CN112662750B - 用于人类白细胞抗原hla-e基因调控区-26位碱基测定的相关引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域。一种用于人类白细胞抗原HLA‑E基因调控区‑26位碱基测定的相关引物，包括特异性扩增HLA‑E 123bp调控区基因序列的上游引物E‑NT‑26‑F和下游引物E‑NT‑26‑R，以及用于检测HLA‑E 123bp调控区基因的突变型探针E‑NT‑26‑探针M和野生型探针E‑NT‑26‑探针W。包含该相关引物的试剂盒可应用于人类白细胞抗原HLA‑E调控区‑26位碱基的快速测定，具有高度特异性、灵敏度和准确性，技术简单，操作便捷，自动化程度高，为中国群体HLA‑E调控区‑26位的频率筛查、基因的表达调控、疾病关联研究等领域提供广泛的应用基础。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的相关引物、试剂盒和方法。
背景技术
HLA-E基因作为非经典HLA类分子，其基因的多态性虽较为有限，但其可影响细胞表面HLA-E分子的表达水平，HLA-E分子作为NK细胞表面受体的配体，可以激活或抑制机体的免疫反应，从而参与到机体的抗炎，抗肿瘤等免疫应答中。近些年来，已有大量的文献证明HLA-E基因的多态性与多种疾病息息相关，对其调控区序列多态性的研究也越来越深入，但目前HLA-E基因的多态性的测定方法多使用传统的PCR-SBT，虽然方法精准，但操作复杂，耗时长，不适合应用于临床实验的筛查。本发明采用Taqman探针法进行HLA-E调控区-26位碱基的测定，可用于大规模的人群中突变位点频率的统计及与疾病相关性的快速分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用中国汉族个体样本建立稳定可靠的，用于人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的相关引物以及含有其的试剂盒，该试剂盒可应用于人类白细胞抗原HLA-E调控区-26位碱基的快速测定，具有高度特异性、灵敏度和准确性，技术简单，操作便捷，自动化程度高，为中国群体HLA-E调控区-26位的频率筛查、基因的表达调控、疾病关联研究等领域提供广泛的应用基础。
本发明的目的还在于提供一种适合于中国人群的HLA-E基因调控区-26位碱基的快速分型方法。
本发明的技术方案如下：
一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的相关引物，包括特异性扩增HLA-E 123bp调控区基因序列的上游引物E-NT-26-F和下游引物E-NT-26-R，以及用于检测HLA-E 123bp调控区基因的突变型探针E-NT-26-探针M和野生型探针E-NT-26-探针W；
所述上游引物E-NT-26-F序列为5'-GGGTTTCTAGAGAAGCCAATCAG-3'(SEQ ID NO:1)；
所述下游引物E-NT-26-R序列为5'-GGAGTAAAAGGAGGGTTCCATC-3'(SEQ ID NO:2)；
所述E-NT-26-探针M序列为5'-CGGACTCAAGAATTTCTCAGGACTC-3'(SEQ ID NO:3)；
所述E-NT-26-探针W序列为5'-CCGGACTCAAGAAGTTCTCAGGACT-3'(SEQ ID NO:4)。
进一步的，所述突变型探针和所述野生型探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
进一步的，所述记荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXAS RED、NED、ALEXA、TAMRA、Quasar705、CY5.5、CY5；所述荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL。
进一步的，所述E-NT-26-探针M的5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
进一步的，所述E-NT-26-探针W的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的试剂盒，包括所述的相关引物。
一种人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的方法，包括所述的相关引物，对HLA-E基因调控区-26位碱基进行Taqman探针分型。由一对位点特异性PCR扩增引物以及突变型和野生型探针对DNA样本进行扩增，扩增区域包含HLA-E基因的5’-启动子序列123bp。
进一步的，包括以下步骤：以待测样本的DNA为模板，分别用上游引物E-NT-26-F、下游引物E-NT-26-R、E-NT-26-探针M和E-NT-26-探针W进行扩增反应，上机检测不同探针的荧光信号。
进一步的，所述HLA-E基因调控区-26位Taqman探针法分型扩增反应体系为：
进一步的，所述HLA-E基因调控区-26位Taqman探针法分型反应体系的循环参数为：
进一步的，使用罗氏480PCR仪器终点法基因分型分析实验结果。
本发明具有如下有益效果：
本发明测定了中国人群人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基，为HLA-E基因的表达调控、进化、疾病相关性等研究提供一种更为快速的HLA-E基因调控区-26位碱基Taqman探针分型方法，适用于中国人群HLA-E基因调控区-26位碱基G/T的快速筛查，以及HLA-E基因的群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究工作，结果准确，方便易行。
附图说明
图1为本发明HLA-E基因调控区-26位碱基Taqman探针法的测定结果图；
图2为本发明HLA-E基因调控区-26位碱基Taqman探针法测定的终点基因型结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
一种HLA-E基因调控区-26位碱基的Taqman探针分型的测定方法，通过反复筛选扩增引物及探针、探索扩增温度及调节DNA浓度及引物浓度等条件，本发明提供的引物、探针和方法可稳定地对HLA-E-26位碱基T/G进行区分。
本发明中DNA引物序列共2条，探针2条，委托广州艾基生物有限公司合成。Taqman探针法试剂为罗氏公司的产品。
实施例1
本实施例给出了HLA-E基因调控区-26位Taqman探针法分型扩增的整套方案。
取本发明中的HLA-E基因启动子区扩增引物E-NT-26-F以及E-NT-26-R，分别对14份亚洲人随机DNA标本进行HLA-E基因调控区-26位碱基Taqman探针分型扩增，于罗氏480PCR仪器进行。
其中，上游引物E-NT-26-F序列为5'-GGGTTTCTAGAGAAGCCAATCAG-3'；下游引物E-NT-26-R序列为5'-GGAGTAAAAGGAGGGTTCCATC-3'；E-NT-26-探针M序列为VIC-CGGACTCAAGAATTTCTCAGGACTC-BHQ1；E-NT-26-探针W序列为FAM-CCGGACTCAAGAAGTTCTCAGGACT-BHQ1。
其中，所述HLA-E基因调控区-26位Taqman探针法分型扩增反应体系为：
其中，所述HLA-E基因调控区-26位Taqman探针法分型反应体系的循环参数为：
使用罗氏480PCR仪器终点法基因分型分析实验结果。
一、HLA-E基因调控区-26位Taqman探针基因分型
采用本发明PCR扩增引物，成功的分析出14个标本的HLA-E基因调控区-26位碱基G/T结果，结果参见图1-2。Allele Y表示HLA-E基因调控区-26位碱基为T碱基纯合，BothAlleles表示HLA-E基因调控区-26位碱基为GT碱基杂合，Allele X表示HLA-E基因调控区-26位碱基为G碱基纯合。
二、14个受检标本HLA-E基因调控区-26位分型结果
用本发明建立的方法所得出的HLA-E序列包含HLA-E基因的5’-启动子区123bp，14个受检标本HLA-E基因调控区-26位分型结果如下表所示：
其中，A1、A2、A3标本结果为HLA-E基因调控区-26位碱基为T碱基纯合，A1测序序列如SEQ ID NO:5所示；B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3标本结果为表示HLA-E基因调控区-26位碱基为GT碱基杂合，B1测序序列如SEQ ID NO:6所示；E1、E2、E3、F1、F2、F3、G1、G2、G3HLA-E基因调控区-26位碱基为G碱基纯合，E1测序序列如SEQ ID NO:7所示。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不应理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。本文所述技术方案的等同技术方案也包括在本发明范围内。
序列表
<110> 深圳市血液中心（深圳市输血医学研究所）
<120> 用于人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的相关引物、试剂盒和方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggtttctag agaagccaat cag 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagtaaaag gagggttcca tc 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggactcaag aatttctcag gactc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggactcaa gaagttctca ggact 25
<210> 5
<211> 123
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gggtttctag agaagccaat cagcgtcgcc acgactcccg actataaagt ccccatccgg 60
actcaagaat ttctcaggac tcagaggctg ggatcatggt agatggaacc ctccttttac 120
tcc 123
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Claims (5)
1.一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的引物和探针组合，其特征在于，包括特异性扩增HLA-E 123bp调控区基因序列的上游引物E-NT-26-F和下游引物E-NT-26-R，以及用于检测HLA-E 123bp调控区基因的突变型探针E-NT-26-探针M和野生型探针E-NT-26-探针W；
所述上游引物E-NT-26-F序列如SEQ ID NO:1所示；
所述下游引物E-NT-26-R序列如SEQ ID NO:2所示；
所述E-NT-26-探针M序列如SEQ ID NO:3所示；
所述E-NT-26-探针W序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述突变型探针E-NT-26-探针M和所述野生型探针E-NT-26-探针W的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物和探针组合，其特征在于，所述E-NT-26-探针M的5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求2所述的引物和探针组合，其特征在于，所述E-NT-26-探针W的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
5.一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因调控区-26位碱基测定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物和探针组合。
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| 中国人HLA-E启动子新变异NT-26 G/T调控基因表达的研究;徐筠娉 等;《中国输血杂志》;20181101;第31卷(第1期);第55页右栏第2段-第56页左栏第1段 * |
| 人类白细胞抗原E基因全长序列测定及两个新等位基因的鉴定;何柳媚等;《中国组织工程研究》;20170908;第21卷(第25期);摘要、第4069页左栏第1段-第4074页左栏第3段 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112662750A (zh) | 2021-04-16 |
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