CN108218984B

CN108218984B - 一种抗破伤风毒素的全人源中和抗体

Info

Publication number: CN108218984B
Application number: CN201711482969.7A
Authority: CN
Inventors: 廖化新; 袁晓辉; 王月明
Original assignee: GUANGZHOU TAINUODI BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Zhuhai Microlab Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhuhai Tainuo Maibo Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: WO2019128120A1; CN108218984A

Abstract

本发明公开了一种破伤风毒素的全人源中和抗体。具体而言，本发明涉及一种抗破伤风类毒素单克隆抗体，具有SEQ ID NO.1～3所示的重链CDR1～3区，SEQ ID NO.5～7所示的轻链CDR1～3区。本发明还公开了针对破伤风毒素的抗体在预防和治疗破伤风感染相关疾病中的应用，以及它们在检测破伤风感染中的应用。本发明提供的针对破伤风毒素的抗体为全人源的单克隆抗体，无免疫原性，且特异性好、亲和力高、效价高，解决了现有技术中破伤风感染预防和治疗药物的短板问题。

Description

一种抗破伤风毒素的全人源中和抗体

技术领域

本发明本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种抗破伤风毒素的全人源中和抗体。

背景技术

破伤风是由破伤风梭菌(Clostridium tetani)感染引起的一种急性病，主要临床症状为牙关紧闭，局部或全身肌肉呈阵发性或强直痉挛。破伤风梭菌感染于伤口，在缺氧的条件下繁殖并产生外毒素—破伤风神经毒素(tetanus neurotoxin)(简称破伤风毒素)，毒素大部分被血流带进血液系统，并扩散到身体的全部神经途径，影响中枢神经系统。

破伤风梭菌没有侵袭力，只在污染的局部组织中生长繁殖。当局部产生破伤风毒素后，引起全身横纹肌痉挛。毒素在局部产生后，通过运动终板吸收，沿神经纤维间隙至脊髓前角神经细胞，上达脑干，也可经淋巴吸收，通过血管到达中枢神经。毒素能与神经组织中的神经节工苷脂结合，封闭了脊髓抑制性突触末端，阻止释放抑制冲动的传递介质甘氨酸和γ氨基丁酸，从而破坏上下神经原之间的正常抑制性冲动的传递，导致超反射反应(兴奋性异常增高)和横纹肌痉挛。

虽然注射破伤风疫苗可以完全预防破伤风的临床症状，但由于没有接种疫苗或免疫效应过期从而导致破伤风杆菌感染的情况依然非常普遍。

破伤风毒素毒性强，作用迅速。当病人被确诊为感染破伤风杆菌后，体内一般已存在大量细菌和毒素，使用抗菌素已来不及拯救病人生命。因此预防和治疗方法破伤风的唯一有效的方法是及时注射抗破伤风毒素的抗体，与毒素进行中和反应而使毒素失活，并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。因此，制备无免疫原性、亲和力高、特异性强、效价高的破伤风毒素全人源中和抗体在本领域中具有非常重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种无免疫原性、亲和力高、特异性强、效价高的针对破伤风毒素的全人源单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“破伤风毒素”是指破伤风梭菌在厌氧条件下产生的分泌蛋白破伤风毒素，其是本领域公知的(参见NCBI GENEBANK数据库等公开序列)。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。

如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。

如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体TRN0011)以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，破伤风毒素)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如破伤风感染或与破伤风感染相关的疾病)有效量是指，足以预防、阻止、或延迟疾病(例如破伤风感染或与破伤风感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

本发明的第一方面提供了一种能够特异性破伤风毒素的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括选自下列的重链可变区(VH)：

(1)如SEQ ID NO.1所示的VH CDR1；

(2)如SEQ ID NO.2所示的VH CDR2；和

(3)如SEQ ID NO.3所示的VH CDR1；

所述的单克隆抗体包括选自下列的轻链可变区(VL)：

(1)如SEQ ID NO.5所示的VL CDR1；

(2)如SEQ ID NO.6所示的VLCDR2；和

(3)如SEQ ID NO.7所示的VL CDR3；

进一步，所述的单克隆抗体包括氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的重链结构域；和/或

氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示的轻链结构域。

进一步，所述的单克隆抗体包括氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的重链可变区(VH)；和/或

氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示的轻链可变区(VL)。

进一步，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

进一步，所述抗体为全人源化抗体。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的KD结合破伤风毒素。

本发明的破伤风毒素的中和抗体还包括其功能性变异体。如果单克隆抗体的变异体可与本发明的单克隆抗体竞争以特异性结合破伤风毒素的片段，则它们被认为是本发明的单克隆抗体的功能性变异体。具体地，如果功能性变异体可结合至破伤风毒素或其片段，且具有抗所述亚型或片段的中和活性，则该功能性变异体被认为是本发明的功能性变异体。

功能性变异体包括(但并不限于)：在一级结构序列中基本类似、但包含本发明的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至破伤风毒素或其片段。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体对破伤风毒素或其片段可具有升高或降低的结合亲和力。优选地，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是CDR3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个CDR)和更保守的区域(所谓的构架区域(FR))。高可变区域包括来自CDR的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。意于落入本发明的范围内的功能性变异体与本文所定义的亲本单克隆抗体具有至少大约50～99％、优选至少大约60～99％、更优选至少大约80～99％、甚至更优选至少大约90～99％、尤其至少大约95～99％，且特别至少大约97～99％的氨基酸序列同源性。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如Gap或Bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定点诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis)和定点诱变(site-directed mutagenesis))改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。

本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的抗体的核苷酸序列。

本发明中的核酸分子包含通过本领域的技术人员已知的方法将本发明的抗体的氨基酸序列翻译成多核苷酸序列所获得的所有核酸分子。因此，可制备具有开放阅读框(ORF)的多种多核苷酸序列，且该制备的多核苷酸序列包含在本发明的核酸分子的范围内。

本发明的第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

本发明中的表达载体包括(但不限于)由Celltrion Inc.(韩国)生产的MarEx表达载体；市场上可广泛买到的pCDNA载体；F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体，诸如λ噬菌体、λ形噬菌体、M13噬菌体、Mu噬菌体、P1噬菌体、P22噬菌体、Qμ噬菌体、T-偶数噬菌体、T2噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体等；植物病毒。本发明中可使用本领域技术人员已知的各种表达载体的任意一种，且表达载体的选择依赖于所选择的宿主细胞的性质。宿主细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的表达载体和宿主细胞的导入方法。优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的宿主细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本发明并不是关键性的。

为了促进本发明的核酸分子的纯化，可将标签(tag)序列插入表达载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或FLAG标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。

本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子，或包含本发明第三方面所述的表达载体。

上述细胞包含(但并不限于)哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。作为哺乳动物细胞，可优选使用选自(但并不限于)由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞组成的组中的一种作为宿主细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

进一步，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明的第五方面提供了本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的抗体。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物还可包括一种或多种其它治疗剂。治疗剂可包含抗体、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列等。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明第一方面所述的抗体在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染的药物中的应用；

2)本发明第二方面所述的核酸分子在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染药物中的应用；

3)本发明第三方面所述的表达载体在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染中的应用；

4)本发明第四方面所述的宿主细胞在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染中的应用。

在另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记时本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。

在另一个方面，本发明还提供了检测破伤风毒素或破伤风梭菌在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品或者来自患者的样品)。

在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了破伤风毒素或破伤风梭菌感染的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测破伤风毒素或破伤风梭菌感染在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测破伤风毒素或破伤风梭菌在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了破伤风。

在另一个方面，本发明提供了用于中和样品中破伤风毒素的毒力的方法，其包括，将包含破伤风毒素的样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。此类方法可以用于治疗目的，或非治疗目的(例如所述样品是细胞样品，而不是患者或来自患者的样品)。

在本发明的又一方面中，提供了本发明的抗破伤风毒素单克隆抗体或其抗原结合片段在制备破伤风梭菌感染的诊断试剂中的用途。

本领域技术人员还将理解的是，本发明涵盖所述破伤风毒素抗体的氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体之结合亲和力及/或其它生物学特性。抗破伤风毒素抗体之氨基酸序列变体是由向抗破伤风毒素抗体核酸中引入适当核苷酸变化或由肽合成制备。该等修饰包括(例如)抗破伤风毒素抗体氨基酸序列内之残基缺失及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代之任何组合以达成最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所要特征。氨基酸变化亦可改变抗破伤风毒素抗体之转译后过程，诸如改变糖基化位点之数目或位置。

氨基酸序列插入物包括长度为一个残基至含有一百个或更多残基之多肽之氨基及/或羧基末端融合体，以及具有单个或多个氨基酸残基之序列内插入物。末端插入物之实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗破伤风毒素抗体或与细胞毒性多肽融合之抗体。抗破伤风毒素抗体分子的其它插入变体包括抗破伤风毒素抗体的N末端或C末端与酶(例如，对于ADEPT而言)或增加抗体之血清半衰期之多肽的融合体。

本发明涵盖与所述抗体的氨基酸序列或者编码该抗体的任何核苷酸序列具有一定程度的序列一致性或序列同源性的序列，本发明中，“同源性”可等同于“一致性”。

本发明的药物组合物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，真空干燥和冷冻干燥从活性成分和其它期望成分的预先无菌过滤过的溶液产生活性成分和其它期望成分的粉末。可选择地，本发明的组合物可在溶液中，且在递送之前或递送时可加入和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂以提供可注射的单位剂型。优选地，本发明中使用的药学上可接受的赋形剂适用于高药物浓度，可保持适当的流动性，且如果需要可延迟吸收。

本发明的药物组合物的最佳给药途径的选择会受到几个因素的影响，包含组合物中活性分子的物理化学性质、临床表现的紧迫性和活性分子的血浆浓度与期望的治疗效果之间的关系。例如，可与载剂一起制备本发明的单克隆抗体，其中载剂将保护它们以防止快速释放(诸如控释制剂)，该载剂包含植入物、透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。可在本发明中使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。进一步地，单克隆抗体可包被有防止抗体失活的材料或化合物、或与这样的材料或化合物同时给药。例如，单克隆抗体可与适当的载剂(例如脂质体或稀释剂)一起给药。

本发明的药物组合物的给药途径可分成口服给药和胃肠外给药。优选的给药途径是静脉注射，但并不限于此。

口服剂型可被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、分散的粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊、软胶胶囊、糖浆或酏剂、丸剂、糖衣丸、液体、凝胶或膏剂。这些制剂可包含药学赋形剂，其中药学赋形剂包括但并不限于：成粒剂和崩解剂，结合剂，润滑剂，防腐剂，着色剂、调味剂或甜味剂，植物油或矿物油，湿润剂，和增稠剂。

由于胃肠外给药的制剂可为水性或非水性的等渗无菌无毒的注射或灌注溶液或悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包括所采用的剂量和浓度对接受者无毒的试剂，诸如1，3-丁二醇、林格氏溶液、汉克溶液、等渗的氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉剂、防腐剂、缓冲液、粘度或溶解性增高的试剂、水溶性的抗氧化剂、油溶性的抗氧化剂和金属螯合剂。

由于胃肠外给药的制剂可为水性或非水性的等渗无菌无毒的注射或灌注溶液或悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包括所采用的剂量和浓度对接受者无毒的试剂，诸如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer’s solution)、汉克溶液(Hank’ssolution)、等渗的氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉剂、防腐剂、缓冲液、粘度或溶解性增高的试剂、水溶性的抗氧化剂、油溶性的抗氧化剂和金属螯合剂。

附图说明

图1是本发明所述的抗体的SDS-PAGE和Western Blot检测结果图；其中，图A是SDS-PAGE图；图B是Western Blot图；

图2是本发明所述的抗体与破伤风标准毒素中和活性检测结果图；

图3是本发明所述的抗体与破伤风标准毒素的亲和活性检测图；

图4是本发明所述的抗体体内保护试验结果图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1全人源抗破伤风毒素中和抗体的制备

1、分选细胞

一名健康志愿者注射1500IU破伤风类毒素(疫苗)，分别于第0、14、21天采集血液样本。然后分离单个核细胞(PBMC)；然后用BD FACSria流式细胞仪从PBMC分选出浆细胞，将形态完好的单个细胞置于96孔PCR板中，使每个孔含有一个记忆性B细胞，-80℃冰箱保存备用。

2、分离抗体可变区基因

将含有单个B细胞的96孔板加入0.5μM的各亚型重链与轻链的恒定区引物与Superscript III反转录酶，37℃孵育1小时；按以下参数进行PCR扩增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min；4℃5min。产物cDNA-20℃保存。

以上述cDNA和相应引物为模板，PCR扩增抗破伤风痉挛毒素全人源抗体基因。

(1)PCR体系和参数设置如下：

试剂体积(μl)

10×缓冲液5

Mg²⁺(25mmol/l)2

10mM dNTP Mix 1

P-Fwd0.5

P-Rev 0.5

模板cDNA 5

THotStarTaq Plus酶1

ddH2O 35

总量50/样品

PCR参数设置：预变性94℃5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：94℃×30s，55℃×30s，72℃×50s，最后用72℃延伸7min。

(2)用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，并与DNA分子量标记LD2000判断扩增片段的大小。结果显示：分别有23条兼并引物扩增出轻链可变区基因，有21条兼并引物扩增出重链可变区基因，其大小约为500-800bp，条带单一，与轻/重链可变区基因片段的理论大小基本一致。

3、抗破伤风毒素全人源单克隆抗体真核表达载体的构建

(1)分别将上述轻链/重链基因插入pcDNA3.3(+/-)表达载体(购自Invitrogen公司)的单克隆酶切位点，构建抗破伤风痉挛毒素全人源单克隆抗体的表达载体。

(2)用上述连接产物转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜。

(3)挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28个循环，最后72℃再延伸5min；

(4)取5μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。

结果显示，本发明构建的抗破伤风毒素单抗重链/轻链的重组表达载体其序列正确。

4、破伤风毒素全人源单克隆抗体的表达和鉴定

利用DNA转染试剂盒PolyFect将抗破伤风毒素全人源抗体重链/轻链表达载体共转染293细胞，以未转染质粒的空细胞对照。培养96h后，采用常规ELISA法，用HRP标记的羊抗人IgG抗破伤风毒素全人源抗体的表达及抗体对破伤风标准毒素抗原的特异性识别。

结果显示，共转染表达质粒载体的293细胞成功表达全人源抗体，能有效识别破伤风标准毒素，而未转染表达质粒的293细胞培养上清不能识别。即瞬时转染293成功表达了能特异性识别破伤风标准毒素的抗破伤风毒素全人源抗体。

5、破伤风毒素全人源单克隆抗体批量生产与纯化

将中和实验鉴定的有中和活性的编号为TRN0011抗体重链与轻链的表达载体(其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示)共转染293细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃8％CO₂培养箱中培养96小时。收集转染上清、离心，利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。

利用SDS-PAGE和Western Blot实验检验抗体的表达及纯化情况，结果见图1，证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链。

实施例2 TRN0011抗体的中和活性检测

用前文提到的相同的ELISA方法对表达纯化的抗体的结合活性进行检测：以破伤风标准毒素为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔100μl 4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2h。将本发明所述的抗体按比例稀释后作为一抗常温孵育2h，用HRP/anti-His-tag(1:2000稀释)作为二抗常温孵育1h，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸中止反应，用450nm波长进行比色，分析结果。

结果如图2所示，把表达纯化的TRN0011抗体进行大于50,000倍稀释后(抗体浓度约为：0.0002μg/ml)，TNA0011抗体依然可以与中和抗原，具有极强的中和活性。

实施例3 TRN0011抗体的亲和性检测

使用CM5芯片和人抗体捕获试剂盒，先偶联抗人FC二抗，再捕获抗破伤风毒素单抗，最后用不同浓度的破伤风毒素蛋白为分析物。破伤风标准毒素用HBS-EP缓冲液稀释作为分析物，分析物以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用3mol/L的氯化镁再生芯片以回复到原始未结合抗原的状态。用BiaCore X-100System软件进行单抗与破伤风标准毒素(抗原)结合的亲和力和动力学分析。

结果如图3和表1所示，全人源抗破伤风毒素中和抗体的解离常数为3.87E-05(1/s)，平衡常数达9.05E-10M，表明该抗体具有很高的亲和力。

表1全人源抗破伤风痉挛中和抗体的亲和力测定结果

ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
			4.27E+04	3.87E-05	9.05E-10

实施例4抗破伤风毒素单克隆抗体对动物的保护作用实验

(1)待检抗破伤风毒素单抗的稀释

用稀释液将待检单抗稀释成100μg/ml(单抗浓度>1mg/ml)，即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中单抗浓度为50μg/ml。

(2)标准抗毒素稀释：

标准抗毒素用生理盐水溶解液与中性甘油(经116℃10分钟高压蒸汽灭菌)等量混合，然后用稀释液稀释，使每1ml含0.5IU(即5个IU/10)；即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中含IU/10。标准抗毒素原液的一次吸取量不应少于0.5ml。

(3)毒素稀释：

自中检所购买的冻干粉状毒素应用生理盐水溶解液与中性甘油(经116℃10分钟高压蒸汽灭菌)等量混合，然后用稀释液稀释毒素至使用量。

(4)半数致死量的测定(LD₅₀)

将配制好的毒素用稀释液依次稀释10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，每个稀释度至少稀释2ml，取0.2ml注射小鼠，每组4只。观察5天。根据实验结果计算出LD₅₀，实验组使用10倍于LD₅₀量。

(5)破伤风毒素的标定

将配制好的毒素用稀释液稀释30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，与0.2ml含IU/10的标准抗破毒素混合，37℃结合1小时，立即注射。观察5天，小鼠应该存活3-5天为合适的毒素剂量，即1个试验量(L+/10)。

(6)单抗效价测定

混合定量吸取已稀释之标准抗毒素及不同稀释度之待检单抗分别装入小试管中，每管加入等量之稀释试验毒素，混合均匀，加塞，37℃结合1小时，立即注射。

取健康实验小白鼠28只，每组4只，分为7组。将上述中混合物分别皮下注射体重为18～22g小白鼠腹部，每只注射0.4ml(阴性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml硼酸盐缓冲盐水；阳性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml抗毒素；实验组包括0.2ml毒素+0.2ml单抗)。每日上、下午各观察一次，连续一周，记录小白鼠发病与死亡情况。

结果：结果如图4所示，阴性对照小白鼠于48小时之内全部死亡，单抗浓度低至0.62μg/mL剂量的实验组小鼠于全部存活。表明本发明的单抗剂量为0.62μg/mL时，与标准抗毒素的效价(10IU/ml)相当，能有效地保护动物防御致死剂量破伤风毒素的攻击，与标准抗毒素的保护性基本一致。并且，本发明单抗的实际用量远远低于标准抗毒素，这表明本发明的抗破伤风毒素全人源单克隆抗体与破伤风毒素具有极其强的效价作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 珠海泰诺麦博生物技术有限公司

<120> 一种抗破伤风毒素的全人源中和抗体

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Gly Pro Phe Thr Gly Ser Tyr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Ser Gln Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Leu Thr Lys His Tyr Ile Asn Ser Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Gly Val Ala Gly Gly Pro Phe Thr Gly Ser

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Val Ser Gln Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Thr Lys His Tyr Ile Asn Ser Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Ile Ile Gly Ser Trp

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Lys Ala Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Val Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gly Pro Phe Thr Gly Ser Tyr Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro

1 5 10 15

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Ser Gln Ser Gly Ser Thr

20 25 30

Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr

35 40 45

Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp

50 55 60

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Thr Lys His Tyr Ile Asn Ser

65 70 75 80

Ala Tyr

<210> 10

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Ile Ile Gly Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

1 5 10 15

Ala Pro Thr Leu Val Ile Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val

20 25 30

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Thr Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

35 40 45

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

50 55 60

Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

65 70

Claims

1.一种破伤风毒素的中和抗体，其特征在于，所述中和抗体包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区；其中所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、6、7所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

4.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1或2所述的抗体的核苷酸序列。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的核酸分子，或包含权利要求6所述的表达载体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的抗体。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

10.如下任一项所述的应用：

1)权利要求1-4任一项所述的抗体在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染的药物中的应用；

2)权利要求5所述的核酸分子在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染的药物中的应用；

3)权利要求6所述的表达载体在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染的药物中的应用；

4)权利要求7所述的宿主细胞在制备抗破伤风毒素或破伤风梭菌感染的药物中的应用。