CN105567643A - 可分泌抗ev71病毒蛋白vp1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 - Google Patents

可分泌抗ev71病毒蛋白vp1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种灵敏度较高且特异性较强的EV71病毒检测试纸，该EV71病毒检测试纸通过使用杂交瘤细胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体，在标记物为较大的纳米颗粒时，间接标记可以降低标记抗原的使用量，在提高灵敏度的同时改善特异性。此外，本发明还涉及一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。该杂交瘤细胞为两株，保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号是CCTCC？No：C2015225和CCTCC？No：C2015226。

Description

可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
背景技术
手足口病(Hind-foot-mouthdisease，HFMD)是一种主要由肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)或柯萨奇病毒16型(CoxsackievirusA16，CoxA16)感染导致的流行性疾病，两种病毒常相伴造成手足口病的暴发流行，每次流行中两种病毒所占比例有所不同。感染后临床表现多样，从隐形感染、普通手足口病到中枢神经系统感染等重症，部分重症患者病情进展较快，甚至死亡。患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下儿童发病率高。与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病发生重症感染的比例相对较高。肠道病毒EV71的临床诊断主要依据三个方面：一是临床表现，而是血清学证据，三是病原学证据。由于肠道病毒EV71型感染临床表现多，因此肠道病毒EV71的血清学检测和病原学检测时目前最主要的依据。EV71感染后可在咽部会分泌物、粪便和皮疹的疱液中排出病毒。病原学检测方法中，病毒分离是最早用于EV71病毒的检测诊断的方法，这种方法具有较高的特异性，但由于计数操作难度大、周期长、不适合临床使用。RT-PCR技术用于检测病毒RNA，具有快速、简便的优点，而且还有很高的灵敏度和特异性。但其灵敏度一方面依赖于患者携带的病毒与所用引物的匹配性，另一方面也受到扩增片段的高级结构的很大影响。另外，RT-PCR本身对于操作环境及操作人员的要求较高，并且价格昂贵，因此难以在广大基层单位中使用。结合以上方面，血清学检测显得较为简便，节约时间，且易操作。
肠道病毒71型(EV71)基因组含有大约7.5kb的单链正股RNA，包括5’端非编码区、3’端非编码区和由P1，P2，P3所组成的多蛋白。共编码11种蛋白，其中4个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4，7个非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中VP1、VP2、VP3暴露于病毒外壳的表面，为EV71主要的抗原变异位置；VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部的RNA结合，其功能类似病毒外壳的锚，用以稳定病毒蛋白的结构。非结构蛋白2A为分裂初期先驱蛋白质，也与终止宿主细胞合成其本身所需蛋白有关；3C蛋白则参与大部分的蛋白裂解反应；3D为RNA聚合酶，在病毒RNA复制时主导转录及复制反应；2B、2C、3A、3B等四种蛋白则与病毒RNA复制有关。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VP1是EV71病毒的主要中和决定因子，因此VP1蛋白可被认为是最适合来建立检测方法的抗原。
在血清中和试验中，EV71和CoxA16一般难以区分，病毒变异、样本中存在多个交叉同源性的病毒等因素均可能影响抗原分型。传统的HRP标记多克隆兔抗血清抗体建立的双抗体夹心法也无法准确的检测EV71病毒。
发明内容
基于此，有必要提供一种与其他病毒无交叉、可以准确的检测EV71病毒检测试剂盒，以及可应用在该EV71病毒检测试剂盒中的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCCNo：C2015225。
上述的杂交瘤细胞在制备EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备中的应用。
在一个实施例中，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-7。
一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCCNo：C2015226。
上述的抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体在制备EV71病毒检测试剂或检测设备中的应用。
在一个实施例中，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-11。
一种EV71病毒检测试纸，其特征在于，包括上述的7P1-7和上述的7P1-11。
在一个实施例中，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有7P1-7包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为7P1-11，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。
一种EV71病毒检测试剂盒，包括上述的EV71病毒检测试纸。
上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在制备EV71病毒导致的手足口病诊断的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等。
上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体具有高敏感性、高特异性等优点，可广泛应用在制备手足口病早期分型诊断的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，可以实现准确、快速地检测出EV71病毒，而与柯萨奇病毒(CoxA16)、普通肠道病毒无交叉，有利于对EV71病毒作出早期分型诊断，且在特异性、灵敏度等方面较之传统的检测方法具有显著的优势，可以应用于EV71病毒早期检测。
附图说明
图1为一实施方式的EV71病毒检测试纸的正面示意图；
图2为图1中EV71病毒检测试纸的纵截面示意图；
图3为一实施方式的EV71病毒检测试剂盒的示意图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。
一实施方式的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞于2015年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCCNo：C2015225，分类命名：杂交瘤细胞株7P1-7。该杂交瘤细胞可分泌出抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的单克隆抗体，记为7P1-7，7P1-7可以作为检测抗体。7P1-7可以应用于EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备的制备领域中。
另一实施方式的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞于2015年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCCNo：C2015226，分类命名：杂交瘤细胞株7P1-11。该杂交瘤细胞也可分泌出抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的单克隆抗体，记为7P1-11，7P1-11可以作为捕获抗体。7P1-11可以应用于EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备的制备领域中。
一实施方式的EV71病毒检测试剂盒包括壳体、EV71病毒检测试纸和其他检测试剂。
如图1和图2所示，本实施方式的EV71病毒检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠，金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠，硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜140上，且检测线160设在靠近金标垫130的一端，质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。金标垫130上涂覆有7P1-7包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的7P1-7。检测线160为7P1-11。质控线170为羊抗鼠IgG抗体。
本实施方式中，7P1-7作为检测抗体，7P1-11为捕获抗体。在其他的实施方式中，也可以选择7P1-11作为检测抗体，7P1-7为捕获抗体。
如图3所示，EV71病毒检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线170裸露于观察窗220中，方便观察。
其他检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。
上述EV71病毒检测试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中的是否含有VP1蛋白。检测时，VP1蛋白先和胶体金标记的7P1-7结合形成VP1-胶体金标记的7P1-7复合物，由于毛细管作用，VP1-胶体金标记的7P1-7复合物沿硝酸纤维素膜140向前泳动，到达检测线160时，VP1-胶体金标记的7P1-7复合物会与7P1-11结合，形成7P1-11-VP1-胶体金标记的7P1-11的复合物，从而富集在检测线160上，形成红色沉淀线。未结合VP1蛋白的胶体金标记的7P1-11则通过检测线160，被羊抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控线170上，形成红色沉淀线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有VP1蛋白，未结合VP1蛋白的胶体金标记的7P1-11到达检测线160时，不会形成7P1-11-VP1蛋白-胶体金标记的7P1-11复合物，未结合VP1蛋白的胶体金标记的7P1-11通过检测线160，仅富集在质控线170上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。
在其他实施方式中，EV71病毒检测试剂盒的结构不限于上文描述。上述单克隆抗体除应用在上述胶体金标记的单抗EV71病毒检测试剂盒外，还可以用于其他EV71病毒检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体(例如ELISA)，则可用于其他形式的VP1蛋白检测试剂或设备。故本实施方式所制备得到的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可广泛适用于制备VP1蛋白检测试剂或设备。
通过使用上述杂交瘤细胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体，在标记物为较大的纳米颗粒如胶体金、乳胶或其他纳米颗粒类标记物时，间接标记可以降低标记抗原的使用量，在提高灵敏度的同时改善特异性。间接标记相对于传统双抗原夹心法的两部特异识别而言相对于多了一步特异识别，即三步特异识别，可以提高检测试剂盒的特异性，而且相对标记抗原的纯度要求降低又可以降低检测试剂盒的成本。通过使用上述抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体，制备得到的EV71病毒检测试剂盒与现有EV71病毒检测试剂盒相比，在特异性、灵敏度及检出率方面都具有显著的优势。
下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞及相关应用作进一步详细的说明。
实施例1
杂交瘤细胞株的建立与抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的制备。
1、抗原免疫。
将VP1蛋白抗原(1.5mg/mL，深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号AG-EV71-VP1-0008与弗氏完全佐剂(SIGMA，F5881)等体积混合，得到油状乳液。将该乳液以每只0.2毫升的剂量皮下施给BALB/c小鼠(广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(抗原与弗氏不完全佐剂(SIGMA，F5506)等体积混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。
融合前3天，用相同剂量抗原与等体积0.9％氯化钠注射液混合腹腔注射追加免疫。
2、杂交瘤细胞系的制备。
(1)饲养细胞的制备。
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡5分钟，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，180μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
(2)免疫脾细胞的制备。
小鼠末次免疫后第三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清RPMI1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
(3)小鼠瘤细胞的制备。
小鼠瘤细胞经筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。
(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤。
将小鼠瘤细胞与免疫脾细胞按1:10细胞数量比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI1640基础培养液洗1次，1,200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。1,000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI1640完全培养液)两次。
(5)抗体的检测。
用0.05MpH9.5碳酸缓冲溶液稀释VP1蛋白抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号AG-EV71-VP1-0008)，使其终浓度为6μg/ml。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时或4℃过夜，接着用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01MpH7.4PBS，0.12mL/孔，37℃孵育2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。
分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆四次，扩大培养后，用含10％DMSO的完全培养液冻存，细胞密度为106个/mL。细胞融合一次共获得2株能稳定分泌抗体的细胞株，于2015年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(即中国典型培养物保藏中心)，保藏号是分别为CCTCCNo：C2015225、CCTCCNo：C2015226。保藏号为CCTCCNo：C2015225的细胞系分泌的抗体即为7P1-7，保藏号为CCTCCNo：C2015226的细胞系分泌的抗体即为7P1-11。
3、单克隆抗体的制备。
选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的弗氏不完全佐剂；10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒死之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～15mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。
取腹水上清，用2倍体积的0.06MpH4.0的醋酸缓冲液稀释。向混合液中加原腹水体积3％正辛酸沉淀杂质。12000rpm离心20min沉淀杂质，取上清过滤。用1M的NaOH调滤液pH至7.4。向所得的滤液中加等体积的饱和硫酸铵，沉淀IgG。12000rpm离心20min后，弃上清，沉淀用0.01MpH7.4的PBS复溶。
4、效价测定。
用0.05MpH9.5碳酸缓冲溶液稀释VP1抗原，使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时或4℃过夜。后用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01MpH7.4PBS，0.12mL/孔，37℃孵育2小时，用于检测。
(1)细胞上清效价的检测：用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01MpH7.4PBS稀释1G2、3G6和4G8细胞培养上清依次至10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍。向已包被抗原的96孔板中每孔依次加入0.1mL的不同稀释倍数的细胞培养上清，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。2株细胞在640倍稀释细胞培养上清时，吸收值大于0.5。7P1-7，7P1-11细胞培养上清效价可达到1:640。
(2)小鼠腹水效价的检测：用上述方法检测1G2、3G6和4G8单克隆抗体的杂交瘤细胞所制备的腹水抗体效价。7P1-7、7P1-11腹水效价为1：320000，1：320000
实施例2
EV71病毒VP1抗原胶体金快速检测试纸的制备。
1、硝酸纤维素膜的制备。
包被缓冲液的配制：含6％甲醇的0.01MPH7.2的PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000mL6％甲醇的0.01MPH7.2PBS缓冲液配方：NaCL8g，KCL0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，甲醇60mL，双蒸去离子水定容至1000mL。
硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液将实施例1制得的单克隆抗体7P1-7稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm；用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5～8mm，均匀。37℃烘干，封装备用。
2、胶体金、金标记单克隆抗体的制备。
(1)溶液的配制。
①氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000mL1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸：双蒸去离子水定容至1000mL。
②柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1％溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期容至1000mL。
③0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000mL。
④2％PEG-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL2％PEG-20000溶液配方：20gPEG-20000；双蒸去离子水定容至1000mL。
⑤标记洗涤保存液的配制：2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％叠氮钠(NaN3)，0.01MpH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL标记洗涤保存液配方：20gBSA，0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)胶体金的制备：
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100mL0.01％氯金酸加入2mL1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。
(3)胶体金标记单克隆抗体的制备：
用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8～10μg抗体/ml胶体金加入实施例1中制备得到的单克隆抗体7P1-11，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。
3、金标垫的制备。
(1)封闭液的配制：
2％BSA，0.1％TritonX-100、0.05％NaN3，0.01MpH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20gBSA，0.5gNaN3、1mLTritonX-100、0.01MPH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)金标垫的制备：
将金标垫浸泡于封闭液中30min后好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。
4、试纸条样品垫的制备。
(1)封闭液的配制：
2％BSA，0.1％TrtionX-100、0.05％NaN3，0.01MpH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20gBSA，0.5gNaN3、1mLTrtionX-100、0.01MPH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)样品垫的制备：
将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。
5、试纸条的组装。
将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到所述检测试纸。
实施例3
检测EV71病毒VP1蛋白的试剂盒。
1、快速检测EV71病毒VP1蛋白的试剂盒包括：实施例2制作的检测试纸及样品稀释液。
样品稀释液为8％NaCl溶液。配制方法：80gNaCl，加蒸馏水定容至1000ml。
2、胶体金法检测EV71病毒VP1蛋白。
(1)直接吸取120μl采集好的人血清或血浆加入到试纸卡加样孔，等待15min后即可观察结果。
(2)结果判定：当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，没有出现肉眼可见的红色检测线，结果判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，同时也出现肉眼可见的红色检测线，结果判为阳性。检测线颜色越深说明被检测样品的EV71病毒VP1蛋白水平越高。当试纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果都判为检测试纸条失效，应废弃。
实施例4
EV71病毒VP1抗原胶体金快速检测试纸试剂盒的应用。
以Suoaobio肠道病毒71型/柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)双色荧光检测试剂盒检出的EV71阳性样本，CA16阳性样本，以及EV71/CA16双阴性样本作为本试剂盒的检测样本，其中126例检出EV71阳性样本，43例检出CA16阳性样本，500例阴性标本。采用本专利发明的EV71病毒VP1抗原胶体金试剂盒检测上述126份EV71阳性样本，43份CA16阳性样本和500份阴性样本，检出结果见表1。
表1：实施例3的EV71病毒VP1抗原检测试剂盒的检测结果
由表1可以看出，本实施例的EV71病毒VP1抗原胶体金快速检测试纸试剂盒检出EV71阳性标本117份，相对灵敏度为92.68％；CA16标本未检出，相对特异性为100％，500份阴性样本检出500份，相对特异性为100％。该结果与Suoaobio肠道病毒71型/柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)双色荧光检测试剂盒的结果符合率为98.65％。
由此说明，本实施例的EV71病毒VP1抗原胶体金快速检测试纸试剂盒可以用于EV71型肠道病毒早期分型快速诊断。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为CCTCCNo：C2015225。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞在制备EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备中的应用。
3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体，其特征在于，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-7。
4.一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为CCTCCNo：C2015226。
5.如权利要求4所述的抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体在制备EV71病毒检测试剂或检测设备中的应用。
6.如权利要求4所述的杂交瘤细胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体，其特征在于，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-11。
7.一种EV71病毒检测试纸，其特征在于，包括如权利要求3所述的7P1-7和如权利要求6所述的7P1-11。
8.如权利要求7所述的EV71病毒检测试纸，其特征在于，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有7P1-7包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为7P1-11，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。
9.一种EV71病毒检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7或8所述的EV71病毒检测试纸。
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