CN111499744A

CN111499744A - 一种乳铁蛋白纳米抗体及制备方法、应用

Info

Publication number: CN111499744A
Application number: CN202010341697.4A
Authority: CN
Inventors: 曲光刚; 王长江; 单玉飞; 沈志强; 武曰星; 赵中伟
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: CN111499744B

Abstract

本发明提供了一种乳铁蛋白纳米抗体及制备方法，并提供一种利用乳铁蛋白纳米抗体纯化乳铁蛋白的方法。该乳铁蛋白纳米抗体为VHH抗体，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，将所述乳铁蛋白纳米抗体与填料偶联得到可以用于乳铁蛋白纯化的填料，所述偶联乳铁蛋白单链抗体的填料，能成功结合乳铁蛋白，且载量较高，可以用于乳铁蛋白的分离纯化以及工业化生产。

Description

一种乳铁蛋白纳米抗体及制备方法、应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种乳铁蛋白纳米抗体及制备方法、应用。

背景技术

乳铁蛋白( lactoferrin，LF )是乳汁中提取的一种天然物质，是从人乳汁中从分离得到的一种具有免疫功能的非血红素铁结合糖蛋白，安全可靠，具有抗菌、杀菌、无副作用、无残留等特点。此外，经研究发现乳铁蛋白也具有参与铁代谢、广谱抗菌、抗病毒、影响自由基的生成等作用，由此可见乳铁蛋白具有非常广泛的用途。鉴于现在细胞培养的广泛普及，随着研究进展乳铁蛋白作用越来越多，对乳铁蛋白的需求增加。再加上人乳铁蛋白成本高，产量少，远远难以满足现在所需。因此提供一种能够大批量生产高纯度乳铁蛋白的方法是非常有必要的。

单域抗体（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH）相对分子质量约为15KD，仅为常规抗体的1/15，因此也被称为纳米抗体，它是目前天然来源的相对分子质量最小的抗体。纳米抗体由于其理化性质稳定、易于基因操作和克隆等优势，在疾病诊断、分子检测和治疗等方面受到广泛关注。目前纳米抗体主要通过噬菌体展示技术获得，该技术通过PCR扩增出抗体的全套可变区基因，并将其克隆到噬菌粒载体上，利用E.coli构建包含纳米抗体全部基因序列的抗体文库；辅助噬菌体感染纳米抗体文库后释放包含有重组噬菌粒的噬菌体，形成噬菌体抗体文库，VHH表达在重组噬菌体表面，该技术将表型与基因型直接联系在一起，将抗体识别抗原的能力与噬菌体扩增的能力结合在一起，对特异性抗体的筛选更为高效。

本发明以牛乳铁蛋白作为靶抗原构建乳铁蛋白特异性纳米抗体噬菌体库，并对噬菌体库相关指标进行了鉴定分析，提供了一种乳铁蛋白纳米抗体及其制备方法，并将其用于乳铁蛋白纯化中，利用乳铁蛋白纳米抗体偶联，并利用偶联纳抗后的填料对牛的乳铁蛋白进行纯化，使高纯度的乳铁蛋白工业化生产成为了现实，在乳铁蛋白作为细胞培养添加剂、抑菌、抗菌以及抗肿瘤领域有巨大前景。

发明内容

本发明的目的在于制备一种乳铁蛋白纳米抗体及其制备方法，并提供一种利用乳铁蛋白纳米抗体纯化乳铁蛋白的方法。

本发明提供一种乳铁蛋白纳米抗体，其特征在于，所述乳铁蛋白纳米抗体具有SEQID No.1所示的氨基酸序列。

编码所述乳铁蛋白纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组载体，所述载体包含SEQ ID No.2所示的编码所述乳铁蛋白纳米抗体的核苷酸序列。

本发明还涉及一种重组菌，所述重组菌包含上述重组载体，表达得到所述乳铁蛋白纳米抗体。

优选的，所述重组菌为大肠杆菌E.coli。

本发明还提供了上述技术方案所属的乳铁蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）使用乳铁抗原蛋白通过背部皮下多点注射方式对羊驼进行免疫；

（2）采集免疫后羊驼血液，分离得到淋巴细胞；

（3）将步骤（2）所述得到的淋巴细胞进行总RNA提取，反转录制备cDNA，经两轮PCR对cDNA进行扩增，得到VHH基因片段;

（4）将步骤（3）所述得到的VHH基因片段连接入表达载体，并转化至感受态细胞，构建抗体免疫库；

（5）将步骤（4）所得抗体免疫库进行筛选，得到乳铁蛋白纳米抗体序列；

（6）验证乳铁蛋白纳米抗体与乳铁蛋白抗原蛋白结合。

特别指出，步骤（6）中，筛选出的乳铁蛋白纳米抗体的氨基酸序列见SEQ ID No.1，核苷酸序列见SEQ ID No.2。

特别指出，所述乳铁蛋白纳米抗体库的筛选方法，包括以下步骤：

（1）对乳铁蛋白纳米抗体库进行第一轮淘筛,得到乳铁蛋白纳米抗体序列;所述第一轮淘筛包被浓度为10-20μg/ml；

（2）将所述步骤（1）得到的乳铁蛋白纳米抗体序列进行第二轮淘筛,得到第一菌液；所述第二轮淘筛包被浓度为5-10μg/ml；

（3）将所述步骤（2）所得菌液进行第三轮淘筛，得到第二菌液；所述第三轮淘筛包被浓度为1~5μg/ml；

（4）将所述步骤（3）所得第二菌液感染TG1后培养，得到菌株；

（5）将所述步骤（4）所得菌株与MK13辅助噬菌体混合、感染，得到感染物；

（6）将感染物进行第一离心、重悬、第一振荡，得到重悬液；所述第一离心转速为3000g，第一振荡温度为30℃；

（7）将所述步骤（6）所得重悬液进行第二离心、重悬，得到上清液；所述第二离心转速为3000g；

（8）将所述步骤（7）所得上清液进行ELISA检测，检测第二上清液同乳铁蛋白的反应性，以确定所述菌株与乳铁蛋白具有反应性；

（9）将所述步骤（8）与乳铁蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段；

（10）将所述步骤9）所得纳米抗体VHH片段转入大肠杆菌，得到乳铁蛋白纳米抗体表达菌株，对菌株进行特异性表达，得到乳铁蛋白纳米抗体；

（11）对所述步骤（10）所得的乳铁蛋白纳米抗体蛋白进行表达；

（12）对所述步骤（11）所得的乳铁蛋白纳米抗体进行偶联；

（13）用所述步骤（12）所得的偶联乳铁蛋白纳米抗体的填料进行乳铁蛋白纯化。

本发明还提供一种用于乳铁蛋白纯化的填料，所述填料是将所述的乳铁蛋白纳米抗体与填料偶联得到。

本发明还请求保护一种乳铁蛋白纯化方法，利用所述的乳铁蛋白纳米抗体，采用免疫亲和层析的方式对乳铁蛋白进行分离和纯化。

优选的，所述方法采用所述用于乳铁蛋白纯化的填料。

附图说明

图1.第一轮PCR-VHH凝胶电泳图。

图2. 第二轮PCR-VHH凝胶电泳图。

图3.乳铁蛋白单链抗体的表达图。

图4. 乳铁蛋白纳米抗体的纯化图。

图5.乳铁蛋白纳米抗体偶链结果。

图6.乳铁蛋白纯化结果。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。

实施例1：乳铁蛋白纳米抗体制备及纯化方法

1.使用得到的乳铁蛋白抗原蛋白对羊驼进行免疫。

将乳铁蛋白抗原蛋白通过背部皮下多点注射的方式对羊驼进行免疫，共免疫4次，免疫间隔为14天。

采集免疫后羊驼血液，分离得到淋巴细胞；最终将分离到的淋巴细胞用4mL PBS重悬，移至1.5 mL无RNA酶EP管中。

所述得到的淋巴细胞进行总RNA提取，反转录制备cDNA，使用引物VHH1-F和VHH1-R对cDNA进行扩增，得到VHH基因片段，其中引物VHH1-F和VHH1-R的序列如下：

引物VHH1-F序列：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG，见SEQ ID NO:3；

引物VHH1-R序列：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC，见SEQ ID NO:4。

如图1所示，切取第一轮扩增后600 bp大小的目的片段，利用胶回收试剂盒进行回收，以回收产物作为第二轮PCR反应的模板，然后分别用引物VHH3-F、VHH3-R作为上游引物与下游引物扩增VHH片段，体系为40 μL，其中：

引物VHH3-F序列：5’-TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGT-3’，见SEQID NO:5

引物VHH3-R序列：5’-AAACCGTTGGCCATAATGGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3’，见SEQ IDNO:6

电泳结果如图2所示，第二轮PCR产物经纯化后与噬菌粒载体pCANTAB 5E分别经Sfi I和Not I限制性内切酶双酶切，使用DNA纯化回收试剂盒回收双酶切后的VHH目的片段和pCANTAB 5E载体，定量后使用T4 DNA连接酶连接过夜。

2. 将得到的VHH基因片段连接入表达载体，并转化至感受态细胞，构建抗体免疫库

将VHH目的基因片段与pCANTAB5E噬菌粒载体分别使用Sfi I和Not I限制性内切酶双酶切，经琼脂糖凝胶回收；使用T4 DNA连接酶将纯化的VHH目的基因片段与双酶切处理后的噬菌粒载体pCANTAB 5E 连接。将连接产物经电穿孔法转入新制备的E.colo TG1感受态细胞中，电穿孔仪设置电压为1.8KV，电转化完成后37℃ 200r/min振荡培养1h，取100μL进行梯度稀释计算电转化效率；剩余菌液涂布氨苄抗性固体平板，30℃过夜培养。

使用LB培养基冲洗平板上固化的菌落并收集到250mL灭菌锥形瓶中，取100μL 菌液进行梯度稀释后涂布氨苄抗性平板，过夜培养后计数各稀释度平板上的菌落数，根据菌落数及稀释倍数计算抗体文库的库容；随机挑取50个单菌落分别于5mL LB培养基中过夜培养，以过夜培养的菌液作为模板，使用VHH4-F和VHH5-R引物进行PCR反应，鉴定阳性克隆比例。将阳性克隆菌提取质粒后送第三方测序，鉴定抗体文库基因序列多样性。

引物VHH4-F序列：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG，见SEQ ID NO:7。

引物VHH4-R序列：CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT，见SEQ ID NO:8。

将连接产物通过电穿孔转入新鲜制备的E.coli TG1感受态细胞中，转化子涂布氨苄抗性平板，30℃过夜培养后收获平板上的菌落。从稀释后菌液涂布的抗性平板上随机挑取50个单菌落进行PCR鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示其中有3个为阴性，其余均扩增出约700bp的预期大小条带，阳性率为94.0%，计算最终库容大小为1.06×10¹⁰CFU/mL。

3. 对建立的乳铁蛋白抗体库进行筛选

（一）特异性抗体的淘选

（1）取初级抗体库一支（1 m L），加入250 m L 2×YT-G（2%葡萄糖）培养基中，37℃，250rpm，培养1 h；

（2）取培养液，测定细菌浓度，加入100 μg/m L Amp和Moi=20:1的M13K07噬菌体，37℃水浴轻摇 30 min，再37℃摇床培养30 min；

（3）4000 rpm 离心10 min，小心弃上清；

（4）用2×体积（500 m L）的2×YT-AK悬浮细菌沉淀，37℃，220 rpm，培养过夜；

（5）10000 rpm 离20 min，取上清至另一新管中，准备进行淘筛；

（6）加 100 m L的PEG/ Na Cl，4℃冰浴，不超过1 h；

（7）4℃，8000 rpm离心20 min，弃上清，控干；

（8）用5m L 的 2×YT悬浮噬菌体沉淀，再次10000 rpm离心15 min，取上清备用；按照MPBS:上清=2:3的比例将MPBS和噬菌体上清混匀，室温下去干扰化处理20 min；

（9）提前一天将免疫管用抗原包被（包被量2 m L/管）；

（10）包被完毕，用PBS洗管3次，拍干；

（11）用封闭液（2％脱脂乳PBS，MPBS）封闭免疫管，37℃封闭2h；

（12）弃封闭液，用PBS洗管3次，拍干；

（13）向封闭好的免疫管加入处理过的噬菌体上清混合液，2 m L/管，轻摇温育30min，再静置温育1.5 h；

（14）弃去免疫管内噬菌体上清，用PBST（0.1%）洗涤5次，再用PBS洗涤3次，拍干；

（15）洗脱：加入宿主菌TG1（OD600=0.5），4 m L/管，37℃，150 rpm振荡培养1h，此时，完成了第一轮淘筛，获得了一级抗体库；

（16）取振荡培养的菌液，用2×YT培养基做倍比梯度稀释，取稀释液100 μL涂布SOBAG平板，30℃培养过夜，计算输出淘筛步骤的噬菌体量；

（17）向一级库中，加入终浓度为100 μg/m L Amp和2%葡萄糖，同时加入4×10¹⁰M13KO7辅助噬菌体，37℃低速培养30 min后，再250 rpm振荡培养30 min；

（18）5000 rpm室温离心10 min，去上清，用100 m L 2×YT-AK轻悬细胞，37℃，220rpm，培养过夜；

（19）从以上第5步骤，进行循环淘筛，开始下一轮淘筛；

（20）最终经3轮淘筛，取获得的菌液做倍比梯度稀释，取稀释液100 μL涂布SOBAG平板，30℃培养20-24 h。剩余菌液-80℃冻存，标记为三级抗体库。实施例2：Phage ELISA鉴定抗原阳性重组抗体

（一）从三级抗体库中单克隆表达重组抗体

（1）从第4轮稀释后的平板上随机挑选单克隆，于400 μL2×YT-AG 培养基中过夜培养；

（2）菌液PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆排为一板，此板标记为 Master Plate；

（3）另取新的灭菌EP管，每管加入400 μL含有2.5×10¹⁰pfu/m L M13KO7 的2×YT-AG，此板标记为P1 Plate；

（4）将Master Plate中的细菌培养液每管取40 μL至P1 Plate；

（5）将P1 Plate中的离心管置于摇床，37℃，150 rpm，振荡培养2 h；

（6）4000 rpm离心20 min，小心去上清；

（7）每管加入400 μL 2×YT-AK培养液，37℃，220 rpm振荡培养过夜；

（8）7000 rpm离心20 min，取上清放于4℃备用。

（二）Phage ELISA

（1）包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被ELISA板，设立阳性对照和阴性对照；

（2）洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次；拍干；

（3）封闭：加入2% MPBS至满孔，37℃封闭1.5 h；

（4）洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；

（5）加重组抗体：提前将160 μL重组抗体和40 μL MPBS混匀，室温孵育20 min，加入封闭好的酶标孔内，37℃反应2 h；

（6）洗涤：弃重组抗体液，先用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干；

（7）加酶标二抗：将HRP标记抗M13单抗用2%MPBS做1:4000稀释，200 μL/孔，37℃孵育1h；

（8）洗涤：弃二抗，洗涤同上，拍干；

（9）显色：加入200 μL/孔TMB显色液，室温显色45 min左右；（10）终止：用200 μL/孔终止液，终止显色，于450 nm处读值。

通过间接ELISA方法检测94个单克隆对应的噬菌体上清同乳铁蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了16个单克隆抗体，这些单克隆均同乳铁蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱。

(10) 将16个与乳铁蛋白有较好反应性的单克隆抗体菌群进行测序，得到乳铁蛋白纳米抗体核苷酸序列：SEQ ID No.2，相应的，根据密码子编码原则确定其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

实施例3: 构建重组表达载体及鉴定

（一）乳铁蛋白纳米抗体的表达

（1）取甘油菌按1：100比例，接种于50 μg/ml Amp的600ml LB培养液中，37℃ 220 rpm振摇至菌体OD600为0.5-0.8；

（2）600ml发酵培养基中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，160 rpm于22℃培养5h；

（3）5000rpm，4^oC离心5min，离心去上清收集发酵菌体，-20℃保存；

（4）超声破碎菌体

破碎条件：150W功率，破碎1s，间隔1.5s，共20min，破菌缓冲液：PBS，pH7.4。表达结果如图3所示，其中第1泳道为蛋白marker，第2泳道为阴性菌破碎沉淀，第3泳道为阴性菌破碎上清，第4泳道为乳铁蛋白单链抗体表达菌破碎沉淀，第5泳道为乳铁蛋白单链抗体表达菌破碎上清，由此可知，蛋白正确表达且为可溶。

（二）乳铁蛋白单链抗体纯化

破碎后的菌体12000rpm，离心10min，4℃，收集上清进行镍柱纯化，填料类型为Smart-NI。平衡液：PBS，pH7.4，洗脱液：PBS，250mM imidazole，pH7.4。结果如图4所示，其中第1泳道为蛋白marker，第2-4泳道为乳铁蛋白纳米抗体纯化结果，第5泳道为乳铁蛋白纳米抗体流穿液，第6泳道为乳铁蛋白纳米抗体离心沉淀，第7泳道为乳铁蛋白纳米抗体离心上清，由此可知，镍柱纯化后目的蛋白纯度大于90%，且浓度较高。

实施例4:乳铁蛋白纳米抗体在乳铁蛋白纯化中的应用

（一）纳米抗体偶联

1）环氧活化：取全新琼脂糖凝胶，流干乙醇，纯水洗涤数遍后真空泵将胶抽干。按每100g凝胶，加入100ml 1M NaOH、15ml环氧氯丙烷，混匀，摇床60℃恒温震荡3-4h，再用纯水洗涤，如暂时不用，可置于20%乙醇中，4℃长期储存。

2）抗体偶联：按每1ml活化胶，加入过量（10mg）待偶联抗体（溶于20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0），混匀。摇床28℃恒温震荡1-2h或4℃过夜。

3）洗涤：20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0清洗掉未结合抗体（10倍体积）。

结果显示，乳铁蛋白单链抗体绝大部分已偶联至活化胶，偶联效果如图5所示，其中Lane M: Marker；Lane 1: 乳铁蛋白单链抗体样品；Lane 2: 偶联穿出；Lane 3: 填料洗涤。

（二）乳铁蛋白的纯化

1）将制备好的填料用10倍柱体积的PBS(pH=8.0)平衡；

2）将乳铁蛋白上样纯化；

3）洗涤：用 5 倍柱体积20mM磷酸盐缓冲液洗涤免疫亲和柱以洗涤非特异性吸附杂蛋白；

4) 洗脱：加入2倍体积的 0.1M Gly –HCl (pH3.0)，室温放置 5-10 min 使结合在柱床上的乳铁蛋白洗脱下来；

5)结果显示，偶联乳铁蛋白单链抗体的填料，能成功结合乳铁蛋白，且载量较高，效果如图6所示，其中，第1道: 上清液（supernatant）；Lane 第2道: 洗涤液（Flow through）；第3道: 洗脱液（Elution by 0.1M Gly）；第4道:填料（Beads）；M: Marker。

由上述实施例可知，本发明提供了一种乳铁蛋白纳米抗体的制备纯化方法及其应用实例。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对上述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 一种乳铁蛋白纳米抗体及制备方法、应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Ser Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Met Pro

20 25 30

Tyr Val Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ala Cys Ile Ser Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Asp Gln Thr Tyr Tyr Phe Cys Thr Gly Ser Asn Asp

100 105 110

Phe Pro Ser Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His

115 120 125

His Ser Glu Asp Pro

130

<210> 2

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctcagt tgcagctcgt ggagtctggg ggagactcgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

agagtttcat gtgcggcctc tggtttgaca atgccgtatg ttgccatagg ctggttccgc 120

caggccccag ggcgggagcg tgagggggtc gcatgtatta gtacttatga tggtagtaca 180

ttgtatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacagcgc caagaacacg 240

gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaaccc gaggacacgg gcctttatta ctgtgcggca 300

gaccagacgt attacttttg tacagggtcg aatgactttc cttcgaaggg ccaggggacc 360

caggtcaccg tctcctcggc gcaccacagc gaagacccc 399

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttctattac taggcccagc cggcccaggt gcagctggtg gagt 44

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaccgttgg ccataatggc ctgaggagac ggtgaccagg gt 42

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34

Claims

1.一种乳铁蛋白纳米抗体，其特征在于，所述乳铁蛋白纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的乳铁蛋白纳米抗体，其特征在于，编码所述乳铁蛋白纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种重组载体，所述载体包含权利要求2所述的编码所述乳铁蛋白纳米抗体的核苷酸序列。

4.一种重组菌，所述重组菌包含权利要求3所述的重组载体，能够表达得到所述乳铁蛋白纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，所述重组菌为大肠杆菌E.coli。

6.根据权利要求1或2所述的乳铁蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）采集免疫后羊驼血液，分离得到淋巴细胞；

（3）将步骤（2）所述得到的淋巴细胞进行总RNA提取，反转录制备cDNA，使用引物VHH1-F和VHH1-R对cDNA进行扩增，得到VHH基因片段，其中引物VHH1-F和VHH1-R的序列分别见SEQID No.3和SEQ ID No.4；

（6）验证乳铁蛋白纳米抗体与乳铁蛋白抗原蛋白结合。

7.一种用于乳铁蛋白纯化的填料，所述填料是将权利要求1或2所述的乳铁蛋白纳米抗体与填料偶联得到。

8.一种乳铁蛋白纯化方法，利用权利要求1或2所述的乳铁蛋白纳米抗体，采用免疫亲和层析的方式对乳铁蛋白进行分离和纯化。

9.根据权利要求8所述的方法，所述方法采用权利要求7所述的用于乳铁蛋白纯化的填料。