CN111116716B

CN111116716B - 一种与骨髓瘤细胞高表达抗原hla-e特异性结合的多肽及其用途

Info

Publication number: CN111116716B
Application number: CN202010139801.1A
Authority: CN
Inventors: 魏敏杰; 杨莹; 于丽凤; 于兆进
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2040-03-03
Also published as: CN111116716A

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种对骨髓瘤细胞高表达的表面抗原HLA‑E有特异性结合的多肽及其用途。该多肽为以下任意（1）多肽的氨基酸序列为：NALDEDCEDKNR，NALDELGEHRNW，NALDESWEDKNR，NALDEYCEDKNR；（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。所述多肽及其衍生物在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。本发明提供的多肽作用效果明显，为临床早期诊断和靶向药物的研发提供了可靠的科学依据，为多发性骨髓瘤的靶向治疗提供新的选择。

Description

一种与骨髓瘤细胞高表达抗原HLA-E特异性结合的多肽及其用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种对骨髓瘤细胞高表达的表面抗原HLA-E有特异性结合的多肽及其用途。

背景技术

HLA-E 基因被发现于1988 年，它在正常细胞表面的膜蛋白表达水平相对于经典的HLA-I 类分子HLA-A、B、C 来说较低，HLA-E 分子是NK 细胞表面受体CD94 /NKG2 的配体，可通过CD94 /NKG2A 抑制NK 细胞的活性，也可通过CD94 /NKG2C 活化NK 细胞的细胞毒作用。HLA-E 分子表达水平的改变可见于某些病理环境或特殊组织细胞中。有研究表明，多种病毒感染的细胞可通过提高HLA-E 的表达逃避NK 细胞免疫监视，如HCMV、HIV、HCV及HPV等。多种肿瘤细胞表面如卵巢癌、淋巴瘤、神经胶质瘤、结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌等检测到HLA-E 的高量表达。

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是第二常见的血液系统恶性疾病，是以骨髓浆细胞克隆增殖的恶性肿瘤，约占血液肿瘤的10%。近年来随着新型药物的不断研发以及自体干细胞移植的开展，ＭＭ的预后得到显著改善，其中位生存期达到7～10年。但大部分患者最终难免复发，ＭＭ仍不可治愈。目前ＭＭ免疫治疗发展迅速，为治疗ＭＭ带来了更多的策略。免疫治疗相对于传统的化疗，特异性更高，毒副作用更小，主要包括单克隆抗体、双特异性抗体、免疫检查点阻断剂树突状细胞疫苗、过继细胞治疗等。虽然目前的治疗手段已经显著延长了该疾病的生存期，但是多发性骨髓瘤可能出现的一系列并发症，包括造血相关并发症（贫血，骨髓衰竭，出血表现），骨相关并发症（病理性骨折，溶骨损伤，高钙血症），肾功能不全以及免疫及神经功能损伤，则大大降低了患者的生活质量。因此，新的治疗方式，尤其是免疫相关的治疗方式亟待研发。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种对骨髓瘤细胞高表达的表面抗原HLA-E有特异性结合的多肽及其用途。所述的多肽能特异性与多发性骨髓瘤高表达表面抗原HLA-E靶向结合，而正常浆细胞由于几乎不表达HLA-E，所以几乎没有影响，这对于特异识别多发性骨髓瘤细胞具有重要的意义，不仅提供了识别多发性骨髓瘤的药物作用靶点，同时该多肽亦可以靶向亲和该靶点。

本发明以生物信息学的方式发现HLA-E在骨髓瘤细胞高表达，同时检测多发性骨髓瘤患者以及正常人浆细胞HLA-E mRNA以及蛋白水平的表达，证实HLA-E确实可以作为识别多发性骨髓瘤的靶点。利用HLA-E与来自NK细胞表面的CD94/NKG2A的相互作用，寻找到二者结合的关键区域。分析并筛选关键区域的氨基酸结构，最终从CD94上获取模板氨基酸序列。然后应用计算机辅助设计药物软件Molecular Operating Environment (MOE)将模板肽与HLA-E进行docking，随后利用突变非关键氨基酸的方法构建肽库，筛选出高亲和力的肽段。设计出具有靶向HLA-E高亲和力的肽段，可以特异性识别出HLA-E高表达的骨髓瘤细胞，可以为多发性骨髓瘤的靶向治疗提供新的选择。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种与多发性骨髓瘤细胞表面HLA-E抗原特异性结合的多肽，该多肽为以下任意：

（1）多肽的氨基酸序列NALDEDCEDKNR，NALDELGEHRNW，NALDESWEDKNR，NALDEYCEDKNR。（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物，经过突变其中的非关键氨基酸所得到的多肽衍生物。

进一步地，所述多肽对HLA-E蛋白靶向结合作用，与肿瘤细胞特异性结合。

进一步地，所述的肿瘤细胞为多发性骨髓瘤细胞。

一种与多发性骨髓瘤细胞表面HLA-E抗原特异性结合的多肽及其衍生物在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。

进一步地，所示试剂盒中包含所述多肽或多肽衍生物。

一种与多发性骨髓瘤细胞表面HLA-E抗原特异性结合的多肽在制备用于治疗高表达HLA-E的多发性骨髓瘤药物中的应用。

进一步地，该药物包含所述的多肽与药物活性成分或包含所述的多肽与递药载体。

进一步地，该药物为任何药物治疗学上可接受的剂型，该药物优选的剂型为注射制剂。

进一步地，该药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

本发明使用HLA-E与CD94/NKG2A相互作用的关键位点，利用计算机辅助设计药物软件进行docking，筛选出亲和力高的模板肽而后进行非关键氨基酸的随机突变，构建肽库。再次利用计算机算法进行docking，筛选出稳定性及亲和性最佳的肽段。该方法成本低，可以模拟肽段在体内的真实存在状态机情况，为后续科学研究及临床治疗提供理论支持。后续利用流式细胞术以及免疫荧光的方法进行亲和力的验证。结果显示该多肽可以与HLA-E进行靶向特异性的结合，作用效果明显，为后续的临床治疗提供了可靠的科学依据。

附图说明

图1 是修饰后的亲和肽与HLA-E相互作用的情况，其中A、C、E亲和肽与HLA-E的相互作用，箭头所指的棍模型为亲和肽，其可以结合在HLA-E双螺旋的关键区域；B、D、F为亲和肽与HLA-E相互作用的局部放大图，呈现肽段与其关键区域成键情况。

图2 是以FITC-C6-Asn-Ala-Leu-Asp-Glu-Tyr-Cys-Glu-Asp-Lys-Asn-Arg（NALDEYCEDKNR）为例的液相图。

图3 是以FITC-C6-Asn-Ala-Leu-Asp-Glu-Tyr-Cys-Glu-Asp-Lys-Asn-Arg（NALDEYCEDKNR）为例的质谱图。

图4是流式细胞术检测肽的亲和性流式细胞术证实随着肽浓度的增加，亲和性增强，分别加入5μg/ml, 10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml浓度的肽，最后加入HLA-E封闭抗体预处理后亲和率显著下降。

图5是免疫荧光检测亲和肽与HLA-E的亲和性，其中A-D为 5μg/ml, 10μg/ml, 25μg/ml以及50μg/ml的荧光肽与高表达HLA-E细胞的亲和情况；E为预先应用HLA-E封闭抗体处理高表达HLA-E的细胞系，再加入50μg/ml的亲和肽，检查不到荧光肽的信号，提示亲和被阻断。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例。

1.实验材料。

1.1细胞。

方法1：工具细胞293T转染HLA-E质粒，构建高表达HLA-E的细胞系。293T细胞购自中国科学院上海细胞库。

方法2：利用多发性骨髓瘤细胞系U266，通过加入先导肽诱导HLA-E的表达。U266细胞系购自中国科学院上海细胞库。

1.2 实验试剂。

HLA-E抗人单克隆荧光抗体（APC）： Biolegend 美国。

HLA-E封闭抗体： proteintech 中国。

Lipofectamine 2000： Invitrogen公司美国。

HLA-E质粒：吉凯基因中国。

荧光肽：中泰公司中国。

DIL： Invitrogen公司美国。

RPMI-1640培养基： Gibco公司美国。

胰蛋白酶： Gibco公司美国。

胎牛血清（FBS） HyClone公司美国。

DAPI Invitrogen公司美国。

1.3 试剂的配制及准备。

（1）转染前准备工作。

利用瞬时转染的方式构建高表达HLA-E的293T工具细胞系。首先将5X10⁵cell/ml的293T细胞铺于100mm培养皿中，于37℃，5%CO2的条件下进行培养。贴壁生长70-90%左右可以进行转染。转染前1天用胰酶消化2min，弃胰酶，加入10%胎牛血清培养基停止消化，1000转离心5min，弃上清，重悬细胞并接种于六孔板中（1X10⁵cells/孔），培养24h贴壁后，用无血清培养基饥饿4h。

（2）转染液的配制。

细胞完成饥饿4h后，各取250μl无血清培养基，分别加入lipofectamine 2000 2μl、质粒4μg，小心混匀后，静置5min，然后将含lipofectamine 2000的培养基与含质粒的培养基混匀，静置20min。空白组加入1ml无血清培养基，阴性对照组和实验组加入500μl无血清培养基，后加入500μl混匀的转染体系，轻轻混匀，继续37℃培养4-6h，更换为正常培养液，培养48h作用，收集相应蛋白备用。

（3）构建高表达HLA-E的U266细胞系。

选取多发性骨髓瘤细胞系U266并按照先前报道加入使HLA-E稳定表达的先导肽使其稳定高表达HLA-E蛋白。将500μM的先导肽HLA-B7（VMAPRTVLL）或对照肽（VGRGAFVLI）加入U266细胞系，于37℃孵育12小时。同时以未加入先导肽或溶解肽的DMSO作为阴性对照。加入HLA-E流式抗体15min避光孵育，PBS洗3遍，流式细胞仪检测荧光强度及阳性百分率。

2.实验方法。

2.1利用MOE设计靶向HLA-E的亲和肽。

在PDB数据库中（PDB，http://www.rcsb.org）获得人类HLA-E与CD94/NKG2A蛋白相互作用的晶体结构。搜索结果显示3CDG以及3CII均为二者相互作用的晶体结构。因为3CDG具有更高的分辨率，更适合设计靶向亲和肽，故后续研究选取3CDG进行分析。蛋白-蛋白相互作用解析以及肽与蛋白的对接利用MOE软件（Molecular Operating Environment，MOE，2018.01，Chemical Computing Group ULC, Montreal, Quebec, Canada；http://www.chemcomp.com/）完成。

首先将HLA-E与CD94/NKG2A的晶体结构导入MOE软件，通过加氢、去水以及最小能级化进行结构准备。进一步确认二者相互作用的关键区域，分析氨基酸间化学键及力的相互作用情况，同时结合文献进行模板肽的设计。分析并筛选关键区域的氨基酸结构，最终发现CD94上与HLA-E相互作用的连续氨基酸最多，预实验发现其相互作用最强，故获取其序列为模板氨基酸序列。利用MOE软件将模板肽与HLA-E关键结合的口袋部位进行对接，发现其确实可以结合于HLA-E的关键口袋区域。为了增强肽段的亲和力及稳定性，利用随机突变非关键氨基酸进行肽库的构建。对MOE预测最佳肽段进行亲和力测试。步骤如下：（1）利用LowModeMD方法对肽段进行构象搜索，选取同样氨基酸序列下能量最小即最稳定的实际构象；（2）利用最佳构象肽段与HLA-E关键区域进行二步法对接，每次对接至少进行100次，选择最佳的10次输；（3）利用London dG以及GBVI/WSA dG为肽对HLA-E的亲和性进行评分。最终相互作用的亲和性可以从相互作用的成键情况以及结合的自由能进行打分（对接得到的S值）。

2.2人工合成亲和肽。

按照Fmoc原理合成亲和肽，然后通过HPLC纯化和HPLC-MS分析其纯度与分子量。

2.3流式细胞术检测肽的亲和性。

收集生长状态良好的转染HLA-E质粒后的293T细胞以及293T细胞，消化、离心，以1×10⁵个/孔的比例均匀接种于六孔板, 继续常规培养 24h；弃去培养液，PBS 稍洗，分别加入浓度为5μg/ml, 10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml FITC-M及P1-3，以及APC标记的HLA-E抗体，于37℃孵育 30min；PBS 洗 2 次,用 500μl PBS 重悬细胞沉淀，上流式细胞仪检测荧光强度及阳性百分率。加入HLA-E封闭抗体处理30h后，再加入FITC标记的多肽进行检测荧光强度和阳性百分率。

2.4细胞免疫荧光染色。

将生长状态良好的高表达HLA-E的U266细胞4×10⁵个/ml加入6孔板中，加入FITC标记的荧光肽1μl（终浓度为5μg/ml, 10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml）避光孵育1h后，PBS 稍洗，500μl 的 4%多聚甲醛室温固定 30min，PBS 洗 3 次。同时封闭抗体+荧光肽组首先加入HLA-E封闭抗体于 37℃预处理30min，PBS稍洗后加入终浓度为50μg/ml的荧光肽，37℃孵育避光1h后PBS洗3次。分别加入膜染料DLI和核染料DAPI 避光孵育30min，用于标记细胞位置。而后，PBS 洗 3 次，甘油封片。激光共聚焦显微镜下观察荧光肽与高表达HLA-E的U266亲和情况。

3.实验结果。

3.1利用MOE设计靶向HLA-E的亲和肽。

HLA-E与CD94/NKG2A相互作用的晶体结构如图1所示，HLA-E在先导肽存在的情况下可以稳定表达于细胞表面，同时其与NK细胞表面的抑制性受体CD94/NKG2A的相互作用最强，故选择二者相互作用的晶体构象进行模板肽的设计。如图可以看到CD94以及NKG2A复合物与HLA-E复合体的双螺旋结构处相结合，其内包括先导肽以及双螺旋处氨基酸。通过分析成键以及相互作用力情况选择连续的氨基酸序列作为模板肽的候选。将候选氨基酸序列进行构象搜索以优化肽段的稳定性，使其构象处于最低能量符合现实空间形态。而后利用MOE软件中的docking功能进行对接。最终来源于CD94的由12个氨基酸构成的多肽被作为最佳候选肽段。

3.2 构建靶向亲和肽HLA-E的肽库。

模板肽的氨基酸序列为NALDESCEDKNR，对其中非关键氨基酸进行随机替换构建肽库。利用MOE软件中残基搜索功能进行构建，软件根据氨基酸的理化性质进行合理的设计下的随机替换，得到一个包含众多肽段的肽库。进一步将肽库中的全部肽段与HLA-E关键区域进行docking对接，根据亲和性、稳定性进行打分排序，得到预测高亲和性的肽段。图1中展示其中3条亲和肽的成键情况。进一步将肽段进行构象搜索后，使其接近肽段真实存在的状态，进而与HLA-E关键区域进行docking对接，结果发现修饰后的肽段与HLA-E结合的关键区域成键增多，提示亲和力增强，如图1所示。

3.3 人工合成亲和肽。

亲和肽NALDEYCEDKNR纯度及分子量检测结果如图 2和3所示。

3.4 流式细胞术验证亲和肽与HLA-E的亲和性。

首先检测转染后293T细胞以及293T细胞系HLA-E的表达情况，证实293T不表达HLA-E蛋白，而转染后HLA-E高表达，如图4所示。进一步将APC染料标记的HLA-E抗体以及不同浓度的5μg/ml, 10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml FITC标记的荧光肽加入293T细胞以及转染HLA-E后的293T细胞进行亲和性的检验。浓度的选择结合多肽的溶解性，上限浓度定为50μg/ml。结果显示，亲和肽与转染前的293T细胞未检测到荧光强度，提示无亲和；但将其加入转染HLA-E后的293T细胞可检测到荧光，故提示亲和肽可以与HLA-E蛋白结合，同时结果显示随着多肽浓度增大，亲和率增加，如图4所示。将转染HLA-E后的293T细胞加入封闭抗体，再加入50μg/ml荧光肽，流式细胞术再次检测荧光强度，提示荧光量显著下降至几乎阴性表达，如图4所示，证实肽可与HLA-E蛋白靶向结合且亲和力高。

3.5 免疫荧光检测不同浓度的亲和肽与HLA-E的亲和性。

U266是一株常见的多发性骨髓瘤细胞系，预先利用先导肽处理U266细胞系后使其高表达HLA-E。利用共聚焦显微镜检测不同浓度（5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml）亲和肽与高表达HLA-E的U266细胞亲和性，同时加入封闭抗体后亲和性的变化，如图5所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医科大学

<120> 一种与骨髓瘤细胞高表达抗原HLA-E特异性结合的多肽及其用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Asn Ala Leu Asp Glu Asp Cys Glu Asp Lys Asn Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Asn Ala Leu Asp Glu Leu Gly Glu His Arg Asn Trp

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Asn Ala Leu Asp Glu Ser Trp Glu Asp Lys Asn Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Asn Ala Leu Asp Glu Tyr Cys Glu Asp Lys Asn Arg

1 5 10

Claims

1.一种与多发性骨髓瘤细胞表面HLA-E抗原特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为NALDEYCEDKNR。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽对HLA-E蛋白靶向亲和作用，与肿瘤细胞特异性结合；所述的肿瘤细胞为多发性骨髓瘤细胞。

3.一种如权利要求1所述的与多发性骨髓瘤细胞表面HLA-E抗原特异性结合的多肽在制备HLA-E抗原检测诊断试剂盒中的应用。