CN114181305B - 一种犬瘟热病毒h蛋白纳米抗体及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺，涉及纳米抗体技术领域；该犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，包括以下步骤：S1灭活苗免疫双峰驼；S2分离细胞；S3扩增VHH基因及展示载体构建；S4纳米抗体文库的构建以及库容量测定；S5重组噬菌体滴度测定；S6淘选H蛋白特异性重组噬菌体；S7H蛋白特异性重组噬菌体富集；通过将犬瘟热灭活疫苗免疫骆驼后分离其外周血淋巴细胞利用巢氏PCR方法扩增双峰驼的VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术经过淘选，共筛选到3株H蛋白特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与H蛋白特异性反应，具有分子量小、稳定性好、高亲和力的特点。
Description
技术领域
本发明涉及纳米抗体技术领域，具体为一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺。
背景技术
犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬科、鼬科和浣熊科等动物危害最为严重的传染病之一；犬瘟热是泛嗜性病毒，可以感染很多组织和器官，仅通过临床症状观察和病理变化很难对犬瘟热进行确诊；犬瘟热基因组编码核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质膜蛋白（M）、大蛋白（L）、融合蛋白（F）和血凝蛋白（H）6个蛋白，而H蛋白是犬瘟热感染细胞过程中侵袭宿主所必需的，也是产生中和抗体的主要抗原，同时也是变异最大的结构抗原。
目前现有的针对犬瘟热结构蛋白的抗体以单克隆抗体和多克隆抗体为主，单克隆抗体分子量大，不易识别隐藏表位，生产成本高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺，解决了现有的针对犬瘟热H蛋白的抗体生产成本高，表达系统繁琐复杂等问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，所述纳米抗体以H蛋白作为靶标，所述H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述纳米抗体由DNA分子编码制成，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
优选的，一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，包括以下步骤：
S1.灭活苗免疫双峰驼
将2～3mL犬瘟热灭活疫苗注射于双峰骆驼颈部，注射方式为皮下注射，每次免疫注射间隔期为两周，第五次免疫注射后使用注射器在双峰驼颈部静脉处采集外周血100mL；
S2.分离细胞
向离心管内加入2～3mL的血液和2～3mL的PBS溶液吹打混匀进行稀释，再取一个新的离心管并向内滴加3～5mL的ficoll分离液，再将稀释后的血液轻缓的滴加至离心管内，使得混合血液层位于ficoll分离液上层，将离心管放入离心机内，以300～500xg的离心加速度进行离心25～40min，离心温度为18～25℃，离心结束后首先吸取离心管内上层的血浆层，再吸取中间的白膜层，白膜层即为淋巴细胞，血浆层为血清；
S3.扩增VHH基因及展示载体构建
将采集的100mL外周血装入抗凝血采血袋中，并加入相同体积的细胞培养基稀释好的血液，外周血淋巴细胞使用RNA提取试剂盒进行RNA提取，以提取的RNA作为模板，使用巢氏PCR方法进行第一轮扩增，胶回收700～750bp附近的条带，再以cDNA作为模板进行第二步扩增VHH基因，将第二轮PCR产物放入电泳仪内进行电泳，切去400～450bp附近的条带，使用胶回收试剂盒回收PCR产物，选择Pst I和Not I对酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切16～18h后，使用DNA连接酶将VHH连接至 pCANTAB 5E载体；
S4.纳米抗体文库的构建以及库容量测定
将S3步骤的连接产物通过电转化至TGI感受态细胞中，转化结束后加入10～13mL预热的SOC培养基置于37～40℃的摇床中以220～250rpm培养1～2h，培养结束后取出50～60μL的菌体均匀涂抹在LB/Amp-GLU固体平板上将固体平板倒置放在培养箱内，以37～40℃的温度培养6～8h，培养结束后用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，装入有浓度为50%的甘油瓶内，密封保存在-80～-85℃的冷冻设备中，取出1～2mL菌液涂抹在固定平板上，放入培养箱内培养12～14h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，并进行菌液PCR鉴定；
S5.重组噬菌体滴度测定
在甘油瓶内取出1～2mL的文库菌液放入2 × TY/Amp-GLU培养基中，将培养基置于摇床内培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，培养基37℃静置30～45min，400～500g离心15～30min后去除上层清液，再加入2 ×TY/Amp-Kan培养基重悬菌体，220～250r/min的转速培养14～16h，然后再以12000g离心5min后取出上层清液，加入2～4mL的PEG溶液，4℃静置6～8h，12000～13000g离心5～10min后加入1～2mLPBS重悬液；蘸取TG1菌液均匀涂抹与M9平板上，37℃培养40～48h后，挑取单菌落培养至对数期，使用2 × TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9和10-10的样品100～120 µL加入到200～250 µL的TG1菌液中，在37℃的温度下静置30～45min后，均匀涂抹于LB/Amp-GLU平板上，37℃培养8～10h;
S6.淘选H蛋白特异性重组噬菌体
将ELISA板内每孔包被10μgH蛋白，对照孔内包被PBS溶液，并加入100μL3%的BSA溶液，在室温条件下封闭1～2h，再使用PBS溶液对板材冲洗4次，将噬菌体稀释至5×1011pfu/ml，洗板结束后加入100～150μL的0.1M的三乙胺，将板材置于通风橱内静置10～15min后，加入100～150μL的1M Tris-HCl进行中和，中和后pH值为7.4，测定洗脱下来的噬菌体滴度，取2～4mL对数生长期的TG1菌液，加入100～120μL的噬菌体溶液混匀，37℃的培养箱内放置30～45min后，立即加入8～10mL的2×TY/Amp-GLU培养基，并置于摇床中培养至对数生长期；取40～45μL的M13K07辅助噬菌体加入到培养基内浸染1～2h，再将培养基内液体放入离心机内以1500～1800r/min的转速离心5～10min，离心后使用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床内培养12～14h，重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程；
S7.H蛋白特异性重组噬菌体富集
取第三轮噬菌体洗脱液100μL，涂抹于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导过夜表达，12000g离心10～15min后收集菌体，置于-80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μLPBS溶液12000g/min的转速离心5min后收集上层清液，将ELISA板内每孔包被H蛋白400～450ng，在4～6℃的温度条件下放置8～12h，3%的BSA封闭1～2h；使用PBS’T溶液洗涤三次，每孔加入100μL十倍稀释的上层清液，孵育1h，再次洗板三次后加入1：3000稀释的抗M13噬菌体单克隆抗体100μL，在25～30℃下孵育1～1.5h后，使用PBS’T洗板3次，加入TMB显色液静置15～20min显色，向每孔内加入50～100μL的3M硫酸终止，使用分光光度计读取吸光度。
本发明提供了一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺，具备以下有益效果：
本发明通过将犬瘟热灭活疫苗免疫骆驼后分离其外周血淋巴细胞利用巢氏PCR方法扩增双峰驼的VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术经过淘选，共筛选到3株H蛋白特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与H蛋白特异性反应，其中H蛋白纳米抗体有较强的结合力，本发明制备的纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势，并且可通过原核表达系统制备仍具有生物学活性，能特异性识别犬瘟热病毒H蛋白，较常规单克隆抗体用途更广，成本低廉可大量制备，同时可避免与其他病毒蛋白发生交叉反应，值得大力推广。
附图说明
图1为本发明的骆驼血血清抗体效价示意图；
图2为本发明的展示文库的构建与鉴定示意图；
图3为本发明的VHH效价示意图；
图4为本发明的VHH特异性检测示意图；
图5为本发明的Nb2表达及纯化示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
如图2所示，本发明实施例提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，纳米抗体以H蛋白作为靶标，H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
纳米抗体由DNA分子编码制成，DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，包括以下步骤：
S1.灭活苗免疫双峰驼
将3mL犬瘟热灭活疫苗注射于双峰骆驼颈部，注射方式为皮下注射，每次免疫注射间隔期为两周，第五次免疫注射后使用注射器在双峰驼颈部静脉处采集外周血100mL；
S2.分离细胞
向离心管内加入3mL的血液和3mL的PBS溶液吹打混匀进行稀释，再取一个新的离心管并向内滴加5mL的ficoll分离液，再将稀释后的血液轻缓的滴加至离心管内，使得混合血液层位于ficoll分离液上层，将离心管放入离心机内，以500g的离心加速度进行离心40min，离心温度为25℃，离心结束后首先吸取离心管内上层的血浆层，再吸取中间的白膜层，白膜层即为淋巴细胞，血浆层为血清；
S3.扩增VHH基因及展示载体构建
将采集的100mL外周血装入抗凝血采血袋中，并加入相同体积的细胞培养基稀释好的血液，外周血淋巴细胞使用RNA提取试剂盒进行RNA提取，以提取的RNA作为模板，使用巢氏PCR方法进行第一轮扩增，胶回收750bp附近的条带，如图2中A所示，再以cDNA作为模板进行第二步扩增VHH基因，将第二轮PCR产物放入电泳仪内进行电泳，切去450bp附近的条带，如图2中B所示，使用胶回收试剂盒回收PCR产物，选择Pst I和Not I对酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切18h后，使用DNA连接酶将VHH连接至pCANTAB 5E载体；
S4.纳米抗体文库的构建以及库容量测定
将S3步骤的连接产物通过电转化至TGI感受态细胞中，转化结束后加入13mL预热的SOC培养基置于40℃的摇床中以250rpm培养2h，培养结束后取出60μL的菌体均匀涂抹在LB/Amp-GLU固体平板上将固体平板倒置放在培养箱内，以40℃的温度培养8h，培养结束后用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，装入有浓度为50%的甘油瓶内，密封保存在-85℃的冷冻设备中，取出2mL菌液涂抹在固定平板上，放入培养箱内培养14h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，并进行菌液PCR鉴定，如图2中C所示；
S5.重组噬菌体滴度测定
在甘油瓶内取出2mL的文库菌液放入2 × TY/Amp-GLU培养基中，将培养基置于摇床内培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，培养基37℃静置45min，500g离心30min后去除上层清液，再加入2 ×TY/Amp-Kan培养基重悬菌体，250r/min的转速培养16h，然后再以12000g离心5min后取出上层清液，加入4mL的PEG溶液，4℃静置8h，13000g离心10min后加入2mLPBS重悬液；蘸取TG1菌液均匀涂抹与M9平板上，37℃培养48h后，挑取单菌落培养至对数期，使用2 × TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9和10-10的样品120µL加入到250µL的TG1菌液中，在37℃的温度下静置45min后，均匀涂抹于LB/Amp-GLU平板上，37℃培养10h；
S6.淘选H蛋白特异性重组噬菌体
将ELISA板内每孔包被10μgH蛋白，对照孔内包被PBS溶液，并加入100μL3%的BSA溶液，在室温条件下封闭2h，再使用PBS溶液对板材冲洗4次，将噬菌体稀释至5×1011 pfu/ml，洗板结束后加入150μL的0.1M的三乙胺，将板材置于通风橱内静置15min后，加入150μL的1MTris-HCl进行中和，中和后pH值为7.4，测定洗脱下来的噬菌体滴度，取4mL对数生长期的TG1菌液，加入120μL的噬菌体溶液混匀，37℃的培养箱内放置45min后，立即加入10mL的2×TY/Amp-GLU培养基，并置于摇床中培养至对数生长期；取45μL的M13K07辅助噬菌体加入到培养基内浸染2h，再将培养基内液体放入离心机内以1800r/min的转速离心10min，离心后使用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床内培养14h，重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程；
S7.H蛋白特异性重组噬菌体富集
取第三轮噬菌体洗脱液100μL，涂抹于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导过夜表达，12000g离心15min后收集菌体，置于-80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μLPBS溶液12000g/min的转速离心5min后收集上层清液，将ELISA板内每孔包被H蛋白450ng，在6℃的温度条件下放置12h，3%的BSA封闭2h；使用PBS’T溶液洗涤三次，每孔加入100μL十倍稀释的上层清液，孵育1h，再次洗板三次后加入1：3000稀释的抗M13噬菌体单克隆抗体100μL，在30℃下孵育1.5h后，使用PBS’T洗板3次，加入TMB显色液静置20min显色，向每孔内加入100μL的3M硫酸终止，使用分光光度计读取吸光度。
通过将犬瘟热灭活疫苗免疫骆驼后分离其外周血淋巴细胞利用巢氏PCR方法扩增双峰驼的VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术经过淘选，共筛选到3株H蛋白特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与H蛋白特异性反应，其中H蛋白纳米抗体有较强的结合力，本发明制备的纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势，并且可通过原核表达系统制备仍具有生物学活性，能特异性识别犬瘟热病毒H蛋白，较常规单克隆抗体用途更广，成本低廉可大量制备，同时可避免与其他病毒蛋白发生交叉反应。
实施例二：
如图2所示，本发明实施例提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，纳米抗体以H蛋白作为靶标，H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
纳米抗体由DNA分子编码制成，DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，包括以下步骤：
S1.灭活苗免疫双峰驼
将2mL犬瘟热灭活疫苗注射于双峰骆驼颈部，注射方式为皮下注射，每次免疫注射间隔期为两周，第五次免疫注射后使用注射器在双峰驼颈部静脉处采集外周血100mL；
S2.分离细胞
向离心管内加入2mL的血液和2mL的PBS溶液吹打混匀进行稀释，再取一个新的离心管并向内滴加3mL的ficoll分离液，再将稀释后的血液轻缓的滴加至离心管内，使得混合血液层位于ficoll分离液上层，将离心管放入离心机内，以300g的离心加速度进行离心25min，离心温度为18℃，离心结束后首先吸取离心管内上层的血浆层，再吸取中间的白膜层，白膜层即为淋巴细胞，血浆层为血清；
S3.扩增VHH基因及展示载体构建
将采集的100mL外周血装入抗凝血采血袋中，并加入相同体积的细胞培养基稀释好的血液，外周血淋巴细胞使用RNA提取试剂盒进行RNA提取，以提取的RNA作为模板，使用巢氏PCR方法进行第一轮扩增，胶回收700bp附近的条带，如图2中A所示，再以cDNA作为模板进行第二步扩增VHH基因，将第二轮PCR产物放入电泳仪内进行电泳，切去400bp附近的条带，如图2中B所示，使用胶回收试剂盒回收PCR产物，选择Pst I和Not I对酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切16h后，使用DNA连接酶将VHH连接至pCANTAB 5E载体；
S4.纳米抗体文库的构建以及库容量测定
将S3步骤的连接产物通过电转化至TGI感受态细胞中，转化结束后加入10mL预热的SOC培养基置于37℃的摇床中以220rpm培养1h，培养结束后取出50μL的菌体均匀涂抹在LB/Amp-GLU固体平板上将固体平板倒置放在培养箱内，以37℃的温度培养6h，培养结束后用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，装入有浓度为50%的甘油瓶内，密封保存在-80℃的冷冻设备中，取出1mL菌液涂抹在固定平板上，放入培养箱内培养12h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，并进行菌液PCR鉴定，如图2中C所示；
S5.重组噬菌体滴度测定
在甘油瓶内取出1mL的文库菌液放入2 × TY/Amp-GLU培养基中，将培养基置于摇床内培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，培养基37℃静置30min，400g离心15min后去除上层清液，再加入2 ×TY/Amp-Kan培养基重悬菌体，220r/min的转速培养14h，然后再以12000g离心5min后取出上层清液，加入2mL的PEG溶液，4℃静置6h，12000g离心5min后加入1mLPBS重悬液；蘸取TG1菌液均匀涂抹与M9平板上，37℃培养40h后，挑取单菌落培养至对数期，使用2 × TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9和10-10的样品100µL加入到200µL的TG1菌液中，在37℃的温度下静置30min后，均匀涂抹于LB/Amp-GLU平板上，37℃培养8h；
S6.淘选H蛋白特异性重组噬菌体
将ELISA板内每孔包被10μgH蛋白，对照孔内包被PBS溶液，并加入100μL3%的BSA溶液，在室温条件下封闭1h，再使用PBS溶液对板材冲洗4次，将噬菌体稀释至5×1011 pfu/ml，洗板结束后加入100μL的0.1M的三乙胺，将板材置于通风橱内静置10min后，加入100μL的1MTris-HCl进行中和，中和后pH值为7.4，测定洗脱下来的噬菌体滴度，取2mL对数生长期的TG1菌液，加入100μL的噬菌体溶液混匀，37℃的培养箱内放置30min后，立即加入8mL的2×TY/Amp-GLU培养基，并置于摇床中培养至对数生长期；取40μL的M13K07辅助噬菌体加入到培养基内浸染1h，再将培养基内液体放入离心机内以1500r/min的转速离心5min，离心后使用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床内培养12h，重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程；
S7.H蛋白特异性重组噬菌体富集
取第三轮噬菌体洗脱液100μL，涂抹于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导过夜表达，12000g离心10min后收集菌体，置于-80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μLPBS溶液12000g/min的转速离心5min后收集上层清液，将ELISA板内每孔包被H蛋白400ng，在4℃的温度条件下放置8h，3%的BSA封闭1h；使用PBS’T溶液洗涤三次，每孔加入100μL十倍稀释的上层清液，孵育1h，再次洗板三次后加入1：3000稀释的抗M13噬菌体单克隆抗体100μL，在25℃下孵育1h后，使用PBS’T洗板3次，加入TMB显色液静置15min显色，向每孔内加入50μL的3M硫酸终止，使用分光光度计读取吸光度。
通过将犬瘟热灭活疫苗免疫骆驼后分离其外周血淋巴细胞利用巢氏PCR方法扩增双峰驼的VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术经过淘选，共筛选到3株H蛋白特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与H蛋白特异性反应，其中H蛋白纳米抗体有较强的结合力，本发明制备的纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势，并且可通过原核表达系统制备仍具有生物学活性，能特异性识别犬瘟热病毒H蛋白，较常规单克隆抗体用途更广，成本低廉可大量制备，同时可避免与其他病毒蛋白发生交叉反应。
实施例三：
如图2所示，本发明实施例提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，纳米抗体以H蛋白作为靶标，H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
纳米抗体由DNA分子编码制成，DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，包括以下步骤：
S1.灭活苗免疫双峰驼
将2.5mL犬瘟热灭活疫苗注射于双峰骆驼颈部，注射方式为皮下注射，每次免疫注射间隔期为两周，第五次免疫注射后使用注射器在双峰驼颈部静脉处采集外周血100mL；
S2.分离细胞
向离心管内加入2.5mL的血液和2.5mL的PBS溶液吹打混匀进行稀释，再取一个新的离心管并向内滴加4mL的ficoll分离液，再将稀释后的血液轻缓的滴加至离心管内，使得混合血液层位于ficoll分离液上层，将离心管放入离心机内，以400g的离心加速度进行离心32min，离心温度为21℃，离心结束后首先吸取离心管内上层的血浆层，再吸取中间的白膜层，白膜层即为淋巴细胞，血浆层为血清；
S3.扩增VHH基因及展示载体构建
将采集的100mL外周血装入抗凝血采血袋中，并加入相同体积的细胞培养基稀释好的血液，外周血淋巴细胞使用RNA提取试剂盒进行RNA提取，以提取的RNA作为模板，使用巢氏PCR方法进行第一轮扩增，胶回收725bp附近的条带，如图2中A所示，再以cDNA作为模板进行第二步扩增VHH基因，将第二轮PCR产物放入电泳仪内进行电泳，切去425bp附近的条带，如图2中B所示，使用胶回收试剂盒回收PCR产物，选择Pst I和Not I对酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切17h后，使用DNA连接酶将VHH连接至pCANTAB 5E载体；
S4.纳米抗体文库的构建以及库容量测定
将S3步骤的连接产物通过电转化至TGI感受态细胞中，转化结束后加入11.5mL预热的SOC培养基置于38.5℃的摇床中以235rpm培养1.5h，培养结束后取出55μL的菌体均匀涂抹在LB/Amp-GLU固体平板上将固体平板倒置放在培养箱内，以38.5℃的温度培养7h，培养结束后用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，装入有浓度为50%的甘油瓶内，密封保存在-82.5℃的冷冻设备中，取出1.5mL菌液涂抹在固定平板上，放入培养箱内培养13h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，并进行菌液PCR鉴定，如图2中C所示；
S5.重组噬菌体滴度测定
在甘油瓶内取出1.5mL的文库菌液放入2 × TY/Amp-GLU培养基中，将培养基置于摇床内培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，培养基37℃静置37min，450g离心27min后去除上层清液，再加入2 ×TY/Amp-Kan培养基重悬菌体，235r/min的转速培养15h，然后再以12000g离心5min后取出上层清液，加入3mL的PEG溶液，4℃静置7h，12500g离心7.5min后加入1.5mLPBS重悬液；蘸取TG1菌液均匀涂抹与M9平板上，37℃培养44h后，挑取单菌落培养至对数期，使用2 × TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9和10-10的样品110µL加入到225µL的 TG1菌液中，在37℃的温度下静置37.5min后，均匀涂抹于LB/Amp-GLU平板上，37℃培养9h;
S6.淘选H蛋白特异性重组噬菌体
将ELISA板内每孔包被10μgH蛋白，对照孔内包被PBS溶液，并加入100μL3%的BSA溶液，在室温条件下封闭1.5h，再使用PBS溶液对板材冲洗4次，将噬菌体稀释至5×1011 pfu/ml，洗板结束后加入125μL的0.1M的三乙胺，将板材置于通风橱内静置12.5min后，加入125μL的1M Tris-HCl进行中和，中和后pH值为7.4，测定洗脱下来的噬菌体滴度，取3mL对数生长期的TG1菌液，加入110μL的噬菌体溶液混匀，37℃的培养箱内放置37.5min后，立即加入9mL的2×TY/Amp-GLU培养基，并置于摇床中培养至对数生长期；取42.5μL的M13K07辅助噬菌体加入到培养基内浸染1.5h，再将培养基内液体放入离心机内以1650r/min的转速离心7.5min，离心后使用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床内培养13h，重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程；
S7.H蛋白特异性重组噬菌体富集
取第三轮噬菌体洗脱液100μL，涂抹于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导过夜表达，12000g离心12.5min后收集菌体，置于-80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μLPBS溶液12000g/min的转速离心5min后收集上层清液，将ELISA板内每孔包被H蛋白425ng，在5℃的温度条件下放置10h，3%的BSA封闭1.5h；使用PBS’T溶液洗涤三次，每孔加入100μL十倍稀释的上层清液，孵育1h，再次洗板三次后加入1：3000稀释的抗M13噬菌体单克隆抗体100μL，在27.5℃下孵育1.25h后，使用PBS’T洗板3次，加入TMB显色液静置17.5min显色，向每孔内加入75μL的3M硫酸终止，使用分光光度计读取吸光度。
通过将犬瘟热灭活疫苗免疫骆驼后分离其外周血淋巴细胞利用巢氏PCR方法扩增双峰驼的VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术经过淘选，共筛选到3株H蛋白特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与H蛋白特异性反应，其中H蛋白纳米抗体有较强的结合力，本发明制备的纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势，并且可通过原核表达系统制备仍具有生物学活性，能特异性识别犬瘟热病毒H蛋白，较常规单克隆抗体用途更广，成本低廉可大量制备，同时可避免与其他病毒蛋白发生交叉反应。
实施例四：
如图1所示，本发明实施例提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，H蛋白抗体效价测定方法如下：将S2步骤分离出的血清用于检测针对N蛋白的抗体效价，使用未免疫前血清作对照，通过间接ELISA检测，血清中抗H蛋白的抗体效价可达1:320000，图1中的横坐标为骆驼血清稀释比例，纵坐标为OD450nm的吸光度。
实施例五：
如图3-4所示，本发明实施例提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，H蛋白重组纳米抗体的ELISA检测方法，H蛋白包被400ng每孔，使用PRRSV-N蛋白作为对照蛋白，使用PBS’T溶液洗3次后，加入200 µL 3%BSA，在室温下封闭1 h，然后洗去封闭液，再向孔内加入稀释好的纳米抗体粗提物100μL，在25℃下孵育1h，在PBS’T洗涤结束后，加入100 μL Mouse@E-tag（1:2000）的抗体并置于室温下孵育1 h，洗板三次后加入100μLHRP标记的羊抗鼠的 IgG（1:5000），洗板结束后每孔加入100µL TMB显色液避光显色15min。
反应后加入50μL 3M硫酸终止，读取OD450nm吸光值。
将实验孔比对照孔数值高三倍以上的孔记录，对应的阳性的克隆测序后根据其CDR区域将序列分类，48个阳性克隆含有3株高变区序列不同的纳米抗体，用ELISA鉴定纳米抗体的特异性和效价，纳米抗体效价及抗体特异性如图3和4所示。
实施例六：
如图5所示，本发明实施例提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，Nb2表达载体的构建及表达方法，将Nb2的基因克隆至pET25b，通过双酶切和胶回收、连接、转化，以及菌液PCR鉴定重组质粒的构建情况，Ni柱纯化后进行SDS-PAGE后蓝染观察，结果如图5所示，表明Nb2成功表达。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 山东畜牧兽医职业学院
<120> 一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr Arg Gly Tyr Asp Gly Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactcgagtg ggtctcaagt atttctggtg gtggtgggag cacagactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa cacgctgttt 240
ctacaattga acagcctgaa aactgaggac acggccgtgt attactgtgc aaaagcaacc 300
ttatctgcct actatagagg atatgacgga gggtctcggg gcccggggac ccaggtcacc 360
gtctcctca 369
Claims (2)
1.一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体以H蛋白作为靶标，所述H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体由DNA分子编码制成，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
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