CN109913404B - 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法。本发明将鸡胚成纤维细胞细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞；本发明进一步提供了一种制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)将所述适应无血清培养基呈悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的细胞接种IBDV病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液；(3)将病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻干燥，即得。本发明制备方法降低了污染风险和生产成本，有效缩短了疫苗的生产时间，便于进行扩大生产规模；所制备的鸡传染性法氏囊病毒活疫苗安全性好，具有良好免疫保护效力。

Description

鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法，尤其涉及采用无血清悬浮培养技术制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，属于鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备领域。

背景技术

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、溶淋巴细胞性传染病，主要感染3～6周龄的青年鸡。该病毒主要侵害雏鸡法氏囊内未成熟的B淋巴细胞或B淋巴前体细胞，使鸡群产生严重、长期的免疫抑制，使机体对疫苗应答能力的下降，引起免疫失败，或导致其他病毒性或细菌性疾病的继发感染性，从而增加了鸡群的死淘率。本病仍无有效的治疗方法，免疫接种一直是防治IBD的最佳选择。近年来变异株和超强毒株的存在使本病的预防工作更加复杂，采用免疫接种结合综合防制仍是预防本病最有效措施。

DF-1细胞起源于鸡胚成纤维细胞，现已经成为一种成熟的传代细胞系。DF-1细胞体外培养具有很强的增殖能力，其细胞的密度能够超过CEF4倍以上。DF-1细胞是逆转录酶阴性、非致瘤性的细胞。DF-1细胞系是经美国食品与药物管理局(FDA)授权的全球商业化细胞系，目前已被广泛应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达、肿瘤病毒的研究及动物和人类疫苗的生产。

传统的DF-1培养大多采用血清贴壁的方式，该培养方式工艺复杂，占地面积大，需大量人工操作并且在培养过程中需要添加血清，增加了被外源病毒、支原体等污染的可能性，而且不同批次间的血清差异也会导致产品质量难以控制，同时也加大了下游分离纯化的难度。与血清贴壁培养技术相比，无血清悬浮培养技术无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，降低了污染风险和生产成本，缩短了生产时间。由于无血清悬浮培养技术不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。因此，无血清悬浮培养技术是细胞工业化生产疫苗的必然趋势。

因此，将DF-1细胞进行全悬浮驯化培养获得适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的细胞以及将其应用于鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备，对于降低鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的生产成本和污染风险、进行规模化生产等均具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞；

本发明的目的之二是应用所驯化获得的适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞(DF-1细胞)制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗，该制备方法采用悬浮培养技术降低鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的生产成本和污染风险，能够进行规模化工业生产。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明将传代鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得一株适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，该细胞被命名为DF-1-XF。

本发明首先采用逐步降低血清的方法驯化DF-1细胞以适应低浓度血清培养：本发明将含10％新生牛血清的MEM培养液中稳定生长的DF-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×10⁵cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中；经过数代后，DF-1细胞在含5％新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养；以同样的方法使DF-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。随着血清使用浓度的降低，DF-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。DF-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，仅有个别细胞呈现出稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，DF-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮DF-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明DF-1细胞已经适应了无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态；本发明经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1细胞命名为DF-1-XF细胞。

本发明将驯化培养获得适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16295，分类命名是：适应全悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞；保藏日期是：2018年9月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明进一步的应用所述的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗，所述方法包括：

(1)将DF-1-XF细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种IBDV病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，(3)将病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。

本发明将DF-1-XF细胞分别以初始密度为0.3×10⁶cells/ml、0.5×10⁶cells/ml和0.75×10⁶cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，每隔24小时取样计数，结果表明细胞初始接种密度为0.75×10⁶cells/ml，培养48小时细胞密度可3.0×10⁶cells/ml以上，适合大生产需求；因此，步骤(1)将DF-1-XF细胞优选按照0.75×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；另外，步骤(1)中所述的细胞悬浮增殖培养条件还包括：pH值、溶氧、培养温度和搅拌转速等条件，这些参数均可以采用常规的细胞悬浮培养的参数进行培养，作为参考，所述pH可以控制为7.2、溶氧值可以控制为(DO)为50％、温度可以控制为37℃、搅拌转速可以控制为50-500r/min。

本发明在血清浓度为1％、细胞初始接种密度0.75×10⁶个/ml、pH为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃的条件下，将DF-1-XF细胞分别以60r/min、80r/min、100r/min和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行DF-1细胞悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。结果发现，当搅拌转速为100r/min时，细胞增殖最快，48小时细胞密度达到3.2×10⁶cells/ml；因此，在步骤(1)中进行细胞悬浮增殖培养时，所采用的搅拌转速优选为100r/min。

将DF-1-XF细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养36小时、48小时和60小时按2v/v％接种IBDV病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。

本发明进一步发现，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种IBDV病毒的接毒时间对于病毒的增殖培养效果有较大的影响：

本发明将DF-1-XF细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养36小时、48小时和60小时按2v/v％接种IBDV，培养过程中每隔12小时取样，测定病毒含量；结果发现，细胞培养60小时后接种IBDV，病毒滴度可达10^8.2TCID₅₀/ml，即最佳接毒时间为细胞培养60小时；因此，步骤(2)中优选将DF-1-XF细胞悬浮增殖培养60小时接种IBDV病毒。

本发明进一步发现，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种IBDV病毒的接毒剂量以及收获并毒液的时间对于病毒的增殖培养效果的影响也非常显著：

本发明将DF-1-XF细胞以0.75×10⁶个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养60小时后(其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min)，分别以体积比1％、2％、5％和10％的接毒量接种IBDV，培养过程中每隔12小时取样，测定病毒含量；试验结果发现，接毒剂量为5％，接种后36h收获毒液，病毒毒价可达10^8.45TCID₅₀/ml；因此，步骤(2)优选浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种IBDV病毒的最佳接毒剂量为培养体积的5％；收获病毒的时间优选为为接种后36小时。

本发明鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法采用无血清悬浮培养技术，与血清贴壁培养技术相比，本发明制备方法无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，显著降低了污染风险和生产成本，有效缩短了生产时间；不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。本发明制备方法所制备的鸡传染性法氏囊病毒活疫苗安全性好；免疫保护效力检验的实验结果表明，所制备的鸡传染性法氏囊病毒活疫苗对于鸡只具有良好的免疫保护效力。

附图说明

图1DF-1细胞驯化过程中的细胞形态变化；A:悬浮培养初期；B:悬浮培养后期。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的DF-1细胞的驯化培养

采用逐步降低血清的方法驯化DF-1细胞以适应低浓度血清培养。将含10％新生牛血清的MEM培养液中稳定生长的DF-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×10⁵cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中。经过数代后，DF-1细胞在含5％新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养。以同样的方法使DF-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。将适应了1％新生牛血清培养条件的DF-1细胞在细胞三角瓶中进行悬浮培养驯化适应。细胞培养液为上海源培DF-1无血清培养基，细胞初始接种密度为1.0×10⁶cells/ml，转速设置为160r/min，置于5％CO₂培养箱中进行悬浮培养。

随着血清使用浓度的降低，DF-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。DF-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，各别细胞呈现出稍稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，DF-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮DF-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明DF-1细胞已经适应了无血清悬浮状态生长，将其命名为DF-1-XF细胞。

实施例2鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备

(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮培养，培养时间为36小时；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；

(2)向悬浮增殖培养36小时的DF-1-XF细胞按照5％(v/V)的接种剂量接种鸡传染性法氏囊病毒H11株(保藏编号为CGMCC NO.6910)；进行病毒增殖培养；接种36小时后收获病毒液；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；经检测，病毒毒价为10^8.45TCID₅₀/ml。

(3)将冻干保护剂与病毒液按1:1的体积比混匀，定量分装迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。

实施例3鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备

(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.3×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为60r/min；

(2)向悬浮增殖培养48小时的DF-1-XF细胞按照1％的接种剂量接种接种鸡传染性法氏囊病毒H11株(保藏编号为CGMCC NO.6910)进行病毒增殖培养；接种12小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为10^5.45TCID₅₀/ml；

(3)将冻干保护剂与病毒液按1:1体积比混匀，定量分装迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。

实施例4鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备

(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为120r/min；

(2)向悬浮增殖培养36小时的DF-1-XF细胞按照2％的接种剂量接种接种鸡传染性法氏囊病毒H11株(保藏编号为CGMCC NO.6910)进行病毒增殖培养；接种24小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为10^6.07TCID₅₀/ml；

(3)将冻干保护剂与病毒液按1:1体积比混匀，定量分装迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。

实施例5鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备

(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为80r/min；

(2)向悬浮增殖培养36小时的DF-1-XF细胞按照10％的接种剂量接种接种鸡传染性法氏囊病毒H11株(保藏编号为CGMCC NO.6910)进行病毒增殖培养；接种48小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为10^5.49TCID₅₀/ml；

(3)将冻干保护剂与病毒液按1:1体积比混匀，定量分装迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。

实施例6鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备

(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；

(2)向悬浮增殖培养36小时的DF-1-XF细胞按照10％的接种剂量接种接种鸡传染性法氏囊病毒H11株(保藏编号为CGMCC NO.6910)进行病毒增殖培养；接种60小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为10^6.12TCID₅₀/ml；

(3)将冻干保护剂与病毒液按1:1体积比混匀，定量分装迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。

试验例1鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备工艺参数优化试验

1.试验方法

1.1细胞悬浮培养条件的优化

1.1.1细胞初始接种密度的优化

将DF-1-XF细胞分别以0.3×10⁶个/ml、0.5×10⁶个/ml和0.75×10⁶个/ml三个初始密度接种于生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。其它悬浮培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速为100r/min。

1.1.2搅拌转速的优化

将DF-1-XF细胞分别以60、80、100和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行DF-1细胞悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。其它悬浮培养条件：血清浓度为1％、细胞初始接种密度0.75×10⁶个/ml、pH为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃。

1.2 IBDV悬浮培养参数确定

1.2.1接毒时间的优化

将DF-1-XF细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养36小时、48小时和60小时按2v/v％接种鸡传染性法氏囊病毒H11株(保藏编号为CGMCCNO.6910)；培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。

1.2.2接毒剂量及收毒时间的优化

将DF-1-XF细胞以0.75×10⁶个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养60小时后，分别以体积比1％、2％、5％和10％的接毒量接种IBDV，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量及收毒时间。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。

2.试验结果

2.1细胞初始接种密度优化结果

将DF-1-XF细胞分别以初始密度为0.3×10⁶cells/ml、0.5×10⁶cells/ml和0.75×10⁶cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，每隔24小时取样计数，结果表明细胞初始接种密度为0.75×10⁶cells/ml，培养48小时细胞密度可3.0×10⁶cells/ml以上，适合大生产需求，结果见表1，因此选择0.75×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度。

表1不同细胞接种密度与悬浮细胞生长速度的关系

2.2搅拌转速的优化

将DF-1-XF细胞分别以60、80、100和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。结果表明当搅拌转速为100r/min时，细胞增殖最快，48小时细胞密度为3.2×10⁶cells/ml，结果见表2。

表2不同搅拌转速与悬浮细胞生长速度的关系

2.3接毒时间的优化

将DF-1-XF细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养36、48和60小时按2v/v％接种IBDV，培养过程中每隔12小时取样，测定病毒含量。结果表明，细胞培养60h后接种IBDV，病毒滴度最高可达10^8.2TCID₅₀/ml，即最佳接毒时间为细胞培养60h，结果见表3。

表3不同接毒时间对病毒含量的影响(TCID₅₀/ml)

2.4接毒剂量及收毒时间的优化

将DF-1-XF细胞以0.75×10⁶个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养60小时后，分别以体积比1％、2％、5％和10％的接毒量接种IBDV，培养过程中每隔12小时取样，测定病毒含量。结果表明，接毒剂量为5％，接种后36h收获，病毒毒价最高可达10^8.45TCID₅₀/ml，即最佳接毒剂量为培养体积的5％，收毒时间为接种后36h，结果见表4。

表4不同接毒剂量对病毒含量的影响(TCID₅₀/ml)

试验例2鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的安全性试验

用7-10日龄SPF雏鸡25只，分成2组。第1组15只，每只点眼、口服接种10羽份疫苗(实施例1所制备的活疫苗)；第2组10只，不接种病毒作为对照，2组分别隔离饲养。观察21日后，均健活，扑杀，剖检，观察法氏囊，无明显变化。

试验例3鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的免疫保护效力试验

用雏鸡检验用7-14日龄SPF雏鸡25只，其中10只鸡每只经点眼、口服接种1/5羽份疫苗(实施例1制备的鸡传染性法氏囊病毒活疫苗)，另15只作为对照，分别隔离饲养，21日后，取全部免疫鸡连同对照组10只鸡，用10个法氏囊最小感染量的强毒BC6-85株点眼0.1ml，5日后，扑杀所有存活鸡和死亡鸡，检查法氏囊变化，免疫鸡法氏囊10只无病变，健康对照鸡法氏囊没有任何变化，攻毒对照鸡应全部有法氏囊病变，并且死亡8只。

Claims (16)

1.将鸡胚成纤维细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，其特征在于，所述的传代鸡胚成纤维细胞的命名是DF-1-XF，其微生物保藏编号是：CGMCC No.16295。

2.权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞在制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗中的应用。

3.一种制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括：（1）将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；（2）向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡传染性法氏囊病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，（3）将收获的病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞按照初始密度为0.3×10⁶cells/ml、0.5×10⁶cells/ml或0.75×10⁶cells/ml的接种密度接种于生物反应器或细胞培养瓶中进行悬浮培养。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞按照初始密度为0.75×10⁶cells/ml的接种密度接种于生物反应器或细胞培养瓶中进行悬浮培养。

6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中在搅拌的条件下进行细胞悬浮增殖培养；其中，所采用的搅拌转速为50-500r/min。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所采用的搅拌转速为60-120r/min。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，所采用的搅拌转速为100r/min。

9.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的细胞悬浮增殖培养的条件还包括：pH值为7.2、溶氧值为50%、培养温度为37℃。

10.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中向悬浮增殖培养36-120小时后的细胞接种鸡传染性法氏囊病毒进行病毒增殖培养。

11.按照权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（2）中向悬浮增殖培养60小时后的细胞接种鸡传染性法氏囊病毒进行病毒增殖培养。

12.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，按照v/v计，按照1-10%的接种比例向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡传染性法氏囊病毒进行病毒增殖培养。

13.按照权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤（2）中按照5%的接种比例向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡传染性法氏囊病毒进行病毒增殖培养。

14.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的病毒增殖培养条件还包括：pH值为7.2、溶氧为50%、培养温度为37℃、搅拌转速为100r/min。

15.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种IBDV病毒进行病毒增殖培养12-60小时收获病毒液。

16.按照权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤（2）中向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡传染性法氏囊病毒进行病毒增殖培养36小时收获病毒液。

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