CN114045291A - 重组人Sema4C蛋白、表达载体、宿主细胞以及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了重组人Sema4C蛋白、表达载体、宿主细胞以及应用。通过选取人Sema4C基因21‑633aa区域中的若干结构域，构建其重组质粒，转染真核细胞HEK 293F细胞，进行体外重组表达，获得了相关结构域的目的蛋白。该方法具有转染周期短和快速获得目的蛋白的效果，能够应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。

Description

重组人Sema4C蛋白、表达载体、宿主细胞以及应用

技术领域

本申请涉及Sema4C基因技术领域，尤其涉及重组人Sema4C蛋白、表达载体、宿主细胞以及应用。

背景技术

Semaphorins家族是一种分泌型或跨膜蛋白，早期作为神经系统中一种发挥轴突导向功能的因子被发现，大部分蛋白通过其受体Plexins和Neuropilins家族发挥相应的生物学效应，包括:发育、调节细胞运动、血管生成、免疫调节、肿瘤形成和干细胞特性。一些Semaphorin家族成员参与了上皮细胞屏障的分离，与肿瘤的Epithelial-MesenchymalTransition(EMT)有关，例如，Sema3E通过激活PI3K/ERK/MAPK使Snail在细胞核内积聚来诱导EMT。例如，Sema4C在调控神经轴突的定向生长和肌管发育方面有重要作用，在人类宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌中均表达，并与淋巴转移等恶性行为相关。Sema4C在乳腺癌细胞过表达上调了转录因子Snail、Slμg和SOX-2，在肌细胞的分化过程中Sema4C是P38MAPK信号通路的重要激活因子。研究表明Sema4C在宫颈癌组织的过表达与恶性生物学行为有关，EMT与宫颈癌的进展密切相关，Seam4C成为宫颈癌侵袭转移的预测标记和治疗靶点。

因此在体外研究或人Seam4C结构和功能尤为重要。现有技术中，对人Seam4C蛋白的重组表达一般以原核宿主为主，但原核表达容易产生包涵体和无生物活性的可溶性蛋白。因此，需要寻找新型重组表达人Seam4C蛋白的宿主或表达形式，以利用获得体外获得大量的人Seam4C蛋白，以利于对该蛋白进行研究，为其作为抗肿瘤药物或诊断试剂提供帮助。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于解决上述技术问题之一。

第一方面，本申请实施例公开了用于重组表达Sema4C蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA分子具有Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列中的至少一种。

第二方面，本申请实施例公开了一种Sema4C蛋白重组表达载体，所述表达载体以质粒为骨架构建，其中插入有融合基因，所述融合基因如SEQ ID NO.1所示，所述融合基因包含Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列中的至少一种。

在本申请实施例中，所述融合基因还包含位于所述结构域5'端的第一序列和位于3'端的第二序列，所述第一序列如SEQ ID NO.2或3所示，，所述第二序列为C-6His、N-rabbit FC或C-Human FC-6His标签。

第三方面，本申请实施例公开了用于PCR扩增Sema4C蛋白重组表达载体融合基因的引物组，其中，所述结构域包括Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列中的一种；所述引物组包括六对引物，所述六对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～15所示。

第四方面，本申请实施例公开了一种携带第二方面所述的重组表达载体的重组大肠杆菌。

第五方面，本申请实施例公开了一种用于表达Sema4C蛋白的重组表达载体的重组表达细胞，所述重组表达细胞为携带第二方面所述重组表达载体的HEK 293F细胞。

第六方面，本申请实施例公开了一种利用第五方面所述的重组表达细胞表达的重组蛋白。

第七方面，本申请实施例公开了第一方面所述的DNA分子、或第六方面所述的重组蛋白在制备或筛选宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌之一肿瘤治疗或诊断制剂中的用途。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

本申请中选取人Sema4C基因21-633aa区域中的若干结构域，进行体外重组表达，亦能够产生人Sema4C蛋白的部分功能，也为其抗肿瘤研究提供帮助。以真核细胞HEK 293F为宿主细胞，将上述构建的6种重组质粒通过瞬时转染的方式获得稳定表达如Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域的目的蛋白。该方法具有转染周期短和快速获得目的蛋白的效果，能够应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。

附图说明

图1为本申请实施例提供的对四段目的片段PCR扩增的电泳检测结果图，A对应为21-663aa结构域的目的片段、B对应为1-497aa结构域的目的片段、C对应为30-497aa结构域的目的片段、D对应为556-644aa结构域的目的片段。

图2为本申请实施例提供的6种重组质粒转染细胞后的WB检测的蛋白电泳图(A-F)；每一电泳图中的左方泳道为上清液样本，右方泳道为离心收集的具体细胞样本。

图3为本申请实施例提供的重组表达质粒5和重组表达质粒6转染细胞后的培养上清液纯化产物电泳结果图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

人Sema4C蛋白是从人胎脑中克隆分离出的一个Ⅳ型跨膜Semaphorin家族新成员，其编码基因由13个外显子组成，染色体定位于2q11.2，该基因编码833个氨基酸，分子量约为92.6kD，为单次跨膜蛋白。人Sema4C编码基因全长如SEQ ID NO.1所示，发明人发现，选取该基因21-633aa区域中的若干结构域，进行体外重组表达，亦能够产生人Sema4C蛋白的部分功能，也为其抗肿瘤研究提供帮助。其具体实施过程如下：

一、重组质粒的构建

1、目的片段的扩增

分别以21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列的DNA片段为目的片段，进行PCR扩增，扩增反应体系如表1所示，目的片段均由武汉金开瑞公司合成提供。

表1 50μL体系

Gloria Nova HS 2X HF Master Mix(ABclonal,货号RK20715)	25μL
		ddH<sub>2</sub>O	22μL
模板	1μL
		上/下游引物	1+1μL

PCR反应程序为：98℃/5min→98℃/20s→60/30s→72℃/2kb/1min→72℃/10min→16℃/1h，其中，98℃/20S→60℃/30S→72℃/2kb/1min的步骤设置30个循环。结果如图1所示，其结果表明21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列的DNA片段扩增正确。

2、凝胶回收

PCR反应完成后，向PCR反应管中加入DNA Loading Buffer，上样并进行琼脂糖凝胶电泳。在割胶仪的紫外灯下切取含有目的DNA的凝胶，将胶切碎后置于2mL离心管中，凝胶回收目的DNA片段。使用康为世纪琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。

3、重组质粒的构建

本申请实施例选用了6种空载质粒，分别利用上述回收的目的片段与其对应的空载质粒进行同源重组，并且在其中插入了两种信号肽序列以及用于纯化的标签序列，以此构建了6种重组质粒。重组质粒的结果如表2所示。

表2 重组质粒的结构示意

表2中，采用上述PCR扩增得到的用于构建重组质粒的目的片段所使用的引物对分别与6个质粒相对应，对应为6对引物对，用于构建重组质粒1的目的片段扩增所用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示，用于构建重组质粒2的目的片段扩增所用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～7所示，用于构建重组质粒3的目的片段扩增所用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示，用于构建重组质粒4的目的片段扩增所用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示，用于构建重组质粒5的目的片段扩增所用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示，用于构建重组质粒6的目的片段扩增所用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示。

对于重组质粒1、2和5，其构建过程为：

分别将含有目的片段的PCR产物分别与质粒1、质粒2和质粒5分别对应的酶切后的空载体质粒，用EcoRI/XhoI限制性内切酶进行双酶切空载体，37℃处理3h后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，将纯化产物用1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段和线性载体并测定浓度，并以如表4所示的反应体系进行同源重组，在PCR管中按上述体系配好并混合均匀后置于金属浴中50℃反应30min，即可得到重组的质粒。其中，双酶切反应体系如表3所示，同源重组反应体系如表4所示。

对于重组质粒3的构建过程为：

分别将含有目的片段的PCR产物和质粒3对应的酶切后的空载体质粒，用XhoI/XbaI限制性内切酶进行双酶切空载体，37℃处理3h后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，将纯化产物用1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段和线性载体并测定浓度，并以如表4所示的反应体系进行同源重组，在PCR管中按上述体系配好并混合均匀后置于金属浴中50℃反应30min，即可得到重组的质粒。其中，双酶切反应体系如表3所示，同源重组反应体系如表4所示。

对于重组质粒4和6的构建过程为：

分别将含有目的片段的PCR产物和质粒4和质粒6，分别对应的酶切后的空载体质粒，用NheI限制性内切酶进行单酶切空载体，37℃3h)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，将纯化产物用1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段和线性载体并测定浓度，并以如表4所示的反应体系进行同源重组，在PCR管中按上述体系配好并混合均匀后置于金属浴中50℃反应30min，即可得到重组的质粒。其中，酶切反应体系如表3所示，同源重组反应体系如表4所示。

表3 酶切反应体系

表4 同源重组反应体系

二、重组菌的构建

对上述构建的重组质粒1～6进行测序检测，将测序正确的质粒分别转化DH5ɑ感受态细胞(货号BTN12-11y，百奥莱博)，得到重组质粒1～质粒6对应的重组菌。

1、转化

(1)取预冷的100μL DH5ɑ感受态细胞，加入10μL重组产物(重组质粒1～6分别设立不同的组别进行混合)，冰浴处理30min后，42℃热水浴90s(严格控制时间)，冰浴处理5min；

(2)再于超净台上，向转化体系中加入加入500μL无抗LB/SOB培养基，37℃，220rmp摇床中复苏45min；

(3)6000rmp离心1min，收集菌体，留200μL菌液，用移液器吸打混匀后加入相应抗性的平板中，倒入4～6颗玻璃珠，轻晃平板将菌液涂布均匀，倒掉玻璃珠，将平板倒置放在37℃培养箱过夜培养。

2、PCR鉴定阳性克隆菌体

无无菌环境下，每个平板中挑取2～5个单菌落至含0.5mL相应抗性的液体LB培养基和10μLddH₂O的溶液中，充分分散，取4μL菌液做菌液PCR鉴定。取6μL菌液密封，于37℃，220rmp摇床中培养4h，便送到测序公司(武汉金开瑞生物科技有限公司)，及经过比对，测序100％匹配。

表5 菌液PCR鉴定体系：20μL体系

PCR仪扩增反应程序：

95℃/5min→(95℃/30S,60℃/30S,68℃/1kb/1min)30cycle→68℃/10min→16℃/1h。

将摇好的菌液(菌液PCR鉴定有条带)送到测序公司(武汉金开瑞生物科技有限公司)，及经过比对，测序100％匹配。

三、重组表达细胞

本申请实施例以真核细胞HEK 293F为宿主细胞，将上述构建的6种重组质粒通过瞬时转染的方式获得稳定表达如Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域的目的蛋白。该方法具有转染周期短和快速获得目的蛋白的效果，能够应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。

1、瞬时转染

经过上述实施例制得的6种重组质粒浓度(质粒1～6)分别为质粒浓度1260ng/μL、1190ng/μL、1220ng/μL、1187ng/μL、1310ng/μL和1250ng/μL。将这些质粒分别转入至HEK293F细胞，具体过程如下：

(1)在培养基中转染前一天以1.3E6细胞/mL的HEK 293F细胞(Thermo Fisher)，体积27mL；

(2)在转染之前，将所有试剂置于室温下；

(3)转染前，将细胞密度调节到2.6E6/mL；

(4)在无菌试管中用1.5mL Opti-MEM稀释总质粒DNA(μg)30μg；

(5)将90μL PEI(1mg/mL，pH7.1)加入稀释的1.5mL Opti-MEM中，混匀静置5min；

(6)将PEI的混合溶液加入到DNA的混合溶液中，翻转或移液混合(混匀的过程要求缓慢进行)；

(7)在室温下孵育20分钟(不要超过)；

(8)将DNA/PEI混合物加入细胞中，通过轻轻旋转将它们充分混合,混合后细胞总体积30mL；

(9)转染后16～20小时第一次补料1.5mL，96小时后测活率及密度；

(10)收获转染后的细胞，收集上清液添加10mM AEBSF进行亲和纯化。

如表6所示，分别对转染后的活细胞数和活率件统计分析，结果在6质粒质粒分别转染HEK 293F细胞后得到的重组表达细胞的活细胞数，在转染第4天后，重组表达细胞的活细胞数仍然高达10⁶个/mL。

表6 重组表达细胞的活细胞数(10⁶个/mL)

重组表达细胞	0天	第1天	第2天	第3天	第4天
						转染重组质粒1	2.6	3.9	3.3	2.8	1.9
转染重组质粒2	2.6	3.6	3.2	2.4	1.65
						转染重组质粒3	2.6	3.33	2.8	2.2	1.55
转染重组质粒4	2.6	3.45	3.01	2.45	1.6
						转染重组质粒5	2.6	3.64	3.11	2.5	1.87
转染重组质粒6	2.6	3.98	3.22	2.55	2.01

2、WB验证表达

(1)样品制备：

取转染后HEK293F细胞100μL 3000r/min离心10min；离心后取上清20μL加20μL 3×loading buffer制样，97℃加热5min，命名为上清(supernatant)；沉淀使用100μL PBS进行悬浮后，取20μL加入20μL3×loading buffer制样，97℃加热10min，命名为细胞(cell)；

(2)WB检测

1)取上样5μL进行SDS-PAGE电泳：根据目的蛋白的分子量的大小选择合适的分离胶浓度。电泳采用恒压模式，5％浓缩胶80V，当marker开始分离大约25min，调至120V，溴酚蓝至分离胶底部终止电泳；

2)转膜：组装顺序：转膜夹黑色面(负极)－海绵垫－3层滤纸－胶－膜－3层滤纸－海绵垫－红色面(正极)。转膜时间：200mA、90-180min；

3)封闭：转膜完成后标记并洗去转膜液(TBST、5min，2次)；清洗干净的膜放入盛有3％脱脂牛奶(TBST配制)的容器中，室温封闭60-90min；

4)6His-tag一抗孵育：封闭完成后，倒掉封闭液。加入用3％脱脂牛奶(TBST配制)1:7000稀释的一抗溶液，摇床上平缓摇动，室温孵育2h或4℃孵育过夜(4℃孵育后需室温再孵育15～30min)。一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

5)二抗孵育：一抗孵育完成前，将对应一抗种属的酶标二抗1：5000稀释到实验需要的量(TBST稀释)。将清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，摇床上缓慢摇动，于室温孵育60～80min。二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

6)曝光：用镊子将膜从TBST中取出，适当控干，置于凝胶托盘。用ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ等体积混合，均匀加至膜上，完全覆盖。底物与膜反应约30s，置于化学发光成像系统仪。设置的曝光时间为3S；10S；30S；60S；120S。

WB检测目的包括：蛋白表达大小是否正确；与高表达样本比较，获取蛋白表达量高/低信息；对于WB中无条带的项目，通过强曝光，如果可以出来条带判定为低表达，无条带的判断为无表达。

3、WB验证结果分析

Western blot结果如图2所示，质粒1-4转染细胞的沉淀中亦检测出目的蛋白的表达。而使用质粒5和6转染细胞后的电泳结果均可见上清液中出现蛋白条带，表明质粒5和6转染的宿主细胞均于胞外表达了目的蛋白。

4、目的蛋白纯化

为此，本申请进一步对质粒5和6转染的宿主细胞培养上清液进行纯化，纯化过程如下。

(1)实验材料

纯化柱Polv-Prep@Chromatography Columns：BIO-RAD 731-1550AT Protein ADiamond(上海博格隆)。

(2)孵育以及柱纯化

取出灭菌的10mL纯化柱管，用无内毒素水冲洗柱管1～2次；从4℃冰箱取出Protein A基质，用移液器吸取1mL基质加入纯化柱管中，待乙醇流完后用无内毒素水清洗6个柱体积；用Binding Buffer平衡填料6个柱体积；将平衡好的基质加入上清管中，用封口膜封口，置于旋转培养器上，20rpm，4℃旋转过夜。

(3)柱流穿

孵育结束后，将离心管配平离心，600rpm，10min，4℃。将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿。同时留约5mL的上清用于悬浮基质，将基质转移至纯化柱管中，待流穿流完(此次流穿不用收集)。

(4)洗杂与洗脱

a.向纯化柱管中加入10mL Washing Buffer洗柱，洗下基质中的杂蛋白。重力流，流出液用灭菌的5mL EP管收集，EP管需要插在冰上保持低温。流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续加入5mL WashingBuffer洗柱，直到G250不变蓝，结束Washing Buffer预洗脱。

b.加入1mL Elution Buffer 1洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 1预洗脱。加入0.01M NaOH用于调节蛋白溶液的pH。

c.加入1mL Elution Buffer 2洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。加入0.01M NaOH用于调节蛋白溶液的pH。

d.加入1mL Elution Buffer3洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。加入0.01M NaOH用于调节蛋白溶液的pH。

e.将上面收集的流穿与洗脱液制样，一般为2×制样，即20μL蛋白+20μL 2×loading，进行SDS-PAGE电泳。

关于质粒5和6中连接的Fc-Tag标签纯化用缓冲液如表7所示。

表7 Fc-Tag标签纯化用缓冲液

缓冲液名称	成分
		Binding Buffer	PBS,pH7.4
Washing Buffer	PBS,pH7.4
		Elution Buffer 1	0.05M醋酸钠，150mM NaCl,pH4.0
Elution Buffer 2	0.05M醋酸钠，150mM NaCl,pH3.0
		Elution Buffer 3	0.05M醋酸钠，150mM NaCl,pH2.2

对纯化后蛋白进行电泳检测，结果如图3所示，质粒5转染的细胞上清液中未纯化到目的蛋白，可能由于其表达量较低所至。质粒6转染的细胞上清液中，能够纯化得到556-644aa结构域的目的蛋白，表达量约为8.53mg/1000mL cells。

综上所述，本申请实施例通过第一序列和N-rabbit FC标签的共同存在的条件下实现了蛋白的分泌表达，经过WB验证及亲和纯化成功获取了Sema4C蛋白SEMA4C的556-644aa的重组表达，表达量约为8.53mg/1000mL cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉爱博泰克生物科技有限公司

<120> 重组人Sema4C蛋白、表达载体、宿主细胞以及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2499

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggccccac actgggctgt ctggctgctg gcagcaaggc tgtggggcct gggcattggg 60

gctgaggtgt ggtggaacct tgtgccgcgt aagacagtgt cttctgggga gctggccacg 120

gtagtacggc ggttctccca gaccggcatc caggacttcc tgacactgac gctgacggag 180

cccactgggc ttctgtacgt gggcgcccga gaggccctgt ttgccttcag catggaggcc 240

ctggagctgc aaggagcgat ctcctgggag gcccccgtgg agaagaagac tgagtgtatc 300

cagaaaggga agaacaacca gaccgagtgc ttcaacttca tccgcttcct gcagccctac 360

aatgcctccc acctgtacgt ctgtggcacc tacgccttcc agcccaagtg cacctacgtc 420

aacatgctca ccttcacttt ggagcatgga gagtttgaag atgggaaggg caagtgtccc 480

tatgacccag ctaagggcca tgctggcctt cttgtggatg gtgagctgta ctcggccaca 540

ctcaacaact tcctgggcac ggaacccatt atcctgcgta acatggggcc ccaccactcc 600

atgaagacag agtacctggc cttttggctc aacgaacctc actttgtagg ctctgcctat 660

gtacctgaga gtgtgggcag cttcacgggg gacgacgaca aggtctactt cttcttcagg 720

gagcgggcag tggagtccga ctgctatgcc gagcaggtgg tggctcgtgt ggcccgtgtc 780

tgcaagggcg atatgggggg cgcacggacc ctgcagagga agtggaccac gttcctgaag 840

gcgcggctgg catgctctgc cccgaactgg cagctctact tcaaccagct gcaggcgatg 900

cacaccctgc aggacacctc ctggcacaac accaccttct ttggggtttt tcaagcacag 960

tggggtgaca tgtacctgtc ggccatctgt gagtaccagt tggaagagat ccagcgggtg 1020

tttgagggcc cctataagga gtaccatgag gaagcccaga agtgggaccg ctacactgac 1080

cctgtaccca gccctcggcc tggctcgtgc attaacaact ggcatcggcg ccacggctac 1140

accagctccc tggagctacc cgacaacatc ctcaacttcg tcaagaagca cccgctgatg 1200

gaggagcagg tggggcctcg gtggagccgc cccctgctcg tgaagaaggg caccaacttc 1260

acccacctgg tggccgaccg ggttacagga cttgatggag ccacctatac agtgctgttc 1320

attggcacag gagacggctg gctgctcaag gctgtgagcc tggggccctg ggttcacctg 1380

attgaggagc tgcagctgtt tgaccaggag cccatgagaa gcctggtgct atctcagagc 1440

aagaagctgc tctttgccgg ctcccgctct cagctggtgc agctgcccgt ggccgactgc 1500

atgaagtatc gctcctgtgc agactgtgtc ctcgcccggg acccctattg cgcctggagc 1560

gtcaacacca gccgctgtgt ggccgtgggt ggccactctg gatctctact gatccagcat 1620

gtgatgacct cggacacttc aggcatctgc aacctccgtg gcagtaagaa agtcaggccc 1680

actcccaaaa acatcacggt ggtggcgggc acagacctgg tgctgccctg ccacctctcc 1740

tccaacttgg cccatgcccg ctggaccttt gggggccggg acctgcctgc ggaacagccc 1800

gggaccttcc tctacgatgc ccggctccag gccctggttg tgatggctgc ccagccccgc 1860

catgccgggg cctaccactg cttttcagag gagcaggggg cgcggctggc tgctgaaggc 1920

taccttgtgg ctgtcgtggc aggcccgtcg gtgaccttgg aggcccgggc ccccctggaa 1980

aacctggggc tggtgtggct ggcggtggtg gccctggggg ctgtgtgcct ggtgctgctg 2040

ctgctggtgc tgtcattgcg ccggcggctg cgggaagagc tggagaaagg ggccaaggct 2100

actgagagga ccttggtgta ccccctggag ctgcccaagg agcccaccag tccccccttc 2160

cggccctgtc ctgaaccaga tgagaaactt tgggatcctg tcggttacta ctattcagat 2220

ggctccctta agatagtacc tgggcatgcc cggtgccagc ccggtggggg gcccccttcg 2280

ccacctccag gcatcccagg ccagcctctg ccttctccaa ctcggcttca cctggggggt 2340

gggcggaact caaatgccaa tggttacgtg cgcttacaac taggagggga ggaccgggga 2400

gggctcgggc accccctgcc tgagctcgcg gatgaactga gacgcaaact gcagcaacgc 2460

cagccactgc ccgactccaa ccccgaggag tcatcagta 2499

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cctgcagggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga 60

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggaaaccg acacactgct gctgtgggtg ctgttgttgt gggtgccagg ctctaccggc 60

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cttgtgacta actctgaatt cgctgaggtg tggtggaacc ttgtgccgc 49

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tcattactaa ccggtctcga gttagtgatg gtgatggtga tgccccaggt tttccagggg 60

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgccaggctc taccggcgct gaggtgtggt ggaaccttgt gccgc 45

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tcattactaa ccggtctcga gttagtgatg gtgatggtga tgccccaggt tttccagggg 60

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atccagcctc cggactctag agccaccatg gccccacact gggctgtctg gct 53

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tcattactaa ccggtctcga gtcagtgatg gtgatggtga tgcacgggca gctgcaccag 60

ctg 63

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ccgcagcccc ggcaaggcta gccgtaagac agtgtcttct ggggagctgg ccacgg 56

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

caagctgggg atccttagct agccacgggc agctgcacca gctgagag 48

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cacttgtgac taactctaag aaagtcaggc ccactcccaa aa 42

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctggaagtac agattctcag ccacaaggta gccttca 37

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ccgcagcccc ggcaaggcta gcaagaaagt caggcccact cccaaaa 47

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tcaccagtgg atccttagct agctcaagcc acaaggtagc cttcagca 48

Claims (8)

1.用于重组表达Sema4C蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA分子具有Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列中的至少一种。

2.一种Sema4C蛋白重组表达载体，所述表达载体以质粒为骨架构建，其中插入有融合基因，所述融合基因如SEQ ID NO.1所示，所述融合基因包含Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述融合基因还包含位于所述结构域5'端的第一序列和位于3'端的第二序列，所述第一序列如SEQ ID NO.2或3所示，所述第二序列为C-6His、N-rabbit FC或C-Human FC-6His标签。

4.用于PCR扩增Sema4C蛋白重组表达载体融合基因的引物组，其中，所述融合基因具有Sema4C蛋白编码基因的21-663aa、1-497aa、30-497aa和556-644aa结构域序列中的一种；所述引物组包括六对引物，所述六对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～15所示。

5.一种携带如权利要求2或3所述的重组表达载体的重组大肠杆菌。

6.一种用于表达Sema4C蛋白的重组表达载体的重组表达细胞，所述重组表达细胞为携带权利要求2或3所述重组表达载体的HEK 293F细胞。

7.一种利用如权利要求6所述的重组表达细胞表达的重组蛋白。

8.权利要求1所述的DNA分子、或权利要求7所述的重组蛋白在制备或筛选宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌之一肿瘤治疗或诊断制剂中的用途。

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