CN103622938B - 3-{2-[([1,1′-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了3-{2-[([1,1′-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的抗肿瘤应用。本发明通过结构生物学、生物信息学和生物学活性验证相结合的候选药物筛选平台,筛选出3-{2-[([1,1′-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚这种小分子化合物,能够应用于抗肿瘤领域,或与其它药物和手段联合应用于抗肿瘤领域。3-{2-[([1,1′-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚能够靶向抑制HAb18G/CD147蛋白,能够应用于制备与HAb18G/CD147蛋白高表达相关疾病(如肿瘤,尤其是肝癌)的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域,具体涉及3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的抗肿瘤应用。
背景技术
肝癌是严重威胁人类生命健康的疾病之一,死亡率极高。目前治疗肝癌的常用手段为手术治疗、放化疗等。然而多数患者就诊时已进入晚期,不适宜手术切除,而放化疗的远期疗效亦均较差。近年来,随着现代分子生物学、蛋白组学的不断发展,肝癌的分子靶向治疗逐渐兴起,并引起广泛关注和高度重视。分子靶向治疗是以肝癌细胞特异性分子标志物为靶点,选择相应的阻断剂,达到抑制肝癌生长、转移等功效。因此,寻找高特异性的标志物分子是分子靶向治疗方法的前提和关键所在。
CD147分子,又称为基质金属蛋白酶诱导因子,是细胞膜表面的糖蛋白分子,属于免疫球蛋白超家族的一员。研究表明,CD147分子在肺癌、肝癌、乳腺癌等诸多肿瘤中高表达,并参与了肿瘤的发生发展、代谢、迁移运动和侵袭转移等生物功能。HAb18G/CD147分子是用肝癌单克隆抗体HAb18筛选人肝癌cDNA文库获得的一个新的肝癌相关抗原,高表达于人肝癌组织和一些高转移性肝癌细胞表面,属于CD147家族新成员。研究表明,该分子是一个新型通用型、有较好癌特异性的标志物。因此,HAb18G/CD147有望成为新药筛选的特异性靶标。
随着结构生物学和生物信息学的不断发展,基于蛋白质三维结构的计算机辅助药物筛选技术应运而生。依靠不断更新优化的计算机软件,实现蛋白质与化合物的对接和筛选,既缩短了传统药物研发的周期,又能够增强靶向性,大大提高了成药效率。目前该技术已经得到了充分认可和广泛应用。目前,尚无靶向HAb18G/CD147的小分子药物及候选化合物,已经研制出的靶向HAb18G/CD147的“碘[131I]美妥昔单抗注射液”利卡汀,虽然显示了很好的疗效及安全性,但是和小分子药物相比,生产成本昂贵等因素使其在临床应用中有一定的局限性。
发明内容:
本发明的目的在于提供3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的抗肿瘤应用,3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚能够在制备抗肿瘤药物中应用。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:
3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物为能够与HAb18G/CD147蛋白结合的药物。
所述的抗肿瘤药物为能够与表达HAb18G/CD147蛋白的肿瘤细胞结合的药物。
所述的抗肿瘤药物为能够阻断HAb18G/CD147蛋白功能位点的药物。
所述的抗肿瘤药物为能够靶向抑制HAb18G/CD147蛋白生物学活性的药物。
所述的抗肿瘤药物包括能够抑制肿瘤细胞生长和增殖的药物。
所述的抗肿瘤药物包括能够抑制肿瘤细胞迁移运动的药物。
所述的抗肿瘤药物包括能够抑制肿瘤细胞侵袭转移的药物。
所述的抗肿瘤药物包括抗肝癌药物。
所述的抗肝癌药物包括能够抑制肝癌细胞生长、增殖、迁移运动和侵袭转移的药物。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:
本发明提供了3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明通过结构生物学、生物信息学和生物学活性验证相结合的候选药物筛选平台,筛选出3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚这种小分子化合物,能够应用于抗肿瘤领域,或与其它药物和手段联合应用于抗肿瘤领域。
进一步的,本发明提供的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚是针对HAb18G/CD147蛋白的结构设计出的,是首个以HAb18G/CD147蛋白为靶点的抗肝癌小分子化合物,3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚与HAb18G/CD147蛋白特异性结合后,能够有效靶向阻断HAb18G/CD147蛋白分子的功能位点,能够作为HAb18G/CD147蛋白的抑制剂,从而能够用于制备抗肿瘤药物,尤其是用于制备治疗HAb18G/CD147蛋白高表达的肝癌细胞的药物,具有能够抑制肝癌细胞生长、增殖、迁移运动和侵袭转移的作用。
本发明提供的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚与HAb18G/CD147蛋白的亲和力常数为3.6×10-4mol/L。将3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚加入肝癌细胞的培养液中后,检测到吸光值降低,说明3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚能够抑制肝癌细胞的生长和增殖。并且与对照组相比,加入3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的处理组的肝癌细胞的迁移率和侵袭转移数降低。
附图说明
图1是3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚和HAb18G/CD147蛋白体外表面等离子共振结果图。
图2是向肝癌细胞的培养液中加入不同浓度的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚后的吸光值图,其中3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的浓度分别为0、3.125μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L。
图3是加入3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚后肝癌细胞的迁移结果,其中a~d分别为实验组1~4的肝癌细胞的迁移显微照片,e为实验组1~4的肝癌细胞的迁移率图;其中实验组1为纯的SMMC-7721细胞,实验组2为HAb18抗体阳性对照组,实验组3为加入5μmol/L的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的实验组,实验组4为加入10μmol/L的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的实验组。
图4是加入3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚后肝癌细胞的侵袭转移结果,其中a为加入0μmol/L的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的肝癌细胞的显微照片,b为加入10μmol/L的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的肝癌细胞的显微照片,c为统计的细胞数柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实验结果对本发明作进一步详细说明。此部分仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人在《分子克隆:实验室手册》(纽约,冷泉港实验室出版社,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述条件,或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,本发明中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。下述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
经过前期广泛而深入的研究,发现与正常组织相比,肝癌细胞内HAb18G/CD147蛋白的表达量往往明显升高,提示HAb18G/CD147可能与肝癌发生及发展密切相关。同时,在高表达HAb18G/CD147的肝癌细胞内,阻断HAb18G/CD147蛋白分子可以在一定程度上抑制肝癌细胞的增殖、迁移运动和侵袭转移能力,提示HAb18G/CD147蛋白很可能是肝癌诊断和治疗中潜在的候选靶标。而且在前期的工作中已经成功解析出HAb18G/CD147蛋白分子胞外段的三维晶体结构(PDB编号:3B5H),并通过深入研究,明确了HAb18G/CD147的N端的活性位点以及这些位点可能具备的重要生物学活性。因此,本发明首先采用计算机辅助药物设计的筛选方法,并基于生物信息学的方法,运用计算机软件Discovery Studio3.0对HAb18G/CD147胞外段三维晶体结构模型(PDB编号:3B5H)进行构象分析,最终确定在3B5H一个单体的N端建立药效团模型。然后根据已经建立好的药效团模型,对Specs化合物库(约30万个化合物)进行虚拟筛选,对匹配值高的前5000个化合物做进一步的构象优化,最后根据结合能评分,选出排名较高的1000个化合物。再继续应用Discovery Studio3.0软件,对初选的1000个化合物进行分析。根据化合物结构相似性进行聚类分析,从中选取具有结构多样性的100个可能会和HAb18G/CD147蛋白结合的候选小分子化合物。随后运用体外表面等离子相互作用试验、WST-1增殖试验、细胞划痕试验以及细胞侵袭试验对这些化合物进行复筛,得到首个可以靶向结合HAb18G/CD147蛋白分子,能够与HAb18G/CD147分子特异性结合,抑制其生物学活性,并且能够抑制肝癌细胞系SMMC-7721增殖、迁移运动和侵袭转移的小分子化合物,即3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚,记为AN-465/42834501,可由荷兰Specs公司购买得到,其结构式如式(1)所示:
3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚是一种指向HAb18G/CD147蛋白的先导化合物,3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚及其药学上可以接受的盐和活性衍生物均可作为活性成分用于制备抗肿瘤药物,尤其是抗肝癌药物。
下面结合具体验证实验,进一步阐述本发明提供的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的抗肿瘤效果。
细胞系:
选用SMMC-7721细胞系:购自中国科学院上海生化细胞所,这是一种阳性表达CD147的肝癌细胞系。
SMMC-7721细胞的培养方法:将该细胞接种于含有体积浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养液中,置于CO2的体积分数为5%、温度为37℃的培养箱中常规培养。
1.小分子化合物AN-465/42834501(即3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚)与靶标HAb18G/CD147蛋白的体外结合试验(SPR小分子-大分子亲和力检测试验):
对于选出的AN-465/42834501(购自荷兰Specs公司),通过基于表面等离子共振(Surpace Plasmon Resonance,SPR)技术的ProteOn XPR36(BIO-RAD公司),检测该小分子化合物与HAb18G/CD147蛋白结合与否及亲和力大小。
结果证实AN-465/42834501与HAb18G/CD147结合,图1所示为AN-465/42834501与CD147体外结合曲线,图1中纵坐标的单位RU表示信号强度。
由分析软件计算出来得到其亲和力常数KD=3.6×10-4mol/L。
2.小分子化合物(AN-465/42834501)对肝癌细胞的生长抑制实验(WST-1细胞增殖检测试验):
本实验采用了WST-1检测细胞增殖的方法。具体方法如下:
将SMMC-7721细胞以5000个细胞/孔的密度种于96孔板培养过夜。待细胞贴壁后,将该小分子化合物以不同浓度(0、3.125μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L)加入孔中。48小时后,每孔加入10μL的WST-1,放入培养箱,2小时候取出,置于酶标仪(购自BioTek公司)中检测其在450nm处的吸光值。
图2中的结果显示,AN-465/42834501可以抑制肝癌细胞的生长和增殖,其中图2的纵坐标OD450表示在450nm处的吸光值,横坐标表示加入的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的浓度。图2中的***代表统计结果具有显著性差异。
3.AN-465/42834501对肝癌细胞迁移运动能力的检测实验。
(1)将SMMC-7721细胞种于6孔板中,培养至100%融合度。
(2)去除培养液,使用无血清培养液洗涤。
(3)使用枪头在培养板底部划出清晰笔直划痕,用无血清培养基将划出的细胞轻柔洗去。
(4)加入质量分数为1%的FBS培养基,倒置显微镜观察并拍照。
(5)放入培养箱,24h后取出,在原位置拍照,评估划痕愈合能力。
图3中的结果显示,与实验组1即对照组相比,加入小分子化合物AN-465/42834501的实验组4(浓度为10μmol/L)中肝癌细胞迁移率明显降低,表明AN-465/42834501可以抑制肝癌细胞迁移运动。图3e中的***代表统计结果具有显著性差异。
4.AN-465/42834501对肝癌细胞侵袭转移能力的检测实验。
(1)将Matrigel(购自美国BD公司)胶按1:4的体积比稀释后,按每孔100μL加到24-well transwell上室中,放入培养箱,37℃孵育至少4-5小时。
(2)用无血清培养基轻洗凝胶用以水化基底膜。
(3)将24-well transwell小室放入24孔板中,上室加入细胞数为2×105个,以及含体积浓度为0.1%的胎牛血清的细胞悬液200μL,下室加入500μL含体积浓度为10%的胎牛血清的培养基。
(4)在上室加入不同浓度的小分子化合物(终浓度为0、10μmol/L)。
(5)在37℃下孵育20-24小时。
(6)用棉签擦去上室上面的非侵袭细胞,移去transwell小室,倒置风干。
(7)结晶紫进行染色,15分钟后取出,显微镜下拍照,计数。
图4中的结果显示,与对照组(加入0μmol/L的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的实验组)相比,加入10μmol/L的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚的实验组中肝癌细胞的侵袭转移细胞明显减少,说明小分子化合物AN-465/42834501可以抑制肝癌细胞的侵袭转移。图4c中的***代表统计结果具有显著性差异。
上述实验结果表明,本发明提供的3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚可特异性阻断HAb18G/CD147蛋白,进而抑制肝癌细胞增殖、迁移运动和侵袭转移的能力,最终达到在一定程度上治疗肝癌的效果,能够用于制备抗肝癌药物或作为抗肝癌药物,以及在制备与HAb18G/CD147蛋白高表达相关疾病(肿瘤、自身免疫病)的治疗药物中应用,并且具有渗透性好,毒副作用小,结构简单,易于合成的优点。
Claims (8)
1.3-{2-[([1,1'-联苯]-4-甲基)氨基]-1-羟乙基}苯酚在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够与HAb18G/CD147蛋白结合的药物。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够与表达HAb18G/CD147蛋白的肿瘤细胞结合的药物。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的应用,其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞生长和增殖的药物。
5.如权利要求1-3中任意一项所述的应用,其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞迁移运动的药物。
6.如权利要求1-3中任意一项所述的应用,其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞侵袭转移的药物。
7.如权利要求1-3中任意一项所述的应用,其特征在于:所述的抗肿瘤药物为抗肝癌药物。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于:所述的抗肝癌药物为能够抑制肝癌细胞生长、增殖、迁移运动和侵袭转移的药物。
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