CN103439498B - 检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断elisa抗体的试剂盒 - Google Patents
检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断elisa抗体的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒，其特征在于：包括ELISA板条、阻断抗体、酶标抗体、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照，ELISA包被抗原；其中所述的ELISA包被抗原采用保藏号为CGMCC NO.4858犬瘟热病毒；通过酶联免疫技术研制一种检测犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，其是一种准确、快速、安全性好、能够进行大量筛查犬瘟热病毒抗体检测的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒（CDV）抗体检测试剂盒，具体而言，本发明特别是涉及一种动物检疫中检测抗体的ELISA试剂盒及其用途，是一种检测水貂、狐、貉犬瘟热病毒阻断ELISA方法，属于生物技术领域。
背景技术
犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）属于副粘病毒科（Paramyxoviridae），副粘病毒亚科（Paramyxovirinae），麻疹病毒属（Morbillivirus），由该病毒感染引起的犬瘟热（Canine distemper, CD）是一种急性、高度接触性传染病，可引起大批犬、狐、貉和貂等易感动物发病，死亡率30-80%，雪貂高达100%。构成CDV病毒粒子囊膜主要成分的血凝蛋白（H蛋白），为机体抗感染免疫针对的主要靶蛋白，由其诱导机体产生的中和抗体在抗CDV感染的机制中发挥重要作用。目前, 世界各国家检测CDV抗体多采用血清中和试验（serum neutralization, SN），和间接酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）。血清中和试验需要时间长，一般需要3-4天，不适合大规模血清学调查；而间接酶联免疫吸附试验，对动物种属有着严格的要求，不适合多种属兽群的检测。阻断ELISA检测方法不仅能够继承ELISA方法快速，大容量检测的优点，而且没有检测动物种属的限制，特别适应检测水貂、狐狸、貉等毛皮动物犬瘟热病毒血清。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒，是以原核表达的重组蛋白为阻断抗体，通过酶联免疫技术研制一种检测犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，其是一种准确、快速、安全性好、能够进行大量筛查犬瘟热病毒抗体检测的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的: 一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒，其特征在于：包括ELISA板条、阻断抗体、酶标抗体、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照，ELISA包被抗原；其中所述的 ELISA包被抗原采用保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2011年5月16日，保藏编号为CGMCC No.4858，分类命名：犬瘟热病毒；
所述的ELISA板条:每个试剂盒装有1块，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2011年5月16日，保藏编号为CGMCC No.4858，分类命名：犬瘟热病毒；
所述的特异阻断抗体：由重组犬瘟热病毒囊膜抗原免疫新西兰大白兔所得血清纯化而来，20ml；
所述的酶标抗体：辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，20ml；
所述的显示液，即用型TMB显色液，20ml；
所述的洗涤液为20倍浓缩，使用时稀释成1倍工作浓度即可；
所述的阴性和阳性对照，为犬瘟热抗体阳性血清和阴性血清；
所述的阻断ELISA试剂盒在检测水貂犬瘟热病毒抗体中的应用。
一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下：将保藏号为CGMCC NO.4858 犬瘟热病毒以碳酸盐缓冲液( pH9.6，0.05 mol/L) 稀释后， 100μL/孔，4℃包被过夜，PBST洗板机洗涤3次；用2％BSA封闭，200μL/孔，37℃封闭2h，PBST洗板机洗涤3次；将待检水貂血清用PBST稀释后，50μL/孔，37℃孵育30min；将兔抗犬瘟热H血清按工作浓度稀释后，50μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板机洗涤3次；羊抗兔酶标抗体经PBST稀释后，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液， 100μL/孔，室温作用10 min；2M浓硫酸终止显色，50ul/孔，测定D450nm值，计算抑制率。
本发明的积极效果是:建立一种准确、快速、安全性好、能够进行大量筛查犬瘟热病毒抗体检测的方法，并且该试剂盒所用包被抗原为犬瘟热病毒，能够大量、稳定生产，为动物检验检疫部门提供了一套实用性强、效果可靠的诊断试剂盒产品。
附图说明
图1 犬瘟热病毒系统发育树及CDV-PS所属亚型。
图2 犬瘟热病毒重组囊膜蛋白SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述：如图1、2所示，本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：
1、犬瘟热病毒CDV-PS株（CGMCC NO.4858）介绍
病毒的分离如下：取发病动物的内脏器官加入灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rPm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体，加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清接种长满单层的Vero细胞，0.2ml/孔，置37度CO2培养箱中培养72小时，每天观察两次，弃除24小时内的污染细胞。
病毒的鉴定方法如下：
培养孔中显示出明显的犬瘟热细胞病变为疑似犬瘟热病毒分离株，将其进行特异性RT-PCR检测，在琼脂糖凝胶电泳中显示特异条带，则确定为犬瘟热病毒，并命名为CDV-PS株。
CDV-PS株的分子特征：
提取CDV-PS株RNA，反转录成为cDNA并进行其H基因的序列测定，测定结果显示CDV-PS株与其他犬瘟热病毒H基因核酸相似率达到98%以上，构建系统发育树证实其位于我国主要的犬瘟热病毒流行基因群Asis-1（如图1），具有较好的抗原性。
2、竞争抗体制备过程
从犬瘟热野毒株CDV-PS株提取总RNA，经RT-PCR扩增得到388 bp的基因片段，将目的基因与原核表达载体pET28a(+)连接构建了pET28a-CDV-H5重组质粒，在大肠杆菌中成功的表达，经Ni-NTA洗脱纯化后，rCDV-H5蛋白被成功纯化（见图2）。
将重组蛋白免疫新西兰大白兔，2个月内免疫3次后采血30-50ml，使用蛋白A/G纯化总抗体后，最终获得竞争抗体2mg。
3、阻断ELISA的操作过程
将保藏号为CGMCC NO.4858 犬瘟热病毒以碳酸盐缓冲液( pH9.6，0.05 mol/L) 稀释后， 100μL/孔，4℃包被过夜，PBST洗板机洗涤3次；用2％BSA封闭，200μL/孔，37℃封闭2h，PBST洗板机洗涤3次；将待检水貂血清用PBST稀释后，50μL/孔，37℃孵育30min；将兔抗犬瘟热H血清按工作浓度稀释后，50μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板机洗涤3次；羊抗兔酶标抗体经PBST稀释后，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液， 100μL/孔，室温作用10 min；2M浓硫酸终止显色，50ul/孔，测定D450nm值，计算抑制率。每次均设 CDV阳性血清对照（未阻断）。
4、判断结果确定
抑制率(%) = (阻断抗体D450 nm - 样本D450 nm) / 阻断抗体D450 nm *100%
用已经优化好的间接阻断ELISA 反应条件，对水貂10份CDV未疫苗免疫血清样本进行检测。根据公式计算临界值, 临界值=阴性样品平均抑制率+2倍标准偏差。
对未免疫血清样本的检测结果显示，水貂的平均抑制率为29%，标准偏差为4%。根据临界值公式计算出水貂阻断ELISA抗体的临界值为37%。
实施例1
犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒最佳使用条件的确定
1、抗原包被浓度和阻断抗体稀释度的确定
犬瘟热病毒以38.4mg/L包被，阻断抗体做1:100、1：200、1：400、1：800稀释，进行间接ELISA，结果表明，确定的抗原工作浓度为 9.6mg/L，阻断抗体的稀释度为1：400(见表1)。
2、待检血清稀释度的确定
将水貂血清分别做1：2.5；1：5；1：10；1：20；1：40；1：80 倍比稀释，按照优化好的条件进行间接阻断ELISA，结果显示：当血清1：10 稀释时，免疫血清的抑制率在50%以上，而未免疫血清的抑制率在25%以下。因此，血清稀释度规定为1：10(见表2)。
实施例2
利用犬瘟热病毒阻断ELISA方法检测4份水貂血清犬瘟热病毒阳性血清效价
主要操作方法如下：
将犬瘟热病毒以碳酸盐缓冲液( pH9.6，0.05 mol/L) 稀释后加入96孔酶标板中， 100μL/孔， 37℃包被3h后，用 PBST洗板机洗涤3次；用2％BSA封闭， 200μL/孔， 37℃封闭2h，再用PBST洗板机洗涤3次；将待检水貂血清用PBST稀释后加入酶标板中， 50μL/孔， 37℃孵育30min后，加入等量按工作浓度稀释的阻断抗体孵育1h后，用PBST洗板机洗涤3次；将羊抗兔酶标抗体经PBST稀释后， 100μL/孔， 37℃孵育1h，用PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液，100μL/孔，室温作用10 min；每孔加入50μL浓度为2mol/L的浓硫酸终止显色后，测定D450nm值，计算抑制率。每次均设 CDV阳性血清对照（未阻断）。实验结果见表3。
实施例3
犬瘟热病毒阻断ELISA方法与犬瘟热抗体中和试验结果比较
主要方法如下：
对30份CDV免疫阳性血清分别进行犬瘟热病毒阻断ELISA方法与犬瘟热抗体中和试验，检测结果表明，该方法的总体符合率为88.6%。显示出良好的适应性（见表4）。
Claims (2)
1.一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于：包括ELISA板条、阻断抗体、酶标抗体、底物显色液、洗涤液、终止液、阳性对照、阴性对照，ELISA包被抗原；其中所述的 ELISA包被抗原采用保藏号为CGMCCNO.4858犬瘟热病毒CDV-PS株；
所述的ELISA板条：每个试剂盒装有1块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸已包被抗原的ELISA微孔板；
所述的阻断抗体：由重组犬瘟热病毒囊膜抗原H蛋白免疫新西兰大白兔所得血清纯化而来，20mL；
所述的酶标抗体：辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，20mL；
所述的底物显色液，即用型TMB显色液，20mL；
所述洗涤液为20倍浓缩，使用时稀释即可；
阴性和阳性对照，为犬瘟热病毒抗体阳性血清和阴性血清。
2.根据权利要求1所述的一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于检测的具体步骤如下：将保藏号为CGMCC NO.4858 犬瘟热病毒以pH 9.6，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀释后， 100μL/孔，4℃包被过夜，PBST洗板机洗涤3次；用2％BSA封闭，200μL/孔，37℃封闭2h，PBST洗板机洗涤3次；将待检血清用PBST稀释后，50μL/孔，37℃孵育30min；将兔抗犬瘟热病毒囊膜抗原H蛋白的抗血清按工作浓度稀释后，50μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板机洗涤3次；羊抗兔酶标抗体经PBST稀释后，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液， 100μL/孔，室温作用10 min；2M硫酸终止显色，50μl/孔，测定OD450nm值，计算抑制率。
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