CN102875674B

CN102875674B - 一种抗破伤风毒素抗体及其制备方法和用途

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Publication number: CN102875674B
Application number: CN201210418135.0A
Authority: CN
Inventors: 何太平; 聂艳桃; 唐菁燕; 杨波; 宋春雷; 伍立恒
Original assignee: RONGSHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Current assignee: RONGSHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2032-10-26
Also published as: CN102875674A

Abstract

本发明公开了一种抗破伤风毒素的抗体，其重链可变区中：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区中：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。本发明还公开了编码抗破伤风毒素抗体的核苷酸序列，以及相应的重组质粒和重组表达载体。本发明还公开了抗破伤风毒素抗体的制备方法和用途。本发明抗破伤风毒素抗体为全人源抗体，副反应低，亲和力高，制备方法简单，具有良好的工业应用前景。

Description

一种抗破伤风毒素抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种抗体，特别涉及一种抗破伤风毒素抗体，属于生物技术领域。

背景技术

破伤风是由破伤风芽孢杆菌引起的一种感染性疾病，病死率极。破伤风芽孢杆菌广泛存在于土壤、灰尘、铁锈等处，很容易随开放性伤口及新生儿创伤引起感染。当被破伤风杆菌感染后，细菌在体内大量繁殖并释放破伤风毒素，后者与神经细胞结合，引起剧烈的神经症状，病人痛苦不堪，很快死去。破伤风有两种治疗方法，一是注射破伤风类毒素进行主动免疫，二是注射破伤风抗毒素（抗体）进行被动免疫治疗，前者见效慢主要用于预防，后者见效快，是破伤风治疗的最有效的治疗措施。

目前，市面上用于破伤风治疗的抗体类产品包括第一代动物源性抗血清和，第二代为人源免疫球蛋白制剂。前者注射到人体会产生一系列的副反应，后者是经破伤风类毒素免疫健康人群后，从其血浆分离纯化制备的特异性免疫球蛋白制剂，不会产生副反应，但是，由于血浆资源的有限性，以及该方法存在血源性病毒感染的风险和类毒素免疫后的副反应大的缺陷不易被献血员接受，不具有实际应用价值。

因此，利用基因工程抗体技术开发新一代重组抗体就显得尤为重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的抗破伤风毒素抗体及其制备方法和用途。

本发明抗破伤风毒素抗体，其重链可变区中：CDR1的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区中：CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

CDR，是指互补性决定区，重链可变区和轻链可变区的三个互补决定区共同组成抗体的抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定基互补的表面，不同抗体的CDR序列不相同，CDR序列是决定抗体特异性的关键区域。在已知破伤风毒素抗体CDR区域的基础上，本领域技术人员可以利用常规手段，制备得到抗破伤风毒素抗体。

优选地，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述抗体为单链抗体scFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或者全抗体。

优选地，所述Fab片段重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述全抗体重链的氨基酸序列如SEQID NO.19所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。

本发明还提供了编码前述抗破伤风毒素抗体的核苷酸序列。

其中，抗破伤风毒素抗体的重链可变区中：CDR1的核苷酸序列如SEQID NO.11所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；轻链可变区中：CDR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

优选地，抗破伤风毒素抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步优选地，抗破伤风毒素抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；或者，其重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

本发明还提供了一种重组质粒，它包括前述核苷酸序列。优选地，其为重组真核表达质粒。进一步优选地，重组质粒为重组pHWD3质粒。

本发明还提供了一种宿主细胞，它前述重组质粒。优选地所述宿主细胞为CHO细胞系、骨髓瘤细胞系、HEK293细胞系或和PER.C6细胞系。。

本发明还提供了前述抗体的制备方法，它包括如下步骤：

（1）取前述重组表达载体，在细胞培养基中培养，表达，得上清液；

（2）取步骤（1）所得上清液，分离纯化，即得本发明抗体。

本发明还提供了一种药物组合物，它是由前述抗体加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。

本发明最后提供了前述抗体在制备治疗、预防或者诊断破伤风的药物中的用途。

本发明抗破伤风毒素抗体为全人源抗体，副反应低，亲和力高，能有效中和破伤风毒素，制备方法简单，可大规模生产，应用前景广阔。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1复合胶纯化图；

图2亲和纯化图；

图3抗体非还原SDS-PAGE图，M.蛋白分子标准；1.Capto adhere层析洗脱液；

图4抗体还原SDS-PAGE图；

图5本发明抗体的亲和力结果图。

具体实施方式

实验材料：真核表达载体pTT、CHO-DG44细胞、精制破伤风类毒素、蓉生逸普和HRP标记的羊抗人IgG，均为市售品。

实施例一本发明抗体的制备

一、人免疫抗体文库构建

常规方法收集5名经吸附精制破伤风类毒素免疫的中和效价高的健康成年人外周血，分离单个核细胞；

用Trizol提取总RNA，根据M-Mulv-RT试剂说明书逆转录合成单链cDNA，并以此为模板用下述引物分别PCR扩增不同家族的轻重链基因；

KI-5’ACCGGAGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA。

KII-5’ACCGGAGAGCTCGTGWTGACYCAGTCTCCA。

上述两条引物为轻链5’端引物，下划线为SacI酶切位点。

K-3’GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAG。

上述引物为轻链3’端引物，下划线为XbaI酶切位点。

H 1-5’：CAGGTCAGCTGGTGSAGTCTGG。

H2-5’：CAGGTCAACTT GAAGGAGTCTGG。

H3-5’：CAGGTGCAGCTGCAGAGTCGGG。

上述为Fd重链5’端引物。

H-3’：GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGA。

上述为重链3’端引物，下划线为SpeI酶切位点。

VH-5’：CAGGTGCAGCTCGAGSAGTCTGG。

上述为Fd重链5’引物，用于二次PCR引入酶切位点XhoI。

将所获κ链（轻链）PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，双酶切纯化后，与相应酶切纯化的噬菌体p3MH连接，电穿孔转化XL-1Blue细胞，扩增培养获得轻链抗体库；同样，将获得的Fd片段（重链）电泳分离纯化，双酶切纯化后，与相应酶切纯化的含轻链片段的噬菌体p3MH连接，电穿孔转化XL-1Blue细胞，扩大培养获得抗体库。

经菌落PCR鉴定，轻链重组率为90%，轻链、重链的双链基因重组率为60%，库容为4.5×10⁶。

二、高亲和力抗体的筛选

吸附：用精制破伤风类毒素包被ELISA板，BSA封闭后加入步骤一获得的轻链抗体库或者重链抗体库中的抗体（100μl/孔，约1010cfu/孔），孵育2h，PBST洗1次，PBS洗5次，以100μl/孔洗脱液（PH2.2、0.1M甘氨酸-HCl缓冲液，含1%BSA）回收噬菌体，并加入2M Tris 3μl/孔中和；

洗脱：洗脱液加入2ml对数生长期的XL-1Blue细菌悬液中，37℃静置30min后，再加入10ml SB（含氨苄青霉素和四环素），取出2μl，20μl铺氨苄青霉素培养板测定cfu；

扩增：其余细菌置37℃培养2h后，加入适量VCSM13超感染，PEG沉淀获得次级噬菌体抗体库。

同上操作，反复进行“吸附→洗脱→扩增”5次淘洗，每轮抗原包被量逐渐减少，至第5轮抗原包被量为1μg/ml。而洗涤次数逐渐增加使特异性噬菌体抗体高度富集。

最终获得一株高亲和力特异性抗体，该抗体不是全抗体，是Fab抗体，由一条完整的轻链和重链的重链可变区（V_H）和重链恒定区1（C_H1），经测序，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO.12所示，其中，编码重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，编码轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。

根据该DNA序列可以得知：Fab抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的互补决定区：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，轻链的互补决定区：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

三、全抗体的制备

（1）制备重组质粒：将上述抗体片段在基因水平上与IgG1恒定区基因经PCR拼接，得到全分子抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，并克隆到真核表达载体pHWD3上，得抗破伤风毒素抗体真核表达载体pTT；

（2）表达：取10ug表达质粒pTT，按转染试剂说明书用LipofectamineTM2000（Invitrogen）转染CHO-DG44细胞，在含血清、HT的IMDM培养液中培养24h后，将转染细胞分入96孔细胞板中进行培养，每三到四天换液一次，待克隆开始出现后，取克隆上清进行ELISA分析，挑取强阳性克隆经24孔培养，摇瓶无血清培养适应和MTX施压获得稳定表达细胞株，该细胞株扩大培养后液氮冻存保种；

从液氮中复苏一支工程细胞，经摇瓶逐级放大培养扩增种子，将种子细胞接种7升细胞培养罐（型号EZ-CONTROL，Applikon Biotechnology，Holland），培养基为SFM4CHO（HyClone），细胞起始密度为5×10⁵/ml，参数控制为温度37℃、PH6.9、PO40%、转速200RPM，待细胞活力下降至70%时收取上清纯化；

（3）纯化：取步骤（2）制备的上清，按下述方法纯化，获得纯化样品：

采用0.22um一次性滤器（PALL公司）过滤澄清细胞培养上清，除去细胞及细胞碎片；

利用AKTA purifier 100层析系统，以平衡缓冲液（20mM PB+150mMNaCl pH,7.0-7.5）充分平衡Mabselect亲和层析柱，待280nm紫外吸收基线平稳，电导、pH均保持稳定时开始上样；上完样后，再以平衡缓冲液冲洗层析柱，待280nm紫外吸收回到基线，电导、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液（20mM Citrate缓冲液，PH 3.0-4.0）洗脱，收集洗脱液（如图1所示），常规非还原SDS-PAGE电泳方法检测；

将亲和层析洗脱液用1M Tris-HCl调节pH至6.0-7.0，用NaCl调节离子强度至10mS/cm-30mS/cm，以平衡缓冲液（Citrate缓冲液，PH 6.0-7.0，电导10mS/cm-30mS/cm）充分平衡Capto adhere复合介质层析柱，待280nm紫外吸收基线平稳，电导、pH均保持稳定时开始上样；上完样后，再以平衡缓冲液冲洗层析柱，待280nm紫外吸收回到基线，电导、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液（20mM Citrate缓冲液，PH 3.0-5.0，电导30mS/cm-60mS/cm）洗脱，收集洗脱液（如图2所示），即为目的抗体，常规非还原SDS-PAGE电泳方法和还原SDS-PAGE电泳方法检测。

非还原SDS-PAGE电泳方法检测结果如图3所示，本发明制备得到了纯化的抗体，根据泳道4，由面积积分计算，抗体纯度为99%，抗体的分子量为150KD。其中，采用ProteinA亲和层析介质Mabselect（GE产品）和复合层析介质Capto adhere（GE产品）纯化，Protein A亲和层析方法可一步从细胞培养上清液中几乎完全纯化抗体。复合层析介质能够降低HCP、D/A等杂质水平，提高产物纯度，有效保证本发明抗体的质量。

还原SDS-PAGE电泳方法检测结果如图4所示，用还原SDS-PAGE检测本发明抗体，其会裂解为2段等重轻链和2段等重重链，分子量分别为25KD和50KD。

四、本发明抗体在小鼠体内的中和毒素实验

依据《中华人民共和国药典2010年版》《破伤风抗毒素效价测定法（小白鼠试验法）》测定本发明抗体的效价：

将破伤风毒素稀释至每ml含5个试验量，将蓉生逸普（抗破伤风毒素抗体标准品）稀释至每ml含0.5IU，步骤三制备得到的本发明抗体样品稀释至0.5mg/ml；

稀释的抗破伤风毒素抗体标准品、本发明抗体样品分别与稀释的破伤风毒素等量混合，37℃结合1小时，立即腹部皮下注射小白鼠，每组3只，每只注射0.4ml，连续观察小鼠的发病情况。

实验结果如表1所示：

表1小鼠体内破伤风毒素中和实验结果

由表1可知，在相同剂量下，本发明抗体在小鼠体内的中和活性高于抗破伤风抗毒素抗体标准品，说明本发明抗体是抗破伤风毒素抗体，效价高，能有效中和破伤风毒素。

五、本发明抗体的相对亲和力测定

以精制破伤风类毒素10μg/ml包被ELISA板，100μl/well，10%小牛血清封闭；

取步骤三制备得到的本发明抗体和蓉生逸普（抗破伤风毒素抗体标准品），对倍稀释后加到相应的孔中，孵育洗涤后，用HRP标记的羊抗人IgG（Fc special）进行结合反应，TMB显色，测A450值；

根据达到最大吸光度A值的50%时结合的抗体浓度，计算其相对亲和力。

实验结果如图5所示，由该图可知，步骤三制备得到的本发明抗体相对亲和力高达10^--11M。

综上，用本发明抗破伤风毒素抗体为全人源抗体，副反应低，效价高，亲和力高，能有效中和破伤风毒素，并且，制备方法简单，可大批量生产，具有良好的工业应用前景。

Claims

1.一种抗破伤风毒素抗体或抗体片段，其特征在于：

其重链可变区中：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5 所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区中：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述抗体片段为Fab片段。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于：所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述抗体片段的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

3.编码权利要求1所述抗体或抗体片段的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的抗体或抗体片段的核苷酸序列，其特征在于：其重链可变区中：CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11 所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；轻链可变区中：CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

5.根据权利要求4所述的抗体或抗体片段的核苷酸序列，其特征在于：其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求5所述的抗体或抗体片段的核苷酸序列，其特征在于：所述抗体片段的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

7.一种重组质粒，其特征在于：它包括权利要求3~6任意一项所述的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于：其为重组真核表达质粒。

9.一种宿主细胞，其特征在于：它包括权利要求7或8任意一项所述的重组质粒。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为CHO细胞系、骨髓瘤细胞系、HEK293细胞系或PER.C6细胞系。

11.一种制备权利要求1所述抗体或抗体片段的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）取权利要求9或者10所述宿主细胞，在细胞培养基中培养，表达，得上清液；

（2）取步骤（1）所得上清液，分离纯化，即得本发明抗体或抗体片段。

12.一种药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1所述抗体或抗体片段为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成。

13.权利要求1所述抗体或抗体片段在制备治疗、预防或者诊断破伤风的药物中的用途。