CN101376909A - 区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点，融合反转录－聚合酶链式反应(RT－PCR)和限制性内切酶分析(RFLP)两种分子生物学检测方法，选择CDV NP基因，设计特异引物扩增829bp，再利用BamHI RFLP处理该片段，经琼脂糖凝胶电泳判定，通过片段的数目鉴别动物体内检测到的犬瘟热病毒属于接种的疫苗株还是感染了野毒，电泳得到675bp和153bp 2条片段为疫苗株，得到455bp、220bp和153bp 3条片段为野毒株。有效区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株，为毛皮动物的养殖提供兽医技术保证。

Description

区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点

技术领域：

本发明涉及一种区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点，是融合反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和限制性内切酶分析(RFLP)两种常规分子生物学鉴定检测方法的发明，选择特异的核酸片段和一种限制性内切酶，有效地鉴别犬瘟热病毒的接种疫苗株和感染野毒株。

背景技术：

中和试验、免疫荧光抗体技术、酶联免疫吸附测定等方法已经在犬瘟热的诊断中发挥了作用。另外，电镜诊断法与上述方法相比较，其检出率有显著的一致性。虽然上述方法取得了一定的效果，但有的耗时较长，有的敏感性、特异性或准确性较差，不能及时确诊。近年来，随着核酸杂交、PCR等技术的应用，犬瘟热的诊断也进入了分子生物学阶段。核酸探针、原位杂交、RT-PCR以及基因序列分析等方法建立之后，就可对病料中是否含有CDV特异性核酸进行鉴定，从而提高了犬瘟热诊断的准确性、敏感性和特异性。尽管目前犬瘟热疫苗灭活苗可以保护大多数免疫动物不被感染发病，但也存在野毒感染发病的危险。由于疫苗在动物体内存在一定的半衰期，临床上发病初期检测疫苗免疫动物时，检测到的犬瘟热病毒是疫苗残存还是感染野毒，还难以确定，从而没有更好的治疗和综合防治措施。因此，区分疫苗株和野毒株就显得尤为重要。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点，有效区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株，为毛皮动物的养殖提供兽医技术保证。

本发明的技术方案是这样实现的：区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点，其特征在于：在CDV犬瘟热结构蛋白核蛋白NP基因的372-1200位之间，设计引物(P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC 3’，P2：5‘CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT 3’)RT-PCR扩增特异性片段829bp，并进行BamHI RFLP分析，可以通过扩增片段的酶切图谱的条带数目来确定所检测到的CDV属于疫苗株还是野毒株；酶切NP基因目的片段，琼脂糖凝胶电泳得到675bp和153bp 2条带者为疫苗株，得到455bp、220bp和153bp 3条带者为野毒株。

本发明的积极效果是：鉴定方法简单，准确率和效率都很高；河北肃宁某狐狸养殖场送检的发病狐狸，我们检测犬瘟热阳性，利用该方法扩增到目的片段829bp片段，并进行RFLP分析，得出该场狐狸感染了野毒，此过程在6个小时内完成。建议他们隔离发病动物，紧急接种犬瘟热疫苗，病情得到了很好控制。后来我们进一步用核酸测序的方法验证该扩增序列确实为CDV NP基因中我们选择的目的序列，并且在预计位点处有预期分析的酶切位点。现在已经有此种实例23例，其中5个国内外使用的疫苗株，18个不同地区临床感染野毒实例。选择5个疫苗株及有代表性的5个野毒株列举测序结果，见序列表。根据我们选择的序列和酶切位点，可在送检病料当天6小时内得出结果，确定动物体内检测到的犬瘟热病毒类型。

附图说明：

图1为区别犬瘟热疫苗株和野毒株的扩增片段电泳图，野毒株来自2005-2007年间收集的部分犬瘟热阳性组织病料，疫苗株为收集的国内外临床上使用的疫苗株；1、19为100bp Ladder DNA Marker；2～14为扩增病料结果，其中2、3、4、5、7、9、12为犬瘟热阳性；15～18为收集的国内外犬瘟热疫苗株扩增条带。

图2为区别犬瘟热疫苗株和野毒株的扩增片段的酶切鉴定电泳图，M为100bp Ladder DNA Marker；1～4为发病脏器中扩增的829bp目的片段RFLP分析结果，得到3条带：455bp、220bp和153bp，属于CDV野毒株；5～8为收集的几种国内外犬瘟热疫苗株扩增的目的产物RFLP分析结果，得到2条带：675bp和153bp。

具体实施方式：

下面实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1：

1、引物的设计与合成：

设计合成一对引物P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC3’，P2：5‘CTTGGATGCT ATTTC TGACA CT 3’，预期扩增目的片段大小为829bp。将特产研究所疫苗株CDV3株中CDV NP基因829片段扩增。

2、病毒RNA制备采用invitrogen公司的Trizol试剂提取RNA。主要步骤为：(1)无菌取发病动物的内脏或血液，内脏要加1：1的PBS进行研磨；(2)取250μl研磨悬液先后加入750μl Trizol和200μl氯仿，剧烈振荡混匀15s，4℃14000rpm离心15min。(3)取出上清转移至一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温沉淀10分钟，4℃14000rpm离心10min。(4)倒去液体，加入1ml 75％乙醇；颠倒几次，8500rpm离心5min。(5)弃去上清，用滤纸沾干残留部分，室温晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的RNA可直接用于RT-PCR反应，也可保存于-70℃备用。

3、RT-PCR反应

RT：20μl反转录体系中，反转录引物P2 1μl，RNA 5μl，70℃加热10min，冰浴10min；再加入5倍PCR buffer 4μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，RNasin0.5μl，AMV反转录酶1μl，DEPC H₂O 6.5μl，充分混合后离心，经42℃60min，95℃灭活AMV反转录酶，立即于冰上冷却，进入PCR。PCR：反转录产物5μl，10倍PCR buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP4μl，P1、P2各1μl，rTaq DNA Polymerase 1μl，加水补足50μl。优化PCR循环参数，确定PCR的最佳反应程序为：94℃ 45s，51.6℃ 45s，72℃ 45s，30个循环后，72℃延伸5min。取5μl PCR产物，以100bp Ladder作对照，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

4、RFLP鉴定

将扩增得到的片段经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，进行酶切反应，20μ体系中包含：2μl 10×buffer，1μl BamHI限制性内切酶，6μl PCR产物，11μl灭菌去离子水。混匀，37℃水浴1~1.5小时，加入1/10的10倍Loading buffer，琼脂糖凝胶电泳观察结果。判定检测的样品病毒所属类型，2条带为疫苗株。

5、目的片段验证测序

根据上述方法经测序在下列序列表中标注的BamHI位于153位，为内切酶。

TTCTGAGGCAGATGAGTTCTTCAAAATTGTAGACGAAGGGTCGAAAGCTCAAGGGCAATTAGGCTGGTTGGAGAATAAGGATATAGTAGACATAGAAGTTGATGATGCTGAGCAATTCAATATATTACTAGCTTCCATCTTGGCTCAAATTTTGCTAGCTAAAGCGGTGACTGCTCCTGATACTGCAGCCGACTCGGAGATGAGAAGGTGGATTAAGTATACCCAGCAAAGACGTGTGGTCGGAGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACCTATCTTTGAGGCGATTCATGGTGGCACTCATTTTGGACATCAAAAGATCCCCAGGGAACAATCCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTGTGGAAGCTGGGTTAGCTAGTTTCATCCTAACTATCAAGTTTGGCATTGAAACTATGTATCCGGCTCTTGGGTTGCATGAGTTTTCCGGAGAATTAACAACTATTGAATCCCTCATGATGCTATATCAACAGATGGGTGAAACAGCACCATACATGGTTATCTTGGAAAACTCTGTTCAAAACAAATTTAGTGCAGGGTCCTACCCATTGCTCTGGAGTTATGCTATGGGGGTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCCATGGGAGGATTAAATTTCGGTCGATCTTACTTTGACCCAGCCTACTTCAGACTCGGGCAAGAAATGGTTAGACGATCTGCCGGCAAAGTAAGCTCCGCACTTGCTGCCGAGCTTGGCATCACCAAgGAGGAAGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG

实施例2：

1、引物的设计与合成：

设计合成一对引物P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC 3’，P2：5‘CTTGGATGCT ATTTC TGACA CT 3’，预期扩增目的片段大小为829bp。将法国维克公司联苗中Ondersterpoort株中CDV NP基因829片段扩增。

2、病毒RNA制备采用invitrogen公司的Trizol试剂提取RNA。主要步骤为：(1)无菌取发病动物的内脏或血液，内脏要加1：1的PBS进行研磨；(2)取250μl研磨悬液先后加入750μl Trizol和200μl氯仿，剧烈振荡混匀15s，4℃14000rpm离心15min。(3)取出上清转移至一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温沉淀10分钟，4℃14000rpm离心10min。(4)倒去液体，加入1ml 75％乙醇；颠倒几次，8500rpm离心5min。(5)弃去上清，用滤纸沾干残留部分，室温晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的RNA可直接用于RT-PCR反应，也可保存于-70℃备用。

3、RT-PCR反应

RT：20μl反转录体系中，反转录引物P2 1μl，RNA5μl，70℃加热10min，冰浴10min；再加入5倍PCR buffer 4μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，RNaisn0.5μl，AMV反转录酶1μl，DEPCH₂O6.5μl，充分混合后离心，经42℃60min，95℃灭活AMV反转录酶，立即于冰上冷却，进入PCR。

PCR：反转录产物5μl，10倍PCR buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP4μl，P1、P2各1μl，rTaq DNA Polymerase 1μl，加水补足50μl。优化PCR循环参数，确定PCR的最佳反应程序为：94℃ 45s，51.6℃ 45s，72℃ 45s，30个循环后，72℃延伸5min。取5μl PCR产物，以100bp Ladder作对照，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

4、RFLP鉴定

将扩增得到的片段经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，进行酶切反应，20μ体系中包含：2μl 10×buffer，1μl BamHI限制性内切酶，6μl PCR产物，11μl灭菌去离子水。混匀，37℃水浴1~1.5小时，加入1/10的10倍Loadingbuffer，琼脂糖凝胶电泳观察结果。判定检测的样品病毒所属类型，2条带为疫苗株。

5、目的片段验证测序

根据上述方法经测序在下列序列表中标注的BamHI位于153位，为内切酶。

TTCTGAGGCAGATGAGttCTTCAAAATTGTAGACGAAGGGTCGAAAGCTCAAGGGCAATTAGGCTGGTTAGAGAATAAGGATATAGTAGACATAGAAGTTGATAATGCTGAGCAATTCAATATATTGCTAGCTTCCATCTTGGCTCAAATTT

TGCTAGCTAAAGCGGTGACTGCTCCTGATACTGCAGCCGACTCGGAGATGAGAAGGTGGATTAAGTATACCCAGCAAAGACGTGTGGTCGGAGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACCTATCTTTGAGGCGATTCATGGTGGCGCTCATATTGGACATCAAACGATCCCCAGGGAACAAGCCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTGTGGAAGCTGGGTTAGCTAGTTTCATCCTAACTATCAAGTTTGGCATTGAAACTATGTATCCGGCTCTTGGGTTGCATGAGTTTTCCGGAGAATTAACAACTATTGAATCCCTCATGATGCTATATCAACAGATGGGTGAAACAGCACCGTACATGGTTATCTTGGAAAACTCTGTTCAAAACAAATTTAGTGCAGGGTCCTACCCATTGCTCTGGAGTTATGCTATGGGGGTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCCATGGGAGGGTTAAATTTCGGTCGATCTTACTTTGACCCAGCTTACTTCAGACTCGGGCAAGAAATGGTTAGGAGATCTGCCGGCAAAGTAAGCTCTGCACTTGCCGCCGAGCTTGGCATCACCAAGGAGGAAGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG

实施例3：

1、引物的设计与合成：

设计合成一对引物P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC 3’，P2：5‘CTTGG ATGCTATTTC TGACA CT3’，预期扩增目的片段大小为829bp。将来自河北昌黎貉HCL07株中CDVNP基因829片段扩增。

2、病毒RNA制备采用invitrogen公司的Trizol试剂提取RNA。主要步骤为：(1)无菌取发病动物的内脏或血液，内脏要加1：1的PBS进行研磨；(2)取250μl研磨悬液先后加入750μl Trizol和200μl氯仿，剧烈振荡混匀15s，4℃14000rpm离心15min。(3)取出上清转移至一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温沉淀10分钟，4℃14000rpm离心10min。(4)倒去液体，加入1ml 75％乙醇；颠倒几次，8500rpm离心5min。(5)弃去上清，用滤纸沾干残留部分，室温晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的RNA可直接用于RT-PCR反应，也可保存于-70℃备用。

3、RT-PCR反应

RT：20μl反转录体系中，反转录引物P2 1μl，RNA 5μl，70℃加热10min，冰浴10min；再加入5倍PCR buffer 4μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，RNaisn0.5μl，AMV反转录酶1μl，DEPC H₂O 6.5μl，充分混合后离心，经42℃60min，95℃灭活AMV反转录酶，立即于冰上冷却，进入PCR。

PCR：反转录产物5μl，10倍PCR buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP4μl，P1、P2各1μl，rTaq DNA Polymerase 1μl，加水补足50μl。优化PCR循环参数，确定PCR的最佳反应程序为：94℃ 45s，51.6℃ 45s，72℃ 45s，30个循环后，72℃延伸5min。取5μl PCR产物，以100bp Ladder作对照，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

4、RFLP鉴定

将扩增得到的片段经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，进行酶切反应，20μl体系中包含：2μl 10×buffer，1μl BamHI限制性内切酶，6μl PCR产物，11μl灭菌去离子水。混匀，37℃水浴1~1.5小时，加入1/10的10倍Loadingbuffer，琼脂糖凝胶电泳观察结果。判定检测的样品病毒所属类型，3条带为野毒株。

5、目的片段验证测序

根据上述方法经测序在下列序列表中标注的BamHI位于153位和608位为内切酶。

TTCTGAGGCAGATGAGtTCTTCAAAATTGTAGACGAAGGGTCGAAAGCTCAAGGACAATTAGGCTGGTTGGAGAATAAGGATATTGTAGACATAGAAGTTGATGATGCTGAGCAATTCAATATATTGCTAGCTTCCATCCTGGCTCAAATTTTGCTCGCTAAAGCAGTGACTGCTCCTGATACTGCAGCCGACTCGGAGATGAGAAGGTGGATTAAGTATACCCAACAGAGACGTGTGGTCGGGGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACTTATCTTTGAGGCGGTTCATGGTGGCACTCATCTTGGATATCAAACGATCCCCAGGGAACAAGCCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTGTGGAAGCTGGATTAGCTAGTTTCATCTTAACTATCAAATTTGGCATTGAAACTATGTATCCGGCTCTTGGGTTGCATGAGTTTTCCGGAGAGTTAACAACTATTGAATCCCTTATGATGCTATATCAACAGATGGGTGAAACAGCACCGTACATGGTTATTCTGGAAAATTCTGTTCAGAACAAATTTAGTGCA

TACCCATTGCTTTGGAGTTATGCTATGGGAGTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCCATGGGAGGGTTAAATTTCGGTAGATCCTACTTTGATCCAGCTTATTTCAGGCTCGGGCAAGAAATGGTTAGAAGATCTGCCGGCAAAGTAAGCTCTGCACTTGCCGCCGAGCTTGGCATCACCAAGGAAGAGGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG

实施例4：

1、引物的设计与合成：

设计合成一对引物P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC 3’，P2：5‘CTTGGATGCT ATTTC TGACA CT3’，预期扩增目的片段大小为829bp。将河北肃宁狐狸HSN07株中CDVNP基因829片段扩增。

2、病毒RNA制备采用invitrogen公司的Trizol试剂提取RNA。主要步骤为：(1)无菌取发病动物的内脏或血液，内脏要加1：1的PBS进行研磨；(2)取250μl研磨悬液先后加入750μl Trizol和200μl氯仿，剧烈振荡混匀15s，4℃14000rpm离心15min。(3)取出上清转移至一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温沉淀10分钟，4℃14000rpm离心10min。(4)倒去液体，加入1ml 75％乙醇；颠倒几次，8500rpm离心5min。(5)弃去上清，用滤纸沾干残留部分，室温晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的RNA可直接用于RT-PCR反应，也可保存于-70℃备用。

3、RT-PCR反应

RT：20μl反转录体系中，反转录引物P2 1μl，RNA 5μl，70℃加热10min，冰浴10min；再加入5倍PCR buffer 4μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，RNaisn0.5μl，AMV反转录酶1μl，DEPC H₂O 6.5μl，充分混合后离心，经42℃60min，95℃灭活AMV反转录酶，立即于冰上冷却，进入PCR。

PCR：反转录产物5μl，10倍PCR buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP4μl，P1、P2各1μl，rTaq DNA Polymerase 1μl，加水补足50μl。优化PCR循环参数，确定PCR的最佳反应程序为：94℃ 45s，51.6℃ 45s，72℃ 45s，30个循环后，72℃延伸5min。取5μl PCR产物，以100bp Ladder作对照，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

4、RFLP鉴定

将扩增得到的片段经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，进行酶切反应，20μ体系中包含：2μl 10×buffer，1μl BamHI限制性内切酶，6μl PCR产物，11μl灭菌去离子水。混匀，37℃水浴1~1.5小时，加入1/10的10倍Loadingbuffer，琼脂糖凝胶电泳观察结果。判定检测的样品病毒所属类型，3条带为野毒株。

5、目的片段验证测序

根据上述方法经测序在下列序列表中标注的BamHI位于153位608位为内切酶。

TTCTGAGGCAGATGAGTTCTTCAAAATTGTAGACGAAGGGTCGAAAGCTCAAGGACAATTAGGCTGGTTGGAGAATAAGGATATTGTAGACATAGAAGTTGATGATGCTGAGCAATTCAATATATTGCTAGCTTCCATCCTGGCTCAAATTT

TGCTCGCTAAAGCAGTGACTGCTCCTGATACTGCAGCCGACTCGGAGATGAGAAGGTGGATTAAGTATACCCAACAGAGACGTGTGGTCGGGGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACTTATCTTTGAGGCGGTTCATGGTGGCACTCATCTTGGATATCAAACGATCCCCAGGGAACAAGCCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTGTGGAAGCTGGATTAGCTAGTTTCATCTTAACTATCAAATTTGGCATTGAAACTATGTATCCGGCTCTTGGGTTGCATGAGTTTTCCGGAGAGTTAACAACTATTGAATCCCTTATGATGCTATATCAACAGATGGGTGAAACAGCACCGTACATGGTTATTCTGGAAAATTCTGTTCAGAACAAATTTAGTGCA

TACCCATTGCTTTGGAGTTATGCTATGGGAGTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCCATGGGAGGGTTAAATTTCGGTAGATCCTACTTTGATCCAGCTTATTTCAGGCTCGGGCAAGAAATGGTTAGAAGATCTGCCGGCAAAGTAAGCTCTGCACTTGCCGCCGAGCTTGGCATCACCAAGGAAGAGGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG

Claims (3)

1、区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点，其特征在于：在CDV犬瘟热结构蛋白核蛋白NP基因的372-1200位之间，设计引物P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC 3’，P2：5‘CTTGGATGCT ATTTC TGACA CT 3’RT-PCR扩增特异性片段829bp，PCR扩增的目的片段可以被特异核酸位点BamHI切成2个或者3个片段，从而鉴别犬瘟热病毒疫苗株和野毒株。

2、根据权利要求1所述的区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点，其特征在于所选择的特异核酸位点位于选择的目的核酸片段的疫苗株为153位或野毒株为153位和608位。

3、根据权利要求1、2所述的区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点，其特征在于所述的PCR扩增的目的片段可以被特异核酸位点BamHI切成的疫苗株2个片段大小为675bp和153bp，野毒株3个片段大小为455bp、220bp和153bp。

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