并将层析柱两端封闭，于4℃保存。

2.3.4包涵体溶解液纯化：步骤与上述超声上清纯化相同，但各缓冲液中均含8mol/L尿素。

2.4透析复性

上清组：透析法置换缓冲体系。经亲和纯化得到的重组蛋白中含有500mM咪唑，将其装入截留分子量为3500的透析袋中，置于PBS中，4℃搅拌透析24h，其间换液4次。

包涵体组：经亲和纯化得到的重组蛋白中含有8mol/L的尿素，将其装入截留分子量为3500的透析袋中，置于含6mol/L尿素的2L透析液(50mM NaCl，50mM Tris，0.5mM EDTA，10％甘油，pH 7.2)中，4℃搅拌透析复性。每隔2h降低复性液中的尿素浓度降低1mol/L，直至透析液中的尿素浓度低于2mol/L时，加入含终浓度为1μmol/L的GSH(谷胱甘肽)和0.2μmol/L的GSSG(还原型谷胱甘肽)的透析液，继续4℃搅拌透析，每隔2h尿素浓度降0.5mol/L，尿素浓度低至0.2mol/L以下时，换成不含尿素的透析液，4℃搅拌透析24h。最终复性率为50％-80％。

透析完毕后，用截流分子量为3000的超滤管将重组蛋白超滤浓缩，用BCA法测蛋白浓度，分装保存于-80℃。

实施例3、重组单链抗体G5-4ScFv的鉴定

针对实施例2得到的重组单链抗体G5-4ScFv进行鉴定。

一、理化性质

质谱分析重组单链抗体G5-4ScFv的分子量，质谱图如图9所示，重组单链抗体G5-4ScFv的分子量为29840.9kD。

二、SDS-PAGE和Western blot鉴定

对实施例2获得重组单链抗体G5-4ScFv进行10％SDS-PAGE检测，结果如图10中的A幅(A：聚丙烯凝胶电泳图。1、Marker；2、G5-4ScFv)所示，表明获得了纯度较高的30kD左右的重组单链抗体G5-4ScFv，与预期结果相符。然后，分别用anti-Histag Ab(His标签抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)和Goatanti-mouse IgG Ab(山羊抗鼠IgG多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)进行Western blot鉴定，结果如图10中B幅(B：Western-blot鉴定(anti-HistagAb)。1、Marker；2、G5-4ScFv)和C幅(C：Western-blot鉴定(Goat anti-mouseIgG Ab)。1、Marker；2、G5-4ScFv)所示，鉴定结果表明所纯化的蛋白大小为30KD左右，带His标签，即得到了目的蛋白。

三、重组单链抗体G5-4ScFv生物学性质的鉴定

1.重组单链抗体G5-4ScFv的结合特性

1.1流式细胞术检测

流式细胞术检测G5-4ScFv与γδT细胞的结合情况，具体方法：取抗体扩增培养两周得到的γδT细胞1×10⁶个，用含1％BSA的PBS洗3遍，分别加入IsotypeControl、IMMU510、G5-4ScFv、D5-3ScFv及S1-9，终浓度为3μg/ml，4℃孵育30分钟；用含1％BSA的PBS洗3遍，加入FITC标记的山羊抗鼠IgG多克隆抗体，4℃孵育30分钟；用含1％BSA的PBS洗3遍，加入300μl 4％多聚甲醛溶液固定。用流式仪进行检测。

结果如图11所示，图示A：Isotype Control(mouse IgG2a Isotype，同型对照，购自Biolegend)；B：IMMU510(购自immunotech公司)，为市售的pan-γδTCR单克隆抗体；C：G5-4ScFv；D：D5-3ScFv，来源于同时获得的另一株分泌pan-γδTCR抗体的杂交瘤，此蛋白分子量为26K左右，但不能与γδT细胞结合，为本实验的阴性对照；E：S1-9为本组表达的带有HIS标签的35K左右的无关蛋白。检测结果表明本发明的G5-4ScFv能与γδT细胞特异性结合。

1.2重组单链抗体G5-4ScFv的竞争结合实验

流式细胞术检测G5-4ScFv和IMMU510与γδT细胞的竞争结合情况，方法为：分别在1×10⁶个纯度大于90％的γδT细胞中加入3μg同型对照(mouse IgG2aIsotype，同型对照，购自Biolegend)(A)、G5-4ScFv(B)、D5-3ScFv(C)于4℃孵育30分钟，洗三遍后加入FITC标记的IMMU510(阳性对照IMMU510(D)进行常规间标法流式细胞术染色检测。结果如图12所示，与同型对照和阴性对照D5-3ScFv相比，G5-4ScFv能有效抑制IMMU510与γδT细胞的结合，提示二者结合位点相近或者相同。

2.重组单链抗体G5-4ScFv刺激γδT细胞增殖

2.1重组单链抗体G5-4ScFv有效刺激PBMC中γδT细胞增殖

分别用5μg/mL的IMMU510、G5-4ScFv或D5-3ScFv包被培养板，加入2×10⁶个新鲜分离的人PBMC，用含IL-2(200U/mL)的RP1640完全培养基培养2周后检测γδT细胞纯度。结果如图13所示(D5-3ScFv(A)、IMMU510(B)和G5-4ScFv(C))，培养PBMC 2周时，G5-4ScFv与阳性对照IMMU510均可使其中γδT细胞增殖，纯度达90％左右，而阴性对照D5-3ScFv组仅为13.6％。

2.2重组单链抗体G5-4ScFv扩增的γδT细胞能有效分泌细胞因子

取分别用固相化G5-4Scfv及IMMU510扩增的纯度大于90％的γδT细胞，在下述条件下A：只加BFA(10μg/mL)、B：PMA(25μg/mL)+离子霉素(1μg/mL)+BFA(10μg/mL)，培养6小时，而后进行细胞内流式染色，检测IFN-γ和TGF-α的分泌情况的变化。结果如图14所示，非刺激条件下(A)G5-4ScFv扩增的γδT细胞与IMMU510扩增的γδT细胞均不分泌IFN-γ和TGF-α；在PMA(25μg/mL)联合离子霉素(1μg/mL)刺激下(B)，G5-4ScFv扩增的γδT细胞分泌IFN-γ的比例是70.3％，分泌TGF-α的比例是98％；IMMU510扩增的γδT细胞分泌IFN-γ和TGF-α的比例分别是67.1％和97.1％。检测结果表明G5-4ScFv扩增的γδT细胞能够在刺激条件下有效分泌细胞因子IFN-γ和TGF-α。

3.重组单链抗体G5-4ScFv扩增的γδT细胞的肿瘤细胞毒功能

通过对人B淋巴细胞瘤(daudi)细胞的杀伤实验检测G5-4ScFv扩增的γδT细胞的细胞毒功能，方法为：分别用G5-4ScFv(斜纹)和IMMU510(灰色)扩增的纯度大于90％的γδT细胞做为效应细胞，检测其不同效靶比时对daudi细胞的杀伤作用。结果如图15所示，G5-4ScFv扩增的γδT细胞能有效杀伤daudi细胞，效靶比为5∶1时杀伤效率大于85％，比IMMU510扩增的γδT细胞的杀伤效率稍高。

综上所述，重组单链抗体G5-4ScFv能与γδTCR特异结合；固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖，2周时其纯度可达90％。扩增得到的γδT细胞在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α，并能有效杀伤肿瘤细胞系：daudi细胞，说明其具有较好的细胞毒作用，可以用于临床上肿瘤的过继免疫治疗。重组单链抗体G5-4ScFv在应用上有以下优势：1、降低免疫原性，提高了临床应用的安全性；2、分子量小，穿透力强，容易进入实体瘤周围的微环境；3、可大批量生产，提高了产量，降低成本。

Claims (10)

1.一种抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体，其重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列。

2.根据权利要求1所述的抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体，其特征在于：所述重链可变区和轻链可变区通过柔性连接肽连接，所述柔性连接肽的氨基酸残基序列的通式为(Gly₄Ser)n，n为1-5的整数，优选为3，其中n为3时的重组单链抗体的氨基酸残基序列如序列表中序列5所示。

3.编码权利要求1或2所述重组单链抗体的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：编码所述具有(Gly₄Ser)₃柔性连接肽的重组单链抗体的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：6所示。

6.含有权利要求3或4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌；具体包括保藏号CGMCC No.4983的重组单链抗体G5-4ScFv的表达工程菌G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB和保藏号CGMCC No.4984的重组G5-4ScFv蛋白的表达工程菌G5-4SCFV-PET22b(+)-transB。

7.一种表达权利要求1所述抗人γδTCR单克隆抗体重组单链抗体的方法，是将权利要求3所述基因插入表达载体中，再将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经表达、纯化得到高活性的抗人γδTCR单克隆抗体重组单链抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体具体为将所述重组单链抗体G5-4ScFv基因插入pET-22b(+)的多克隆位点得到的重组表达载体G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)；转化有G5-4ScFv-PET22b(+)-sp或G5-4ScFv-PET22b(+)的重组大肠杆菌分别为G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-transB；在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为200μmol/L，诱导温度为16-37℃，优选为20℃。

9.权利要求1或2所述的抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体在制备扩增γδT细胞制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体方法为：用5μg/mL的重组单链抗体G5-4ScFv包被培养板，加入2×10⁶个新鲜分离的人PBMC，用含IL-2(200U/mL)的RP1640完全培养基培养2周，得到纯度较高的γδT细胞。

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