CN113336843B

CN113336843B - 一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN113336843B
Application number: CN202010135940.7A
Authority: CN
Inventors: 苏霞; 杨兵; 周宏专; 徐福洲; 齐颀; 林路路; 张进
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2040-03-02
Also published as: CN113336843A

Abstract

本发明提供了用于抗犬细小病毒病的单链抗体及其制备方法，其单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所示单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示所示。本发明提供的用于抗犬细小病毒病的单链抗体可有效中和犬细小病毒，可用于预防犬细小病毒病药物的制备。

Description

一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体及其制备方法。

背景技术

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬科动物最常见的、危害最严重的病毒病性感染源之一，是食肉动物细小病毒的典型代表，患病犬难以治愈。CPV是主要引起犬科动物感染严重肠炎和心肌炎综合征的烈性传染病，尤其是2-4月龄的幼犬危害最大，发病率和致死率达到70％，对犬类的健康造成了极大的危害，给养犬业带来了重大的损失。临床上对患病犬进行治疗的总原则为消炎、补液、止血、止呕、抗病毒，治疗方法是给予发病早期犬注射抗CPV血清或抗CPV单克隆抗体，同时辅助输液、输血、静脉注射犬免疫球蛋白或血白蛋白等其它疗法以提高疗效。

到目前为止，抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用。截至2015年底，欧美市场已有超过50种治疗性抗体上市销售，同时还有300多种抗体药物进入了临床试验阶段。从研究趋势看，抗体药物的成功率大于20％，远远超过传统化学小分子药物的11％，因此抗体药物必将成为未来制药行业发展的主要方向。由于多克隆抗体(抗血清)和单克隆抗体因其自身不足越来越不适合临床实践了。因此，应用现代子生物学技术和蛋白质工程技术，建立一些治疗性的基因工程抗体将成为防控疫病的大势所趋。

单链抗体(single chain variable fragment,scFv)是基因工程抗体的一种，由于具备亲本抗体可与抗原特异性结合的特征，同时具有其分子量小、组织穿透性强、免疫源性低、血液清除快、可经济方便地生产、易于基因工程改造(或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合)等特点，显示出比完整长度的单克隆抗体更大的优势，因此将在畜禽疾病的临床治疗中拥有很好的应用前景。在国内外已报道的几十种抗体片段分子中，单链抗体占35％，是目前研究较多的重组抗体之一。迄今，国内外已有十几种用于防治动物疫病的单链抗体研制成功。但是选择何种犬细小病毒的抗原进行制备单链抗体的制备，如何进一步用于治疗犬细小病毒病的单链抗体还未发现。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种编码如上所述用于抗犬细小病毒病的单链抗体的DNA分子，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种编码用于抗犬细小病毒病的单链抗体的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

一种表达用于抗犬细小病毒病的单链抗体的载体，其特征在于，其含有如上所述编码如权利要求2所述的用于抗犬细小病毒病的单链抗体的DNA分子序列。

一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、构建含有抗犬细小病毒病的单链抗体的全场基因序列的原核表达载体pET-32a(+)-scFv质粒；

(2)、原核表达载体pET-32a(+)-scFv质粒转入表达菌；

(3)、将表达菌加入含IPTG的LB液体培养基进行诱导表达蛋白；

(4)、将步骤(3)的菌液在37℃，振荡培养过夜，

(5)、将表达菌大量诱导表达后，收集菌体进行蛋白纯化。

优选地，在步骤(1)中含有抗犬细小病毒病的单链抗体的全场基因序列含有SEQID NO.10所示序列。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体及其制备方法，其单链抗体可有效中和犬细小病毒，可用于预防犬细小病毒病药物的制备。

附图说明

图1为重链和轻链可变区基因的PCR扩增结果；

图2为单链抗体基因片段的融合；

图3为重组质粒p ET 32a-scFv的酶切鉴定；

图4为单链抗体的诱导表达；

图5为IPTG最佳诱导浓度的鉴定；

图6为不同温度下重组蛋白的诱导表达；

图7为纯化后scFv蛋白的Western-blotting分析；

图8为未接病毒的对照组的照片；

图9给毒但未加单链抗体的细胞产生明显细胞病变的照片；

图10为1：10-1：160稀释的单链抗体可以保护90％的F81细胞不产生CPE的照片；

图11为1：320稀释的单链抗体可以保护50％的F81细胞不产生CPE的照片。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例中所用的毒株、菌株及质粒可来自：犬细小病毒株由北京市农林科学院畜牧兽医研究所分离和保存。DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞、原核表达载体pET-32a克隆载体pEASY-T5 Zero载体购自北京全式金生物技术有限公司。

本实施例所用的主要试剂可来自：RNeasy Mini Kit、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；IPTG储存液、氨苄青霉素储存液、T1感受态细胞、pEasy-T5Zero均购自北京全式金生物技术有限公司；ES Taq Master Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司；Difco LBBroth、Difco LB Agar、skim Milk购自BD公司；50×TAE电泳缓冲液、Gold ViewⅠ型核酸染色剂购自Solarbio公司；Anit-His单克隆抗体；PDVF膜；HRP底物显示试剂；DMEM培养基、胎牛血清；细胞培养瓶、96孔细胞培养板。

LB液体培养基：称取10g Difco LB Broth粉末溶于400m L去离子水中，于121℃高压20min灭菌，待培养基冷却后，按1：1000加入氨苄青霉素储存液，4℃贮存备用。LB固体培养基：称取16g Difco LB Agar粉末溶于400mL去离子水中，121℃高压20min灭菌，待培养基冷却后，按1：1000加入氨苄青霉素储存液，浇制平板，待其冷却后置于4℃贮存备用。

(1)单克隆抗体可变区的基因克隆

1.1总RNA的提取

操作方法按照RNeasy Mini Kit的说明书进行，取200μL CPV病毒细胞液，离心并弃去上清后加入350μL的buffer RLT重悬细胞，加入等体积的70％乙醇，上下颠倒混匀，并取700μL混合液到RNeasy Mini Spin column，以12000rpm的转速离心15s后弃去流传液，加入700μL buffer RW1，离心后弃去废液，加入500μL buffer RPE后离心并弃掉流出液，空离1min去除残留的液体，将柱子转移到新的离心管中，并在室温中静置2min晾干，加入45μL无RNase超纯水，离心后再次吸出离心下的液体，将液体转移至柱子中，再离心后收集RNA溶液。

1.2cDNA第一链的合成

反转录程序：上述制备的RNA溶液8μL，10nM DNTP1μL，Oligo(dT)1μL，65℃反应5min后，立即冰上冷却1min。上述变性后反应液加入5×buffer4μL，0.1M DTT 2μL，25mMMgCl₂ 2μL，Rnase Inhibitor 1μL，缓慢混匀，42℃孵育2min，向反应液加入1μlgoldscript RT，42℃水浴50min后70℃加热15min立即冰上冷却，加入RNase H 1μl，37℃孵育20min。cDNA产物于-20℃保存。

1.3扩增引物的设计经大量实验验证，最后选择的VP2基因对应的单链抗体，作为用于抗犬细小病毒病的单链抗体，因VP2基因编码CPV的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体，并且VP2蛋白还具有血凝活性。因此，VP2是CPV生物学特性的主要决定者，也是CPV变异的主要区域。单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。经试验验证能获得上述蛋白所需要的基因为：轻链(VL)可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链(VH)可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。要获得上述基因序列设计扩增鼠源抗体的重链可变区及轻链可变区的引物如下，引物均由北京生工公司合成。

扩增VH片段的引物如下：

VHF(SEQ ID NO.5):5’-TGAGGAGACGGTGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3’，

VHR(SEQ ID NO.6):5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’；

扩增VL片段的引物序列如下：

VLF(SEQ ID NO.7)：5’-GGATRTTKTGATGACCCARASTCCACT-3’，

VLR(SEQ ID NO.8)：5’-CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3’。

1.4VH及VL基因的PCR扩增

以反转录合成的cDNA为模板，用VLF、VLR为上下游引物扩增VL基因。以VHF、VHR为上下游引物扩增VH基因。PCR扩增体系：模板为上述制备的cDNA 2.0μl，HiFi PCR SuperMix12.5μl，上、下游引物各1μl(10μmol/L)，ddH₂O8.5μl，最终体系为25μl。PCR扩增条件：95℃预变性3min；94℃变性15s，57℃退火15s，72℃30s，进行30个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存。用1％琼脂糖凝胶对扩增的产物进行电泳，以120V电压进行20-30min，紫外检测产物分析结果并进行切胶回收目的基因。电泳结果如图1所示，图中M：DNA分子质量标准；1：重链可变区(VH)PCR扩增产物；2：轻链可变区(VL)PCR扩增产物经过基因测序分析，获得VL基因片段长度为329bp，序列如SEQ ID NO.3所示，VH基因片段长度为371bp，序列如SEQ ID NO.4所示。1.5VH及VL目的片段的连接与转化

将目的基因连接到pEasy-T5 Zero克隆载体中，体系为PCR扩增产物4μl，pEasy-T5Zero克隆载体1μl。混合好的体系于室温作用5min,获得连接产物，将T1感受态细胞置于冰上融化后，将连接产物全部加入感受态细胞，手指轻弹混匀离心管混匀液体，冰浴30min后于42℃热激30s，立即在冰上放置2min；加入800μl LB液体培养基并轻轻吹打混匀，在37℃，200rpm振荡培养1h；取菌液与1500×g离心1min，弃掉700μl的上清，用剩余的上清将菌液沉淀重悬，取100μl重悬的菌液涂布于Amp/LB固体培养基，37℃倒置培养过夜。

1.6重组克隆载体的鉴定

挑选克隆平板上的单菌落，以菌落为PCR扩增的模板，使用1.3中合成的特异性引物进行PCR扩增鉴定，反应体系及程序同1.4。

1.7重组质粒的提取

将PCR鉴定为阳性的菌落接种于5ml Amp/LB液体培养基中，37℃200rpm培养过夜，按QIAprep Spin Miniprep Kit说明书操作提取质粒：菌液过夜培养后，8000rpm 3min后弃掉上清，用250μl Buffer P1将菌细胞重悬，再加入250μl Buffer P2颠倒管4-6次直到清澈，加入350μl Buffer N3颠倒管4-6次使混合液清澈，13000rpm离心10min，把上清转移到柱子中，以13000rpm离心1min，加入500μl Buffer PB离心1min，弃去流传液后再加入750μlBuffer PE离心1min，空离1min去除残留的液体，将柱子转移到新的离心管中，加入50μlBuffer EB离心1min收集液体，储存于-80℃，将提取的重组质粒送至北京擎科新业生物有限公司测序鉴定，将阳性质粒命名为CPV-VH、CPV-VL。

(2)单链抗体基因的合成

在测序正确序列(序列指的是前面提到的VH和VL序列)的VH和VL基因的两端分别引入Eco RⅠ与HindⅢ酶切位点，并在重链可变区下游及轻链可变区上游引入Linker序列，Linker序列如下(SEQ ID NO.9)：GGTG GAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。

将设计的好SCFV片段即包括有VH和VL序列和Linker序列的片段，序列为(SEQ IDNO.10):ATGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGAAATACATTCACTGAAAATATCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTTTTAATCCTAAGAATGGTGGTACTGAGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGTACAGTCTTCATGGATCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGGGCAACTCGGGCTTCGTTGGACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACCCAGAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGTCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAGTCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTCGGAATTTATTTCTGTTCTCAAACTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTGA，送由上海生工生物工程有限公司合成，转入pET-32a表达载体，将合成的质粒活化后，提取基因组DNA并通过PCR验证片段大小约为759bp，如图2所示。

对重组表达载体pET-32a-scFv进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，将VH-l inker-VL、克隆载体和表达载体pET-32a进行，酶切体系采用20μl的体系，具体为10×K Buffer 2μl，EcoRⅠ1μl，HindⅢ1μl，质粒6μl，ddH₂O 10μl；按上述体系，放置37℃作用3h后，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外检测并分析结果。

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外检测并切胶回收目的片段。得到5900bp和771bp条带(如图3所示)，表明目的基因插入成功。

将VH序列、Linker序列和VL序列联合在一起构成VH-L-VL序列及scFv序列，送由上海生工生物有限公司构建含有scFv全长基因的原核表达载体pET-32a(+)-scFv质粒。

(3)单链抗体蛋白的诱导表达

将公司合成回来的甘油菌菌种涂布含有AMP的LB固体平板，挑取PCR鉴定为阳性的表达菌接种于5mL含AMP的LB液体培养基，37℃，180rpm振荡培养过夜，以1:100接种于20mL含AMP的LB液体培养基，当OD600达到0.5-0.6时加入1mmol/LIPTG进行诱导表达蛋白，同时做空载体诱导及未诱导的pET32a-HL，作对照。

(4)SDS-PAGE鉴定重组蛋白

取1ml诱导表达蛋白的菌液12000rpm离心2min，收集菌体沉淀，用100ulPBS重悬，加入5×蛋白上样缓冲液煮沸10min，点样前12000rpm离心1min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。其结果如图4所示，图中M:蛋白质分子质量标准；1：未经诱导的pET32a空载体对照；2：诱导5h后的pET-32a空载体；3：未经诱导的pET-32a(+)-scFv；4-8：分别诱导2-8h的表达产物。

结果显示蛋白表达并且蛋白大小为46kD左右，与预期的ScFv蛋白分子大小一致。

(5)最佳诱导剂浓度的确定

挑取鉴定为阳性的表达菌接种于5mL含AMP抗生素的LB液体培养基，37℃，180rpm振荡培养过夜，以1:100接种于20mL含AMP抗生素的LB液体培养基，当OD600达到0.5-0.6时，加入不同浓度的IPTG进行诱导，诱导剂IPTG终浓度分别为0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L的LB液体培养基诱导表达蛋白，并设置未加诱导剂IPTG的表达菌为对照；

200rpm，37℃，诱导6h。收集菌体沉淀，用100μlPBS重悬，加入5×蛋白上样缓冲液煮沸10min，点样前12000rpm离心1min。进行

12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图5所示，图中M:蛋白质分子质量标准；1-4：分别加0、0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L的IPTG。结果表明诱导剂IPTG的浓度在单链抗体重组蛋白的表达无明显影响，可选择在

0.5mmol/L～1.5mmol/L范围内的浓度。

(6)最佳诱导温度及可溶性的确定

挑取鉴定为阳性的表达菌接种于5mL含AMP的LB液体培养基，37℃，180rpm振荡培养过夜，以1:100接种于20mL含AMP的LB液体培养基，当OD600达到0.5-0.6时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，200rpm，在28℃、37℃分别诱导6h。取7ml诱导表达蛋白的菌液12000rpm离心2min，收集菌体沉淀，用600μl PBS重悬，选择合适的超声探头，冰浴超声破碎工作时间5min，4℃恢复温度5min，共四次，超声3s，间隙2s，12000rpm，4℃离心5min，分别收集上清和沉淀，在不同温度表达蛋白的菌液超声裂解后离心的上清和沉淀重悬液中加入5×蛋白上样缓冲液煮沸10min，点样前12000rpm离心1min。进行12％SDS-PAGE凝胶电泳并观察结果。结果如图6所示，图中M:蛋白质分子质量标准；1：诱导的pET32a空载体对照；2:37℃表达的全菌蛋白；3:37℃表达的菌液超裂沉淀；4:37℃表达的菌液超裂上清；5：28℃表达的菌液超裂沉淀；6：28℃表达的菌液超裂上清。结果显示37℃诱导表达是蛋白表达量最高，重组蛋白以包涵体的形式表达。

(7)单链抗体蛋白的纯化及Western blot鉴定

使用能结合融合有His标签的蛋白镍柱纯化单链抗体，将表达菌大量诱导表达后，收集菌体进行蛋白纯化，纯化后的蛋白用HRP标记的抗His单克隆抗体对诱导表达的表达菌进行Western blot检测：具体是样品处理及SDS-PAGE凝胶电泳步骤同上(6)，电泳结束后进行转膜，剪一块大小适中的PVDF膜，于甲醇中活化1min后用电转仪液浸泡，将滤纸、PVDF膜放入电转移液中平衡直至使用。将胶浸入电转移液中。在电转印夹上依次放上海绵、一层滤纸、胶、膜、一层滤纸、海绵，夹好电转印夹，100V转2h，将膜用TBST洗涤3次，每次10min。加入5％脱脂乳的封闭液于常温摇床封闭2h。弃掉封闭液并用TBST洗涤3次，用anti-His单克隆抗体作为一抗以1:3000用一抗稀释液稀释，室温摇床孵育过夜。洗涤3次，将HRP标记的羊抗鼠单抗作为二抗用封闭液1:6000稀释，室温孵育60min，洗涤3次，用ECL化学显色试剂盒检测观察。结果如图7所示，图中M:蛋白质分子质量标准；1：纯化的重组蛋白；结果表明46kD左右有条带出现，其大小与预期的ScFv蛋白分子大小一致。

实施例2单链抗体抑制CPV病毒的中和实验

将实施例1中制备的纯化后的单链抗体的浓度调为1mg/ml，然后将其在96孔细胞板中进行倍比稀释，使其最终体积为50μL，在上述各孔中加入50μL稀释为200TCID₅₀/0.1ml的CPV病毒工作液混合，同时设置病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照药做200个TCID₅₀、20个TCID₅₀、2个TCID₅₀、0.2个TCID₅₀，四个不同浓度。37℃孵育1h后加入100μL细胞(F81猫肾细胞)悬液，继续置37℃，5％CO₂培养箱培养。多长时间后观察结果，未接病毒的对照组如图8所示，表明细胞生长良好；给毒但未加单链抗体的细胞产生明显细胞病变(如图9所示)，1：10-1：160稀释的单链抗体可以保护90％的F81细胞不产生CPE(如图10所示)，1：320稀释抗体可以保护50％的F81细胞不产生CPE(如图11所示)，表明抗体的中和效价为1:320(3.1μg/ml)。说明本发明制备的单抗可有效预防CPV病毒，用于对CPV病毒的治疗。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体及其制备方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 轻链(VL)

<400> 1

Pro Arg Val His Ser Pro Cys Leu Ser Val Leu Glu Ile Lys Pro Pro

1 5 10 15

Ser Leu Ala Asp Leu Val Arg Val Leu Tyr Thr Val Met Glu Thr Pro

20 25 30

Ile Tyr Ile Gly Thr Cys Arg Ser Gln Ala Ser Leu Gln Ser Ser Ser

35 40 45

Thr Lys Phe Pro Val Asp Phe Leu Gly Ser Gln Thr Gly Ser Val Ala

50 55 60

Val Asp Gln Gly Gln Ile Ser His Ser Arg Ser Ala Glu Trp Arg Leu

65 70 75 80

Arg Ile Ser Glu Phe Ile Ser Val Leu Lys Leu His Met Phe Arg Thr

85 90 95

Arg Ser Glu Gly Ala Pro Ser Trp Lys Ser Asn

100 105

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 重链(VH)

<400> 2

Ser Cys Arg Ser Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Gly Leu Gln Arg Tyr

1 5 10 15

Pro Ala Arg Leu Leu Glu Ile His Ser Leu Lys Ile Ser Cys Thr Gly

20 25 30

Ser Arg Ala Met Glu Arg Ala Leu Ser Gly Leu Glu Val Leu Ile Leu

35 40 45

Arg Met Val Val Leu Ser Thr Thr Arg Ser Ser Gly Ala Arg Pro His

50 55 60

Leu Thr Ser Pro Pro Val Gln Ser Ser Trp Ile Ser Ala Ala His Leu

65 70 75 80

Arg Ile Leu Gln Ser Ile Thr Val Gln Asp Gly Gln Leu Gly Leu Arg

85 90 95

Trp Thr Met Leu Trp Thr Thr Gly Ala Lys Gly Pro Arg Ser Pro Ser

100 105 110

Pro Ser Pro His

115

<210> 3

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacccagag tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca 60

gatctagtca gagtcttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga 120

agtcaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc cagtcgattt tctggggtcc 180

cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg 240

aggctgagga tctcggaatt tatttctgtt ctcaaactac acatgttccg tacacgttcg 300

gagggggcac caagctggaa atcaaacgg 329

<210> 4

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaagctgca ggagtctgga cctgaactgg taaagcctgg ggcttcagtg aagatatcct 60

gcaagacttc tggaaataca ttcactgaaa atatcatgca ctgggtgaag cagagccatg 120

gaaagagcct tgagtggatt ggaggtttta atcctaagaa tggtggtact gagtacaacc 180

agaagttcag gggcaaggcc acattgactg tagacaagtc ctccagtaca gtcttcatgg 240

atctccgcag cctgacatct gaggattctg cagtctatta ctgtgcaaga cgggcaactc 300

gggcttcgtt ggactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc accgtcaccg 360

tctcctcatg a 371

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgaggagacg gtgacggtga ccgtggtccc ttggccccag 40

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggatrttktg atgacccara stccact 27

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgtttgatt tccagcttgg tgcc 24

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45

<210> 10

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggtgaagc tgcaggagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaaga cttctggaaa tacattcact gaaaatatca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaggt tttaatccta agaatggtgg tactgagtac 180

aaccagaagt tcaggggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag tacagtcttc 240

atggatctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagacgggca 300

actcgggctt cgttggacta tgctatggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggat 420

attgtgatga cccagagtcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 480

tcttgcagat ctagtcagag tcttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 540

ctgcagaagt caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccag tcgattttct 600

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 660

agagtggagg ctgaggatct cggaatttat ttctgttctc aaactacaca tgttccgtac 720

acgttcggag ggggcaccaa gctggaaatc aaacggtga 759

Claims

1.一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述用于抗犬细小病毒病的单链抗体的DNA分子，其特征在于，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种编码用于抗犬细小病毒病的单链抗体的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.一种表达用于抗犬细小病毒病的单链抗体的载体，其特征在于，其含有如上所述编码如权利要求2所述的用于抗犬细小病毒病的单链抗体的DNA分子序列。

5.一种用于抗犬细小病毒病的单链抗体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)、构建含有抗犬细小病毒病的单链抗体的全长基因序列的原核表达载体pET-32a(+)-scFv质粒；

(2)、原核表达载体pET-32a(+)-scFv质粒转入表达菌；

(3)、将表达菌加入含IPTG的LB液体培养基进行诱导表达蛋白；

(4)、将步骤(3)的菌液在37℃，振荡培养过夜，

(5)、将表达菌大量诱导表达后，收集菌体进行蛋白纯化；

在步骤(1)中含有抗犬细小病毒病的单链抗体的全长基因序列含有如SEQ ID NO.10所示序列。