JP2003527440A

JP2003527440A - コラーゲン結合蛋白質からの交差反応性追放抗体および同定方法および使用

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Publication number: JP2003527440A
Application number: JP2001568463A
Authority: JP
Inventors: マグナスフック; イスー; ピエトロスペジャーレ; リヴィアヴィサイ; ファブリジャキャソリニ; ジョセフパティ; プラチクシャパテル; ポールドマンスキー
Original assignee: インヒビテックスインコーポレーテッド; ザテキサスエーアンドエムユニヴァーシティシステム; ユニヴァーシタデグリストゥディディパヴィア
Priority date: 2000-03-17
Filing date: 2001-03-19
Publication date: 2003-09-16
Also published as: EP1267930A1; US7241592B2; US20070122416A1; CA2403359A1; EP1267930A4; WO2001070267A1; AU2001256958A1

Abstract

(57)【要約】ＣＮＡ蛋白質およびコラーゲン結合ドメインからの他の領域（ドメインＣＮＡ１９を含む）に対する抗体が提供され、そしてこの様式で産生される抗体は、Staphylococcus aureusおよびStaphylococcus epidermidis細菌に対して交差反応性であると示され、従ってこれはこれらのタイプの両方の細菌によって引き起こされる感染の予防および処置に使用され得る。更に、医療機器が、それらの感染または更なる感染の広がりの可能性を減少または排除するために、本発明の抗体を使用して処理される。特に、該蛋白質は有利であり、何故ならばそれらが交差反応性であり、従って１種以上のブドウ球菌による重篤な感染を減少または予防するために患者へ投与され得るからである。この様式で作製された抗体はまた、追放活性を示すことが示され、従ってこれらの抗体は、細胞外マトリックス上の結合部位から細菌蛋白質を追放する能力のために、既存のブドウ球菌感染を有する患者に投与され得る方法において有利に使用され得る。最後に、追放抗体を同定、単離および使用する方法がまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、概して、コラーゲンが黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
細菌へ結合することを阻害し得る追放抗体（displacing antibodies）、および
追放抗体を発生および使用するための方法、特にS.aureusおよびS.epidermidis
の多重菌株に交差反応性であるＣＮＡ、Staphylococcus aureusのコラーゲン付
着因子及びそのサブ領域(subresions)に対する抗体に関し、そしてこれはコラー
ゲンがS.aureusへ結合することを阻害するために、そして種々の組成物ならびに
S.aureusおよびS.epidermidisからの感染の治療または予防的処置のための方法
において、使用され得る。

【０００２】発明の背景 Staphylococcus aureusは、広範な宿主組織に定着し、そして感染（例えば、
心内膜炎、創傷感染、肺炎、骨髄炎及び敗血性関節炎）を引き起こし得る細菌病
原体である。宿主組織における初期の付着および定着（colonization）は、疾患
発生における最初の重要なステップであると考えられる。Staphlococciは、細胞
外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質への付着を媒介する、ＭＳＣＲＡＭＭ（Microb
ial Surface Component Recognizing Adhesive Matrix Molecules）という名の
表面蛋白質のファミリーを産生する。コラーゲンは、主要なＥＣＭ蛋白質であり
、そして皮膚、骨、腱、軟骨および歯のような組織の主成分である。Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓは、宿主組織に定着する方法としてコラーゲンを使用するストラテジーを
開発したことが、考えられる。

【０００３】いくつかの研究が、この考えを支持している。例えば、感染した関節から取っ
たＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞は、軟骨へ主に付着されることが示された（１）。Swit
alskiらは、コラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭ，ＣＮＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓがイ
ンビトロで軟骨へ付着するために必要かつ十分であることを実証した（２）。更
に、ＣＮＡは、実験的な敗血性関節炎（experimental septic arthritis）にお
いて毒性因子（virulence factor）であることが示された（３）。ＣＮＡ＋株は
、関節の臨床的症状および組織病理学パターンによって評価されるように、同系
ＣＮＡ−株と比較して、劇的に増加した毒性を示す。生きているＳ．ａｕｒｅｕ
ｓ細胞は、ＳＮＡ−株を感染させたマウスの関節から回収されず、一方著しい数
のＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞が、ＣＮＡ＋株を感染させたものの関節から単離された
。更に、ＣＮＡの組換えフラグメントのワクチン接種は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの静
脈内チャレンジに対して敗血性死からマウスを保護する（４）。

【０００４】コラーゲン付着因子を発現すると報告された他の細菌としては、特定の株のEs
cherichia coli（５）、Yersinia enterocolitica（６〜８）、Klebsiella pneu
moniae（９）、Streptococcus mutans（１０、１１）、group A streptococci（
１２）、Streptococcus gordonii（１１、１３）、Enterococcus faecalis（１
４）、Lactobacilli reuteri1（１５）およびLactobacilli crispatus（T.K.Kor
honen, personal communication）が挙げられる。コラーゲン付着因子ＹａｄＡ
は、ラットモデルにおけるY. enterocoliticaの関節炎惹起性（arthritogenicit
y）に寄与することが示された（１６）。アラニンでのＹａｄＡの２ヒスチジン
残基の置換は、コラーゲン結合および細胞付着を廃止し、そしてマウスにおける
毒性を減少させ（１７）、ＹａｄＡのこれらの官能基が関連していることを示唆
する。コラーゲンと相互作用する哺乳動物蛋白質としては、細胞外マトリックス
蛋白質（例えば、フィブロネクチン、デコリン（decorin）、トロンボスポンジ
ン（thrombospondin）およびフォン・ヴィレブランド因子）および細胞レセプタ
ー（例えば、インテグリンα₁β₁およびα₂β₁）が挙げられる。それらの相互作
用は、細胞付着および移動、血小板凝集、および腫瘍転移のようなプロセスを媒
介する。従って、コラーゲンとブドウ球菌付着因子との間の相互作用のより深い
理解は、ブドウ球菌感染の分子病原体の理解に寄与するだけでなく、コラーゲン
結合蛋白質が一般的にこのリガンドとどのように相互作用するかの洞察を提供す
る。

【０００５】以前の研究は、ＣＮＡは、３重らせんコラーゲンならびにコラーゲン様３重ら
せんを形成するいくつかの合成ペプチドを認識することを示した（１８）。ＣＮ
Ａは、グラム陽性細菌の表面蛋白質の典型的なエレメント（elements）を含有す
ることが見出された。それは、シグナルペプチド、非反復性Ａドメイン（non-re
petitive A domain）、いくつかの繰り返し（Ｂドメイン）、続いて細胞壁アン
カー領域（cell-wall anchor region）貫膜セグメント（transmembrane segment
）および短い細胞質テイル（shot cytoplasmic tail）からなる。ＣＮＡのＡド
メイン（ＣＮＡ５５）は、ＣＮＡのコラーゲン結合活性を完全に担うことが見出
された（１９）。最小結合ドメイン（minimun binding domain）は、ＣＮＡ５５
内の、１９ｋＤａフラグメント、ＣＮＡ１９（正式にはＣＢＤ（１５１〜３１８
）と称される）に局在する。ＣＮＡ１９の結晶構造は解明された（２０）。構造
は、２つのアンチパラレルβ−シートおよび２つの短いα−ヘリックスから構成
された。β−ストランドＡ、Ｂ、Ｄの一部、ＥおよびＨはβ−シートＩを形成し
、ならびにストランドＣ、Ｄの一部、Ｆ、Ｇ，ＩおよびＪはβ−シートＩＩを形
成する。トレンチ（trench）が、［（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）₄］₃または［（
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）₄］₃の理論的コラーゲンプローブを使用するドッキン
グ実験によって示されたように、３重らせんコラーゲン分子がフィットするβ−
シートＩにおいて観察された。ＣＮＡ１９のトレンチにおけるいくらかの残基の
部位特異的突然変異（site-directed mutagenesis）は、コラーゲン結合（Ｙ１
７５Ｋ、Ｒ１８９Ａ、Ｆ１９１Ａ、Ｎ１９３Ｋ、およびＹ２３３Ａ）を廃止した
（abolished）か、または減少した結合親和性（Ｎ２２３ＫおよびＮ２７８Ｋ）
を引き起こし（２０、２１）、トレンチは結合に必須であることを示す。それぞ
れ除去されたＮ末端３０アミノ酸またはＣ末端２２アミノ酸を有するＣＮＡ１９
の２つの切断物（truncates）を生成した。Ｃ末端切断物、ＣＢＤ（１５１〜２
９７）はコラーゲンに結合せず、一方Ｎ末端切断物は不溶性であった。Ｎ末端切
断物は、トレンチにおいて６残基以外全てを含有し、そしてＣ末端切断物は全て
の残基を含有し、インタクトなＣＮＡ１９分子は、活性なコラーゲン結合コンフ
ォーメーションにおいてトレンチを提示する際に重要であることを示唆する。イ
ンテグリンα₁β₁およびα₂β₁のＩドメイン（コラーゲン結合ドメイン）につい
ての構造分析はまた、トレンチ様構造の存在を示した（２２〜２４）。α₂β₁の
Ｉドメインにおけるトレンチの壁に沿ういくつかの残基の突然変異は、コラーゲ
ン結合に影響を及ぼした（２５〜２８）。従って、コラーゲンについての相互作
用の部位としてトレンチ構造を使用することが一般的なテーマであり得るようで
ある。

【０００６】近年、Enterococcus faecalisのコラーゲン付着因子（ＡＣＥ）が同定された
（１４）。ＡＣＥは、ＣＮＡと類似のドメイン組織である、シグナルペプチド配
列、繰り返しセグメント（Ｂ繰り返し（B repeats））によって続くコラーゲン
結合領域（Ａ）、および表面ディスプレイ（surface display）のために必要な
エレメントを有する。ＡＣＥのＡドメインは、対応のセグメントにおいてＣＮＡ
のＡドメインと配列類似性を共有し、そして２つの蛋白質のこれらの部分は、Ａ
ＣＥＡドメインの遠ＵＶ円偏光二色性分析（far-UV circular dichroism analy
sis）によって測定されるように、構造的に関連されるようである（１４）。こ
れは、ＡＣＥＡドメインにおけるトレンチ構造が存在し得え、そしてトレンチ
がコラーゲンについての結合部位であり得る可能性を生じさせた。

【０００７】しかし、ブドウ球菌細菌に関しては、ブドウ球菌感染をより有効に予防および
／または処置する方法を開発するためにコラーゲン結合部位に関する情報を同定
しそして使用することは、依然として問題のままである。更に、１を越えるタイ
プのブドウ球菌感染から感染を処置または予防することにおいて有用でありうる
方法および組成物を開発することが、コラーゲン結合活性の研究のゴールである
。最後に、ブドウ球菌感染の予防においてだけでなく、ヒトまたは動物患者の細
胞における細胞外マトリックス上の部位に既に結合されている蛋白質を追放する
ことによって存在する感染を処置することにおいてもまた特に成功した組成物を
開発することは、感染疾患の分野においてなお更に望ましい。

【０００８】発明の要旨従って、本発明の目的は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣＮＡ１９最小コラーゲン結合
領域に対する抗体を提供することであり、これはまた、交差反応性であり、Ｓ．
ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方のコラーゲン結合領域を
認識する。

【０００９】本発明の更なる目的は、１を越える種のブドウ球菌細菌によるコラーゲン結合
を阻害することにおいて有用であり得るコラーゲン結合領域に抗体を提供するこ
とである。

【００１０】本発明の更なる目的は、コラーゲンのような細胞外マトリックス蛋白質へのブ
ドウ球菌細菌の付着を予防する抗体および抗血清を提供することであり、これは
また細胞外マトリックスにおける部位へ既に結合されているＭＳＣＲＡＭＭを追
放し得るであろう。

【００１１】本発明の更なる目的は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよび
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むブドウ球菌細菌による感染を処置または予防する
ことに使用され得る受動ワクチン（passive vaccines）を提供することである。

【００１２】本発明のなお更なる目的は、ＣＮＡ蛋白質およびＣＮＡ１９を含むそのコラー
ゲン結合ドメインに対する抗血清および抗体を生成することであり、これはまた
、ブドウ球菌細菌へのコラーゲンの結合を阻害し得そして従ってブドウ球菌感染
を処置または予防するために使用され得る処置方法を開発することにおいて有用
であり得る。

【００１３】本発明の更なる目的は、臨床および実験セッティングにおけるブドウ球菌生物
中のコラーゲン結合蛋白質を検出および識別するための改善された材料および方
法を提供することである。

【００１４】本発明の更なる目的は、本発明のモノクローナル抗体から可変軽鎖配列および
可変重鎖配列をコードする核酸配列を提供することである。

【００１５】本発明のなお更なる目的は、コラーゲンへのブドウ球菌細菌の付着を阻害また
は追放し得そして従ってブドウ球菌感染の予防処置の改善された治療方法に有用
であり得る好適な組成物を製造するために、ブドウ球菌においてコラーゲン結合
蛋白質に対する抗体を使用するより有効かつ効果的な方法を開発することである
。

【００１６】これらおよび他の目的は、ＣＮＡ蛋白質およびそのサブ領域（ＣＮＡ１９ペプ
チドを含む）に対するモノクローナル抗体の単離および使用を含む本発明によっ
て提供され、そしてこの様式で生成されたモノクローナル抗体は、１を越えるブ
ドウ球菌種の細菌と交差反応性であると示された。本発明に従って、宿主細胞へ
のブドウ球菌細菌の結合を阻害し得るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が提供され
、そして更に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを認識し得
るＣＮＡ１９に対する抗体が、本発明に従って提供される。

【００１７】本発明の別の局面において、認識はコンフォーメーション依存性（conformati
on-dependent）であることが示されたので、本発明は、生成され機能的関連性の
あるＣＮＡ１９内のエピトープを首尾よくマップするために使用されるＣＮＡ１
９とＡＣＥＡドメインのセグメントとの間のキメラ蛋白質を含む。

【００１８】なお更に、本発明に従ってＣＮＡ１９ペプチドに対して惹起された抗体のキャ
ラクタライゼーションは、ＣＮＡ１９ｍＡｂは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の可溶性
コラーゲンへの結合および固定化（immobilized）コラーゲンへの付着に対して
阻害効果を有することを示した。その上、これらの抗体のいくつかは、追放挙動
（diplacing behavior）を示し、そして従ってこれらの抗体は、既に形成された
コラーゲン−細菌複合体からＳ．ａｕｒｅｕｓを有効に放出させ、そして固定化
コラーゲンの表面からＳ．ａｕｒｅｕｓを脱着（detach）し得る。コラーゲンと
ＣＮＡ１９の種々のコンフォーメーショナル状態との間の相互作用のモデルおよ
び治療薬剤としてのこれらの追放ｍＡｂの意図された臨床適用がまた、本発明に
従って提供される。

【００１９】更に、本明細書中で示されるように、本発明に従ってＳ．ａｕｒｅｕｓからの
ＣＮＡ１９に対して生成されたマウスモノクローナル抗体は、それらがＳ．ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓの５つの異なる臨床分離株を認識した点で交差反応性である
ことが示され、そして従って１種を超えるブドウ球菌細菌からの感染を予防また
は処置することにおいて有効である抗体組成物を開発することに有用であり得る
。

【００２０】なお更に、本発明は、細菌感染を処置または予防する方法において単離および
使用され得る追放抗体（displacing antibodies）のクラスの発見に関する。更
に、本発明は、追放抗体を同定および単離するための方法、ならびに本方法にお
いて同定および単離される抗体を提供する。

【００２１】従って、本発明に従って、コラーゲン結合ドメインのＣＮＡ１９領域に対して
惹起された抗体が提供され、そして１種を超える細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からの細菌感染を処置または予防する交
差反応性方法において、該抗体を含有する組成物、ＣＮＡ１９または感染におけ
るそれらの細菌を同定させ得るコラーゲン結合蛋白質の他の領域に対して惹起さ
れた好適な抗体または抗血清を含有する診断試験キットと共に、使用され得る。

【００２２】開示される発明の精神および範囲内のこれらの実施形態ならびに他の代替物お
よび改変物は、本明細書および／または本明細書中で引用される参考文献を読む
ことから、容易に当業者に明らかとなるであろう。

【００２３】好ましい実施形態の詳細な説明本発明に従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣＮＡ蛋白質に対するモノクローナル抗
体、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方に対し
て交差反応性であると示された、ブドウ球菌細菌におけるＣＮＡコラーゲン結合
蛋白質のＣＮＡ１９領域に特異的な抗体が提供される。更に、ＣＮＡ１９に対し
て生成された他の抗体は、それらが宿主細胞へ既に結合されたブドウ球菌細菌を
追放し得るような、追放挙動を示すことが示された。

【００２４】ブドウ球菌細菌におけるＣＮＡ蛋白質は、該細菌が宿主細胞の細胞外マトリッ
クスにおけるコラーゲンを標的化しそしてこれに結合することを可能にするコラ
ーゲン結合付着因子であり、そして従ってヒトおよび動物患者に感染し得そして
医療機器および補綴装置に定着および影響を与えさせし得る細菌細胞の定着（co
lonization）および増殖（multiplication）に関して非常に重要な蛋白質であり
得る。研究は、実際に、多くの他の蛋白質と異なり、ＣＮＡの蛋白質配列（これ
は、ブドウ球菌細菌の６０％によって発現される）は、この蛋白質を発現する広
範な株にわたって事実上同一であり、そしてＣＮＡ配列に関して種々の株間には
変化（variation）はほとんど或いは全く無い。結果として、ＣＮＡ蛋白質に対
して生成されたモノクローナル抗体は非常に価値があり、何故ならば、特定の抗
原およびその配列に非常に特異的である多くの他のモノクローナルとは異なり、
ＣＮＡ蛋白質に対して生成されたモノクローナル抗体は、それが広範なブドウ球
菌株による感染を認識しそしてこれから保護するという点で、極めて万能である
からである。

【００２５】従って、本発明は、ブドウ球菌感染を予防および処置する方法において有用で
あり得る、ＣＮＡ蛋白質またはＣＮＡ１９ペプチドに対して生成された単離およ
び／または精製されたモノクローナル抗体に関し、そしてこれらのモノクローナ
ル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（２９）の方法または当
該分野に公知の他の好適な様式を使用して製造され得る。なお他の有用な抗体が
、以下に更に説明されるように、コラーゲン結合ドメインのＣＮＡ１９領域を含
むであろうＡドメインのより大きなセグメントに対して精製され得る。本発明に
従うモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して調製された抗血清がま
た、意図され、そして当業者によって認識されるであろうように任意の多数の好
適な様式で調製され得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣＮＡ蛋白質のＣＮＡ１９ペプチ
ド領域に対して惹起された抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓだけでなくＳ．ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｄｉｓも同様にその感染の予防および処置に有用であることがまた意図さ
れる。ＣＮＡ１９に対する抗体に関して、これらの抗体は、天然の単離されそし
て精製されたＣＮＡ１９に対して生成され得、または好ましくは、組換えＣＮＡ
１９に対して生成され得る。抗体が惹起されるＣＮＡ１９ペプチドは、好ましく
は、広範なブドウ球菌株、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＣｏｗａｎＩ、または
、５７、７２、１１６、１７５、１７６、１８０、２０３、２０５、２１２およ
び４０４６として同定される任意の他の株（これは、世界中の種々の国からの臨
床分離株である）から単離される。一般的に、本発明に従い利用されるＳ．ａｕ
ｒｅｕｓ株は、コラーゲンへ結合することが公知であるものを使用することが好
ましい。

【００２６】本発明に従って、ＣＮＡ蛋白質のコラーゲン結合ドメインのＣＮＡ１９モチー
フ（またはＣＢＤ１５１〜３１８）に対する抗体が、例えばＣＮＡ１９に対する
モノクローナル抗体を生成するために使用され得る十分に確立されたＫｏｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ法（２９）のような、当業者に周知であろう多数の好
適な様式で調製され得る。この方法において、マウスが精製組換えＣＮＡ１９ド
メインを長期間週に一回腹腔内注射され、続いて精製ＣＮＡ１９ペプチドに対す
る反応性を測定するために免疫化マウスから得られる血液の試験がなされる。Ｃ
ＮＡ１９に対して反応性のマウスの同定に続いて、マウス脾臓から単離されたリ
ンパ球を、マウス骨髄腫細胞に融合させて、ＣＮＡ１９に対する抗体について陽
性のハイブリドーマを製造し、これを次いで単離しそして培養し、続いて精製お
よびアイソタイピング（isotyping）する。

【００２７】本発明に従ってモノクローナル抗体を生成するために、これらは、組換えで調
製されたＣＮＡ１９ペプチドを使用して、当該分野に周知の慣用方法で生成され
ることが好ましい。例えば、１つのこのような方法は、組換え蛋白質およびペプ
チドをクローニングおよび発現するために、宿主として大腸菌株ＪＭ１０１をそ
して発現ベクターとしてｐＱＥ−３０を使用する。ＤＮＡ調製、精製、制限消化
、アガロースゲル電気泳動およびライゲーション（ligation）が、標準方法を使
用して行われ得、そして得られる組換えＣＮＡ１９セグメントが、単離および精
製され得、次いで上記に記載の様式でモノクローナル抗体を生成するために使用
される。

【００２８】モノクローナル抗体に加えて、本発明はまた、同様にＣＮＡ１９からのポリク
ローナル抗体を生成することを意図する。このようなポリクローナル抗体は、当
該分野で周知の任意の多数の好適な様式（例えば、精製ＣＮＡ１９ペプチドの好
適な動物宿主への導入、続いて宿主動物において作製された生成された抗体の単
離および精製）で生成され得る。

【００２９】ＣＮＡ１９モチーフの組換え形態を使用しての抗体の製造が好ましいが、抗体
は、同様に天然の単離および精製されたＣＮＡ１９から生成され得、そしてモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体が、このような抗体を得るために上記で記
載されたのと同一の様式で天然ＣＮＡ１９を使用して生成され得る。更に、本発
明に従う抗体を生成するための多数の他の様式が可能であり得、全ＣＮＡ蛋白質
を組換えで発現させてそして次いで単離ＣＮＡ蛋白質からＣＮＡ１９領域を単離
することを含む。なお他の慣用の様式は、当業者に認識されるように、組換えま
たは天然精製ＣＮＡ１９を使用して、本発明のＣＮＡ１９抗体を生成するために
利用可能である。

【００３０】当業者によって認識されるように、本発明の抗体はまた、ブドウ球菌細菌（例
えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）によって引き起こ
される感染を処置または予防するために、ヒトまたは動物患者への投与に好適な
薬学的組成物へ形成され得る。本発明の抗体またはその有効なフラグメントを含
有する薬学的組成物は、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタ
ノール、他の治療学的化合物およびその組み合わせのような、当該分野に一般的
に使用される好適な薬学的ビヒクル、賦形剤または担体と合わせて、処方され得
る。当業者が認識するように、使用される特定のビヒクル、賦形剤または担体は
、患者および患者の状態に依存して変化し、当業者によって認識されるように種
々の投与形態が本発明の組成物について好適であろう。本出願に開示される任意
の薬学的組成物の投与の好適な方法としては、局所、経口、肛門、膣、静脈内、
腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内および皮内が挙げられるが、これらに限定されない
。

【００３１】局所投与について、組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、ドロップ
（例えば、点眼剤および点耳剤（ear drops））、または溶液（例えば、マウス
ウォッシュ）の形態で処方される。創傷または手術包帯（dressings）、縫合糸
およびエアゾール噴霧器（aerosols）が、該組成物で含浸され得る。組成物は、
保存剤、浸透を促進するための溶媒、および軟化剤（emollients）のような慣用
の添加物を含有し得る。局所製剤はまた、クリームまたは軟膏ベース、エタノー
ル、またはオレイルアルコールのような慣用の担体を含有し得る。

【００３２】抗体組成物のさらなる形態、ならびにコラーゲン結合蛋白質に関する組成物、
方法および適用に関する他の情報は、例えば米国特許出願シリアル番号08/856,2
53（１９９７年５月１４日出願）、米国特許出願シリアル番号09/494,297（２０
００年１月３１日出願）、および米国特許出願シリアル番号09/568,470（２００
０年５月１０日出願）に開示され、これら出願の全明細書が、本明細書中で参考
として援用される。

【００３３】Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣＮＡ蛋白質のＣＮＡ１９または最小コラーゲン結合領域
に対して生成されるがしかしＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対しても有効である
本発明の抗体組成物はまた、該複合体（conjugate）に対する免疫応答を増強さ
せるに有効な量の好適なアジュバントと共に、投与され得る。この時、ヒトに広
く使用される唯一のアジュバントは、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水
酸化アルミニウム）である。サポニンおよびその精製成分ＱｕｉｌＡ、フロイ
ント完全アジュバント（Freund's complete adjuvant）ならびに研究および獣医
学適用に使用されるための他のアジュバントは、ヒトワクチンにおけるそれらの
可能性がある使用を制限する毒性を有する。しかし、ムラミールジペプチド、モ
ノホスホリルリピドＡ、リン脂質複合体（例えば、Goodman-Snitkoff et al. J.
Immunol. 147:410-415 (1991)に開示され、そして本明細書中で参考として援用
されるもの）、プロテオリピドソーム中の複合体の封入物（例えば、Miller et
al., J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992)によって開示され、そして本明細書中
で参考として援用される）、および脂質小胞中の蛋白質の封入物（例えば、Ｎｏ
ｖａｓｏｍｅ^TM脂質小胞（Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH））のよ
うな化学的に規定される調製物がまた、有用であり得る。

【００３４】従って、いずれの場合でも、本発明の抗体組成物は、ブドウ球菌細菌と宿主細
胞におけるコラーゲンとの間の結合相互作用を妨げ、調節し、阻害するために、
または宿主細胞におけるコラーゲンに結合しているブドウ球菌細菌を追放するこ
とにおいて、有用である。

【００３５】本発明によれば、感染を処置または予防するに有効な量で、上述のようなＣＮ
Ａ１９に対する有効量の抗体を投与することを含む、ブドウ球菌感染を予防また
は処置するための方法が提供される。上記でも示したように、ＣＮＡ１９抗体は
、コラーゲン（例えば、宿主細胞の細胞外マトリックスにおけるコラーゲン）へ
結合されているＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌を追放する能力を示すことが観察され、そ
して従って本発明の有利な局面の１つは、ブドウ球菌細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の存在する（standing）感染と戦う
ために使用され得る方法および組成物の提供であり、何故ならば本発明のＣＮＡ
１９抗体は、宿主細胞におけるコラーゲンから該細菌を追放するからである。従
って、本発明によれば、上述の任意の従来様式（例えば、局所、非経口、筋肉内
など）での本発明の抗体の投与は、以前は可能でない様式でブトウ球菌感染を追
放することに有用であり、そして従って、ヒトまたは動物患者におけるブドウ球
菌感染を処置する非常に有用な方法を提供する。有効量は、宿主細胞へのブドウ
球菌細菌の結合を阻害するに十分なレベルの抗体力価か、または感染前の場合に
は、宿主細胞から細菌を追放して感染を処置するに十分である量を意味する。当
業者に認識されるように、ブドウ球菌感染を処置または予防することにおいて有
効であるために必要とされる抗体力価のレベルは、患者の性質および状態、およ
び／または既存のブトウ球菌感染の重篤度に依存して変化する。

【００３６】従って、このような部位に既に結合された蛋白質を追放するような結合部位に
対する追放活性を示す本発明に従う単離された抗体は、ブドウ球菌感染を処置ま
たは予防するために慣用的に使用される多数の好適な方法において、単独でまた
はアジュバントと組み合わせてのいずれかで、ヒトまたは動物へ投与され得る。

【００３７】上述のようなＣＮＡ１９に対する抗体の使用に加えて、本発明は、ブドウ球菌
細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の検出、
そして従って患者においてまたは医療器具（これもまた感染され得る）において
に関わらず、ブドウ球菌感染を診断するために抗体を使用することを含む、種々
の様式でのこれらの抗体の使用を意図する。本発明によれば、ブドウ球菌感染の
存在を検出する好ましい方法は、１以上のブドウ球菌細菌種または株によって感
染されていると疑われるサンプル（例えば、個体から、例えばその血液、唾液、
組織、骨、筋肉、軟骨、または皮膚から得られるサンプル）を得る工程を包含す
る。次いで、細胞が溶解され得、そしてＤＮＡが抽出され、沈殿され、そして増
殖される。サンプルの単離に続いて、本発明の抗体を使用する診断アッセイが、
ブドウ球菌細菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含む）
の存在を検出するために行われ得、そしてサンプルにおけるこのような存在を測
定するためのこのようなアッセイ技術は、当業者に周知であり、そしてラジオイ
ムノアッセイ、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。

【００３８】従って、本発明に従う抗体は、ブドウ球菌コラーゲン結合蛋白質の特異的検出
、ブドウ球菌細菌からの感染の予防、継続中の感染の処置、または研究ツールと
しての使用のために使用され得る。本明細書中で使用される用語“抗体”は、モ
ノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖、二重特異性（bispecific）、
猿化（simianized）、およびヒト化または霊長類化（primatized）抗体ならびに
Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーのプロダクトを含
む）を含む。これらのタイプの抗体または抗体フラグメントの産生は、当業者に
周知である。今回の場合、ＣＮＡ１９に対して特異的なポリクローナル抗血清が
産生され、これは、ウェスタンイムノブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイにおい
てＣＮＡ１９と反応し、そしてコラーゲンへの結合を妨げる。

【００３９】上述の抗体のいずれもが、ブドウ球菌細菌の同定および定量のために、検出可
能な標識で直接標識化され得る。イムノアッセイにおける使用のための標識は、
一般的に、当業者に公知であり、そして酵素、ラジオアイソトープ、および蛍光
、発光および色素産生性物質（コロイダルゴールドまたはラテックスビーズのよ
うな着色された粒子を含む）を含む。好適なイムノアッセイとしては、酵素結合
イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。

【００４０】あるいは、抗体は、免疫グロブリンについて親和性を有する標識化物質との反
応によって、間接的に標識化され得る。抗体は、第２物質と複合体化されて、そ
して抗体へ複合体化された第２物質について親和性を有する第３物質で検出され
得る。例えば、抗体はビオチンへ結合され、抗体−ビオチン複合体が、標識化さ
れたアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検出され得る。同様に、抗体
はハプテンへ複合体化され、そして抗体−ハプテン複合体が、標識化された抗−
ハプテン抗体を使用して検出され得る。抗体およびアッセイ複合体を標識するこ
れらおよび他の方法は、当業者に周知である。

【００４１】コラーゲン−結合蛋白質ドメインＣＮＡ１９に対する抗体がまた、例えばアフ
ィニティークロマトグラフィーによって、更なる量の蛋白質を単離するために、
製造設備または実験室において、使用され得る。例えば、本発明の抗体はまた、
更なる量のコラーゲンを単離するために使用され得る。

【００４２】本発明の単離された抗体、またはその活性なフラグメントはまた、ブドウ球菌
感染に対する受動免疫化（passive immunization）のためのワクチン開発におい
て使用され得る。更に、創傷へ薬学的組成物として投与されるかまたはインビト
ロまたはインビボで医療装置またはポリマー性生体材料をコーティングするため
に使用される場合、本発明の抗体は、追放挙動を示すので、これらの抗体はこの
細菌感染を追放するように機能するので、既存のブドウ球菌感染が既に存在する
場合に特に有用である。更に、抗体は、特定の場合において、それが投与される
患者においてそれがより少ない免疫性であるように、必要である場合には修飾さ
れ得る。例えば、患者がヒトである場合、抗体は、例えばJones et al., Nature
321:522-525 (1986) またはTempest et al. Biotechnology 9:266-273 (1991)
によって記載されるように、ハイブリドーマ由来抗体の相補性決定領域をヒトモ
ノクローナル抗体へ移植することによって、“ヒト化”され得る。

【００４３】ここで記載される抗体、蛋白質および活性フラグメントでコーティングされる
医療装置またはポリマー性生体材料としては、ステープル（staples）、縫合糸
、置換心臓弁（replacement heart valves）、心臓補助装置（cardiac assist d
evices）、ハードまたはソフトコンタクトレンズ、眼内レンズインプラント（前
房（anterior chamber）または後房）、他のインプラント、例えば、角膜インレ
ー（corneal inlays）、角膜プロテーゼ（kerato-prostheses）、脈管ステント
、エピケラトファリア（epikeratophalia）装置、緑内障シャント（glaucoma sh
unts）、網膜ステープル（retinal staples）、強膜バックル（scleral buckles
）、歯科プロテーゼ（dental prostheses）、甲状腺軟骨形成装置、喉頭形成装
置、脈管グラフト、軟および硬組織プロテーゼ（ポンプを含むが、これに限定さ
れない）、電気装置（スティミュレーターおよびレコーダーを含む）、耳プロテ
ーゼ、ペースメーカー、人工喉頭、歯科インプラント、乳房インプラント、陰茎
インプラント、頭蓋／顔の腱、人工関節、腱、靭帯、半月板、および円板、人工
骨、人工器官（人工膵臓、人工心臓、人工肢、および心臓弁を含む）、ステント
、ワイヤー、ガイドワイヤー、静脈内および中心静脈カテーテル、レーザーおよ
びバルーン血管形成装置、脈管および心臓装置（チューブ、カテーテル、バルー
ン）、心室補助器（ventricular assists）、血液透析成分、血液オキシジェネ
−ター、尿道／尿管／尿装置（Ｆｏｌｅｙカテーテル、ステント、チューブおよ
びバルーン）、気道カテーテル（気管内および気管開口チューブおよびカフ（cu
ffs））、経腸供給チューブ（経鼻胃管、胃内および空腸チューブ）、創傷ドレ
ナージチューブ、体腔（例えば、胸膜、腹膜、頭蓋、および心膜腔）を空にする
ために使用されるチューブ、血液バック、試験管、採血チューブ、ヴァキュテイ
ナー（vacutainers）、注射器、針、ピペット、ピペットチップ、および血液チ
ュービングが挙げられるが、これらに限定されない。

【００４４】用語“コーティングされた（coated）”または“コーティング（coating）”
は、本明細書中で使用される場合、抗体または活性フラグメント、あるいはそれ
から誘導される薬学的組成物を、装置の表面、好ましくはブドウ球菌細菌感染へ
曝される外部表面に適用することを意味する。装置の表面は、該蛋白質、抗体ま
たは活性フラグメントによって完全にカバーされる必要はない。

【００４５】好ましい実施形態において、抗体はまた、ブドウ球菌感染を処置または予防す
るために好適な抗体を提供することにおいて有用である受動ワクチン（passive
vaccine）として使用され得る。当業者に認識されるように、ワクチンは、多数
の好適な様式での、例えば非経口（即ち、筋肉内、皮内または皮下）投与または
鼻咽頭（即ち、鼻内）投与による投与のために、パッケージされ得る。一般的に
、ワクチンが三角筋へ筋肉内注射されることが好ましいが、投与の特定のモード
は、扱われる細菌感染の性質および患者の状態に依存する。ワクチンは、好まし
くは、投与を促進するために薬学的に許容される担体と組み合わせられ、そして
担体は、通常、保存剤を含むかまたは含まない、水または緩衝生理食塩水である
。ワクチンは、投与時に再懸濁のために凍結乾燥されるか、または溶液であり得
る。

【００４６】本発明に従う抗体組成物の投与のために好ましい用量は、量がブドウ球菌感染
を予防または処置することにおいて有効であることであり、そしてこの量は、感
染の性質および患者の状態に依存して大いに変化することが認識されるだろう。
上述のように、本発明に従って使用される“有効量”の抗体または薬学的薬剤は
、所望の予防または治療効果が引き起こされるような、非毒性であるが十分な量
の薬剤を意味するように意図される。以下に指摘されるように、必要とされる抗
体または特定の薬剤の正確な量は、被験体の種、年齢、および一般的状態、処置
される状態の重篤度、使用される特定の担体またはアジュバントおよびその投与
モードなどに依存して、被験体ごとに変化する。従って、任意の特定の抗体組成
物の“有効量”は、特定の状況に基づいて変化するであろう。

【００４７】しかし、好適な有効量は、ルーチンの実験のみを使用して、当業者によって、
適用の各場合において決定され得る。この点で、本発明の組成物が、約０．５〜
７５ｍｇ／ｋｇの本発明に従うＣＮＡ１９抗体を含有することが、一般的に好ま
しく、約５〜３０ｍｇ／ｋｇ範囲が抗体のより一般的な所望の範囲である。この
範囲に基づいて、より重い体重についての等価投薬量が決定され得る。用量は、
組成物が投与される個体に合うように調節されるべきであり、そして個体の年齢
、体重および代謝で変化する。組成物は、更に、安定剤または薬学的に許容され
る保存剤（例えば、チメロサール（エチル（２−メルカプトベンゾエート−Ｓ）
水銀ナトリウム塩）（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO））を含有し得
る。

【００４８】好適な標識または他の好適な検出可能な生体分子または化学物質と共に使用さ
れる場合、ここで記載されるモノクローナル抗体は、ブドウ球菌感染のインビボ
またはインビトロ診断あるはブドウ球菌細菌の検出のような目的のために有用で
ある。実験室研究はまた、このような抗体の使用によって促進され得る。例えば
以下に記載されるような、種々のタイプの標識および本発明の抗体へ該標識を複
合体化させる方法が、当業者に周知である。

【００４９】例えば、抗体は、これらに限定されないが³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ、¹²⁵Ｉ、ま
たは¹³¹Ｉのような放射標識へ結合され得る。標識の検出は、シンチレーション
カウンティング、ガンマ線分光法またはオートラジオグラフィーのような方法に
より可能である。生物発光標識（例えば、ホタルルシフェリンの誘導体）がまた
有用である。生物発光物質が、慣用方法で該蛋白質へ共有結合され、そして標識
化蛋白質が、ルシフェラーゼのような酵素がＡＴＰとの反応を触媒して生物発光
分子に光の光子を発させる。フルオロゲン（fluorogen）がまた、蛋白質を標識
するために使用され得る。フルオロゲンの例としては、フルオレセインおよび誘
導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシアニン（allo-phycocyanin）、フィコ
シアニン、ローダミン、およびテキサスレッドが挙げられる。フルオロゲンは、
一般的に、蛍光検出器によって検出される。

【００５０】細胞中のリガンドの位置は、上述の抗体を標識しそして当業者に周知の方法（
例えば、ＷａｒｒｅｎおよびＮｅｏｓｏｎ（Mol. Cell. Biol., 7:1326-1337, 1
987）によって記載されるもののような手順を使用する免疫蛍光顕微鏡検査法）
に従って標識を検出することによって測定され得る。

【００５１】上述のように、本発明のモノクローナル抗体、またはその活性な部分またはフ
ラグメントは、哺乳動物細胞外マトリックス蛋白質（例えば、コラーゲン）への
該細菌の付着のような、感染を担うブドウ球菌病原体と哺乳動物宿主との間の初
期物質的相互作用を妨害するために特に有用であり、そして該物質的相互作用の
この妨害は、患者を処置することおよび使用のためにより安全にするために留置
（in-dwelling）医薬装置における細菌感染を予防または軽減することの両方に
、有用であり得る。

【００５２】本発明の別の実施形態において、ブドウ球菌細菌および感染を単離および同定
することに有用であり得るキットが提供され、これは、単一容器に凍結乾燥され
て次いでブドウ球菌細菌を含有すると疑われる水性サンプルの添加によって活性
となるような、好適な形態で本発明の抗体を含む。このようなキットは、典型的
に、本発明のＣＮＡ１９抗体へ結合する複合体の同定を可能にする好適な免疫検
出試薬と共に、好適な形態の抗体を収容するために好適な容器を含む。例えば、
免疫検出試薬は、好適な検出可能なシグナルまたは標識（例えば、ビオチンまた
は検出可能な色を生成する酵素など）を含み得、これは、通常、抗体へ結合され
る得るか、または抗体が抗原へ結合する場合に検出可能な結果を提供するような
他の好適な様式で使用され得る。

【００５３】手短に言えば、従って、ブドウ球菌細菌のコラーゲン結合蛋白質のＣＮＡ１９
領域へ結合し、そして宿主細胞への１種を超えるブドウ球菌細菌の付着を追放し
得る本発明の抗体は、ヒトおよび動物患者ならびに医療または他の留置デバイス
における、ブドウ球菌感染を処置または予防することに非常に有用である。

【００５４】更に、本発明によれば、追放活性を示し、そして宿主細胞における所定の位置
へ結合している細菌を追放するために使用され得る抗体を同定および単離する方
法が提供される。本発明に従う好ましい方法において、細菌結合付着について公
知の部位を含む媒体、例えば宿主細胞の細胞外マトリックスの表面蛋白質（例え
ば、コラーゲン、ラミニンなど）が、先ず、好適な検出可能な標識（例えば、¹² ⁵ Ｉのような放射活性標識）で標識される。次に、固定化形態であってもよい、
標識された結合部位媒体（例えば、標識されたコラーゲンまたは他の蛋白質）が
、それに結合すると公知である好適な細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ
．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むブドウ球菌細菌）と接触して配置され、そして
該細菌が該蛋白質または結合部位からの他の好適な材料へ結合するに十分な時間
の間、該細菌と接触させたままにされる。結合のための十分な時間に続いて、該
検出可能な標識へ結合された細菌が好ましくは収穫され、次いで好適な培地に配
置され、ここで、その結合部位で特定の細菌に対する追放活性を有すると疑われ
る抗体が、標識された細菌へ導入され得る。この工程に続いて、どの細菌がそれ
らの結合部位またはそれらの結合部位を作製する蛋白質から追放されるかを決定
し、そして従って、このような追放を行うことが出来た抗体を同定しそして単離
することは、慣用的な事である。この方法は、表面蛋白質、あるいは細菌が付着
することが公知である他の蛋白質または材料と共に使用され得、そして各場合に
おいて、結合媒体を認識する抗体が、該結合媒体へ付着された細菌についてのそ
の追放活性を決定するために、試験され得る。従って、本発明を使用して同定お
よび／または単離される抗体、例えばこのような追放活性を示すＣＮＡ１９抗体
は、本発明の更なる部分を構成する。

【００５５】実施例以下の実施例が提供され、これは本発明の好ましい実施形態の局面を例証する
。続く実施例において開示される技術は、本発明者らによって本発明の実施におい
て十分に機能すると発見された技術を示し、そして従ってその実施のために好ま
しいモードを構成すると考えられ得ることが、当業者によって認識されるべきで
ある。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変化が、本発明の精神およ
び範囲から逸脱することなしに、開示される特定の実施形態においてなされて、
そして依然として同様または類似の結果を得ることができるを認識すべきである
。

【００５６】実施例１：モノクローナル抗体の生成ならびに追放効果および交差反応性の実
証細菌株、プラスミドおよび培養条件−−組換え蛋白質をクローニングおよび発
現するために、大腸菌株ＪＭ１０１を宿主として、そしてｐＱＥ−３０（Qiagen
Inc., Chatsworth, CA）を発現ベクターとして使用した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ株ＣｏｗａｎＩは、Instituto Seroterapico Milane
se（Milan, Italy）（１８）からの臨床分離株（clinical isolate）であった。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株５７、７２、１１６、１７５、１７６、１８０、２０３、２
０５、２１２、および４０４６は、中国、ヨーロッパ、香港、シンガポールおよ
び米国からの臨床分離株であった。全てのこれらのＳ．ａｕｒｅｕｓ分離株は、
コラーゲンに結合する（データは示されず）。大腸菌株を、ＬｅｎｎｏｘＬＢ
ｒｏｔｈ（ＬＢ）（SIGMA, St. Louis, MO63178）またはＬＢ寒天上において、
３７℃で一晩、好適な場合には抗生物質と共に、増殖させた。ブドウ球菌を、Ｂ
ｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）（DIFCO, Detroit, MI 48232
-7058）ブロスまたはＢＨＩ寒天上において、３７℃で一晩、増殖させた。

【００５７】モノクローナル抗体の生成−−ＣＮＡ１９に対するモノクローナル抗体を、本
質的に、多少の改変を伴ってＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（２９）によ
って開示されるように産生した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０μｇの該精製組換
え蛋白質を、１週間間隔で５回、腹腔内注射した。該抗原を、第１免疫化のため
に、等容量のフロイント完全アジュバント（complete Freund's adjuvant）で乳
化し、続いて不完全アジュバント（incomplete ajuvant）において３回注射した
。マウスから採血し、そして血清を、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを使
用して、精製ＣＮＡ１９に対する反応性について試験した。最終免疫化のために
、該抗原を生理食塩水に与えた。３日後、脾臓から単離したリンパ球を、５０％
ポリエチレングリコール４０００を使用して、５：１の割合で、Ｓｐｅ／０Ａ
ｇ．１４マウス骨髄腫細胞と融合させた。懸濁した細胞を、先ず、２％ヒポキサ
ンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）（Sigma）、２％グルタミン、２
％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する高グルコースＤＭＥＭ／ＲＰ
ＭＩ１６４０（１：１）培地（Sigma, St. Louis, Mo.）において、増殖させ、
そして選択した。１週間後、ＨＡＴ培地を、１％（ｖ／ｖ）Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ
−ＳＲ（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）および抗生物質を補足した
ＤＭＥＭ／ＰＲＭＩ１６４０からなる無血清培地においてクローン化ハイブリ
ドーマを培養することによって次第に置換させた。細胞培養物の上澄みを、第１
０日にＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、そしてＣＮＡ１９に対する抗体に
ついて陽性のハイブリドーマを、限界希釈によって、１ウェル当たり１細胞の密
度まで継代培養し、そしてＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによって更にキ
ャラクタライズした。

【００５８】１６Ｈ９は、同一方法を使用してＣＮＡ５５に対して惹起されたｍＡｂであっ
た。７Ｅ８は、同一手順を使用して生成された抗−ＨｉｓタグｍＡｂであった。

【００５９】抗体精製およびアイソタイピング − ハイブリドーマ細胞の上澄みを、回収
しそして遠心分離した。抗体を、該上澄みの硫酸アンモニウム沈殿、続いて製造
業者の推奨に従ってプロテインＡ／Ｇ−セファロースカラム（Amersham Pharmac
ia Biotech）におけるアフィニティークロマトグラフィーを使用して、精製した
。

【００６０】産生したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のアイソタイピングを、Ｍｏｕｓｅ−
Ｔｙｐｅｒサブアイソタイピングキット（Bio-rad, Richmond, CA）を使用して
行った。

【００６１】ルーチンのＤＮＡ操作および大腸菌の形質転換 − ＤＮＡ調製、精製、制限
消化、アガロースゲル電気泳動およびライゲーションを、標準方法（３０）を使
用してまたは別に述べられない限り製造業者の説明書に従って行った。制限酵素
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび仔ウシ腸アルカリホスファターゼは、Life Techno
logies, GIBCO BRL（Gaithersburg, MD 20884-9980）製であった。配列決定のた
めのＤＮＡを、QlAprep Spin Miniprepキット（Qiagen）を使用して調製した。
大腸菌コンピテント細胞のルーチンの調製および大腸菌へのＤＮＡの形質転換を
、ワンステップ手順（３１）によって行った。

【００６２】ａｃｅ１９のクローニング − ＣＮＡ５５およびＡＣＥ４０のアミノ酸配列
を、デフォルトパラメータと、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して比較した。ＡＣＥ４
０におけるアミノ酸１５２〜３１８からの領域を使用して、ＡＣＥ１９を構築し
た。プライマーを、製造業者の説明書に従ってＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Str
atagene, La Jolla, CA 92037）を使用して、対応のヌクレオチド配列（第１Ａ
表）をＰＣＲ増幅するために、設計した。該プライマーを、該ＰＣＲ産物がその
５’末端でＢａｍＨＩ部位およびその３’末端でＳａｌＩ部位が続く停止コドン
を含むように、設計した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、そ
して精製した。次いで、それをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ消化し、脱ホスファター
ゼしたｐＱＥ−３０（Qiagen, Chatsworth, CA）に連結した。連結混合物を、大
腸菌ＪＭ１０１へ形質転換し、そして該細胞を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを補
足したＬＢ寒天プレート上において３７℃で一晩インキュベートし、形質転換株
について選択した。構築物を制限酵素消化によって確認し、そしてＤＮＡ配列決
定によって更に確証した。

【００６３】ＡＣＥ１９とＣＮＡ１９との間のキメラ配列を含む構築物の生成 − オーバ
ーラッピングＰＣＲストラテジー（overlapping PCR strategy）を、構築のため
に使用した。ＡＣＥ１９とＣＮＡ１９との間の各対応接合領域（junction regio
n）に及ぶプライマーを設計した（第１Ａ表）。ＰＣＲ反応を、プライマーおよ
びテンプレートの好適な組み合わせを使用して行った（第１Ｂ表）。キメラＬの
構築を、例として使用した。簡単に言えば、ａｃｅ１９の５’末端ＡＣＥ１９
５’およびＡＣＥ１９とＣＮＡ１９との間の接合領域に及ぶＡＣＥ１９Ｉへのプ
ライマーを使用して、ＡＣＥ１９からのＮ−末端４分の１セグメント（quarter
segment）を増幅した。対応のＣＮＡ１９プライマー、ＣＮＡ１９ＩおよびＣＮ
Ａ１９３’を使用して、ＣＮＡ１９からのＣ−末端４分の３(three-quarter)セ
グメントを増幅した。ＰＣＲ反応は、ＡＣＥ１９のクローニングについて上述し
た通りであった。反応後、各反応の５倍希釈１μｌを混合し、そしてプライマー
ＡＣＥ１９５’およびＣＮＡ１９３’との第２ラウンドＰＣＲのためのテンプ
レートとして使用した。各構築物を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

【００６４】大腸菌における組換え蛋白質の発現および蛋白質精製−−蛋白質発現および精
製は前に記載された（１４、２１）。簡単に言えば、１リットルのＬＢ（５０μ
ｇ／ｍｌアンピシリンを補足した）に、組換え大腸菌株の一晩培養物４０ｍｌを
接種し、そして３７℃で３時間増殖させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシドを添加し、そして培養物を更に３時間増殖させて蛋白質発現させた。細菌
を遠心分離によって収穫し、細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、
ｐＨ７．４に再懸濁し、そして−８０℃で保存した。

【００６５】ペレットを解凍し、そしてフレンチプレス（French press）において溶解させ
た。細胞破片を遠心分離によって除去し、そして上澄みを０．４５μｍメンブレ
ンで濾過した。上澄みを５ｍｌＮｉ²⁺−帯電ＨｉＴｒａｐキレート化カラム（A
mersham Pharmacia Biotech）へ適用し、そして結合された蛋白質を、４ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ,１００ｍＭＮａＣｌ,（ｐＨ７．９）中０〜２００ｍＭイミダ
ゾールの２００ｍｌ線形勾配で、５ｍｌ／分の流速で溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって測定される、各組換え蛋白質に対応するフラクションを、プールし、
そして３．４ｍＭＥＤＴＡを含有するＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１
５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して透析した。蛋白質濃度を、λ_280-315 でＢｅｃｋｍａｎＤＵ−７０ＵＶ−可視分光光度計において測定した。各蛋白
質のモル吸光係数を、Ｐａｃｅら（３２）の値を使用して算出した。

【００６６】円偏光二色性（ＣＤ）−−遠ＵＶＣＤを、ＪａｓｃｏＪ７２０分光偏光計を
使用して記載されるように（３３）行った。全てのサンプル濃度は、０．５％Ｐ
ＢＳ中５または１０μＭのいずれかであった。スペクトルを、円筒状０．５ｍｍ
路長キュベットにおいて室温で記録した。

【００６７】酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ） − マイクロタイターウェ
ルを、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中１０μｇ／ｍｌの各組換え蛋白
質１００μｌで、一晩４℃でコーティングした。更なる蛋白質結合部位をブロッ
クするために、ウェルを２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ２
００μｌで１時間２２℃で処理し、次いでＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳ）で５回洗浄した。２％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μｌ中に溶解し
た各ｍＡｂの示される量をウェルに添加し、そして２２℃で２時間インキュベー
トした。次いで、プレートをＰＢＳＴで広範囲に洗浄し、そして西洋ワサビペル
オキシダーゼへ複合体化されたウサギ抗−マウスＩｇＧ（１：５００希釈）（Da
ko, Gostrup, Denmark）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、結合を、基
質ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（Sigma）を使用しそしてマイクロ
プレートリーダー（Bio-Rad）において４９２ｎｍでの吸光度を測定して、定量
した。ＣＮＡ１９への該抗体の半最大結合（half-maximal binding）のために必
要とされる濃度を、各ｍＡｂの見かけＫ_Dを算出するために使用した。

【００６８】コラーゲンのヨウ素化（iodination） − II型コラーゲンを、Ｓｔｒａｗｉ
ｃｈおよびＮｉｍｍｉ（３４）によって記載されるように、ウシ鼻中隔から調製
した。無担体（carrier-free）¹²⁵Ｉ（１５ｍＣｉ／μｇ）は、Amersham Pharma
cia biotech製であった。コラーゲンを、製造業者（Pierce, Rockford, III）に
よって推奨されるようなヨードゲンコーティングチューブ（iodogen coated-tub
e）技術を使用して標識した。放射標識されたリガンドの特異的活性は、４×１
０⁶ｃｐｍ／μｇであると概算された。

【００６９】ｍＡｂによるＣＮＡ１９のコラーゲン結合の阻害 − マイクロタイターウェ
ルを、上述のＥＬＩＳＡにおいてのようにＣＮＡ１９でコーティングし、次いで
１時間、特定量の各ｍＡｂの存在下で、¹²⁵Ｉ−コラーゲン（８×１０⁴ｃｐｍ）
と共にインキュベートした。広範な洗浄後、各ウェルにおける放射活性をγカウ
ンターで測定した。各ウェルにおける放射活性量を、ｍＡｂを含まないウェルの
それと比較した。全ての実験を２重で行った。

【００７０】ブドウ球菌へのコラーゲンの結合ならびにｍＡｂの阻害および追放効果 −
Ｓ.ａｕｒｅｕｓ細胞への¹²⁵Ｉ−標識化コラーゲンの結合を、既に記載されたよ
うに定量した（３５）。簡単に言えば、５×１０⁸Ｓ.ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎ
Ｉ細胞を、０．１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳ０
．５ｍｌ中、５×１０⁴ｃｐｍの¹²⁵Ｉ−コラーゲンと共にインキュベートした。
混合物を、１時間２２℃で、エンド−オーバー−エンドミキサー（end-over-end
mixer）において回転させた。反応を、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する２
．５ｍｌの氷冷ＰＢＳの添加によって停止させ、そしてチューブを１４００×ｇ
で１０分間遠心分離した。上澄みの吸引後、ペレットをγカウンターにおいて放
射活性について分析した。細菌の非存在下でインキュベートされたチューブにお
いて回収された放射活性（４００〜６００ｃｐｍ）を、細菌を含むサンプルのそ
れから引いた。サンプルを２重で実行した。

【００７１】可溶性コラーゲンへの結合に対するｍＡｂの阻害効果を試験するために、細菌
を、¹²⁵Ｉ−コラーゲンの添加前に１時間、増加量の各ｍＡｂと共にプレインキ
ュベートし、そして上記のように処理した。

【００７２】コラーゲン結合に対するｍＡｂの追放効果を試験するために、細菌を、１時間
、¹²⁵Ｉ−コラーゲンと共にプレインキュベートした。遠心分離後、上澄みを除
去し、細菌−コラーゲンペレットを洗浄し、そして特定量の各ｍＡｂと共に０．
１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳに再懸濁させ、そ
して更に１時間インキュベートした。細菌へ結合された残存コラーゲンの量を、
上記のように測定した。

【００７３】固定化コラーゲン基質へのＳ.ａｕｒｅｕｓの付着、ならびにｍＡｂの阻害お
よび追放効果 − マイクロタイターウェルを、一晩４℃で、５０ｍＭ炭酸ナト
リウム（ｐＨ９．５）中１０μｇ／ｍｌのII型コラーゲン１００μｌと共にイン
キュベートし、次いで１時間２２℃で、２００μｌの２％ＢＳＡでのブロッキン
グへ供した。ＰＢＳＴでの洗浄後、ウェルを、２２℃で２時間、１００μｌのＣ
ｏｗａｎの懸濁液（１×１０⁷細胞／ｍｌ）と共にインキュベートし、次いでＰ
ＢＳＴで広範に洗浄した。付着細胞を、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダー
ゼ複合体化ウサギ抗−マウスＩｇＧ（１：５００希釈）と共に１時間のウェルの
インキュベーションによって検出した。色発現および測定は上述の通りであった
。

【００７４】ｍＡｂによる固定化コラーゲンへの細菌付着の阻害を研究するために、細胞を
、示される量の各抗体と共に、３０分間プレインキュベートした。細胞を、コラ
ーゲンコーティングされたウェルへ移し、２時間インキュベートし、そして上記
のように処理した。

【００７５】追放実験において、細菌を、先ず、コラーゲンコーティングしたウェルと共に
インキュベートし、次いで増加濃度の示されたｍＡｂと共に２時間インキュベー
トした。コラーゲンへ結合されたままの細菌を、上述のように、西洋ワサビペル
オキシダーゼ複合体化ウサギ抗−マウスＩｇＧの添加によって検出した。１実験
において、細菌をまた、以前に記載されたクリスタルバイオレット染色（３６）
と同様に、西洋ワサビペルオキシダーゼ−複合体化ヤギ抗−ウサギＩｇＧを使用
して検出した。

【００７６】Ｓ.ａｕｒｅｕｓＣＮＡ１９に対して生成されたモノクローナル抗体の交差反
応性 − Ｓ.ａｕｒｅｕｓからのＣＮＡ１９に対して生成されたマウスモノク
ローナル抗体を、インタクトなＳ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを認識するそれらの
能力について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。図９に示されるように
、ｍＡｂ１１Ｈ１１は、Ｓ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの５つの異なる臨床分離株
を認識した。３Ｄ３、９Ａ４、および１２Ｈ１０を含むいくつかの他のｍＡｂは
、より低いが検出可能な結合を有した。

【００７７】実施例２：モノクローナル抗体のキャラクタライゼーションおよびエピトープ
のマッピンッグモノクローナル抗体の初期キャラクタライゼーション − ＣＮＡ１９に対す
る２２のモノクローナル抗体を単離した。ＣＮＡ１９に対して惹起された２２の
ｍＡｂの各々および１６Ｈ９（これは、ＣＮＡの全長Ａドメイン，ＣＮＡ５５に
対して惹起された）のアイソタイプを、測定した（第２表）。ｍＡｂの大部分は
、ＩｇＧ₁−ｋタイプであり、６つはＩｇＧ_2a−ｋであり（２Ｂ３，３Ｄ３，７
Ｃ２，８Ｈ１０，１１Ｄ５及び１１Ｈ１１）、そして１つ（１Ｆ６）はＩｇＧ_2b −ｋタイプであった。

【００７８】ＥＬＩＳＡアッセイを、２２のｍＡｂの各々および１６Ｈ９のＣＮＡ１９につ
いての見かけＫ_D値を決定するために行った（第２表）。ｍＡｂの大部分は、１
０^-9Ｍ範囲で類似のＫ_D値を示した。５Ｇ４は、２．９×１０^-8ＭのＫ_Dを有する
僅かに低い親和性を示し、そして８Ｅ６は７．５×１０^-10ＭのＫ_Dを有する僅か
に高い親和性を示した。

【００７９】各ｍＡｂ２μｇの添加後の固定化ＣＮＡ１９への¹²⁵Ｉ−コラーゲンの結合割
合を図１に示した。ＣＮＡ１９に対する２２のｍＡｂは、ＣＮＡ１９のコラーゲ
ン結合に対する阻害効果を示した。劇的に減少した結合が、これらのｍＡｂの添
加時に観察され、一方、抗−Ｈｉｓ−タグｍＡｂ、７Ｅ８は、結合を阻害しな
かった。７Ｅ２を除いて、ｍＡｂは、少なくとも８０％だけ、ＣＮＡ１９のコラ
ーゲン結合を阻害した。７Ｅ２は、５７％だけ結合を減少させた。ＥＬＩＳＡに
よって測定されるようなｍＡｂの親和性とその阻害効力との間に直接的な相関関
係はないようであった。興味深いことに、ｍＡｂ１６Ｈ９は、コラーゲンへの
ＣＮＡ１９結合を増強する能力を示した（図１）。

【００８０】ブロッキングｍＡｂ（blocking mAb）によって認識されるエピトープのマッピ
ング − ２２のブロッキングｍＡｂによって認識される抗原性エピトープをマ
ッピングするために、一連のオーバーラッピング（overlapping）合成ペプチド
を作製した。各々のペプチドは、２５−アミノ酸長であり、そして全セットは、
完全なＣＮＡ１９配列に及ぶ。しかし、どのペプチドも、ＥＬＩＳＡアッセイに
おいてどのｍＡＢとも反応しなかった（データは示されない）。これは、ｍＡｂ
はコンフォーメーショナルエピトープを認識するを示唆した。ＣＮＡ１９におい
てのようなコンフォーメーションをより取りそうなより長いペプチドを作製する
ために、一連のＧＳＴ融合構築物（これら各々は、ＣＮＡ１９配列の５０〜５５
アミノ酸のストレッチ（stretch）をコードした）をまた構築し、そして融合ペ
プチドを精製した。いずれのｍＡｂもこれらの融合ペプチドと反応せず（データ
は示されない）、ＧＳＴ−融合ペプチドは、ｍＡｂによって認識され得るコンフ
ォーメーションへ折り畳むことが依然として出来ないことを示唆する。

【００８１】本発明者らのグループによる以前の研究（１４）は、ＣＮＡとＡＣＥ（Ｅ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓのコラーゲン付着因子）との間のアミノ酸配列類似性が、主とし
てＣＮＡ１９領域にあることを示した。ＡＣＥのＡドメイン（結合ドメイン）は
、主に、その遠ＵＶＣＤスペクトルによって測定されるように、β−シートか
ら主に構成された。ＡＣＥにおける対応領域がＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌを使用して
分析した場合、予測された構造は、Ｘ線結晶化によって決定されたＣＮＡ１９の
ものと高度に類似する骨格コンフォーメーションを示した。次いで、ＡＣＥにお
ける対応領域がＡＣＥ１９と呼ばれた。図２Ａは、デフォルトパラメータを使用
してのＣＮＡ１９およびＡＣＥ１９のアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷアライン
メントの結果を示す。２つの配列は、２９％の全体的同一性（overall identity
）および４０％の全体的類似性（overall similarity）を有した。より高い相同
性が、ＣＮＡ１９ β鎖Ａ、Ｂ、およびＨに対応する領域ならびにそれらのフラ
ンキング残基（flanking residues）（それぞれ、８のうち７、９のうち８、お
よび１３のうち８の残基が、類似であった）で観察された。これは注目に値し、
何故ならば、これらの鎖は、ＣＮＡ１９の１つの表面のコラーゲン結合トレンチ
（trench）の主要部分を形成するからである（２０）。β鎖ＣおよびＤのＮ末端
部分もまた高度に類似したが、しかし、これらの鎖の残りの部分は相同性がより
低かった。ＡＣＥ１９をクローニングし、そして精製したＡＣＥ１９蛋白質を、
ＥＬＩＳＡにおいて、２２の抗−ＣＮＡ１９ｍＡｂならびに１６Ｈ９および７
Ｅ８とのその反応性について試験した。７Ｅ８を除いて、それはいずれのｍＡｂ
とも反応しないことがわかった（第３表）。従って、ＡＣＥ１９は、ＡＣＥ１９
からの対応配列によって置換されたＣＮＡ１９の領域を有するキメラ蛋白質を構
築するための“不活性”テンプレートとして使用された。次いで、これらのキメ
ラをエピトープをマッピングするために使用した。

【００８２】初めに、ＣＮＡ１９配列の、Ｎ−末端４分の１(quarter)（Ｅ）、Ｎ−末端４
分の３(three-quarters)（Ｇ）、中心領域（Ｉ）、Ｃ−末端４分の１(quarter)
（Ｊ）およびＣ−末端４分の３(three-quarters)（Ｌ）をおおよそ含む５つのキ
メラを作製した（図２Ｂ）。これらのキメラ蛋白質は、発現系において十分に発
現され、そして可溶性であった。それらの遠ＵＶＣＤスペクトルは、ＣＮＡ１
９およびＡＣＥ１９のものと類似のパターンを示し、これらの分子の全体的な折
り畳み（folding）における類似性を示唆する（データは示されず）。

【００８３】キメラを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、２２の抗−ＣＮＡ１９ｍＡｂの各
々で試験した。キメラＥを除いて、それらは、その他ではなくｍＡｂのいくつか
と良好な反応性を示した（第３表）。全ての５つのキメラ、ＣＮＡ１９およびＡ
ＣＥ１９は、７Ｅ８、抗−Ｈｉｓ−タグモノクローナル抗体と反応した。本発明
者らは、キメラＥを除いて、各キメラを認識するｍＡｂの数は、各蛋白質内のＣ
ＮＡ１９配列の長さにおおよそ比例することに気付いた。これは、キメラＧ、Ｉ
、ＪおよびＬは、好適なコンフォーメーションのＣＮＡ１９エピトープを示すと
いう示唆としてとられた。

【００８４】キメラＧは、１７のｍＡｂ（１Ｆ６、２Ｂ１、２Ｂ３、３Ｄ３、５Ｇ４、７Ｃ
２、７Ｅ２、７Ｇ２、８Ｅ６、８Ｈ１０、９Ａ４、９Ｆ１１、９Ｇ３、９Ｇ７、
１０Ｇ５、１１Ｄ５および１１Ｈ１１）と反応したが、残りの５つ（１Ｈ１、３
Ｂ１２、５Ｄ１２、５Ｈ１および１２Ｈ１０）とは反応しなかった。キメラＧに
おいて、ＣＮＡ１９のＣ末端４分の１配列を、ＡＣＥ１９の関連領域で置換し、
結果は、前者の１７のｍＡｂが、アミノ酸残基１５１〜２８４のＣＮＡ１９のＮ
末端４分の３でのエピトープを認識し、一方、後者の５つが、アミノ酸２８５〜
３１８のＣ末端４分の１でのエピトープを認識することを示唆した（図２Ｂ）。
キメラＩは、１３のｍＡｂ（１Ｆ６、２Ｂ３、３Ｄ３、５Ｇ４、７Ｃ２、７Ｅ２
、７Ｇ２、８Ｅ６、８Ｈ１０、９Ａ４、９Ｇ７、１１Ｄ５および１１Ｈ１１）と
反応したが、その他とは反応せず、１３のｍＡｂがＣＮＡ１９の中央領域でのエ
ピトープを認識し、一方、残りの９つがＮまたはＣ末端４分の１のいずれかであ
ることを示唆する。同様の論法が、キメラＪおよびＬに適用された。キメラＧ、
Ｉ、ＪおよびＬのＥＬＩＳＡデータを組み合わせると、本発明者らは、ＣＮＡ１
９の異なる領域へエピトープをマッピングすることができた。１１のｍＡｂ（２
Ｂ３、３Ｄ３、５Ｇ４、７Ｃ２、７Ｅ２、７Ｇ２、８Ｈ１０、９Ａ４、９Ｇ７、
１１Ｄ５、および１１Ｈ１１）は、キメラＧ、ＩおよびＬと反応したがＪとは反
応せず、従って、それらはアミノ酸残基１８７〜２８４のＣＮＡ１９の中央領域
へマッピングされた。８Ｅ６、９Ｇ３および１０Ｇ５は、キメラＧおよびＬと反
応したがＩまたはＪとは反応せず、そしてそれらは、２つのキメラの間で共通の
領域に基づいて中央領域へマッピングされた。８Ｅ６および９Ｇ３は、ウェスタ
ンブロット分析においてキメラＧ、Ｌおよび弱くＩと反応すると示され（データ
は示されず）、ＥＬＩＳＡ結果と一致している。ｍＡｂの１つ、１Ｆ６は、キメ
ラＧ、Ｉ、およびＬと、そしてＪと反応した。しかし、Ｊとのその反応性は、Ｇ
、ＩおよびＬとのそれよりも弱かった。従って、１Ｆ６は、仮に中央半分へマッ
ピングされた。これはまた、１Ｆ６を異なるキメラと共に使用してのウェスタン
ブロット分析によって確認された（データは示されず）。全体で、１５のｍＡｂ
が、残基１８７〜２８４（β鎖Ｂの第２残基〜β鎖Ｈの最後の第２残基）のＣＮ
Ａ１９の中央領域でのエピトープを認識することがわかった。

【００８５】５つのｍＡｂ（１Ｈ１、３Ｂ１２、５Ｄ１２および１２Ｈ１０）は、キメラＪ
およびＬと反応したがＧまたはＩとは反応せず、従ってそれらは、残基２８３〜
３１８（β鎖Ｈの最後の第２残基〜３’末端）のＣＮＡ１９のＣ末端４分の１へ
マッピングされた。キメラＧとのしかしＩ、ＪまたはＬとではない反応に基づい
て、ｍＡｂ２Ｂ１および９Ｆ１１は、残基１５１〜１９３のＣＮＡ１９のＮ末端
４分の１へマッピングされた。しかし。それらは、キメラＥとは反応しなかった
。これは、ＣＮＡ１９とＡＣＥ１９との間のβ鎖ＡおよびＢ領域の周りの高い配
列類似性に起因し得、主にＡＣＥ１９であるキメラ蛋白質を生じ、そして従って
キメラＥにおけるＮ末端でのエピトープは、好適なコンフォーメーションで示さ
れ得ななかった。

【００８６】エピトープを更にマッピングするために、第２セットのキメラ（Ｎ〜Ｘ）を構
築した。キメラＮ〜Ｖにおいて、ＣＮＡ１９配列（キメラＬにおけるＣＮＡ１９
配列のＮ末端出発点からキメラＧのＣＮＡ１９配列のＣ末端終点）は、徐々に、
ＡＣＥ１９の対応する領域によって置換された。しかし、これらのキメラは、種
々の程度の乏しい溶解性を示した。それらがｍＡｂで試験された場合、キメラＮ
（図２Ｂ）のみが、比較的に適当な数のｍＡｂとの反応を示し、そしてその反応
性は、キメラＧ、Ｉ、ＪおよびＬについて観察されたものよりも低かった（第３
表）。従って、キメラＯ〜Ｖを、更に議論しなかった。キメラＷおよびＸを構築
し、ＣＮＡ１９のＣ末端４分の１領域へマッピングされたエピトープを更にマッ
ピングし、そしてそれらは良好な溶解性を有した。Ｗは、多数のｍＡＢとの反応
性を示し、それが好適にエピトープを示すことを示唆した（第３表）。キメラＸ
は、いずれのｍＡｂとも反応せず、Ｘは非常に少ないＣＮＡ１９配列を含むとい
う、キメラＥについて議論した同様の理由のためである可能性がある。

【００８７】キメラＷからの結果は、キメラＧ、Ｉ、ＪおよびＬの結果から得られた結論を
完全に支持した。中央領域にマッピングされた全ての１５のｍＡｂおよびＮ末端
４分の１への２つは、キメラＷと反応し、一方、Ｃ末端４分の１への５つのｍＡ
ｂはいずれも反応せず、マッピング結果を確証した。更に、結果は、Ｃ末端４分
の１へ前にマッピングされた５つのｍＡｂは、ＣＮＡ１９の真にＣ末端での最後
の２１のアミノ酸残基に局在するエピトープを認識することを示唆した。

【００８８】キメラＮからの結果は、以前の結論と大部分は一致している。それは、中央領
域へマッピングされた１５のｍＡｂのうちの１４と反応し、そしてＮ末端４分の
１への２つとは反応しなかった。Ｎと反応しなかった中央領域のｍＡｂは、１０
Ｇ５であり、これはいくつかの他のキメラとも十分に反応しなかった。１つの可
能性は、１０Ｇ５は、関連エピトープ（単数または複数）のコンフォーメーショ
ンにおける変化に非常に感受性であり、その結果、僅かな変化が反応性の損失へ
至ったということであった。他の可能性は、１０Ｇ５によって認識されるエピト
ープ（単数または複数）は、残基１８７〜２０７（β鎖Ｂ〜β鎖Ｃの中央）に局
在した。しかし、ＣＮＡ１９のＣ末端へマッピングされた５つのｍＡｂは、キメ
ラＮと反応しなかった。これは、キメラＮにおける関連エピトープの不適切な折
り畳みのためと解釈され、何故ならば、キメラＧ、Ｉ、Ｊ、ＬおよびＷからの結
果は、明らかに、それらをＣ末端へ局在化したからである。

【００８９】１６Ｈ９（ＣＮＡ５５に対して惹起されたｍＡｂの１つ）は、ＣＮＡ１９、キ
メラＧ，Ｉ、Ｌ、Ｎ（弱く）およびＷと反応するとわかった。従って、１６Ｈ９
はまた、ＣＮＡ１９の中央半分へマッピングされた（第３表）。

【００９０】結論として、ＣＮＡ１９に対して惹起された２２の阻害ｍＡｂは、コンフォー
メーションに依存するエピトープを認識し、そしてこれらのエピトープは、ＣＮ
Ａ１９にわたって局在された（図３）。これは、完全分子が、コラーゲンにおけ
る特異的残基に直接接触することによってか、またはコラーゲン３重らせんの調
節に必要な好適なコンフォーメーションをとることによって、コラーゲンとのそ
の相互作用に関与することを示唆する。

【００９１】２２のモノクローナル抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＣｏｗａｎＩのコラーゲ
ン結合を阻害する − ｍＡｂおよびキメラを使用してマッピングされた機能的
に関連するエピトープが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞表面上に提示される全長天然蛋
白質に存在するかどうかを見るために、本発明者は、液相結合アッセイにおいて
、ＣＮＡを発現するＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＣｏｗａｎＩのコラーゲン結合を阻害
するｍＡｂの能力を試験した。全ての２２のｍＡｂは、可溶性¹²⁵Ｉ−コラーゲ
ンへのＣｏｗａｎＩ結合を阻害し、一方、１６Ｈ９抗−Ｈｉｓ−タグｍＡｂ
、７Ｅ８は阻害せず（図４）、エピトープはＣｏｗａｎＩの表面に存在するこ
とを示す。ＣＮＡ１９を阻害する能力とコラーゲンへのＣｏｗａｎＩ結合の間
の粗い相関関係が観察された。例えば、ＣＮＡ１９の良好なインヒビターのうち
の２つである、ｍＡｂ９Ｇ７および１１Ｈ１１はまた、有効に、コラーゲンへ
のＣｏｗａｎＩ結合を阻害し（図５）、結合は１μｇの抗体でほぼ完全に阻害
された。ＣＮＡ１９の適度なインヒビターである、８Ｅ６は、より少なく有効に
、ＣｏｗａｎＩのコラーゲン結合を阻害し、結合は０．５μｇの８Ｅ６でたっ
た５０％超だけ減少され、そしてより大きな阻害が２．５μｇ超の抗体の使用で
観察された（図５）。１６Ｈ９は、可溶性コラーゲンへのＣｏｗａｎＩ結合を
阻害しなかった（図４）。

【００９２】ｍＡｂがＳ．ａｕｒｅｕｓの付着を阻害するかどうかを試験するために、固定
化コラーゲンへのＣｏｗａｎＩ付着に対するいくつかのｍＡｂの阻害効果をま
た試験した（図６）。試験したものの中で、全てが、種々の程度までだが阻害活
性を示し、そして結果は、可溶性コラーゲンについて観察されたものと一致した
。例えば、９Ｇ７および１１Ｈ１１は、効果的に、コラーゲンへのＣｏｗａｎ
Ｉの付着を阻害し、一方、８Ｅ６は乏しかった。１６Ｈ９は、予想されたように
、細菌付着を阻害しなかった（図６）。

【００９３】Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣＮＡ１９に対して生成されたモノクローナル抗体の交差
反応性 − 上記に示されるように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣＮＡ１９に対して惹
起さえたマウスモノクローナル抗体の交差反応性を、インタクトなＳ．ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓを認識するそれらの能力を試験したＥＬＩＳＡスクリーニングに
よって確立した。図９に示されるように、ｍＡｂ１１Ｈ１１は、Ｓ．ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓの５つの異なる臨床分離株を認識した。３Ｄ３、９Ａ４、および
１２Ｈ１０を含むいくつかの他のｍＡｂは、より低いが検出可能な結合を有した
。従って、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対して有用であるためのＳ．ａｕｒｅ
ｕｓに対して惹起された抗体の交差反応性が示され、そして従ってここで議論さ
れるＣＮＡ１９抗体は、複数のブドウ球菌細菌に対して有用であり得る。

【００９４】ｍＡｂによるコラーゲンからのＳ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎＩの追放−−阻
害ｍＡｂがプレ形成されたコラーゲン−細菌複合体からＳ．ａｕｒｅｕｓを追放
し得るかどうかの可能性を試験するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎＩを
１時間¹²⁵Ｉ−コラーゲンと共にインキュベートし、該複合体を形成させた。次
いで、種々の量のｍＡｂを洗浄した複合体へ添加し、そして細胞ペレットにおけ
る¹²⁵Ｉの減少を、コラーゲン−細菌複合体の解離を示すものとした。

【００９５】全てのｍＡｂは、種々の程度まで、コラーゲン−細菌複合体からコラーゲンを
放出し、一方、抗−Ｈｉｓタグ抗体７Ｅ８および１６Ｈ９は放出しなかった。１
μｇおよび５μｇの各ｍＡｂの添加後に残存するコラーゲン結合を、図７に示し
た。ｍＡｂ１Ｆ６、１Ｈ１、２Ｂ１、３Ｂ１２、５Ｄ１２、５Ｈ１、７Ｅ２、
７Ｇ２、９Ａ４、９Ｇ３、および９Ｇ７は、１μｇ抗体で、結合コラーゲンの少
なくとも８６％を、そして５μｇ抗体で少なくとも９６％の結合コラーゲンを放
出し得た。９Ｆ１１および１２Ｈ１０は、それぞれ、１μｇ抗体で５４％および
７２％の結合コラーゲンを、そして５μｇ抗体で９５．３％および９５．５％を
放出し得た。他のｍＡｂは、上述ほど強力な追放体（displacers）でなく、５Ｇ
４、８Ｅ６、８Ｈ１０、１０Ｇ５、１１Ｄ５および１１Ｈ１１は、それぞれ、１
μｇ抗体で８％、１４％、２４％、４６％、１２％および３６％のコラーゲンを
、５μｇ抗体で５０％、５０％、７９％、７１％、４８％、および５３％のコラ
ーゲンを放出し得た。コラーゲン−細菌複合体からコラーゲンを放出するｍＡｂ
の能力とコラーゲン結合を阻害するｍＡｂの有効性との間には、一定の相関関係
がなかった。良好なインヒビターの中で、いくつか（例えば、３Ｂ１２および９
Ｇ７）がまた良好な追放体であり、一方、他（例えば、８Ｈ１０および１１Ｈ１
１）は、劣った追放体であった。劣ったインヒビターは、一般的に、劣った追放
活性を示した。種々の濃度での９Ｇ７、１１Ｈ１１、８Ｅ６および１６Ｈ９の追
放効果を、図８Ａに示した。

【００９６】ｍＡｂが固定化コラーゲンの表面からＳ．ａｕｒｅｕｓを脱着し（detach）得
るかどうかを試験するために、いくつかのｍＡｂを試験した。ＣｏｗａｎＩを
、先ず、固定化コラーゲンへ付着させ、次いで増加する量のｍＡｂを添加した。
付着したままである細菌を、ウサギ−抗マウス抗体を使用して検出した。結果は
、細菌−コラーゲン複合体からの可溶性コラーゲンの追放からのものと一致した
。例えば、９Ｇ７はまた強力な追放能力を示し、一方１１Ｈ１１および８Ｅ６は
、適度なまたは劣った追放体のままであり、そして１６Ｈ９は追放しなかった（
図８Ｂ）。固定化コラーゲンの表面からＣｏｗａｎＩを追放するｍＡｂ９Ｇ７
の能力をまた、異なるタイプの第二抗体（ヤギ−抗ウサギ）、または細菌検出の
ためのクリスタルバイオレットを使用してアッセイした。同様の結果が得られた
（データを示さず）。

【００９７】実施例３：ＭＡＢ有効性のインビトロ実証抗体スケールアップおよび精製ハイブリドーマ細胞を、２〜３リットル培養容積まで２ｍＭピルビン酸ナトリ
ウム、４ｍＭＬ−グルタミンおよび２×ペニシリン−ストレプトマイシンを含
有するＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ、１×Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ培地において増殖さ
せた。ハイブリドーマ上澄みを遠心分離により収穫した。上澄みを０．４５μＭ
フィルターで濾過し、そしてＩｇＧを、プロテインＧクロマトグラフィーを使用
してアフィニティー精製した。モノクローナル抗体を、０．１Ｍグリシン（ｐＨ
２．７）を使用して溶出し、そして直ぐに１０分の１容量の２ＭＴｒｉｓ（ｐ
Ｈ８．０）で中和した。次いで、精製したＩｇＧを１×Ｄ−リン酸緩衝生理食塩
水（ｐＨ７．４）で透析した。必要であれば、精製した抗体を濃縮し、そしてア
リコート凍結させた。

【００９８】Ｓ．ａｕｒｅｕｓＳ．ａｕｒｅｕｓ株Ｂａｒｎｅｔｔを、骨髄炎の患者から分離した。凍結グリ
セロールストックからのＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌細胞を、単一血液寒天プレートに
線状接種（streaked）した。次いで、初期プレートからの単一コロニーを、約３
０の血液寒天プレートに再線状接種し、３７℃インキュベーター中に２４時間配
置した。細菌をプレートからこすり落とし（scraped off）、そして１０ｍｌの
滅菌１×ＰＢＳを含有する５０ｍｌチューブに配置し、そして穏やかに攪拌して
スクレーパーから細菌を除去した。全てのプレートをスクレーピングした後、更
に１０ｍｌの滅菌１×ＰＢＳを添加し、そして細菌懸濁液を激しく攪拌して、細
菌から寒天破片の分離を促進させた。次いで、細菌懸濁液を３５００×ｇで、４
℃で１０分間、ＲＣ３Ｃ遠心分離機において遠心分離した。上澄みをデカントし
、そして細菌ペレットを２０ｍｌの滅菌１×ＰＢＳで再懸濁させた。ペレットを
ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、細菌ペレットを１０ｍｌの凍結媒体（freesing
media）（１×Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４；１０％ＤＭＳＯ；５％ＢＳＡ）に再
懸濁させ、次いで、所望の容量のために更なる容量の凍結媒体を添加し、そして
１ｍｌアリコートをエタノール／ドライアイスにおいてスナップ凍結(snap froz
en)させ、そして−８０℃フリーザーに配置した。注射の日に、凍結細菌ストッ
クを解凍させ、そして滅菌ＰＢＳにおいて１：２０に希釈した。チャレンジ接種
物（challenge inoculum）のアリコートを血液寒天プレートに配置し、実際のＣ
ＦＵを測定した。

【００９９】動物性別、種、数、年齢およびソース雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５〜６週齢）を、Taconic Quality Laboratory Ani
mals and Services for Research（Germantown, NY）から購入した。動物を、処
置の開始前に少なくとも１４日間順応させた。到着と同時に、マウスを検査し、
吸収材敷料（absorbent bedding）を備えたポリカーボネートシューボックスケ
ージにグループを収容した（５／ケージ）。全てのマウスを、Ｃａｒｅａｎｄ
ＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓについてのＮＩＨＧ
ｕｉｄｅに見られる必要な畜産基準（husbandry standards）下で、１２時間明
−暗サイクルで配置した。

【０１００】同定および無作為化全ての動物を、投薬の前に、尾の刺青(tattoo)を使用して独自に同定した。処
置の開始前に、動物を個々に計量し、そしてそれらの健康を評価した。マウスを
無作為化し、そして層化（stratified）体重を使用して処置グループへ割り当て
た。

【０１０１】実験デザイン第１日目、動物を、モノクローナル抗体９Ｇ３、３Ｂ１２の単回０．５ｍｌ
ＩＰ注射で処置したか、または処置しなかった。第０日目、約７×１０⁷ ＣＦＵＳ．ａｕｒｅｕｓを、単回ＩＶ注射（０．１ｍｌ）によって尾の静脈を介して
全ての動物へ投与した。

【０１０２】ＩｇＧ投与後２４時間で、マウスを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（株Ｂａｒｎｅｔｔ）
の単回静脈内注射でチャレンジした。マウスを１０日間追跡し、この時点で、全
ての残りのマウスを犠牲にした。処置グループの間に生存時間の有意な差異が検
出された。最初の実験において、９Ｇ３（ｐ＝０．０００２ｖｓ．コントロー
ル；生存時間についてのＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）を受容したマウスの６７パ
ーセント（２０／３０）が、細菌チャレンジ（bacterial challenge）を生き延
びた。処置された未処理マウスのたったの２０％（４／１８）が、全研究期間を
生き延びた（図１０）。第２実験において、３Ｂ１２（ｐ＝０．０３ｖｓ．コ
ントロール；生存時間についてのＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）を受容したマウス
の７０パーセント（１４／２０）が細菌チャレンジを生き延びた（図１１）。逆
に、コントロールマウスのたった２７％が、１０日間研究を生き延びた。これら
の結果は、明らかに、ＭＳＣＲＡＭＭ特異的モノクローナル抗体がＳ．ａｕｒｅ
ｕｓの致死感染に対して有意なレベルの保護を提供することを示す。

【０１０３】実施例４：配列情報可変領域配列の単離および配列決定：ＣＮＡ１９についてのモノクローナル抗体の可変軽鎖および可変重鎖の両方に
ついての配列を、以下のように決定した：メッセンジャーＲＮＡを、ＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０キット（Invitrogen；
カタログ番号Ｋ４５００）を使用して、ＣＮＡ３Ｂ１２ハイブリドーマ細胞か
ら単離した。手短に言えば、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１０培地で培養され
た１．４×１０⁸のハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペ
レット化し、次いでＰｒｏｔｅｉｎ／ＲＮａｓｅＤｅｇｒａｄｅｒを含有する
洗浄剤（detergent）中で溶解させた。ＰｏｌｙＡ⁺ｍＲＮＡを、オリゴ−ｄＴセ
ルロース上でのアフィニティー精製によって単離した。第一鎖（first strand）
ｃＤＮＡの合成を、各可変重鎖および可変軽鎖についての２０ｐｍｏｌの３’オ
リゴヌクレオチドマウス特異的プライマー（Novagen；カタログ番号６９７９６
および６９８１２）を含有するｃＤＮＡ合成キット（Novagen；カタログ番号６
９００１−３）において、５μｇのｍＲＮＡおよび逆転写酵素を使用して遂行し
た。ｃＤＮＡの一部（５〜５０ｎｇ）を、３０サイクルについて（９４Ｃホット
スタート、次いで１分間９４Ｃ、１分間５０Ｃおよび１分間７２Ｃのサイクル）
、ＰＣＲＲｅａｇｅｎｔＳｙｓｔｅｍ（Life Technologies；カタログ番号１
０１９８−０１８）およびマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット（
Novagen；カタログ番号７００８１−３、各々５ｐｍｏｌ）を使用して、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。ＰＣＲ産物を、酢酸ナトリウム
緩衝液中の１％超純粋アガロースゲルにおいて電気泳動で分画し、そして臭化エ
チジウム染色によって可視化させた。予測されたサイズにマッチするＰＣＲフラ
グメントをゲルから切り出し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen）プ
ラスミドへの連結のために、Ｂｉｏ１０１Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラム（
カタログ番号１１０１−４００）を使用して精製し、続いてコンピテントＴＯＰ
１０大腸菌（Invitrogen；カタログ番号Ｋ４５００）へ形質転換させた。ＱＩＡ
ｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（QIAGEN；カタログ番号２７１０
６）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した後、挿入物を有する陽性クローンを
、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、
続いてＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してＡＢＩ自動
シーケンサーにおいて配列決定した。得られた配列は、以下の通りであった：

【０１０４】

【化１】

【０１０５】実施例５：ＣＮＡ１９に対して生成されたｍＡｂの更なるキャラクタライゼー
ションＡ．固定化コラーゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓの付着に対する、ＣＮＡ１９［Ｃ
ＢＤ（１５１〜３１８）］に対して生成されたｍＡｂのブロッキング活性上述のように、ＣＮＡ１９領域、またはコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）の
残基１５１〜３１８に対して惹起されたｍＡｂの全てのメンバーは、Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓＣｏｗａｎＩ細胞への¹²⁵Ｉ−コラーゲンの結合を阻害した。細菌を、
各ｍＡｂの増加濃度の存在下でコラーゲンへ結合する能力についてアッセイした
場合、抗体３Ｂ１２、３Ｄ３、８Ｅ６、１１Ｈ１１、１２Ｈ１０、７Ｃ２、９Ｇ
７、および５Ｇ４が、ブドウ球菌付着をブロックしたことがわかった。ｍＡｂ
９Ｇ７、７Ｃ２および３Ｂ１２の阻害活性は、図１２Ａおよび１２Ｂに示される
ように、抗体８Ｅ６と比較してより有効であるようであった。

【０１０６】Ｂ．ｍＡｂによる、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞と複合体化したコラーゲンの追放細菌−コラーゲン複合体からコラーゲンを追放することにおける各ｍＡｂの役
割を試験するために、¹²⁵Ｉ−標識化コラーゲンを、最初に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
細胞へ結合させた。細菌を遠心分離によって収穫し、次いで添加し、そして増加
濃度の各抗体と共にインキュベートした。最後に、細胞へ結合された放射活性を
、γカウンターにおいて測定した。これらの実験条件において、細菌へ結合され
た¹²⁵Ｉ−コラーゲンの大部分は、各ｍＡｂの添加によって細胞から追放され得
た。モノクローナル抗体１Ｆ６、１Ｈ１、２Ｂ１、３Ｂ１２、９Ａ４および９Ｇ
７は、非常に有効な追放体であることを示し、、一方ｍＡｂ５Ｇ４、８Ｅ６、
１１Ｄ５および１１Ｈ１１は、細菌細胞からのリガンドの解離に弱く影響を与え
た（図１２Ａ、１２Ｂ、および１３を参照のこと）。

【０１０７】ｍＡｂ３Ｂ１２を用いて行われた追放反応の時間経過を、図１３の差し込み
図において示す。細菌を、先ず、¹²⁵Ｉ−標識化コラーゲンとインキュベートし
た。引き続いて、ブドウ球菌を遠心分離によって収穫し、１μｇのｍＡｂ３Ｂ
１２へ添加し、そして増加期間の間インキュベートした。５分インキュベーショ
ンに続いて、放射標識化リガンドの大部分の迅速な追放が観察された。

【０１０８】ｍＡｂによる細菌−リガンド複合体の解離がまた、ブドウ球菌が固定化コラー
ゲンへ付着されたるアッセイにおいて実証され得る（図１４Ａ〜Ｃ）。増加濃度
のｍＡｂ３Ｂ１２、３Ｄ３、７Ｃ２、および９Ｇ７が、固定化コラーゲンに付
着するＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞へ添加されると、細菌が、速やかにウェルから追放
された。抗体１２Ｈ１０および１１Ｈ１１は、適度な追放を促進し、ここでｍＡ
ｂｓ８Ｅ６および５Ｇ４は複合体を乏しく解離させる。

【０１０９】追放反応に関する更なる洞察を得るために、各ｍＡｂについてのＫ_D値を、第
２表に示されるように測定した。ＣＢＤ（１５１〜３１８）について比較的に低
い親和性を有するＭａｂは、強い追放活性を示し、逆も同様であった。従って、
各ｍＡｂが細菌−コラーゲン複合体からリガンドを追放する効率は、Ｋ_D値と相
互に関係しないようである。逆に、これらのデータは、ＣＮＡ１９（ＣＢＤ１５
１〜３１８）が低いおよび高い親和性コンフォーメーション状態を有し得、そし
て“追放体抗体”が低いコンフォーメーション状態を安定化し得るという概念を
支持する。しかし、ＣＮＡ１９への“追放体抗体”の結合が、リガンド結合と不
適合な状態を生じるトレンチへのコンフォーメーション変化を誘発するというこ
とは、排除され得ない。

【０１１０】機構が何であろうと、この情報は、細菌からリガンドを有効に阻害および追放
する、本発明に従うＣＮＡ１９に対するモノクローナル抗体、特に抗体３Ｂ１２
、３Ｄ３、７Ｃ２および９Ｇ７の臨床的重要性および治療的価値を強調する。従
って、本発明によれば、これらの抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓ感染に冒される患者を処置する方法および予防方法の両方におい
て有用であるということが、熟考される。

【０１１１】実施例６：ＣＢＤ抗体の更なるファミリーおよびＣＮＡ１９領域の反応性Ａ．ＣＢＤ（３０〜５２９）に対するｍＡｂの特性ＣＢＤ（３０〜５２９）（またはＭ５５）に対するｍＡｂの新規のファミリー
を生成し、そしてＣＮＡの組換えＡドメインと反応する抗体を産生および分泌す
る８つの安定なハイブリドーマを得た。抗体のクラスを、第４表に報告する。該
抗原に対する異なるｍＡｂの相対反応性を、酵素結合イムノソルベント検定法（
ＥＬＩＳＡ）においてアッセイし、ここで、ＣＮＡの全長Ａドメインを、マイク
ロタイターウェルにコーティングしそして増加濃度の各ｍＡｂと共にインキュベ
ートした。吸着された抗原へ結合された抗体の量は、プラトーに達し、そしてこ
れらの相互作用についての見かけＫ_D（解離定数）値を、半最大シグナルについ
て必要とされる濃度から概算した（第５表）。

【０１１２】Ｂ．異なるｍＡｂによって認識されるエピトープの局在化生成されたｍＡｂによって認識されるエピトープを局在化するために、Ａドメ
インの種々のセグメントを、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにおいて、抗
体結合を支持するそれらの能力について試験した。予想されるように、これらの
実験結果は、全てのｍＡｂがネイティブレセプター（抗体１Ｃ９を除く）および
ＣＢＤ（５０−３２９）と反応することを明らかにした。３つのｍＡｂ、２Ｂ８
、１６Ｈ９および１Ｃ９はまた、ＣＢＤ（６１−３４３）およびＣＢＤ（１５１
−３１８）（ＣＮＡ１９）と反応した。その上、２Ｂ８およびより少ない程度で
１Ｃ９が、ＣＢＤにおいて対応するエピトープ（１５１−２９７）を認識した（
第６表）。最初のマッピングにおいてＣＢＤ（１５１−３１８）ＣＮＡ１９ドメ
インと反応するｍＡｂについての抗原決定基を更に局在化するために、コラーゲ
ン付着因子のＣＢＤ（１５１−３１８）に及ぶ一連のＧＳＴ−ＣＮＡ誘導体を構
築した。得られた組換え蛋白質はいずれも、ｍＡｂ１６Ｈ９および２Ｈ８によ
ってＥＬＩＳＡにおいて認識されず、しかしそれらは、図１５Ａに示されるよう
に、ＣＢＤ（１５１−３１８）に対して惹起されたＩｇＧを含有する血清に対し
て良好な反応性を示した。全体的に、これらのデータは、これらのエピトープは
コンフォーメーショナル（conformational）であることを示唆する。

【０１１３】ｍＡｂ２Ｂ８および１６Ｈ９についてＣＢＤ（１５１−３１８）におけるコ
ンフォーメーショナルエピトープをマッピングするために、ＡＣＥ１９（１７４
−３１９）およびＣＮＡ１９（１５１−３１８）のセグメントからなる５つのキ
メラを構築した。図１５Ｂに示されるように、抗体１６Ｈ９についてのキメラＧ
、ＩおよびＬの反応性は、ＣＢＤ（１５１−３１８）の中央半分（central half
）における抗体結合部位の局在化を示唆する。２Ｂ８によるキメラＬの排他的な
認識は、該融合蛋白質の中央半分におけるエピトープ配置を示唆する。あるいは
、該抗原決定基がＣＢＤ（１５１−３１８）のＣ末端にマッピングするという可
能性は、除外され得ない。両方の場合において、エピトープ形成を誘発すること
におけるフランキング領域（flanking regions）の役割は、必要とされるようで
ある。

【０１１４】Ｃ．リガンド結合に対するｍＡｂの効果抗ＣＢＤ（３０−５２９）ｍＡｂを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞へのコラーゲン結
合に対するそれらの効果について試験した。結合阻害アッセイを使用し、ここで
、細菌および¹²⁵Ｉ−コラーゲンを各ｍＡｂの存在下でインキュベートした。ｍ
Ａｂ２Ｂ８および１Ａ１１のみが、いくらかの程度でブドウ球菌へのリガンド
の結合を阻害した（図１５Ｃ）。ｍＡｂ２Ｂ８および１Ａ１１は、６０％まで
Ｓ．ａｕｒｅｕｓへのコラーゲン結合を阻害し、そして最高濃度で共に組み合わ
せた場合、ほぼ完全にリガンド結合をブロックした。２つのｍＡｂはまた、細菌
−コラーゲン複合体からコラーゲンを適度に追放する特性を共有した（図１５Ｄ
）。

【０１１５】実施例７：Ｓ．ＡＵＲＥＵＳ臨床分離株によって発現された天然ＣＮＡのモノ
クローナル抗体３Ｂ１２認識方法要約：細菌調製 − １０ｍｌのトリプシンダイズブロス一晩培養物を、凍結ストッ
クから調製した画線プレート（streak plate）の単一コロニーから調製した。翌
朝、１０ｍｌのトリプシンダイズブロスに、５０μｌの一晩ストックを接種し、
そして３時間増殖させた。全ての培養物を、増殖期間後に氷上で保存した。全て
の培養物を、ほぼ同一ＯＤへ正規化させた。

【０１１６】プロテインＡのブロッキング − 全ての培養物を、１×ＰＢＳ中のウサギＩ
ｇＧの１：１００希釈（０．１１６ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌ中、氷上で、３０分間
インキュベートした。細菌を、１０分間３０００ｒｐｍでの遠心分離によって１
０冷１×ＰＢＳ中で１回洗浄した。それらを、１×ＰＢＳ中２．５％ＢＳＡ（Ｐ
ＢＳＡ）に再懸濁させ、そして氷上で保存した。

【０１１７】抗体調製 − ＰＢＳＡ中８μｇ／ｍｌｍＡｂ１０ｍｌを、各抗体および上
澄みについて調製した。溶液を氷上で保存した。

【０１１８】一次Ａｂインキュベーション − アッセイを、取り扱い易くするために、１
４４タイターチューブにおいて行った。マルチチャネルピペットを使用して、２
０μｌの細菌を各チューブへ添加した。次いで、０．５ｍｌの８μｇ／ｍｌＡ
ｂ溶液を、指定されたチューブへ添加した。全てのチューブを攪拌し、そして３
０分間氷上でインキュベートした。インキュベーションに続いて、各チューブを
攪拌し、次いで１０分間３０００ＲＰＭでプレートローターにおいて遠心分離し
た。上澄みを、各チューブについて手動でデカントした。細菌を冷ＰＢＳＡにお
いて２回洗浄した。

【０１１９】二次ＰＥＦ（ａｂ’）₂インキュベーション − 各チューブは、二次抗体
の１：２００希釈０．５ｍｌを受容した。細菌を再懸濁し、そして攪拌によって
混合した。チューブを、１０分間隔で２回攪拌して、３０分間氷上でインキュベ
ートした。このインキュベーションに続いて、細菌をＰＢＳＡ中の最終再懸濁物
で２回洗浄した。チューブをＦＡＣＳ分析まで氷上で保存した。

【０１２０】ＦＡＣＳ分析 − 各タイターチューブ（１４４）を、１２×７５ｍｍフロー
チューブへ移した。器具を校正し、そしてＦＬ−２検出器を、アイソタイプコン
トロールＰＥ放射がＦＬ−２ヒストグラムスケールの最初のディケード（decade
）において検出されるように調節した。

【０１２１】染色プロフィール − 図１６Ａ〜Ｄのヒストグラム図は、各モノクローナル
での３時間および一晩の培養時点での各株の染色プロフィールを示す。

【０１２２】結果 − これらの試験は、本発明に従うｍＡｂ３Ｂ１２による、Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ株における天然コラーゲンＭＳＣＲＡＭＭの認識の例を提供した。

【０１２３】

【表１】

【０１２４】

【表２】

【０１２５】

【表３】

【０１２６】

【表４】

【０１２７】

【表５】

【０１２８】

【表６】

【０１２９】

【表７】

【０１３０】

【表８】

【０１３１】

【表９】

【０１３２】

【表１０】

【０１３３】

【表１１】

【０１３４】

【表１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１．固定化ＣＮＡ１９への¹²⁵Ｉ−コラーゲンの結合の阻害。ＣＮＡ１９
組換え蛋白質を、マイクロタイターウェルへ固定化し（１００μｌ中１μｇ）、
そして２μｇの各ｍＡｂの存在下で¹²⁵Ｉ−コラーゲン（８×１０⁴ｃｐｍ）でプ
ローブした。抗体の非存在下でのＣＮＡ１９への¹²⁵Ｉ−コラーゲンの結合を、
１００％結合と設定した。バーは、二重試験を伴う、平均±標準偏差を示す。

【図２Ａ】図２Ａ．ＣＮＡ１９およびＡＣＥ１９の配列アラインメント（alignment）
。デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷを使用した。影を付けたアミノ酸残
基は、同一および類似残基であった。Ｘ線結晶学によって測定されたＣＮＡ１９
のβ−ストランドおよびα−ヘリックスを、ＣＮＡ１９の対応する領域の上のダ
ークバーによって示した。β−ストランドＡ、Ｂ、Ｄの一部、ＥおよびＨは、観
察されたトレンチを形成しそして^*によって示されるものである。

【図２Ｂ】図２Ｂ．キメラの略図。ＣＮＡ１９配列は、影を付けたバーによって示され
、一方ＡＣＥ１９はブランクバーによって示される。ダークな影付きボックスは
、β−ストランドを示し、そして縞模様の（striped）ボックスはＣＮＡ１９の
α−ヘリックスを示す。“^*”は、トレンチを形成するβ−ストランドを示す。
数字は、ＣＮＡ１９におけるアミノ酸残基の位置を示す。

【図３】図３．ｍＡｂによって認識されるＣＮＡ１９エピトープの局在の要約。ＣＮ
Ａ１９の直下の水平線は、種々のｍＡｂがマップされた領域を示し、各線の上の
数は、該領域におけるｍＡｂの数を示す。中央領域についての数字は、１６Ｈ９
を含むが、抗−ＨｉｓタグｍＡｂ７Ｅ８を含まない。

【図４】図４．Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎＩへ結合する¹²⁵Ｉ−コラーゲンに対
する抗−ＣＮＡ１９ｍＡｂの効果。Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎＩ（５×１
０⁸細胞）を、¹²⁵Ｉ−コラーゲン（５×１０⁴ｃｐｍ）の添加の前に、示される
量の各ｍＡｂと共にプレインキュベートした。コラーゲン結合を、“実験手順”
で記載されるように定量した。値をｍＡｂの非存在下で結合するリガンドの割合
として表現する。結果を二重測定の平均±標準偏差として表現する。

【図５】図５．ｍＡｂによるＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞への¹²⁵Ｉ−コラーゲン結合の用
量依存性阻害。Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎＩ細胞（５×１０⁸細胞）を、¹²⁵ Ｉ−コラーゲンの添加の前に、増加する濃度のｍＡｂ９Ｇ７、１１Ｈ１１、８
Ｅ６および１６Ｈ９と共にプレインキュベートした。値は、抗体の非存在下での
細菌へ結合するリガンドの割合として表現され、そして二重測定の平均±標準偏
差を示す。

【図６】図６．ｍＡｂによる固定化コラーゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓ付着の用量依存
性阻害。マイクロタイターウェルを、以下の実施例セクションにおいて報告され
るように、コラーゲンタイプIIでコーティングした。細菌細胞を、ウェルへ添加
する前に、示される増加する量のｍＡｂと共にプレインキュベートした。付着値
（adherence values）を、抗体の非存在下で得られる付着の割合として表現する
。バーは、平均±標準偏差を示す。各サンプルを二重で行った。

【図７】図７．コラーゲン−細菌複合体からの¹²⁵Ｉ−コラーゲンの追放。Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓＣｏｗａｎＩ細胞（５×１０⁸）を、１時間、¹²⁵Ｉ−コラーゲン（５
×１０⁴ｃｐｍ）と共にプレインキュベートした。遠心分離後、細菌−コラーゲ
ン複合体を再懸濁させ、そして示される量の各ｍＡｂを懸濁液に添加し、そして
更に１時間インキュベートした。細菌へ結合された残りのコラーゲンの量を、γ
カウンターにおいて測定した。二重サンプルを各データポイントについて使用し
た。

【図８Ａ】図８Ａ．ｍＡｂによるコラーゲン−ブドウ球菌複合体からの¹²⁵Ｉ−コラー
ゲンの用量依存性追放。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞を、図７に報告されるように、¹² ⁵ Ｉ−コラーゲンと共にプレインキュベートした。増加する量の示されるｍＡｂ
を、コラーゲン−細菌複合体へ添加し、そして１時間インキュベートした。細菌
と結合された残りの¹²⁵Ｉ−コラーゲンを、γカウンターにおいて定量した。バ
ーは二重測定の平均からの標準偏差を示す。

【図８Ｂ】図８Ｂ．ｍＡｂによる固定化コラーゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞付着の追
放。Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎ１細胞を、コラーゲンコーティングされたプ
レートへ付着させた。洗浄後、示される量のｍＡｂをウェルへ添加し、そして２
時間インキュベートした。多数の洗浄後、残りの付着された細菌の数を、“実験
手順”において報告されるように、ペルオキシダーゼ−複合体化ウサギ抗−マウ
スＩｇＧを使用することによって定量した。データを、ｍＡｂの非存在下での付
着された細菌の割合として表現する。値は、二重で行われたインキュベーション
の平均である。

【図９】図９．Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣＮＡ１９に対して生成されたモノクローナル抗
体の交差反応性。Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣＮＡ１９に対して惹起されたモノクロー
ナル抗体の交差反応性を、インタクトなＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの認識を示
すＥＬＩＳＡスクリーニングによって確立した。この図におけるグラフは、ＣＮ
Ａ１９に対して生成されたモノクローナル抗体の５つのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ株への結合を測定することによって、この認識を反映する。この図に示され
るように、Ｍａｂ１１Ｈ１１は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの５つの異なる
臨床分離株（clinical isolates）を認識した。３Ｄ３、９Ａ４、および１２Ｈ
１０を含むいくつかの他のＭａｂは、より低いが検出可能な結合を有した。

【図１０】図１０．未処理動物に対する、本発明に従って９Ｇ３モノクローナル抗体で
処理した動物についての生存プロット。

【図１１】図１１．未処理動物に対する、本発明に従って３Ｂ１２モノクローナル抗体
で処理した動物についての生存プロット。

【図１２Ａ】図１２Ａ．ＣＮＡ１９（ＣＢＤ１５１−３１８）に対して生成されたｍＡｂ
による固定化コラーゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞付着の阻害。

【図１２Ｂ】図１２Ｂ．ＣＮＡ１９（ＣＢＤ１５１−３１８）に対して生成されたｍＡｂ
による固定化コラーゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞付着の阻害。

【図１３】図１３．ＣＮＡ１９（ＣＢＤ１５１〜３１８）に対して生成されたｍＡｂに
よるＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞からの¹²⁵Ｉ−コラーゲンの追放。

【図１４Ａ】図１４Ａ．ＣＮＡ１９（ＣＢＤ１５１〜３１８）に対して生成されたｍＡｂ
による固定化コラーゲンへ結合されたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の追放。

【図１４Ｂ】図１４Ｂ．ＣＮＡ１９（ＣＢＤ１５１〜３１８）に対して生成されたｍＡｂ
による固定化コラーゲンへ結合されたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の追放。

【図１４Ｃ】図１４Ｃ．ＣＮＡ１９（ＣＢＤ１５１〜３１８）に対して生成されたｍＡｂ
による固定化コラーゲンへ結合されたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の追放。

【図１５Ａ】図１５Ａ．ＣＢＤ（１５１〜３１８）に対して惹起されたポリクローナル抗
体およびｍＡｂ２Ｂ８および１６Ｈ９を用いた固定化ＧＳＴ−ＣＮＡ融合蛋白
質誘導体のＥＬＩＳＡ分析。

【図１５Ｂ】図１５Ｂ．ＡＣＥ１９（１７４〜３１９）およびＣＮＡ１９（１５１〜３１
８）のセグメントからなるキメラを使用することによる、ｍＡｂ２Ｂ８および
１６Ｈ９についてのエピトープのマッピング。

【図１５Ｃ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎ１へのコラーゲン結合に対する、ＣＢＤ（３０
〜５２９）に対して生成されたｍＡｂの阻害活性。

【図１５Ｄ】ｍＡｂ１Ａ１１および２Ｂ８によるＳ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎ１からの¹ ²⁵ Ｉ−コラーゲンの追放。

【図１５Ｅ】図１５Ｅ．ｍＡｂ１Ａ１１および２Ｂ８によるＳ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａ
ｎ１からの¹²⁵Ｉ−コラーゲンの阻害。

【図１６Ａ】図１６Ａ．これらは、各モノクローナルでの、３時間および一晩培養時間ポ
イントでの、３Ｂ１２という名のモノクローナル抗体による４つの異なる株の認
識を反映する染色プロフィールを示すヒストグラム図である。

【図１６Ｂ】図１６Ｂ．これらは、各モノクローナルでの、３時間および一晩培養時間ポ
イントでの、３Ｂ１２という名のモノクローナル抗体による４つの異なる株の認
識を反映する染色プロフィールを示すヒストグラム図である。

【図１６Ｃ】図１６Ｃ．これらは、各モノクローナルでの、３時間および一晩培養時間ポ
イントでの、３Ｂ１２という名のモノクローナル抗体による４つの異なる株の認
識を反映する染色プロフィールを示すヒストグラム図である。

【図１６Ｄ】図１６Ｄ．これらは、各モノクローナルでの、３時間および一晩培養時間ポ
イントでの、３Ｂ１２という名のモノクローナル抗体による４つの異なる株の認
識を反映する染色プロフィールを示すヒストグラム図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＥＧ０１Ｎ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｌ 33/00 Ｔ (31)優先権主張番号６０／２２５，４０２ (32)優先日平成12年８月15日(2000．8．15) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人ユニヴァーシタデグリストゥディディパヴィアイタリア国アイ−27100 パヴィアストラーダヌオヴァ 65 (72)発明者フックマグナスアメリカ合衆国 77005 テキサス州ヒューストンオバーリン 4235 (72)発明者スーイアメリカ合衆国 77006 テキサス州ヒューストンバンクス 1215 アパートメント２ (72)発明者スペジャーレピエトロイタリア国 27100 パヴィアヴィアカルパネリ＃17 (72)発明者ヴィサイリヴィアイタリア国 20088 ロゼート（ミラノ) ヴィアドンコロンボ＃12 (72)発明者キャソリニファブリジャイタリア国 23035 サンダロ（ソンドリオ）ヴィアグライル＃17 (72)発明者パティジョセフアメリカ合衆国 30040 ジョージア州カミングストラトフォードプレース 6680 (72)発明者パテルプラチクシャアメリカ合衆国 30062 ジョージア州マリエッタバリーズコーナー 1300 (72)発明者ドマンスキーポールアメリカ合衆国 30319 ジョージア州アトランタエヌ．トンプソンロード 2655 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4C081 AB01 AB11 AB31 AC01 AC03 AC06 AC08 BA14 BB04 CD112 CD121 CD131 CD141 CD34 CE01 DA01 DA02 DA03 DA04 DC03 DC05 EA02 EA06 4C085 AA13 AA14 AA16 BA13 BB11 CC07 CC13 DD62 EE01 EE03 4C087 AA01 AA02 BB35 DA15 DA26 MA52 MA55 MA59 MA66 NA14 ZB05 ZB35 4H045 AA11 BA10 CA11 DA76 EA29 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣＮＡ１９ペプチドを認識する単離
された抗体。
【請求項２】前記抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓの両方に対して交差反応性である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】前記抗体がヒトまたは動物におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を
予防する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】前記抗体がヒトまたは動物におけるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ感染を予防する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】前記抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓからなる群から選択されるブドウ球菌細菌のコラーゲン結合を阻害する、請
求項１に記載の抗体。
【請求項６】前記抗体がコラーゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方の結合を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】前記抗体がヒトまたは動物における非経口、経口、鼻内、皮
下、または静脈内投与に好適である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗
体。
【請求項９】前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗
体。
【請求項１０】請求項１に記載の抗体を含有する単離された抗血清。
【請求項１１】細胞外マトリックス蛋白質へ結合されたＳ．ａｕｒｅｕｓ
を追放し（displacing）得る、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項１２】コラーゲンへ結合されたＳ．ａｕｒｅｕｓを追放し得る、
請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項１３】請求項１に記載の抗体および該抗体による結合を検出する
ための手段を含む、診断キット。
【請求項１４】有効量の請求項１に記載の抗体および薬学的に許容される
ビヒクル、担体または賦形剤を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓの感染を処置または予防するための薬学的組成物。
【請求項１５】有効量の請求項１に記載の抗体をヒトまたは動物患者へ投
与することを含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの感染
を処置または予防する方法。
【請求項１６】有効量の請求項１に記載の抗体をヒトまたは動物患者へ投
与することを含む、コラーゲンへ結合されたＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓを追放する方法。
【請求項１７】単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓＣＮＡ１９ペプチドを患者
へ投与することを含む、免疫学的応答を誘発する方法。
【請求項１８】細胞外マトリックスにおける表面蛋白質へ結合された細菌
を追放し得る抗体を同定する方法であって、該細胞外マトリックスの１以上の表
面蛋白質を標識化する工程；該細菌が該標識化表面蛋白質へ結合することを確実
にするに十分な時間、該標識化表面蛋白質を、該表面蛋白質へ結合し得ることが
公知の細菌と組み合わせる工程；該標識化表面蛋白質へ結合された細菌を収穫す
る工程；該標識化表面蛋白質へ結合された該細菌に対して追放活性（displaceme
nt activity）を有すると疑われる抗体を導入する工程；および該標識化表面蛋
白質から該細菌の追放を引き起こす抗体を同定する工程を含む、方法。
【請求項１９】前記表面蛋白質がコラーゲンである、請求項１８に記載の
方法。
【請求項２０】宿主細胞からＳ．ａｕｒｅｕｓを追放する能力を有する抗
体が単離される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】前記表面蛋白質が固体担体上に固定化される、請求項１８
に記載の方法。
【請求項２２】請求項１８に記載の方法によって産生される単離された追
放抗体。
【請求項２３】Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣＮＡ蛋白質のコラーゲン結合ドメイ
ンの領域１５１〜３１８に対して生成される、単離された交差反応性抗体。
【請求項２４】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌がコラーゲン結合部位へ結合するこ
とを阻害し得る、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２５】Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細菌がコラーゲン結合部位へ
結合することを阻害し得る、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２６】請求項１に記載の抗体を含有する単離された抗血清。
【請求項２７】特定の蛋白質へ結合し得る細菌を追放し得る抗体を同定す
る方法であって、細菌によって結合されることが公知である１以上の蛋白質を標
識化する工程；該細菌が該標識化表面蛋白質へ結合することを確実にするに十分
な時間、該標識化蛋白質を、該蛋白質へ結合し得ることが公知の細菌と組み合わ
せる工程；該標識化蛋白質へ結合された細菌を収穫する工程；該標識化蛋白質へ
結合された該細菌に対して追放活性（displacement activity）を有すると疑わ
れる抗体を導入する工程；および該蛋白質から該細菌の追放を引き起こす抗体を
同定する工程を含む、方法。
【請求項２８】請求項２７に記載の方法によって産生される単離された追
放抗体。
【請求項２９】好適な容器中に、請求項１に記載の抗体および免疫検出試
薬を含む、免疫検出のための診断キット。
【請求項３０】前記免疫検出試薬が、前記抗体へ連結される検出可能な標
識である、請求項２９に記載の診断キット。
【請求項３１】Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣＮＡ蛋白質に対して惹起された
単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３２】請求項３１に記載の抗体を含有する単離された抗血清。