CN115873107B - 一种抗犬瘟热病毒h蛋白的纳米抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗犬瘟热病毒H蛋白的纳米抗体，所述的纳米抗体包含有三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，恒定区包含有FR1、FR2、FR3和FR4。所述的纳米抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。本发明提供了一种能够特异识别中和犬瘟热病毒的纳米抗体，所筛选的纳米抗体对犬瘟热病毒具有高度特异的识别和结合能力，具有制备犬瘟热病毒的治疗或检测试剂的应用前景。

Description

一种抗犬瘟热病毒H蛋白的纳米抗体

技术领域

本发明属于纳米抗体制备技术领域，具体涉及一种抗犬瘟热病毒H蛋白的纳米抗体。

背景技术

犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)在分类上属副黏病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)，是一种单链RNA病毒。犬瘟热病毒CDV会导致易感动物全身多系统感染，并伴有显著的呼吸道、胃肠道和神经症状的高度传染性疾病，死亡率高达80％。该病毒于1905年由Henri Carré首次分离。随着犬瘟热的宿主范围不断扩大，从犬科动物、猫科动物、鼬科动物、熊科动物和一些非人灵长类动物上都分离到该病毒。犬瘟热病毒导致世界范围的大量动物死亡，其死亡率仅次于狂犬病，对野生濒危物种造成巨大威胁。

CDV属副粘病毒科(Paramyxo viridae)、麻疹病毒属，为单股负链RNA病毒，编码6个结构蛋白3′-N-P-M-F-H-L-5′和2个非结构蛋白V和C蛋白。其中血凝素(H)基因具有最强的遗传变异性，在中和抗体产生和宿主细胞受体中起着关键作用，是细胞致病性和组织嗜性的主要靶点，其糖基化位点及半胱氨酸的发生与抗原性和宿主嗜性密切相关，然而在环境、疫苗免疫等的选择压力下CDV的H蛋白在不断发生着变异从而导致免疫失败。

1989年一种新型的抗体首先发现于单峰驼的血清中，1993年首次报道骆驼血液中有一半的抗体天然缺失轻链和重链的第一恒定区(CH1)，因此被称为重链抗体(Heavychain antibodies，HCAbs)。克隆重链抗体的可变区得到仅由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)。VHH抗体分子量较小，约为15kDa，仅为常规抗体的1/10，由于其晶体结构呈椭球形，直径为2.5nm、长为4nm，因此被称为纳米抗体(Nanobody，Nb)。纳米抗体是迄今为止发现的可与抗原结合的最小抗体片段，是免疫诊断和治疗的理想抗体。

纳米抗体具有稳定性高、组织穿透力强、抗原结合能力强、水溶性好、易于通过体外重组表达高质量稳定生产、穿透性和靶向性强等优点，在疾病诊断、疾病治疗、病原检测、药物残留分析、环境监测等领域具有巨大的应用潜力，近年来受到了极大关注。

抗体的特异性结合能力使其可直接作为药物或作为药物载体进行疾病的治疗，而体积小、组织穿透力强、易于高通量筛选和大量生产的纳米抗体成为抗体药物的首选。例如：Serruys等制备出5个纳米抗体，可特异性的识别乙肝病毒的S蛋白，阻止病毒进入细胞，并证明纳米抗体可在体内有效阻止乙肝病毒的分泌。口蹄疫是一种急性、高传染性微小RNA病毒，而从美洲骆驼身上获得的纳米抗体可以有效地中和病毒，起到被动免疫的作用。另外，抗脂多糖纳米抗体治疗内毒素血症和抗非洲锥虫病的纳米抗体，在体内、体外的试验中，也取得了较好的治疗效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗犬瘟热病毒H蛋白的纳米抗体，所提供的纳米抗体可以有效的结合犬瘟热病毒的H蛋白，从而中和犬瘟热病毒；为预防治疗犬瘟热病毒导致的犬瘟热病提供一种有效的生物分子制品。

本发明首先提供一种抗犬瘟热病毒H蛋白的纳米抗体，所述的纳米抗体包含有三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列信息如下：

CDR1序列：GSMFSIPT(SEQ ID NO:1)、

CDR2序列：ITGNDST(SEQ ID NO:2)、

CDR3序列：NAAILEGQRWKTDTNSNY(SEQ ID NO:3)；

本发明所提供的纳米抗体，其中的恒定区包含有FR1、FR2、FR3和FR4，其氨基酸序列信息如下：

FR1：QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:4)、

FR2：WFRQAPGKQREGVSR(SEQ ID NO:5)、

FR3：KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCA(SEQ ID NO:6)、FR4：WGQGTQVTVS(SEQID NO:7)。

所述的纳米抗体，其一种具体的氨基酸序列如下：

QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSMFSIPTWFRQAPGKQREGVSRITGNDST KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCANAAILEGQRWKTDTNSNYWGQGTQVT VS(SEQ ID NO:8)；

本发明还提供用于编码上述纳米抗体的核酸片段，其一种具体的序列如下：

CAAGTTCAACTCCAGGAATCAGGAGGTGGCCTAGTTCAAGCTGGAGGCTCACTCA

GACTCTCGTGCGCTGCATCAGGCTCAATGTTCTCAATCCCAACATGGTTCAGACAAGCT

CCAGGAAAGCAAAGAGAAGGCGTATCAAGAATCACAGGAAACGACTCAACAAAGGGAAG

ATTCACAATCTCAAGAGACAACGCTAAGAACACACTCTACCTGCAGATGAACTCACTCA

AGCCAGAGGACACAGCTATGTACTACTGCGCTAACGCTGCTATCCTGGAAGGCCAAAGA

TGGAAGACAGACACAAACTCAAACTACTGGGGTCAAGGGACTCAAGTCACAGTTTCA(S

EQ ID NO:9)。

本发明再一个方面还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体中插入了上述的核酸片段；

本发明还提供一种含有上述表达载体的宿主细胞。

本发明还提供所述的纳米抗体在制备用于预防或治疗犬瘟热病毒的制品中的应用；

本发明还提供一种药物组合物，其中包含有在药学可接受的载体中和所述的纳米抗体。

本发明还提供了一种用于检测犬瘟热病毒的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有上述的纳米抗体。

本发明提供了一种能够特异识别中和犬瘟热病毒的纳米抗体，所筛选的纳米抗体对犬瘟热病毒具有高度特异的识别和结合能力，具有制备犬瘟热病毒的治疗或检测试剂的应用前景。

具体实施方式

本发明通过体外重组表达的犬瘟热病毒H蛋白对羊驼进行注射免疫，免疫后采集羊驼外周血，提取总RNA，反转录为cDNA，通过巢式PCR方法扩增编码羊驼的重链抗体可变区(VHH)的基因片段。将VHH基因与载体连接后转化入感受态细胞中来构建噬菌体展示纳米抗体文库。筛选鉴定阳性噬菌体，经测序和序列比对分析后，获得目的纳米抗体。

对于本发明说明书中所涉及的词汇记载如下：

纳米抗体：一种天然缺失轻链，仅含有重链的抗体(重链抗体)。该类抗体的可变区约12-15kDa左右，可以识别结合抗原，且亲和力极高，是最小的活性抗原结合片段。纳米抗体具有分子量小、亲和力高、高稳定性和水溶性的特点。

本发明的纳米抗体包括互补决定区CDR和恒定区(也称为框架区)FR。互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，恒定区FR包括恒定区FR1、恒定区FR2、恒定区FR3和恒定区FR4。恒定区与互补决定区相比，其氨基酸序列更保守。

下面结合实施例进对本发明进行详细的描述。

实施例1：犬瘟热病毒H蛋白的重组表达和纯化

本实施例利用原核表达载体来制备可溶性表达的犬瘟热病毒H蛋白，通过表达纯化来制备犬瘟热病毒H基因的重组表达蛋白，作为免疫抗原来制备纳米抗体。

将包含编码犬瘟热病毒H蛋白的核酸片段(H蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:10，编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11)的编码框插入到pET28a载体上。其中编码框从N端到C端分别是氨基酸序列为KFLVNVALVFMVVYISYIYAA的分泌信号肽、Gly-Ser中间连接体、H蛋白的编码核酸片段、Gly-Ser连接序列、序列为LEVLFQGP的3C蛋白酶切位点、Gly-Ser连接序列、序列为GLNDIFEAQKIEWHE的Avi标签、Gly-Ser连接序列和His标签。制备的重组质粒命名为pET28a-H重组质粒。

取5μL制备的pET28a-H重组质粒加入到30μL的BL21DE3感受态细胞中，在冰上孵育20-30min后，在42℃的水浴锅中热激90s，于冰上孵育1min，再加入300μL LB液体培养基，在37℃，250rpm的摇床中培养1h后，取200μL的扩大培养液涂布到氨苄抗性的固体LB培养皿中，倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。

培养完成后，在1.5mL EP管中加入1mL氨苄抗性的液体LB培养基，挑取检测为阳性的单克隆于1.5mL EP管中，在培养条件为37℃、220rpm的摇床中培养6h后，按照1:50的比例将菌液转接至含有10mL氨苄抗性的液体LB培养基的试管中，在培养条件为37℃、220rpm的摇床中培养，直到菌液OD600的值达到0.6～0.8之间，向试管中加入10μL IPTG至终浓度为1mM，在37℃、2000rpm的摇床中继续培养5-8h。

培养结束后，在10000rpm离心10min收集表达后的上清，用0.22μm滤膜过滤后，加入20mM咪唑，与3mL Ni-Smart beads填料混合，于4℃下搅拌孵育结合3-4小时。随后将混合物加入到重力柱中，收集resin，用10个柱体积的加入20mM咪唑的缓冲液A(150mM NaCl,20mM Tris HCl pH 8.0)洗杂，然后用含有300mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白。使用Ni柱亲和层析蛋白纯化方法对表达出的H蛋白进行纯化。

将纯化后的H蛋白进行透析，置换Buffer中存在的咪唑，为后期免疫双峰驼提供符合要求的H蛋白。

将透析好的H蛋白从透析袋中取出，装入规格为10kDa的浓缩管中，在水平转子离心机中进行浓缩，浓缩浓度为2mg/mL H蛋白保存在-20℃的冰箱中备用。

实施例2:针对H蛋白特异性纳米抗体的筛选

1、构建噬菌体文库

将实施例1中制备H蛋白与GERBU佐剂按体积比1:1混合制成乳浊液，在羊驼颈部靠近弓淋巴结的位置进行皮下注射抗原-佐剂乳浊液。每隔2周进行一次加强免疫，总共进行4次免疫注射实验。第4次免疫后，血清抗体的效价高于10⁶，在EDTA包被的采血管中收集血液，立即上下颠倒以抑制凝血；用Ficoll Plus 1.077分离外周血淋巴细胞PBLs。

利用RNAsio Plus(TaKaRa)裂解分离的外周血淋巴细胞PBLs，按照试剂盒的步骤来提取RNA。然后利用试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)(Vazyme)制备cDNA。进一步通过两轮PCR获得VHH片段。

其中第一步PCR的引物为通用引物CALL001和CALL002；该两个引物的序列信息如下：

CALL001：5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′、

CALL002：5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′。

从cDNA中扩增所有免疫球蛋白的重链可变区，包括重链可变区VH和重链抗体的可变区VHH。然后按照试剂盒的步骤，通过琼脂糖凝胶电泳回收700bp左右的目的片段。第二轮PCR以该产物为模板，使用分别结合在编码纳米抗体的FR1和FR4的位置上的引物来扩增纳米抗体的编码基因；获得的片段使用BspQI酶切后连接到pDX-init载体上。将构建好的文库电转到E.coli菌株中。

将进行复苏后的菌液接种至YT-AG培养基中，在37℃培养温度下，150rpm振荡速度的条件下培养到培养物OD₆₀₀＝0.5。然后取出5ml菌液加入3×10¹⁰VCSM13，在37℃静止感染30分钟。5000rpm，常温离心10分钟去除上清。用含氨苄青霉素和卡那霉素的2×YT-AK培养基重悬菌体，在37℃、200rpm培养条件下培养过夜。培养结束后，在5000rpm离心10min后，取上清，加入10ml含有20％PEG的NaCl(/2.5M)溶液充分混合，再次按照同样条件离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液洗涤离心，取上清，加入预冷的PEG/NaCl溶液，充分混匀并洗涤重悬，完成噬菌体文库的构建。

2、ELISA筛选和纳米抗体序列分析

通过ELISA方法，用瘟热病毒H蛋白抗原挑取阳性克隆，分别命名为CDV-H-NB1、CDV-H-NB12……CDV-H-NBN。

对筛选出抗H蛋白的纳米抗体进行测序，用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区FR和互补决定区CDR。

对CDV-H-NB1纳米抗体进行测序，确定其编码基因的序列如下：

CAAGTTCAACTCCAGGAATCAGGAGGTGGCCTAGTTCAAGCTGGAGGCTCACTCAGACTCTCGTGCGCTGCATCAGGCTCAATGTTCTCAATCCCAACATGGTTCAGACAAGCTCCAGGAAAGCAAAGAGAAGGCGTATCAAGAATCACAGGAAACGACTCAACAAAGGGAAGATTCACAATCTCAAGAGACAACGCTAAGAACACACTCTACCTGCAGATGAACTCACTCAAGCCAGAGGACACAGCTATGTACTACTGCGCTAACGCTGCTATCCTGGAAGGCCAAAGATGGAAGACAGACACAAACTCAAACTACTGGGGTCAAGGGACTCAAGTCACAGTTTCA；

编码的蛋白的氨基酸序列如下：

QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSMFSIPTWFRQAPGKQREGVSRITGNDST KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCANAAILEGQRWKTDTNSNYWGQGTQVT VS；

其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-48位氨基酸序列为FR2，第49-55位氨基酸序列为CDR2，第56-88位氨基酸序列为FR3，第89-106位氨基酸序列为CDR3，第107-116位氨基酸序列为FR4。

实施例3纳米抗体纯化

将编码纳米抗体CDV-H-NB1的核苷酸构建到pSb-init载体，pSb-init载体的C末端还有Myc标签和6xHis标签；将构建好的质粒转化至大肠杆菌MC1061中。将构建的重组菌株使用TB培养基(0.17M KH₂PO₄和0.72M K₂HPO₄，1.2％蛋白胨，2.4％酵母抽提物，0.5％甘油)，在37℃，200rpm条件下培养至待细菌生长到OD约0.5，然后将温度降到22℃，继续培养细胞。当培养液中重组工程菌株的浓度OD值为1.4-1.5左右时，加入阿拉伯糖诱导表达12h。

诱导表达结束后，10000rpm离心10min收集培养好的细胞，每用TES-high Buffer(0.5M蔗糖,0.5mM EDTA,和0.2M Tris Tris-HCl pH 8.0)重悬收集的细胞，4℃孵育30min。随后加入冰水，在4℃搅拌1h。然后10000rpm，4℃离心30min，收集上清，并加入终浓度为150mM NaCl和2mM MgCl₂；处理好的上清与3mL Ni-Smart beads(SA035100)孵育结合30min，再用含5mM imidazole的buffer A进行洗杂。

目的蛋白用含250mM咪唑的buffer A进行洗脱，洗脱下的目的蛋白使用RBD-Nanobody复合物纯化，液氮速冻后存放于-80℃。

实施例4：CDV-H-NB1纳米抗体对H蛋白的结合亲和力

使用Octet RED96仪器进行生物膜干涉法检测CDV-H-NB1纳米抗体对H蛋白的结合亲和力。将生物素化标记的H蛋白用添加有Tween20的PBS溶液稀释至终浓度为2g/mL，稀释后的蛋白在30℃下固定到链霉亲和素标签上，换到PBS-T中平衡120s，然后与不同浓度的CDV-H-NB1纳米抗体结合300s，随后将传感器浸泡在PBS溶液中进行解离。数据处理使用的是Data Analysis 10.0软件，按照1:1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到CDV-H-NB1纳米抗体对H蛋白的亲和力为4.127E^-10，结合常数为6.913E+0.5，解离常数为3.159E-0.5。

生物膜干涉测定法(BLI)检测结果显示CDV-H-NB1纳米抗体H蛋白结合的K_D值小于1x10^-12M

综上，本发明所提供的纳米抗体能够高效结合犬瘟热病毒的H蛋白，可用于预防和/或治疗犬瘟热病毒所导致的疾病。

Claims (8)

1.一种抗犬瘟热病毒H蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体包含有三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、CDR2的氨基酸序列为SEQID NO:2，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的恒定区包含有FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:4、FR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，FR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，FR4的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

3.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的氨基酸序列为SEQ IDNO:8。

4.编码权利要求1所述的纳米抗体的核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段的序列为SEQ ID NO:9。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中插入了权利要求4所述的核酸片段。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中插入了权利要求5所述的重组表达载体。

7.权利要求1所述的纳米抗体在制备用于检测犬瘟热病毒的制品中的应用。

8.一种用于检测犬瘟热病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1所述的纳米抗体。