CN112725285B - 一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到细胞株10B7，保藏编号为：CGMCC No.21904；步骤二、应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞；步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，分装产品。该方法提高了犬瘟热病毒单克隆抗体的效价，无需浓缩，克服了传统腹水生产抗体的缺点，使抗体产品无杂蛋白，产品稳定，批间差异小。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法。
背景技术
犬瘟热（canine distemper）是犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，常引起消化道、呼吸道以及神经系统症状，并能引起机体免疫抑制。该病的传染性极强，死亡率达80%以上，接种犬瘟热疫苗是预防犬瘟热最有效的途径之一。近年来，在广泛应用疫苗防治的同时，世界各地仍有犬感染犬瘟热病毒，并有范围内流行的报道。
单克隆抗体由细胞工程产生的鼠源单克隆抗体，由单一B细胞克隆产生的高度均一，仅针对某一特定抗原表位的抗体。最大的特点是特异性强，纯度高，可扩大生产。
目前为止，犬瘟热单克隆抗体的制备方法主要是小鼠腹腔收集，将单克隆抗体细胞注入BALB/c小鼠腹腔，细胞在内生长并产生腹水，7~10天后小鼠腹腔增大，收集腹水。此方法收集的抗体浓度高，但操作繁琐，产量低，无法规模化生产。而且收集的腹水中会有杂蛋白，需纯化并伴有污染动物病毒的危险。目前用生物反应器培养杂交瘤细胞可以规模化生产抗体并且避免动物病毒的危险。但是，生产后抗犬瘟热病毒单抗无法达到所需效价，需要进行浓缩，受温度、pH、料液浓缩倍数、经济成本等影响，急需研究出应用生物反应器生产抗犬瘟热病毒单克隆抗体且无需进行浓缩的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，该方法提高了犬瘟热病毒单克隆抗体的效价，无需浓缩，克服了传统腹水生产抗体的缺点，使抗体产品无杂蛋白，产品稳定，批间差异小。本发明应用的培养基成分明确，具有过程和质量可控、操作简单、生产效率高、稳定性好等优点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到成活率高、抗体分泌能力强的细胞株10B7，其中：
所述杂交瘤细胞选自能够稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株，通过有限稀释克隆，挑选出可以稳定在无血清培养基悬浮培养的细胞株10B7，分类命名为杂交瘤细胞（hybridoma），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.21904，保藏日期为2021年2月25日；
所述悬浮培养的具体步骤如下：待亚克隆挑选后的细胞株生长至单层，细胞密度按1.2E6接种于F125摇瓶内，每天取样计数，细胞密度按1.2E6传代，其中，培养基用法：接种摇瓶时用含15%血清的DMEM，每次传代用液DMEM（含15%血清）：无血清培养基的比例为1:3，1:1，3:1依次递减DMEM（含15%血清）用量；
步骤二、应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆，其中：
所述生物反应器内分细胞生长阶段（即：培养细胞增殖）和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞，将收获的细胞液进行离心分离，无需浓度制得抗犬瘟热病毒单克隆抗体成品；
所述细胞生长阶段为以获得细胞数为主，抗体分泌阶段以持续稳定的获得大量分泌抗体为主；
所述细胞生长阶段的培养条件：温度为37℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；
所述抗体分泌阶段的培养条件：温度为34℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；
所述生物反应器为搅拌式生物反应器；
所述生物反应器培养细胞所用的培养基是无血清培养基，培养基分为两个部分：基础培养基和补料培养基；
所述生物反应器内的培养方法为补料批次培养法；
所述批次培养法为在生物反应器内放入罐体容积60%的培养基，细胞密度按1.0E6~1.2E6接种生物反应器，细胞在生物反应器内生长，一次性收获产品；
所述补料批次培养法为在培养过程中补加补料培养基，其中：接种上罐的D1（接种当天为D0），细胞密度高于2.0E6，开始每日进行添加补料，补料添加量为培养体积的3%；
所述生物反应器内的培养方式为单极培养法和/或逐级放大培养法；
所述单极培养法为10L单极培养法，逐级放大培养法为10L-50L-200L逐级放大培养法；
所述10L单级培养法以摇瓶培养细胞为种子细胞，将其接种到10L搅拌式生物反应器中进行培养，添加补料培养基，其中：细胞密度按1.0E6~1.2E6接种生物反应器，接种上罐的D1（接种当天为D0），细胞密度高于2.0E6，开始每日进行添加补料，补料添加量为培养体积的3%，培养D7，成活率低于40%，收集抗体；
所述10L-50L-200L逐级放大培养法以10L生物反应器培养细胞为种子细胞，再将种子细胞放大到50L生物反应器中培养，再以50L生物反应器中培养的细胞作为种子细胞，将其放大到200L生物反应器进行培养，产生抗体，其中：细胞密度按1.0E6~1.2E6接种10L生物反应器，接种后体积为8L，接种上罐后的D2（接种当天为D0），细胞密度高于4.0E6，成活率高于90%，将8L细胞接种于50L生物反应器，接种后体积为33L，接种上罐后的D2（接种当天为D0），细胞密度高于4.0E6，成活率高于90%，将33L细胞接种于200L生物反应器，接种后体积为120L，接种上罐的D1（接种当天为D0），细胞密度高于2.0E6，开始每日进行添加补料，补料添加量为培养体积的3%，并产生抗体，培养D7，成活率低于40%，收集抗体；
步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，分装产品。
为了清楚的表述本发明的保护范围，本发明对以下术语进行如下界定：
本发明中的“交瘤细胞株”是将具有抗犬瘟热病毒单克隆抗体分泌的小鼠脾细胞和具有无限分裂的SP2/0细胞融合而成，所形成的杂交瘤细胞同时具有分泌抗体和无线增值的特性，包括但不限于本发明所举例的10B7细胞。
本发明中涉及的基础培养基和补料培养基为无血清培养基，其包括但不限于本发明。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1、本发明应用有限稀释法进行抗犬瘟热病毒细胞克隆，筛选出一株生长状态好、成活率高的细胞株并且可以稳定在无血清培养基内生长。
2、本发明采用单极培养法或逐级放大培养法，生产过程自动化控制，收获的细胞培养液不需要浓缩即可达到所需效价，降低生产成本，提高产品质量。
3、本发明应用生物反应器使用无血清悬浮培养杂交瘤细胞以制备抗犬瘟热病毒单克隆，不需要进行膜浓缩以能达到所需的抗体效价，该方法应用的无血清培养基成分明确，不使用牛血清，从而避免了血清中特异蛋白的残留，保证了产品质量。该培养基具有成分明确、生产过程和质量可控、抗体纯度高、稳定性好等优点。
保藏信息：
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；
保藏日期：2021年2月25日；
保藏编号：CGMCC No.21904。
附图说明
图1为本发明利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的流程图；
图2为抗体检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，该方法所用杂交瘤细胞为鼠源杂交瘤细胞，来源于北京世纪元亨公司，无血清培养基购自上海倍谙基公司，细胞培养摇床购自美国精骐摇床，DMEM购自GIBCO，血清购自兰州荣晔有限公司。
一、杂交瘤细胞复苏
将鼠源杂交瘤细胞从液氮中取出，37℃水浴，使其迅速融化，将细胞转入装有10ml新鲜DMEM培养基的离心管中，1000转/min，离心3min，弃去上清，加入8ml含15%血清的DMEM培养基，轻轻吹打细胞，将细胞移至T25透气方瓶内，放入二氧化碳培养箱内（37℃，5%二氧化碳），隔天，将细胞进行传代。
二、细胞克隆
用胎盘蓝进行染色和计数，用含15%血清的DMEM培养基稀释成80个/10ml培养，将稀释后的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μl，37℃，5%二氧化碳培养箱内培养，3天后，显微镜下观察克隆细胞的形成，记录只有单个克隆细胞生长孔，8~9天取细胞上清液，进行免疫酶飞片检测。选取10株细胞生长快且效价高的孔进行扩大培养，冻存。
三、杂交瘤细胞的无血清悬浮适应培养
将克隆后挑选的10株细胞进行复苏，培养传代2次，细胞长成致密单层后，用弯头吸管轻轻吹打细胞，按1E6接种透气培养条件125摇瓶培养，此时培养基为含15%血清的DMEM。培养条件为37℃，5%二氧化碳，摇床转速130rpm。隔日取样观察细胞生长情况，用无血清培养基按1E6传代，慢慢替换含15%血清的DMEM培养基。传代5~7次，各别细胞株会有细胞结团，弃掉。稳定传代10个代次，无结团，计数细胞成活率在90%以上，细胞数隔天翻倍生长，即判定细胞株已驯化至无血清培养基悬浮培养，此时挑选出5株杂交瘤细胞已驯化到无血清培养基内。
将5株细胞在125摇瓶内进行补料培养，选出效价为1:1280细胞株。
四、10L生物反应器培养杂交瘤细胞
本实施例所用生物反应器为搅拌式生物反应器（购自赛多利斯），配备大泡通气装置，血清培养基购自上海倍谙基公司。
（1）种子细胞制备：将挑选出的已驯化到无血清悬浮培养基的细胞株接种到125ml摇瓶中培养，待细胞密度达到4×106个/ml后，传代至500ml摇瓶中，进行种子细胞的扩大培养，培养条件为37℃，5%二氧化碳，摇床转速130rpm，制得种子细胞。
（2）生物反应器的准备：将生物反应器罐体进行清洗，将pH电极进行校准后安装到罐体上，管道进行包扎，并且对呼吸器及罐体进行检漏试验，完成后进行高压蒸汽灭菌（121℃，1h），自然冷却至室温。罐体夹层注水来控制温度。将无菌过滤好的无血清基础培养基无菌连接到反应器，通过压力倒入罐体。加入培养基的量要浸没电极探头，设定参数，打开反应器温度、搅拌，直通空气进行溶氧校准。12h后溶氧校准，待用。
（3）杂交瘤细胞接种生物反应器：将摇瓶种子细胞计数后，接种密度按1×106个/ml接种到10L反应器，接种体积不低于3L，后依据细胞密度逐渐补充至工作体积。培养过程中采用无血清基础培养基，每天监测细胞密度和细胞活率。
（4）接种到50L生物反应器：获取的10L生物反应器培养的杂交瘤细胞作为种细胞，接种到50L生物反应器中进行培养，接种密度按1×106个/ml，培养参数为：温度37℃，搅拌转速50rpm，DO为40%，pH为6.8。培养过程中采用无血清基础培养基，每天监测细胞密度和细胞活率。
（5）接种到200L生物反应器：获取的50L生物反应器培养的杂交瘤细胞作为种细胞，接种到200L生物反应器中进行培养，接种密度按1×106个/ml，培养参数为：温度37℃，搅拌转速50rpm，DO为40%，pH为6.8。在细胞生长和抗体分泌阶段，每天监测细胞密度和细胞活率。在细胞密度达到2×106个/ml时，每天补加无血清补料培养基。在细胞密度达到3×106个/ml时，将温度降至34℃。补料培养基培养添加到第7天至第9天时收获细胞液。
（6）将收获的细胞液经过4000rpm离心去除细胞碎片，无菌分装。
（7）产品按照《中华人民共和国兽药典》的要求进行检验，应无细菌、支原体、霉菌生长。
五、抗体检测
（1）抗原片制备：将vero细胞接种CDV病毒，待细胞出现病变或确知细胞内含有丰富的病毒抗原后，用胰酶消化分散细胞，PBS洗涤3次，最后用适量PBS悬浮细胞。将细胞悬浮液滴于玻片孔内。同时消化不感染病毒的同批同种细胞，滴加同一玻片另一孔内，作为正常细胞对照。孔内滴加的细胞以细胞铺开，不重叠为宜。室温干燥后，冷丙酮（4℃）固定10min。用蒸馏水漂洗后充分干燥，置于-20℃备用。
（2）抗体检测：取出抗原片，室温干燥后，滴加适当稀释的待检样品和阴性、阳性样品，每份样品加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，37℃ 30分钟。 PBS洗3次，每次5min，室温干燥。滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，37℃ 30分钟。PBS洗3次，每次5分钟。将玻片放入底物溶液中，在室温下显色5～10分钟。PBS漂洗2次，再用蒸馏水漂洗1次。吹干后，在显微镜下判定结果。
结果判定：在阴性、阳性对照样品成立的情况下，即阴性样品与正常细胞和病毒感染细胞反应无色；阳性样品与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞呈棕褐色，即可判定结果。待检样品与正常细胞和病毒感染细胞反应呈无色，判为阴性。待检样品与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应呈棕褐色，判为阳性。
由2图可见，病毒感染细胞和阴性样品的细胞培养物呈无色，病毒感染细胞和杂交瘤细胞培养上清液1280倍稀释样品呈棕褐色。本发明的方法所获得的单克隆抗体对于鉴定CDV感染具有很高的特异性诊断。
Claims (6)
1.一种分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株10B7，保藏编号为：CGMCCNo.21904。
2.一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
步骤一、应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段和抗体分泌阶段两个阶段培养权利要求1所述的杂交瘤细胞株10B7；
步骤二、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，分装产品。
3.根据权利要求2所述的用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述步骤一中，细胞生长阶段的培养条件：温度为37℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧为40±10%，pH为6.8±0.2；抗体分泌阶段的培养条件：温度为34℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧为40±10%，pH为6.8±0.2。
4.根据权利要求2所述的用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述步骤一中，生物反应器为搅拌式生物反应器。
5.根据权利要求2所述的用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述步骤一中，生物反应器内的培养方法为补料批次培养法。
6.根据权利要求2所述的用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述步骤一中，生物反应器内的培养方式方法为单级培养法和/或逐级放大培养法，其中：所述单级培养法为10L单级培养法，逐级放大培养法为10L-50L-200L逐级放大培养法。
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