CN106119209A - 一种抗肠道病毒EV71 IgA单克隆抗体及应用 - Google Patents
一种抗肠道病毒EV71 IgA单克隆抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗肠道病毒EV71 IgA单克隆抗体及应用，本发明提供的EV71 IgA单克隆抗体由杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA分泌得到，该杂交瘤细胞的保藏号为CCTCC NO:C2016132。本发明的提供的单克隆抗体IgA具有良好的结合病毒VP1的特异性，能够在细胞水平抑制病毒入侵，同时可在细胞内中和病毒，且能在乳鼠体内保护乳鼠免受EV71病毒的攻击。利用本发明提供的IgA单克隆抗体制备得到的EV72病毒ELISA检测试剂盒，无论从特异性还是灵敏度均优于其他试剂盒，具备广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地，本发明涉及一种抗肠道病毒EV71IgA单克隆抗体及应用。
技术背景
手足口病(Hand-foot and mouth disease)日益严重地威胁到公众健康，特别是对婴幼儿。严重的感染会导致无菌性脑膜炎，脑炎，心肌炎，急性麻痹，肺水肿，以致危及生命(Wang and Liu.Enterovirus 71:epidemiology,pathogenesis and management.Expert Rev Anti Infect Ther.2009；7:735-742)。该疫情常散发于亚洲国家，其中包括中国、日本、马来西亚以及新加坡(Chua and Kasri.Hand foot and mouth disease due to enterovirus 71 in Malaysia.Virol Sin 2011；26,221–228)。近几年在中国有爆发的趋势，例如在2008-2010年间就发生488955，1155525和1774669例手足口临床确诊病例，其中分别有126，353和905人最终致死(中华人民共和国卫生部.2010年全国法定传染病报告发病、死亡统计表，http://www.moh.gov.cn)。
导致手足口病主要病原体是属于小核糖核酸病毒家族(Picornaviredea)肠道病毒科(En teroviredea)的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒(Coxsackivirus,CV)。它们作为小核糖核酸病毒家族内肠病毒属的成员，具有相对简单相似的病毒结构和感染过程。从结构上讲，核衣壳包含典型的正义单链RNA基因组(ssRNAgenome)，整个基因组含有单一开放阅读框(ORF)，编码4个衣壳蛋白(VP1-4)和7个非结构蛋白(2A，2B，2Cpro，3A，3B，3C和3Dpol)。从EV71的晶体结构的研究中发现，一个EV71病毒粒子包含由三个病毒结构蛋白VP1-VP3的60个拷贝形成的核衣壳，衣壳的内表面附着60个拷贝的小蛋白VP4。
尽管添加铝佐剂EV71灭活疫苗于2015年12月获得中国食品药品管理局批准进入市场(An inactivated enterovirus 71 vaccine were approved into market of chinaby C hina Food and drug administration.Available from:http://www.sfda.gov.cn/ WS01/CL0051/136853.html)，但近年EV71疫苗小鼠中的研究发现，病毒衣壳诱导的抗体IgG会导致病毒感染增强作用。Han，than分别在细胞水平及乳鼠中发现，低浓度(为50μg/ml)的抗EV71的中和抗体(免疫球蛋白)可增强肠病毒71型感染单核细胞系(Han et al.Antibody dependent enhancement infection of enterovirus 71 in vitro and invivo.Virol J.2011；8:106)。Cao IgG3是提高了肠病毒71型在体外的感染的主要抗体亚型(C ao et al.,Human IgG subclasses against enterovirus Type 71:neutralizationver sus antibody dependent enhancement of infection.PLoS One.2013；8(5):e64024)。最近的研究显示，EV71结构蛋白特异的黏膜IgG与病毒滴度成显著相关性，暗示在临床中也存在这种抗体介导的病毒感染增强效应(Xue et al.EV71 infectioncorrelates with viral IgG preexisting at pharyngo-laryngeal mucosa inchildren,Virologica sini ca 2015,DOI:10.1007/s12250-014-3555-2)。因此，以灭活病毒作为主要免疫原的疫苗(主要成分是衣壳蛋白)免疫人体后通常会诱导针对病毒衣壳蛋白的IgG抗体应答与Th2细胞免疫应答。这些应答是否会在人体内在遭遇再次病毒感染时诱导ADE效应，目前还不得而知。除此之外，但前期研究显示EV71灭活苗无法诱导针对CA16的免疫保护(Jia et al.The cross-reactivity of the enterovirus 71 to human braintissue and identification of the cross-reactivity related fragments.VirolJ.2010；7:47)。因此，亟需研发针对肠道病毒新型的抗病毒药物。
针对上述问题，本发明提供的IgA抗体不仅能在细胞外结合病毒，阻止病毒的粘附入侵，更重要的是IgA抗体没有IgG抗体的Fc段，因此不能导致病毒感染抗体依赖的增强效应。而且，IgA抗体能通过粘膜细胞基底层的pIgR受体从粘膜细胞的基底层转运至腔面。在穿过细胞的过程中可能遭遇病毒的结构与非结构成分，从而使病毒的复制与组装得以抑制。除此之外，通过研制针对EV71VP1保守区的IgA抗体可以获得具有广谱胞内胞外中和病毒活性的抗体分子。
发明内容
本发明提供了一种抗肠道病毒EV71 IgA单克隆抗体，该单克隆抗体能特异结合肠道病毒71型VP1蛋白，赋予攻毒乳鼠82％的保护，所述单克隆抗体由11G12分泌得到，该杂交瘤细胞已于2016年6月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA，保藏编号：CCTCC NO:C2016132，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了抗肠道病毒EV71 IgA单克隆抗体的应用，包括利用该单克隆抗体制备检测肠道病毒71型检测试剂盒，或是抗肠道病毒EV71 IgA单克隆抗体在制备抑制肠道病毒71型药物中的应用。本发明的单克隆抗体IgA具有良好的结合病毒VP1的特异性，能够在细胞水平抑制病毒入侵，同时可在细胞内中和病毒，更重要的是能在乳鼠体内保护乳鼠免受病毒的攻击。
本发明还有一个目的在于提供了与抗肠道病毒EV71VP1另外一表位(区别于11G12)特意结合的IgG单克隆抗体。所述的单克隆抗体由20K2细胞分泌得到，该杂交瘤细胞已于2016年6月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株EV7_VP1_20K2_IgG，保藏编号：CCTCC NO:C2016133，地址：中国武汉武汉大学。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种抗肠道病毒EV71IgA单克隆抗体，通过下述方法获得：
EV71BrCr毒株的VP1蛋白按常规方式被表达和纯化，纯化的VP1蛋白用来免疫的小鼠，遵照标准程序用于产生单克隆IgG抗体。通过常规的杂交瘤技术制备了50个分泌针对EV71VP1蛋白特异性单克隆IgG抗体的杂交瘤细胞株。进一步地，从多株产生IgG的细胞株中，通过有限稀释的方法筛选到一株分泌抗原特异性的IgA细胞。该杂交瘤细胞已于2016年6月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA，保藏编号：CCTCC NO:C2016132，地址，中国武汉武汉大学。
所述的杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA具有以下生理生化及培养特性：杂交瘤细胞株可以在含有10％胎牛血清的1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5％CO2的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌针对EV71VP1的单克隆抗体IgA。
抗肠道病毒EV71IgA单克隆抗体的应用，包括利用IgA单克隆抗体在制备抑制肠道病毒71型药物中的应用，无论是本发明所述IgA单抗以主效成分，或是与其他有效成分共同使用制备成抑制肠道病毒71型的药物，均为本发明的保护范围。
抗肠道病毒EV71IgA单克隆抗体的应用，包括利用IgA单克隆抗体制备成检测肠道病毒71型的试剂盒。优选的，制备成肠道病毒71型检测试剂盒时，优选的包被抗体为单克隆抗体20K2_IgG。
所述的单克隆抗体20K2_IgG通过以下方式获得：
EV71BrCr毒株的VP1蛋白按常规方式被表达和纯化，纯化的VP1蛋白用来免疫的小鼠，遵照标准程序用于产生单克隆IgG抗体。通过常规的杂交瘤技术制备了多个分泌针对EV71VP1蛋白特异性单克隆IgG抗体的杂交瘤细胞株。通过抗体结合表位分析，发现多株细胞分泌的IgG识别表位与前述的单抗IgA识别表位有重合或者部分重合，仅有一株编号为20K2的细胞株分泌的抗体与杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA分泌的IgA抗体识别表位不干扰。两种互不干扰的抗体配对使用为检测试剂盒的组装提供基础。该杂交瘤细胞已于2016年6月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株EV7_VP1_20K2_IgG，保藏编号：CCTCC NO:C2016133，地址，中国武汉武汉大学。
分泌该20K2_IgG单克隆抗体的细胞株EV7_VP1_20K2_IgG具有以下生理生化及培养特性：杂交瘤细胞株可以在含有10％胎牛血清的1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5％CO2的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌针对EV71VP1的单克隆抗体IgG。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
现在用于肠道病毒71型检测的方法主要是realtime PCR,但是这种方法对设备，人员与试剂的要求都很高，普通基层医院难以开展对肠道病毒的快速检测。本IgA和IgG单克隆抗体为基础的病原检测方法，不仅简单易行，对设备、人员都没有特别要求，更重要的是基于不同识别表位的夹心ELISA方法，提高了病毒检测的特异性和灵敏性。在IgA抗体应用的另外一方面，由于目前还没有可直接用于抑制肠道病毒71型的特异性药物，本研究中提到的IgA抗体将为肠道病毒的感染提供有效的控制手段。
附图说明
图1为8％非还原SDS-PAGE鉴定从腹水中纯化的单克隆抗体IgA 11G12的纯度和分子量示意图。
图2为免疫荧光染色示意图。
显示IgA抗体11G12能特异性检测的感染细胞的EV71，并且绿色信号定位在细胞质中，而无关抗体IgA(麻疹病毒IgA抗体5H7-IgA(Zhou D等，J Virol 2012))检测不到信号。图3为传统的细胞外中和病毒示意图。
显示0.1ug每孔抗体可显著抑制病毒黏附并在细胞中复制。而对照抗体不能抑制病毒复制。
图4为11G12的Vero-pIgR细胞内中和病毒示意图。
1ug每孔抗体可在极化的细胞转运过程中中和细胞内病毒的复制。
图5为腹腔注射5ug的11G12均可以预防小鼠被EV71感染。
对照抗体及PBS组在7天如鼠均死亡，而5ug 11G12-IgA组均获得完全保护。
图6为EV71 VP1特异的IgG单克隆抗体可结合感染细胞的病毒粒子示意图。
IgG抗体20K2能特异性检测的感染细胞的EV71，并且绿色信号定位在细胞质中。而无关抗体IgG(沙门氏菌鞭毛素蛋白单克隆抗体IgG,5G10)检测不到信号。
图7为以EV71VP1单克隆抗体IgG,IgA为基础建立的双抗体夹心方法检测EV71示意图。
具体实施方式
可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。
在本申请中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。
除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版(Sambrook和Russel，2001年)；动物细胞培养(RI Freshmey主编，1987年版)；分子生物学当代程序(FM Ausubel等主编，1987年，包括补充至2001年)；免疫学当代程序(JE Coligan等主编，1991年)；免疫分析手册“(D.Wild主编，斯托克顿出版社，纽约，1994年)；免疫学分析方法(R.Masseyeff，WHAlbert和NA Staines等主编，Weinheim：VCH VERLAGS GESELLSCHAFT MBH，1993年)。
提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们决不旨在限制或缩小本发明的范围。
实施例1：
分泌抗肠道病毒EV71IgA单克隆抗体的杂交瘤细胞的获得：
1.1、抗原制备
EV71BrCr毒株的完整VP1基因克隆到载体pET28a。简言之，将含有重组3D表达载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)，细菌生长，通过诱导来制备这些重组蛋白，并通过亲和色谱法在Ni-NTA柱上(Qiagen公司)纯化。
1.2、免疫和制备EV71VP1特异性IgG单克隆抗体
制备EV71VP1-特异性单克隆抗体方法如(Li YM,Liu F,Han C and YanHM.Monoclo nal antibody that blocks the Toll-like receptor 5 binding regionof flagellin.Hybridoma(Larchmt).2012 Feb；31(1):60-62)。简言之，5周龄雌性SPFBALB/c小鼠皮下免疫100μg VP1，时间间隔为2周。最后一次加强后四个星期和细胞融合的前3天，小鼠用200μg VP1腹腔接种加强。三天后，收获小鼠脾细胞，和SP2/0融合，融合中使用50％聚乙二醇(Sigma-Aldrich公司，密苏里州)。杂交瘤培养物上清液用ELISA筛选。阳性杂交瘤细胞通过有限稀释进行克隆，稳定的杂交瘤克隆被注射到液体石蜡预处理BALB/c小鼠的腹腔。随后，收获单克隆抗体，用抗体纯化试剂盒(NAbTM Protein A/G Spin Kit,Thermo Scientific,USA)，根据制造商的说明纯化。
1.3、有限稀释法筛选IgA分泌型单克隆杂交瘤细胞株
a.将扩增的EV71VP1蛋白特异的IgG分泌型杂交瘤细胞分10块96孔培养板培养，计数板计数控制细胞数量1000个/Well。
b.培养2-3天后，一抗Goat-Anti-Mouse IgA Unlabeled用包被缓冲液稀释至3ug/m l，取10块96孔ELISA板用稀释一抗包被，100μl/孔，4℃过夜
c.弃去孔内的包被体，同时用洗涤液洗3次，每次5分钟，将ELISA板倒扣于吸水纸上拍干。
d.每孔加250μl封阻液，37℃温育2小时。
e.每孔加100μl待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照，并补加完全细胞培养基100μl/孔l至细胞培养板内；ELISA板4℃过夜后，用洗涤液洗涤3次，每次5分钟拍干。
f.用封阻液1：2000倍稀释二抗Goat-Anti-Mouse IgA-AP，按100μl/Well加入ELISA板中，37℃温育1小时，洗涤，拍干。
g.每孔加新鲜配制的底物溶液100μl，室温放置20-30分钟。
h.观察ELISA结果，选择所有呈阳性的ELISA孔所对应的细胞培养孔的细胞，将其全部取出扩大培养后冻存，取阳性结果最好的一个孔的细胞扩大培养并分入10块96孔培养板继续培养，计数板计数控制细胞数量100个/孔。
i.重复a-h操作，直至96孔细胞培养板中每孔初始细胞小于或者等于1个细胞，则ELISA检测IgA为阳性的孔即为IgA分泌型单克隆细胞。取出细胞进行扩大培养和进一步检测，冻存所得的阳性细胞。
至此，申请人获得了一株分泌抗肠道病毒EV71IgA单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞已于2016年6月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA，保藏编号：CCTCC NO:C2016132，地址，中国武汉武汉大学。
实施例2：
EV71 VP1特异性IgA单克隆抗体的获得：
1、小鼠腹水的制备
a.Prime:每只BALB/c小鼠腹腔注射500μl液体石蜡。
b.饲养15天后，每只小鼠腹腔注射3－5×105个杂交瘤细胞，注射体积为1ml。
c.密切观察小鼠生理状况，待小鼠腹部体积增大，行动不便，活力下降后(通常为8-14天后)，脱颈椎法处死小鼠，打开胸腔，从横膈膜处插入玻璃吸管吸取腹水。腹水的效价是2百万。
2、二氧化硅除脂
a.将新鲜采集的腹水2000r/min离心15分钟，除去细胞成分和组织碎片，取上层清亮的腹水，等体积加入pH7.2的PBS稀释；
b.每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；
c.2000g离心20分钟，取上清，沉淀中加等体积PBS重悬，室温孵育30分钟后再次离心，上清与之前的上清合并。
3、疏水交换法纯化IgA
a.用PBS平衡疏水柱，至蛋白核酸紫外检测仪读数0-2，且稳定不再下降，PH7.0。
b.调零：可在空气中调零，也可PBS洗柱平衡后调零。先调T至100，再调A至0。
c.将除脂后的腹水用PBS稀释1倍上样，读数10以上的流穿液回收继续上样，至流穿峰读数稳定，即可开始用PBS或蒸馏水洗柱。所有读数10以上流穿液回收待检测。
d.用PH4.0的50mM醋酸钠洗柱，收集蛋白峰(可能会先出一个小峰，随后下降，再稳定上升，这是正常的)。收集读数10以上的洗脱液，立刻加入饱和硫酸铵(实际操作中按每ml洗脱液加035g纯硫酸铵计算，边加边摇晃，避免局部硫酸铵浓度过高)，立刻加氨水调PH至7.0(否则过酸条件下抗体会变性)。4度放置半小时，不时摇动。
e.1M NaOH洗柱，至读数稳定(10以下)。
f.PBS长时间洗柱，至读数稳定，PH7.0。
g.抗体在硫酸铵溶液中成为白色絮状沉淀，4度5000rpm离心20min，弃上清，沉淀以适量(1-2ml，视对抗体浓度和损失要求而定)PBS溶解，装入透析袋，4度PBS中透析24h(持续搅拌)，每8小时换液一次。
h.透析除盐后的抗体过0.22um滤膜除菌，测浓度(浓度是1ug/ml)后分装并与-80度保存备用，本发明将该IgA或称为11G12-IgA或11G12。
4、非变性胶观察纯化的IgA
1ug纯化的IgA。溶于10ul非变性胶缓冲液中，沸水中煮五分钟，12000rpm离心5分钟,上样。80V 30分钟，120V 1小时，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色完毕后拍照分析结果。(图1)图一显示1ug 11G12-IgA二聚体，纯度在90％以上。
5、免疫荧光验证VP1特异性IgA单克隆抗体的结合活性
24孔板中的Vero-1008细胞用EV71(MOI＝0.1)感染。感染24小时后，用无水甲醇固定细胞，进行间接免疫荧光试验(IFA)，先用VP1特异性单抗(11G12)，接着用荧光素异氰酸酯缀合的山羊抗小鼠IgA的抗体；阴性对照单克隆抗体5H7-IgA显示无染色。(图2)
实施例3：
IgA单克隆抗体在制备抑制肠道病毒71型药物中的应用：
1、11G12-IgA胞外中和作用
将1×104PFU EV71(BrCr毒株)加入到连续稀释的200μl单克隆抗体11G12-IgA(16CF7-IgA麻疹病毒基质蛋白M特异性的IgA抗体作为无关抗体对照)。孵育1小时后，该混合物感染Caco-2细胞。收集EV71感染的Caco-2细胞，通过噬斑测定法测定这些细胞样品中的病毒滴度。如图3所示，在0.01-1μg/孔的浓度下，可显著降低病毒的感染。1ug/孔(200ul)可抑制90％病毒，0.1ug/孔可抑制70％的病毒感染，而0.01ug/孔可抑制50％的病毒感染。
2、EV71 VP1特异11G12-IgA在胞内抑制EV71的复制
用Vero C1008-pIgR细胞铺Transwell，2×105个/孔，每天测电阻，待四天左右电阻稳定后说明极化完成，接下来接度测定IgA的细胞内抗病毒作用。
b.取一孔用胰酶消化，1ml维持培养基吹打洗下后计数，估算每孔细胞数量。
c.用维持培养基将病毒稀释至MOI＝1.0，Transwell Apical面每孔加入150μl病毒稀释液，Basolateral面每孔加入500μl维持培养基，37℃吸附2h。
d.移除病毒，用维持培养基洗3遍，每遍500μl。
e.用完全培养基将抗体稀释到工作需要浓度后，在Transwell Apical面每孔加入500μl完全培养基，Basolateral面每孔加入120μl抗体稀释液。
f.培养一定时间后，分别收取Apical面和Basolateral面样品；用枪头刮下细胞，并用维持培养基每次100μl冲洗3次后合并，冻融三次后2000rpm离心20分钟取上清作为细胞层样品。计量实验结果显示：1ug/孔(200ul)可抑制70％病毒，0.1ug/孔可抑制50％的病毒感染，而0.01ug/孔可抑制30％的病毒感染(图4)。
3、VP1特异性单克隆抗体IgA在鼠模型中的抗病毒效果
EV71VP1特异性11G12-IgA的抗病毒功效在鼠模型中进行了研究。15只1日龄新生小鼠被随机分成三组(每组5只小鼠)。通过腹腔接种分别给予每组5ug的11G12-IgA,16CF7-IgA(麻疹病毒基质蛋白M特异性的单克隆IgA抗体，此处作为不相关抗体使用。)和PBS组作为阴性对照；然后通过腹腔接种每组给予103TCID50 EV71攻毒。每天收集小鼠存活数据，收集1周。如图5所示，0.5ug 11G12-IgA提供80％的保护，5ug 11G12-IgA 100％保护，而对照组16CF7-IgA没有提供任何保护。
实施例4：
IgA单克隆抗体在制备检测肠道病毒71型的试剂盒中的应用：
1).针对EV71 VP1特异性单克隆IgG分泌细胞株的建系
制备EV71VP1-特异性单克隆抗体方法如(Li YM,Liu F,Han C and YanHM.Monoclo nal antibody that blocks the Toll-like receptor 5 binding regionof flagellin.Hybridoma(Larchmt).2012 Feb；31(1):60-62)。简言之，5周龄雌性SPFBALB/c小鼠皮下免疫100μg VP1，时间间隔为2周。最后一次加强后四个星期和细胞融合的前3天，小鼠用200μg VP1腹腔接种加强。三天后，收获小鼠脾细胞，和SP2/0融合，融合中使用50％聚乙二醇(Sigma-Aldrich公司，密苏里州)。杂交瘤培养物上清液用ELISA筛选。阳性杂交瘤细胞通过有限稀释进行克隆，获得多个稳定的杂交瘤细胞，通过抗体结合表位分析，发现多株细胞分泌的IgG识别表位与前述的11G12-IgA识别表位有重合或者部分重合，仅有一株编号为20K2的细胞株分泌的抗体与杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA分泌的IgA抗体识别表位不干扰。该杂交瘤细胞已于2016年6月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株EV7_VP1_20K2_IgG，保藏编号：CCTCC NO:C2016133，地址，中国武汉武汉大学。其分泌的单克隆抗体本发明或称为20K2-IgG或20K2。
稳定的杂交瘤克隆被注射到液体石蜡预处理BALB/c小鼠的腹腔。随后，收获单克隆抗体，用抗体纯化试剂盒(NAbTM Protein A/G Spin Kit,Thermo Scientific,USA)，根据制造商的说明纯化。纯化的抗体20K2-IgG调整成浓度1ug/ul后冻存于-80摄氏度备用。免疫荧光结果显示，抗体20K2-IgG病原体具有良好的结合活性，能特异性检测的感染细胞的EV71，并且绿色信号定位在细胞质中。而无关抗体IgG(沙门氏菌鞭毛素蛋白单克隆抗体IgG,5G10)检测不到信号。(图6)
2).双抗体夹心检测病原体EV71方法的建立
肠道病毒71型双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒最佳反应条件的确定
以抗EV71的抗体作为包被抗体，检测抗体用生物素标记，AVDIN-HRP，并催化TMB底物显色。包被抗体的最佳包被浓度为3ug/ml，检测抗体的最佳稀释度为1：10000(检测抗体的初始浓度是5mg/ml)，酶标AVDIN的最佳稀释倍数为1：50000(酶标AVDIN的初始浓度是1mg/ml)，用于以下实验。检测原理如图7。
3).肠道病毒71型双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒阴阳界线的确定
单克隆抗体20K2-IgG作为包被抗体，生物素标记的11G12-IgA作为检测抗体，其余参数与2)相同。
检测经RT-PCR确定为肠道病毒71型感染阴性的样品，包括：43份咽拭子样品、20份肛拭子样品、38份血液样品，同时设标准阳性对照及阴性对照，经多次重复检测OD630值(OD630)，最终确定本方法的阴阳性界线判定标准如下：
实验成立条件：
阳性对照平均OD值(PC)：大于0.5；
阴性对照平均OD值(NC)：小于0.2；
CPC计算方法：CPC＝PC–NC；
SP计算方法：SP＝(样品OD值-NC)/CPC。
阴阳性界线判定标准：
阳性 可疑 阴性
SP≥0.4 0.2≤SP＜0.4 SP＜0.2
如果样品的检测结果落在可疑区间，则需要进行第二次检测。若第二次检测后结果仍为可疑，则要考虑重新收集样品再进行检测。结果见表一。
表一.101份肠道病毒71型阴性样品夹心ELISA检测结果
4).肠道病毒71型双抗体夹心ELISA检测试剂盒的敏感性和特异性：
利用本发明提供的单克隆抗体，制备了4个可用于检测EV71的ELISA试剂盒，用于检测该试剂盒的敏感性和特异性，如下：
试剂盒1：使用20K2-IgG作为包被抗体，生物素标记11G12-IgA作为检测抗体。
试剂盒2：使用20K2-IgG作为包被抗体，市售HRP酶标记的EV71IgG抗体作为检测抗体。
试剂盒3：市售EV 71IgG抗体作为包被抗体，生物素标记11G12-IgA作为检测抗体。
试剂盒4：市售EV 71IgG抗体作为包被抗体，市售HRP酶标记的EV71IgG抗体作为检测抗体；
以上试剂盒的其余参数与2)相同。
表二和表三中：
+表示EV71病毒蚀斑检测阳性的样品作为阳性对照。
-表示EV71病毒蚀斑检测阴性的样品作为阴性对照。
将EV71(BrCr毒株)浓度梯度稀释，使用上述试剂盒进行检测，以考察其灵敏度：
表二肠道病毒71型双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒敏感性比较
从表二中可以看到，103PFU/ml病毒时4种试剂盒检测结果均为阴性，但是试剂盒1的SP计算结果略高于其他几种。试剂盒1在病毒含量为104PFU/ml时仍能检出，SP结果为阳性，检测能力明显高于其他试剂盒(表二)。检测时上样量为100ul/孔，即103PFU能检测到。
表三双抗体夹心ELISA肠道病毒71型抗原检测试剂盒特异性试验结果
表三结果表明，仅试剂盒1对于以上6种病毒的检测结果均为阴性。
从表二和表三可以看到，当使用20K2-IgG作为包被抗体，生物素标记11G12-IgA作为检测抗体时，无论是灵敏性和特异性均优于其余试剂盒。
Claims (6)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA，保藏编号为：CCTCC NO: C2016132。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备抑制EV71病毒复制药物中的应用。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备EV71疫苗中的应用。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备EV71检测试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述试剂盒的包被抗体为20K2-IgG，检测抗体为11G12-IgA；所述的包被抗体由杂交瘤细胞株EV7_VP1_20K2_IgG分泌，保藏编号为：CCTCCNO: C2016133；所述的检测抗体由杂交瘤细胞株EV7_VP1_11G12_IgA分泌，保藏编号为：CCTCC NO: C2016132。
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