CN103204939A - CD147-HAb18MAb复合物晶体结构及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了CD147-HAb18MAb复合物晶体结构及应用。本发明包括HAb18MAb抗体识别的抗原表位信息和HAb18MAb抗体上参与识别抗原表位的氨基酸残基。本发明也包括制备所述晶体、解析所述晶体结构的方法。本发明还包括计算机模建、分子对接的方法确定CD147胞外区活性位点的方法及相应的活性位点。另外还公开了所述晶体的用途，包括基于结构的药物设计，抗体、配体及相互作用分子的筛选和鉴定以及抗体的改造和修饰。

Description

CD147-HAb18MAb复合物晶体结构及应用

技术领域

本发明涉及一种CD147-HAb18MAb复合物的晶体，还涉及用结晶通过X射线衍射确定的立体结构及其用途，更具体的，涉及利用复合物立体结构确定HAb18MAb的抗原表位以及与表位结合相关的CDR区，通过计算机分子模建方法确定其与其它抗体5A12MAb、6H8MAb、配体和相互作用分子复合物的三维结构和活性作用位点，以及利用计算机分子模建的方法识别能与CD147胞外区结合的蛋白、肽类物质和化学物质。还涉及鉴别CD147抑制物及其医用价值。

背景技术

CD147是一种广泛表达的细胞跨膜糖蛋白，分子量为50-60Kd，具有广泛的生理学及病理学意义。其最主要的功能是诱导细胞外基质金属蛋白酶(EMMPRIN)的分泌、与cypA相互作用，介导炎症发生、易化病毒入侵宿主细胞以及介导疟原虫侵入红细胞等。与胚胎发育、肿瘤侵袭、转移，炎症发生、发展，病毒、寄生虫感染扩增等密切相关。

CD147分子广泛表达于造血及非造血细胞系，如造血细胞、上皮细胞、内皮细胞和淋巴细胞。HAb18G/CD147是CD147家族新成员，是一种新的肝癌相关膜抗原，为一高度糖基化的跨膜蛋白分子。利用我室制备、纯化的肝癌单抗HAb18筛选人肝癌细胞cDNA文库，克隆出其相应抗原HAb18G的cDNA片段(长度约1.6kb)。查询GenBank，发现HAb18GcDNA序列与人CD147分子碱基序列高度同源，进一步分析开放读框，表明两者由相同基因编码。在此基础上，本研究中心又从蛋白水平的不同角度证实了这两种分子的一致性。进一步研究发现，CD147是一个肿瘤细胞表面的基质金属蛋白酶诱导因子，可通过成纤维细胞刺激合成基质金属蛋白酶(MarixMetalloproteinases,MMPs)。在既往的研究中，我们通过荷瘤小鼠模型证明不同剂量的碘[¹³¹I]美妥昔单抗注射液有不同的抑瘤效果，中、高组剂量的肿瘤抑制率均和阴性对照组有显著性差异；随后将该单抗标记同位素¹³¹I制成碘[¹³¹I]美妥昔单抗注射液（LICARTIN）治疗原发性肝癌安全、有效。另一个临床研究表明LICARTIN可作为肝癌肝移植后的抗复发药物。随访1年后，治疗组与对照组相比的肝移植术后患者的肝癌复发率下降、生存率提高。以上研究表明，CD147分子是一个治疗肝癌等肿瘤药物的新靶点。

我们用HAb18G/CD147抗体进行广泛的组织谱鉴定，表明该分子高表达于上皮来源的癌组织(69.47%)，良性瘤不表达，胚胎组织及正常组织低表达(分别为2.67%，10.62%)。是一个广谱的癌型特异性的肿瘤标志物。

人CD147是由269个氨基酸组成的蛋白质，属于I型跨膜蛋白家族。从克隆的cDNA序列可知CD147分子的mRNA长度大约1.7Kb，在转录起始位点的相关区域未发现TATA或CAAT盒，但发现转录起始位点位于CpG岛中，尤其在-247-+6核苷酸处较多。N端起始码之前有约115个核苷酸为非编码区，编码区编码269个氨基酸，21个氨基酸为信号肽，中间185个氨基酸构成胞外结构域，从206-229共24个氨基酸为跨膜区，C端39个氨基酸为胞内结构域。胞外4个半胱氨酸形成2个二硫键构成IgSF典型的半球型结构域(C⁴¹，C⁸⁷，C¹²⁶，C¹⁸⁵)。此外，胞膜外区还有三个相似的N-糖基化天冬酰氨序列，糖基化作用决定了CD147分子刺激MMP的活性，纯化的去糖基化CD147分子不能诱导MMP的活性且具有拮抗其天然分子的活性的特点，用Endo-F糖苷酶消化可使CD147分子量减少大约30KD，表明CD147分子的糖基化主要以N-连接的寡聚糖方式存在。

跨膜区的24个氨基酸残基在人、鼠、鸡中CD147分子中高度保守，提示CD147分子的跨膜片段扮演着重要的功能角色，在不同种属中体现出功能的相似性。在跨膜区的中间部位存在有带电荷的谷氨酸残基，这在其它的膜蛋白分子中是不常见的，揭示CD147分子可以与其它的跨膜蛋白相互联系。跨膜区包括3个亮氨酸残基(L²⁰⁶、L²¹³、L²²⁰)和1个苯丙氨酸残基(F²²⁷)，且每隔7个氨基酸残基出现一次，为典型的亮氨酸拉链结构。跨膜区的带电残基及亮氨酸拉链结构是一个潜在的蛋白相互作用基序，很可能介导CD147分子参与形成信号转导多肽链或膜转运蛋白成份。

对胞内结构域的研究，目前尚无全面的分析，Schlosshauer-B等曾用双标记实验检测到CD147与F-肌动蛋白(actin)共同存在，发现膜表面CD147的表达与细胞骨架中微丝蛋白有关。而是否有磷酸化位点，如何传递信号等功能尚为未知。

CD147基因由8个外显子编码，总长度10.8Kb。Exon1(aa1~23,107bp)与Exon2(aa2~75,154bp)被Intron1(约6.5Kb)隔开，该内含子是EMMPRIN基因中最大的内含子序列。Intron2大约700bp，是基因中第二大干扰序列。Exon3(aa76~102,83bp)与Exon4(aa103~148,138bp)被300bp的Intron3所分隔开。Intron4大约650bp；Exon5(aa149~240,276bp)；Intron5约550bp；Exon6(aa241~249,25bp)非常短；Intron6约250bp；Exon7(aa250~269,69bp)；Intron7约300bp,最后一个外显子是Exon8，为736bp。Exon1编码5’非翻译区(5’-UTR)和信号肽。Exon2和Exon3编码第一个Ig1结构域：Exon2编码52个密码子，约占Ig1的66%，Exon3编码27个密码子，约占Ig的34%。Exon4和Exon5编码第二个Ig结构域：Exon4编码46个密码子，约为45%，Exon5是“结合”外显子，编码剩余55%的Ig结构域，以及跨膜结构域的24氨基酸残基和一小部分胞内结构域。Exon6和7编码胞内结构域，Exon7也编码终止密码子和3’-UTR的5个核苷酸残基。Exon8编码剩余的3’UTR。

CD147分子是一个潜在的粘附分子，CD147与N-CAM、I-CAM及其他相关IgSF亚群分子在功能上有相似的特性，参与细胞与细胞、细胞与基质的粘附。已有实验证明CD147分子可与Integrin家族α3β1、α6β1形成蛋白复合物，但关于复合物的功能目前还不清楚，可能与肿瘤细胞与细胞外基质及肿瘤细胞与间质细胞之间的粘附有关；另有实验表明：某些CD147单抗可抑制雌激素依赖的乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-435的同型聚集，以及MCF-7细胞对Ⅳ型胶原、FN、LN的粘附。CD147分子是一个新的细胞表面粘附分子，介导细胞粘附作用。这类分子的表达及在肿瘤中的作用是目前肿瘤研究的一个重点。

HAb18MAb是我中心制备的HAb18杂交瘤细胞株（中国，北京，中关村，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号：CGMCC NO.0426，1999年12月6日）产生的鼠源性抗CD147单克隆抗体，体内外实验均证实HAb18MAb能够显著抑制肝癌细胞侵袭和转移。以HAb18MAb为基础研发的“利卡汀”是全球第一个应用于原发性肝癌的抗体靶向治疗药物。临床试验表明“利卡汀”对中晚期肝癌具有良好的治疗效果，能显著延长患者的生存期。

蛋白质的生物学功能在很大程度上取决于其空间结构，蛋白质结构构象多样性导致了不同的生物学功能。蛋白质结构与功能关系研究是进行蛋白质功能预测及蛋白质设计的基础。蛋白质分子只有处于它自己特定的三维空间结构情况下，才能获得它特定的生物活性；三维空间结构稍有破坏，就很可能会导致蛋白质生物活性的降低甚至丧失。例如，血红蛋白与氧分子的结合、酶与其底物的结合、激素与受体的结合以及抗体与抗原的结合等。知道了基因密码，科学家们可以推演出组成某种蛋白质的氨基酸序列，却无法绘制蛋白质空间结构。随着近年来在结构生物学方面的进展，用X射线衍射或NMR分析，使用立体结构和分子设计技术，已揭示了许多蛋白质以及蛋白质复合物的立体结构。对于蛋白质以及蛋白复合物空间结构的了解，将有助于明确蛋白质的功能机制。同时，蛋白质是药物作用的靶标，联合运用基因密码知识和蛋白质结构信息，药物设计者可以设计出小分子化合物，抑制与疾病相关的蛋白质以及蛋白质复合物，进而达到治疗疾病的目的。

CD147-HAb18MAb抗原抗体复合物结构的阐明，在为疾病的治疗或诊断试剂的设计中具有重要作用。在本发明之前，CD147促进肿瘤进展、调节肿瘤细胞浸润转移、介导炎症发生、易化病毒入侵宿主细胞等的机制并不十分明确，HAb18MAb的抗原表位及其抑制肿瘤侵袭转移的分子机制并不十分清楚。因此，尽管有关于CD147及其单抗HAb18MAb的一般功能与作用的知识，但是为治疗或诊断疾病（例如肝癌）而进行的试剂研发、抗体改造则因为缺乏相应的结构信息而受到限制。

因此，有必要阐明CD147分子与其单克隆抗体HAb18MAb形成的复合物的三维结构并建立其模型，这将明确CD147分子与HAb18MAb单抗的结合位点，有助于确定CD147分子与整合素、CyPA、AnnexinⅡ等作用分子相互作用的活性位点，以便利用结构和模型来辅助疾病治疗策略，譬如基于结构的药物设计。

本文所用的术语“蛋白质的立体结构”指某些条件下蛋白质氨基酸序列确定的蛋白质的三维结构，即具有氨基酸序列的蛋白质在某些条件下折叠而成的三维结构。可用X射线衍射的方法或NMR确定蛋白质的结构。

发明内容

本发明涉及CD147胞外区与其单克隆抗体HAb18MAb Fab段形成的抗原抗体复合物晶体的结构，以及从该结构得到的CD147与HAb18MAb的活性作用位点，以及这些结构、活性作用位点的应用。本发明者是第一个阐明CD147胞外区与其单克隆抗体HAb18MAb Fab段形成的抗原抗体复合物的三维结构及活性作用位点，并为针对该活性作用位点的药物设计提供三维模型。

相应地，本发明的一个目的是，为确定CD147-HAb18MAb复合物的三维结构提供足够质量的晶体。本发明也包括培养CD147-HAb18MAb复合物晶体的方法。

本发明的第二个目的是提供了关于CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构信息。这些信息为设计和生产在动物体内（包括人）调节肿瘤发生、发展及抑制肿瘤转移等方面的抗体、肽类物质、蛋白物质、小分子物质（包括化学物质）提供了一种方式（即基于结构的药物设计）。譬如，通过各种计算机软件和模型，可以设计上述物质来抑制CD147分子的生物学活性，从而达到抑制肿瘤进展、炎症发生、病毒以及寄生虫入侵宿主细胞等。

相应地，本发明的第三个目的是提供一种方法，其利用所获得的CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构信息，结合定点突变和功能实验等手段确定CD147分子胞外区的活性位点，及由该活性位点的氨基酸序列、结构等信息来设计用于治疗和诊断疾病的试剂。

相应地，本发明的第四个目的是提供利用CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构信息来设计、制备能与CD147胞外区结合并抑制或刺激CD147生物学活性的抗体、蛋白物质、肽类物质或小分子物质（化学物质）等。该抑制性或刺激性物质由以下几点的方法确定：(a)提供CD147-HAb18MAb复合物的三维结构；(b)明确CD147分子胞外区的活性位点；(c)使用活性位点结构信息设计抗体、蛋白类物质、肽类物质或小分子物质（化学物质）等；(d)合成该种物质；及(e)评估合成的所述物质改变CD147介导的胚胎发育、肿瘤侵袭、转移，炎症发生、发展，病毒、寄生虫（如疟原虫等）感染扩增等。

本发明包括一种CD147胞外区与鼠源抗CD147单克隆抗体HAb18MAbFab段的复合物CD147-HAb18Mab的晶体，该晶体具有单斜晶系中的空间群P21和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列；所述晶体具有符合下表的三维结构。

表1

括号内数据指最高分辨率壳层的相应数据；

^aR_merge=(∑|I_i–<I_i>|)/∑|I_i|，其中I_i是给定衍射点的积分强度；

^bR_cryst=(∑||F_o|–|F_c||)/∑|F_o|，其中F_o和F_c分别指测量得到的和计算得到的结构因子；

^cR_free与R_cryst计算方式相同，但采用的数据来自随机选取的5%校验点集。

该晶体具有四棱柱形的晶胞，在一个不对称单位内有两个CD147分子，两个单抗HAb18MAb的Fab段，分子量之和约为148.8±0.5kD，溶剂含量约52±1%。在该复合物晶体中，CD147靠近N端的C2-set结构域与单抗HAb18MAb的Fab段形成了抗原抗体复合物。CD147胞外区序列来源于人，HAb18MAb是鼠源性抗CD147单克隆抗体。

CD147胞外区与HAb18MAb Fab段相互作用的位点位于该蛋白N端C2-set结构域，参与表位的残基为：Leu33，Val61，Leu62，Asp65，Leu67，Lys71，Glu73，Lys75；抗体HAb18MAb上参与识别抗原表位的残基包括重链上的Asp50，Trp52，Ser72，Asn75，Arg119，以及轻链上的Asn51，Asp52，Phe69，Tyr70。

本发明也包括一种鉴别能与CD147胞外区结合的物质的方法，包括用CD147晶体浸泡可能的小分子化合物并共结晶、以及采用测定分子间相互作用的方法筛选可能的配体或拮抗剂及通过计算机模建方法利用CD147晶体结构与可能的配体进行三维结构比对、设计、对接。

本发明还包括一种利用计算机辅助三维模建、分子对接技术选择及确定CD147胞外区抗体、配体及其它相互作用分子的方法，包括如下步骤：(1)通过计算机三维模建CD147胞外区与可能的抗体、配体及其它作用分子的三维结构；(2)CD147胞外区三维结构和抗体、配体及其它相互作用分子三维结构的对接；(3)评估抗体、配体及其它作用分子的三维结构是否能与CD147功能性表位的三维结构结合；(4)CD147胞外区生物活性位点的分析。

本发明包括一种利用计算机辅助三维模建、分子对接技术选择及确定CD147胞外区抗体、配体及其它相互作用分子的方法，基于CD147-HAb18MAb复合物晶体结构设计、研发、改造的抗体、配体及其它作用分子作为试剂、拮抗物、模拟物或药物。

本发明包括一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助方法，（1）该方法包括：a.提供一种CD147-HAb18MAb复合物晶体，其中所述晶体表现为一种基本符合表1的三维结构；b.用所述晶体的结构信息设计一种抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质；c.合成所述的抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质。d.评估上述的合成的抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质等的生物活性。（2）其中所述的设计步骤包括计算机筛选一个或多个化学化合物数据库，其中所述化合物的三维结构是已知的。（3）该方法进一步包括让所述筛选步骤鉴定出的化合物与所述计算机模型相互作用。（4）其中所述的设计步骤包括定向药物或随机药物设计。（5）其中所述的设计步骤包括筛选出那些被预测为能够结合所述CD147胞外区功能性表位三维结构的化合物。（6）其中所述的生物活性指：与所述CD147蛋白结合，抑制或激活所述CD147蛋白活性。

本发明为确定CD147-HAb18MAb复合物的三维结构提供足够质量的晶体，也为培养CD147-HAb18MAb复合物晶体提供了方法。本发明所提供的关于CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构信息，将为设计和生产在动物体内（包括人）调节炎-癌疾病的发生、发展等方面的抗体、肽类物质、蛋白物质、小分子物质（包括化学物质）提供了一种方式（即基于结构的药物设计）。譬如，通过各种计算机软件和模型，可以设计上述物质来抑制CD147分子的生物学活性，从而达到抑制肿瘤进展、炎症发生、病毒及寄生虫入侵宿主细胞等。同时，利用所本发明所提供的CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构信息，结合定点突变和功能实验等手段可确定CD147分子胞外区的活性位点，及由该活性位点的氨基酸序列、结构等信息来设计用于治疗和诊断疾病的试剂。此外，本发明所提供的CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构信息可用来设计、制备能与CD147胞外区结合并抑制或刺激CD147生物学活性的抗体、蛋白物质、肽类物质或小分子物质（化学物质）等。

附图说明：

图1.CD147-HAb18MAb复合物晶体结构示意图

图2.K63A突变体的表达。

图3.K63A突变体的纯化。

图4.Western blot法检测K63A突变体与HAb18MAb的亲和力。

中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：中国，北京，中关村邮编：100080

保藏的培养物名称：抗人肝癌单克隆抗体Hab18杂交瘤细胞株

保藏编号：CGMCC NO：0426

保藏日期：1999年12月6日

具体实施方式

本发明涉及如下发现：CD147胞外区与其抗体HAb18MAb形成的抗原抗体复合物晶体的结构、从结构得到的CD147活性作用位点，以及一种基于这种结构的药物设计方法、由这些方法确认的抗体、蛋白物质、肽类物质、小分子物质、以及这些物质在治疗诊断中的应用、以及CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构、活性作用位点的应用。需要说明的是，本文的术语如权利要求中所述的本发明中CD147-HAb18MAb复合物晶体的氨基酸序列的“同系物”、“片段”、“变异体”、“类似物”、“衍生物”指从本发明所提供的已形成晶体CD147-HAb18MAb复合物的氨基酸序列中取代、变异、更改、替换、删除或增加一个或多个氨基酸残基后所形成的分子，或指从本发明所提供的已形成晶体CD147-HAb18MAb复合物氨基酸序列选取一段序列后所形成的分子。

本发明中“变异体”指添加、删除或置换野生型CD147胞外区、HAb18MAb序列或CD147胞外区、HAb18MAb序列片段中的氨基酸残基。本发明CD147-HAb18MAb复合物晶体的氨基酸序列的变异体可能包括（1）删除序列中任意一位或多位氨基酸残基，（2）用一个或多个氨基酸残基置换序列中任意一位或多位氨基酸残基。

本发明中“同系物”指氨基酸序列上的相似性，即将本发明中CD147-HAb18MAb复合物晶体的氨基酸序列与其它氨基酸序列进行比对，如果二者氨基酸序列间有至少70%相同，则认为二者为同系物。比对方法可单凭肉眼，也可通过计算机软件如CLUSTAL等，进行同源性比对。

本发明中“片段”指本发明所提供的CD147-HAb18MAb复合物晶体的氨基酸序列中的任意一段，并且此段可被结晶。

本发明中“类似物”指与本发明所提供的CD147-HAb18MAb复合物晶体的氨基酸序列相似，且不会损害氨基酸结晶能力的氨基酸置换或删除。

本发明中“衍生物”指针对本发明所提供的CD147-HAb18MAb复合物晶体的氨基酸序列进行化学修饰后所形成的氨基酸序列，如取代烷基、酰基或氨基上的氢等。

本发明所述的CD147-HAb18MAb复合物晶体不仅指天然存在的CD147分子晶体或用野生型CD147分子与HAb18MAb抗体Fab段形成的复合物通过结晶所成的晶体，也包括野生型CD147分子的突变体所形成的与野生型CD147分子具有相同三维结构的晶体。野生型CD147分子的突变体可为：取代野生型CD147分子中至少一个氨基酸残基、加入/删除野生型CD147分子肽链中的氨基酸或在野生型CD147分子肽链的N末端或C末端填加/删除氨基酸。

本发明所述的CD147-HAb18MAb复合物晶体也包括与HAb18MAb抗体具有相同三维结构的HAb18MAb抗体突变体与CD147分子所形成的复合物的晶体。HAb18MAb抗体突变体可为：取代HAb18MAb抗体分子中至少一个氨基酸残基、加入/删除HAb18MAb抗体分子轻链和/或重链中的氨基酸或在HAb18MAb抗体分子轻链和/或重链的N末端或C末端添加/删除氨基酸。

在一个实施方案中，CD147-HAb18MAb复合物晶体具有晶胞常数：

α=γ=90°，β=91.5°。另外，本发明提供了一种制备CD147-HAb18MAb复合物晶体的方法，包括以下步骤：将CD147胞外区基因序列克隆至pET21a(+)原核表达系统，在origami B（DE3）菌株中表达，纯化出CD147胞外区蛋白；将HAb18MAb抗体用木瓜蛋白酶酶切后，纯化Fab段；将纯化的CD147胞外区蛋白与纯化的HAb18MAb抗体Fab段4℃孵育，而后纯化复合物。提供5-20mg/ml的CD147-HAb18MAb复合物溶液；混合CD147-HAb18MAb复合物溶液和池液；让混合物溶液放置一段时间，直到CD147-HAb18MAb复合物晶体在溶液中形成并长到预定的大小或更大。

在另一个实施方案中，利用X-射线衍射法确定CD147-HAb18MAb复合物晶体的三维结构，具体方法如下：在同步辐射光源（Advanced Photon Source,USA）的19ID光束线收取了复合物晶体的衍射数据（

分辨率），并以HKL2000软件包进行数据处理。相位问题的解决采用分子置换法（MolecularReplacement,MR），以CD147的晶体结构（PDB号3B5H）和鼠源抗体Fab段的晶体结构（PDB号2I9L中的A链和B链）为初始模型。得到的初步结构模型后首先按照HAb18MAb的氨基酸序列进行置换，然后通过phenix.refine程序进行倒易空间修正，并在coot程序中进行正空间手工调整。经过若干轮修正和添加水分子之后，得到最终的复合物结构模型。

一个基本上符合权利要求1的CD147-HAb18MAb复合物的三维结构可利用合适的计算机建模程序如WAM（Web Antibody Modeling）来模拟计算。这种模拟计算需要使用一些信息，如：(1)CD147胞外区的氨基酸序列；(2)HAb18MAb抗体Fab段的氨基酸序列；(3)与具有三维结构的蛋白的相关部分的氨基酸序列；(4)特定三维结构的信息。与本发明CD147胞外区或HAb18MAb抗体Fab段的三维结构基本上相符的其它类型的CD147胞外区（CD147胞外区的突变体、片段、衍生物、变异体、类似物或同源物）或HAb18MAb抗体Fab段（HAb18MAb抗体Fab段的突变体、片段、衍生物、变异体、类似物或同源物）的三维结构也能够用分子替代的方法进行计算，详见下述。

表1

括号内数据指最高分辨率壳层的相应数据；

^aR_merge=(∑|I_i–<I_i>|)/∑|I_i|，其中I_i是给定衍射点的积分强度；

^bR_cryst=(∑||F_o|–|F_c||)/∑|F_o|，其中F_o和F_c分别指测量得到的和计算得到的结构因子；

^cR_free与R_cryst计算方式相同，但采用的数据来自随机选取的5%校验点集。

上表中列出了一个合适的用于模拟或计算另一个CD147胞外区蛋白的三维结构的CD147胞外区蛋白的三维结构。根据本发明，本领域的技术人员可通过该三维结构模拟或计算出与本发明所述的CD147胞外区氨基酸序列相似的CD147胞外区突变体、片段、衍生物、变异体、类似物或同源物蛋白的三维结构。这些技术是基于从CD147胞外区晶体分析得到的信息。因此，晶体CD147胞外区三维结构的发现，使得可以使用本领域的一些常规技术来衍生CD147胞外区突变体、片段、衍生物、变异体、类似物或同源物的三维结构和模型。任何CD147胞外区突变体、片段、衍生物、变异体、类似物或同源物的结构的衍生甚至可以在没有关于其晶体结构数据的情况下得以实现。而且，当某种CD147胞外区突变体、片段、衍生物、变异体、类似物或同源物的晶体结构时，使用已有的从本发明CD147胞外区结构得到的信息，可以对新的CD147胞外区突变体、片段、衍生物、变异体、类似物或同源物的三维结构的模拟进行优化。本发明的新发现使得确定CD147胞外区与其它抗体、整合素、CyPA及其它相互作用分子的活性位点，以及基于结构的药物设计、药物筛选变得现实起来，这样设计、筛选出来的抗体、蛋白类物质、肽类物质或小分子物质（化合物）有效地影响CD147分子的活性。并且，本发明为HAb18MAb抗体以及与HAb18MAb抗体具有相似表位的其它抗体的修饰、改造和优化提供了模型。

利用本发明所述的CD147-HAb18MAb复合物晶体结构，有助于筛选CD147抗体、配体及其它相互作用分子，及相应的活性作用位点，特别是筛选CD147的抑制性或激活性分子，如抗体、肽、蛋白、化学分子等，此外该模型将有助于HAb18MAb抗体以及与HAb18MAb抗体具有相似表位的其它抗体的修饰、改造、优化。如针对CD147胞外区晶体的活性结合位点，利用计算机设计、筛选能与之结合的试剂、拮抗物及药物等。基于结构的药物设计是指用计算机模拟来预测一种抗体、肽、多肽、蛋白质、化学物质与蛋白构象的相互作用。通常，对一种能与治疗用抗体、肽类物质、蛋白物质、化学分子有效地相互作用的蛋白质而言，需要将该治疗用化合物的三维结构推想为一种相容构象以确保二者的结合。所述蛋白质的三维结构知识可保证本领域技术人员能设计出具有相似构象的诊断、治疗用抗体、肽类物质、蛋白物质或化学分子。如CD147胞外区与抗体HAb18MAb结合位点的信息能使本领域技术人员设计出一种能与CD147结合的抗体、肽类、蛋白物质或化合物，且该抗体、肽类、蛋白物质或化合物能抑制CD147的生物学活性。

CD147-HAb18MAb复合物三维结构的测定为CD147分子胞外区上可能的活性位点的确定提供了重要信息。结构信息有助于针对分子上活性位点设计CD147分子的抑制物。例如，利用计算机技术鉴定能与活性位点结合的配体，或进行药物设计，或利用X-ray晶体衍射分析鉴定并定位结合配体的结合位点。

Greer等人利用计算机模型的重复序列、蛋白-配体复合体结构和X-ray衍射方法，设计出胸腺嘧啶核苷酸抑制物。因此，CD147分子的抑制物也可通过此种方法进行设计。例如，利用本发明所提及的CD147-HAb18MAb复合物的三维结构，通过计算机模建的方法，设计可与本发明所提及的功能活性位点或是三维结构上其它位点结合的抗体、蛋白分子、肽类分子、小分子物质等，然后合成该种物质，与CD147形成复合物，再利用X射线晶体衍射的方法分析复合物，从而获得真实的结合位点。根据X射线晶体衍射分析的结果，可对配体的结构和/或功能基团进行必要的调整，直至获得最优化的物质分子。

此外，根据CD147-HAb18MAb复合物三维结构的结果还可利用多种计算机软件进行推理性药物设计，从而设计出CD147分子的抑制物。如利用自动化的配体-受体对接软件(Jones et al.in Current Opinion in Biotechnology,Vol.6,(1995),652-656)。

以上所述的基于结构的药物设计方法均需要首先确定能与靶生物分子相互作用的物质。有时，此种物质是可从文献中获得。然而，大多数针对靶分子的抑制物是未知的，或是希望发现新的针对靶分子的抑制物。此时，首先要在数据库中进行筛选(如the Cambridge Structural Database)能与靶分子的活性位点或位点相互作用的化合物。在靶分子活性位点未知的情况下，筛选标准通常为药物代谢动力学特性，如代谢稳定性和毒性等。然而，CD147-HAb18MAb复合物结构的确定，将有助于揭示CD147胞外区活性位点的结构信息，从而通过该分子活性位点的结构和特性进行筛选。筛选标准可为：潜在的抑制剂能否与CD147胞外区活性位点形成三维的药效结构。

本发明的一个实施方案是利用计算机辅助三维模建、分子对接技术选择及确定CD147胞外区抗体、配体及其它相互作用分子的方法，其中包括：(1)提供一种蛋白质结构，包括本发明的CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构；并利用计算机三维模建预测可能性抗体、配体及其它作用分子的三维结构；(2)CD147胞外区三维结构和其它抗体、配体及其它相互作用分子三维结构的对接；(3)评估抗体、配体及其它作用分子的三维结构是否能与CD147胞外区活性位点的三维结构结合；进一步分析包括(4)CD147胞外区抗体、配体及其它作用分子与CD147生物学活性分析；(5)是否CD147胞外区抗体、配体及其它作用分子可以调节CD147的生物学功能。

本发明的另一个实施方案是基于结构的计算机辅助的药物设计方法，其中包括：(1)提供一种蛋白质结构，包括本发明的一种CD147-HAb18MAb复合物三维结构或模型；(2)用三维结构或模型设计一种抗体、肽类、蛋白物质或化合物；(3)合成该抗体、肽类、蛋白物质或化合物。

本发明的配体、相互作用分子或抑制性抗体、肽、蛋白、化学分子可通过本领域技术人员所知的各种方法鉴定。如将配体、相互作用分子或抗体、肽、蛋白、化学分子与CD147胞外区蛋白结合，或相互作用，可以在溶液中或细胞上的CD147蛋白进行确定，如免疫分析（如酶联免疫吸附分析，ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或结合分析（如表面等离子共振技术，酵母双杂交，噬菌体肽库或抗体库技术）进行筛选、鉴定。

实施例：

用下列实例更详细的描述本发明。提供这些实例是为了说明本发明，而不是为了限制本发明

实施例一、CD147-HAb18MAb复合物晶体的生成及晶体结构的解析

1、CD147胞外区的制备及纯化

1）载体:pET21a(+),NdeI/XhoI cloning sites

2)宿主细胞:OrigamiB（DE3）

3）表达：1mM IPTG,20℃,overnight

纯化

1）HiTrap Q Hp,20mM Tris pH8.0w/wo1M NaCl

2）Mono Q HR10/10,20mM Tris pH8.0w/wo1M NaCl

3）HiLoadTM16/60Superdex75prep grade,20mM Tris pH8.0,150mMNaCl

2、HAb18MAb抗体Fab的制备和纯化

1）本室采用杂交瘤细胞表达HAb18MAb抗体；

2）采用亲和层析法纯化HAb18MAb抗体；

3）采用木瓜蛋白酶酶切HAb18MAb抗体，纯化Fab段。

3、CD147-HAb18MAb复合物的制备

1）将纯化后的CD147胞外区蛋白和纯化后的HAb18MAb抗体Fab段混合后在4℃孵育；

2）采用分子筛纯化CD147-HAb18MAb复合物。

3、蛋白结晶

悬滴扩散法（hanging-drop vapor diffusion procedure）

1）蛋白浓度：5-20mg/ml

2）生长周期:3～4周，4℃。

4、结构测定

X-Ray衍射和数据收集

在同步辐射光源（Advanced Photon Source,USA）的19ID光束线收取了复合物晶体的衍射数据（

分辨率），并以HKL2000软件包进行数据处理。相位问题的解决采用分子置换法（Molecular Replacement,MR），以CD147的晶体结构（PDB号3B5H）和鼠源抗体Fab段的晶体结构（PDB号2I9L中的A链和B链）为初始模型。得到的初步结构模型后首先按照HAb18MAb的氨基酸序列进行置换，然后通过phenix.refine程序进行倒易空间修正，并在coot程序中进行正空间手工调整。经过若干轮修正和添加水分子之后，得到最终的复合物结构模型。如表1和图1所示。

实施例二、HAb18MAb关键表位的确认（以CD147胞外区K63氨基酸为例）

1、根据CD147-HAb18MAb复合物晶体的结构信息，初步确定HAb18MAb的抗原表位包括CD147胞外区的K63位氨基酸残基。

2、设计并合成突变引物。

上游引物：5’GGGCGTGGTGCTGGCGGAGGACGCGCTG3’

下游引物：5’CAGCGCGTCCTCCGCCAGCACCACGCCC3’

3、采用定点突变的方法构建包含63位突变（K63A）的CD147胞外区原核表达载体。

4、K63A突变体的表达和纯化。20℃诱导16小时后，与未诱导组相比，诱导组在21KD处可见大量目标蛋白表达（参见图2）。

1）载体:K63A-pET21a(+),NdeI/XhoI cloning sites

2)宿主细胞:OrigamiB（DE3）

3）表达：1mM IPTG,20℃,overnight

采用多步纯化后，突变体蛋白的纯度可达到95%以上（参见图3）。

1）HiTrap Q Hp,20mM Tris pH8.0w/wo1M NaCl

2）Mono Q HR10/10,20mM Tris pH8.0w/wo1M NaCl

3）HiLoadTM16/60Superdex75prep grade,20mM Tris pH8.0,150mMNaCl

5、采用Western blot的方法鉴定K63A突变体与HAb18MAb的亲和力。K63A突变体与HAb18MAb的亲和力明显下降，说明K63在CD147与HAb18MAb的结合中起重要作用（参见图4）。

Claims (10)

1.一种CD147胞外区与鼠源抗CD147单克隆抗体HAb18MAb Fab段的复合物CD147-HAb18Mab的晶体，其特征在于，该晶体具有单斜晶系中的空间群P2₁和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列；所述模型具有符合下表的三维结构；

括号内数据指最高分辨率壳层的相应数据；

^aR_merge=(∑|I_i–<I_i>|)/∑|I_i|，其中I_i是给定衍射点的积分强度；

^bR_cryst=(∑||F_o|-|F_c||)/∑|F_o|，其中F_o和F_c分别指测量得到的和计算得到的结构因子；

^cR_free与R_cryst计算方式相同，但采用的数据来自随机选取的5%校验点集。

2.如权利要求1所述的复合物CD147-HAb18Mab晶体，其特征在于：（1）该晶体具有四棱柱形的晶胞，在一个不对称单位内有两个CD147分子，两个单抗HAb18MAb的Fab段，分子量之和约为148.8±0.5kD，溶剂含量约52±1%；（2）CD147-HAb18MAb晶体的三维空间结构特点：CD147靠近N端的C2-set结构域与单抗HAb18MAb的Fab段形成了抗原抗体复合物；（3）CD147胞外区序列来源于人，HAb18MAb是鼠源性抗CD147单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的复合物CD147-HAb18Mab晶体，其特征在于，CD147胞外区与HAb18MAb Fab段相互作用的位点位于该蛋白N端C2-set结构域，参与表位的残基为：Leu33，Val61，Leu62，Asp65，Leu67，Lys71，Glu73，Lys75；抗体HAb18MAb上参与识别抗原表位的残基包括重链上的Asp50，Trp52，Ser72，Asn75，Arg119，以及轻链上的Asn51，Asp52，Phe69，Tyr70。

4.一种鉴别能与CD147胞外区结合的物质的方法，其特征在于，包括用CD147晶体浸泡可能的小分子化合物并共结晶、以及采用测定分子间相互作用的方法筛选可能的配体或拮抗剂及通过计算机模建方法利用CD147晶体结构与可能的配体进行三维结构比对、设计、对接。

5.一种利用计算机辅助三维模建、分子对接技术选择及确定CD147胞外区抗体、配体及其它相互作用分子的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)通过计算机三维模建CD147胞外区与可能的抗体、配体及其它作用分子的三维结构；(2)CD147胞外区三维结构和抗体、配体及其它相互作用分子三维结构的对接；(3)评估抗体、配体及其它作用分子的三维结构是否能与CD147功能性表位的三维结构结合；(4)CD147胞外区生物活性位点的分析。

6.如权利要求5所述的一种利用计算机辅助三维模建、分子对接技术选择及确定CD147胞外区抗体、配体及其它相互作用分子的方法，其特征在于：基于CD147-HAb18MAb复合物晶体结构设计、研发、改造的抗体、配体及其它作用分子作为试剂、拮抗物、模拟物或药物。

7.一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助方法，其特征在于：该方法包括：

a.提供一种CD147-HAb18MAb复合物晶体，其中所述晶体表现为一种基本符合表1的三维结构；

b.用所述晶体的结构信息设计一种抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质；

c.合成所述的抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质；

d.评估上述的合成的抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质等的生物活性。

8.如权利要求7所述的一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助方法，其特征在于：其中所述的设计步骤包括计算机筛选一个或多个化学化合物数据库，其中所述化合物的三维结构是已知的。

9.如权利要求8所述的一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助方法，其特征在于：该方法进一步包括让所述筛选步骤鉴定出的化合物与所述计算机模型相互作用。

10.如权利要求7所述的一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助方法，其特征在于：（1）其中所述的设计步骤包括定向药物或随机药物设计；（2）其中所述的设计步骤包括筛选出那些被预测为能够结合所述CD147胞外区功能性表位三维结构的化合物；（3）其中所述的生物活性指：与所述CD147蛋白结合，抑制或激活所述CD147蛋白活性。

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