CN104877968A - 高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞a135株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效分泌抗犬细小病毒（CPV）单克隆抗体杂交瘤细胞A135株，属于生物技术领域。本发明从建立的分泌抗CPV单克隆抗体杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞A135株，生物学性能十分优良，注射BALB/C小鼠腹腔诱生的腹水，对CPV的中和效价高达10¹⁰，并且对CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）、CPV-2c（b）等多个CPV亚型病毒株以及狐、貉源CPV毒株的中和能力相当，抗CPV毒株范围广，用于CPV感染发病犬的临床治疗，有效率达到100%。

Description

高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞A135株

技术领域

本发明涉及一种高效分泌抗犬细小病毒（CPV）单克隆抗体杂交瘤细胞，属于生物技术领域。

背景技术

犬细小病毒病（Canine parvovirus disease，CPVD）是一种由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬病毒性传染病，该病传染性强，死亡率高，各种年龄犬均可感染，幼犬的死亡率高达70%，由该病导致的经济损失巨大。尽管对易感犬广泛采取了CPVD疫苗接种，但由于CPV对外界的抵抗力强、易变异，目前仍是危害我国养犬业最为严重的传染病之一。

CPV（又称CPV-2）是1977年由美国学者从患出血性肠炎的犬腹泻粪便中分离得到的一种新型细小病毒，为了与1967年Binn从健康犬分离的非致病性犬极小病毒（minute virus of canine, MVC，又称CPV-1）相区别而被命名为CPV-2。CPV-2与MCV在致病性上显著不同，抗原性上也有明显差异。目前公认CPV只有1个抗原型，即CPV-2，但CPV-2在其出现后的几年时间内已发生了抗原漂移，在抗原性、宿主范围和血凝性上都发生了变化，其变异速度之快，在DNA病毒中是很少见的。现在CPV已出现了多个亚型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）和CPV-2c（b），对动物的感染宿主谱（如：狐、貉等）也在扩大，严重威胁着家养和野生犬科及猫科动物的生存。

由于CPV的变异速度快，现有CPV疫苗的免疫效果有所下降。对临床发病犬追溯调查发现，免疫犬感染不同抗原型病毒的病例屡见不鲜，CPV-2 免疫犬对同型病毒( CPV-2) 中和抗体 ( SNAb) 水平明显高于异型，较多研究者认为低水平的SNAb 可能无法提供免疫犬对异型病毒的完全保护。此外，免疫犬感染发病的其他原因也不容忽视:①疫苗首次接种时幼犬体内残余的母源抗体限制了疫苗弱毒在其体内的复制。②疫苗接种后犬在“感染窗口期”内（约1-2周免疫产生期）遭受强毒的侵袭而感染。③某些品种、日龄的犬对强毒易感程度更高。

犬细小病毒病（CPVD）是一种由犬细小病毒（CPV）引起的以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬病毒性传染病，由该病导致的经济损失巨大。用抗CPV免疫血清或抗CPV单克隆抗体对患病犬进行治疗，可降低死亡率，减少经济损失。预防CPVD的主要手段是接种疫苗，对患病犬的治疗方法为给发病早期犬注射抗CPV血清或抗CPV单克隆抗体，同时辅助输液、输血、静脉注射犬免疫球蛋白或血白蛋白等，可以有效降低病死率。目前，市场上用本动物或异源动物制备的抗CPV免疫血清，质量不稳定、质控难、生产成本高，而且存在着外源病毒传入、感染患病犬的巨大风险，产生严重的生物安全问题；应用单克隆抗体治疗，可以降低上述风险，提高疗效，但现有的抗CPV单克隆抗体不仅中和效价（抗病毒活性）低，且对不同CPV亚型毒株的中和能力差异很大，对某些CPV亚型毒株没有中和活性。因此，在CPVD临床治疗上，亟需研制具有中和活性高、并且对不同的CPV亚型毒株都具有高中和能力的单克隆抗体。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种高效分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体不仅中和活性高，而且对不同的CPV亚型病毒株都具有高中和能力。

技术方案 

一种高效分泌抗CPV单克隆抗体杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞A135株于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201556，分类命名：杂交瘤细胞。

所述一种高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞A135株可以在制备犬细小病毒单克隆抗体治疗剂中得到应用

用所述杂交瘤细胞A135株制备的犬细小病毒单克隆抗体，再用所述的单克隆抗体制备犬细小病毒单克隆抗体治疗剂。

有益效果

本发明的特点和优点如下：

1. 本发明使用的BALB/c小鼠免疫原是用CPVD免疫发病犬体内分离的CPV当前流行强毒株（CPV-JS12株）制备。

2. 本发明从建立的178株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞A135株，用其诱生的BALB/c小鼠腹水单克隆抗体对犬细小病毒的中和效价高达10¹⁰，抗CPV的生物学活性十分优良。

3. 本发明的杂交瘤细胞A135株分泌的单克隆抗体对CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）、CPV-2c（b）等多个CPV亚型病毒株以及狐、貉源CPV毒株均表现高中和活性，抗CPV毒株范围广。

4. 本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体治疗剂，用于CPV感染发病犬的临床治疗，治愈率达100%，安全无不良副反应。

具体实施方式

（一）单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1. CPV抗原的制备  将从CPVD免疫发病犬体内分离的犬细小病毒强毒株CPV-JS12毒株（李月华，等. 犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达. 中国兽医科学，2013, 43(10): 991-998）接种于FK81细胞（购自南京天邦生物科技有限公司），将病变的细胞培养物冻融3次，离心去除细胞碎片，取上清液，采用PEG沉淀和不连续蔗糖密度梯度方法进行纯化，紫外分光光度计测定病毒浓度，制成CPV免疫抗原，-20℃保存备用。

动物免疫  用纯化的CPV免疫抗原经腹腔注射免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学实验中心），50μg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂（Sigma公司产品）乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐剂（Sigma公司产品）乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d断尾采血，用间接ELISA方法测定血清抗体效价，选取血清抗体ELISA效价＞10⁶的小鼠，在融合前3d用不加佐剂的CPV抗原经腹腔注射加强免疫。

细胞融合 采用PEG细胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5～1:10的比例，充分混匀，1000rpm 离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的50% PEG₄₀₀₀（Sigma公司产品）1mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入15mL预热至37℃的无胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入含15％胎牛血清（FCS）（兰州民海公司产品）和HAT（Sigma公司产品）的RPMI-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5% CO₂培养箱培养。3d后补加含HAT（Sigma公司产品）和15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基，5d后改用含HT（Sigma公司产品）和15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基，10d后换成含15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。

杂交瘤细胞的筛选  按方阵法确定纯化CPV抗原的包被浓度，用包被液为0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液对纯化的CPV抗原进行倍比稀释，用稀释至400倍的CPV抗原量包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以含10％小牛血清的PBST封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将融合后12d的细胞上清、1:1600稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1600稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100 μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1:2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置1h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入TMB底物，100μL/孔，室温避光显色5～10min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD_450nm值，以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD_450nm值，当阴性参考血清的OD_450nm值≦0.1，阳性参考血清的OD_450nm值与阴性参考血清的OD_450nm值的比值≧2.1，即阴、阳性对照成立的前提下， P/N≧2.1的检测孔判为阳性，隔2～3d后再检测一次，对两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。

杂交瘤细胞的克隆化  首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5 % CO₂培养箱中培养，4～5d 后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD_450nm值较接近。将克隆化的IBDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞株扩大培养，冻存。经过20次的细胞融合、筛选、克隆、鉴定，建立了178株稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞库。

腹水的制备  将灭菌的液体石蜡腹腔注射8~10周龄的BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学实验中心），0.5mL /只， 7天后，将杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔，每只0.2mL（含2×10⁶～5×10⁶个杂交瘤细胞），7～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000 rpm离心10 min，收集上清，即为CPV单克隆抗体，分装后于-20℃保存备用。

抗病毒活性分析

用分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞培养液与CPV-JS12毒株进行中和试验的方法分析178株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的抗病毒活性。简述之：采用固定病毒稀释抗体的方法，将FK81细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将各株单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清液（或腹水）系列稀释分别与等体积含200 TCID₅₀的CPV JS12株悬液混合均匀，37℃作用1 h，取该病毒-抗体混悬液接种于上述96孔细胞板中，0.1ml/孔，置37℃，5%CO₂温箱培养，观察结果（试验同步设立单独CPV及正常FK81细胞试验对照组）。

对具有中和活性的单克隆抗体，进一步用CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）、CPV-2c（b）等多个CPV亚型病毒株以及狐、貉源CPV毒株（以上材料均购自南京天邦生物科技有限公司）、CPV154毒株（购自荷兰英特威国际有限公司）、CPV-SP99毒株（购自美国富道动物保健公司）检验其中和能力，筛选分泌中和效价高、且抗CPV毒株范围广的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实验结果显示，杂交瘤细胞株A135腹水的中和效价最高，并且对不同的CPV毒株及亚型毒株的中和能力相当，腹水的中和效价达到10¹⁰，抗CPV的生物学活性十分优良。

杂交瘤细胞株A135的生物学特性

8.1 杂交瘤细胞株染色体分析  用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞进行染色体计数。分别取SP2/0骨髓瘤细胞和阳性杂交瘤细胞培养，生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4~5h。用5mL 37℃预温的0.075mol/L KCI 低渗液将细胞吹起混匀，置37℃温箱作用30min，向其中加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸为3:1）l mL，边滴加边混匀，1000rpm 离心10min。弃上清留细胞沉淀，用5mL固定液将细胞吹起，37℃作用30min，1000rpm离心10min，重复上述操作一次。细胞沉淀用 lmL固定液悬起混匀，用滴管吸取悬液1滴，滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆萨染液染色10min，自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染色体数量为94条，而骨髓瘤细胞的染色体的数量为54~64条，小鼠脾细胞染色体数量为40条，证明所获得的此杂交瘤细胞株是两种细胞融合的结果。

分泌单克隆抗体的稳定性测定  将获得的杂交瘤细胞A135株进行连续培养传代50次、液氮冻存与复苏试验，用CPV中和试验连续检测，杂交瘤细胞能够稳定分泌单克隆抗体。

单克隆抗体的亚类测定  用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒（购于Thermo scientific公司）测定杂交瘤细胞A135株分泌单克隆抗体的亚类，结果显示，该单克隆抗体亚类为IgG1κ。

单克隆抗体的间接免疫荧光试验  实验在24孔细胞培养板中进行。将CPV-JS12毒株接种到FK81细胞，培养72h病变后，吸弃细胞培养液，用无血清的培养液洗2次，然后向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇1mL/孔，4℃固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入杂交瘤细胞A135株培养上清液，200μL/孔，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体（购买于武汉博士德生物工程有限公司），200μL/孔，37℃孵育1h，PBS洗涤5次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，单克隆抗体均能与CPV-JS12感染的FK81细胞反应，产生荧光，而与正常FK81细胞无荧光，进一步证明单克隆抗体对CPV的特异性。

二)单克隆抗体的治疗性试验

1. 试验动物 6周龄非免疫健康易感比格犬（CPV抗体阴性），购自南京安立默科技有限公司。

．攻毒用强毒毒株 为从CPVD发病犬体内分离的犬细小病毒强毒株CPV-JS12毒株，（李月华等. 犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达. 中国兽医科学，2013, 43(10): 991-998）。用第5代FK81细胞培养病毒感染实验犬。

单克隆抗体治疗剂的制备 将液体石蜡注射入8～10周龄BALB/c小鼠，7天后，将杂交瘤细胞A135株注射小鼠腹腔，每只注射2×10⁶～5×10⁶个杂交瘤细胞，7～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，3000g，离心10 min，收集上清。单克隆抗体腹水经56℃、30分钟处理，离心，收集上清液，灭活补体，过滤除菌，用PBS稀释至中和抗体效价1000，即为CPV单克隆抗体治疗剂,分装，置-20℃保存备用。

．单克隆抗体的治疗性试验  将6只6周龄非免疫健康易感比格犬随机分成2组，每组3只，所有试验犬肌肉注射感染CPV-JS12株5代细胞毒2mL。隔离饲养2日后，将其中1组每日肌肉注射CPV单克隆抗体治疗剂，注射剂量为0.5ml/kg体重，连续注射3日；另1组同法注射生理盐水作为试验对照。每日观察临床症状。治疗性试验结果：试验犬在接毒后相继出现体温升高、呕吐或血便等典型的CPVD临床症状，治疗组犬连续注射3日CPV单克隆抗体后，全部健活，有效率达到100%；而生理盐水对照组分别于接毒后第5-6日后病情恶化、死亡。采集死亡犬的粪便，用CPV夹心ELISA检测证明为CPV感染致死。试验结果表明，本发明制备的CPV单克隆抗体用于CPV感染发病犬的临床治疗，疗效显著。

本发明用所述杂交瘤细胞A135株制备的CPV单克隆抗体，腹水的中和效价达到10¹⁰，并且对CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）、CPV-2c（b）等多个CPV亚型病毒株以及狐、貉源CPV毒株的中和能力相当，抗CPV毒株范围广，生物学性能十分优良。所述的单克隆抗体可在制备CPV单克隆抗体治疗剂中得到应用，应用于CPV感染发病犬的临床治疗，疗效显著，有效率达到100%。

Claims (5)

1.高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞A135株，该杂交瘤细胞A135株于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201556，分类命名：杂交瘤细胞。

2.权利要求1所述一种高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞A135株的应用。

3.权利要求1所述一种高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞A135株在制备犬细小病毒单克隆抗体治疗剂中的应用。

4.用权利要求1所述杂交瘤细胞A135株制备的犬细小病毒单克隆抗体。

5.用权利要求4所述的单克隆抗体制备的犬细小病毒单克隆抗体治疗剂。