CN109627331A

CN109627331A - 一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区及基因工程抗体

Info

Publication number: CN109627331A
Application number: CN201910056041.5A
Authority: CN
Inventors: 石晶; 李雪; 殷玉和; 李希辰; 赵健; 刘伟; 付玉; 张馨月
Original assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109627331B

Abstract

本发明公开了一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区及基因工程抗体，属于抗体工程技术领域。本发明提供的抗犬细小病毒抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，为构建高亲和力、低免疫原性的抗犬细小病毒的基因工程抗体提供支持。本发明还将犬细小病毒的单克隆抗体的可变区序列与鼠源恒定区进行组装，得到抗犬细小病毒的基因工程抗体，表现出良好的中和CPV病毒的活性，且具有抑制犬细小病毒对红细胞的凝集作用，可将其应用于犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。

Description

一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区及基因工程抗体

技术领域

本发明涉及抗体工程技术领域，尤其涉及一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区，包括其氨基酸序列和核苷酸序列，以及利用其构建的抗犬细小病毒的基因工程抗体。

背景技术

犬细小病毒(Canine parvo-virus，CPV)是细小病毒科细小病毒属的成员，主要感染幼犬，能引起幼犬剧烈呕吐、白细胞显著减少，临床症状以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征，幼犬发病急，传染快，死亡率高，严重危害养犬业的发展，给养犬业造成了严重的经济损失。

预防犬细小病毒病的疫苗主要有：灭活苗、弱毒苗、多联苗，但是市场上仅20％的疫苗能产生100％保护力的抗体。对于犬细小病毒感染，目前尚没有特效药物，临床上多采用对症治疗、支持疗法和特异性疗法联合应用。其中，特异性疗法，一般早期采用犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清，进行抑制病毒对宿主细胞的侵染及病毒的复制，提高免疫力。

由于单克隆抗体的应用已经由体外诊断转向体内定位或者体内抗体治疗，特别是在临床治疗病毒疾病、自身免疫疾病具有较强的优势。而鼠源单克隆抗体对非鼠源体有较强的异源性和免疫原性，在体内应用时容易引起宿主的免疫排斥或过敏反应，使得鼠源单克隆抗体疗效降低，甚至在病体内产生严重后果,极大地限制了鼠源单克隆抗体的临床应用的效果，因此对鼠源单克隆抗体进行改造成为必要，经过改造的鼠源单抗降低了其免疫原性，可以更加有效应用于临床和治疗各种疾病。

目前，市场上的犬细小病毒单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，单克隆抗体和抗血清的免疫原性强，在治疗过程中会存在副作用降低疗效，极大地限制了其临床犬细小病犬的应用。因此，制备低免疫原性、高亲和力、特异性强的单克隆抗体更有利于推动抗体药物的大规模临床应用。采用的基因工程法获得表达靶抗体的基因序列，对于降低免疫原性的进一步改造至关重要。目前犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究较少，本发明提取了以犬细小病毒的单克隆抗体的可变区序列，并将其与鼠源恒定区进行组装，得到抗犬细小病毒的基因工程抗体，表现出良好的中和CPV病毒的活性，可应用于犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗犬细小病毒抗体的可变区编码序列和抗犬细小病毒的基因工程抗体，能够特异性的识别犬细小病毒，对犬细小病毒有很高的亲和力，降低免疫原性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种针对犬细小病毒鼠源的基因工程抗体。

本发明还提供了优选的抗犬细小病毒抗体的重链可变区氨基酸序列和核苷酸序列。

本发明还提供了优选的抗犬细小病毒抗体的轻链可变区氨基酸序列和核苷酸序列。

本发明所述的抗犬细小病毒鼠的基因工程抗体可以是，例如，单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的抗犬细小病毒抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，为构建高亲和力、低免疫原性的抗犬细小病毒的基因工程抗体提供支持。本发明还将犬细小病毒的单克隆抗体的可变区序列与鼠源恒定区进行组装，得到抗犬细小病毒的基因工程抗体，表现出良好的中和CPV病毒的活性，且具有抑制犬细小病毒对红细胞的凝集作用，可将其应用于犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的抗犬细小病毒抗体的重链和轻链的类型鉴定图；

图2为本发明实施例2提供的抗犬细小病毒抗体的重链和轻链的可变区PCR产物电泳图；

图3为本发明实施例2提供的抗犬细小病毒抗体的重链和轻链的质粒构建酶切鉴定图。

图4为本发明实施例3提供的抗犬细小病毒的基因工程抗体与犬细小病毒的阻抗作用图谱；

图5为本发明实施例3提供的抗犬细小病毒的基因工程抗体与犬细小病毒的中和作用图谱。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明中采用的犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、犬瘟病毒均来源于军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所。

实施例1小鼠CPV单克隆抗体的制备和筛选

(1)杂交瘤细胞系制备

动物的免疫选取5只6～8周龄雌性BALB/c小鼠，向小鼠注射浓缩纯化的犬细小病毒第三代病毒和等量弗氏完全佐剂乳化物，每只皮下多点注射200μl。两周后进行二免，向小鼠注射犬细小病毒浓缩纯化病毒和等量弗氏不完全佐剂乳化物，注射量和方法同首次免疫。二次免疫两周后按照第二次免疫进行第三次免疫，三免两周后选取经剪尾采血后，采用间接ELISA法测定血清效价高的小鼠进行腹腔注射。

细胞融合将8周龄左右的BALB/c小鼠断颈处死后，75％酒精浸泡10分钟。将处死的小鼠腹腔获得饲养细胞，加入到96孔细胞培养板100μl/孔，放入细胞培养箱中培养24小时。

筛选过的SP2/0细胞在融合前48小时传代扩大培养，使其处于生长对数期。选取效价高的BALB/c免疫小鼠制备单个脾细胞悬液。对悬液进行细胞计数。将免疫脾细胞与SP2/0以6︰1的比例混合于无菌离心管中，吸取经37℃预热的50％PEG4000进行细胞融合。离心后加入含有HAT12％FBS的RPMI-1640完全培养液，悬浮融合的细胞沉淀。取出提前铺有饲养细胞的96孔板，加入融合细胞悬液100μl/孔，并做好标记于细胞培养箱培养，每天观察细胞变化。

阳性融合孔的筛选细胞融合5天后，用含HAT，20％FBS的RPMI-1640培养液换掉一半原培养液。融合12天后将HAT换为HT培养液。融合17天后换为正常细胞培养液。在整个培养筛选的过程中，密切观察每孔细胞的生长变化，当有细胞融合簇出现且融合细胞达足够数量时，对融合孔采用间接ELISA法连续三次以上检测阳性的孔做好标记，及时克隆化。

对连续克隆化两次以上且一直是阳性结果的孔内细胞进行扩大培养和冻存。随时检测细胞分泌抗体的情况。对扩大培养的检测一直阳性结果的单克隆细胞株按照常规方法进行冻存，冻存细胞液按照RPMI-1640︰FBS︰DMSO＝7︰2︰1比例配制。标记好冻存细胞株代号，冻存日期。

(2)单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定

取杂交瘤细胞株培养上清，采用IsoStrip Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping试剂盒(Roche公司)测定抗体重链、轻链类型。经鉴定，鼠源CPV基因工程抗体亚型为IgGa2b/kappa。

(3)非竞争性ELISA测定CPV单克隆抗体的相对亲和力

包被抗原为纯化CPV-VLPs，按1、0.5、0.25、0.125μg/ml包被酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜；加入配制好的BSA，每孔150μl，37℃封闭2h；PBST洗涤后，按确定的单抗浓度，将单抗从80ng/ml开始进行倍比稀释，以抗体浓度的对数值为横坐标，以其对应的OD450值为纵坐标，在一个坐标系中做出4条S形曲线。找出S曲线的顶部，设定为ODmax。在曲线中分别找出4条曲线各自50％ODmax对应的抗体浓度。按4个浓度两两一组，根据公式(1-1)计算单抗的亲和常数。

Ka＝(n-1)/n([Ab']t-[Ab]t) 公式(1-1)

n为每组中两个包被抗原浓度的倍数；

[Ab']t和[Ab]t分别为每组中两个50％ODmax对应的抗体浓度。

利用非竞争间接ELISA测定CPV基因工程抗体的亲和力，根据测得的数据按照公式1-1求出CPV单克隆抗体的6个Ka平均值为1.02×10¹¹M^-1，表明其为高亲和力抗体，CPV单克隆抗体亲和力测定吸光度值见表1。

表1：CPV单克隆抗体亲和力测定吸光度值

(4)CPV单克隆抗体的特异性检测

分别用犬细小病毒VLps和犬腺病毒、犬冠状病毒、犬瘟病毒各1μg/ml包板。4℃过夜；2％BSA封闭液37℃封闭2h。洗涤后，分别加入分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞上清液和阳性对照Hytest CPV单克隆抗体以及阴性对照RPMI 1640100μl/孔，37℃温育1h。洗涤后，分别加入100μl HRP标记的相应二抗，37℃温育1小时。洗涤后，加入100μl TMB显色液，37℃温育5-10min，50μl 2M硫酸终止反应，OD450读数，结果见下表2。

表2：单克隆抗体特异性测定

	犬细小病毒VLPs	犬腺病毒	犬冠状病毒	犬瘟病毒
					CPV单克隆抗体	1.07	N/A	N/A	N/A
阳性对照	1.137	N/A	N/A	N/A
					阴性对照	N/A	N/A	N/A	N/A

由表2可见，上清液中的CPV单抗仅与CPV抗原结合，而与犬腺病毒，犬冠状病毒,犬瘟病毒均无交叉反应。

实施例2鼠源CPV基因工程抗体的制备

(1)CPV单克隆抗体可变区序列的获得

利用RNA提取试剂盒操作方法提取杂交瘤细胞株的总RNA，然后使用RACE 5’/3’试剂盒(Takara公司)，反转录得到cDNA，根据单克隆抗体的亚型设计引物见表3。

表3抗体扩增引物

序列号	引物名称	引物序列
			SEQ ID 5	重链外部引物(5’-3’)	AGG ACA GGG GTT GAT TGT TGA
SEQ ID 6	轻链外部引物(5’-3’)	CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC
			SEQ ID 7	重链内部引物(5’-3’)	CTC AAG TTT TTT GTC CAC CGT GGT GC
SEQ ID 8	轻链内部引物(5’-3’)	CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC AAT GGG

经RACE PCR扩增获得抗体重链和轻链的DNA片段，结果见图2，1、3泳道为DL5000maker，从上至下分子量依次为5000kDa、3000kDa、2000kDa、1500kDa、1000kDa、750kDa、500kDa、250kDa、100kDa；2泳道为重链PCR产物，4泳道为轻链PCR产物。经测序其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，连于克隆载体，挑取克隆进行测序，采用IMGT对测序结果在线分析得到抗体序列的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)鼠源CPV基因工程抗体的真核表达

将鼠源CPV基因工程抗体重链和轻链的可变区与鼠源抗体恒定区组装，将优化后的序列和真核表达载体pCDNA3.1(+)经HindⅢ和BamhⅠ双酶切后进行连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液扩增，采用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行双酶切鉴定结果如图3所示，泳道1和3为1KB maker，从上至下依次8000kDa、7000kDa、6000kDa、5000kDa、4000kDa、3000kDa、2000kDa、1500kDa、1000kDa、500kDa，泳道2为酶切后的pCDNA3.1(+)和重链产物，泳道4为酶切后的pCDNA3.1(+)和轻链产物。由此证明鼠源CP V基因工程抗体轻重链序列成功构建与pCNA3.1(+)表达载体中。采用瞬时转染的方法，按轻链：重链＝1：1混合后与PEI(1μg/μl)为1：3的比例转染至于六孔板的HEK-293细胞中进行表达，转染72小时后收集上清进行活性鉴定。

(3)采用间接ELISA方法进行表达活性鉴定

用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释CPV-VLPs，包被96孔酶标板(100μl/孔)4℃过夜，用PBST洗涤3次，之后用2％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，用PBST洗涤3次。将收集的上清液按照每孔100μl加入，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次。HRP标记的羊抗鼠IgG用抗体稀释液按比例稀释后每孔100μl，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次。每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育3-5min后加入50μl/孔终止液2mol/L的硫酸水溶液。最后用酶标仪测定450nm下的吸光值。结果显示，该上清液中CPV基因工程抗体的平均表达量为41.6ng/ml。CPV基因工程抗体在真核细胞中表达，且具有与CPV-VLPs结合的生物活性。

实施例3鼠源CPV基因工程抗体的活性研究

(1)血凝抑制法测定CPV基因工程抗体对犬细小病毒与血红细胞结合的阻抗作用

制备稀释CPV为八单位病毒(即为有三个血凝单位的CPV病毒溶液)96孔V型血凝板中加入15mM p H6.5的PBS，25μl/孔，在第一列中分别加入25μl CPV单克隆抗体，每个抗体做3个重复，做2倍梯度倍比稀释，稀释至最后一排弃去25μl液体，最后两行作为猪红细胞对照区，样品区(包括阳性对照组，实验组，空质粒对照组，空白对照组)每孔加入25μl八单位CPV病毒溶液，猪红细胞对照区补25μl PBS，37℃恒温箱1h。随后，每孔补入50μl 1％的猪红细胞液，轻轻上下混匀，4℃冰箱静置1h，竖立血凝板记录结果。

实验结果如图4所示，第1-2行为阳性对照组，第3-5行为实验组，第6-8行为空质粒对照组，第9-11行为空白对照组，第12-13行为猪红细胞对照组。

阳性对照组从右至左第8孔和第7孔，血红细胞沿着V型板孔壁流下，是由于阳性犬细小单克隆抗体与犬细小病毒结合，抑制犬细小病毒对猪血红细胞的凝集作用。

实验组从右至左第2孔和第3孔，血红细胞沿着V型板孔壁流下。是由于实验组待检样品中的鼠源犬细小单克隆抗体与犬细小病毒结合，抑制犬细小病毒对猪血红细胞的凝集作用。该上清液中抗犬细小病毒血凝抑制效价为1：2³。结果说明鼠源犬细小单克隆抗体可抑制犬细小病毒对猪红细胞的凝集作用。

空质粒对照组和空白对照组每孔血红细胞均未沿着V型板孔壁流下，表明二组样品中不含犬细小单克隆抗体，未能抑制犬细小病毒对猪血红细胞的凝集作用。

猪红细胞对照组每孔血红细胞均沿着V型板孔壁流下，表明本实验所用的猪血红细胞适用血凝抑制实验。

(2)CPV基因工程抗体中和抗体效价检验

将待检样品(实验组)和阳性对照组样品(分泌CPV抗体的杂交瘤细胞上清液)在96孔板中做2倍系列稀释，每个稀释度做3孔重复，稀释后每孔加入100个TCID50的病毒稀释液0.05ml，置37℃5％二氧化碳恒温培养箱中作用1小时。每孔再加入0.1mlF81细胞悬液(细胞浓度2×10⁵～3×10⁵个/ml)，轻轻混匀后放入37℃5％二氧化碳恒温培养箱中，5日后判定结果。

病毒对照组：即病毒回归试验，每次检测都要设立病毒对照。将本次检测稀释好的100个TCID₅₀的病毒再做10倍梯度稀释，分别将100、10、1、0.1、0.01个TCID₅₀的病毒每孔加入0.05ml。结果0.01、0.1个TCID₅₀应不引起病变，100、10个TCID₅₀必须引起细胞病变。

空白对照组：正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态，为避免培养板本身引起试验误差。取5日后的上清做血凝实验，竖立血凝板记录中和效价结果。

实验结果如图5所示，第1-3行为实验组，第4-6行为阳性对照组，第7-9行为病毒对照组，第10-11行为空白对照组。

实验组从右至左第2孔和第3孔，血红细胞沿着V型板孔壁流下，是由于实验组待检样品中的鼠源犬细小单克隆抗体与犬细小病毒结合，抑制犬细小病毒感染F81细胞，进而抑制犬细小病毒数量的增长，进而抑制了犬细小病毒对猪血红细胞的凝集作用。该CPV基因工程抗体的中和效价结果为1：2²-1:2³。结果说明该CPV基因工程抗体为中和抗体，可以与病毒有效结合阻断其对细胞的感染，具有一定治疗作用。

阳性对照组从右至左第5孔，血红细胞沿着V型板孔壁流下，是由于阳性犬细小单克隆抗体与犬细小病毒结合，抑制犬细小病毒感染F81细胞，进而抑制犬细小病毒数量的增长，进而抑制了犬细小病毒对猪血红细胞的凝集作用。

病毒对照组从右至左第4列和第5列，血红细胞沿着V型板孔壁流下，表明0.01、0.1个TCID₅₀犬细小病毒完全未引起F81细胞的病变；在第3列中1孔血红细胞沿着V型板孔壁流下，表明1个TCID₅₀犬细小病毒引起F81细胞的部分病变；第1列和第2列血红细胞全部凝集，表明100、10个TCID₅₀犬细小病毒完全引起F81细胞的病变。符合病毒回归实验结果要求。

空白对照组每孔血红细胞均沿着V型板孔壁流下，表明本实验所用的猪血红细胞适用血凝实验。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

序列表

<110> 长春西诺生物科技有限公司

<120> 一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区及基因工程抗体

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg His Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Thr Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Ser Phe Tyr Gly Ser Thr Pro Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 2

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Ala Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp

20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Gln Asn Met Leu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 3

<211> 369

<212> DNA

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 3

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaact agctatggtg tacactgggt tcgccactct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180

gcagctttca tatccagact gagcatcacc aaggacaatt ccaagaccca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaagc taatgacaca gccatatatt actgtgccag aaactccttc 300

tacgggagta cgccagggtc ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 4

caaattgttc tcacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga aaaagtcacc 60

atcagatgca tagccagcac tgatattgat gatgatatga actggtacca gcagaagcca 120

gggaaacctc ctaacctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 180

cgattctcca gcagtggcta tggtacagat tttgttttta caattcaaaa catgctctca 240

gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 5

aggacagggg ttgattgttg a 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 6

ctcattcctg ttgaagctct tgac 24

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 7

ctcaagtttt ttgtccaccg tggtgc 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)

<400> 8

ctcattcctg ttgaagctct tgacaatggg 30

Claims

1.一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种DNA分子，编码如权利要求1所述的抗犬细小病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，编码抗犬细小病毒抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码抗犬细小病毒的轻链可变区的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

4.一种抗犬细小病毒的基因工程抗体，包含如权利要求1所述的抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区。

5.根据权利要求4所述的抗犬细小病毒的基因工程抗体，其特征在于，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求4所述的抗犬细小病毒的基因工程抗体，其特征在于，其为包含所述重链、轻链可变区的单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，或者为包括包含所述重链、轻链可变区的抗体片段或含有抗原结合结构域的任何多肽。