CN103059133B - 一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中和犬瘟热病毒（CDV）的单克隆抗体及抗体组合物，属于生物技术领域。本发明的单克隆抗体2G3具有高的中和犬瘟热病毒活性，与筛选的另一株杂交瘤细胞1D7株制备的中和CDV单克隆抗体识别作用CDV不同的抗原表位。将两种单克隆抗体制成抗体组合物，对犬瘟热病毒的中和能力明显优于其组分中的单种单克隆抗体2G3和1D7，两者组合后能产生抗病毒协同增强作用，中和犬瘟热病毒的范围和能力均得到增强。用本发明的单克隆抗体制备抗体组合物治疗临床犬瘟热发病动物，中和病毒能力更强，可避免犬瘟热病毒变异导致单克隆抗体失效，临床应用范围更广泛。

Description

一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物

技术领域

本发明涉及中和犬瘟热病毒（CDV）单克隆抗体2G3及抗体组合物，属于生物技术领域，涉及抗体工程技术。具体为单克隆抗体2G3对CDV具有高的中和活性，与另一种作用于CDV不同抗原表位的中和单克隆抗体1D7组合产生抗病毒协同增强作用，中和能力得到提高，中和CDV毒株范围广泛，可应用于犬瘟热（CD）发病动物的临床治疗。

背景技术

犬瘟热病毒（CDV）是引起犬、狐狸和水貂等多种动物发生犬瘟热（CD）的病原，可感染动物体内多种细胞和组织，以淋巴细胞和上皮细胞的亲嗜最强，是一种泛嗜性病毒，对动物危害极大。CDV在病毒学分类上属于副黏病毒科麻疹病毒属，为不分节的负链RNA，主要编码核衣壳蛋白( N)、融合蛋白( F)、血凝或附着蛋白( H)、基质膜蛋白( M)、大蛋白( L)和磷蛋白( P)。病毒RNA被螺旋状衣壳包裹，由N蛋白、P蛋白和L蛋白组成，N蛋白是病毒蛋白中含量最多、保守性最强的免疫原性蛋白，P蛋白和L蛋白则具有聚合酶活性。病毒囊膜表面的H和F蛋白通过M蛋白与核衣壳连接，在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中起作用。CDV只有一个血清型，但近年来研究发现，目前CDV主要流行毒株与免疫预防使用的弱毒疫苗株存在不同程度的抗原性差异。

犬瘟热几乎分布世界各国，自然宿主广泛，传染性强、发病率和死亡率高，并可引起机体免疫抑制，继发或混合感染其它病原。近年来，我国宠物犬、警犬、实验用犬等的饲养量不断增加，以水貂、狐、貉等为饲养对象的经济动物养殖业也迅猛发展。然而犬瘟热在我国的发病率却有升高的趋势，该病不仅在非免疫动物中发病率和致死率很高，而且用弱毒疫苗免疫动物也未能得到完全保护，有许多免疫动物群体暴发犬瘟热，损失十分惨重。此外，随着CDV自然感染的宿主范围不断扩大，熊猫、熊、狮子和老虎等珍稀野生动物也经常发生犬瘟热，严重危害我国野生动物保护业的健康发展。发生犬瘟热的动物，种类和数量较多，经济价值较高，有些伴侣动物（如宠物犬等）被视为家庭成员，因此对犬瘟热除了积极的预防外，有必要对患病动物进行有效的治疗，将损失降到最小。

犬瘟热是一种病毒性传染病，一旦发病还没有特效的治疗药物，发病时用特异性抗体进行治疗是主要的方法。犬瘟热病毒的高免血清常用于治疗犬瘟热，但制备成本较高，易传播其它病毒，抗体中和效价参差不齐，难以标准化。因此制备特异性好，抗体中和效价高，易于标准化，制备成本低的单克隆抗体是必然选择。近几年的流行病学调查显示，CDV流行毒株与疫苗毒株之间存在变异导致不同程度的抗原性差异，单克隆抗体只针对病毒的单一抗原表位，因此存在单克隆抗体因病毒抗原表位变异而失去中和作用，不能有效杀灭病毒的风险。联合使用针对不同抗原表位的两种或两种以上的单克隆抗体，可以避免或减少因病毒抗原性差异导致的治疗失败，获得更好的疗效。另外，使用两种或两种以上的单克隆抗体还有可能产生抗病毒协同增强效应，增强抗体中和病毒的能力。美国FDA批准的单克隆抗体药物CL184组合就是采用CR57和CR4098两个单克隆抗体的混合物治疗狂犬病毒感染，取得了跟市售高免疫血清中提取的免疫球蛋白制品相似或更好的效果。

之前，我们用新分离的CDV NJ01株作为免疫原制备犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库，从中筛选到一株分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株，用其制备的单克隆抗体1D7可以中和不同动物源的CDV毒株。本发明又筛选制备了另一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体2G3，与单克隆抗体1D7识别作用的CDV抗原表位不同，而且将单克隆抗体2G3与单克隆抗体1D7进行组合，产生抗病毒协同增强作用，中和病毒的能力得到增强，抗犬瘟热病毒毒株的范围更广泛。

发明内容

技术问题

犬瘟热是犬和肉食目中多种动物的一种高度接触性传染病，尽管免疫预防是防控该病的指导原则，但最近几年却不断有免疫动物发生犬瘟热的状况。因此要对犬瘟热发病动物进行及时有效地治疗。目前临床上主要采用犬瘟热的高免血清和单克隆抗体对其进行治疗。犬瘟热高免血清存在生产成本偏高，易传播血源性疾病，中和效价参差不齐，难以标准化等问题，单克隆抗体可以弥补以上缺陷，但单克隆抗体识别作用抗原位点单一，使用一种单克隆抗体治疗犬瘟热，可能对不断出现的犬瘟热病毒变异株失去中和能力。

本发明的目的是提供一种中和CDV的单克隆抗体及抗体组合物。该单克隆抗体是通过病毒中和试验从建立的CDV单克隆抗体杂交瘤细胞库中筛选得到的，与另一种识别作用CDV不同抗原表位的单克隆抗体组合，中和能力得到显著增强，抗犬瘟热病毒毒株的范围更广泛。

技术方案

为达到以上目的，是通过以下技术方案来实现的：

一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体2G3，该单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；编码单克隆抗体轻链可变区氨基酸的基因序列如SEQ ID NO.3 所示，编码重链可变区氨基酸的基因序列如SEQ ID NO.4 所示。

所述的单克隆抗体2G3及抗体组合物是由杂交瘤细胞培养上清法制备的。

该单克隆抗体2G3对犬瘟热病毒具有病毒中和活性，中和效价高，与犬瘟热病毒反应特异性良好。

经鉴定，该犬瘟热病毒单克隆抗体2G3与杂交瘤细胞1D7株（一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株. 国家发明专利申请号： 201210081170.8，公开号： CN102618503A， 公开日：2012.08.01）分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体1D7结合的犬瘟热病毒抗原表位是不同的。

该犬瘟热病毒单克隆抗体2G3与杂交瘤细胞株1D7制备的犬瘟热病毒单克隆抗体1D7按1:1的比例混合均匀，制备成单克隆抗体组合物，该抗体组合物对犬瘟热病毒的中和能力显著增强。

所述的中和犬瘟热病毒单克隆抗体2G3可在制备临床治疗犬瘟热发病动物的药物中得到应用。所述中和犬瘟热病毒的抗体组合物可在制备临床治疗犬瘟热发病动物的药物中得到应用。

有益效果 本发明的特点和优点如下：

1. 本发明的犬瘟热病毒单克隆抗体2G3对犬瘟热病毒具有高的中和活性。

2. 本发明的犬瘟热病毒单克隆抗体2G3与杂交瘤细胞1D7株分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体识别作用于犬瘟热病毒不同的抗原表位，将两种单克隆抗体混合制备成抗体组合物可克服单克隆抗体识别抗原位点的单一性，避免病毒变异导致单克隆抗体无中和能力。

3. 本发明的抗体组合物中和效价中和效价为2¹²，显著高于（4倍）分别使用单种单克隆抗体2G3或1D7的中和效价（单克隆抗体2G3和1D7的中和效价均为2¹⁰），抗体组合物的中和病毒能力更强。

4. 本发明的抗体组合物用于临床治疗，中和犬瘟热病毒的范围和能力增强，降低生产成本，提高治疗效果，临床应用范围更广泛。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例一：分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1. CDV 抗原的制备 将CDV NJ01强毒株（毕振威等, 非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达. 中国预防兽医学报, 2011, 33(8) : 625-629.）接种于Vero细胞，3d细胞发病变（CPE），5d后收毒。将病变的细胞培养物反复冻融3次，4000×g离心后去除细胞碎片。病毒上清液经1M醋酸锌溶液沉淀后，用饱和EDTA溶液重新悬浮沉淀，4℃条件下，49000×g离心60min，沉淀用NTE充分悬浮。加入20%、30%、40%、50%和60%（质量/体积）的密度梯度蔗糖溶液，61000×g 离心90 min。吸取病毒带，通过电镜负染观察病毒形态，并用分光光度计测定病毒浓度，置-70℃保存备用。

2. 动物免疫 用纯化的CDV NJ01株作为免疫原，腹腔注射免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学实验中心），50μg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂（Sigma公司产品）乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐剂（Sigma公司产品）乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d断尾采血，测定血清抗体效价。选取血清抗体效价＞10⁶的小鼠，融合前3d用不加佐剂的抗原腹腔加强免疫，剂量加倍（100μg/只）。

3. 细胞融合 采用PEG细胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例充分混匀，在45s内加完预热至40℃的50% PEG-4000（Sigma公司产品）1mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入15mL预热至37℃的无胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温静置10min，1,000rpm离心10min，弃上清，加入含15％FCS（兰州民海公司产品）和HAT（Sigma公司产品）的RPMI-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5% CO₂培养箱培养。3d后补加含HAT（Sigma公司产品）和15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基，5d后改用含HT（Sigma公司产品）和15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基，10d后换成含15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。

4. 杂交瘤细胞的筛选 按方阵法确定纯化抗原的包被浓度，用包被液为0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液对纯化的CDV抗原进行倍比稀释，用稀释至400倍的抗原量包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜（不少于12h），PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以含10％小牛血清的PBST封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将融合后12d的细胞上清、1∶1600稀释的免疫小鼠阳性血清和1∶1600稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100 μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（本试验室自制），100μL/孔，37℃放置1h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色20min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD_450nm值，以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD_{450 nm}值，当阴性参考血清的OD_450nm值≦0.1，阳性参考血清的OD_{450 nm}值与阴性参考血清的OD_{450 nm}值的比值≧2.1，即阴、阳性对照成立的前提下， P/N≧2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性。隔2～3d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株。

5. 杂交瘤细胞的克隆化首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5 % CO₂培养箱中培养，4～5d 后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近。将克隆化的CDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞株扩大培养，冻存，建立了82株稳定分泌CDV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞库。

6. 单克隆抗体的制备：

采用杂交瘤细胞培养上清法制备单克隆抗体。将分泌犬瘟热病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别在细胞培养瓶中用含15%FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基进行培养，待细胞密度生长达80%-90%（细胞浓度约为2×10⁶个/mL）时，将培养基换成无血清的RPMI-1640培养基，放置5% CO₂培养箱培养直到所有细胞死亡，将培养液1000rpm离心10min，取单克隆抗体上清于-20℃保存备用。

7. 中和活性单克隆抗体的筛选

采用固定病毒稀释抗体的方法进行细胞微量病毒中和试验。将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将2倍倍比稀释的单克隆抗体与等体积含200 TCID₅₀的犬瘟热病毒液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5%CO₂温箱培养，观察结果。结果筛选到一种中和效价高的单克隆抗体2G3，其对犬瘟热病毒的中和效价为2¹⁰。

实施例二：单克隆抗体2G3可变区基因的克隆和序列测定

1. 杂交瘤细胞 RNA 的提取

将分泌单克隆抗体2G3的杂交瘤细胞2G3株用含15％FCS（兰州民海公司产品）的 RPMI 1640 培养基于37℃，5％CO₂ 孵箱中培养至对数生长期，用适量PBS将细胞吹打下来，置于-20℃冰箱冻融3次。按TRIZOL®Reagent (InvitrogenTM Life technologies)试剂使用方法提取总RNA。

2. RT- PCR 法扩增单克隆抗体的 VL 和 VH 基因

设计单克隆抗体轻链可变区上游引物VL F和下游引物VL B以及重链链可变区上游引物VH F和下游引物VH B两对引物，并送至上海Invitrogen公司合成。引物序列如下：

VL F：5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’

VL B：5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’

VH F：5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’

VH B：5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’

(IUB 标准兼并碱基代码 ：Y：C/T； R ：A/G ；)

用反转录试剂盒（购自Promega公司）对提取的杂交瘤细胞2G3的RNA进行反转录合成cDNA，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR，扩增单克隆抗体2G3的 VL 和 VH基因。PCR反应体积50μl，反应条件为：94℃ 5min；95℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 1min，循环35次；72℃7min。

3. PCR 扩增产物的克隆和筛选

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒（购自TaKaRa公司）回收，与pMD18-T simple Vector（购自TakaRa公司）连接后转化E.coli DH5α感受态细胞（购自Invitrogen公司），涂布于1.5%琼脂LB平板（含Amp100μg/mL），37℃培养过夜。挑白色单菌落在Amp抗性LB培养基中37℃摇菌过夜，以1μ菌液为模板，通过上述针对轻链、重链可变区设计的引物，用PCR法筛选重组阳性克隆，将所获得重组阳性克隆送交上海Invitrogen公司完成基因序列测定。测序结果为轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4 所示。

实施例三：单克隆抗体2G3的生物学特性

1. 单克隆抗体的特异性鉴定

采用间接免疫荧光试验验证单克隆抗体2G3是否与Vero细胞反应。用CDV感染Vero细胞，培养72h病变后，吸弃细胞培养液，用无血清的培养液洗2次，然后向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇1mL/孔，4℃固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入单克隆抗体2G3，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体（购买于武汉博士德生物工程有限公司），37℃孵育1h，PBS洗涤5次，置于荧光显微镜下观察。单克隆抗体2G3与CDV感染的Vero细胞反应，产生荧光，而与正常Vero细胞无荧光。用间接ELISA方法验证单克隆抗体是否与其它病毒有交叉反应。用0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液分别包被犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒1型(CAV-1)和犬冠状病毒(CCV)作为抗原，加入单克隆抗体2G3作用1h，PBST洗涤拍干，以酶标羊抗鼠IgG抗体（本实验室自制）作为指示抗体作用1h，底物TMB- H₂O₂显色，2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪测定OD_450nm值，结果以CPV、CPIV、CAV-1和CCV为抗原检测单克隆抗体2G3的OD_450nm值均小于0.1，判为阴性，而以CDV为抗原检测单克隆抗体2G3的OD_450nm值为1.0，判为阳性，证明单克隆抗体2G3是抗CDV的特异性单克隆抗体。

2 ． 单 克隆 抗 体的类型测定

亚类测定按照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒（购买于Thermo scientific公司）操作说明书进行，结果显示，单克隆抗体2G3亚类为IgG1κ。

3. 单克隆抗体效价和 稳定性 测定

将分泌单克隆抗体2G3的杂交瘤细胞2G3株进行连续培养传代20次、液氮冻存与复苏试验，以纯化的CDV抗原为检测抗原，间接ELISA连续检测单克隆抗体2G3效价，结果各传代的抗体ELISA效价相同，达到10⁴。

4. 单克隆抗体中和活性的测定

采用固定病毒稀释抗体的方法进行细胞微量病毒中和试验。将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将2倍倍比稀释的单克隆抗体2G3与等体积含200 TCID₅₀的犬瘟热病毒悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5%CO₂温箱培养，结果单克隆抗体2G3对CDV的中和效价为2¹⁰。

5. 单克隆抗体针对抗原表位的分析

采用间接ELISA相加试验分析单克隆抗体2G3与1D7结合抗原表位的差异。根据单克隆抗体2G3和1D7的ELISA抗体效价，将其分别稀释至饱和浓度，在此浓度下各取50%混匀，分别测定混合的单克隆抗体及饱和浓度下单克隆抗体2G3和1D7的OD_450nm值。按下列公式分别计算2株单克隆抗体相互叠加后的AI值: AI= AI(%) = [(2A₁₊₂/A₁+A₂ )-1] ×100，A₁和A₂是2种单克隆抗体各自的吸收值，A₁₊₂是2种单克隆抗体相加所测得的吸收值。若AI<50 为2种单克隆抗体结合同一抗原位点，若AI>50为2种单克隆抗体结合不同的抗原位点。实验结果为单克隆抗体2G3与1D7的AI为75，大于50，表明2G3与1D7结合CDV不同的抗原表位。

实施例四：单克隆抗体组合物及中和活性测定

1. 单克隆抗体 2G3 和 1D7 的制备

采用细胞培养上清法制备单克隆抗体2G3和1D7。将分泌犬瘟热病毒特异性单克隆抗体杂交瘤细胞2G3株和1D7株分别在细胞培养瓶中用含15%FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基进行培养，待细胞密度生长达80%-90%（细胞浓度约为2×10⁶个/mL）时，将培养基换成无血清的RPMI-1640培养基，放置5% CO₂培养箱培养直到所有细胞死亡，分别将培养液1000rpm离心10min，取上清于-20℃保存备用。

2. 单克隆抗体组合物的制备：

将用细胞培养上清法制备的单克隆抗体2G3和单克隆抗体1D7按1:1体积比充分混合均匀，制备单克隆抗体组合物。

3. 单克隆抗体及组合物中和活性的测定

用Vero细胞微量病毒中和试验分别测定细胞培养上清法制备的单克隆抗体2G3、单克隆抗体1D7以及单克隆抗体2G3和1D7组合物的中和效价。将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将2倍倍比稀释的各待测抗体分别与等体积含200 TCID₅₀的犬瘟热病毒悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5%CO₂温箱培养观察，结果见表一，单克隆抗体2G3和1D7组合物对CDV的中和效价为2¹²，显著高（4倍）于分别使用单种单克隆抗体2G3或1D7的中和效价（单克隆抗体2G3和1D7的中和效价均为2¹⁰）。

表一 单克隆抗体中和效价比较

单克隆抗体	2G3	1D7	2G3和1D7组合物
				中和效价	210	210	212

SEQ ID NO.1 轻链可变区氨基酸序列

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

SEQ ID NO.2 重链可变区氨基酸序列

Leu Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Leu Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Asp Ile Ser Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Asp Arg Ile Phe Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Glu Thr Gly Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

SEQ ID NO.3 轻链可变区核苷酸序列

gggcccaggcggccgagctcgatattcagatgacacagactcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagctctacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatct

SEQ ID NO.4 重链可变区核苷酸序列

gctgcccaaccagccatggccctcgaggtaaagcttctcgagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactccatcgccagtggttattactggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggaatggttgggctacataagctacgacgatatcagtaactccaacccatctctcaaagatcgaatcttcatcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagctgaattctgtgacttctgaggacacagctacatattattgtgcaagagagaaagaaactgggaggtggggccaagggaccactctcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcg

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物

<130> 0

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<221> 轻链

<222> (1)..(117)

<223>

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser

115

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<221> 重链

<222> (1)..(123)

<223>

<400> 2

Leu Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Ala Ser

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Asp Ile Ser Asn Ser Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Asp Arg Ile Phe Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Glu Lys Glu Thr Gly Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120

<210> 3

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 轻链可变区核苷酸序列

<222> (1)..(371)

<223>

<400> 3

gggcccaggc ggccgagctc gatattcaga tgacacagac tcctgcttcc ttagctgtat 60

ctctggggca gagggccacc atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct 120

atagttatat gcactggaac caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc 180

ttgtatccaa cctagaatct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag 240

acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc 300

acattaggga gctctacacg ttcggagggg ggaccaagct ggagctgaaa cgaactgtgg 360

ctgcaccatc t 371

<210> 4

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 重链可变区核苷酸序列

<222> (1)..(390)

<223>

<400> 4

gctgcccaac cagccatggc cctcgaggta aagcttctcg agtcaggacc tggcctcgtg 60

aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc tctgtcactg gctactccat cgccagtggt 120

tattactgga actggatccg gcagtttcca ggaaacaaac tggaatggtt gggctacata 180

agctacgacg atatcagtaa ctccaaccca tctctcaaag atcgaatctt catcactcgt 240

gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag ctgaattctg tgacttctga ggacacagct 300

acatattatt gtgcaagaga gaaagaaact gggaggtggg gccaagggac cactctcaca 360

gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg 390

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> VL F

<222> (1)..(40)

<223>

<400> 5

gggcccaggc ggccgagctc gayatycaga tgacacagac 40

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> VL B

<222> (1)..(42)

<223>

<400> 6

agatggtgca gccacagttc gtttcagctc cagcttggtc cc 42

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> VH F

<222> (1)..(44)

<223>

<400> 7

gctgcccaac cagccatggc cctcgaggtr aagcttctcg agtc 44

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> VH B

<222> (1)..(42)

<223>

<400> 8

cgatgggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gt 42

Claims (3)

1.一种中和犬瘟热病毒的抗体组合物，其特征在于，该抗体组合物含有中和犬瘟热病毒单克隆抗体2G3和保藏编号为CCTCC NO：C201222的杂交瘤细胞1D7株分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体1D7，所述单克隆抗体2G3包含重链可变区和轻链可变区，轻链可变区氨基酸序列如SE Q ID NO：1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1或2所述的一种中和犬瘟热病毒的抗体组合物，其特征在于，所述中和犬瘟热病毒单克隆抗体2G3和杂交瘤细胞1D7株分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体1D7按1:1的比例混合均匀，制备成单克隆抗体组合物。

3.权利要求1或2所述中和犬瘟热病毒的抗体组合物在制备临床治疗犬瘟热发病动物的药物中的应用。