CN102453091B - 抗破伤风类毒素单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗破伤风类毒素单克隆抗体、其制备方法及其用途。具体而言,本发明涉及一种抗破伤风类毒素单克隆抗体,其重链可变区的互补决定区具有:SEQ ID NO:6所示的CDR1;SEQ ID NO:8所示的CDR2;和/或SEQ ID NO:10所示的CDR3,其轻链可变区的互补决定区具有:SEQ ID NO:12所示的CDR1;SEQID NO:14所示的CDR2;SEQ ID NO:16所示的CDR3。本发明还提供了编码所述序列的DNA分子、表达载体和宿主细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫学领域。更具体地说,本发明涉及一种具有中和破伤风类毒素的单克隆抗体。另外,本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法和用途。
背景技术
破伤风(Tetanus)是一种人畜共患的严重感染疾病,由破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)感染引起。在厌氧条件下细菌于创口生长繁殖,产生大量的毒素,毒素侵害中枢神经系统,导致患者全身性肌肉强直性痉挛,形成破伤风特有的牙关禁闭、角弓反张等症状,严重者最后会死于窒息及全身性衰竭。目前,在大部分发展中国家破伤风仍然是一个主要的公共卫生问题,每年大约有100万人死于破伤风,其中新生儿占死亡总数80%。
破伤风梭状芽胞杆菌,长4~8μm,宽0.3~0.8μm,经常以相当长的细丝形式存在,形成芽胞时,细菌呈特殊的鼓槌状,芽胞为卵圆形。破伤风梭状芽胞杆菌为严格厌氧菌,其芽胞可抗高温抗干燥,对大多数防腐剂由抗性,但对碘的水溶液及中性戊二醛溶液敏感,可在短时间内被这些试剂杀灭。破伤风梭菌可以产生两种外毒素:一种是具有溶血作用的破伤风溶血毒素;另一种是破伤风痉挛毒素,即常说的破伤风毒素。
破伤风毒素是由破伤风梭状杆菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质,由1315个氨基酸组成,相对分子质量为150700Da。破伤风毒素的基因存在于一个75Kb的质粒上,编码基因长约4Kb。破伤风毒素在菌体内表达后是单一的一条蛋白质链,在分泌过程中被蛋白酶裂解成由二硫键链接的轻链和重链。根据毒素在体内的作用,破伤风毒素分子分为A、B、C三个部分,毒素的轻链片段为A片段,重链N末端的一半为B片段,另一半为C片段。
破伤风毒素是已知最毒的毒素之一,经纯化的破伤风毒素对小鼠的致死剂量为0.1ng/kg,对豚鼠的致死剂量为0.3ng/kg,推测对人的致死剂量为0.25ng/kg。它的作用过程一般为结合、导入和作用三步。研究结果表明毒素的C片 段可以和毒素的受体结合,毒素的受体一般认为是神经节苷脂,毒素的C片段具有逆行轴突运输进入中枢神经系统的功能,已被用于研究亚单位疫苗;B片段可以在人工磷脂膜上形成离子通道,将毒素的活性片段导入到细胞内;毒素的A片段分子是Zn蛋白酶,具有蛋白酶活性,它可以裂解神经细胞膜上的传送神经递质的蛋白质-囊泡相关膜蛋白,从而抑制神经递质的释放,使兴奋的冲动不停传递,导致患者产生强直性痉挛的临床症状。然而,从破伤风毒素中直接提取和纯化C片段亦有许多弊端:破伤风毒素毒性高,易形成芽胞进行传播,培养、分离过程复杂、回收率不高,且具有一定危险性。
破伤风类毒素疫苗作为主动免疫疗法被应用于破伤风的预防。破伤风类毒素是用破伤风梭状芽胞杆菌菌种在适宜的培养基中培养产生的毒素,经甲醛脱毒、精制并加入氢氧化铝佐剂后制成的疫苗。类毒素接种过程中虽然消除了培养基成分或多次加强注射等引起的过敏因素,还是有一定的不良反应发生(如类毒素疫苗制品纯度不高、致敏性强等),临床上较难推广。而且类毒素疫苗在我国是作为计划免疫接种的,用量很大,其质量尤为重要,这极大限制了类毒素疫苗的应用。
破伤风毒素毒性极强,作用迅速,因此破伤风的有效预防和治疗往往需要及时注射破伤风抗毒素(Tetanus antitoxin,TAT)或破伤风人血免疫球蛋白(Human tetanus immunoglulin,HTIG)。
破伤风抗毒素是用破伤风梭状杆菌或类毒素免疫动物获取而制备的免疫血清,该血清具有中和的破伤风毒素的能力。目前我国用于临床的破伤风抗毒素主要为马血清。抗毒素和毒素的中和反应只能在毒素处于游离的状态下才能发生,而且用抗毒素预防或治疗破伤风其成败的关键在于时间。若抗毒素能赶在毒素与易感细胞或组织结合之前中和毒素,其治疗效果是肯定的。然而,另一方面,破伤风毒素抗作为异种蛋白的抗原性毕竟还未完全改变,血清过敏反应的危险性仍未彻底根除。尤其是我国有大量人群已使用过破伤风抗毒素,再次使用的可能性较大,因此产生血清过敏的风险也更大,临床应用受到一定的限制。关键的是,抗毒素的临床应用效果不确实,马血清抗毒素在体内的半衰期短,不利于预防作用。
破伤风人血免疫球蛋白是采集经破伤风类毒素免疫的健康献血者抗体滴度较高的抗毒素血浆制备而成的抗体,属人源性同种蛋白,较为安全,几乎不会发生血清病与过敏反应。而且,该免疫球蛋白半衰期长,可达3~4周,大大 提升了破伤风的防治水平。但由于人血来源困难,价格昂贵,工业化生产复杂,易受病毒污染,使破伤风人血免疫球蛋白的应用受到了极大地限制。因此,目前主要还是由马血清破伤风抗毒素占领着市场。
由此,利用先进的技术,寻找更加高效的、安全的抗破伤风类毒素单克隆抗体在本领域中具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种高效的、安全的抗破伤风类毒素单克隆抗体并揭示其可变区序列,更具体为其互补决定区(CDR)序列。本发明的另一目的在于提供一种特异性的、抗破伤风类毒素人-鼠嵌合单克隆抗体。本发明的另一目的在于提供抗破伤风类毒素单克隆抗体的制备方法和用途。
在本发明的第一方面中,提供了一种抗破伤风类毒素单克隆抗体,该单克隆抗体的重链可变区的互补决定区具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:8所示的CDR2、SEQ ID NO:10所示的CDR3;其轻链可变区的互补决定区具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:12所示的CDR1、SEQ ID NO:14所示的CDR2、SEQ ID NO:16所示的CDR3。
在本发明的一个实施方式中,所述单克隆抗体的CDR序列如SEQ ID NO:6、8、10、12、14和16所示。
在本发明的另一个实施方式中,所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列,所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一个优选例中,所述单克隆抗体的框架区内存在一个或多个氨基酸取代。
在另一个优选例中,所述单克隆抗体为:鼠源抗体、人-鼠嵌合抗体或人源化抗体,优选人-鼠嵌合抗体,更优选所述人-鼠嵌合抗体包含人的重链恒定区和轻链恒定区(如人IgG1恒定区)。
在另一个优选例中,所述单克隆抗体的可变区序列中包括前述序列的同系物或修饰物;同系物为抗体可变区的蛋白序列,其同系性达到上述序列的60%或以上、70%或以上、80%或以上;修饰物为对所述抗体的氨基酸或其核酸序列通过取代、增加或截短进行改变的产物,上述单克隆抗体具有中和破伤风类毒素的活性。
在本发明的第二方面中,提供了一种DNA分子,其编码包含SEQ ID NO:6、8和10的氨基酸序列,或编码包含SEQ ID NO:12、14或16的氨基酸序列。
在一个优选例中,所述DNA分子编码SEQ ID NO:2所示的重链可变区,或编码SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。
在本发明的一个实施方式中,所述DNA分子含有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面中,提供了一种表达载体,它含有本发明的DNA分子序列以及与所述序列操作性相连的表达调控序列。
在一个优选例中,所述表达载体是pCDNA3.1(+/-)。
在本发明的第四方面中,提供了一种宿主细胞,它含有本发明的DNA分子或被本发明的表达载体转化。
在一个优选例中,所述宿主细胞是哺乳动物细胞,优选人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞,更优选CHO细胞。
在本发明的第五方面中,提供了一种疫苗组合物,其包含:免疫有效量的本发明的单克隆抗体,以及免疫学上可接受的载体和/或佐剂。
在本发明的第六方面中,提供了一种诊断试剂盒,其包含:诊断有效量的本发明的单克隆抗体或其免疫偶联物。
在一个优选例中,所述免疫偶联物具有选自下组的偶联部分:药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。
在本发明的第七方面中,提供了一种制备本发明的抗破伤风类毒素单克隆抗体的方法,所述方法包括:a)提供表达载体,该表达载体含有本发明的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列;b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞;c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞;和d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
在本发明的另一方面中,提供了本发明的抗破伤风类毒素单克隆抗体在制备预防破伤风感染的疫苗中的用途。在本发明的又一方面中,提供了本发明的抗破伤风类毒素单克隆抗体在制备破伤风细菌感染的诊断试剂中的用途。在本发明的其它方面中,提供了一种抗破伤风类毒素单克隆抗体,其中所述抗体可变区的基因和蛋白质序列同系物或修饰物;同系物为抗体可变区的蛋白序列,其同系性达到上述序列的60%或以上、70%或以上、80%或以上;修饰物为对所述抗体的氨基酸或其核酸序列通过取代、增加或截短进行改变的产物仍旧保留 中和破伤风毒素的能力。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
本发明其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了鼠源抗破伤风类毒素单抗的纯化SDS-PAGE电泳图。
图2显示了鼠源抗破伤风类毒素单抗的亲和力测定结果。
图3显示了采用RT-PCR制备抗破伤风类毒素鼠源单抗cDNA的反应体系和步骤。
图4显示了抗破伤风类毒素单抗可变区基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图,1~20依次为实施例2中所示抗体轻链及重链上游可变区兼并引物。
图5显示了抗破伤风类毒素单抗6D12的重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列,其中下划线部分为CDR序列。
图6显示了本发明表达载体pcDNA3.1(+/-)并标明了其中的元件及酶切位点。其中VH为抗破伤风类毒素单抗6D12重链可变区基因;CH为人IgG1抗体重链恒定区基因;VL为抗破伤风类毒素单抗6D12轻链可变区基因;CL为人IgG1抗体轻链恒定区基因。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究,以破伤风类毒素为免疫原,以Balb/c小鼠为免疫对象,通过免疫注射小鼠,取免疫小鼠脾脏制备悬液并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得可表达抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。发明人进一步从众多细胞株中筛选出可表达高特异性的抗破伤风类毒素的单克隆抗体。并且,本发明人还利用基因重组技术,保留鼠源抗体可变区部分,将其与人源抗体恒定区拼接,构建抗破伤风类毒素人-鼠嵌合单克隆抗体。在此基础上,发明人完成了本发明。
本发明涉及一种新的抗破伤风类毒素人-鼠嵌合单克隆抗体,包括该抗体的基因和蛋白序列和生物功能。本发明的抗破伤风类毒素人-鼠嵌合单克隆抗体是 通过下述几个主要步骤实现的:1、抗破伤风类毒素鼠源单克隆抗体的制备;2、单克隆抗体可变区编码序列的克隆与鉴定;3、人-鼠嵌合抗体表达真核载体的构建;4、人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达;
近年来,利用基因抗体工程技术对鼠源单克隆抗体进行改造制备的基因工程抗体不仅降低甚至消除了一种血清蛋白引起的过敏反应,又克服了人源免疫球蛋白生产过程中的障碍,具有较好的发展前景。采用基因重组技术,在基因水平上对抗体分子进行改造,形成嵌合抗体,即将鼠抗可变区基因与人IgG恒定区链接;人源化抗体,即将鼠抗可变区的互补决定区移植入人IgG的骨架区中,进一步降低了鼠抗引起的免疫反应;完全人源抗体,该类抗体不含任何外来基因,不会造成过敏反应,是目前基因工程抗体研究的热点之一。
本发明建立一种既具有高特异性、高效价、能中和破伤风毒素,又能降低或基本消除异种蛋白引起的过敏反应的单抗,以用于治疗。以破伤风类毒素作为免疫原,采用杂交瘤技术制备抗破伤风类毒素单克隆杂交瘤细胞株,并制备其抗破伤风类毒素鼠源单抗。由于鼠源单抗作为异种蛋白的抗原性仍异常强烈,可能会引起强烈的过敏反应而限制其临床应用。采用基因工程抗体技术对鼠抗进行改造构建嵌合抗体,该抗体不仅具有中和破伤风毒素的能力,且极大降低了其异种蛋白的抗原性。利用基因过程抗体生产嵌合抗体、人源化抗体的技术已趋于成熟,且大量产品以市场化。这为抗破伤风基因工程抗体的制备提供了有力的前提条件。
如本文所用,“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用,“分离的”或“分离纯化的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
本文所用的术语“单克隆抗体(单克隆抗体)”指从一类基本均一的群体获得的抗体,即该群体中包含的单个抗体是相同的,除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且,与常规多克隆抗 体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的,不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从基本均一的抗体群中获得的,这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些还可进一步分成亚类(同种型),如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
本发明还提供了抗破伤风类毒素单克隆抗体的氨基酸序列及其可变区链,以及具有这些链的其它蛋白质或融合表达产物。具体地,本发明包括具有含超变区(互补决定区,CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表 达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述,称为超变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab或(Fab’)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如,单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等,Nature,256:495(1975)首先提出)制得,或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本发明还提供了编码本发明单克隆抗体中重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的DNA分子。在一个较佳的实例中,该DNA分子含有SEQ ID NO:1所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列,以及SEQ ID NO:3所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。
在获得上述编码本发明的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后,通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。
首先,提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。但是,本领域普通技术人员也能预计到,将编码本发明单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别插入不同的表达载体中进行共表达也能获得本发明的单克隆抗体。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列 的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如,如果启动子或增强子增加了编码序列的转录,则它与编码序列是操作性相连的。
编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如,可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后,用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中,使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前,并使它们在同一读框内。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体,例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体,以及其它可获得的表达载体,如pMG18(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具开发》“Development of Tools for Environmental Monitoring Based on INCP-9Plasmids Sequences”.A.Greated,R.Krasowiak,M.Titok,C.M.Thomas,1992年出版,具体载体图见该书第143页)。
随后,用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞,昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中,优选哺乳动物细胞。通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》,Academic Press,Kruse and Patterson编辑(1973),该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰,包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。尽管在下文实施例中,本发明仅列举了以CHO细胞作为宿主细胞的例子,但是本领域技术人员在阅读了本发明的详细描述和具体实施例可以知道,本发明也能采用上述这些细胞系。
用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种,所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的,其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中,较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。 例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染诸如CHO细胞等宿主细胞。
然后,在适合本发明单克隆抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤,如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的人源抗EGFR单克隆抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
另一方面,本发明还提供了一种预防或治疗破伤风的疫苗组合物,该组合物含有免疫有效量的本发明单克隆抗体以及免疫学上可接受的载体。在较佳的实施方案中,该组合物中还可含有与本发明的单克隆抗体偶联的其它标记或治疗部分。本文所用的术语“免疫学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“免疫学上可接受的载体或赋形剂”应当与本发明的单克隆抗体相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低单克隆抗体或疫苗组合物的药效。
作为免疫学上可接受的载体的具体例子包括但不限于:糖类,如葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉;纤维素及其衍生物,如乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;调味剂;稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。
使用疫苗组合物时,其安全有效量可为常规用量。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明的组合物可根据需要制成各种剂型,并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。
本发明的单克隆抗体还可用于制备破伤风细菌感染的诊断试剂盒,从而用于有效诊断破伤风细菌的感染。例如所述诊断试剂盒中可包括检测条,其含有本发明的单克隆抗体或其偶联物、或它们与可检测标记物的结合物。所述可检测标记物选自:胶体金标记、荧光标记、同位素标记、酶标记,优选所述酶标 记为HRP酶标。
本发明的诊断试剂盒所针对的生物样品可以是获自患者的新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织、体液、血液、或细胞等,优选为新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液等适于检测的各种形式存在,例如在结合免疫组织化学的检测中,优选采用石蜡切片标本。
可根据多种检测原理和方法,按照需要在试剂盒中配备检测所需的试剂或试剂组。在本发明中,“试剂组”是指包含了检测所需的多种试剂的试剂组合。此外,本发明的试剂盒还可根据需要包括:容器、对照物(包括阳性或阴性对照)、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等,本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
本发明的优点
本发明中制备了高特异性抗破伤风类毒素单克隆抗体,并利用基因重组技术构建的抗破伤风类毒素人-鼠嵌合单克隆抗体,其基因和蛋白质序列与现有报道不同,该抗体具有较高的中和破伤风毒素的能力。通过小鼠实验证明,该抗体可保护动物抵御破伤风毒素的攻击。此外,该抗体作为药物与国内现有抗体比较,具有以下优点:
1、极大降低过敏反应:目前国内使用的马血清抗体,容易诱发严重的过敏反应。而此抗体是经基因重组技术改造构建的抗破伤风类毒素人-鼠嵌合单克隆抗体,极大降低了过敏反应。
2、较高的效价:该抗体具有较高的中和毒素的能力。小鼠体内实验证明本发明的抗体可完全保护小鼠抵御致死剂量的破伤风毒素的攻击。
本发明经基因重组技术大大降低了异种蛋白的抗原性,但由于嵌合抗体仍保留部分鼠源抗体可变区的异源性,可对嵌合抗体进一步人源化。本发明克服了现有产品存在的缺点,提供了一种嵌合抗破伤风类毒素单抗的制备和应用,不仅克服了目前临床使用的抗破伤风毒素(主要为马抗破伤风毒素抗血清)引起的人体过敏反应,而且利用基因重组技术所制备的单抗克服了动物病毒感染病人的危险性。
实施例
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件(例如可参考通常按照常规条件如《分子克隆:实验室指南》(同上)中所述的条件、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、抗破伤风类毒素鼠源单克隆抗体的制备
一、抗破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
1、免疫原
购自上海生物制品研究所生产部的破伤风类毒素。
2、免疫Balb/c小鼠
Balb/c小鼠购自上海斯莱克公司,所有免疫用Balb/c小鼠均为3周龄、雌性、标准化无病、健康的纯种小鼠,符合美国FDA标准。
3、Balb/c小鼠免疫方法
第一次免疫:将50μg(250μl)抗原与250μl铝佐剂混匀,配置成500μl溶液,注射于Balb/c小鼠皮下多点及足掌。第二次免疫:距第一次免疫间隔三周后,同法同剂量进行第二次免疫。第三、四次免疫:距第二次免疫间隔二周后,同法同剂量进行第三、四次免疫。四次免疫后小鼠尾静脉采血,采用常规酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定血清抗体滴度,待血清滴度>105以上时(为3.3×106),准备做细胞融合。细胞融合前三天进行加强免疫:小鼠尾静脉注射抗原20μg(100μl)。
4、细胞融合:
Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞购自美国ATCC公司。
(1)融合前一天换液,使Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞保持良好生长状态。
(2)脾细胞:取免疫小鼠,放血,断颈猝死,于75%酒精浸泡3-4min。无菌条件下取出小鼠脾脏,放入15ml离心管中,加入少许无血清RPM 1640培养液, 用移液管轻轻吹打,碾碎,直至没有组织结块、细胞均匀为止。然后,用无血清RPM 1640培养液洗涤小鼠脾脏细胞三次,计数备用。
(3)取对数生长期的Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞,无血清RPM 1640培养液洗涤三次,计数备用。
(4)将小鼠脾脏细胞和Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞以10:1的比例混合,1500rpm离心7min。洗去上清液,准备融合。
(5)一分钟内缓缓加入1ml PEG(1450),轻摇90sec;再在2.5min中内加入5ml无血清RPM 1640培养液,最后再加入5ml无血清培液终止反应,静置5min后,1280rpm离心8min,弃去上清,加入常规RPM 1640培养液(含有10%胎牛血清),制备成细胞悬液。
(6)将上述细胞悬液以每孔2×104个细胞的密度种入96孔板,每孔200μl,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。培养24h后,更换含有HAT(25×)的常规RPM1640培养液,于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续孵育。培养14d后用ELISA法检测各个克隆细胞的上清液筛选抗破伤风类毒素抗体的阳性克隆。
5、细胞筛选与亚克隆:
首先使用含有HAT的常规RPM 1640培养液进行培养筛选,培养7d后,改用HT的常规RPM 1640培养液培,进行再次培养筛选。培养14d后,用ELISA方法以各个克隆细胞的上清液筛选抗破伤风类毒素抗体的阳性克隆。采用有限稀释法,将细胞悬液稀释至60个/ml,于96孔板中每孔加100μl(约6个细胞/孔)。接种2排,剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释,再接种2排。重复一次。置37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。每隔2~3天,更换1/2培养液。培养约10d后,选择单个克隆生长的阳性孔进行第二次筛选和亚克隆。连续三次亚克隆后,经ELISA法检测抗体阳性率为100%时确定为稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞株,保种建库。
6、单克隆抗体的类型鉴定
经筛选,获得一株抗破伤风类毒素单克隆抗体,命名为6D12。采用SigmaTM抗体亚型检测试剂盒对该抗体的类型进行测定。经测定(结果如表1所示),抗破伤风类毒素单克隆抗体6D12的类型为:IgG1亚型,Kappa(κ)。
抗体亚型 | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM |
6D12 | 1.854 | 0.295 | 0.397 | 0.331 | 0.418 | 0.464 |
鼠源抗破伤风类毒素单抗6D12的纯化SDS-PAGE电泳图如图1所示。
采用常规ELISA法测定抗破伤风类毒素单克隆抗体6D12的亲和力,其亲和常数为3.9×108M-1(如图2所示)。
实施例2、抗破伤风类毒素单抗可变区编码序列的克隆和鉴定
以实施例1中筛选所得抗破伤风类毒素杂交瘤细胞株(6D12)cDNA为模板,利用PCR技术,克隆抗破伤风类毒素鼠源单抗可变区基因;经测序,选取无突变无终止密码子的序列,采用5’RACE技术克隆出功能性VL和VH基因。
一、抗破伤风类毒素鼠源单抗可变区编码序列的克隆
(一)从杂交瘤细胞株中提取抗破伤风类毒素单抗的总RNA
用上海飞捷生物公司FAST1000试剂盒提取。
(1)取4×105杂交瘤细胞,1000rpm×3min,弃上清。用PBS洗涤一次。将细胞重悬于100μlPBS中,放入离心管内。
(2)加入RB1液1ml,充分颠倒混匀直至完全溶解,室温放置5min。
(3)加入RB2液500μl,充分颠倒混匀1min。将混匀后的液体吸入或直接倒入内套管中离心1min。
(4)弃去外套管中液体,内套管中加入500μl洗液,离心1min,再重复一次。
(5)取出内套管,弃去外套管中液体,仍然套回内套管,不加洗液,离心1min。
(6)将内套管移入新的离心管中,在膜中央加入洗脱液40μl,室温静置1min,获得总RNA。
(以上枪头、离心管和无菌水均用DEPC处理,经121℃灭菌20min。)
(二)RT-PCR制备抗破伤风类毒素鼠源单抗cDNA
以总RNA为模板,Oligo(dT)18为引物,RT-PCR扩增抗破伤风类毒素单抗cDNA。反应体系和步骤如图3所示。
(三)抗破伤风类毒素鼠源单抗可变区基因的克隆
A、兼并引物的合成
根据抗体信号肽及骨架区基因的保守性,设计并合成以下兼并引物(以下引物中W=A/T,K=G/T,R=A/G,Y=C/T,M=A/C,S=C/G,N=C/G/T,V=A/C/G):
(1)轻链上游可变区兼并引物(分别对应于图4中的1-6):根据信号肽序列设计(5’-3’)
1、VLFWD1(SEQ ID No.:17):
GAATTCCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT
2、VLFWD2(SEQ ID No.:18):
GAATTCCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG
3、VLFWD3(SEQ ID No.:19):
GAATTCCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA
4、VLFWD 4(SEQ ID No.:20):
GAATTCCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT
5、VLFWD 5(SEQ ID No.:21):
GAATTCCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG
根据FR1保守序列设计(5’-3’)
6、MKac-Fwd(SEQ ID No.:22):GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA
(2)轻链下游兼并引物(5’-3’)
MKac-Rev(SEQ ID No.:23):GGATACAGTTGGTGCAGCATC
(3)重链上游兼并引物:根据信号肽序列设计(5’-3’)(分别对应于图4中的7-13)
7、MuIgVHD1(SEQ ID No.:24):ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT
8、MuIgVHD2(SEQ ID No.:25):ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT
9、MuIgVHD3(SEQ ID No.:26):ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACC
10、MuIgVHF1(SEQ ID No.:27):ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT
11、MuIgVHF2(SEQ ID No.:28):ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT
12、MuIgVHF3(SEQ ID No.:29):ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG
13、MuIgVHF4(SEQ ID No.:30):
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG
(4)重链上游兼并引物:根据FR1保守序列设计(5’-3’)(分别对应于图4中的14-20)
14、MHFR-Fwd-1(SEQ ID No.:31):SARGTNMAGCTGSAGSAGTC
15、MHFR-Fwd-2(SEQ ID No.:32):SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG
16、MHFR-Fwd-3(SEQ ID No.:33):CAGGTTACTCTGAAAGWGTST
17、MHFR-Fwd-4(SEQ ID No.:34):GAGGTCCARCTGCAACARTC
18、MHFR-Fwd-5(SEQ ID No.:35):GAGGTCCAACTVCAGCARCC
19、MHFR-Fwd-6(SEQ ID No.:36):AGAGTGAASSTGGTGGAATC
20、MHFR-Fwd-7(SEQ ID No.:37):GATGTGAACTTGGAAGTGTC
(5)重链下游兼并引物
MHCC-Rev(SEQ ID No.:38):ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC
B、可变区基因的克隆
以上述兼并引物和已制备抗破伤风类毒素单抗cDNA为模板,PCR扩增抗破伤风类毒素鼠源单抗可变区基因。
(1)PCR体系和参数设置如下:
试剂 体积(μl)
10×缓冲液 5
Mg2+(25mmol/l) 2
10mM dNTP Mix 1
P-Fwd 1
P-Rev 1
模板cDNA 1
Tag DNA聚合酶 1
ddH2O 38
总量 50/样品
PCR参数设置:95℃,预变性,5min;30轮如下循环:95℃变性,0.5min,65℃复性,0.5min,72℃延伸,0.5min;72℃延伸,10min。
(2)用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果,并与DNA分子量标记LD2000判断扩增片段的大小(如图4所示)。结果显示:分别有5条兼并引物(分别为1、2、3、5、6兼并引物)扩增出轻链可变区基因,有4条兼并引物(分别为12、15、17、19兼并引物)扩增出重链可变区基因,其大小约为330bp左右,条带单一,与轻/重链可变区基因片段的理论大小基本一致。
采用博大泰克公司的胶回收试剂盒回收330bp处的单抗可变区PCR扩增片段,并连接于pMD 18T克隆载体(购自Takara公司)上,转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞中,进行蓝白斑筛选,将阳性克隆送Invitrogen公司测序验证。
根据NCBI IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)免疫球蛋白基因比对分析结果,筛选出功能性抗体可变区基因,设计抗体轻链和重链可变区下游引物:
TT6D12-L-Rev(SEQ ID NO:39):TCTAGACTAGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGTTT
TT6D12-H-Rev(SEQ ID NO:40):TCTAGACTAGGGGAAGACCGATG GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT
采用5’RACE扩增出可变区5’端的序列。最终获得抗破伤风类毒素单抗的功能性可变区基因。
在6D12杂交瘤细胞株中,SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3分别是抗破伤风类毒素单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的DNA编码序列;SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4分别是上述DNA编码序列相应的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。SEQ ID NOs:5、7和9分别为重链的CDR1、CDR2和CDR3编码序列。SEQ ID NOs:11、13和15分别为轻链的CDR1、CDR2和CDR3编码序列。图5显示了6D12单抗的重链和轻链可变区核苷酸及氨基酸序列,其中下划线部分显示了CDR部分。
实施例3、抗破伤风类毒素人-鼠嵌合单克隆抗体真核表达载体的构建
利用重叠PCR技术将轻链VL基因与人Ig的CL基因进行拼接,构成轻链嵌合基因;轻链5’端引入BamHI限制性内切酶位点,轻链3’端引入EcoRI限制性内切酶位点。同理,构建重链嵌合基因。分别将上述轻链/重链基因插入pcDNA3.1(+/-)表达载体(购自Invitrogen公司)的单克隆酶切位点,构建抗破伤风类毒素人-鼠嵌合抗体的表达载体。
(1)按常规方法设计上下游物,利用PCR技术分别于重链/轻链可变区基因5’端引入BamHI单酶切位点,在重链/轻链恒定区基因3’端引入EcoR I单酶切位点。BamHI和EcoRI双酶切重链/轻链嵌合基因,切胶回收目的片段。
(2)pcDNA3.1(+/-)真核表达载体的处理:BamHI和EcoRI双酶切pcDNA3.1(+/-)载体,切胶回收目的片段(~5400bp)。
(3)将(1)中抗体重链/轻链基因分别克隆到(2)中pcDNA3.1(+/-)载体的BamHI和EcoRI位点。
(4)用上述连接产物转化DH5α感受态细胞,小量抽提重组质粒DNA。挑选插入目的片段的阳性克隆送上海Invitrogen公司测序鉴定。
经酶切及测序鉴定,验证本发明构建的抗破伤风类毒素单抗重链/轻链的重组表达载体其序列正确。该表达载体的结构如图6所示。
实施例4、抗破伤风类毒素人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及鉴定
采用脂质体法将抗破伤风类毒素人-鼠嵌合抗体重链/轻链表达载体共转染CHO/dhfr-细胞(购自ATCC),以未转染质粒的空细胞对照。培养48h、72h后,采用常规ELISA法,用HRP标记的羊抗人IgG抗体检测抗破伤风类毒素人-鼠嵌合抗体的表达及嵌合抗体对破伤风类毒素抗原的特异性识别。
鉴定结果如表1所示:
结果显示,共转染表达质粒载体的CHO细胞成功表达嵌合抗体,能有效识别破伤风类毒素抗原,而未转染表达质粒的CHO细胞培养上清不能识别破伤风类毒素抗原。即瞬时转染CHO成功表达了能特异性识别破伤风类毒素的抗破伤风类毒素抗原人-鼠嵌合抗体。
实施例5、抗破伤风类毒素单克隆抗体对动物的保护作用实验
(1)待检抗破伤风类毒素单抗的稀释
鼠源抗破伤风类毒素单抗6D12及8D9(6D12及8D9均按照实施例1方法制备)为我所制备,浓度均为10mg/ml,用稀释液(硼酸盐缓冲液)以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例稀释6D12单抗,使每1ml约含0.5IU。以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的比例稀释8D9单抗,使每1ml约含0.5IU。即使得单抗与毒素等量混合后每0.4ml注射量中含抗毒素约1/10IU。
(2)标准抗毒素的稀释
标准抗毒素购自中科院,批号001,效价为10IU/ml,用量为0.5ml。用稀释液以1∶20的比例稀释标准抗毒素,每毫升含0.5IU。即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中含1/10IU,用做治疗对照组。
(3)标准毒素的稀释
标准毒素购自上海生物制品研究所,批号20030301,用量1mg,用稀释液 按1∶17.3的比例稀释毒素,每毫升含0.5IU。
(4)定量吸取稀释后的抗毒素标准溶液及不同稀释度的抗破伤风类毒素单抗分别加入小试管,每管加入等量的稀释毒素溶液,混合均匀,37℃温育1h后,立即注射。
(5)取健康实验小白鼠18只,每组3只,分为6组。将(4)中混合物分别皮下注射体重为17~19g小白鼠腹部,每只注射0.4ml。每日上、下午各观察一次,连续6日,记录小白鼠发病与死亡情况。
(6)6D12单抗效价结果如下所示:
动物种类:小白鼠 体重:17~19g 注射剂量:0.4ml 注射途径:皮下
-:正常
+:发病程度(由轻到重表示为+,++,+++,++++)
48,96,120等数字代表小鼠死亡时间(单位:小时)
*动物标化列中所标示的是试验中动物标记的不同部位,以区分各试验组动物
(7)8D9单抗效价结果如下所示:
动物种类:小白鼠体重:17~19g 注射剂量:0.4ml 注射途径:皮下
-:正常
+:发病程度(由轻到重表示为+,++,+++,++++)
48,96,120等数字代表小鼠死亡时间(单位:小时)
*动物标化列中所标示的是试验中动物标记的不同部位,以区分各试验组动物
(8)结果判定:
对照组即标准抗毒素与标准毒素混合后注射的小鼠于72~120h内全部死亡,标准抗毒素效价为0.5IU/ml。
与对照组相比,待检组即本发明抗破伤风类毒素单抗6D12经20倍稀释后(最高有效稀释倍数)治疗的小鼠其死亡时间处于96~120h,和对照组小鼠的死亡时间基本相同。由于标准抗毒素的效价为10IU/ml,故可判定本发明的抗破伤风类毒素单抗的效价为10IU/ml(抗体浓度为10mg/ml,即10g/L)。
而采用同样方法制备的另一抗破伤风类毒素单抗8D9,经5倍稀释后(最高有效稀释倍数)治疗的小鼠其死亡时间处于90~96h,和对照组小鼠的死亡时间基本相同。判定抗破伤风类毒素单抗8D9的效价为不高于2.5IU/ml(抗体浓度为 10mg/ml,即10g/L)。
根据《中华人民共和国药典》(005年版第三部化学工业出版社)规定,抗毒素蛋白含量不高于180g/L,效价不低于100IU/ml。若按蛋白含量等比例换算,本发明抗破伤风类毒素单抗6D12的效价不低于180IU/ml,远远超过药典规定的100IU/ml,效价较高,而抗破伤风类毒素单抗8D9的效价不高于45IU/ml。
本发明抗破伤风类毒素单抗6D12的效价不仅高于以相同方法制备的单抗8D9,且与标准抗毒素的效价(10IU/ml)相当,能有效地保护动物防御致死剂量破伤风毒素的攻击,与标准抗毒素的保护性基本一致。并且,本发明单抗的实际用量低于标准抗毒素,这表明其效果比标准抗毒素更佳。
重复实验得到相同的结果。
附表:序列表及说明书中SEQ ID NOs:1-40各自所代表的序列
SEQ ID NO: | 所代表序列 |
1 | 6D12单抗重链编码序列 |
2 | 6D12单抗重链氨基酸序列 |
3 | 6D 12单抗轻链编码序列 |
4 | 6D12单抗轻链氨基酸序列 |
5 | 6D12单抗重链CDR-1编码序列 |
6 | 6D12单抗重链CDR-1氨基酸序列 |
7 | 6D12单抗重链CDR-2编码序列 |
8 | 6D12单抗重链CDR-2氨基酸序列 |
9 | 6D12单抗重链CDR-3编码序列 |
10 | 6D12单抗重链CDR-3氨基酸序列 |
11 | 6D12单抗轻链CDR-1编码序列 |
12 | 6D12单抗轻链CDR-1氨基酸序列 |
13 | 6D12单抗轻链CDR-2编码序列 |
14 | 6D12单抗轻链CDR-2氨基酸序列 |
15 | 6D12单抗轻链CDR-3编码序列 |
16 | 6D12单抗轻链CDR-3氨基酸序列 |
17-40 | 实施例中所用的人工引物 |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后, 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗破伤风类毒素单克隆抗体,其特征在于,
所述单克隆抗体的重链可变区的互补决定区的氨基酸序列选自下组:
SEQ ID NO:6所示的CDR1;
SEQ ID NO:8所示的CDR2;
SEQ ID NO:10所示的CDR3,
所述单克隆抗体的轻链可变区的互补决定区的氨基酸序列选自下组:
SEQ ID NO:12所示的CDR1;
SEQ ID NO:14所示的CDR2;
SEQ ID NO:16所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的抗破伤风类毒素单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的CDR序列如SEQ ID NO:6、8、10、12、14和16所示。
3.如权利要求1所述的抗破伤风类毒素单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种DNA分子,其特征在于,所述DNA分子编码如SEQ ID NO:6、8和10所示的氨基酸序列,或编码如SEQ ID NO:12、14或16所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的DNA分子,其特征在于,所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。
6.一种表达载体,其特征在于,它含有权利要求4所述的DNA分子序列以及与所述序列操作性相连的表达调控序列。
7.一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求4所述的DNA分子或被权利要求6所述的表达载体转化。
8.一种疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物包含:免疫有效量的权利要求1所述的单克隆抗体,以及免疫学上可接受的载体和/或佐剂。
9.一种诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含:诊断有效量的权利要求1所述的单克隆抗体或其免疫偶联物。
10.一种制备权利要求1所述的抗破伤风类毒素单克隆抗体的方法,所述方法包括:
a)提供表达载体,该表达载体含有权利要求4所述的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列;
b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞;
c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞;和
d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
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2010
- 2010-10-20 CN CN 201010512416 patent/CN102453091B/zh active Active
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CN1178472A (zh) * | 1996-03-23 | 1998-04-08 | 财团法人阪大微生物病研究会 | 破伤风毒素功能性片段抗原和破伤风疫苗 |
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人源抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性和预防治疗作用;赵红;《中国生物制品学杂志》;20030630;第16卷(第6期);356-358 * |
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