CN116430051B - 一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用，所述试剂盒中包含荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象，所制备的荧光抗体具有特异性，该荧光抗体的最适工作浓度确定为1:480。相比于对照荧光抗体而言，本发明的荧光抗体具备优越的检测特异性和灵敏性，在CPV病毒浓度为0.390625‑50μg/mL之间存在线性相关，可实现高灵敏地检测CPV病毒，更适合实际临床检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及犬细小病毒检测技术领域，更具体地，涉及一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术
犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）是细小病毒科细小病毒属成员，单链小DNA 病毒，在 1977 年首先在美国被发现的，1978 年首次从患有肠炎的病犬体内分离获得该病毒，随后在世界各地的犬科动物中相继被发现。病犬以剧烈呕吐、腹泻、白细胞显著减少和病死率较高为主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎。本病发病率和死亡率为均很高，对养犬业、经济动物养殖业危害很大，也威胁到了野生动物的生存。
犬细小病毒病的诊断包括临床诊断和实验室诊断，临床诊断首先根据发病迅速，传染性强，往往呈局部暴发性等流行病学调查结果，再结合临床表现症状如呕吐、脱水、腹泻等肠炎综合征，并且排出的稀粪恶臭带血，最后结合病理剖检结果可怀疑是 CPV 感染。但本病与犬冠状病毒病、轮状病毒病、细菌性肠炎等病临床症状相近似，只有实验室做病原诊断才能确诊。
近年来国内外有关犬细小病毒病实验室诊断技术包括常用的 CPV 抗原的检测方法有动物感染试验、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验、病毒分离（VI）、电镜（EM）与免疫电镜（ME）、免疫色谱法（IC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、免疫荧光试验（FA）、核酸探针检测等。但是这些方法存在特异性差、灵敏度低、耗时长、操作繁琐等不足之处，不便于实现现场检疫。
因此，开发一种新的检测方法，快速、敏感、特异、准确地检测犬细小病毒对该疾病预防和治疗具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用。本研究以纯化的犬细小病毒单克隆抗体制备荧光抗体，对该荧光抗体的检测效果进行鉴定。并用该荧光抗体建立了 CPV 抗原的直接免疫荧光检测方法。
具体而言，本发明首先是提供了一种犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其序列分别对应于SEQ ID NO.3-5所示，所述犬细小病毒单克隆抗体轻链可变区包括CDR4、CDR5和CDR6，其序列分别对应于SEQ ID NO.6-8；
进一步地，本发明还提供了一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，采用荧光基团标记所述犬细小病毒单克隆抗体，其中所述犬细小病毒单克隆抗体的轻链CDR4-6分别如SEQ ID NO.6-8所示，所述单克隆抗体的重链CDR1-3分别如SEQ DI NO.3-5所示。
优选地，本发明提供的所述荧光标记为FITC、FAM、Rhodamine B、TAMRA、Cy3、Cy5等荧光基团标记。
优选地，本发明提供的所述荧光标记为FITC。
优选地，本发明提供的所述荧光抗体的最适工作浓度确定为 1:480。
进一步地，本发明还提供了一种非诊断目的的犬细小病毒抗原的直接免疫荧光检测方法，该方法包括采用所述试剂盒中荧光标记的单克隆抗体接触待检样本，孵育结束后，在荧光显微镜下观察结果或酶标仪读取荧光值。
进一步地，本发明还提供了上述荧光标记的单克隆抗体在制备检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
本发明的优点如下：本发明提供的犬细小病毒单克隆抗体是针对 CPV 的特异性抗体，其与 CDV、RV、CAV 和 CCV 均不发生交叉反应。经鉴定，所述单克隆抗体的轻链CDR4-6分别如SEQ ID NO.6-8所示和重链CDR1-3分别如SEQ ID NO.3-5所示。本发明提供的基于犬细小病毒单克隆抗体的荧光抗体，本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象，所制备的荧光抗体具有特异性，该荧光抗体的最适工作浓度确定为 1:480。相比于对照荧光抗体而言，本发明的荧光抗体具备优越的检测特异性和灵敏性，在0.390625-50μg/mL之间存在线性相关，可实现高灵敏地检测CPV病毒，更适合实际临床检测分析。
附图说明
图1为单克隆抗体MAb16对CPV病毒检测灵敏度分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1犬细胞病毒单克隆抗体
1.1杂交瘤细胞系制备
动物的免疫选取6只6周龄雌性BALB/c小鼠，用纯化的犬细小病毒对其进行免疫注射。首免用 250μL 的犬细小病毒与等量的弗氏完全佐剂混合做成乳化抗原后，对小鼠进行皮下免疫注射，500μL/只；于首免后第 14d 进行第二次免疫注射，换成弗氏不完全佐剂与等量病毒混合，充分乳化后，皮下免疫注射小鼠，剂量同首免；二免后第 14d 进行第三次免疫注射，方法与剂量同二免。三免后第 10d 对小鼠断尾采血，用间接 ELISA 方法监测血清抗体效价。当抗体水平达到要求后，于三免第 14d 后，选择效价最高的免疫小鼠，用纯的抗原液尾静脉加强免疫，3d 后无菌采取小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞融合。
在融合前一周复苏 SP2/0 骨髓瘤细胞并扩大培养。融合时将正处于对数分裂期SP2/0 骨髓瘤细胞回收，1000r/min 离心 5min，用 1640不完全培养液悬浮，重复洗 2 次，最后用 10mL 1640不完全培养液重新悬浮细胞并计数。
取加强免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中 5min，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有 10mL 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有 10mL 不完全培养基的平皿中，用 5mL 的注射器吸取培养液反复吹打脾，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基，制成脾细胞悬液。用移液器将悬液移入小试管中。直立小试管 3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。用 1640 不完全培养液洗涤细胞两次（1000rpm，5min），10mL 1640 不完全培养液重新悬浮细胞并计数。
将已制备好的 SP2/0 骨髓瘤细胞及脾细胞混合于灭菌的 50mL 圆筒离心管内，两种细胞之比为 1:10，1200rpm 离心 8min，去上清，轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于 40℃水浴中，使其达融合温度。将离心管倾斜，1min 内加入 40℃预热的 50% PEG（分子量 4000)边加边轻微摇动。40℃水浴作用 1min 后迅速 700rpm 离心 3min。加 37℃预温的不完全培养液以终止 PEG 作用，每隔 1min分别加入 1ml、1ml、1ml、1ml、10ml。1000rpm离心 5min，同样的方法再洗涤一次，以彻底去除 PEG。弃上清，沉淀细胞用 HAT 培养液重悬。将上述细胞加入前日铺有饲养细胞的 96 孔板中，100μL/孔，将培养板放置 37℃ 5%的CO2培养箱中培养。 融合后第 3、6、9 日换入含 HAT 的完全 1640 培养液。换液方法为每孔吸去200μL 培养液上清，然后加入 200μL 新鲜的 HAT 培养液，注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出。于第 10、12 日换液时改用含有 HT 的完全 1640 培养液。仔细观察细胞的生长情况，凡有污染的孔立即滴加 1%的 NaOH，以免污染扩散。温度及 CO2浓度的改变会影响到融合细胞的生长，所以细胞融合后的 1~2d内不宜把培养板从培养箱内拿出长时间的观察。每次换液前首次换液前用倒置显微镜观察细胞的生长、死亡状况。在融合后的第 3d，可见瘤细胞基本破碎消失，在巨噬细胞周围聚集着大量的细胞碎片，少数细胞浑圆透亮，呈葡萄状，形成集落，形似骨髓瘤细胞。集落间细胞数目不等，而且细胞数增长很快。一般 1 个孔里有一个细胞集落，但也有的孔里有两个以上的细胞集落。融合细胞集落生长速度很快，生长快的，6~7d 就能布满培养孔的面积 1/5~1/2，此时可取上清进行抗体检测。一般在 10d 左右检测，两周以上未长出融合细胞的细胞孔应放弃。
1.2杂交瘤细胞系筛选
用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞（长至孔底的1/2以上）分泌抗体的情况，以筛选出阳性细胞株。具体方法为取杂交瘤细胞培养上清200μL加入前日包被好的酶标板孔中，同时设立阳性、阴性对照和空白对照。判定标准为OD490值阳性孔与对照孔比值≥2.1判定为阳性。阴性孔3d后再检测一次，如仍为阴性则弃之。
1.3单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定
取杂交瘤细胞株培养上清，采用IsoStrip Mouse MonoclonalAntibodyIsotyping试剂盒(Roche公司)测定抗体重链、轻链类型。
经鉴定，本发明所述犬细小病毒单克隆抗体MAb16的重链可变区序列如SEQ IDNO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其序列分别对应于SEQ ID NO.3-5所示，所述犬细小病毒单克隆抗体轻链可变区包括CDR4、CDR5和CDR6，其序列分别对应于SEQ ID NO.6-8。
对照抗体：以发明人在先CN114716540 A专利中公开的MAb8 单克隆抗体为对照，具体而言，对照抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区序列如SEQ IDNO.10所示。
1.4单克隆抗体的特性鉴定
单抗效价的测定
用间接 ELISA 方法测定单克隆抗体的效价。提纯的犬细小病毒作为包被抗原，将冻存的腹水溶解后以 1:10 开始倍比稀释，同时以同等稀释度的注射 SP2/0 细胞的小鼠腹水作为阴性对照。以平行稀释的单抗 OD490值/对照OD490≥2.1 的最高稀释倍数为单抗的效价。
结果显示：三免后小鼠的血清效价均在105以上，达到融合要求。选取血清效价最高的小鼠加强免疫并进行融合。杂交瘤细胞长至一个视野（100×）的 1/2以上时开始检测ELISA 效价，挑选效价高的细胞进行亚克隆，三次亚克隆后获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 MAb16。采用间接ELISA 测定了单抗的细胞上清、腹水效价，结果显示MAb16杂交瘤细胞株的细胞上清抗体效价>106，腹水效价>108。
与其他病毒的交叉反应
用间接 ELISA 方法测定单克隆抗体与犬瘟热病毒（CDV）、狂犬病毒（RV）、犬腺病毒（CAV）和犬冠状病毒（CCV）的交叉反应。用 CDV、RV、CAV 和CCV 作为包被抗原，分别与所述单抗和对照单抗作用，设立 CPV 阳性对照和阴性腹水对照。结果表明：本发明制备的单克隆抗体MAb16是针对 CPV 的特异性抗体，与 CDV、RV、CAV 和 CCV 均不发生交叉反应，结果见表 1，证明此所述单抗对犬细小病毒具有良好的特异性。
实施例2单克隆抗体荧光学检测方法
2.1荧光抗体的制备
取一定量的纯单抗溶液，在0.5mol/L pH9.0~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，按荧光素与蛋白质质量比1︰20称取适量FITC，加入二甲亚砜（DMSO），使终浓度为1mg FITC/1mLDMSO；将单抗溶液置于电磁搅拌器上，轻轻搅拌，以不起沫为准。按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入单抗溶液中，磁力搅拌器4℃避光搅拌12h；加完后，随时用试纸测定搅拌液的pH值，若低于9.0，则应以碳酸钠溶液调整。置4℃搅拌12h即可。用Sephadex G25柱过滤标记的荧光抗体，以去除游离荧光素。
2.2荧光抗体的鉴定
F/P比值的测定
用紫外分光光度计测定标记抗体在 280nm、495nm 波长下的 OD 值，根据公式 F/P＝（2.87×OD495）/（OD280-0.35×OD495）计算出荧光色素与球蛋白的结合率，评定标记抗体的质量。
结果显示：用紫外分光光度计测定荧光抗体在280nm波长下的光密度值为0.923，在495nm波长下的光密度值为0.503。根据公式计算出荧光抗体的F/P值为1.932。表明本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象。
2.3抗体工作浓度的确定
将荧光抗体自1:30~1:960倍比稀释，分别用各稀释度对CPV感染细胞和阴性对照F81细胞做染色。以能清晰显示特异荧光（+++）、且无非特异染色的最高稀释度为该荧光抗体的工作浓度。实际应用时，可取低1个或2个稀释度，如效价为1:64，实际应用时可取1:32或1:16。
结果显示：取荧光抗体用 PBS 做一系列稀释，分别对 CPV 感染细胞和 F81 细胞做对照染色。当对荧光抗体做 1:60 稀释时，阴性对照细胞出现少量的非特异性荧光；为保证荧光抗体的特异性荧光亮度，并且消除与正常细胞的非特异性反应，将荧光抗体的最是工作浓度确定为 1:480。具体检测结果见表 2.1。并且，从表2中的数据可以得出，相比于对照抗体MAb8而言，本发明制备的MAb16抗体具备更好的稀释性，在工作浓度确定为 1:480下，依旧能具有较优的荧光强度，而对照抗体MAb8的荧光强度相对较弱。
2.4荧光抗体的初步应用
在96孔微量培养板中加入依次加入浓度为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL、0.78125μg/mL、0.390625μg/mL的CPV ，每个浓度的病毒样品分别做8个孔，其中4个重复孔用于直接免疫荧光检测，4个孔按照传统的观察细胞病变作对比实验。并设一排培养液作细胞对照用，同步接种F81细胞。放入37℃细胞培养箱内培养48h，甩去板内培养液，PBST洗液洗涤3次，200μL/孔，每次3min。每孔加入100μL -20℃预冷80%的丙酮液，-20℃冰箱内过夜固定过夜。弃丙酮，同上洗涤。加入抗犬细小病毒荧光抗体（以PBS稀释至工作浓度，并加入0.01%的伊文思蓝），100μL/孔，37℃孵育60min，PBST洗涤3次。最后用三蒸水洗1min，于酶标仪下记录，激发波长460nm，发射波长520nm。
结果显示：经荧光检测分析可知，如图1所示，本发明提供荧光标记的单克隆抗体能很好地实现对犬细小病毒蛋白的检测，且其在0.390625-50μg/mL之间存在线性相关，可实现高灵敏地检测CPV病毒。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括包含荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其序列分别对应于SEQ ID NO.3-5所示。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒单克隆抗体轻链可变区包括CDR4、CDR5和CDR6，其序列分别对应于SEQ ID NO.6-8。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为FITC、FAM、Rhodamine B、TAMRA、Cy3、Cy5荧光基团标记。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为FITC荧光基团标记。
6. 一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。
7. 如权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其序列分别对应于SEQ ID NO.3-5所示。
8. 如权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述犬细小病毒单克隆抗体轻链可变区包括CDR4、CDR5和CDR6，其序列分别对应于SEQ ID NO.6-8。
9.权利要求6-8任一项所述的单克隆抗体在制备检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
10.一种非诊断目的的犬细小病毒抗原的直接免疫荧光检测方法，其特征在于，所述方法中采用权利要求1-5任一项试剂盒中的单克隆抗体接触待检样本，孵育结束后，在荧光显微镜下观察结果或酶标仪读取荧光值。
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